JP5089058B2 - 試料中の銅イオン濃度測定用酵素 - Google Patents
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Description
本発明は、少なくとも完全なホロ体ではない銅を補欠因子とする酵素、その製造法、及びそれを用いた試料中の銅イオン測定用試薬組成物と銅イオン濃度測定方法に関する。
銅はセルロプラスミン、スーパーオキサイドジスムターゼ、モノアミンオキシダーゼなど銅酵素の構成成分であり、ヒトにとって必須微量金属の一つである。ヒト血清銅または尿中銅の測定は、先天性の銅代謝異常、Ｗｉｌｓｏｎ病、胆道疾患、貧血の経過観察や治療効果の判定のために行われ、臨床意義が高い。
また、銅は過酸化物を産生するフェントン反応を触媒することから、近年、血清中の過剰な銅とアルツハイマー病の関係が報告され（非特許文献１）、血清中の銅イオン濃度の測定意義は益々高まってきている。
現在、ヒト体液中の銅イオン濃度測定は、（１）原子吸光法と（２）キレート剤を用いる方法（非特許文献２）が主流であり、その他に（３）フェニルエチルアミンオキシダーゼまたはヒスタミンオキシダーゼ（特許文献１）と（４）アポガラクトースオキシダーゼ（特許文献２）を用いる方法が報告されている。
ところが、（１）原子吸光法は特異性や感度が高い利点の反面、特別な測定機器が必要であり、また、この測定機器は多数の検体を短時間に測定することが困難である。（２）キレート剤を用いる方法は、試薬の安定性が高く、多数の検体を短時間に測定することが可能だが、コバルトやニッケルとも反応し、特異性に問題がある。（３）フェニルエチルアミンオキシダーゼまたはヒスタミンオキシダーゼを用いる方法と（４）アポガラクトースオキシダーゼを用いる方法は、特異性が高く多数の検体を短時間に測定することが可能だが、反応で生成する過酸化水素を、例えば４−アミノアンチピリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−トルイジン（ＴＯＯＳ）、およびペルオキシダーゼと反応させて得られる発色を測定する方法であり、使用する薬剤や酵素の種類が多くなり煩雑且つ不経済である。
上記のとおり、現状の銅イオン測定法は満足のいくものではなく、よりよい測定法の開発が望まれていた。
Squittiら、Excess of serum copper not related to ceruloplasmin in Alzheimer disease、2005年、64巻、1040-1046 Abeら、Direct Colorimetric Assay for Copper in Serum、Clinical Chemistry、1989年、35巻、552-554 特開平０９−１９１８９７号公報
特開平０８−２２４０９５号公報
また、銅は過酸化物を産生するフェントン反応を触媒することから、近年、血清中の過剰な銅とアルツハイマー病の関係が報告され（非特許文献１）、血清中の銅イオン濃度の測定意義は益々高まってきている。
現在、ヒト体液中の銅イオン濃度測定は、（１）原子吸光法と（２）キレート剤を用いる方法（非特許文献２）が主流であり、その他に（３）フェニルエチルアミンオキシダーゼまたはヒスタミンオキシダーゼ（特許文献１）と（４）アポガラクトースオキシダーゼ（特許文献２）を用いる方法が報告されている。
ところが、（１）原子吸光法は特異性や感度が高い利点の反面、特別な測定機器が必要であり、また、この測定機器は多数の検体を短時間に測定することが困難である。（２）キレート剤を用いる方法は、試薬の安定性が高く、多数の検体を短時間に測定することが可能だが、コバルトやニッケルとも反応し、特異性に問題がある。（３）フェニルエチルアミンオキシダーゼまたはヒスタミンオキシダーゼを用いる方法と（４）アポガラクトースオキシダーゼを用いる方法は、特異性が高く多数の検体を短時間に測定することが可能だが、反応で生成する過酸化水素を、例えば４−アミノアンチピリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−トルイジン（ＴＯＯＳ）、およびペルオキシダーゼと反応させて得られる発色を測定する方法であり、使用する薬剤や酵素の種類が多くなり煩雑且つ不経済である。
上記のとおり、現状の銅イオン測定法は満足のいくものではなく、よりよい測定法の開発が望まれていた。
Squittiら、Excess of serum copper not related to ceruloplasmin in Alzheimer disease、2005年、64巻、1040-1046 Abeら、Direct Colorimetric Assay for Copper in Serum、Clinical Chemistry、1989年、35巻、552-554
本発明の課題は、実用的に優れた、試料中の銅イオン測定用試薬組成物と銅イオン濃度測定方法を提供することである。また、該組成物と測定方法を提供するに際し、少なくとも完全なホロ体ではない銅を補欠因子とする酵素、及びその製造法を提供することも本発明が解決しようとする課題である。
本発明者らは、銅を補欠因子とする酵素であって、少なくとも完全なホロ体ではない酵素を銅イオン濃度測定用試薬組成物に用いることが出来れば、簡便且つ経済的であり、多数の検体を測定することが可能であり、コバルトやニッケルに対する特異性を有し、実用的に優れた測定方法が開発可能となると着想し、先ずは銅を補欠因子とする酵素であって、少なくとも完全なホロ体ではない酵素の製造方法を鋭意検討した結果、本発明の製造方法を見いだした。
次に、該酵素を用いて、汎用の吸光光度分析機や自動分析機にて試料中の銅イオン濃度を測定する簡便な方法を検討した結果、該酵素の酵素活性の変化を測定することにより、試料中の銅イオン濃度を測定できることを見いだした。
さらに、該酵素と該酵素の基質を含有する銅イオン濃度測定用試薬の組成を検討し、正確に試料中の銅イオン濃度を測定できる銅イオン濃度測定用試薬組成物を見出し、本発明を完成するに至った。即ち、本発明は、以下の構成に関する。
（１）銅を補欠因子とする酵素であって、少なくとも完全なホロ体ではないことを特徴とする酵素。
（２）銅を補欠因子とする酵素が少なくとも完全なホロ体でもアポ体でもない上記（１）に記載の酵素。
（３）銅を補欠因子とする酵素が、ビリルビンオキシダーゼ及び／又はラッカーゼである上記（１）又は（２）に記載の酵素。
（４）銅を補欠因子とする酵素が、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来のＣｏｔＡである上記（１）又は（２）に記載の酵素。
（５）銅を補欠因子とする酵素が、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）由来のＣｕｅＯである上記（１）又は（２）に記載の酵素。
（６）上記（１）〜（５）のいずれかに記載の少なくとも完全なホロ体ではない銅を補欠因子とする酵素の製造方法であって、遺伝子組み換え微生物により当該酵素を産生させることを特徴とする、少なくとも完全なホロ体ではない銅を補欠因子とする酵素の製造方法。
（７）少なくとも完全なホロ体ではない銅を補欠因子とする酵素の製造方法が、下記１）〜３）の工程を含む上記（６）に記載の酵素の製造方法。
１）窒素源を３％以下含み、かつ、銅を含まない培地にて、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来のＣｏｔＡまたは大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）由来のＣｕｅＯの遺伝子を導入した遺伝子組み換え微生物を培養する工程
２）１）で得られる、菌体内または培養液中に産生された完全なＣｏｔＡ又はＣｕｅＯのアポ体を精製する工程
３）精製されたアポ体の一部をホロ化する工程
（８）上記（１）〜（５）のいずれか１項に記載の酵素と該酵素の基質を含有することを特徴とする銅イオン濃度測定用試薬組成物。
（９）試料中の銅イオンに、請求項１〜５のいずれか１項に記載の酵素と該酵素の基質を作用させて、該酵素の活性の変化を測定することにより試料中の銅イオン濃度を測定することを特徴とする銅イオン濃度測定方法。
（１０）酵素が、アポ体に予め銅イオンを加えることにより一部ホロ化した少なくとも完全なホロ体ではない酵素である、上記（９）に記載の銅イオン濃度測定方法。
（１１）酵素が、ＣｏｔＡのアポ体(アポＣｏｔＡ)であって、添加する銅イオン濃度が、０．２５ｍｇ／ｍｌのアポＣｏｔＡに対して０．０１〜１μＭである上記（９）に記載の銅イオン濃度測定方法。
（１２）酵素が、ＣｕｅＯのアポ体（アポＣｕｅＯ）であって、添加する銅イオン濃度が、０．０１ｍｇ／ｍｌのアポＣｕｅＯに対して０．５〜２μＭである上記（９）に記載の銅イオン濃度測定方法。
（１３）試料中の銅イオン濃度が低い場合には、完全なホロ体ではない銅を補欠因子とする酵素を作用させる上記（９）に記載の銅イオン濃度測定方法。
（１４）試料中の銅イオン濃度が高い場合には、アポ体の銅を補欠因子とする酵素を作用させる上記（９）に記載の銅イオン濃度測定方法。
（１５）酵素の活性の変化を、基質の吸光度変化として測定する上記（９）に記載の銅イオン濃度測定方法。
次に、該酵素を用いて、汎用の吸光光度分析機や自動分析機にて試料中の銅イオン濃度を測定する簡便な方法を検討した結果、該酵素の酵素活性の変化を測定することにより、試料中の銅イオン濃度を測定できることを見いだした。
さらに、該酵素と該酵素の基質を含有する銅イオン濃度測定用試薬の組成を検討し、正確に試料中の銅イオン濃度を測定できる銅イオン濃度測定用試薬組成物を見出し、本発明を完成するに至った。即ち、本発明は、以下の構成に関する。
（１）銅を補欠因子とする酵素であって、少なくとも完全なホロ体ではないことを特徴とする酵素。
（２）銅を補欠因子とする酵素が少なくとも完全なホロ体でもアポ体でもない上記（１）に記載の酵素。
（３）銅を補欠因子とする酵素が、ビリルビンオキシダーゼ及び／又はラッカーゼである上記（１）又は（２）に記載の酵素。
（４）銅を補欠因子とする酵素が、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来のＣｏｔＡである上記（１）又は（２）に記載の酵素。
（５）銅を補欠因子とする酵素が、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）由来のＣｕｅＯである上記（１）又は（２）に記載の酵素。
（６）上記（１）〜（５）のいずれかに記載の少なくとも完全なホロ体ではない銅を補欠因子とする酵素の製造方法であって、遺伝子組み換え微生物により当該酵素を産生させることを特徴とする、少なくとも完全なホロ体ではない銅を補欠因子とする酵素の製造方法。
（７）少なくとも完全なホロ体ではない銅を補欠因子とする酵素の製造方法が、下記１）〜３）の工程を含む上記（６）に記載の酵素の製造方法。
１）窒素源を３％以下含み、かつ、銅を含まない培地にて、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来のＣｏｔＡまたは大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）由来のＣｕｅＯの遺伝子を導入した遺伝子組み換え微生物を培養する工程
２）１）で得られる、菌体内または培養液中に産生された完全なＣｏｔＡ又はＣｕｅＯのアポ体を精製する工程
