JP6158097B2 - 炎症を抑制するためのペプチド - Google Patents

Description

［関連出願の相互参照］
本出願は、２０１１年３月１８日に出願された米国仮特許出願第６１／４５４，３４２号の優先権を主張し、その仮特許出願は、引用することにより本明細書の一部をなすものとする。

［発明の分野］
本開示は、炎症を低減または抑制し、神経炎症を低減または抑制し、神経学的状態を処置するためのペプチド、方法、および組成物に関する。

［配列表］
配列表は、電子形式でのみ本出願の出願と共に提供され、引用することにより本明細書の一部をなすものとする。配列表ファイル９１１１−ＷＯ００＿ＡＳＦＩＬＥＤ＿ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ＿Ｔｅｘｔ．ｔｘｔは、２０１２年３月１５日に作成され、サイズは１０，９３８バイトである。

アポリポタンパク質Ｅ（「ＡｐｏＥ」）は、複数の生物学的機能を示す、主に肝臓および脳で産生される、２９９アミノ酸（３４ｋＤａ）の糖タンパク質である。コレステロール輸送および代謝におけるその役割について最初に認識された、ＡｐｏＥは、超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）と高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）の複合体中に存在し、ＡｐｏＥは、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）受容体、ＬＤＬ受容体関連タンパク質（ＬＲＰ）、およびＶＬＤＬ受容体を結合することができる。Ｗｅｉｓｇｒａｂｅｒ、（１９９４）Ａｄｖ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｈｅｍ．４５：２４９〜３０２。ＡｐｏＥはまた、免疫調節性を有すること（Ｌａｓｋｏｗｉｔｚら、（２００１）Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．１６７：７４〜８５）、ならびに神経学的疾患および脳傷害の応答において役割を果たすこと（ＬａｓｋｏｗｉｔｚおよびＶｉｔｅｋ、（２００７）Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ ８：９５９〜６９）が知られている。

ＡｐｏＥの三次構造は、受容体結合ドメインを含む、４αヘリックスモチーフを有するアミノ末端領域、および脂質結合に大きく関与しているカルボキシ末端領域を含む。ＡｐｏＥの受容体結合領域は、その成熟完全長タンパク質の残基１３０〜１５０におけるヘリックスドメインにマッピングされており、ＡｐｏＥのこの領域は、グリア活性化およびＣＮＳ炎症を抑制するその能力を支配する。

一態様では、本開示は、以下の式Ｉを含む５個、６個、７個、８個、または９個のアミノ酸残基の単離されたペプチドまたはその塩を提供する：
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５（配列番号１）
（式中、Ｘ１は、疎水性側鎖を有するアミノ酸または正荷電側鎖を有するアミノ酸から選択され、Ｘ２は、疎水性側鎖を有するアミノ酸、正荷電側鎖を有するアミノ酸、または極性非荷電側鎖を有するアミノ酸から選択され、Ｘ３は、正荷電側鎖を有するアミノ酸から選択され、Ｘ４は、正荷電側鎖を有するアミノ酸から選択され、Ｘ５は、疎水性側鎖を有するアミノ酸または正荷電側鎖を有するアミノ酸から選択される）。この態様のいくつかの実施形態は、以下の式ＩＩのペプチドを提供する：
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９（配列番号１７）
（式中、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、およびＸ５は上記で言及された通りであり、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ８、およびＸ９のそれぞれは、任意のアミノ酸から非依存的に選択され、場合により、欠如している）。

一態様では、本開示は、以下の式Ｉの単離されたペプチドまたはその塩を提供する：
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５（配列番号１）
（式中、Ｘ１は、疎水性側鎖を有するアミノ酸または正荷電側鎖を有するアミノ酸から選択され、Ｘ２は、疎水性側鎖を有するアミノ酸、正荷電側鎖を有するアミノ酸、または極性非荷電側鎖を有するアミノ酸から選択され、Ｘ３は、正荷電側鎖を有するアミノ酸から選択され、Ｘ４は、正荷電側鎖を有するアミノ酸から選択され、Ｘ５は、疎水性側鎖を有するアミノ酸または正荷電側鎖を有するアミノ酸から選択される）。

この態様の実施形態では、本開示は、配列番号１（式中、Ｘ１はＶまたはＲであり、Ｘ２はＳ、Ａ、またはＨであり、Ｘ３はＫまたはＲであり、Ｘ４はＫまたはＲであり、Ｘ５はＲ、Ｌ、またはＫである）によるペプチドまたはその塩を提供する。この態様のいくつかの実施形態では、本開示は、ＶＳＲＫＲ（配列番号２）、ＶＳＫＲＲ（配列番号３）、ＶＳＲＲＲ（配列番号４）、ＶＡＲＫＬ（配列番号５）、ＲＨＫＫＬ（配列番号６）、ＲＡＲＲＬ（配列番号７）、ＲＳＫＫＬ（配列番号８）、ＲＨＫＲＲ（配列番号９）、ＶＡＲＲＬ（配列番号１０）、ＶＡＲＲＫ（配列番号１１）、またはＲＳＫＲＲ（配列番号１２）を含むペプチドまたはその塩を提供する。

一態様では、本開示は、式Ｉの単離されたペプチド、および担体、希釈剤、溶媒、または補助剤を含む組成物を提供する。この態様の実施形態は、配列番号１（式中、Ｘ１はＶまたはＲであり、Ｘ２はＳ、Ａ、またはＨであり、Ｘ３はＫまたはＲであり、Ｘ４はＫまたはＲであり、Ｘ５はＲ、Ｌ、またはＫである）によるペプチドまたはその塩を含む組成物を提供する。この態様のいくつかの実施形態では、本開示は、ＶＳＲＫＲ（配列番号２）、ＶＳＫＲＲ（配列番号３）、ＶＳＲＲＲ（配列番号４）、ＶＡＲＫＬ（配列番号５）、ＲＨＫＫＬ（配列番号６）、ＲＡＲＲＬ（配列番号７）、ＲＳＫＫＬ（配列番号８）、ＲＨＫＲＲ（配列番号９）、ＶＡＲＲＬ（配列番号１０）、ＶＡＲＲＫ（配列番号１１）、またはＲＳＫＲＲ（配列番号１２）のペプチドまたはその塩を含む組成物を提供する。

一態様では、本開示は、それを必要としている対象において炎症を低減する方法であって、以下の式Ｉのペプチドまたはその塩の有効量を対象に投与する工程を含む方法を提供する：
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５（配列番号１）
（式中、Ｘ１は、疎水性側鎖を有するアミノ酸または正荷電側鎖を有するアミノ酸から選択され、Ｘ２は、疎水性側鎖を有するアミノ酸、正荷電側鎖を有するアミノ酸、または極性非荷電側鎖を有するアミノ酸から選択され、Ｘ３は、正荷電側鎖を有するアミノ酸から選択され、Ｘ４は、正荷電側鎖を有するアミノ酸から選択され、Ｘ５は、疎水性側鎖を有するアミノ酸または正荷電側鎖を有するアミノ酸から選択される）。

この態様の実施形態では、方法は、配列番号１（式中、Ｘ１はＶまたはＲであり、Ｘ２はＳ、Ａ、またはＨであり、Ｘ３はＫまたはＲであり、Ｘ４はＫまたはＲであり、Ｘ５はＲ、Ｌ、またはＫである）によるペプチドまたはその塩を含む。この態様のいくつかの実施形態では、方法は、ＶＳＲＫＲ（配列番号２）、ＶＳＫＲＲ（配列番号３）、ＶＳＲＲＲ（配列番号４）、ＶＡＲＫＬ（配列番号５）、ＲＨＫＫＬ（配列番号６）、ＲＡＲＲＬ（配列番号７）、ＲＳＫＫＬ（配列番号８）、ＲＨＫＲＲ（配列番号９）、ＶＡＲＲＬ（配列番号１０）、ＶＡＲＲＫ（配列番号１１）、またはＲＳＫＲＲ（配列番号１２）を含むペプチドまたはその塩を提供する。

