PT1762626E - Amplificação de sinal utilizando um zimogénio sintético - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO "AMPLIFICAÇÃO DE SINAL UTILIZANDO UM ZIMOGÉNIO SINTÉTICO"

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Através da amplificação de sinais químicos pode ser detectado um processo que sofre uma reacção química, mesmo a concentrações muito baixas. Um tal processo de amplificação tem o potencial de proporcionar grande utilidade em qualquer campo que requeira uma detecção sensível e/ou rápida de reacções químicas. Por exemplo, esse processo pode ser utilizado para detectar microrganismos que provocam infecção e doença, agentes químicos ou de guerra biológica, ou poluentes ambientais.

Presentemente não existem processos que proporcionem uma detecção sensível e rápida de reacções químicas. Os métodos actuais ou são demasiado lentos ou não são suficientemente sensíveis. Por exemplo, alguns métodos de detecção podem detectar a presença de bactérias prejudiciais ao longo de algumas horas. Contudo, é frequentemente crítico detectar patogéneos em alguns minutos de modo a determinar que um doente terá uma infecção. A capacidade para detectar a presença de bactérias prejudiciais antes do desencadear da infecção iria permitir que ocorresse a cura de feridas e de queimaduras mais rapidamente e com menos complicações. Além disso, após os doentes terem alta do hospital, eles tornam-se responsáveis pela monitorização do seu próprio estado de saúde e os sintomas de infecção podem não ser evidentes para o doente sem experiência. 1 A identificação rápida de estirpes bacterianas perigosas iria permitir a prescrição do tratamento mais apropriado e prevenir a sobreutilização de antibióticos de largo espectro que resultam em resultados melhorados para o doente e numa redução no desenvolvimento de estirpes de bactérias resistentes a antibióticos.

As queimaduras graves são uma das razões principais para admissão em unidades de cuidados intensivos. Actualmente, os doentes com queimaduras totais em 20% da superfície do corpo têm uma taxa de mortalidade de 22%. Embora a terapia antimicrobiana moderna tenha melhorado os resultados para doentes com queimaduras graves, as infecções continuam a ser uma causa principal de morbidez e mortalidade em doentes sobreviventes da fase de choque de uma lesão térmica. Apesar da terapia de antibióticos e assepsia melhoradas, o controlo da infecção não é, frequentemente, completamente bem sucedido. A infecção é também uma das principais causas do sofrimento do doente, fraca cicatrização de feridas, destruição extensa de tecidos e complicações locais e sistémicas graves. Por isso, o controlo da infecção num doente com queimaduras graves desempenha um papel importante no prognóstico, porque o desencadear de infecção grave pode conduzir à morte do doente, directamente ou através de mecanismos relacionados (e. g., o adiamento de cirurgia devido a condições gerais fracas).

As infecções nosocomiais são preocupações sérias para os hospitais, na medida em que muitos doentes são imunologicamente fracos ou comprometidos e susceptíveis a morbidez e mortalidade significativas. As taxas de colonização são significativamente mais elevadas em condições hospitalares, entre profissionais de saúde e entre doentes. Além disso, os organismos colonizadores 2 no ambiente hospitalar são provavelmente resistentes a muitas formas de terapia antimicrobiana, devido à forte pressão selectiva que existe no ambiente nosocomial, onde os antibióticos são frequentemente utilizados. Estima-se que existam mais de 2 milhões de infecções adquiridas em hospitais por ano que poderiam ter sido prevenidas através de lavagem de mãos adequada e de sistemas de detecção rápida de patogéneos microbianos. Estas infecções podem ser mortais para muitos doentes. Por exemplo, os doentes mais idosos que desenvolvem uma infecção de origem sanguínea devido a cateterização, têm uma taxa de mortalidade superior a 50%. Infelizmente, muitos sintomas são apenas evidentes após a infecção estar já estabelecida. A possibilidade de patogéneos com origem em alimentos ou na água serem encontrados em países do terceiro mundo ou libertados num ataque de bioterrorismo é problemática dado o estado da presente tecnologia. Muitas causas comuns de doença são capazes de infectar os mais jovens ou os mais idosos através de água ou alimentos contaminados, mesmo a concentrações muito baixas (tão baixas quanto 10 a 100 células de Shigella, Salmonella, ou E. coli 0157:H7 podem provocar doença ou morte). Um método que proporciona a detecção precoce desses contaminantes seria benéfico uma vez que os métodos actuais requerem um tempo de amostragem e recolha mais demorado para detectar adequadamente a presença e identificação dos patogéneos. A detecção precoce iria reduzir o número de recolhas de alimento e fraco reconhecimento de marcas (por exemplo, quando uma fábrica é encerrada pela USDA).

Nesta era de bactérias resistentes e de armas biológicas, a detecção rápida e identificação de patogéneos humanos e toxinas 3 biológicas é crucial para que possa ser implementada a resposta médica mais apropriada. A detecção precoce requer algum método de amplificação de sinal, na medida em que os agentes biológicos podem infectar em quantidades tão diminutas que os agentes podem passar despercebidos por outras técnicas não amplificadas. Seria útil possuir um método de amplificação de sinal que superasse os sistemas de detecção e identificação existentes na sua velocidade e simplicidade.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Esta invenção refere-se a zimogénios e à sua utilização em dispositivos de detecção.

Este pedido também descreve métodos para detectar a modificação de um péptido. Numa forma de realização, o método compreende os passos de expor um zimogénio a uma amostra e detectar a modificação ou uma ausência da modificação. 0 zimogénio inclui um péptido exógeno e uma enzima de sinal que é inibida pelo péptido exógeno. A exposição ocorre em condições que irão facilitar uma modificação do péptido exógeno. A modificação inclui a clivagem do péptido exógeno e a clivagem resulta na activação da enzima sinal e num sinal detectável. Alguns exemplos de enzimas sinal adequadas incluem a proteína verde fluorescente (GFP), luciferase, lacase (CotA) e a peroxidase de rábano (HRP).

Num outro exemplo aqui descrito, o método compreende os passos de expor uma estrutura a uma amostra e detectar a modificação ou ausência da modificação. A estrutura inclui um péptido exógeno e, pelo menos, um cofactor. A exposição ocorre 4 em condições que irão facilitar uma modificação do péptido exógeno. A modificação inclui a clivagem do péptido exógeno e a clivagem resulta no cofactor a activar um zimogénio para produzir uma enzima sinal. A clivagem também resulta num sinal detectável.

Num outro exemplo aqui descrito, o método compreende os passos de expor um péptido exógeno a uma amostra e detectar a modificação ou uma ausência da modificação. 0 péptido exógeno é ligado a, pelo menos, duas enzimas e o péptido exógeno inibe as enzimas. A exposição ocorre em condições que irão facilitar a modificação do péptido exógeno. A modificação inclui a clivagem do péptido exógeno e a clivagem resulta na activação das enzimas e um sinal detectável.

Num exemplo aqui descrito, o método compreende os passos de expor um complexo a uma amostra e detectar a modificação ou uma ausência da modificação. 0 complexo inclui, pelo menos, um péptido exógeno e, pelo menos, duas enzimas que são inibidas pelo péptido exógeno. A exposição ocorre em condições que irão facilitar a modificação do péptido exógeno. A modificação inclui a clivagem do péptido exógeno e a clivagem resulta num sinal detectável.