３）精製されたアポ体の一部をホロ化する工程
（８）上記（１）〜（５）のいずれか１項に記載の酵素と該酵素の基質を含有することを特徴とする銅イオン濃度測定用試薬組成物。
（９）試料中の銅イオンに、請求項１〜５のいずれか１項に記載の酵素と該酵素の基質を作用させて、該酵素の活性の変化を測定することにより試料中の銅イオン濃度を測定することを特徴とする銅イオン濃度測定方法。
（１０）酵素が、アポ体に予め銅イオンを加えることにより一部ホロ化した少なくとも完全なホロ体ではない酵素である、上記（９）に記載の銅イオン濃度測定方法。
（１１）酵素が、ＣｏｔＡのアポ体(アポＣｏｔＡ)であって、添加する銅イオン濃度が、０．２５ｍｇ／ｍｌのアポＣｏｔＡに対して０．０１〜１μＭである上記（９）に記載の銅イオン濃度測定方法。
（１２）酵素が、ＣｕｅＯのアポ体（アポＣｕｅＯ）であって、添加する銅イオン濃度が、０．０１ｍｇ／ｍｌのアポＣｕｅＯに対して０．５〜２μＭである上記（９）に記載の銅イオン濃度測定方法。
（１３）試料中の銅イオン濃度が低い場合には、完全なホロ体ではない銅を補欠因子とする酵素を作用させる上記（９）に記載の銅イオン濃度測定方法。
（１４）試料中の銅イオン濃度が高い場合には、アポ体の銅を補欠因子とする酵素を作用させる上記（９）に記載の銅イオン濃度測定方法。
（１５）酵素の活性の変化を、基質の吸光度変化として測定する上記（９）に記載の銅イオン濃度測定方法。
本発明により、少なくとも完全なホロ体ではない銅を補欠因子とする酵素の製造法、該製造法によって得られる酵素、該酵素を用いた試料中の銅イオン濃度測定試薬組成物、及び該組成物を用いた試料中の銅イオン濃度測定方法を提供することができる。該銅イオン測定方法は、簡便且つ経済的であり、多数の検体を測定することが可能であり、コバルトやニッケルとの特異性を有する実用的に優れた測定方法である。
本明細書における「ホロ」または「ホロ体」は、タンパク質と補欠因子である金属の複合タンパク質において、その複合タンパク質を指し、「ホロ化」とは複合タンパク質を構成することを指す。また、以下において、「ホロ」または「ホロ体」を単に、ホロ体ということがある。
本明細書における「アポ」または「アポ体」は、タンパク質と補欠因子である金属の複合タンパク質において、そのタンパク質を指し、「アポ化」とはホロ体、すなわち、複合タンパク質から、補欠因子の金属とタンパク質に分離することを指す。また、以下において「アポ」または「アポ体」を単に「アポ体」ということがある。
本明細書における「完全なホロ体」とは、活性発現時に１又は複数の補欠因子を要求するタンパク質において、要求する補欠因子のすべてを備えている複合タンパク質をいい、「少なくとも完全なホロ体でない」とは、その要求する補欠因子が１以上不足している状態の複合タンパク質、又はアポ体を指す。
本明細書における「完全なホロ体でもアポ体でもない」とは、活性発現時に１又は複数の補欠因子を要求するタンパク質において、ホロ体から少なくとも補欠因子が１以上不足しているがアポ体ではない状態の複合タンパク質を指す。
本明細書における「ホロ体」、「アポ体」、および「少なくとも完全なホロ体ではない」を、ビリルビンオキシダーゼとラッカーゼを例に説明する。ビリルビンオキシダーゼやラッカーゼはそれらの立体構造が解析され、酵素１分子に対して４つの銅が配位する事が示されている（Martinsら、Molecular and biochemical characterization of a highly stable bacterial laccase that occurs as a structural component of the Bacillus subtilis endospore coat. J. Biol. Chem. 2002, 277, 18849-18859、又はKimら、Oxidation of phenolate siderophores by the multicopper oxidaase encoded by the Escherichia coli yacK gene. J. Bacteriol. 2001, 183, 4866-4875）。
ビリルビンオキシダーゼとラッカーゼの「ホロ体」は、それらの酵素１分子に対して４つの銅が配位している状態を指す。ビリルビンオキシダーゼとラッカーゼの「アポ体」は、それらの酵素１分子に対して銅が配位していない状態を指す。「少なくとも完全なホロ体ではない」ビリルビンオキシダーゼとラッカーゼは、それらの酵素１分子に対して０から３つの銅が配位している状態を指す。「完全なホロ体でもアポ体でもない」ビリルビンオキシダーゼとラッカーゼは、それらの酵素１分子に対して１から３つの銅が配位している状態を指す。
本明細書における試料中の「銅イオン」は、電荷を持った銅を指し、価数や対イオンによって限定されるものではない。
本発明で使用しうる試料とは、銅イオンを含有するものであれば特に限定されないが、銅イオンを含有する海水、天然水、飲料、廃液、研究用試料の他、生体試料、例えば、血漿、血清、尿などを挙げる事ができる。
本発明のビリルビンオキシダーゼ活性とは、酵素ハンドブック（朝倉書店、１９８４年）やEnzyme nomenclature detabase（http://ca.expasy.org/enzyme/）などに記載される既知のビリルビンオキシダーゼ（ＥＣ １．３．３．５）の触媒作用を指し、ビリルビンをその酸化物に変化する反応の触媒作用を例示するができる。
本発明のラッカーゼ活性とは、酵素ハンドブック（朝倉書店、１９８４年）やEnzyme nomenclature detabase（http://ca.expasy.org/enzyme/）などに記載される既知のラッカーゼ（ＥＣ １．１０．３．２）の触媒作用を指し、syringaldazine（以下、ＳＧＺということがある）、２'２−ａｚｉｎｏｂｉｓ−（３−ｅｔｈｙｌｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌｉｎｅ−６−ｓｕｌｆｏnic ａｃｉｄ）（以下、ＡＢＴＳということがある）、やDimethoxyphenol（以下、ＤＭＰということがある）をその酸化物に変化させる反応の触媒作用を例示するができる。
本明細書中に記載するタンパク質濃度は、バイオラッド社のプロテインアッセイキットを用いて使用説明書記載の方法に従って測定し、ＢＳＡ（牛血清アルブミン）をスタンダードとして算出した。
本明細書中に記載するタンパク質濃度は、バイオラッド社のプロテインアッセイキットを用いて使用説明書記載の方法に従って測定し、ＢＳＡ（牛血清アルブミン）をスタンダードとして算出した。
本発明の実験に使用した試薬類は、特に断らない限り、和光純薬工業社製、国産化学社製、シグマアルドリッチ社製など市販で容易に入手できるものである。
本発明における銅を補欠因子とする酵素は、その種類は特に限定されるものではなく、ビリルビンオキシダーゼやラッカーゼの他、アスコルビン酸オキシダーゼ（ＥＣ １．１０．３．３）やフェロオキシダーゼ（セルロプラスミン、ＥＣ １．１６．３．１）などマルチカッパーオキシダーゼファミリー（multi-copper oxidase family）などが例示されるが、特に好ましい態様としてラッカーゼが挙げられる。また、別の特に好ましい態様としてビリルビンオキシダーゼが挙げられる。例えば、枯草菌由来のＣｏｔＡはビリルビンオキシダーゼ（酒瀬川ら、Bilirubin oxidase activity of Bacillus subtilis CotA、Appl. Environ. Microbiol.2006, 72, 972-975）またはラッカーゼとして（Martinsら、Molecular and biochemical characterization of a highly stable bacterial laccase that occurs as a structural component of the Bacillus subtilis endospore coat. J. Biol. Chem. 2002, 277, 18849-18859.）、大腸菌由来のアポＣｕｅＯはラッカーゼとして報告されている（Kimら、Oxidation of phenolate siderophores by the multicopper oxidaase encoded by the Escherichia coli yacK gene. J. Bacteriol. 2001, 183, 4866-4875）。
本発明におけるビリルビンオキシダーゼ活性及び／又はラッカーゼ活性を有する酵素は、その起源は特に限定されるものではないが、好適には枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、ＡＴＣＣ ２３８５７）由来のＣｏｔＡ、または大腸菌 （Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、大腸菌）Ｋ−１２株由来のＣｕｅＯ(別名ＹａｃＫ)が用いられる。
本発明における枯草菌由来の少なくとも完全なホロ体ではないＣｏｔＡまたは大腸菌由来の少なくとも完全なホロ体ではないＣｕｅＯは、枯草菌または大腸菌を適当な栄養培地で培養して菌体内または培養液中に産生された該酵素を常法にて分離精製して得ることができる。
また、枯草菌由来の少なくとも完全なホロ体ではないＣｏｔＡまたは大腸菌由来の少なくとも完全なホロ体ではないＣｕｅＯの遺伝子を導入した遺伝子組み換え微生物を培養して、菌体内または培養液中に産生された該酵素を、常法にて分離精製して得ることが好適である。
また、枯草菌由来の少なくとも完全なホロ体ではないＣｏｔＡまたは大腸菌由来の少なくとも完全なホロ体ではないＣｕｅＯの遺伝子を導入した遺伝子組み換え微生物を培養して、菌体内または培養液中に産生された該酵素を、常法にて分離精製して得ることが好適である。
本発明における枯草菌由来の少なくとも完全なホロ体ではないＣｏｔＡを構成するアミノ酸配列は、具体的には、配列表配列番号１のアミノ酸配列の１から５１５で表される（Martinsら、Molecular and biochemical characterization of a highly stable bacterial laccase that occurs as a structural component of the Bacillus subtilis endospore coat. J. Biol. Chem. 2002, 277, 18849-18859.、又は酒瀬川ら、Bilirubin oxidase activity of Bacillus subtilis CotA）が、配列番号１のアミノ酸配列の１から５１５で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドによる酵素活性発現と同様の効果を発現する、配列番号１のアミノ酸配列の１から５１５のアミノ酸配列の一部から実質的になるアミノ酸配列や、酵素活性発現に関与しない一部のアミノ酸の配列を変異、欠損または付加したもの、及びその均等物も含まれる。