一態様では、本開示は、それを必要としている対象において神経学的状態を処置する方法であって、以下の式Ｉのペプチドまたはその塩の有効量を対象に投与することを含む方法を提供する：
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５（配列番号１）
（式中、Ｘ１は、疎水性側鎖を有するアミノ酸または正荷電側鎖を有するアミノ酸から選択され、Ｘ２は、疎水性側鎖を有するアミノ酸、正荷電側鎖を有するアミノ酸、または極性非荷電側鎖を有するアミノ酸から選択され、Ｘ３は、正荷電側鎖を有するアミノ酸から選択され、Ｘ４は、正荷電側鎖を有するアミノ酸から選択され、Ｘ５は、疎水性側鎖を有するアミノ酸または正荷電側鎖を有するアミノ酸から選択される）。

この態様の実施形態では、方法は、配列番号１（式中、Ｘ１はＶまたはＲであり、Ｘ２はＳ、Ａ、またはＨであり、Ｘ３はＫまたはＲであり、Ｘ４はＫまたはＲであり、Ｘ５はＲ、Ｌ、またはＫである）によるペプチドまたはその塩を含む。この態様のいくつかの実施形態では、方法は、ＶＳＲＫＲ（配列番号２）、ＶＳＫＲＲ（配列番号３）、ＶＳＲＲＲ（配列番号４）、ＶＡＲＫＬ（配列番号５）、ＲＨＫＫＬ（配列番号６）、ＲＡＲＲＬ（配列番号７）、ＲＳＫＫＬ（配列番号８）、ＲＨＫＲＲ（配列番号９）、ＶＡＲＲＬ（配列番号１０）、ＶＡＲＲＫ（配列番号１１）、またはＲＳＫＲＲ（配列番号１２）を含むペプチドまたはその塩を提供する。いくつかの実施形態では、方法は、外傷性ＣＮＳ傷害、くも膜下出血、頭蓋内出血、脳卒中、実験的アレルギー性脳脊髄炎、多発性硬化症、神経炎症、慢性神経学的疾患、ＡＬＳ、認知症、ニューロパシー、てんかん、パーキンソン病、およびアルツハイマー病の少なくとも１つから選択される神経学的状態を処置することを含む。

他の態様では、本開示は、本明細書に記載されているように、式Ｉの少なくとも１つのペプチドを含む薬剤、その薬剤の調製のための方法、およびその薬剤の投与を含む方法を提供する。

上記で論じられた態様の様々な実施形態では、本開示は、挙げられた配列および式から実質的になる、またはそれらからなるペプチドに関し、かつペプチドを提供する。

本開示は、次に続く図面および詳細な説明に鑑みて、当業者にとって明らかであろう追加の態様および実施形態を提供する。

ミクログリアＴＮＦ−α分泌のペプチドによる阻害を示すグラフである。培養ＢＶ−２マウスミクログリア細胞を、示された濃度のペプチド（配列番号３）かまたは陰性対照ペプチド（配列番号１３）のいずれかとインキュベートし、リポ多糖（ＬＰＳ）（１００ｎｇ／ｍＬ）で６時間、刺激した。６時間後、上清を採取し、分泌されたＴＮＦ−αの濃度をＥＬＩＳＡによって測定した（^＊＊ｐ＜０．０１、ＡＮＯＶＡ）。 外傷性脳傷害後にペプチドで処理されたマウスによる前庭運動機能の向上を示す図である。前庭運動機能を、ロトロッド（rotorod）潜時に関して評価した。ベースラインロトロッド潜時を、無傷頭蓋に対する管理された空気圧衝撃により誘導された外傷性脳傷害の前（０日目）およびその後毎日、評価した。外傷性脳傷害の２時間後および６時間後に、ペプチド（配列番号３、０．０５ｍｇ／ｋｇまたは０．２ｍｇ／ｋｇ）または食塩水溶媒のいずれかをマウスに尾静脈内注射した。ペプチドで処理された動物は、試験期間を通して、ロトロッド潜時の増加によって反映されているように、溶媒での処理と比べて、前庭運動パフォーマンスの向上を示した（^＊ｐ＜０．０５、ＡＮＯＶＡ）。 外傷性脳傷害後にペプチドで処理されたマウスによる前庭運動機能の向上を示す図である。前庭運動機能を、ロトロッド潜時に関して評価した。ベースラインロトロッド潜時を、無傷頭蓋に対する管理された空気圧衝撃により誘導された外傷性脳傷害の前（０日目）およびその後毎日、評価した。外傷性脳傷害の２時間後および６時間後に、ペプチド（配列番号４、０．０５ｍｇ／ｋｇ）または食塩水溶媒のいずれかをマウスに尾静脈内注射した。ペプチドで処理された動物は、試験期間を通して、ロトロッド潜時の増加によって反映されているように、前庭運動パフォーマンスの向上を示した（^＊ｐ＜０．０５、反復測定ＡＮＯＶＡ）。 頭蓋に対する管理された空気圧衝撃により誘導された外傷性脳傷害後にペプチドで処理されたマウスによる認知神経科学的転帰の改善を示す図である。外傷性脳傷害の２時間後および６時間後に、ペプチド（配列番号４、０．０５ｍｇ／ｋｇまたは０．２ｍｇ／ｋｇ）または食塩水溶媒のいずれかをマウスに尾静脈内注射した。認知神経科学的パフォーマンスを、モーリス水迷路潜時に関して評価した。水迷路潜時を、外傷性脳傷害後２８日目に開始した水面下プラットフォーム試験により評価し、傷害後の連続した２９日目、３０日目、および３１日目において、パフォーマンスをさらに評価した。ペプチドで処理された動物は、試験期間を通して、水迷路潜時の減少によって反映されているように、認知神経科学的転帰の改善を示した（^＊ｐ＜０．０５、ＡＮＯＶＡ）。 脳内出血後にペプチドで処理されたマウスによる前庭運動機能の向上を示す図である。前庭運動機能を、ロトロッド潜時に関して評価した。ベースラインロトロッド潜時を、定位的コラゲナーゼ注射により誘導された脳内出血の前（０日目）およびその後毎日、評価した。コラゲナーゼ注射の２時間後および６時間後に、ペプチド（配列番号４、０．０５ｍｇ／ｋｇ）または食塩水溶媒のいずれかをマウスに尾静脈内注射した。ペプチドで処理された動物は、試験期間を通して、ロトロッド潜時の増加によって反映されているように、前庭運動パフォーマンスの向上を示した（^＊ｐ＜０．０５、反復測定ＡＮＯＶＡ）。 ＡｐｏＥ模倣ペプチド（配列番号４）で処理された培養物におけるＮＭＤＡ曝露後のＬＤＨ放出のパーセント抑制を示す図である。 衝撃波管爆風モデル装置のセクションを示す図である。 モーリス水迷路潜時による、爆風損傷を有するマウスの認知神経科学的パフォーマンスへのＡｐｏＥ模倣ペプチド（配列番号４）の効力（学習傾向差に関してｐ＝０．７）を示す図である。 ０．８ｍｇ／ｋｇの単回投与後の時間経過に対するマウスの血漿中のＶＳＲＲＲ（配列番号４）ペプチドの平均量および個々の量を示す図である。 時間経過に対するマウス由来の脳組織におけるＶＳＲＲＲ（配列番号４）ペプチドのＣＮＳ透過を示す図である。 ＶＲ−５５（配列番号４）、ＶＬ−５−１（配列番号５）、およびＶＬ−５−３（配列番号１０）によるミクログリアＴＮＦ−α分泌の阻害を示す図である。 非定型的中大脳動脈閉塞後にペプチドで処理されたマウスの前庭運動機能を示す図である。

本明細書に記載された様々な態様および実施形態は、単に例示を目的とするものにすぎず、特許請求の範囲の範囲を限定する役割を果たすものではないことが理解されよう。

冠詞「１つの（ａ）」および「１つの（ａｎ）」は、その冠詞の文法的対象の１つまたは１つより多く（すなわち、少なくとも１つ）を指すように本明細書で用いられる。例として、「１つの（ａｎ）要素」は、少なくとも１つの要素を意味し、１つより多い要素を含むことができる。他に規定がない限り、本明細書で用いられる全ての技術的用語は、本開示が属する分野の業者によって一般的に理解されているのと同じ意味をもつ。