Num exemplo aqui descrito, o método compreende os passos de expor um zimogénio a uma amostra liquida e detectar a modificação ou uma ausência da modificação. 0 zimogénio inclui um péptido exógeno e uma enzima sinal que é inibida pelo péptido exógeno. 0 zimogénio é ligado a uma superfície sólida num ponto de ligação e a exposição ocorre em condições que irão facilitar a modificação do péptido exógeno. A modificação inclui a clivagem do péptido exógeno e a clivagem resulta na activação da 5 enzima sinal, separação da enzima sinal da superfície sólida e um sinal detectável.

Num exemplo aqui descrito, é um zimogénio sintético compreendendo uma enzima ligada covalentemente a um péptido exógeno de modo a que o péptido exógeno iniba uma actividade enzimática da enzima. 0 péptido exógeno inclui um alvo de uma enzima produzida por um microrganismo.

Como aqui utilizado, um "alvo" é uma proteína, péptido ou porção de uma proteína ou péptido que actua como um substrato. Isto é, um alvo é um péptido, proteína ou sua porção ao qual uma enzima se liga e/ou sobre o qual actua.

Num exemplo aqui descrito, é um complexo de zimogénio que compreende, pelo menos, duas enzimas, cada ligada covalentemente a um péptido exógeno, inibindo o péptido exógeno uma actividade enzimática de cada enzima.

Numa forma de realização, esta invenção apresenta dispositivos de teste. Numa forma de realização, o dispositivo de teste compreende uma membrana, pelo menos um péptido ligado à membrana, uma enzima sinal ligada ao péptido e, pelo menos, um substrato marcado de forma detectável ligado à membrana numa segunda localização. 0 péptido compreende um substrato para uma enzima produzida por um microrganismo e o substrato marcado de forma detectável compreende um alvo para a enzima sinal.

Como aqui descrito, o dispositivo de teste compreende uma superfície sólida, um substrato de péptido ligado à superfície sólida e um zimogénio ligado ao substrato de péptido. 0 6 zimogénio inclui uma enzima sinal que é inibida por um substrato peptidico.

Como aqui descrito, o dispositivo de teste pode apresentar um zimogénio sintético compreendendo Bacillus subtilis CotA com um péptido exógeno (péptido não nativo) inserido no sítio activo (sitio catalítico) do zimogénio, em que o péptido inserido inibe a actividade enzimática do zimogénio. 0 péptido inserido pode também compreender um substrato peptidico alvo específico para uma enzima produzida por um microrganismo de interesse (a ser detectado numa amostra). 0 microrganismo de interesse é um microrganismo seleccionado do grupo consistindo em: bactérias, vírus, fungos e bolores. É também aqui descrito um mutante de CotA (variante) de Bacillus subtilis compreendendo CotA com um péptido exógeno consistindo na ansa lateral reactiva do inibidor de proteinase de alfa-1, em que o péptido inibe a actividade de lacase. É também aqui descrito um sensor para a detecção de um microrganismo compreendendo um zimogénio sintético. É também aqui descrito um método para detectar um sinal de uma reacção compreendendo a utilização de um zimogénio sintético, em que a reacção compreende a degradação de um péptido exógeno inserido no zimogénio e em que, após a degradação do péptido inserido, a actividade enzimática do zimogénio é reactivada resultando na catálise de um substrato específico para o zimogénio e a criação de um sinal detectável. A reactivação do zimogénio pode resultar em reacções catalíticas múltiplas de substrato específico para o zimogénio e assim multiplica (amplifica) o sinal criado a partir da degradação do 7 péptido exógeno inserido. 0 sinal detectável pode ser, por exemplo, um sinal colorimétrico ou fluorescente. 0 pedido também descreve um complexo de zimogénio sintético compreendendo um ou mais zimogénios sintéticos, em que os zimogénios estão acoplados (unidos ou ligados) por um péptido compreendendo um substrato peptidico alvo, especifico para um microrganismo de interesse e para o zimogénio. A actividade enzimática do zimogénio pode ser, por exemplo, lacase, fenol oxidase ou actividade de oxidase multi-cobre. Numa forma de realização, o complexo de zimogénio sintético compreende CotA de Bacillus subtilis. 0 pedido também descreve um sensor para a detecção de um microrganismo compreendendo um complexo de zimogénio sintético. 0 pedido também descreve um método de amplificação de um sinal de uma reacção compreendendo a utilização de um complexo de zimogénio sintético, em que a reacção compreende a degradação do péptido de ligação e em que, após a degradação do péptido de ligação, os zimogénios ligados são libertados um do outro e simultaneamente a actividade enzimática dos zimogénios libertados é substancialmente reactivada resultando em reacções catalíticas múltiplas de substrato específico para o zimogénio e a amplificação de um sinal. 0 pedido também descreve zimogénio sintético compreendendo uma enzima não protease com um péptido de protease exógena (péptido não nativo) inserido no sítio activo (sítio catalítico) do zimogénio, em que o péptido inserido inibe a actividade enzimática do zimogénio. 0 pedido também descreve um método de fabrico de um zimogénio sintético compreendendo inserir um péptido de protease exógena no sítio activo (sitio catalítico) de um zimogénio não protease, em que o péptido inserido inibe a actividade enzimática do zimogénio.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Os objectivos, caracteristicas e vantagens da invenção acima mencionados e outros serão óbvios após a descrição mais particular das formas de realização da invenção preferidas, como ilustrado nas figuras acompanhantes nas quais caracteres com referências iguais referem-se às mesmas partes ao longo das diferentes vistas. As figuras não estão necessariamente à escala, sendo colocado ênfase, por outro lado, na ilustração dos princípios da invenção. 0 processo da patente ou do pedido contém, pelo menos, uma figura a cores. Cópias desta publicação da patente ou do pedido de patente com figuras às cores serão fornecidas pelo Instituto sob pedido e pagamento de uma taxa obrigatória. A Figura 1 ilustra um exemplo comparativo dos resultados que podem ser obtidos com algum dos mecanismos de amplificação desta invenção. A Figura 2 ilustra um exemplo de uma representação gráfica do mecanismo geral por trás de uma forma de realização de uma amplificação catalítica. 9 A Figura 3 ilustra um exemplo de uma representação gráfica do mecanismo geral por trás de uma forma de realização de uma amplificação multi-catalitica. A Figura 4 ilustra uma estratégia de rastreio geral de zimogénio in vitro. A Figura 5 ilustra um processo pelo qual os clones individuais podem ser identificados utilizando métodos desta invenção. A Figura 6 ilustra CotA de Bacillus subtilus. A Figura 7 apresenta a ansa lateral reactiva da proteinase alfa-1 (RSL) anexada ao terminal N de CotA. A região RSL de CPI utilizada na sequência do péptido CPI2 é mostrada a amarelo. A mesma região anexada a CotA é mostrada a branco (a negrito). A Figura 8 ilustra a mutagénese de CotA, incluindo Mutantes SSMl, Mutantes SSM2, Mutantes SSM3, Mutantes SSM4 e Mutantes T3. A Figura 9 ilustra uma fotografia que confirma a inserção de CotA de tipo selvagem de 1,7 kb. A Figura 10 ilustra uma fotografia do gel mostrando a sobre-expressão de CotA no clone JS6. A Figura 11 ilustra uma fotografia de um gel de rastreio por PCR de mutantes de CotA utilizando o conjunto de iniciadores de T7. 10 A Figura 12 ilustra uma fotografia de um gel mostrando a sobre-expressão de CotA mutante (SSMl) no clone JS6. A Figura 13 ilustra um gráfico mostrando que as variantes de CotA foram parcialmente inibidas pela extensão e modificação de CotA. A Figura 14 ilustra um gráfico da reactivação do mutante de

CotA SSM4-1. A Figura 15 ilustra um diagrama de uma forma de realização de uma membrana de fluxo lateral de multi-canal. A Figura 16 ilustra uma fotografia de um gel de adn (à esquerda) ao longo de uma fotografia de um gel de proteína (à direita).