配列番号１のアミノ酸配列１から５１５で表されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡは、そのＮ末端側およびＣ末端側のアミノ酸残基またはポリペプチド残基を含めたアミノ酸配列の各アミノ酸に対応する一連のコドンのうちいずれか１個のコドンからなるＤＮＡであれば良い。また、配列番号１のアミノ酸配列の１から５１５で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドによる酵素活性発現と同様の効果を発現する、配列番号１のアミノ酸配列の１から５１５のアミノ酸配列の一部から実質的になるアミノ酸配列や酵素活性発現に関与しない一部のアミノ酸の配列を変異、欠損または付加したもの、及びその均等物をコードするＤＮＡも、そのＮ末端側およびＣ末端側のアミノ酸残基またはポリペプチド残基を含めたアミノ酸配列の各アミノ酸に対応する一連のコドンのうちいずれか１個のコドンからなるＤＮＡであれば良い。
本発明における大腸菌由来の完全なホロ体でもアポ体でもないＣｕｅＯを構成するアミノ酸配列は、配列表配列番号２のアミノ酸配列の１から５１６で表されるが、配列番号２のアミノ酸配列の１から５１６で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドによる酵素活性発現と同様の効果を発現する、配列番号２のアミノ酸配列の１から５１６のアミノ酸配列の一部から実質的になるアミノ酸配列や酵素活性発現に関与しない一部のアミノ酸の配列を変異、欠損または付加したもの、及びその均等物も含まれる。
配列番号２のアミノ酸配列１から５１６で表されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡは、そのＮ末端側およびＣ末端側のアミノ酸残基またはポリペプチド残基を含めたアミノ酸配列の各アミノ酸に対応する一連のコドンのうちいずれか１個のコドンからなるＤＮＡであれば良い。また、配列番号２のアミノ酸配列の１から５１６で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドによる酵素活性発現と同様の効果を発現する、配列番号２のアミノ酸配列の１から５１６のアミノ酸配列の一部から実質的になるアミノ酸配列や酵素活性発現に関与しない一部のアミノ酸の配列を変異、欠損または付加したもの、及びその均等物をコードするＤＮＡも、そのＮ末端側およびＣ末端側のアミノ酸残基またはポリペプチド残基を含めたアミノ酸配列の各アミノ酸に対応する一連のコドンのうちいずれか１個のコドンからなるＤＮＡであれば良い。
本発明の「アポＣｏｔＡ」や「アポＣｕｅＯ」等の「銅を補欠因子とする酵素のアポ体」の大変に好適な製造方法として、銅を含まない培地にて培養して完全なアポ体を製造する方法を見出した。例えば、「銅を補欠因子とする酵素」の遺伝子を導入した遺伝子組み換え微生物を、銅を含まない培地にて培養して、菌体内及び／又は培養液中に産生された「銅を補欠因子とする酵素のアポ体」を、常法にて分離精製して得る方法が好適な例として挙げられる。
銅を含まない培地として、実施例１と３に示すＭ９−グルコース培地が例示できる。Ｍ９−グルコース培地で「銅を補欠因子とする酵素」の遺伝子を導入した遺伝子組み換え微生物を培養した場合、微生物の成育が「アポＣｏｔＡ」や「アポＣｕｅＯ」等の「銅を補欠因子とする酵素のアポ体」の製造のためには不適当な場合がある。その場合はＭ９−グルコース培地に窒素源を少量添加すると、微生物の成育が改善され、銅を補欠因子とする酵素のアポ体が効率よく得られる場合がある。窒素源としては利用可能な窒素化合物であれば良く、例えばペプトン、肉エキス、酵母エキス、カザミノ酸などが使用されるが、窒素源中に混在する銅の量が少ないものが望ましい。Ｍ９−グルコース培地に添加する窒素源の量は３％以下が好ましく、１％以下は更に好ましい。最も好ましくは約０．５％である。
銅を含まない培地として、実施例１と３に示すＭ９−グルコース培地が例示できる。Ｍ９−グルコース培地で「銅を補欠因子とする酵素」の遺伝子を導入した遺伝子組み換え微生物を培養した場合、微生物の成育が「アポＣｏｔＡ」や「アポＣｕｅＯ」等の「銅を補欠因子とする酵素のアポ体」の製造のためには不適当な場合がある。その場合はＭ９−グルコース培地に窒素源を少量添加すると、微生物の成育が改善され、銅を補欠因子とする酵素のアポ体が効率よく得られる場合がある。窒素源としては利用可能な窒素化合物であれば良く、例えばペプトン、肉エキス、酵母エキス、カザミノ酸などが使用されるが、窒素源中に混在する銅の量が少ないものが望ましい。Ｍ９−グルコース培地に添加する窒素源の量は３％以下が好ましく、１％以下は更に好ましい。最も好ましくは約０．５％である。
また、本発明の「アポＣｏｔＡ」や「アポＣｕｅＯ」等の「銅を補欠因子とする酵素のアポ体」の製造方法として、常法にて得られるホロ体を適切な条件下、アポ化する方法も好適な方法として挙げられる。
また、本発明の「少なくとも完全なホロ体ではないＣｏｔＡ」や「少なくとも完全なホロ体ではないＣｕｅＯ」等の「銅を補欠因子とする酵素であって、少なくとも完全なホロ体ではない酵素」の大変に好適な製造方法として、前記で得た「銅を補欠因子とする酵素のアポ体」に、適量の銅を添加して作成する方法を見出した。銅の添加量は、０．２５ｍｇ／ｍｌのアポＣｏｔＡに対して０．０１〜１μＭ、更に好ましくは０．０５〜０．５μＭ、最も好ましくは０．０５〜０．２μＭであり、０．０１ｍｇ／ｍｌのアポＣｕｅＯに対して０．１〜１０μＭ、更に好ましくは０．５〜５μＭ、最も好ましくは０．５〜２μＭと同等のモル比になるように添加すればよい。アポＣｏｔＡ、またはアポＣｕｅＯと銅イオンを混合する場合は、アポＣｏｔＡ、またはアポＣｕｅＯと銅イオンのモル比が上記の範囲から局所的に逸脱しないように、適宜攪拌や希釈等をするなど、アポＣｏｔＡ、またはアポＣｕｅＯと銅イオンの偏在を避ける工夫をすることは言うまでもない。
また、本発明の「少なくとも完全なホロ体ではないＣｏｔＡ」や「少なくとも完全なホロ体ではないＣｕｅＯ」等の「少なくとも完全なホロ体ではない銅を補欠因子とする酵素」の製造方法として、常法にて得られるホロ体を適切な条件下、部分的にアポ化する方法も好適な方法として挙げられる。
さらには、完全にはホロ体にならない程度に適量の銅を含む培地にて菌体を培養して、菌体内及び／又は培養液中に産生された「少なくとも完全なホロ体ではない銅を補欠因子とする酵素」を、常法にて分離精製して得る方法も好適な方法として挙げられる。
本発明に用いることができる枯草菌由来のＣｏｔＡまたは大腸菌由来のＣｕｅＯ等に代表される銅を補欠因子とする酵素をコードするＤＮＡを組み込むベクターは、組み換えＤＮＡが安定かつ自律的に増殖可能であれば特に限定しないが、宿主微生物体内で自律的に増殖しうるファージまたはプラスミドから遺伝子組み換え用として構築されたものが適している。プラスミドを移入する宿主微生物としては、組み換えＤＮＡが安定かつ自律的に増殖可能であればよく、好適な例としては大腸菌、枯草菌が挙げられる。形質転換微生物の培養条件はその栄養生理的性質を考慮して培養条件を選択すれば良い。
枯草菌由来の少なくとも完全なホロ体ではないＣｏｔＡまたは大腸菌由来の少なくとも完全なホロ体ではないＣｕｅＯはその菌体内及び／又は菌体外に含有、蓄積されており、その菌体内及び／又は培養液から抽出すれば得ることができる。
菌体内からの抽出法は、リゾチーム処理、超音波処理、フレンチプレス処理、ダイノミル処理などの菌体破砕手段を適宜選択組み合わせることができる。枯草菌由来の少なくとも完全なホロ体ではないＣｏｔＡまたは大腸菌由来の少なくとも完全なホロ体ではないＣｕｅＯの精製酵素を得る方法は、例えば、粗製の酵素液にアセトン、メタノール、エタノールなどの有機溶媒による分別沈殿法、硫酸アンモニウム、食塩などによる塩析法、等電点沈殿法や、イオン交換体、ゲル濾過剤、吸着体などを用いるカラムクロマトグラフィー法などが挙げられ、これらの方法を適当に組み合わせるのが通常である。
本発明において、少なくとも完全なホロ体ではないＣｏｔＡまたは完全なホロ体でもアポ体でもないＣｕｅＯを試料中の銅イオンと作用させ、該酵素の活性の変化を測定する際に用いる該酵素の基質は、酵素ハンドブック（朝倉書店（１９８４年））やＥｎｚｙｍｅ ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ ｄｅｔａｂａｓｅ（http://ca.expasy.org/enzyme/）などに記載される既知のビリルビンオキシダーゼやラッカーゼの基質であれば特に限定されないが、好適にはＳＧＺ、ＡＢＴＳやＤＭＰが挙げられる。
また、ＣｏｔＡまたはＣｕｅＯによる、４−アミノアンチピリンや３−メチル−２−ベンゾチアゾリンヒドラシゾンなどのカップラーとクロロフェノール等のフェノール類またはＴＯＯＳやＮ，Ｎ−ジメチルアニリンなどのアニリン類およびそれらの誘導体などの色原体を縮合反応の基質としてもよい。
また、ＣｏｔＡまたはＣｕｅＯによる、４−アミノアンチピリンや３−メチル−２−ベンゾチアゾリンヒドラシゾンなどのカップラーとクロロフェノール等のフェノール類またはＴＯＯＳやＮ，Ｎ−ジメチルアニリンなどのアニリン類およびそれらの誘導体などの色原体を縮合反応の基質としてもよい。
本発明の銅イオン濃度測定用試薬組成物は、少なくとも、銅イオンを補欠因子とする酵素であって少なくとも完全なホロ体ではない酵素、及び該酵素の基質を含有する。銅イオンを補欠因子とする酵素であって少なくとも完全なホロ体ではない酵素は、好適には少なくとも完全なホロ体ではないビリルビンオキシダーゼまたは少なくとも完全なホロ体ではないラッカーゼが挙げられ、更に好ましくは枯草菌由来の少なくとも完全なホロ体ではないＣｏｔＡ、または大腸菌由来の少なくとも完全なホロ体ではないＣｕｅＯが挙げられ、最も好ましくは枯草菌由来の少なくとも完全なホロ体ではないＣｏｔＡ、または大腸菌由来の完全なホロ体でもアポ体でもないＣｕｅＯが挙げられる。
本発明の銅イオン濃度測定用試薬組成物における酵素の濃度は、試料中の銅イオン濃度を精度良く測定できる量であれば良く、好ましくは０．０００５から５ｍｇ／ｍｌ、更に好ましくは０．００１から１ｍｇ／ｍｌとなるように調整される。
本発明の銅イオン濃度測定用試薬組成物における基質の濃度は、試料中の銅イオン濃度測定に支障をきたさない限り特に限定しないが、好ましくは５から５０ｍＭ、更に好ましくは５から２０ｍＭとなるように調整される。
（なお、前記酵素及び基質の濃度は、銅イオン濃度測定用試薬組成物における濃度を示している。）
（なお、前記酵素及び基質の濃度は、銅イオン濃度測定用試薬組成物における濃度を示している。）
本発明の銅イオン濃度測定用試薬組成物のｐＨは、試料中の銅イオン濃度測定に支障をきたさない限り特に限定しないが、好ましくは緩衝液によりｐＨ４から８、更に好ましくはｐＨ４から６、最も好ましくはｐＨ４から５である。また、緩衝液の種類は目的のｐＨを保つことができ、かつ銅イオン濃度の測定に支障をきたさない限り特に限定しないが、グッド緩衝液、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液が例示できる。緩衝液の濃度は目的のｐＨを保つことができ、かつ銅イオン濃度の測定に支障をきたさない限り特に限定しないが、好ましくは５〜５００ｍＭ、更に好ましくは１０〜２００ｍＭである。
本発明の銅イオン濃度測定用試薬組成物には必要により、界面活性剤、防腐剤、安定化剤、塩などを添加しても良い。界面活性剤としては目的に応じて非イオン性、陽イオン性、又は陰イオン性の界面活性剤を単独または混合して用いることができる。防腐剤としては防腐効果があるものであれば特に限定されないがアジ化ナトリウム、抗生物質、又はナリジクス酸などを単独または混合して用いることができる。安定化剤としては、組成物を安定化するものであれば特に限定されないが、グルコース、トレハロース、シクロデキストリン等の糖類、アミノ酸類、アルブミンなどのタンパク質、又は有機溶媒を単独または混合して用いることができる。塩としては、塩化ナトリウム、塩化カリウム、又は硫酸アンモニアなどを単独または混合して用いることができる。