一般的な意味では、本開示は、ＡｐｏＥ活性（本明細書では、「ＡｐｏＥ模倣活性」とも呼ばれる）を示すことができる単離および／または合成ペプチドを含むペプチドに関する。本明細書で用いられる場合、ＡｐｏＥは、ＡＰＯＥ遺伝子によってコードされるヒトアポリポタンパク質Ｅのタンパク質の様々なアイソフォーム（例えば、対立遺伝子）のいずれかに関する。ＡｐｏＥの非限定的例には、ＡｐｏＥ３（配列番号１４）、ＡｐｏＥ２（配列番号１５）、およびＡｐｏＥ４（配列番号１６）が挙げられる。ＡｐｏＥ活性には、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏのいずれかでのＡｐｏＥタンパク質に関連している、任意の機能性生物活性または生物活性の組み合わせが挙げられる。ＡｐｏＥ活性は、例えば、コレステロール代謝、生理的ＡｐｏＥ受容体タンパク質への結合、神経保護活性、抗酸化活性、抗興奮毒性活性、グリア細胞活性の調節、炎症、神経炎症の調節などのいずれか１つまたは組み合わせを指すことができる。最近の研究により、ａｐｏＥ模倣活性を有するペプチドが、例えば、アルツハイマー病（Ｌａｓｋｏｗｉｔｚら、（２０１０）Ｊ Ｎｅｕｒｏｔｒａｕｍａ ２７：１９８３〜１９９５）、多発性硬化症（Ｌｉら、ＪＰＥＴ、２００６），くも膜下出血（Ｇａｏら；２００６ Ｍｅｓｉｓら、２００６）、脳卒中（Ｔｕｋｈｏｖｓｋａｙａ、Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｒｅｓ、２００６）、およびニューロパシー（Ｌｉら、ＪＰＥＴ、２０１０）を含むいくつかの動物モデルにおいて有益な効果を生じ得ることが示されている。したがって、本明細書に開示されたペプチド、組成物、および方法は、それらが、ＡｐｏＥに関連した、一連の疾患、障害、および臨床的適応症を処置するのに用いることができるので、幅広い用途がある。

ＡｐｏＥは、ＬＤＬ受容体、ＶＬＤＬ受容体、ＬＲＰ／α２Ｍ受容体、ＥＲ−２受容体、ＬＲ８受容体、ＡｐｏＥ受容体２（ａｐｏＥＲ２）、およびメガリン／ｇｐ３３０など（まとめて「ＡｐｏＥ受容体」）などのスカベンジャー受容体を含む受容体の公知のリガンドである。受容体結合相互作用に関与することが知られたＡｐｏＥの１つの領域は、天然ＡｐｏＥポリペプチド（配列番号１４）の残基１３０〜１５０の間にあるα−ヘリックスドメインである。このヘリックスドメインを含む活性ＡｐｏＥ断片は、ＡｐｏＥ模倣活性を示している（引用することにより本明細書の一部をなすものとする米国特許第７，３１９，０９２号および第７，２０５，２８０号を参照）。これらのペプチドは、受容体結合ヘリックスドメインにおける天然ＡｐｏＥ一次アミノ酸配列を保持し、天然α−ヘリックス二次構造を保存している（Ｌａｓｋｏｗｉｔｚら（２００１）Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．１６７：７４〜８５）。これらのペプチドの活性は、天然α−ヘリックス二次構造の保持に依存することが示されている（Ｌａｓｋｏｗｉｔｚら（２００６）Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｌ．Ｓｃａｎｄ．１１４（Ｓｕｐｐ．１８５）：１５〜２０）。下記でより詳細に記載されているように、ＡｐｏＥとの一次配列同一性を有さない小ペプチド（例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、または９個のアミノ酸残基長）が、ＡｐｏＥ生物活性を調節し、誘導し、および／または模倣するのに有効であり、かつＡｐｏＥ生物学的機能に関わる様々な疾患、障害、または状態の処置に用い得ることが、驚くべきことに見出されている。

本明細書で用いられる場合、「ペプチド」は、少なくとも単一のアミノ酸残基を含む化合物、もしくはその誘導体、または少なくとも１つのアミノ酸模倣体を含む化合物を指す。アミノ酸は当技術分野においてよく知られており、それには、例えば、イソロイシン、ロイシン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、リシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、メチオニン、システイン、フェニルアラニン、スレオニン、トリプトファン、グリシン、バリン、プロリン、セリン、チロシン、アルギニン、ヒスチジン、ノルロイシン、オルニチン、タウリン、セレノシステイン、セレノメチオニン、ランチオニン、２−アミノイソ酪酸、デヒドロアラニン、ヒプシン、シトルリン、３−アミノプロピオン酸、ガンマ−アミノ酪酸、ニトロアルギニン、Ｎ−メチル化ロイシン、ホモアルギニン、ジメチルアルギニン、アセチルリシン、アザリシン、ピロリシンなどが挙げられる。「アミノ酸側鎖」は、あるアミノ酸を別のアミノ酸から識別する様々な有機置換基を指す。疎水性側鎖を有するアミノ酸には、アラニン（Ａ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）、およびバリン（Ｖ）の非限定的な例が挙げられる。典型的な生理的条件下で正荷電側鎖を有するアミノ酸には、アルギニン（Ｒ）、ヒスチジン（Ｈ）、およびリシン（Ｋ）の非限定的例が挙げられる。典型的な生理的条件下で負荷電側鎖を有するアミノ酸には、アスパラギン酸（Ｄ）およびグルタミン酸（Ｅ）の非限定的例が挙げられる。極性非荷電側鎖を有するアミノ酸には、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、アスパラギン（Ｎ）、およびグルタミン（Ｑ）の非限定的例が挙げられる。これらの非限定的例を考慮すれば、当業者は、上記で明確には例示されていない他のアミノ酸側鎖の特性を（例えば、疎水性、正／負荷電、極性非荷電などとして）認識し、かつそれらを決定することができるであろう。アミノ酸側鎖の「誘導体」は、（例えば、新しい種を形成する化学反応、別の分子への共有結合などを通して）構造的に改変されているアミノ酸側鎖を指す。いくつかの実施形態は、改変が本明細書に記載されているようなペプチドの生物活性を破壊しない限り、非限定的に、グリコシル化、側鎖酸化、アセチル化、アミド化、またはリン酸化を含む改変を含むペプチドを提供する。例えば、いくつかの実施形態では、ペプチドは、Ｎ末端アセチル化および／またはＣ末端アミド化により改変されてもよい。

本明細書で用いられる場合、「アミノ酸模倣体」は、ペプチド模倣体、ペプトイド（ポリ−Ｎ−置換グリシン）、およびβ−ペプチド（すなわち、α炭素ではなくβ炭素に付着したアミノ基を有する１つまたは複数のアミノ酸残基を含むペプチド）を包含することを意図される。適切には、アミノ酸模倣体は、分子性質（例えば、安定性、活性、免疫原性応答の低下、溶解性など）を都合良く調整するように設計されている変化した化学構造を含む。典型的には、変化した化学構造は、天然に存在しないと考えられる（例えば、改変されたバックボーン、非天然アミノ酸などを組み込んでいる）。したがって、アミノ酸模倣体の非限定的例には、Ｄ−ペプチド、レトロ−ペプチド、レトロ−インベルソペプチド、β−ペプチド、ペプトイド、および１つもしくは複数のＤ−アミノ酸、ポリ−Ｎ−置換グリシン、もしくはβ−アミノ酸、またはそれらの任意の組み合わせを含む化合物が挙げられる。

典型的には、ペプチドは、少なくとも３個のアミノ酸（アミノ酸残基）またはアミノ酸模倣体の配列を含む。本開示の実施形態は、少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、または９個のアミノ酸残基、アミノ酸模倣体、またはそれらの組み合わせの小ペプチドに関する。本明細書に記載されたいくつかの実施形態は、９個未満、８個未満、７個未満、６個未満、５個未満、４個未満、３個未満、または２個未満のアミノ酸残基および／または模倣体のペプチドを提供する。いくつかの実施形態は、５アミノ酸長であるペプチドに関する。本明細書に記載されたペプチドは、荷電形態で、典型的には、正味の正電荷を有して提供することができ、塩（例えば、アルカリ金属塩、塩基性または酸性付加塩）として作製して、用いることができる。そのような塩の選択および形成は、当業者の能力の範囲内である。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，第２１版、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ａ Ｗｏｌｔｅｒｓ Ｋｌｕｗｅｒ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａ（２００５）参照。