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Segue-se uma descrição de uma forma de realização de referência. Embora esta invenção tenha sido particularmente mostrada e descrita com referências às suas formas de realização preferidas, será entendido pelos especialistas na técnica que podem ser aí realizadas várias alterações na forma e detalhes sem sair do âmbito da invenção compreendida pelas reivindicações anexas.

Esta invenção refere-se a sistemas de amplificação de sinal para sensores que detectam reacções químicas (e. g., sensores de biopatogéneos) . Utilizando uma cascata de reacções catalíticas de multipassos, esta invenção proporciona a detecção rápida e 11 esta precisa de reacções ou agentes químicos. Por exemplo, invenção pode ser utilizada para detectar toxinas, proteases ou proteínas produzidas por microrganismos (e. g., vírus, bactérias ou fungos). 0 sinal de uma proteína microbiana (e. g., uma protease ou outras enzimas) pode ser amplificado e detectado em segundos com um ensaio de detecção (e. g., um ensaio colorimétrico). Esta invenção também pode ser utilizada para detectar contaminação e/ou infecção microbiana. Esta invenção proporciona sistemas de detecção de fase líquida ou sólida (e. g., sensores de patogéneos ou sistemas de sensor) que superam a detecção existente e sistemas de identificação na sua velocidade, precisão e/ou sensibilidade. Os sensores e sistemas de sensor podem ser utilizados também para amostras de aerossol. A invenção pode ser útil para aplicações militares e médicas.

Microrganismos (e. g., bactérias) secretam ou produzem enzimas e algumas dessas enzimas são específicas ou únicas para o microrganismo de produção ou secreção. Como tal, essas enzimas produzidas por microrganismos podem actuar como uma "impressão digital" ou alvo e podem ser utilizadas como um marcador ou indicador para ensaios de detecção. Alguns desses alvos têm sido utilizados para produzir ensaios rápidos e específicos para Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes e vários outros. Uma vez que uma quantidade muito pequena de enzima pode converter uma grande quantidade de substrato em condições apropriadas, um sensor à base de enzima pode alcançar um nível de sensibilidade que não é possível com técnicas simples à base de anticorpos. Resumidamente, estes sensores e ensaios de detecção detectam a presença de microrganismos interagindo com uma proteína (e. g., uma protease ou outra enzima) secretada ou expressa por um microrganismo (e. g., uma bactéria ou fungo). 12

Por exemplo, os sensores podem incluir um péptido ou substrato que é concebido para interagir com uma enzima que é especifica para um microrganismo de interesse. Quando o substrato do sensor contacta ou interage com a enzima, o péptido é clivado ou modificado de modo que é produzido um sinal detectável.

Num exemplo, o substrato é marcado com dois corantes diferentes, com um corante a servir para interromper a transferência de energia de ressonância de fluorescência (FRET) para o outro quando as moléculas de corante estão em estreita proximidade. FRET é o processo de uma interacção de estado excitado dependente da distância no qual a emissão de uma molécula fluorescente está acoplada com a excitação de outra. Um par de aceitador e dador típico para a transferência de energia de ressonância consiste em ácido 4-(4-(dimetilamino)fenil)azo benzóico (DABCYL) e ácido 5-[(2-aminoetilamino)]naftaleno sulfónico (EDANS). EDANS é excitado por iluminação com luz a um comprimento de onda de cerca de 336 nm e emite um fotão com comprimento de onda próximo de 490 nm. Se uma unidade DABCYL está localizada num raio de 20 angstroms do EDANS; este fotão será absorvido eficientemente. DABCYL e EDANS serão ligados a extremidades opostas de um substrato peptídico. Se o substrato está intacto, o FRET será muito eficiente. Se o péptido foi clivado por uma enzima, os dois corantes já não estarão numa estreita proximidade e o FRET será ineficiente. A reacção de clivagem pode ser seguida observando uma diminuição da fluorescência de DABCYL ou um aumento da fluorescência de EDANS (perda de interrupção). Deste modo, a presença da enzima específica, e desse modo a presença do microrganismo que produz a enzima, é detectada. 13

Noutro exemplo, o substrato está ligado a dois componentes colorimétricos. Um dos componentes colorimétricos pode ser uma primeira cor, por exemplo, azul, e o segundo componente colorimétrico pode ser uma segunda cor, por exemplo, amarelo. Quando presente no mesmo substrato, o substrato não modificado pode revelar-se verde. Se esse mesmo substrato for modificado (e. g., por clivagem enzimática do componente colorimétrico amarelo do substrato) o substrato pode revelar-se azul. Desse modo, a modificação do substrato seria sinalizada por uma alteração na cor de verde para azul.

Noutro exemplo, um substrato é marcado com um componente colorimétrico e ligado a um suporte sólido que é corado. 0 componente colorimétrico pode ser uma primeira cor, tal como amarelo, e o suporte sólido pode ser uma segunda cor, tal como azul. A combinação do suporte sólido com o substrato não modificado pode revelar-se verde. Se o substrato for modificado (e. g., por clivagem enzimática do componente colorimétrico amarelo do substrato), a combinação do suporte sólido e o substrato modificado surgirão em azul. Desse modo, a modificação do substrato seria sinalizada por uma alteração na cor de verde para azul. A forma de realização aqui descrita pode ser utilizada para amplificar ou melhorar os sensores e ensaios de detecção descritos acima. Contudo, os especialistas na técnica irão reconhecer que outros sensores e ensaios de detecção podem também ser utilizados em conjunção com a presente invenção. Alguns exemplos de sensores e ensaios de detecção aos quais os exemplos descritos no presente pedido podem ser aplicados são descritos no Pedido de Patente U.S, N° US 09/848,781, apresentado em 3 de Maio de 2001, publicado em 22 de Maio de 14 2003, como Publicação do Pedido de Patente U.S. N° 2003/0096315 Al e intitulado "Device for Detecting Bacterial Contamination and Method of Use"; Pedido Internacional N° PCT/US03/03172, apresentado em 31 de Janeiro de 2003, publicado em 7 de Agosto de 2003, como Publicação Internacional Número WO 03/063693 A2 e intitulado "Method for Detecting Microorganisms"; Pedido Internacional N° PCT/US2003/037319, apresentado em 21 de Novembro de 2003, publicado em 10 de Junho de 2004, como Publicação Internacional Número WO 2004/047614. O pedido descreve a amplificação de um sinal utilizando a catálise para multiplicar ou aumentar o número potencial de eventos de processos catalíticos (í. e., reacções catalíticas). Alguns exemplos utilizam a catálise enzimática para multiplicar cada evento de processamento de uma proteína microbiana (e. g., uma toxina ou protease bacteriana). Noutras formas de realização de referência, esta invenção proporciona outra amplificação utilizando um mecanismo multi-catalítico ou "reacção em cadeia" para aumentar a quantidade de enzima que pode ser activada com cada evento de processamento. A Figura 1 ilustra um exemplo comparativo dos resultados que podem ser obtidos com estes mecanismos de amplificação. A linha de tendência marcada com "velocidade" representa os processamentos obtidos sem a utilização de um catalisador da invenção. A linha de tendência marcada com "catalítica" representa os processamentos obtidos utilizando catalisadores de enzima para multiplicar cada evento de processamento. A linha de tendência marcada com "multi-catalítica" representa os processamentos obtidos utilizando um mecanismo multi-catalítico ou de "reacção em cadeia" para aumentar a quantidade de enzima que pode ser activada com cada evento de processamento. 15

