JPH0923898A - フェニルアラニンデアミナーゼ試験用反応シート - Google Patents

フェニルアラニンデアミナーゼ試験用反応シート

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JPH0923898A
JPH0923898A JP17703695A JP17703695A JPH0923898A JP H0923898 A JPH0923898 A JP H0923898A JP 17703695 A JP17703695 A JP 17703695A JP 17703695 A JP17703695 A JP 17703695A JP H0923898 A JPH0923898 A JP H0923898A
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JP
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sheet
water
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phenylalanine
reaction sheet
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JP17703695A
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English (en)
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Mika Ishitsubo
美香 石坪
Akiko Shimosato
晶子 下郷
Ryuichi Endo
隆一 遠藤
Masatoshi Mishina
正俊 三品
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Nissui Pharmacetuical Co Ltd
Original Assignee
Nissui Pharmacetuical Co Ltd
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Abstract

(57)【要約】 【解決手段】 シート状吸水性支持体上に、少なくとも
p-ニトロフェニルアラニン及び鉄化合物を担持してなる
フェニルアラニンデアミナーゼ試験用反応シート。 【効果】 少ない菌量で、また短時間で、発色良く、か
つ退色することなく容易にProteus属、、Morganella
及びProvidencia属の細菌の鑑別が可能となる。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【発明の属する技術分野】本発明は、腸内細菌を感度良
く簡単に鑑別できるフェニルアラニンデアミナーゼ試験
用反応シートに関する。
【0002】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】腸内細
菌であるProteus属、Morganella属及びProvidencia属細
菌は、尿検体をはじめ臨床から分離されるものであり、
肺炎、尿路感染等の原因となる日和見病原菌である。こ
れらに分類されるProteus mirabilisProteus vulgari
s及びMorganella morganiiは年間の分離菌の上位30菌種
内に含まれている(1993年,薬剤感受性情報,薬事時報
社)。これらの細菌の鑑別は、Escherichia属など分離
頻度の高い他の腸内細菌と鑑別する上で重要な試験項目
であり、従来主にフェニルアラニンデアミナーゼ試験に
より行われている。
【0003】従来、フェニルアラニンデアミナーゼ試験
は、例えばDL-フェニルアラニンを基質とし、酵母エキ
ス、リン酸水素二ナトリウム及び塩化ナトリウムを含む
寒天培地を用い、菌塊あるいは108〜109CFU/ml程度の濃
厚菌液を接種して培養後、塩化第二鉄水溶液を添加して
呈色させることにより行われている。この反応はフェニ
ルアラニンが菌体酵素により酸化的脱アミノ化されフェ
ニルピルビン酸を生じ、鉄イオンと結合することにより
呈色することを原理としている。
【0004】しかし、上記培地を用いた場合、菌接種量
が少ない場合や菌濃度が低い場合、あるいは反応が弱い
菌株の場合などでは発色が弱く鑑別が困難であること、
培養後塩化第二鉄の添加が必要であること、反応後しば
らくすると退色してしまうことなどの問題があった。
【0005】
【課題を解決するための手段】かかる実情において本発
明者らは鋭意研究を重ねた結果、p-ニトロフェニルアラ
ニン及び鉄化合物を吸水性支持体上に担持させてなる反
応シートを用いれば、短時間で、少ない菌量でも発色が
良く、かつ退色することなく容易にProteus属等の細菌
の鑑別が可能となることを見出し、本発明を完成した。
【0006】すなわち本発明は、シート状吸水性支持体
上に少なくともp-ニトロフェニルアラニン及び鉄化合物
を担持してなるフェニルアラニンデアミナーゼ試験用反
応シートを提供するものである。
【0007】
【発明の実施の形態】本発明に用いられるシート状吸水
性支持体としては、ポリアクリロニトリル、レーヨン、
ナイロン、ポリプロピレン、ポリエステル、ビニロン、
ポリエチレン、ポリウレタン、綿、セルロースパルプ等