本開示の実施形態は、ＡｐｏＥ模倣活性を有する合成ペプチドを提供する。それらはＡｐｏＥ模倣活性を示し得るが、開示されたペプチドは、ＡｐｏＥポリペプチド（配列番号１３）と一次タンパク質配列同一性を共有しない。換言すれば、開示されたペプチド配列は、ＡｐｏＥポリペプチドの一次アミノ酸配列では出現せず、それらは、天然ＡｐｏＥ受容体結合ドメインに類似したα−ヘリックス二次構造も示さない。実施形態では、合成ペプチドは、場合により、単一の活性種へ単離および／または精製される。

本開示の態様では、ペプチドは、以下の式Ｉまたはその塩を含む：
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５（配列番号１）
（式中、Ｘ１は、疎水性側鎖を有するアミノ酸または正荷電側鎖を有するアミノ酸から選択され、Ｘ２は、疎水性側鎖を有するアミノ酸、正荷電側鎖を有するアミノ酸、または極性非荷電側鎖を有するアミノ酸から選択され、Ｘ３は、正荷電側鎖を有するアミノ酸から選択され、Ｘ４は、正荷電側鎖を有するアミノ酸から選択され、Ｘ５は、疎水性側鎖を有するアミノ酸または正荷電側鎖を有するアミノ酸から選択される）。いくつかの実施形態は、Ｘ_１がＶまたはＲであり、Ｘ_２がＳ、Ａ、またはＨであり、Ｘ_３がＫまたはＲであり、Ｘ_４がＫまたはＲであり、Ｘ_５がＲ、Ｌ、またはＫである、ペプチドを提供する。

本態様のいくつかの実施形態は、以下の式ＩＩのペプチドを提供する：
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９（配列番号１７）
（式中、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、およびＸ５は上記で言及された通りであり、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ８、およびＸ９のそれぞれは、任意のアミノ酸から非依存的に選択され、場合により欠如している）。そのような実施形態では、式ＩＩのペプチドは、５個のアミノ酸残基、６個のアミノ酸残基、７個のアミノ酸残基、８個のアミノ酸残基、または９個のアミノ酸残基を含むことができる。

別の態様では、本開示は、以下の式Ｉのペプチドまたはその塩を提供する：
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５（配列番号１）
（式中、Ｘ１は、疎水性側鎖を有するアミノ酸または正荷電側鎖を有するアミノ酸から選択され、Ｘ２は、疎水性側鎖を有するアミノ酸、正荷電側鎖を有するアミノ酸、または極性非荷電側鎖を有するアミノ酸から選択され、Ｘ３は、正荷電側鎖を有するアミノ酸から選択され、Ｘ４は、正荷電側鎖を有するアミノ酸から選択され、Ｘ５は、疎水性側鎖を有するアミノ酸または正荷電側鎖を有するアミノ酸から選択される）。いくつかの実施形態は、Ｘ_１がＶまたはＲであり、Ｘ_２がＳ、Ａ、またはＨであり、Ｘ_３がＫまたはＲであり、Ｘ_４がＫまたはＲであり、Ｘ_５がＲ、Ｌ、またはＫである、ペプチドを提供する。

式Ｉによるペプチドのいくつかの非限定的実施形態は、表１に開示されている。いくつかの実施形態では、ペプチドは、ＶＳＲＫＲ（配列番号２）、ＶＳＫＲＲ（配列番号３）、ＶＳＲＲＲ（配列番号４）、ＶＡＲＫＬ（配列番号５）、ＲＨＫＫＬ（配列番号６）、ＲＡＲＲＬ（配列番号７）、ＲＳＫＫＬ（配列番号８）、ＲＨＫＲＲ（配列番号９）、ＶＡＲＲＬ（配列番号１０）、ＶＡＲＲＫ（配列番号１１）、またはＲＳＫＲＲ（配列番号１２）を含むことができる。いくつかの実施形態では、式Ｉによるペプチドは、ＶＳＲＫＲ（配列番号２）、ＶＳＫＲＲ（配列番号３）、ＶＳＲＲＲ（配列番号４）、ＶＡＲＫＬ（配列番号５）、ＲＨＫＫＬ（配列番号６）、ＲＡＲＲＬ（配列番号７）、ＲＳＫＫＬ（配列番号８）、ＲＨＫＲＲ（配列番号９）、ＶＡＲＲＬ（配列番号１０）、ＶＡＲＲＫ（配列番号１１）、またはＲＳＫＲＲ（配列番号１２）である。

本明細書に記載された全ての態様のいくつかの実施形態では、ペプチドは、本明細書に開示されたアミノ酸配列および式から実質的になる。本明細書に記載された全ての態様のいくつかの実施形態では、ペプチドは、本明細書に開示されたアミノ酸配列および式からなる。

いくつかの実施形態では、ペプチドは、少なくとも１つのＡｐｏＥ模倣活性を示すことができる。いくつかの実施形態では、例えば、開示されたペプチドは、例えば、グリア細胞によって発現された細胞表面受容体、加えて、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）曝露に関連した神経細胞死およびカルシウム流入（興奮毒性）を抑制するように機能する受容体などの１つもしくは複数の生理的ＡｐｏＥ受容体を結合することができ、（例えば、ｉｎ ｖｉｖｏ敗血症モデルにおいて）ＴＮＦ−αおよびＩＬ−６のＬＰＳ誘導性産生から保護し、アテローム性動脈硬化、関節炎、もしくは炎症性腸疾患などの炎症性障害を防止し、処置し、もしくは遅延させ、グリアもしくはミクログリア活性化を抑制し、マクロファージ活性化を抑制し、リンパ球活性化を抑制し、炎症を抑制し、ＣＮＳ炎症を抑制し、ニューロパシーを処置し、ならびに／または神経変性疾患（例えば、軽度認知機能障害、認知症、パーキンソン病、またはアルツハイマー病）および／もしくは急性ＣＮＳ外傷（例えば、外傷性脳傷害）において神経傷害を寛解させることができる。