Em algumas formas de realização de referência, a invenção é a amplificação de sinal que utiliza um catalisador enzimático para multiplicar cada evento de processamento de uma proteína microbiana (e. g., uma toxina microbiana, tal como uma protease ou outra enzima produzida por um microrganismo). Por exemplo, um péptido contendo uma sequência alvo de uma proteína microbiana de interesse é ligado ou unido a uma enzima sinal de modo a que a actividade enzimática da enzima seja inibida. Por outras palavras, o péptido é ligado ou incorporado na enzima sinal, produzindo desse modo um zimogénio (í. e., um precursor de enzima inactiva). A inibição da enzima sinal pode ser realizada através de, por exemplo, ligação de uma molécula à enzima sinal que bloqueia estericamente o sítio activo da enzima sinal ou provocando a dobra da enzima sinal numa confirmação inactiva. Numa forma de realização, uma molécula de bloqueamento é ligada à enzima sinal através de ligações persulfureto.

Este complexo inibido pode ser reactivado, por exemplo, por uma proteína microbiana (e. g., uma protease bacteriana) que reconhece a sequência de péptido como um substrato. A proteína microbiana cliva a porção do péptido do zimogénio, activando desse modo a enzima sinal. A enzima sinal pode então começar a processar um substrato marcado (e. g., um substrato marcado descrito acima) para produzir um sinal detectável, tal como um sinal colorimétrico ou fluorescente. Deste modo, cada evento de clivagem de um péptido individual pode ser multiplicado pela enzima sinal reactivada num grande número de processamentos num curto período de tempo. A Figura 2 ilustra um exemplo de uma representação gráfica do mecanismo geral por trás desta amplificação catalítica. À esquerda, um zimogénio inclui uma sequência de péptido e um 16 inibidor. 0 inibidor bloqueia estericamente um sítio activo, tornando a porção da enzima sinal do zimogénio inactiva. 0 zimogénio encontra uma protease, que cliva a sequência do péptido. A porção clivada do péptido, juntamente com a porção de inibição, move-se (e. g., migra ou difunde) afastando-se do sítio activo, removendo desse modo a inibição e activação da enzima sinal. A enzima sinal fica então livre para catalisar um substrato marcado, produzindo um sinal detectável.

Noutras formas de realização de referência desta invenção, são utilizados mecanismos de activação de sinal alternada ou suplementar para amplificar um sinal para um ensaio de detecção ou sensor. Por exemplo, a actividade enzimática pode ser regulada controlando a disponibilidade de um cofactor que é requerido pela enzima sinal para catálise. Este é um mecanismo adequado para muitas enzimas sinal que podem produzir um sinal colorimétrico ou fluorescente. Em algumas formas de realização, os cofactores de iões metálicos são trancados numa estrutura que pode ser libertada por uma reacção de clivagem de péptido. A clivagem do péptido liberta os iões metálicos e activa várias enzimas. Deste modo, podem ser activadas muitas enzimas sinal de uma só vez, multiplicando deste modo o sinal resultante.

Em algumas formas de realização de referência, esta invenção utiliza um mecanismo multi-catalítico ou de "reacção em cadeia" para aumentar o número de enzimas sinal que podem ser activadas com cada evento de processamento, produzindo, desse modo, um sinal amplificado de um ensaio de detecção ou sensor. Por exemplo, um péptido pode acoplar duas ou mais enzimas sinal de modo a impedir estericamente as enzimas sinal embora mantendo a disponibilidade do péptido para interagir com uma proteína microbiana (e. g., de modo a que possa ser clivado por uma 17 protease bacteriana). As enzimas sinal acopladas podem ser iguais, semelhantes ou diferentes. Em algumas formas de realização de referência, a sequência peptídica é concebida para ser um substrato adequado para a proteína microbiana e para uma ou mais das enzimas acopladas. A Figura 3 ilustra um exemplo de uma representação gráfica do mecanismo geral por trás desta amplificação multicatalítica. À esquerda, uma sequência peptídica acopla duas proteínas sinal inactivas com uma proteína sinal sendo uma enzima inactiva e a outra proteína sinal sendo uma protease inactiva. 0 péptido que acopla as duas proteínas sinal tornou-as inactivas. Após o complexo zimogénio/péptido encontrar um péptido microbiano (e. g., uma protease bacteriana), a sequência peptídica é clivada (e. g., através de hidrólise), activando desse modo ambas as proteínas sinal. A enzima agora activa está então livre para catalisar um substrato marcado de forma detectável para produzir um sinal. A protease agora activa está livre para catalisar a clivagem de péptidos que inibem outras proteínas sinal, multiplicando, desse modo, os eventos de processamento ainda mais. Deste modo, o sinal detectável do ensaio de detecção ou sensor é amplificado. 0 resultado é uma amplificação de sinal que iria proporcionar um aumento relativamente maior na taxa de amplificação com tempo comparado com ensaios de detecção que são baseados num mecanismo em que uma proteína microbiana interage apenas ou directamente com um substrato marcado de forma detectável ou comparado com a amplificação catalítica que utiliza um passo de activação de sinal de enzima única. Pode ser utilizado um mecanismo semelhante, por exemplo, para uma enzima hidrolítica com um substrato fluorescente. 18

Em algumas formas de realização de referência, um ou mais dos métodos de amplificação previamente descritos são utilizados em conjunto, e/ou com, um ensaio de detecção que se baseia num mecanismo em que uma proteína microbiana interactua directamente com um substrato marcado de forma detectável. Por exemplo, numa forma de realização, esta invenção utiliza um complexo multi-catalitico zimogénio/péptido juntamente com um único zimogénio e/ou com um processo de activação de enzima sinal que é regulada pelo controlo da disponibilidade de um cofactor que é requerido pela enzima sinal para catálise.

CONCEPÇÃO DE ZIMOGÉNIO

Ao conceber ou escolher um zimogénio adequado para utilização na presente invenção, podem ser considerados vários factores, incluindo: 1. A diferença na actividade entre o zimogénio e a enzima sinal. De um modo preferido, a diferença na actividade é suficientemente grande para proporcionar a resolução de sinal desejada. 2. 0 tipo de ensaio com o qual o zimogénio será utilizado. De um modo preferido, o ensaio é económico e não é desnecessariamente complexo para a aplicação de interesse. 3. A sensibilidade do zimogénio. De um modo preferido, o zimogénio é suficientemente sensível à presença da proteína microbiana de interesse, de modo a que o ensaio de detecção proporciona um sinal adequado quando 19 o número de microrganismos que são supostos produzir um sinal detectável estão presentes. 4. 0 mecanismo de activação. De um modo preferido, o zimogénio é activado pelo mecanismo desejado (e. g., activação proteolitica). 5. 0 sitio de activação. De um modo preferido, o sitio de activação é configurado de um modo que lhe permite interagir especificamente com um substrato marcado de forma detectável ou outro meio para produzir um sinal detectável.