本発明の銅イオン濃度測定用試薬組成物に、枯草菌由来のアポＣｏｔＡ、または大腸菌由来のアポＣｕｅＯを使用した場合、測定の精度や感度を向上させるために、予め銅イオンを組成物に添加し、アポＣｏｔＡ、またはアポＣｕｅＯを少なくとも完全なホロ体ではない状態にして使用することができる。添加する銅イオン濃度は精度を向上でき、かつ試料中の銅イオン濃度の測定に支障をきたさない限り特に限定しないが、好ましくは０．２５ｍｇ／ｍｌのアポＣｏｔＡに対して０．０１〜１μＭ、更に好ましくは０．０５〜０．５μＭ、最も好ましくは０．０５〜０．２μＭであり、０．０１ｍｇ／ｍｌのアポＣｕｅＯに対して０．１〜１０μＭ、更に好ましくは０．５〜５μＭ、最も好ましくは０．５〜２μＭと同等のモル比になるように添加すればよい。アポＣｏｔＡ、またはアポＣｕｅＯと銅イオンを混合する場合は、アポＣｏｔＡ、またはアポＣｕｅＯと銅イオンのモル比が上記の範囲から局所的に逸脱しないように、適宜攪拌や希釈等をするなど、アポＣｏｔＡ、またはアポＣｕｅＯと銅イオンの偏在を避ける工夫をすることは言うまでもない。
本発明の銅イオン濃度測定用試薬組成物に、人工電子受容体を必要に応じて添加することができる。人工電子受容体としては、フェナジンメトサルフェイト、フェナジンエトサルフェイト、メトキサチン、１，４，ベンゾキノン、２、３，ジメトキシ，５，メチル，１,４，ベンゾキノン、２，６，ジメチル，１、４，ベンゾキノン、２、６，ジクロロ，１、４，ベンゾキノン、１，２，ナフトキノン、１，２，ナフトキノン，４，スルホン酸）、Ｋ３Ｆｅ（ＣＮ）６、Ｎ、Ｎ，ジメチル，ｐ，フェニレンジアミン、又はＮ，Ｎ，Ｎ，Ｎ，テトラメチル，ｐ，フェニレンジアミンジハイドロクロライドなどが挙げられる。
本発明の銅イオン濃度測定用試薬組成物に、枯草菌由来の少なくとも完全なホロ体でないＣｏｔＡ、または大腸菌由来の少なくとも完全なホロ体でないＣｕｅＯを使用した場合、他の金属イオンの干渉を避ける、または軽減するために、キレート剤をマスキング剤として添加することができる。添加するキレート剤は銅イオン濃度の測定精度を向上でき、かつ試料中の銅イオン濃度の測定に支障をきたさない限り特に限定しないが、銅に対するキレート安定度定数が低いキレート剤が望ましい。
本発明の銅イオン濃度測定用試薬組成物は一試薬の組成物としてもよいが、試薬の安定性向上や測定精度向上などを目的とするなどの必要に応じて、二試薬以上に分離してもよい。例えば、銅を含む試薬の場合は、酵素と基質を分離して２試薬とし、また、銅を含まない試薬の場合は、基質と酵素を共存させた一試薬とすることができる。
本発明の銅イオン濃度測定用試薬組成物は液状品、液状品の凍結物、液状品の凍結乾燥品、又は液状品の乾燥品（加熱乾燥及び／又は風乾及び／又は減圧乾燥等による）として提供できる。液状品、液状品の凍結物、液状品の凍結乾燥品が好ましく、液状品、液状品の凍結乾燥品がより好ましく、液状品が最も好ましい。別の態様として、液状品の凍結物が好ましい場合もある。さらに別の態様としては、液状品の凍結乾燥が好ましい場合もある。
枯草菌由来の少なくとも完全なホロ体ではないＣｏｔＡ、ホロ体のＣｏｔＡ、大腸菌由来の少なくとも完全なホロ体ではないＣｕｅＯ、およびホロ体のＣｕｅＯは、安定化剤の非存在下においても高い安定性をもつので、本発明の銅イオン濃度測定用試薬組成物にこれらの酵素を使用した場合、液状で保存できる試薬とすることが容易である。
本発明の銅イオン濃度測定方法では、銅イオンを含有するまたは含有すると予想される試料を、銅イオンを補欠因子とする酵素であって少なくとも完全なホロ体ではない酵素及び該酵素の基質を含有する組成物に作用させ、試料中の銅イオン濃度に比例して認められる銅イオンを補欠因子とする酵素の活性化に伴い変化する基質の変化を、公知の方法で測定する。
一般的には基質の変化に伴うそれら基質の吸収スペクトルや吸光強度の変化を測定する光学的方法が例示され、例えば、ＡＢＴＳ、ＳＧＺやＤＭＰの酸化に伴う吸収スペクトルや特定波長における吸光強度の変化を測定する方法が挙げられる。
また、４−アミノアンチピリンや３−メチル−２−ベンゾチアゾリンヒドラシゾンなどのカップラーとクロロフェノール等のフェノール類またはＴＯＯＳやＮ，Ｎ−ジメチルアニリンなどのアニリン類およびそれらの誘導体などの色原体との縮合反応に伴う吸収スペクトルや特定波長における吸光強度の変化を利用してもよい。
消費する酸素を測定する場合は酸素電極を利用する。
一般的には基質の変化に伴うそれら基質の吸収スペクトルや吸光強度の変化を測定する光学的方法が例示され、例えば、ＡＢＴＳ、ＳＧＺやＤＭＰの酸化に伴う吸収スペクトルや特定波長における吸光強度の変化を測定する方法が挙げられる。
また、４−アミノアンチピリンや３−メチル−２−ベンゾチアゾリンヒドラシゾンなどのカップラーとクロロフェノール等のフェノール類またはＴＯＯＳやＮ，Ｎ−ジメチルアニリンなどのアニリン類およびそれらの誘導体などの色原体との縮合反応に伴う吸収スペクトルや特定波長における吸光強度の変化を利用してもよい。
消費する酸素を測定する場合は酸素電極を利用する。
本発明の銅イオン濃度測定方法の一例として、反応槽中の試料に、本発明の銅イオン濃度測定用試薬組成物を混和して２０から５０℃で０から１５分間、好ましくは、３７℃で５分間の反応で基質を酸化してその変化を測定する方法が挙げられる。
以下、本発明の実施例を詳しく述べるが、本発明は何らこれらにより限定されるものではない。
［参考例１］枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、ＡＴＣＣ ２３８５７）の培養
枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、ＡＴＣＣ ２３８５７）はＡＴＣＣの製品案内書に従い次のように培養した。１Ｌあたり、ニュートリエントブロス２３ｇ、ポテト抽出液２０ｍｌを添加した培地をオートクレーブ滅菌（１２１℃、１５分）して枯草菌を接種し、２６℃で好気的に３２時間培養した。培養終了後、培養物を７，０００ｒｐｍで１０分間遠心し集菌した。
［参考例１］枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、ＡＴＣＣ ２３８５７）の培養
枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、ＡＴＣＣ ２３８５７）はＡＴＣＣの製品案内書に従い次のように培養した。１Ｌあたり、ニュートリエントブロス２３ｇ、ポテト抽出液２０ｍｌを添加した培地をオートクレーブ滅菌（１２１℃、１５分）して枯草菌を接種し、２６℃で好気的に３２時間培養した。培養終了後、培養物を７，０００ｒｐｍで１０分間遠心し集菌した。
［参考例２］ＰＣＲ法による配列表配列番号１で表される遺伝子の増幅
参考例１の菌体から常法に従いＤＮＡを抽出した（Sambrook, J., Fritsch, E. F., and T. Maniatis. 1989. Molecular cloning: A laboratory manual, 2nd Ed. p. 9.14-9.23. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.）。次に、ＰＣＲ法により配列表配列番号１で表される遺伝子を増幅した。ＰＣＲの各条件は以下のとおりである。
＜ＰＣＲに用いたプライマー＞
アンチセンス鎖用
５’−TCA TGT AGA TCT TGT GTG AGC ATA AAA AGC AGC TCC−３’（配列番号３）
センス鎖用
５’−CTA TAG TAC TAG TTT GGA AAA TTT AG−３’（配列番号４）
＜ＰＣＲ反応溶液組成＞
ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ １μｌ
１０倍濃縮のＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼに添付の緩衝液 ５μｌ
１ｍＭ 塩化マグネシウム ２μｌ
０．２ｍＭ ｄＮＴＰ ７．５μｌ
１μｇ／ｍｌ 枯草菌（ＡＴＣＣ ２３８５７）のＤＮＡ １０μｌ
１０ｐｍｏｌ／μｌ センスプライマー ５μｌ
１０ｐｍｏｌ／μｌアンチセンスプライマー ５μｌ
蒸留水 １４．５μｌ
＜ＰＣＲ反応条件＞
（１）９８℃ １５秒
（２）６５℃ ２０秒
（３）７４℃ ３０秒
上記（１）〜（３）を３０回繰り返した。
参考例１の菌体から常法に従いＤＮＡを抽出した（Sambrook, J., Fritsch, E. F., and T. Maniatis. 1989. Molecular cloning: A laboratory manual, 2nd Ed. p. 9.14-9.23. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.）。次に、ＰＣＲ法により配列表配列番号１で表される遺伝子を増幅した。ＰＣＲの各条件は以下のとおりである。
＜ＰＣＲに用いたプライマー＞
アンチセンス鎖用
５’−TCA TGT AGA TCT TGT GTG AGC ATA AAA AGC AGC TCC−３’（配列番号３）
センス鎖用
５’−CTA TAG TAC TAG TTT GGA AAA TTT AG−３’（配列番号４）
＜ＰＣＲ反応溶液組成＞
ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ １μｌ
１０倍濃縮のＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼに添付の緩衝液 ５μｌ
１ｍＭ 塩化マグネシウム ２μｌ
０．２ｍＭ ｄＮＴＰ ７．５μｌ
１μｇ／ｍｌ 枯草菌（ＡＴＣＣ ２３８５７）のＤＮＡ １０μｌ
１０ｐｍｏｌ／μｌ センスプライマー ５μｌ
１０ｐｍｏｌ／μｌアンチセンスプライマー ５μｌ
蒸留水 １４．５μｌ
＜ＰＣＲ反応条件＞
（１）９８℃ １５秒
（２）６５℃ ２０秒
（３）７４℃ ３０秒
上記（１）〜（３）を３０回繰り返した。
［参考例３］枯草菌ＣｏｔＡ発現プラスミドの構築
参考例２で得られた増幅されたＰＣＲ産物を、ＳｐｅＩとＢｇ１IIで切断して精製し、これをｐＥＴ−２１ａ（＋）のＮｈｅＩとＢａｍＨＩの切断部位に挿入し、枯草菌ＣｏｔＡ遺伝子が連結されたプラスミドを構築した。構築されたプラスミドを、常法によって大腸菌 ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換した。
参考例２で得られた増幅されたＰＣＲ産物を、ＳｐｅＩとＢｇ１IIで切断して精製し、これをｐＥＴ−２１ａ（＋）のＮｈｅＩとＢａｍＨＩの切断部位に挿入し、枯草菌ＣｏｔＡ遺伝子が連結されたプラスミドを構築した。構築されたプラスミドを、常法によって大腸菌 ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換した。
［参考例４］形質転換大腸菌の培養とその細胞抽出液の調製