いくつかの実施形態では、ペプチドは、ＡｐｏＥと類似した親和性で特定の受容体に結合する。いくつかの実施形態では、ペプチドは、約５０ｎＭの解離定数（Ｋ_ｄ）でマクロファージを結合する以前に開示されたより長い２０アミノ酸のＡｐｏＥ模倣ペプチドと類似した親和性で特定の受容体に結合する（Ｍｉｓｒａら、（２００１）Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ｂｉｏｌ．７０：６７７〜６８３）。例えば、ペプチドは、約１００μＭ、約９０μＭ、約８０μＭ、約７０μＭ、約６０μＭ、約５０μＭ、約４０μＭ、約３０μＭ、約２０μＭ、約１０μＭ、約５μＭ、約１μＭ、約１００ｎＭ、約９０ｎＭ、約８０ｎＭ、約７０ｎＭ、約６０ｎＭ、約５０ｎＭ、約４０ｎＭ、約３０ｎＭ、約２０ｎＭ、約１０ｎＭ、約５ｎＭ、約１ｎＭ、約１００ｐＭ、約９０ｐＭ、約８０ｐＭ、約７０ｐＭ、約６０ｐＭ、約５０ｐＭ、約４０ｐＭ、約３０ｐＭ、約２０ｐＭ、約１０ｐＭ、約５ｐＭ、または約１ｐＭ以下のＫ_ｄで受容体に結合し得る。ペプチドは、約１ｐＭ以上、約５ｐＭ、約１０ｐＭ、約２０ｐＭ、約３０ｐＭ、約４０ｐＭ、約５０ｐＭ、約６０ｐＭ、約７０ｐＭ、約８０ｐＭ、約９０ｐＭ、約１００ｐＭ、約１ｎＭ、約５ｎＭ、約１０ｎＭ、約２０ｎＭ、約３０ｎＭ、約４０ｎＭ、約５０ｎＭ、約６０ｎＭ、約７０ｎＭ、約８０ｎＭ、約９０ｎＭ、約１００ｎＭ、約１μＭ、約５μＭ、約１０μＭ、約２０μＭ、約３０μＭ、約４０μＭ、約５０μＭ、約６０μＭ、約７０μＭ、約８０μＭ、約９０μＭ、または約１００μＭのＫ_ｄで受容体に結合し得る。ペプチドは、約１ｐＭ〜約１０ｐＭ、約５ｐＭ〜約１５ｐＭ、約１０ｐＭ〜約２０ｐＭ、約２０ｐＭ〜約３０ｐＭ、約３０ｐＭ〜約４０ｐＭ、約４０ｐＭ〜約５０ｐＭ、約５０ｐＭ〜約６０ｐＭ、約６０ｐＭ〜約７０ｐＭ、約７０ｐＭ〜約８０ｐＭ、約８０ｐＭ〜約９０ｐＭ、約９０ｐＭ〜約１００ｐＭ、約１００ｐＭ〜約１ｎＭ、約１ｎＭ〜約１０ｎＭ、約５ｎＭ〜約１５ｎＭ、約１０ｎＭ〜約２０ｎＭ、約２０ｎＭ〜約３０ｎＭ、約３０ｎＭ〜約４０ｎＭ、約４０ｎＭ〜約５０ｎＭ、約５０ｎＭ〜約６０ｎＭ、約６０ｎＭ〜約７０ｎＭ、約７０ｎＭ〜約８０ｎＭ、約８０ｎＭ〜約９０ｎＭ、約９０ｎＭ〜約１００ｎＭ、約１００ｎＭ〜約１μＭ、約１μＭ〜約１０μＭ、約５μＭ〜約１５μＭ、約１０μＭ〜約２０μＭ、約２０μＭ〜約３０μＭ、約３０μＭ〜約４０μＭ、約４０μＭ〜約５０μＭ、約５０μＭ〜約６０μＭ、約６０μＭ〜約７０μＭ、約７０μＭ〜約８０μＭ、約８０μＭ〜約９０μＭ、約９０μＭ〜約１００μＭ、約１００μＭ〜約１μＭの範囲内のＫ_ｄで受容体に結合し得る。例えば、ペプチドは、約１００μＭ、約９０μＭ、約８０μＭ、約７０μＭ、約６０μＭ、約５０μＭ、約４０μＭ、約３０μＭ、約２０μＭ、約１０μＭ、約５μＭ、約１μＭ、約１００ｎＭ、約９０ｎＭ、約８０ｎＭ、約７０ｎＭ、約６０ｎＭ、約５０ｎＭ、約４０ｎＭ、約３０ｎＭ、約２０ｎＭ、約１０ｎＭ、約５ｎＭ、約１ｎＭ、約１００ｐＭ、約９０ｐＭ、約８０ｐＭ、約７０ｐＭ、約６０ｐＭ、約５０ｐＭ、約４０ｐＭ、約３０ｐＭ、約２０ｐＭ、約１０ｐＭ、約５ｐＭ、または約１ｐＭ以下のＫ_ｄでマクロファージに結合し得る。

ＡｐｏＥ受容体への結合の程度は、例えば、典型的な結合アッセイ（例えば、競合結合アッセイ）、ＥＬＩＳＡ、機能アッセイ（例えば、実施例に例証されているような）などの当技術分野において知られた任意の技術を用いて評価することができる。いくつかの実施形態では、ペプチドのサイズは、薬物動態の改善を与え、血液脳関門の横断を促進し、鼻腔内投与を可能にし、製造コストを低下させ、（例えば、１グラムあたりでの）効力を増加させ、および／またはペプチド免疫原性を低下させることができる。

ペプチドは、例えば、合成方法および組換え方法を含む、当技術分野において知られたポリペプチドを作製するための任意の手段を用いて産生することができる。例えば、いくつかの実施形態では、ペプチドは、固相合成、メリフィールド型固相合成、ｔ−Ｂｏｃ固相合成、Ｆｍｏｃ固相合成、ＢＯＰ固相合成、および液相合成などの合成化学技術を用いて合成することができる。例えば、ＳｔｅｗａｒｔおよびＹｏｕｎｇ、Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，第２版、（１９８４）Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ Ｉｌｌ．；Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａｎａｌｙｓｉｓ， Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， Ｂｉｏｌｏｇｙ，ＧｒｏｓｓおよびＭｅｉｅｎｈｏｆｅｒ編、１〜２巻（１９８０）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｂｏｄａｎｓｋｙ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，（１９８４）Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｂｅｒｌｉｎ参照。他の実施形態では、ペプチドは、例えば、当業者によく知られている組換え技術により、細胞において、または無細胞系において、ペプチドをコードする核酸からペプチドを発現することによって産生することができる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，（２００１）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ；Ａｕｓｕｂｅｌら，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，（２００２）Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｓｏｍｅｒｓｅｔ、ＮＪ（それぞれは、引用することにより本明細書の一部をなすものとする）を参照されたい。ペプチドは、本明細書に記載された、またはそうでなければ、例えば、ＭｃＯｍｉｅ、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，（１９７３）Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋに記載されたものなどの当業者に知られた、様々な改変および保護基のいずれかを組み入れることができる。

いくつかの実施形態では、ペプチドは、天然ＡｐｏＥポリペプチド（配列番号１４）の残基１３０〜１５０の間にあるα−ヘリックス受容体結合ドメインの物理的、化学的、および／または構造的特徴を模倣するように設計することができる。例えば、いくつかの実施形態では、ペプチドは、「リニアウォーク（linear walk）」ペプチド設計アプローチ［ペプチドにおけるそれぞれの連続する位置のアミノ酸が、ヘリックスのそれぞれの下行周期的ターン（descending periodic turn）による天然ＡｐｏＥ受容体結合ヘリックスの極性表面上に露出したそれぞれの連続する残基の１つまたは複数の性質（例えば、相対的サイズ／立体障害、極性、非極性、荷電、非荷電、ヒドロパシー指標（例えば、疎水性、親水性）、酸性、塩基性、結合（例えば、共有結合、水素結合、ファンデルワールス相互作用）を形成する能力など）を真似ようと試みることによって選択される］を用いて、天然ＡｐｏＥ受容体結合ヘリックスの三次元構造の外表面に沿って広がる極性表面の物理的、化学的、および／または構造的特徴を模倣するように設計することができる。いくつかの実施形態では、ペプチドは、１つまたは複数のＡｐｏＥ受容体のＡｐｏＥ結合ドメインの物理的、化学的、および／または構造的特徴に基づいて設計されてもよい。例えば、分子間の受容体−リガンド結合相互作用においてＡｐｏＥと相互作用する結合ポケットまたは表面を有するＡｐｏＥ受容体について、ペプチドは、受容体のＡｐｏＥ結合ポケット／表面に沿って結合相互作用を示すことが予想されるペプチドアミノ酸残基を選択することによって、ペプチドと受容体のＡｐｏＥ結合ポケット／表面との間の推定の結合親和性を最大にするように設計されてもよい。

態様では、本開示は、それを必要としている対象において神経学的状態を処置する方法であって、有効量の式Ｉもしくは式ＩＩのペプチド、あるいは有効量の式Ｉもしくは式ＩＩのペプチドを含む組成物もしくは製剤、またはその組み合わせを対象に投与することを含む、方法を提供する。

別の態様では、本開示は、それを必要としている対象において炎症を低減する方法であって、有効量の式Ｉもしくは式ＩＩのペプチド、あるいは有効量の式Ｉもしくは式ＩＩのペプチドを含む組成物もしくは製剤、またはその組み合わせを対象に投与することを含む、方法を提供する。