Alguns ou a totalidade destes critérios pode ser importante, dependendo da aplicação ou microrganismo especifico a ser detectado. A construção ou selecção de um zimogénio para satisfazer estes ou outros critérios pode ser realizado por mutagénese de uma enzima adequada para ligar as regiões do péptido e inibidor (ou protease). Uma vez construído, pode ser utilizada mutagénese aleatória para refinar as propriedades de inibição e activação do zimogénio resultante. É vantajoso utilizar um método de rastreio rápido para identificar as mutações que seriam adequadas para utilizar como um zimogénio num processo de amplificação da invenção. Por exemplo, a medição da actividade pode ser realizada de um modo sequencial, em primeiro lugar para inibição e depois novamente após reactivação. A Figura 4 ilustra uma estratégia de rastreio geral inicial in vitro, que pode incluir os passos de: 1. As células são cultivadas, de um dia para o outro, em meio LB a 37 °C. 20 2. Após indução com IPTG a 1 mM, as células são lisadas e ligadas a placas de ligação a marcador de epitopo (e. g., ácido nitrilotriacético ou placas revestidas com anticorpo). 3. As placas são então lavadas 3x com solução salina tamponada com fosfato (PBS). 4. As células são então incubadas com proteases bacterianas para medir a reactivação dos mutantes de zimogénio CotA. 5. Os mutantes que produzem a cor mais reactivada na presença de um substrato (e. g., ABTS) são então identificadas através de sequenciação de ADN.

Uma reacção enzimática pode ser encarada como um interruptor proteico universal que possui várias utilizações, incluindo amplificação de sinal, rastreio de elevada capacidade de processamento e distribuição de proteína. Para a amplificação de sinal, qualquer proteína ou péptido que é hidrolisado por uma protease pode permitir que um inibidor se difunda do sítio activo e active a actividade da enzima que pode produzir um sinal. Para o rastreio de elevado processamento, uma proteína aleatória ou péptido pode ser colocada entre os resíduos da enzima e do inibidor para rastrear novas enzimas (e. g., proteases) .

Por último, para distribuição de proteína, uma enzima pode ser fundida com um anticorpo ou outro fármaco à base de proteína. A enzima fundida pode ser utilizada para distribuir a proteína no local da doença, tal como uma infecção bacteriana ou 21 virai e/ou uma célula tumoral. A hidrólise especifica do produto de fusão liberta o anticorpo ou fármaco da proteina e distribui-o no sitio do patogénio ou célula tumoral. Deste modo, o fármaco proteico pode ser distribuído com maior precisão à área de tratamento. Uma vez distribuído, o fármaco proteina pode, por exemplo, enfraquecer ou matar o patogénio ou célula tumoral. Em algumas formas de realização da invenção, um péptido bactericida pode ser ligado a um zimogénio com um ligante de activação que reage especif icamente com, ou é um alvo para, as proteínas secretada ou expressas por um patogéneo (e. g., bactéria) Após a descoberta ou contacto com a bactéria na corrente sanguínea, essas proteases especificas da bactéria iriam activar o zimogénio (e. g., por reacção com um substrato peptidico que está a inibir a enzima) e despoletar a libertação do péptido bactericida, que iria então destruir a bactéria. Este tipo de distribuição direccionada de um agente bactericida pode reduzir a hipótese de a bactéria desenvolver resistência ao fármaco para o agente.

Uma discussão adicional sobre a concepção do zimogénio sintético, fabrico e utilização encontra-se na Patente U.S. N° 5811252, emitido por Johan Hendrikus Verheijen em 22 de Setembro de 1998; Verheijen, J.H., et al., "Modified Proenzymes as Artificial Substrates for Proteolytic Enzymes: Colorimetric Assay of Bacterial Collagenase and Matrix Metalloproteinase Activity Using Modified Pro-Urokinase," Biochem. J., 323: 603-609 (1997); Plainkum, P., et al., "Creation of a Zymogen,"

Nature Struct. Blol., 10(2): 115-119 (2003); e Saghatelian, A., et al., "dna Detection and Signal Amplif ication via an

Engineered Allosteric Enzyme," JACS, 125: 344-345 (2003). Além disso, exemplos de microrganismos, enzimas e substratos específicos para utilização com a presente invenção são 22 encontrados no Pedido U.S. e Internacional previamente mencionado. LACASE (CotA)

Numa forma de realização de referência, a enzima sinal é uma lacase. A lacase (oxidase de difenol) é um membro da familia de enzimas da oxidase multi-cobre. Geralmente, estas enzimas requerem oxigénio para oxidar fenóis, aminas de polifenóis aromáticos, e outros substratos não fenóticos por um electrão para criar uma espécie radical. A reacção de oxidação geral que catalisa é:

A lacase encontra-se em fungos, assim como em algumas plantas e bactérias. A função natural da lacase parece ajustar-se a duas classes: formulação (esporulação ou pigmentação) e degradação. A lacase é utilizada na quimica industrial para a lixiviação e biorremediação de corantes e a degradação de lenhina. É uma enzima adequada para a sintese de um zimogénio em parte devido à sua estabilidade e propriedades de oxidação. A oxidação da espécie resulta num electrão não emparelhado que origina uma alteração de cor. A Figura 6 ilustra a CotA de Bacillus subtilus, que é um exemplo de uma lacase bacteriana. A enzima é utilizada na 23 construção da capa do esporo durante a esporulação. (Ver, e. g., Enguita, F.J. et ai., "Crystal Structure of a Bacterial Endospore Coat Component" J Biol. Chem., 278(21): 19416-19425 (2003), cujo conteúdo total é aqui incorporado como referência). A função natural de CotA parece envolver a pigmentação do esporo para resistência a UV e H202. O sitio activo parece aceitar substratos maiores do que as enzimas que se encontram em fungos e em plantas. A CotA é altamente termoestável e pode ser utilizada, por exemplo, numa base de detergente ou uma base de formalina ureia. Não é solúvel e pode actuar como uma proteína de membrana. Uma vantagem de utilizar CotA ou outras lacases em relação a uma abordagem de protease simples é a velocidade. A CotA e a lacase são enzimas catalíticas e, por isso, muito mais rápidas a produzir uma alteração de cor do que um simples ensaio de protease (geralmente em segundos em vez de após vários minutos) . A sequência de CotA é como se segue:

MTLEKFVDALPffDTLKPVQQSKEKTYYEVTMEECTHQLHRDLPPTRLWG

YNGLFPGPTIEVKRNENVYV^WMNNLPSTHFLPIDHTIHHSDSQHEEPEVKT

WHLHGGVTPDDSDGYPEAWFSKDFEQTGPYFKREVYHYPNQQRGÀILWY

HDHAMALTRLNVYAGLVGAYIIHDPKEKRLfCLPSDEYDVPLLITDRTINEDG

SLFYPSAPENPSPSLPNPSIVPAFCGETILVNGKVWPYLEVEPRKYRFRVINAS

NTRTYNLSLDNGGDFIQIGSDGGLLPRSVKLNSFSLAPAERYDIUDFTAYEGE

SIILANSAGCGGDVNPETDANIMQFRVTKPLAQKDESRKPKYLASYPSVQHE

RJQNIRTLKLAGTQDEYGRPVLLLNNKRWHDPVTETPKVGTTErWSÍINPTRG

THPIHLHLVSFRVLDRRPFDIARYQESGELSYTGPAVPPPPSEKGWKDTIQAH

AGEVLRIAATFGPYSGRYVWHCHILEHEDYDMMRPMDITDPHK 24 (Sequência de CotA de Bacillus subtilis; também aqui referida como "SEQ ID N°: 1.")