参考例３で得られたプラスミドを導入した大腸菌 ＢＬ２１（ＤＥ３）を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地（Ｄｉｆｃｏ社製）に接種し、培養液の６００ｎｍの吸光度が０．６になったときにｌａｃプロモーター誘導剤である１ｍＭのイソプロピル−β−Ｄ（−）−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加した。その後、２２℃でさらに１８時間培養し、遠心分離（１５，０００Ｇ、１分、４℃）により集菌し、２５ｐｐｍの塩化銅を含む１０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）で懸濁して超音波破砕機を用いて菌体を破砕した後、遠心分離（１５，０００Ｇ、５分、４℃）し、上清を取得して細胞抽出液とした。
参考例３で得られたプラスミドを導入した大腸菌 ＢＬ２１（ＤＥ３）を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地（Ｄｉｆｃｏ社製）に接種し、培養液の６００ｎｍの吸光度が０．６になったときにｌａｃプロモーター誘導剤である１ｍＭのイソプロピル−β−Ｄ（−）−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加した。その後、２２℃でさらに１８時間培養し、遠心分離（１５，０００Ｇ、１分、４℃）により集菌し、２５ｐｐｍの塩化銅を含む１０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）で懸濁して超音波破砕機を用いて菌体を破砕した後、遠心分離（１５，０００Ｇ、５分、４℃）し、上清を取得して細胞抽出液とした。
［参考例５］枯草菌由来ＣｏｔＡの精製
参考例４で得られた細胞抽出液を、７５℃で６０分間熱処理して、そのまま１０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）で平衡化したＱ ｓｅｐ．ＢＢ（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）に吸着させた。１０ｍＭのトリス，塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）で充分に洗浄した後、０から０．５Ｍの塩化カリウムを含む１０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）を用いたリニアグラジェントにて溶出した。ＣｏｔＡ画分に最終濃度２５％になるように硫酸アンモニウム添加し、２５％の硫酸アンモニウムを含む１０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化したＰｈｅｎｙｌ ｓｅｐ．ＦＦ（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）に吸着して２５から０％の硫酸アンモニウムを含む１０ｍＭのトリス，塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）を用いたリニアグラジェントにて溶出した。ＣｏｔＡ画分はＧ−２５（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）で脱塩した後、１０ｍＭのトリス，塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）で平衡化したＱ ｓｅｐ．ＨＰ（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）に吸着し、０から０．５Ｍの塩化カリウムを含む１０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）を用いたリニアグラジェントにて溶出した。ＣｏｔＡ画分を１０ｍＭのリン酸緩衝液ｐＨ７．０で平衡化したＧ−２５で脱塩して精製酵素とし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで単一バンドである事を確認した。
参考例４で得られた細胞抽出液を、７５℃で６０分間熱処理して、そのまま１０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）で平衡化したＱ ｓｅｐ．ＢＢ（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）に吸着させた。１０ｍＭのトリス，塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）で充分に洗浄した後、０から０．５Ｍの塩化カリウムを含む１０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）を用いたリニアグラジェントにて溶出した。ＣｏｔＡ画分に最終濃度２５％になるように硫酸アンモニウム添加し、２５％の硫酸アンモニウムを含む１０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化したＰｈｅｎｙｌ ｓｅｐ．ＦＦ（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）に吸着して２５から０％の硫酸アンモニウムを含む１０ｍＭのトリス，塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）を用いたリニアグラジェントにて溶出した。ＣｏｔＡ画分はＧ−２５（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）で脱塩した後、１０ｍＭのトリス，塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）で平衡化したＱ ｓｅｐ．ＨＰ（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）に吸着し、０から０．５Ｍの塩化カリウムを含む１０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）を用いたリニアグラジェントにて溶出した。ＣｏｔＡ画分を１０ｍＭのリン酸緩衝液ｐＨ７．０で平衡化したＧ−２５で脱塩して精製酵素とし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで単一バンドである事を確認した。
［実施例１］枯草菌由来アポＣｏｔＡの製造（１）
参考例３のプラスミドを導入した大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンと０．５％グルコースを含み、銅を含まないＭ９培地（Ｄｉｆｃｏ社製）に接種し、培養液の６００ｎｍの吸光度が０．４になったときに１ｍＭのＩＰＴＧを添加した。その後、２２℃でさらに１８時間培養し、遠心分離（１５，０００Ｇ、１分、４℃）により集菌し、１０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）で懸濁して超音波破砕機を用いて菌体を破砕した後、遠心分離（１５，０００Ｇ、５分、４℃）し、上清を取得して細胞抽出液とした。この細胞抽出液は、参考例５記載の方法で精製し、枯草菌由来アポＣｏｔＡの精製酵素を得た。
参考例３のプラスミドを導入した大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンと０．５％グルコースを含み、銅を含まないＭ９培地（Ｄｉｆｃｏ社製）に接種し、培養液の６００ｎｍの吸光度が０．４になったときに１ｍＭのＩＰＴＧを添加した。その後、２２℃でさらに１８時間培養し、遠心分離（１５，０００Ｇ、１分、４℃）により集菌し、１０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）で懸濁して超音波破砕機を用いて菌体を破砕した後、遠心分離（１５，０００Ｇ、５分、４℃）し、上清を取得して細胞抽出液とした。この細胞抽出液は、参考例５記載の方法で精製し、枯草菌由来アポＣｏｔＡの精製酵素を得た。
［実施例２］枯草菌由来アポＣｏｔＡの製造（２）
参考例３のプラスミドを導入した大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を５０μｇ／ｍｌのアンピシリン、０．５％グルコースおよび０．５％カザミノ酸を含み、銅を含まないＭ９培地に接種し、培養液の６００ｎｍの吸光度が０．４になったときに１ｍＭのＩＰＴＧを添加した。その後、２２℃でさらに１８時間培養し、遠心分離（１５，０００Ｇ、１分、４℃）により集菌し、１０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）で懸濁して超音波破砕機を用いて菌体を破砕した後、遠心分離（１５，０００Ｇ、５分、４℃）し、上清を取得して細胞抽出液とした。この細胞抽出液は、参考例５記載の方法で精製し、枯草菌由来アポＣｏｔＡの精製酵素を得た。
参考例３のプラスミドを導入した大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を５０μｇ／ｍｌのアンピシリン、０．５％グルコースおよび０．５％カザミノ酸を含み、銅を含まないＭ９培地に接種し、培養液の６００ｎｍの吸光度が０．４になったときに１ｍＭのＩＰＴＧを添加した。その後、２２℃でさらに１８時間培養し、遠心分離（１５，０００Ｇ、１分、４℃）により集菌し、１０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）で懸濁して超音波破砕機を用いて菌体を破砕した後、遠心分離（１５，０００Ｇ、５分、４℃）し、上清を取得して細胞抽出液とした。この細胞抽出液は、参考例５記載の方法で精製し、枯草菌由来アポＣｏｔＡの精製酵素を得た。
［参考例６］大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、大腸菌）の培養
大腸菌はオートクレーブ滅菌（１２１℃１５分）したＬＢ培地（Ｄｉｆｃｏ社製）で好気的に３７℃１８時間培養した。培養終了後、培養物を７，０００ｒｐｍで１０分間遠心し集菌した。
大腸菌はオートクレーブ滅菌（１２１℃１５分）したＬＢ培地（Ｄｉｆｃｏ社製）で好気的に３７℃１８時間培養した。培養終了後、培養物を７，０００ｒｐｍで１０分間遠心し集菌した。
［参考例７］ＰＣＲ法による配列表配列番号２で表される遺伝子の増幅
参考例６の菌体から常法に従いＤＮＡを抽出した（Sambrook, J., Fritsch, E. F., and T. Maniatis. 1989. Molecular cloning: A laboratory manual, 2nd Ed. p. 9.14-9.23. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.）。次に、ＰＣＲ法により配列番号２で表される遺伝子を増幅した。ＰＣＲの各条件は以下のとおりである。
＜ＰＣＲに用いたプライマー＞
センス鎖用
５’−GAA GCT AGC ATG CAA CGT CGT GAT TTC TTA AAA TAT−３’(配列番号５)
アンチセンス鎖用
５’−GGA GAG CTC CGG GCA TAT TTC CGA ATA CGG TCT−３’（配列番号６）
＜ＰＣＲ反応溶液組成＞
ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ １μｌ