上記の態様に関する実施形態では、ペプチドおよび／または組成物は、急性および／または慢性ＣＮＳ傷害の特定の徴候、症状、および／または有害な神経学的影響を処置し、寛解させ、または防止するために用いることができる。本明細書で用いられる場合、急性ＣＮＳ傷害には、脳卒中（血栓症、塞栓症、または血管狭窄によって引き起こされる）、閉鎖性頭部傷害、外傷性脳傷害、全脳虚血（例えば、心筋梗塞、心不整脈、出血性ショック、および冠動脈バイパスグラフト後脳傷害を含む、任意の原因の全身性低血圧による虚血）、虚血性脳卒中、全無酸素症、局所虚血、くも膜下出血、および頭蓋内出血が挙げられるが、それらに限定されない。中枢神経系への虚血性損傷は、全体性かまたは局所性のいずれかの虚血状態に起因し得る。全虚血は、脳全体への血流が、心停止中などの一時期、停止する場合に生じる。局所虚血は、脳の一部が、大脳血管の血栓塞栓性閉塞中、外傷性脳傷害、水腫、および脳腫瘍など、正常な血流を奪われている場合に生じる。脳虚血によるＣＮＳ損傷の大部分は、虚血状態から数時間またはさらに数日間の間に起こり、損傷組織による細胞毒性産物の放出に二次的なものである。慢性ＣＮＳ傷害には、アルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病、てんかん、およびＨＩＶ関連脳症が挙げられるが、それらに限定されない。ＡｐｏＥペプチドがグリア活性化を抑制し得るという所見により、ミクログリア活性化を伴う任意の神経学的疾患を処置する開示された方法、ペプチド、および組成物についての役割がもたらされる。例えば、ミクログリアは、ＡＤにおいて活性化のマーカーを発現し、ＡＤにおける重大な炎症事象がミクログリアに関わることを示唆する。そのような活性化されたミクログリアは、アミロイド班近くにクラスター形成する。ミクログリアはまた、てんかんにおいても活性化される。

いくつかの実施形態では、ペプチドおよび／または組成物は、神経系（例えば、ＣＮＳ）を冒す炎症状態に関連した臨床神経学的徴候および症状を防止し、処置し、または寛解させるために用いることができる。非限定的例には、多発性硬化症、血管炎、急性播種性脳脊髄炎、およびギラン−バレー症候群が挙げられる。この関連において、開示されたＡｐｏＥ模倣ペプチドは、ＣＮＳ炎症状態の処置のための医薬組成物を製剤化するために、単独で、または他の公知の抗炎症薬もしくはサイトカインと組み合わせて、用いることができる。

いくつかの実施形態では、ペプチドおよび／または組成物は、ＮＭＤＡ興奮毒性に関連した状態を防止し、処置し、または寛解させるために用いることができる。ＮＭＤＡ興奮毒性は、ラチリズム、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、統合失調症、ＨＩＶ認知症および脳症、ハンチントン舞踏病、パーキンソン病、双極性障害、ヒトにおける多発硬化症および動物における実験的アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）、疼痛、うつ病、脳卒中、てんかん、遺伝性ｄ−２−ヒドロキシグルタル酸尿症、ＡＤ、ならびに外傷性脳傷害に関連している。いくつかの実施形態では、ペプチドおよび／または組成物は、ＮＭＤＡ受容体媒介性興奮毒性を遮断し、神経保護を与えることができる。ＮＭＤＡアンタゴニストもまた、臨床的麻酔に用いられ、慢性痛、薬剤耐性、およびアルコール依存症を抑制することが示されている。したがって、いくつかの実施形態では、開示された方法、ペプチド、および組成物は、麻酔製剤における、および記載された状態を処置するのに有用な他の公知の化合物を含有する混合型治療用組成物における成分として用いられてもよい。

いくつかの実施形態では、ペプチドおよび／または組成物は、敗血症においてサイトカインのＬＰＳ誘導性産生から保護するために用いることができる。無傷ＡｐｏＥは、細菌性ＬＰＳ誘導性死亡からマウスを保護することが示されている。他の可能な敗血症併用療法は、ＩＬ−１０、トランスフォーミング増殖因子ベータ、顆粒球コロニー刺激因子、ＩＦＮ−ファイ、マクロファージ遊走阻止因子、および高移動度グループ１タンパク質を含む抗炎症性サイトカインと、抗エンドトキシン抗体、抗腫瘍壊死因子抗体、および抗ＣＤ１４抗体を含むモノクローナル抗体とを投与することを含む。したがって、実施形態は、敗血症を処置するための組成物および方法における、単独での、または他の公知の抗炎症性サイトカインおよび抗体と併用してのペプチドの使用を提供する。

開示された方法、ペプチド、および組成物の効果は、細胞もしくは組織レベルで（例えば、組織学的に、または形態計測学的に）、または対象の神経学的状態を評価することにより、評価されてもよい。グリア活性化の抑制または低下は、当業者に明らかであるような様々な方法によって評価することができ、１つのそのような方法は、活性化グリアによって産生されることが知られている化合物の産生または存在を測定し、そのような測定値を、対照状況における同じ化合物のレベルと比較することである。あるいは、ミクログリア活性化を抑制し、低下させ、または防止することにおける本方法および本化合物の効果は、処置された対象および対照の対象においてＣＮＳ疾患の徴候および／または症状を比較することによって評価されてもよく、そのような徴候および／または症状は、ミクログリアの活性化に関連し、またはミクログリアの活性化に二次的なものである。

典型的には、疾患または処置を必要としている対象に関連して用いられる場合、用語「処置すること」および「処置」には、未処置の対象および／または処置の非存在下と比較して、疾患進行の停止もしくは遅延、疾患の寛解、症状および／もしくは臨床的指標の予防もしくは緩和、疾患および／もしくは症状重症度の低下、または疾患期間の減少が挙げられるが、それらに限定されない。実施形態では、処置の方法は、処置されることになっている特定の疾患の１つまたは複数の臨床的指標を軽減し、または寛解させることができる。ＡｐｏＥ活性に関連した疾患または状態を処置する方法に関する特定の実施形態は、治療的有効量の式Ｉもしくは式ＩＩのペプチド、または配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２から選択される１つもしくは複数のペプチド、加えてそれらの医薬組成物の投与を含む。実施形態では、処置の方法は、ＡｐｏＥ活性に関連した、疾患および／もしくは症状のさらなる進行を防止し、疾患および／もしくは症状のさらなる進行を遅らせ、もしくは低下させ、または疾患および／もしくは臨床症状を逆転させる任意の方法に関し得る。

本明細書に記載された方法によって処置される対象は、哺乳動物対象を包含し、それらには、ヒト対象と、イヌ、ネコ、ウサギ、ヤギ、ウマ、ブタ、ウシなどの非ヒト（動物）対象の両方（男性（雄）と女性（雌）の両方の対象、ならびに乳児、若年、青年、および成人の対象を含む全ての年齢の対象を含む）が挙げられる。対象は、炎症を低減し、ミクログリア活性化を抑制し、慢性疾患を寛解させるなどの任意の目的のために処置され得る。本明細書で用いられる場合、用語「同時（concurrently）投与される」は、２つの化合物が、複合された免疫学的効果に達するのに時間的に十分、接近して投与されることを意味する。したがって、同時（concurrent）投与は、逐次の投与または同時の（simultaneous）投与（例えば、共通の、または同じ担体中での同時の（simultaneous）投与）によって実行されてもよい。

いくつかの実施形態では、開示されたペプチドおよび組成物は、任意の適切な投与経路によって投与されてもよく、その投与経路には、注射（皮下、腹腔内、静脈内、くも膜下腔内、筋肉内、脳室内、および脊髄の注射）、鼻腔内、経口、経皮、非経口、吸入、鼻咽頭、または経粘膜の吸収が挙げられるが、それらに限定されない。投与は、医薬組成物として製剤化された本明細書に記載された（例えば、式Ｉ、式ＩＩ、および／または配列番号１〜１２の）少なくとも１つのペプチドの供給を包含する。活性物質（例えば、化合物、ペプチドなど）の脳への直接的投与は、当技術分野において知られている。くも膜下腔内注射は、作用物質を脳室および脊髄液へ直接、送達する。外科的に埋め込み可能な注入ポンプは、作用物質の脊髄液への直接的な持続的投与を提供するのに利用できる。脊髄注射は、薬学的化合物の脳脊髄液への注射と共に腰椎穿刺を含む。投与はまた、本開示によるペプチドが身体の標的にされた領域（例えば、脳の組織）においてのみ活性がある、標的化送達、加えて、ペプチドが制御された様式で一時期にわたって放出される徐放性製剤を含む。徐放性製剤および標的化送達のための方法は、当技術分野において知られており、それらには、例えば、リポソーム、薬物を充填した生分解性ミクロスフェア、薬物−ポリマーコンジュゲート、薬物特異的結合剤コンジュゲートなどの使用が挙げられる。薬学的に許容される担体は、当業者によく知られており、それらには、キトサンナノ粒子または他の関連した腸溶性ポリマー製剤が挙げられる。所与の処置のための特定の医薬製剤および治療的有効量および投与計画の決定は、例えば、患者の年齢、体重、性別、民族性、器官（例えば、肝臓および腎臓）機能、所望の処置の程度、疾患および随伴症状の病期および重症度、ならびに処置についての患者の許容度を考慮して、当業者の能力の範囲内である。