Foi utilizada CotA para construir um zimogénio modificando a sequência para criar uma forma de pró-enzima da proteína. A análise da estrutura da CotA indica que uma extensão de comprimento adequado anexada ao terminal N da CotA pode permitir que o inibidor anexo seja colocado no sítio activo da enzima. 0 braço de extensão é baseado nas sequências de péptidos mostradas como sendom alvos de clivagem das proteases de bactérias patogénicas. Isto permitirá que o braço seja grampeado na presença da bactéria. Numa forma de realização de referência, o substrato peptídico é CPI2 ou ECT2. As sequências dos substratos péptido CPI2 e ECT2 são como se segue: CPI2 Edans - EGAUFLEAIPMSIPK-Dabcyl ECT2 Dabcyl-KVSRRRRRGGD- Edans (a sequência EGAMFLEAIPMSIPK é também aqui referida como SEQ ID N°: 2; e a sequência KVSRRRRRGGD é também aqui referida como SEQ ID N°: 3) .

Localizada na extremidade do braço de extensão está a região que irá interagir com o sítio activo da enzima. Isto consiste em um ou mais resíduos de aminoácidos que podem inibir a actividade de CotA. Isto pode ser realizado através de ligação à bolsa do sítio activo e/ou ao cobre do sítio activo ou interagindo com a estrutura de proteína de modo a provocar uma alteração estrutural. A análise da estrutura de raios x da CotA foi utilizada para determinar o comprimento da cadeia de aminoácidos necessária para alcançar a distância mais curta em redor da estrutura (~30Ã). 25

Três resíduos foram aleatorizados para permitir a selecção da melhor combinação de inibidor. A localização de cada um foi três aminoácidos do terminal N da forma mutante. Uma concepção semelhante pode ser criada com base na sequência do péptido ECT2 que é específica para a protease OmpT de E. coli. Este péptido é mais curto do que CPI2 e é benéfico adicionar resíduos adicionais (e. g., SAS) para lhe fornecer o mesmo alcance. As sequências das adições para o terminal N do mutante CotA são apresentados abaixo:

Mutantes CPI2 de Tipo 1 MASXXXEGAMFLEAIPMSIPKTLEKFVDAL Mutantes CPI2 de Tipo 2 MASXXXSASEGAMFLEAIPMSIPKTLEKFVDAL Mutantes CPI2 de Tipo 3 MASXXXEGAMFLEAIPMSIPKSASTLEKFVDAL Mutantes ECT2 de Tipo 1 MASXXXSASVSRRRRRGGSASTLEKFVDAL (a sequência MASXXXEGAMEFLEAIPMSEPKTLEKFVDAL é também aqui referida como SEQ ID N°: 4; a sequência MASXXXSASEGAMFLEAIPMSIPKTLEKFVDAL é também aqui referida como SEQ ID N°: 5; a sequência MASXXXEGAMFLEAIPMSIPKSASTLEKFVDAL é também aqui referida como SEQ ID N°: 6; e a sequência MASXXXSASVSRRRRRGGSASTLEKFVDAL é também aqui referida como SEQ ID N°: 7). A ansa lateral reactiva da proteinase alfa-1 (RSL) foi anexada ao terminal N de CotA, como mostrado na Figura 7. A CPI2 foi baseada na sequência da ansa do sítio reactivo (RSL) do inibidor da proteinase alfa-1 (também denominado inibidor da proteinase da cisteína ou CPI). Foi também preparado o mutante de CotA SSM1 possuindo a sequência: massfwegamfleaipmsipktlekfv-DAL (também aqui referida como SEQ ID N°: 8). 26 A Figura 8 ilustra as listagens de sequências gerais que resultam da mutagénese de CotA. Incluídos na Figura 8 estão: 1. Uma sequência peptidica geral para Mutantes SSMl, a sequência geral também aqui referida como SEQ ID N°: 9. 2. Uma sequência peptidica geral para Mutantes SSM2, a sequência geral também aqui referida como SEQ ID N°: 10. 3. Uma sequência peptidica geral para Mutantes SSM3, a sequência geral também aqui referida como SEQ ID N°: 11. 4. Uma sequência peptidica geral para Mutantes SSM4, a sequência geral também aqui referida como SEQ ID N°: 12. 5. Uma sequência peptidica geral para Mutantes T3, a sequência geral também aqui referida como SEQ ID N°: 13.

Para mutantes de Tipo 2 e Tipo 3, foi inserida uma extensão SAS de três aminoácidos na sequência para dar uma maior flexibilidade e um alcance mais longo ao braço anexo. Podem ser inseridas uma ou mais extensões SAS em pontos diferentes, para criar um ligante flexivel. Por exemplo, as extensões SAS podem ser inseridas antes e/ou após o péptido (e. g., o péptido CPI2), como ilustrado pela seguinte sequência, também aqui referida como "SEQ ID N°: 14":

SEQ ID N°: 14 MASXXXSASEGAMFLEAIPMSIPKSASTLEKFVDAL

Pode também ser apresentado um processo semelhante para o péptido ECT2, por exemplo, com um conjunto de três aminoácidos aleatórios na extremidade da proteína mutante. 27

Zimogénios Fortemente Ligados e Utilização em Detecção e Diagnóstico

Em algumas formas de realização de referência, esta invenção apresenta a utilização de uma enzima sinal fortemente ligada a uma superfície sólida (e. g., uma esfera) com um péptido. Alguns exemplos de enzimas sinal adequadas incluem a proteína verde fluorescente (GFP), luciferase, lacase (CotA) e peroxidase de rábano (HRP). 0 péptido funciona como um substrato para uma proteína microbiana (e. g., uma enzima bacteriana, tal como uma protease bacteriana). Quando o péptido interactua com a proteína microbiana de interesse, o péptido é clivado ou hidrolisado pela proteína microbiana. Esta interacção liberta a enzima sinal e a enzima sinal fica então livre para interagir com um repórter ou substrato marcado de forma detectável e produzir um sinal detectável indicando a presença do micróbio de interesse.

Exemplos de substratos repórter adequados incluem ABTS e naftol.

Noutras formas de realização de referência, o substrato da enzima sinal pode estar ligado ou fortemente ligado a uma superfície, tal como uma membrana de fluxo lateral ou esfera (e. g., uma produzida a partir de nitrocelulose). Uma porção da membrana pode compreender a enzima sinal fortemente ligada, enquanto outra porção da membrana pode compreender um substrato marcado de forma detectável. Uma amostra de teste líquido é introduzida na porção da membrana que compreende a enzima sinal fortemente ligada. Se a amostra de teste líquida inclui a proteína microbiana de interesse, a proteína microbiana cliva o péptido e a enzima activada é liberta. A enzima activada migra então em direcção à porção da membrana em que o substrato marcado de forma detectável está localizado. Assim que a enzima activada atinja a porção da membrana que inclui o substrato 28 marcado de forma detectável, a enzima sinal interage com o substrato marcado de forma detectável e produz um sinal visivel.