１０倍濃縮のＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼに添付の緩衝液 ５μｌ
１ｍＭ 塩化マグネシウム ２μｌ
０．２ｍＭ ｄＮＴＰ ７．５μｌ
１μｇ／ｍｌ 大腸菌のＤＮＡ １０μｌ
１０ｐｍｏｌ／μｌ センスプライマー ５μｌ
１０ｐｍｏｌ／μｌ アンチセンスプライマー ５μｌ
蒸留水 １４．５μｌ
＜ＰＣＲ反応条件＞
（１）９８℃１５秒
（２）６５℃２０秒
（３）７４℃３０秒
上記（１）から（３）を３０回繰り返した。
参考例６の菌体から常法に従いＤＮＡを抽出した（Sambrook, J., Fritsch, E. F., and T. Maniatis. 1989. Molecular cloning: A laboratory manual, 2nd Ed. p. 9.14-9.23. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.）。次に、ＰＣＲ法により配列番号２で表される遺伝子を増幅した。ＰＣＲの各条件は以下のとおりである。
＜ＰＣＲに用いたプライマー＞
センス鎖用
５’−GAA GCT AGC ATG CAA CGT CGT GAT TTC TTA AAA TAT−３’(配列番号５)
アンチセンス鎖用
５’−GGA GAG CTC CGG GCA TAT TTC CGA ATA CGG TCT−３’（配列番号６）
＜ＰＣＲ反応溶液組成＞
ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ １μｌ
１０倍濃縮のＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼに添付の緩衝液 ５μｌ
１ｍＭ 塩化マグネシウム ２μｌ
０．２ｍＭ ｄＮＴＰ ７．５μｌ
１μｇ／ｍｌ 大腸菌のＤＮＡ １０μｌ
１０ｐｍｏｌ／μｌ センスプライマー ５μｌ
１０ｐｍｏｌ／μｌ アンチセンスプライマー ５μｌ
蒸留水 １４．５μｌ
＜ＰＣＲ反応条件＞
（１）９８℃１５秒
（２）６５℃２０秒
（３）７４℃３０秒
上記（１）から（３）を３０回繰り返した。
［参考例８］大腸菌由来ＣｕｅＯ発現プラスミドの構築
参考例７で得られた増幅されたＰＣＲ産物を、ＮｈｅＩとＳａｃＩで切断して精製し、これをｐＥＴ−２１ａ（＋）のＮｈｅＩとＳａｃＩの切断部位に挿入し、大腸菌ＣｕｅＯ遺伝子が連結されたプラスミドを構築した。構築されたプラスミドを、常法によって大腸菌 ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換した。
参考例７で得られた増幅されたＰＣＲ産物を、ＮｈｅＩとＳａｃＩで切断して精製し、これをｐＥＴ−２１ａ（＋）のＮｈｅＩとＳａｃＩの切断部位に挿入し、大腸菌ＣｕｅＯ遺伝子が連結されたプラスミドを構築した。構築されたプラスミドを、常法によって大腸菌 ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換した。
［参考例９］形質転換大腸菌の培養とその細胞抽出液の調製
参考例８で得られたプラスミドを導入した大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地に接種し、培養液の６００ｎｍの吸光度が０．６になったときに１ｍＭのＩＰＴＧを添加した。その後、３７℃でさらに６時間培養し、遠心分離（１５，０００Ｇ、１分、４℃）により集菌し、２５ｐｐｍの塩化銅を含む１０ｍＭのトリス，塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）で懸濁して超音波破砕機を用いて菌体を破砕した後、遠心分離（１５，０００Ｇ、５分、４℃）し、上清を取得して細胞抽出液とした。
参考例８で得られたプラスミドを導入した大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地に接種し、培養液の６００ｎｍの吸光度が０．６になったときに１ｍＭのＩＰＴＧを添加した。その後、３７℃でさらに６時間培養し、遠心分離（１５，０００Ｇ、１分、４℃）により集菌し、２５ｐｐｍの塩化銅を含む１０ｍＭのトリス，塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）で懸濁して超音波破砕機を用いて菌体を破砕した後、遠心分離（１５，０００Ｇ、５分、４℃）し、上清を取得して細胞抽出液とした。
［参考例１０］大腸菌由来ＣｕｅＯの精製
参考例９で得られた細胞抽出液は５５℃で６０分間熱処理して、そのまま１０ｍＭのトリス，塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）で平衡化したＱ ｓｅｐ．ＢＢに吸着させた。１０ｍＭのトリス，塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）で充分に洗浄した後、０から０．５Ｍの塩化カリウムを含む１０ｍＭのトリス，塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）を用いたリニアグラジェントにて溶出した。ＣｕｅＯ画分に最終濃度２５％になるように硫酸アンモニウム添加し、２５％の硫酸アンモニウムを含む１０ｍＭのトリス，塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化したＰｈｅｎｙｌ ｓｅｐ．ＦＦに吸着して２５から０％の硫酸アンモニウムを含む１０ｍＭのトリス，塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）を用いたリニアグラジェントにて溶出した。ＣｕｅＯ画分はＧ−２５で脱塩した後、１０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）で平衡化したＱ ｓｅｐ．ＨＰに吸着し、０から０．５Ｍの塩化カリウムを含む１０ｍＭのトリス，塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）を用いたリニアグラジェントにて溶出した。ＣｕｅＯ画分を１０ｍＭのリン酸緩衝液ｐＨ７．０で平衡化したＧ−２５で脱塩して精製酵素とし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで単一バンドである事を確認した。
参考例９で得られた細胞抽出液は５５℃で６０分間熱処理して、そのまま１０ｍＭのトリス，塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）で平衡化したＱ ｓｅｐ．ＢＢに吸着させた。１０ｍＭのトリス，塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）で充分に洗浄した後、０から０．５Ｍの塩化カリウムを含む１０ｍＭのトリス，塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）を用いたリニアグラジェントにて溶出した。ＣｕｅＯ画分に最終濃度２５％になるように硫酸アンモニウム添加し、２５％の硫酸アンモニウムを含む１０ｍＭのトリス，塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化したＰｈｅｎｙｌ ｓｅｐ．ＦＦに吸着して２５から０％の硫酸アンモニウムを含む１０ｍＭのトリス，塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）を用いたリニアグラジェントにて溶出した。ＣｕｅＯ画分はＧ−２５で脱塩した後、１０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）で平衡化したＱ ｓｅｐ．ＨＰに吸着し、０から０．５Ｍの塩化カリウムを含む１０ｍＭのトリス，塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）を用いたリニアグラジェントにて溶出した。ＣｕｅＯ画分を１０ｍＭのリン酸緩衝液ｐＨ７．０で平衡化したＧ−２５で脱塩して精製酵素とし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで単一バンドである事を確認した。
［実施例３］大腸菌由来アポＣｕｅＯの製造（１）
参考例８のプラスミドを導入した大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンと０．５％グルコースを含み、銅を含まないＭ９培地に接種し、培養液の６００ｎｍの吸光度が０．４になったときに１ｍＭのＩＰＴＧを添加した。その後、３７℃でさらに６時間培養し、遠心分離（１５，０００Ｇ、１分、４℃）により集菌し、１０ｍＭのトリス，塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）で懸濁して超音波破砕機を用いて菌体を破砕した後、遠心分離（１５，０００Ｇ、５分、４℃）し、上清を取得して細胞抽出液とした。この細胞抽出液は、参考例１０記載の方法で精製し、大腸菌由来アポＣｕｅＯの精製酵素を得た。
参考例８のプラスミドを導入した大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンと０．５％グルコースを含み、銅を含まないＭ９培地に接種し、培養液の６００ｎｍの吸光度が０．４になったときに１ｍＭのＩＰＴＧを添加した。その後、３７℃でさらに６時間培養し、遠心分離（１５，０００Ｇ、１分、４℃）により集菌し、１０ｍＭのトリス，塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）で懸濁して超音波破砕機を用いて菌体を破砕した後、遠心分離（１５，０００Ｇ、５分、４℃）し、上清を取得して細胞抽出液とした。この細胞抽出液は、参考例１０記載の方法で精製し、大腸菌由来アポＣｕｅＯの精製酵素を得た。
［実施例４］大腸菌由来アポＣｕｅＯの製造（２）
参考例８のプラスミドを導入した大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を５０μｇ／ｍｌのアンピシリン、０．５％グルコースおよび０．５％カザミノ酸を含み、銅を含まないＭ９培地に接種し、培養液の６００ｎｍの吸光度が０．６になったときに１ｍＭのＩＰＴＧを添加した。その後、３７℃でさらに６時間培養し、遠心分離（１５，０００Ｇ、１分、４℃）により集菌し、１０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）で懸濁して超音波破砕機を用いて菌体を破砕した後、遠心分離（１５，０００Ｇ、５分、４℃）し、上清を取得して細胞抽出液とした。この細胞抽出液は、参考例１０記載の方法で精製し、大腸菌由来アポＣｕｅＯの精製酵素を得た。
参考例８のプラスミドを導入した大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を５０μｇ／ｍｌのアンピシリン、０．５％グルコースおよび０．５％カザミノ酸を含み、銅を含まないＭ９培地に接種し、培養液の６００ｎｍの吸光度が０．６になったときに１ｍＭのＩＰＴＧを添加した。その後、３７℃でさらに６時間培養し、遠心分離（１５，０００Ｇ、１分、４℃）により集菌し、１０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）で懸濁して超音波破砕機を用いて菌体を破砕した後、遠心分離（１５，０００Ｇ、５分、４℃）し、上清を取得して細胞抽出液とした。この細胞抽出液は、参考例１０記載の方法で精製し、大腸菌由来アポＣｕｅＯの精製酵素を得た。