本明細書に記載された方法のいくつかの実施形態は、例えば、多発性硬化症、アルツハイマー病、てんかん、パーキンソン病、関節炎、炎症性腸疾患、白血病、またはアテローム性動脈硬化などの慢性疾患を有する対象のための本明細書に記載された１つもしくは複数のペプチド、またはペプチドを含む組成物の鼻腔内送達を提供する。鼻腔内投与および吸入投与に適切な製剤および方法は当技術分野において知られている。

治療的用途に関する実施形態では、投与は、関心対象の障害をすでに患っている対象に実施することができる。疾患の潜伏期または急性期における治療的用途は、適切には、特定の疾患／状態、患者、および組み合わせに基づいて、単独かまたは他の処置と共のいずれかでの本明細書に記載された方法により処置することができる。当業者は、併用処置が適している場合、または適していない場合を決定することができるであろう。

治療的方法および使用において、本明細書に記載されたペプチドおよび組成物は、症状および／または合併症を処置し、または少なくとも部分的に抑止するのに十分な量で対象に投与することができる。これを達成するのに十分な量は、しばしば、「治療的有効用量」と呼ばれる。この使用に有効な量は、ペプチド、組成物、投与様式、処置されることになっている状態の病期および重症度、患者の年齢、体重、および全般的健康状態、ならびに処方医師の判断に一部、依存する。

実施形態では、本明細書に開示された組成物およびペプチドの有効量には、約１００ｍｇ／ｋｇ未満、約５０ｍｇ／ｋｇ未満、約２５ｍｇ／ｋｇ未満、約１０ｍｇ／ｋｇ未満、約１ｍｇ／ｋｇ未満、約０．１ｍｇ／ｋｇ未満、約０．０５ｍｇ／ｋｇ未満、約０．０１ｍｇ／ｋｇ未満、約０．００５ｍｇ／ｋｇ未満、および約０．００１ｍｇ／ｋｇ未満のペプチドを挙げることができる。いくつかの実施形態では、本明細書に開示された組成物およびペプチドの有効量には、少なくとも約０．０００１ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．００１ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．００５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．０１ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．０５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．１ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約１ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約５ｍｇ／ｋｇ、および少なくとも約１０ｍｇ／ｋｇのペプチドを挙げることができる。これには、例えば、約０．０００１ｍｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇ、約０．００１ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．００５ｍｇ／ｋｇから約０．５ｍｇ／ｋｇ、および約０．０１ｍｇ／ｋｇから約０．０５ｍｇ／ｋｇの範囲のペプチド量が挙げられる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載された方法、ペプチド、および組成物は、重篤な疾患状態、すなわち、命を脅かす、または命を脅かす可能性がある状況に用いることができる。そのような症例において、これらの組成物の実質的過剰量を投与することが可能であり、処置する医師がそれを望ましく感じる場合がある。追加として、当業者は、所与の対象について、必要に応じて、用量、投薬スケジュール、および投与経路などの可変事項を調整または変更する方法も知っているであろう。

開示されたペプチドおよび組成物は、さもなければ起こるだろう症状の進行を低下または寛解させるために、急性的に（すなわち、発症中、または処置を必要とする状態をもたらす事象の直後に）、予防的に（例えば、予定された手術の前に、または神経学的徴候もしくは症状の出現の前に）、または変性疾患の経過中に、投与されてもよい。投与のタイミングおよび間隔は、対象の症状によって異なり、当業者によって決定されるように、数分間、数時間、または数日間に及ぶ間隔で、数時間、数日間、数週間、またはそれ以上の時間経過にわたって、投与されてもよい。

治療的または予防的処置のための医薬組成物に関するいくつかの実施形態は、粘膜（口腔、鼻腔、吸入、直腸、膣、気管など）投与、非経口投与、局所投与、または局部投与のいずれかに特異的な製剤を提供する。本明細書における目的にとって、粘膜投与とは、気道、胃腸管、生殖器系の表面などの粘膜表面へのワクチンの適用を指すため、粘膜投与は、局所投与とは異なる。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、適切には、非経口で、例えば、静脈内に、皮下に、皮内に、または筋肉内に投与される。局所投与（すなわち、非粘膜）は、水性または非水性液体（例えば、液滴）、乳濁液、ペースト、軟膏、クリームなどの任意の適切な形態での、眼、耳、爪、毛髪、または皮膚などの対象の非粘膜表面に対するものであり得る。したがって、本開示は、水性担体などの許容される担体中に溶解または懸濁された、１つまたは複数の小さいＡｐｏＥ模倣ペプチドを含む局所（粘膜または非粘膜）投与または非経口投与のための組成物を提供する。実施形態では、医薬組成物は経鼻的に投与される。任意の様々な水性担体が用いられてもよく、例えば、水、緩衝水、０．９％食塩水、０．３％グリシン、ヒアルロン酸などである。これらの組成物は、通常のよく知られた滅菌技術によって滅菌することができ、または滅菌濾過されてもよい。生じた溶液は、そのまま用いるものとして包装されてもよいし、または凍結乾燥されてもよく、凍結乾燥した調製物は、投与前に滅菌溶液と混合される。組成物は、緩衝剤、等張化剤、湿潤剤など、例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、モノラウリン酸ソルビタン、オレイン酸トリエタノールアミンなどの生理学的状態に近づけるために必要とされる薬学的に許容される補助的物質を含有することができる。あるいは、本明細書に記載された医薬組成物はまた、乾燥粉末製剤の形態であり得る。乾燥粉末ワクチン製剤に関する実施形態では、典型的には、液体ワクチンは、優れた温度安定性を有するワクチン製剤を提供するために、少なくとも１つの増量剤（トレハロースまたは他の糖など）の存在下、減圧で急速凍結されて、乾燥される（例えば、凍結乾燥される）。そのような乾燥粉末ワクチン製剤は、乾燥粉末として宿主に投与されてもよく、それによって、液体による復元の必要性が除かれる。

医薬組成物および製剤を含む組成物に関する本明細書に記載された態様では、いくつかの実施形態は、許容される担体、溶媒、希釈剤、または補助剤と組み合わせて、配列番号１による少なくとも１つのペプチド（例えば、配列番号１〜１２）を含む組成物を提供する。さらなる実施形態では、組成物は、担体、溶媒、希釈剤、または補助剤と組み合わせた、配列番号２〜１２のいずれかから選択されるペプチド、またはその２つ以上のペプチドの任意の組み合わせを含む。

いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号１または配列番号１７のペプチド、および担体、溶媒、希釈剤、または補助剤から実質的になる組成物を提供する。さらなる実施形態では、組成物は、配列番号２〜１２のいずれかから選択されるペプチド、またはその２つ以上のペプチドの任意の組み合わせ、および担体、溶媒、希釈剤、または補助剤から本質的になる。

一態様において、本開示は、それを必要としている対象において神経学的状態を処置するための薬剤であって、有効量の式Ｉおよび／または式ＩＩのペプチドを含む、薬剤を提供する。

一態様では、本開示は、それを必要としている対象において炎症を処置するための薬剤であって、有効量の式Ｉおよび／または式ＩＩのペプチドを含む、薬剤を提供する。

以下の実施例は、本開示の特定の態様および実施形態のさらに詳細な説明を提供するが、それらは、単に例示にすぎないとみなされるべきで、決して、特許請求の範囲の範囲を限定するものとしてみなされるべきではない。
［実施例］