Podem ser detectados múltiplos patogéneos ou enzimas em séries na mesma membrana de fluxo lateral através da formação de um canal na membrana com cera ou outro (s) material (ais) que tornam o material da membrana impenetrável a proteínas e substratos, mas permite que o liquido ou tampão fluam. Como um exemplo, a cera de parafilme pode ser dissolvida em hexano e utilizada para dividir a amostra em câmaras múltiplas (e. g., canais ou pistas). Isto seria um modo muito rentável para ter testes de fluxo lateral múltiplos para detectar a presença de bactérias patogénicas numa membrana de fluxo lateral único, reduzindo deste modo o custo de cada teste. A Figura 15 ilustra um diagrama de uma forma de realização de membrana de fluxo lateral de multi-canal. A cera (e. g., cera de parafilme) é dissolvida em hexano e derramada sobre uma membrana de fluxo lateral POREX® (disponível em Porex Technologies Corp., Fairburn Geórgia) utilizando uma ponta de pipeta. Uma amostra a ser testada é colocada dentro ou próximo dos poços com 10 ng de HRP localizada na extremidade do fundo da membrana. A amostra interage com o zimogénio fortemente ligado e começar a fluir em direcção à linha de substrato através das linhas de cera ou pistas. Se a proteína microbiana de interesse está presente na amostra de teste, a enzima sinal será libertada e a enzima agora activa irá migrar para a linha de substrato juntamente com a amostra de teste. Assim que a enzima sinal active atinge a linha do substrato, a enzima irá interagir com o substrato marcado de forma detectável e produzir um sinal visível (e. g., uma linha visível). 29

Adicionalmente aos diagnósticos de fluxo lateral e fase liquida, os zimogénios fortemente ligados também podem ser utilizados num rastreio de elevado rendimento (HTS) para novos alvos de diagnóstico. Por exemplo, um rastreio pode utilizar proteína verde fluorescente (e. g., GFP) fundido sinteticamente a uma região de 10 aminoácidos aleatórios ligada ao marcador do epitopo C-terminal (e. g., poli-histidina). O marcador de epitopo permite que o sistema repórter seja fortemente ligado a uma superfície até que um evento de hidrólise de uma espécie enzimática da proteína microbiana (e. g., uma protease bacteriana) desencadeie a libertação da enzima repórter.

Utilizando PCR, uma biblioteca de GFP de péptidos aleatórios foi amplificada e clonada para realizar um rastreio de elevado rendimento para detectar a presença de eventos proteolíticos específicos. O rastreio pode ser utilizado para identificar novos substratos para patogéneos bacterianos que podem ser incorporados num ponto de cuidados de diagnóstico rápido. A Figura 16 ilustra uma fotografia de um gel de ADN (à esquerda) ao lado de uma fotografia de um gel de proteínas (à direita) . O gel de ADN da esquerda mostra uma amostra de dez clones da biblioteca em que todos possuem GFP e o gel de proteína na direita indica que todos os clones expressam GFP. Uma vez que os clones podem estar ligados a uma resina ou esferas que se ligam ao marcador do epitopo, estes produtos de proteína são adequados para rastreios de elevado rendimento utilizando placas de microtitulação em formatos 96, 386, ou mais poços que permitem o processamento rápido das células. O processo através do qual podem ser identificados clones individuais utilizando este método é ilustrado na Figura 5.

Resumidamente, as células são cultivadas e depois lisadas numa 30 placa de microtitulação contendo 50 pg de lisozima e 100 U de ADNase I. O resíduo celular é removido por centrifugação e os sobrenadantes de GFP são ligados às placas contendo resina de NTA para se ligar especificamente à proteína. Após lavagem da proteína, cada poço é incubado com uma cultura bacteriana e depois centrifugado através de um filtro de centrifugação para separar a GFP ligada da GFP livre. As amostras que libertam especificamente a GFP são retestadas com outras bactérias para ver se elas são específicas e depois o ADN é sequenciado para identificar o clone. Um dos clones é identificado. O péptido pode ser sintetizado e depois ligado covalentemente ou modificado para CotA ou HRP para o desenvolvimento de novos ensaios de diagnóstico rápido.

Exemplo 1: Clonagem e Expressão de Variantes de CotA de Tipo Selvagem e Mutantes

Os iniciadores de oligonucleótidos (ilustrados na Tabela 1) foram concebidos para incorporar um sitio de restrição NheI na extremidade 5' e um sitio Xhol na extremidade 3' do gene durante a amplificação de variantes CotA de Bacillus subtilis (os sítios de restrição estão sublinhados na Tabela 1). O fragmento amplificado por PCR foi clonado no sítio Nhel/Xhol do vector de expressão pET24a (Novagen, San Diego, Calif.) para criar plasmídeos recombinantes SSM (Tabela 2). PCR de colónias utilizando um conjunto de iniciadores de T7 disponíveis comercialmente confirmaram a presença da inserção em construções de SSM recombinantes. A Figura 9 ilustra uma fotografia do gel de PCR resultante, confirmando a inserção de

CotA de tipo selvagem de 1,7 kb por PCR. O vector é pET24A, a 31 inserção é CotA de tipo selvagem e o conjunto de iniciadores utilizado foi um conjunto de iniciadores de T7 disponível comercialmente. A pista 7 mostra o Clone JS6, indicando um tamanho de inserção de -1,542 kb.

Tabela 1: Iniciadores Oligonucleotídicos

Iniciador Sequência CotAFor CATATGGCTAGCACACTTGAAAAATTTGTGGATGCTCTC MutantFORcotA CTAGCTAGCNNNNNNNNNGAAGGA GCA ATGTTC CTA GAA GCA ATA CCA ATG TCA ATA CCA AAA ACA CTT GAA AAA TTTGTGGAT GCT CTC CTAFEl CTAGCTAGOWNNNNNNNTCA GCA TCA GAAGGA GCA ATGTTC CTA GAA GCA ATA CCA ATG TCA ATA CCA AAA ACA CTT GAA AAA TTTGTGGAT GCT CTC CTAFE2 CTAGCT A GCNNNNNNNNNGA AGGAGC AATGTTCCT AGA AGCAATACCAATGTCA ATA CCA AAATCAGCA TCA ACA CTT GAA AAATTTGTGGATGCTCTC NewCMF CTAGCTAGCGAAGGA GCA ATGTTC CTA GAA GCA ATA CCA ATG TCA ATA CCA AAA ACA CTT GAA AAA TTTGTGGAT GCT CTC CotA Rev CCG CTCG AGTTATTTATG G GGATCAGTTATATCC (CotAFor é também aqui referido como "SEQ ID N° : 15"; MutantFORcotA é também aqui referido como "SEQ ID N° : 16"; CTAFEl é também aqui referido como "SEQ ID N° : 17"; CTAFE2 é também aqui referido como "SEQ ID N°: 18"; NewCMF é também aqui referido como "SEQ ID N°: 19"; e CotA Rev é também aqui referido como "SEQ ID N°: 20") 32

Tabela 2: Plasmídeos Recombinantes

Plasmídeos recombinantes Descrição JS6 COTA SSMl COTA-CPI2-XXX SSM2 COTA-CPI2-SAS-XXX SSM3 COTA-SAS-CPI2-XXX SSM4 COTA-CPI2

Exemplo 2: Expressão de tipo selvagem e Variantes CotA

Para expressar as variantes CotA, as construções de SSM foram transformadas na estirpe de expressão de E. coli BL21DE3. A uma densidade óptica a 550 nm de 0,4, as células foram induzidas através da adição de 1 mM de isopropil-β-ϋ-tiogalactopiranós °C durante 3 horas. Após a indução, 1 mL das células foram centrifugadas e ressuspensas em 50 pL de PSB (tampão da amostra de proteína), fervido durante 10 min e submetido a electroforese a 200 V durante 1 hora. A expressão foi confirmada correndo uma amostra de proteína num gel de SDS PAGE a 12%. Também foi demonstrada a sobre-expressão de CotA no clone JS6. A Figura 10 ilustra uma fotografia do gel mostrando a sobre-expressão de CotA no clone JS6. A Figura 11 ilustra uma fotografia de um gel que demonstra o rastreio de PCR de mutantes CotA utilizando o conjunto de iniciadores T7. A Figura 12 ilustra uma fotografia de um gel mostrando a sobre-expressão do mutante CotA utilizando clones SSMl. 33

Exemplo 3: Ensaio de ABTS de Tipo selvagem e Variantes de Mutantes de CotA A actividade de CotA de tipo selvagem e das variantes mutantes foi determinada utilizando um ensaio de 2,2'-azinobis(3-etilbenzotiazolina-6-sulfonato) (ABTS).