［実施例５］枯草菌由来アポＣｏｔＡの熱安定性
実施例２で得られた精製された枯草菌由来アポＣｏｔＡを０．１ｍｇ／ｍｌになるように２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５、２５℃）中に溶解し、８０℃３０分熱処理後した後にその残存活性を測定したところ、９０％以上の活性を保持していた。
実施例２で得られた精製された枯草菌由来アポＣｏｔＡを０．１ｍｇ／ｍｌになるように２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５、２５℃）中に溶解し、８０℃３０分熱処理後した後にその残存活性を測定したところ、９０％以上の活性を保持していた。
［実施例６］大腸菌由来アポＣｕｅＯの熱安定性
実施例４で得られた精製された大腸菌由来アポＣｕｅＯを０．１ｍｇ／ｍｌになるように２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５、２５℃）中に溶解し、６５℃で３０分熱処理後した後にその残存活性を測定したところ、９０％以上の活性を保持していた。
実施例４で得られた精製された大腸菌由来アポＣｕｅＯを０．１ｍｇ／ｍｌになるように２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５、２５℃）中に溶解し、６５℃で３０分熱処理後した後にその残存活性を測定したところ、９０％以上の活性を保持していた。
［実施例７］枯草菌由来アポＣｏｔＡを用いた銅イオン濃度の測定
＜試料＞
０、５、７．５、１０、１２．５、１５、１７．５、２０、３０及び４０μＭの硫酸銅水溶液
＜銅イオン濃度測定組成物＞
Ｒ１試薬
１０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ ６．０）
０．２５ｍｇ／ｍｌ アポＣｏｔＡ（実施例２製）
Ｒ２試薬
１００ｍＭ 酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ４．５）
５ｍＭ ＡＢＴＳ
＜測定方法＞
使用機器：日立７０８０形自動分析機
パラメーター：試料 ２０μｌ
Ｒ１試薬 １４０μｌ
Ｒ２試薬 ７０μｌ
反応温度 ３７℃
測定主波長 ４５０ｎｍ
Ｒａｔｅ−Ａ
試料２０μｌとＲ１試薬１４０μｌを反応槽中で混和した。５分後、ＣｏｔＡの基質ＡＢＴＳを含むＲ２試薬１４０μｌを混和し、試料中の銅濃度に応じてホロ化され活性化されたＣｏｔＡの酵素反応が開始され、混和後後３分後から４分後の４５０ｎｍにおける吸光度差を測定した（Ａｓ）。また、盲検として酵素抜きのＲ１試薬を用いて同一の操作を行って吸光度差を測定した（Ａｂ）。吸光度差（Ａｓ−Ａｂ）を図１の縦軸に表した。以上の方法で０μＭから４０μＭの硫酸銅水溶液を５重測定した結果、図１に示すような直線の検量線が得られ、相関係数Ｒ２＝０．９９７であることから、試料中の銅イオン濃度の正確な測定が可能であることが判明した。
＜試料＞
０、５、７．５、１０、１２．５、１５、１７．５、２０、３０及び４０μＭの硫酸銅水溶液
＜銅イオン濃度測定組成物＞
Ｒ１試薬
１０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ ６．０）
０．２５ｍｇ／ｍｌ アポＣｏｔＡ（実施例２製）
Ｒ２試薬
１００ｍＭ 酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ４．５）
５ｍＭ ＡＢＴＳ
＜測定方法＞
使用機器：日立７０８０形自動分析機
パラメーター：試料 ２０μｌ
Ｒ１試薬 １４０μｌ
Ｒ２試薬 ７０μｌ
反応温度 ３７℃
測定主波長 ４５０ｎｍ
Ｒａｔｅ−Ａ
試料２０μｌとＲ１試薬１４０μｌを反応槽中で混和した。５分後、ＣｏｔＡの基質ＡＢＴＳを含むＲ２試薬１４０μｌを混和し、試料中の銅濃度に応じてホロ化され活性化されたＣｏｔＡの酵素反応が開始され、混和後後３分後から４分後の４５０ｎｍにおける吸光度差を測定した（Ａｓ）。また、盲検として酵素抜きのＲ１試薬を用いて同一の操作を行って吸光度差を測定した（Ａｂ）。吸光度差（Ａｓ−Ａｂ）を図１の縦軸に表した。以上の方法で０μＭから４０μＭの硫酸銅水溶液を５重測定した結果、図１に示すような直線の検量線が得られ、相関係数Ｒ２＝０．９９７であることから、試料中の銅イオン濃度の正確な測定が可能であることが判明した。
[実施例８]
枯草菌由来少なくとも完全なホロ体でないＣｏｔＡを用いた銅イオン濃度の測定
＜試料＞
０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、及び１０μＭの硫酸銅水溶液
＜銅イオン濃度測定組成物＞
Ｒ１試薬
１０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ ６．０）
０．２５ｍｇ／ｍｌ アポＣｏｔＡ（実施例２製）
０．１μM ＣｕＳＯ４
Ｒ２試薬
１００ｍＭ 酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ４．５）
５ｍＭ ＡＢＴＳ
＜測定方法＞
使用機器：日立７０８０形自動分析機
パラメーター：試料 ２０μｌ
Ｒ１試薬 １４０μｌ
Ｒ２試薬 ７０μｌ
反応温度 ３７℃
測定主波長 ４５０ｎｍ
Ｒａｔｅ−Ａ
Ｒ１試薬中には予め０．１μＭの硫酸銅を添加しておき、アポＣｏｔＡは少なくとも完全なホロ体でない状態にしておいた。その後、試料１０μｌとＲ１試薬１４０μｌを反応槽中で混和した。次いで、５分後、ＣｏｔＡの基質を含むＲ２試薬１４０μｌを混和し、試料中の銅濃度に応じてさらにホロ化され活性化されたＣｏｔＡの酵素反応が開始され、混和後３分後から４分後の４５０ｎｍにおける吸光度差を測定した（Ａｓ）。また、盲検として酵素抜きのＲ１試薬を用いて同一の操作を行って吸光度差を測定した（Ａｂ）。吸光度差（Ａｓ−Ａｂ）を図２の縦軸に表した。
以上の方法で０μＭから１０μＭの硫酸銅水溶液を５重測定した結果、図２に示すような直線の検量線が得られ、相関係数Ｒ２＝０．９７７であることから、試料中の銅イオン濃度の正確な測定が可能であることが判明した。
枯草菌由来少なくとも完全なホロ体でないＣｏｔＡを用いた銅イオン濃度の測定
＜試料＞
０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、及び１０μＭの硫酸銅水溶液
＜銅イオン濃度測定組成物＞
Ｒ１試薬
１０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ ６．０）
０．２５ｍｇ／ｍｌ アポＣｏｔＡ（実施例２製）
０．１μM ＣｕＳＯ４
Ｒ２試薬
１００ｍＭ 酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ４．５）
５ｍＭ ＡＢＴＳ
＜測定方法＞
使用機器：日立７０８０形自動分析機
パラメーター：試料 ２０μｌ
Ｒ１試薬 １４０μｌ
Ｒ２試薬 ７０μｌ
反応温度 ３７℃
測定主波長 ４５０ｎｍ
Ｒａｔｅ−Ａ
Ｒ１試薬中には予め０．１μＭの硫酸銅を添加しておき、アポＣｏｔＡは少なくとも完全なホロ体でない状態にしておいた。その後、試料１０μｌとＲ１試薬１４０μｌを反応槽中で混和した。次いで、５分後、ＣｏｔＡの基質を含むＲ２試薬１４０μｌを混和し、試料中の銅濃度に応じてさらにホロ化され活性化されたＣｏｔＡの酵素反応が開始され、混和後３分後から４分後の４５０ｎｍにおける吸光度差を測定した（Ａｓ）。また、盲検として酵素抜きのＲ１試薬を用いて同一の操作を行って吸光度差を測定した（Ａｂ）。吸光度差（Ａｓ−Ａｂ）を図２の縦軸に表した。
以上の方法で０μＭから１０μＭの硫酸銅水溶液を５重測定した結果、図２に示すような直線の検量線が得られ、相関係数Ｒ２＝０．９７７であることから、試料中の銅イオン濃度の正確な測定が可能であることが判明した。
［参考例１１］大腸菌由来アポＣｕｅＯを用いた銅イオン濃度の測定
＜試料＞
０、２．５、５、７．５、１０、１２．５、１５、１７．５、２０、３０及び４０μＭの硫酸銅水溶液
＜銅イオン濃度測定組成物＞
Ｒ１試薬
１０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ ６．０）
０．０１ｍｇ／ｍｌ アポＣｕｅＯ（実施例４製）
Ｒ２試薬
１００ｍＭ 酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ４．５）
５ｍＭ ＡＢＴＳ
＜測定方法＞
使用機器：日立７０８０形自動分析機
パラメーター：試料 １０μｌ
Ｒ１試薬 １４０μｌ
Ｒ２試薬 ７０μｌ
反応温度 ３７℃
測定主波長 ４５０ｎｍ
Ｒａｔｅ−Ａ
試料１０μｌとＲ１試薬１４０μｌを反応槽中で混和した。５分後、ＣｕｅＯの基質ＡＢＴＳを含むＲ２試薬１４０μｌを混和し、試料中の銅濃度に応じてホロ化され活性化されたＣｕｅＯの酵素反応が開始され、混和後３分後から４分後の４５０ｎｍにおける吸光度差を測定した（Ａｓ）。また、盲検として酵素抜きのＲ１試薬を用いて同一の操作を行って吸光度差を測定した（Ａｂ）。吸光度差（Ａｓ−Ａｂ）を図３の縦軸に表した。以上の方法で０μＭから４０μＭの硫酸銅水溶液を５重測定した結果、図３に示すように、直線の検量線が得られず、このままでは試料中の銅イオン濃度の正確な測定が困難であることが判明した。
＜試料＞
０、２．５、５、７．５、１０、１２．５、１５、１７．５、２０、３０及び４０μＭの硫酸銅水溶液
＜銅イオン濃度測定組成物＞
Ｒ１試薬
１０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ ６．０）
０．０１ｍｇ／ｍｌ アポＣｕｅＯ（実施例４製）
Ｒ２試薬
１００ｍＭ 酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ４．５）
５ｍＭ ＡＢＴＳ
＜測定方法＞
使用機器：日立７０８０形自動分析機
パラメーター：試料 １０μｌ
Ｒ１試薬 １４０μｌ
Ｒ２試薬 ７０μｌ
反応温度 ３７℃
測定主波長 ４５０ｎｍ
Ｒａｔｅ−Ａ
試料１０μｌとＲ１試薬１４０μｌを反応槽中で混和した。５分後、ＣｕｅＯの基質ＡＢＴＳを含むＲ２試薬１４０μｌを混和し、試料中の銅濃度に応じてホロ化され活性化されたＣｕｅＯの酵素反応が開始され、混和後３分後から４分後の４５０ｎｍにおける吸光度差を測定した（Ａｓ）。また、盲検として酵素抜きのＲ１試薬を用いて同一の操作を行って吸光度差を測定した（Ａｂ）。吸光度差（Ａｓ−Ａｂ）を図３の縦軸に表した。以上の方法で０μＭから４０μＭの硫酸銅水溶液を５重測定した結果、図３に示すように、直線の検量線が得られず、このままでは試料中の銅イオン濃度の正確な測定が困難であることが判明した。
［実施例９］大腸菌由来少なくとも完全なホロ体でないＣｕｅＯを用いた銅イオン濃度の測定
＜試料＞
０、２．５、５、７．５、１０、１５、１７．５、２０、３０及び４０μＭの硫酸銅水溶液
＜銅イオン濃度測定組成物＞
Ｒ１試薬
１０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ ６．０）
０．０１ｍｇ／ｍｌ アポＣｕｅＯ（実施例４製）
１μＭ 硫酸銅
Ｒ２試薬