を原料とする不織布;ろ紙、ニトロセルロース、セルロ
ースアセテート、綿ガーゼ、ガラス繊維、その他の化学
・天然素材からなる繊維等が挙げられる。これらのう
ち、吸水量が0.02g/cm2以上、特に0.08〜0.2g/cm2のも
のが好ましい。また、その形状、大きさ、厚さ等は特に
限定されるものではないが、厚さ0.2〜0.7mm程度のもの
が好ましい。
【0008】また、反応シートの吸水量を調整し反応性
を向上させるために、水溶性高分子を固定した材料を支
持体として使用するのが好ましい。かかる水溶性高分子
としては、可溶性デンプン、マンナン、寒天、アルギン
酸ナトリウム、植物粘質物(アラビアゴム等)、微生物
産生粘質物(デキストラン、キサンタンガム、ゼランガ
ム等)、セルロース系物質(メチルセルロース、カルボ
キシメチルセルロース、その他のセルロース)、ポリビ
ニルアルコール、ポリアクリル酸ナトリウム、これらの
高分子物質のグラフト重合体などが挙げられる。これら
の水溶性高分子を支持体上に固定する方法としては特に
限定されないが、他の成分とともに溶液中に溶解して支
持体に含浸・乾燥する方法、粉末状の水溶性高分子を2
枚の支持体ではさむ方法、支持体の繊維に織り込む方法
などが挙げられる。なお、水溶性高分子を支持体に固定
しない場合は、鑑別時に加える菌液中に水溶性高分子を
配合するのが好ましい。
【0009】p-ニトロフェニルアラニンとしては、D
体、L体及びDL体のいずれをも使用することができる
が、L体が反応感度に優れるため好ましい。
【0010】鉄化合物としては、水に溶解して酸化数を
問わず鉄イオンを生成し得るものであれば特に限定され
ないが、例えばクエン酸第二鉄、クエン酸第二鉄アンモ
ニウム、塩化第一鉄、塩化第二鉄、硫酸第一鉄アンモニ
ウム等が挙げられ、なかでもクエン酸第二鉄アンモニウ
ムが好ましい。
【0011】また、本発明の反応シートには、これらの
ほかに栄養源、無機塩、緩衝剤等を担持せしめてもよ
い。栄養源としては、ペプトン、アミノ酸、酵母エキ
ス、植物組織のエキス、動物組織のエキス等が挙げられ
るが、なかでもペプトンが好ましい。無機塩としては、
リン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、マンガン
塩、亜鉛塩、コバルト塩、ナトリウム塩、カリウム塩等
が挙げられるが、なかでも塩化ナトリウムが好ましく、
これらは単独で又は2種以上を組合せて使用することが
できる。また、ここでいう緩衝剤とは、後に菌液を加え
たときに溶解して緩衝液となり得る成分をいい、かかる
緩衝液としては、中性域(pH6.0〜8.0)に緩衝能がある
もの、例えばHEPES緩衝液、MOPS緩衝液、TES緩衝液、リ
ン酸緩衝液、トリス緩衝液等が挙げられる。
【0012】以上の各成分は、後の鑑別試験時に本発明
の反応シートに菌液を添加したとき、培地として適当な
濃度になる量を担持させる必要がある。かかる濃度とし
ては、p-ニトロフェニルアラニンは0.05〜0.5重量%、
鉄化合物は0.01〜1重量%が好ましく、またシートに水
溶性高分子、栄養源、無機塩、緩衝剤を担持させる場合
は、水溶性高分子は0.1〜0.5重量%、栄養源は0.5〜2
重量%、無機塩は0.2〜1重量%、緩衝剤は中性域の緩
衝能を示す濃度が好ましい。
【0013】本発明の反応シートは、少なくともp-ニト
ロフェニルアラニン及び鉄化合物を含む溶液をシート状
吸水性支持体に含浸せしめ、その後乾燥することにより
製造することができる。ここで、シート状吸水性支持体
に含浸させる溶液の量は、支持体の飽和吸水量とするの
が好ましい。含浸させる溶液の量が飽和吸水量に満たな
いとムラの原因となり、また含浸させる溶液の量が飽和
吸水量を超える場合は含浸・乾燥工程を複数回に分ける
必要が生じ煩雑となる。
【0014】本発明の反応シートを用いてProteus属等
の鑑別をするには、まず本発明の反応シートに菌液を添
加する。これにより、本発明の反応シートに担持された
各成分が菌液に再溶解して所期の濃度の各種成分を含有
する培地が調製される。ここで、本発明の反応シートが
栄養源、無機塩、緩衝剤、水溶性高分子を担持していな
い場合には、反応シートに加える菌液中に栄養源及び無
機塩並びに必要に応じて緩衝剤及び/又は水溶性高分子
を配合しておき、菌液を加えたときに各成分が所期の濃
度となるようにする必要がある。また反応シート及び菌
液の双方にこれらの成分を含有せしめておくことも可能
である。反応シートに添加する菌液の量は、各成分が所
期の濃度となる量であるが、飽和吸水量の菌液を添加し
たとき所期の濃度の培地が調製されるように設計するの
が好ましい。
【0015】次いでこれを30〜37℃で3〜6時間培養す
れば、菌液中にProteus属、Morganella属又はProvidenc
ia属細菌が含まれる場合には、その菌体酵素により反応
シートに含まれるp-ニトロフェニルアラニンが酸化的脱
アミノ化されてp-ニトロフェニルピルビン酸を生じ、こ
れが反応シート中の鉄イオンと結合して呈色する。
【0016】
【実施例】以下、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説
明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【0017】実施例1A . p-ニトロ-L-フェニルアラニンを基質とし、本