Resumidamente, foram incubados 45 pL dos lisados do tipo selvagem e do mutante CotA com 10 pL de substrato ABTS (2,0 mM) e 45 pL de solução salina tamponada com fosfato a IX (PBS) . A reacção foi seguida num leitor de placas de microtitulação de 96 poços utilizando um comprimento de onda de 415 nm a 37 °C. A reacção foi monitorizada durante um período de 1 hora (h) e representada utilizando o programa informático KaleidaGraph. Como esperado, o tipo selvagem tinha a reactividade mais elevada para o substrato ABTS quando comparada com a das variantes mutantes de CotA. A Figura 13 ilustra um gráfico que mostra que as variantes CotA (SSM4-1, SSMl-1, SSMl-3, SSM2-4 e SSM2-6) foram parcialmente inibidas pelas extensões e modificações de CotA. Na Figura 13, "wt" refere-se ao tipo selvagem, "1-1" refere-se a SSMl-1, "1-3" refere-se a SSMl-3, "2-4" refere-se a SSM2-4, "2-6" refere-se a SSM2-6, "3-1" refere-se a SSM3-1, "3-2" refere-se a SSM3-2 e "4-1" refere-se a SSM4-1. A actividade do mutante CotA, SSM4-1 foi parcialmente inibida como determinado pelo ensaio de ABTS, como mostrado no gráfico ilustrado na Figura 14. Contudo, a presença de sobrenadantes bacterianos de Streptococcus pyogenes e Enterococcus faecalis em ensaios semelhantes facilitou as reactivações do mutante SSM4-1 em aproximadamente três vezes. As proteases específicas dos sobrenadantes bacterianos clivam o domínio CPI2 do mutante SSM4-1, resultando na desrepressão do fenótipo inibidor. Os ensaios de ABTS foram realizados como 34 previamente descrito. Resumidamente, a mistura de controlo consiste em 10 pg de ABTS, 0,2 mM de CuS04, glicerol a 10%, 0,1% de detergente HECAMEG em solução salina tamponada com fosfato a lx. A mistura de reactivação consiste em 10 pL de ABTS (2,0 mM), 20 pL de sobrenadante de bactérias cultivadas, 0,2 mM de CuS04, glicerol a 10%, 0,1% de detergente hecameg em solução salina tamponada com fosfato a lx. As culturas bacterianas (S. pyogenes e E. faecalis) utilizadas neste ensaio foram cultivados, de um dia para o outro, em caldo de soja triptica (TSB).

Exemplo 4: Zimogénios Fortemente Ligados Com Péptidos

As enzimas sinal foram fortemente ligadas ou conjugadas a superfícies sólidas com uma variedade de péptidos. Exemplos de péptidos que foram utilizados com sucesso para ligar fortemente as enzimas sinal incluem: 1. SAP2, possuindo a sequência: ETKVEENEAIQK (também aqui referido como SEQ ID N°:21) 2. CIO, possuindo a sequência: VTLENTALARC (também aqui referido como SEQ ID N°: 22) 3. PAE8, possuindo a sequência: QADALHDQASALKC (também aqui referido como SEQ ID N°: 23) 4. CPI2, possuindo a sequência indicada em SEQ ID N°: 2 5. T2X, possuindo a sequência: KVSRRRRRGGDKVSRRRRRGGD (também aqui referido como SEQ ID N°: 24) SAP2 e CIO são específicos para Staphylococcus, PAE8 é específico para Pseudomonas, T2 é específico para E. coli e CPI2 é um péptido que interage com um largo espectro de patogéneos.

Além disso, foram também utilizados com sucesso vários péptidos 35 aleatórios com uma sequência de 10 aminoácidos variável para ligar fortemente enzimas sinal a superfícies sólidas. A conjugação de HRP com péptidos foi realizada através do reagente de ligação reticulada bi-funcional sulfo-SMCC. A reacção é um processo de dois passos, incluindo 1) formação de HRP-maleimida, seguido por 2) reacção com um péptido. Os conjugados de péptido-HRP produziram uma cor azul visível após serem hidrolisados a partir da superfície fortemente ligada. O protocolo geral para a conjugação foi:

Ligação do Péptido a Biodyne C

Foi dissolvido 1 mg de péptido em tampão de conjugação (MES pH 4,5). Foi adicionado 125 pL de 10 mg/mL EDC (proporção 5:1) e deixado reagir com membranas durante 2 horas de rotação à temperatura ambiente. As lavagens, à temperatura ambiente, foram realizadas durante 20 minutos com 40 mL de PBS+1% de glicerol e PBS.

Conjugação de HRP Maleimida

Foi dissolvido 2,5 mg de HRP da Roche em 500 pL de 1 M Na fosfato (pH de 7,4). Foi dissolvido Sulfo-SMCC em 50 pL de DMSO, e combinado com a HRP durante 20 minutos à temperatura ambiente. A separação foi realizada com Filtração em Gel em tampão de conjugação de maleimida. 36

Conjugação HRP-Péptido-Membrana

As fracções que eram isentas de sulfo-SMCC (~1 mL) foram combinadas com os discos de péptido-Biodyne e reagidas a ~4 °C de um dia para o outro com rotação. Foram realizadas várias lavagens, incluindo duas lavagens de 20 minutos com 100 mL de triton a 0,1% em PBS, seguido por duas lavagens de 20 minutos com solução de PEG 5000 a 0,1% e uma lavagem de 1 h em 250 mL de uma solução de sacarose a 10%, seguido por centrifugação sob vácuo durante a noite.

Exemplo 5: Ensaio de Zimogénios Fortemente Ligados

Podem ser utilizados zimogénios fortemente ligados numa abordagem de fase liquida ou uma abordagem de membrana de fluxo lateral. Na abordagem de membrana de fluxo lateral, o substrato marcado de forma detectável ou enzima repórter é capturado ou aderido com nitrocelulose liquida que é depositada na superfície de uma membrana de fluxo lateral para formar uma linha visível após a difusão da enzima repórter.

Uma linha de 1% de nitrocelulose altamente purificada em acetato de amilo (CAT#12620-50, de Electron Microscopy Science) misturada a uma proporção volumétrica de 1:1 com naftol foi depositada numa membrana. A membrana tinha cerca de 3 centímetros de comprimento. A concentração final na solução antes do depósito foi de 10 mg/mL de nitrocelulose e 20 mg/mL de naftol. Após a libertação da superfície do péptido fortemente ligado, uma CotA e enzima HRP migraram para baixo da superfície da Câmara de fluxo lateral. Após interacção com o naftol ligado à nitrocelulose depositada, uma linha azul escura formada em 37 apenas alguns bacteriano. segundos, indicando a presença do patogénio

Lisboa, 21 de Janeiro de 2011 38

Claims (1)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Dispositivo de teste, compreendendo: a) uma membrana; b) pelo menos um péptido ligado à membrana, compreendendo o péptido um substrato para uma enzima produzida por um microrganismo; c) uma enzima sinal ligada ao péptido; e d) pelo menos um substrato marcado de forma detectável ligado à membrana numa segunda localização, sendo o substrato marcado de forma detectável um alvo da enzima sinal. Lisboa, 21 de Janeiro de 2011 1