１００ｍＭ 酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ４．５）
５ｍＭ ＡＢＴＳ
＜測定方法＞
使用機器：日立７０８０形自動分析機
パラメーター：試料 １０μｌ
Ｒ１試薬 １４０μｌ
Ｒ２試薬 ７０μｌ
反応温度 ３７℃
測定主波長 ４５０ｎｍ
Ｒａｔｅ−Ａ
Ｒ１試薬中には予め１μＭの硫酸銅を添加しておき、アポＣｕｅＯは少なくとも完全なホロ体でない状態にしておいた。その後、試料１０μｌとＲ１試薬１４０μｌを反応槽中で混和した。次いで、５分後、ＣｕｅＯの基質ＡＢＴＳを含むＲ２試薬１４０μｌを混和し、試料中の銅濃度に応じてさらにホロ化され活性化されたＣｕｅＯの酵素反応が開始され、混和後３分後から４分後の４５０ｎｍにおける吸光度差を測定した（Ａｓ）。また、盲検として酵素抜きのＲ１試薬を用いて同一の操作を行って吸光度差を測定した（Ａｂ）。吸光度差（Ａｓ−Ａｂ）を図４の縦軸に表した。
以上の方法で０μＭから４０μＭの硫酸銅水溶液を５重測定した結果、図４に示すように参考例１１が改善されて直線の検量線が得られ、相関係数Ｒ２＝０．９７３であることから、試料中の銅イオン濃度の正確な測定が可能であることが判明した。
＜試料＞
０、２．５、５、７．５、１０、１５、１７．５、２０、３０及び４０μＭの硫酸銅水溶液
＜銅イオン濃度測定組成物＞
Ｒ１試薬
１０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ ６．０）
０．０１ｍｇ／ｍｌ アポＣｕｅＯ（実施例４製）
１μＭ 硫酸銅
Ｒ２試薬
１００ｍＭ 酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ４．５）
５ｍＭ ＡＢＴＳ
＜測定方法＞
使用機器：日立７０８０形自動分析機
パラメーター：試料 １０μｌ
Ｒ１試薬 １４０μｌ
Ｒ２試薬 ７０μｌ
反応温度 ３７℃
測定主波長 ４５０ｎｍ
Ｒａｔｅ−Ａ
Ｒ１試薬中には予め１μＭの硫酸銅を添加しておき、アポＣｕｅＯは少なくとも完全なホロ体でない状態にしておいた。その後、試料１０μｌとＲ１試薬１４０μｌを反応槽中で混和した。次いで、５分後、ＣｕｅＯの基質ＡＢＴＳを含むＲ２試薬１４０μｌを混和し、試料中の銅濃度に応じてさらにホロ化され活性化されたＣｕｅＯの酵素反応が開始され、混和後３分後から４分後の４５０ｎｍにおける吸光度差を測定した（Ａｓ）。また、盲検として酵素抜きのＲ１試薬を用いて同一の操作を行って吸光度差を測定した（Ａｂ）。吸光度差（Ａｓ−Ａｂ）を図４の縦軸に表した。
以上の方法で０μＭから４０μＭの硫酸銅水溶液を５重測定した結果、図４に示すように参考例１１が改善されて直線の検量線が得られ、相関係数Ｒ２＝０．９７３であることから、試料中の銅イオン濃度の正確な測定が可能であることが判明した。
［実施例１０］枯草菌由来アポＣｏｔＡを用いた銅イオン濃度測定用試薬組成物の特異性
＜試料＞
４０μＭの表１に示す金属塩水溶液
＜銅イオン濃度測定組成物＞
Ｒ１試薬
１０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ ６．０）
０．２５ｍｇ／ｍｌ アポＣｏｔＡ（実施例２製）
Ｒ２試薬
１００ｍＭ 酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ４．５）
５ｍＭ ＡＢＴＳ
＜測定方法＞
使用機器：日立７０８０形自動分析機
パラメーター：試料 ２０μｌ
Ｒ１試薬 １４０μｌ
Ｒ２試薬 ７０μｌ
反応温度 ３７℃
測定主波長 ４５０ｎｍ
Ｒａｔｅ−Ａ
試料２０μｌとＲ１試薬１４０μｌを反応槽中で混和した。５分後、ＣｏｔＡの基質ＡＢＴＳを含むＲ２試薬７０μｌを混和し、試料中の銅濃度に応じてさらにホロ化され活性化されたＣｏｔＡの酵素反応が開始され、Ｒ２試薬混和後３分後から４分後の４５０ｎｍにおける吸光度差を測定した（Ａｓ）。また、盲検として酵素抜きのＲ１を用いて同一の操作を行って吸光度差を測定し（Ａｂ）、吸光度差（Ａｓ−Ａｂ）の相対値を表１に表した。
＜試料＞
４０μＭの表１に示す金属塩水溶液
＜銅イオン濃度測定組成物＞
Ｒ１試薬
１０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ ６．０）
０．２５ｍｇ／ｍｌ アポＣｏｔＡ（実施例２製）
Ｒ２試薬
１００ｍＭ 酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ４．５）
５ｍＭ ＡＢＴＳ
＜測定方法＞
使用機器：日立７０８０形自動分析機
パラメーター：試料 ２０μｌ
Ｒ１試薬 １４０μｌ
Ｒ２試薬 ７０μｌ
反応温度 ３７℃
測定主波長 ４５０ｎｍ
Ｒａｔｅ−Ａ
試料２０μｌとＲ１試薬１４０μｌを反応槽中で混和した。５分後、ＣｏｔＡの基質ＡＢＴＳを含むＲ２試薬７０μｌを混和し、試料中の銅濃度に応じてさらにホロ化され活性化されたＣｏｔＡの酵素反応が開始され、Ｒ２試薬混和後３分後から４分後の４５０ｎｍにおける吸光度差を測定した（Ａｓ）。また、盲検として酵素抜きのＲ１を用いて同一の操作を行って吸光度差を測定し（Ａｂ）、吸光度差（Ａｓ−Ａｂ）の相対値を表１に表した。
表１に示すように、本発明の銅イオン濃度測定組成物を用いることにより、試料中のコバルトやニッケルを誤測定せず、特異性高く試料中の銅イオン濃度を測定できることが判明した。
［実施例１１］大腸菌由来一部ホロ化ＣｕｅＯを用いた銅イオン濃度測定用試薬組成物の特異性
＜試料＞
４０μＭの表２に示す金属塩水溶液
＜銅イオン濃度測定組成物＞
Ｒ１試薬
１０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ ６．０）
０．０１ｍｇ／ｍｌ アポＣｕｅＯ（実施例４製）
１μＭ 硫酸銅
Ｒ２試薬
１００ｍＭ 酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ４．５）
５ｍＭ ＡＢＴＳ
＜測定方法＞
使用機器：日立７０８０形自動分析機
パラメーター：試料 １０μｌ
Ｒ１試薬 １４０μｌ
Ｒ２試薬 ７０μｌ
反応温度 ３７℃
測定主波長 ４５０ｎｍ
Ｒａｔｅ−Ａ
Ｒ１試薬中には予め１μＭの硫酸銅を添加しておき、アポＣｕｅＯは少なくとも完全なホロ体でないにしておいた。試料１０μｌとＲ１試薬１４０μｌを反応槽中で混和した。５分後、ＣｕｅＯの基質ＡＢＴＳを含むＲ２試薬７０μｌを混和し、試料中の銅濃度に応じてさらにホロ化され活性化されたＣｕｅＯの酵素反応が開始され、Ｒ２試薬混和後３分後から４分後の４５０ｎｍにおける吸光度差を測定した（Ａｓ）。また、盲検として酵素抜きのＲ１試薬を用いて同一の操作を行って吸光度差を測定し（Ａｂ）、吸光度差（Ａｓ−Ａｂ）の相対値を表２に表した。
＜試料＞
４０μＭの表２に示す金属塩水溶液
＜銅イオン濃度測定組成物＞
Ｒ１試薬
１０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ ６．０）
０．０１ｍｇ／ｍｌ アポＣｕｅＯ（実施例４製）
１μＭ 硫酸銅
Ｒ２試薬
１００ｍＭ 酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ４．５）
５ｍＭ ＡＢＴＳ
＜測定方法＞
使用機器：日立７０８０形自動分析機
パラメーター：試料 １０μｌ
Ｒ１試薬 １４０μｌ
Ｒ２試薬 ７０μｌ
反応温度 ３７℃
測定主波長 ４５０ｎｍ
Ｒａｔｅ−Ａ
Ｒ１試薬中には予め１μＭの硫酸銅を添加しておき、アポＣｕｅＯは少なくとも完全なホロ体でないにしておいた。試料１０μｌとＲ１試薬１４０μｌを反応槽中で混和した。５分後、ＣｕｅＯの基質ＡＢＴＳを含むＲ２試薬７０μｌを混和し、試料中の銅濃度に応じてさらにホロ化され活性化されたＣｕｅＯの酵素反応が開始され、Ｒ２試薬混和後３分後から４分後の４５０ｎｍにおける吸光度差を測定した（Ａｓ）。また、盲検として酵素抜きのＲ１試薬を用いて同一の操作を行って吸光度差を測定し（Ａｂ）、吸光度差（Ａｓ−Ａｂ）の相対値を表２に表した。
表２に示すように、本発明の銅イオン濃度測定組成物を用いることにより、試料中のコバルトやニッケルを誤測定せず、特異性高く試料中の銅イオン濃度を測定できることが判明した。
本発明により、少なくとも完全なホロ体ではない銅を補欠因子とする酵素、その製造法、およびそれを用いた試料中の銅イオン測定用試薬組成物と銅イオン濃度測定方法を提供することが可能となる。
Claims (6)
- 配列表配列番号１のアミノ酸配列１番目から５１５番目で示されるアミノ酸配列からなる銅を補欠因子とするＣｏｔＡであって、
０．２５ｍｇ／ｍｌのアポＣｏｔＡに対して０．０１〜１μＭの銅イオンを添加して製造される、完全なホロ体でもアポ体でもないＣｏｔＡ。 - 請求項１に記載のＣｏｔＡの製造方法であって、下記１）〜３）の工程を含むＣｏｔＡの製造方法。
１）窒素源を３％以下含み、かつ、銅を含まない培地にて、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来のＣｏｔＡの遺伝子を導入した遺伝子組み換え微生物を培養する工程
２）１）で得られる、菌体内または培養液中に産生された完全なＣｏｔＡのアポ体を精製する工程
３）精製されたアポ体に対して銅イオンを添加しそのアポ体の一部をホロ化することにより完全なホロ体でもアポ体でもないＣｏｔＡを製造する工程 - 下記（１）または（２）に記載のＣｏｔＡおよび該ＣｏｔＡの基質を含有することを特徴とする銅イオン濃度測定用試薬組成物。
（１）配列表配列番号１のアミノ酸配列１番目から５１５番目で示されるアミノ酸配列からなる銅を補欠因子とするＣｏｔＡであって、完全なホロ体でもアポ体でもないＣｏｔＡ。
（２）０．２５ｍｇ／ｍｌのアポＣｏｔＡに対して０．０１〜１μＭの銅イオンを添加して製造される、前記（１）に記載のＣｏｔＡ。 - 試料中の銅イオンに、下記（１）または（２）に記載のＣｏｔＡと該ＣｏｔＡの基質を作用させて、該ＣｏｔＡの活性の変化を測定することにより試料中の銅イオン濃度を測定することを特徴とする銅イオン濃度測定方法。
（１）配列表配列番号１のアミノ酸配列１番目から５１５番目で示されるアミノ酸配列からなる銅を補欠因子とするＣｏｔＡであって、完全なホロ体でもアポ体でもないＣｏｔＡ。
（２）０．２５ｍｇ／ｍｌのアポＣｏｔＡに対して０．０１〜１μＭの銅イオンを添加して製造される、前記（１）に記載のＣｏｔＡ。 - 下記（１）または（２）に記載のＣｕｅＯおよび該ＣｕｅＯの基質を含有することを特徴とする銅イオン濃度測定用試薬組成物。
（１）配列表配列番号２のアミノ酸配列１番目から５１６番目で示されるアミノ酸配列からなる銅を補欠因子とするＣｕｅＯであって、完全なホロ体でもアポ体でもないＣｕｅＯ。
（２）０．０１ｍｇ／ｍｌのアポＣｕｅＯに対して０．１〜１０μＭの銅イオンを添加して製造される、前記（１）に記載のＣｕｅＯ。 - 試料中の銅イオンに、下記（１）または（２）に記載のＣｕｅＯと該ＣｕｅＯの基質を作用させて、該ＣｕｅＯの活性の変化を測定することにより試料中の銅イオン濃度を測定することを特徴とする銅イオン濃度測定方法。
（１）配列表配列番号２のアミノ酸配列１番目から５１６番目で示されるアミノ酸配列からなる銅を補欠因子とするＣｕｅＯであって、完全なホロ体でもアポ体でもないＣｕｅＯ。
（２）０．０１ｍｇ／ｍｌのアポＣｕｅＯに対して０．１〜１０μＭの銅イオンを添加して製造される、前記（１）に記載のＣｕｅＯ。
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