発明の反応シート又はマイクロプレートを用いてフェニ
ルアラニンデアミナーゼ試験を行い、両者を比較した。
【0018】 上記成分のうち、p-ニトロフェニルアラニンを微量の1
N水酸化ナトリウム水溶液に溶解後、その他の成分を混
合して完全に溶解する。その後pHを調整し、0.45μmの
フィルターにてろ過滅菌する。
【0019】(2)プレート又はシート担体への乾燥固定
化 プレート: (1)で調製した基礎培地を、96ウェルのマ
イクロプレートに1ウェル当たり100μlずつ分注し、デ
シケータにて減圧乾燥する。 シート : 直径6mmのアクリル系繊維製不織布シート
(A200,クラレトレーディング社製)を使用した。この
シートは200g/m2、吸水率0.114g/cm2、飽和吸水量25μl
であった。これに、(1)で調製した基礎培地を1シート
当たり25μlずつ分注し、デシケータにて減圧乾燥す
る。乾燥したプレートとシートは試験まで乾燥剤を入れ
た袋に入れて密閉し、冷暗所に保管する。
【0020】(3)供試菌株の準備 供試菌株としては、以下のものを用いた。P. mirabilis:ATCC29906及び臨床株10株M. morganii :臨床株10株E. coli :ATCC11775及び臨床株11株 各供試菌株を羊血液寒天培地(ニッスイ社製)にて30〜
37℃で18〜24時間培養し、供試を行う際に純培養菌であ
ることを確認する。
【0021】(4)ブイヨンの準備 ゼランガム 1g カゼインペプトン 10g 精製水 1000ml 上記成分を混合し、加熱して完全に溶解し、121℃、15
分間オートクレーブ滅菌する。
【0022】(5)菌液の調製 各供試菌株を(4)で用意したブイヨンにマクファーラン
ド0.5(1.5×108CFU/ml相当)となるように浮遊させ、
均質な菌液を調製する。
【0023】(6)プレート・シートへの接種 (5)の菌液を、プレートには1ウェル当たり100μl、シ
ートには1シート当たり25μlピペットで接種し、37℃
で4時間培養する。
【0024】(7)判定 陰性対照(E. coli ATCC11775)の色調を基準とし、 −
<-w<+w<+<++の5段階で判定を行う。この結果を表
1に示す。なお、判定時の色調をカッコ内に併せて示
す。
【0025】B. 基質としてp-ニトロ-L-フェニル
アラニンに代えてL-フェニルアラニンを使用する以外は
Aと同様にしてフェニルアラニンデアミナーゼ試験を行
った。この結果を表1に示す。
【0026】C. 寒天培地を用いDL-フェニルアラ
ニンを基質とする従来法により、フェニルアラニンデア
ミナーゼ試験を行った。
【0027】
【0028】上記成分を加熱溶解し、小試験管に分注
し、121℃で10分間滅菌後、斜面に固めた。この培地斜
面に、新鮮純培養菌を濃厚に(2〜3白金耳)塗布し、
35℃、4〜24時間培養した。その後、斜面部に10%(w/
v)塩化第二鉄水溶液4〜5滴を加え、判定した。陽性
の場合は、斜面部に緑色の呈色が観られるが、しばらく
すると退色するため、試薬滴下直後に判定を行った。こ
の結果を表1に示す。
【0029】
【表1】
【0030】
【発明の効果】以上のように、本発明の反応シートを用
いれば、少ない菌量で、また短時間で、発色良く、かつ
退色することなく容易にProteus属、Morganella属及びP
rovidencia属の細菌の鑑別が可能となる。
フロントページの続き (72)発明者 三品 正俊 茨城県結城市北南茂呂1075−2 日水製薬 株式会社診断薬研究部内

Claims (3)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 シート状吸水性支持体上に、少なくとも
    p-ニトロフェニルアラニン及び鉄化合物を担持してなる
    フェニルアラニンデアミナーゼ試験用反応シート。
  2. 【請求項2】 鉄化合物が、クエン酸第二鉄、クエン酸
    第二鉄アンモニウム、塩化第一鉄、塩化第二鉄又は硫酸
    第一鉄アンモニウムである請求項1記載の反応シート。
  3. 【請求項3】 更に栄養源、無機塩、緩衝剤及び水溶性
    高分子から選ばれる少なくとも1種が担持されている請
    求項1又は2記載の反応シート。
JP17703695A 1995-07-13 1995-07-13 フェニルアラニンデアミナーゼ試験用反応シート Pending JPH0923898A (ja)

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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2007044052A (ja) * 2003-09-02 2007-02-22 Expressive Constructs Inc 合成チモーゲンを用いるシグナル増幅

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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JP2007044052A (ja) * 2003-09-02 2007-02-22 Expressive Constructs Inc 合成チモーゲンを用いるシグナル増幅

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