［細胞培養に基づいた、グリア活性化の評価のための材料および方法］
ペプチドなどの化合物のグリア活性化を抑制する能力を評価するために培養細胞を用いるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法が開発されている。Ｌａｓｋｏｗｉｔｚら、（２００１）Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．，１６７：７４〜８５。グリア細胞培養物を増殖させ、標準条件下で維持した。培養グリア細胞には、初代マウス混合グリア細胞培養物、マウスＢＶ−２ミクログリア細胞、およびヒトＣ３ミクログリア細胞が挙げられ得る。接着性グリア細胞を、血清を除去するためにＯｐｔｉＭＥＭ（登録商標）培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．から入手できる）で洗浄し、ペプチドを含有する新鮮なＯｐｔｉＭＥＭ（登録商標）培地で覆った。

５アミノ酸長のペプチドを、０．３μＭ、３μＭ、および３０μＭなどの約０μＭから約５０μＭまでの範囲の濃度で並行して、１つまたは複数の細胞試料にアプライした。より長いペプチド（それぞれ１２アミノ酸）である、ペプチドＡＬ−１０−１（配列番号１８）およびＶＬ−１７−９（配列番号１９）を、それぞれ、陰性対照および陽性対照として用いた。Ａｏｎｏら，Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ（２００３）１１６：４３７，およびＡｏｎｏら，Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｄｉｓｅａｓｅ（２００２）１１：２１４（どちらも引用することにより本明細書の一部をなすものとする）に記載された方法を用いて、ＮＭＤＡに曝露された初代ラット皮質神経細胞培養物において一連のペプチドをスクリーニングした（表２参照）。初代神経細胞培養物におけるＮＭＤＡ媒介性細胞死からの神経保護を、溶媒で処理された培養物と比較した、ＮＭＤＡへの曝露から２４時間後のＬＤＨにおけるパーセンテージ減少として表した（表２）。ＬＤＨ放出は、ＮＭＤＡ曝露後の神経細胞の死を示している。ペプチドＶＲ−５５（配列番号４）は、ＮＭＤＡ媒介性興奮毒性細胞死を１μＭの濃度で約１９％、低下させた。効果は特異的であり、全てのペプチドが神経保護を示したわけではなかった。陽性対照ペプチドＶＬ−１７−９はＬＤＨ放出を３１％低下させた。相対的に、より短いＶＬ−５−２は、ＬＤＨ放出を３１％低下させ、より短いペプチドもまた、ＮＭＤＡ媒介性興奮毒性細胞死を低下させることを示した。

初代神経細胞培養物におけるＮＭＤＡ興奮毒性からの神経保護の用量応答を、ＡｐｏＥ模倣ペプチドＶＲ−５５（配列番号４）について決定した。図６は、ＶＲ−５５（配列番号４）への曝露の関数としてＬＤＨ放出のパーセント抑制が用量依存性であることを示している。表３は、抑制能力について、全て１μＭの濃度での同じバイオアッセイにおいてスクリーニングされた関連ファミリーにおける全てのペプチドの累積データを示している。「０」は、５％未満の抑制を示し、「＋」は５〜１０％の抑制を示し、「＋＋」は、１１〜２０％の抑制を示し、「＋＋＋」は２０％より大きい抑制を示す。ＶＬ−１７−９に加えて、いくつかの他の候補が、２０％より大きい抑制を有し、その候補には、ＶＲ−５５、ＶＬ−５−１、ＶＬ−５−２、およびＶＲ−５２が挙げられた。

より大きいペプチドまたはタンパク質は、グリア活性化の測定可能な抑制を観察するためにより高い濃度で試験されることが必要である可能性がある。初代マウス細胞およびＢＶ−２細胞を用いる場合には、細胞を、１００ｎｇ／ｍｌ大腸菌ＬＰＳ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．から入手できる）で刺激し、上清を、ＬＰＳ刺激から６時間後、収集し、亜硝酸塩（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．から入手できる比色定量Ｇｒｅｉｓｓ試薬システムを用いる）および／またはＴＮＦ−α（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．から入手できる固相ＥＬＩＳＡキットを用いる）についてアッセイする。ヒトＣ３細胞を用いる場合には、細胞を、２００μｇ／ｍｌポリイノシン酸５’（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．から入手できる）で刺激し、上清を、刺激から５日後、収集し、固相ＥＬＩＳＡキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．から入手できる）を用いてＴＮＦ−αについてアッセイする。

［ＡｐｏＥ模倣ペプチドによるミクログリア活性化の抑制］
実施例１に記載されているように、ミクログリア活性化の抑制を評価するために、マウスＢＶ−２培養物を調製して、用いた。ＢＶ−２細胞の複製試料を、ペプチドなしで、０．３μＭ、３μＭ、もしくは３０μＭのいずれかでのＡｐｏＥ模倣ペプチド（ＶＳＫＲＲ、配列番号３）と、または０．３μＭ、３μＭ、もしくは３０μＭのいずれかでの陰性対照ペプチド（ＶＳＫＫＲ、配列番号１３）とインキュベートした。実施例１に記載されているように、各試料をＬＰＳで刺激し、ＴＮＦ−α産生について評価した。図１に示されているように、試験された各用量におけるＡｐｏＥ模倣ペプチド（配列番号３）での処理は、未処理の細胞、または陰性対照ペプチド（配列番号１３）で処理された細胞と比べて、ＴＮＦ−α産生の減少を生じた。そのデータは、本明細書に開示されたペプチドが、炎症促進性メディエータの放出を低下させるのに有用であったことを示している。

脳傷害に対する保護活性−ＣＮＳ炎症応答のダウンレギュレーションを、ＡｐｏＥ模倣ペプチド、ＶＲ−５５（配列番号４）、ＶＬ−５−１（配列番号５）、およびＶＬ−５−３（配列番号１０）について決定した。図１１Ａおよび１１Ｂは、ＶＲ−５５、ＶＬ−５−１、およびＶＬ−５−３が、ＬＰＳへの曝露後、混合グリア初代培養物における炎症性サイトカインＴＮＦ−αの放出を抑制することを示している。

［ｉｎ ｖｉｖｏで神経学的欠陥を試験するための材料および方法］
外傷性脳傷害についての実験マウスモデルを開発した。Ｌａｓｋｏｗｉｔｚら（２０１０）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｔｒａｕｍａ、２７：１９８３〜９５。雄マウス（週齢１２〜１４）を、麻酔導入箱において、酸素中４．３％イソフルランで９０秒間、麻酔した。気管を挿管し、酸素と窒素の５０／５０混合物中１．４％イソフルランで肺を機械的に換気した。表面加熱／冷却を用いて、体温を３７℃に維持した。正中切開によって頭蓋の先端を露出させ、解剖学的ランドマークを同定し、凹面の３ｍｍ金属ディスクを頭蓋表面に、きっちりと正中線で、かつちょうど尾からブレグマへ、接着剤で固定した。ディスクは、衝撃のエネルギーを拡散し、陥没頭蓋骨骨折の発生率を１０％未満へ低下させた。全身麻酔後、マウスを、定位装置内に配置し、頭蓋を露出させた。３ｍｍの頭変位で６．８±０．２ｍ／秒で発射される空気圧衝撃装置（直径：２．０ｍｍ、Ａｉｒ−Ｐｏｗｅｒ，Ｉｎｃ．から入手できる）を用いて、ディスク表面への単一正中線衝撃を送達した。

脳内出血の実験マウスモデルもまた提供した。Ｊａｍｅｓら，（２００９）Ｓｔｒｏｋｅ、４０：６３２〜３９。雄マウス（週齢１６〜２０）を、麻酔導入箱において、酸素中４．６％イソフルランで９０秒間、麻酔した。気管を挿管し、窒素／酸素の７０／３０混合物中１．６％イソフルランで肺を機械的に換気した。下腹部加温システムを用いて、体温を３７℃に維持した。動物の頭を、定位フレーム内に固定し、局所麻酔を注射し、頭皮を切開した。頭蓋の露出後、バーホールを、ブレグマの２ｍｍ左側方向に作製し、０．５μＬ注射針（Ｈａｍｉｌｔｏｎ Ｃｏ．から入手できる）を、皮質から３ｍｍの深さまで進めた。ＩＶ−Ｓ型クロストリジウムコラゲナーゼ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．から入手できる）を、５分間にわたって注射した（０．４μＬ生理食塩水中０．１Ｕ）。その後、切口を閉じ、動物に自然換気を回復させ、その後、抜管した。

神経学的欠陥を測定するための実験手順を開発した。自動ロトロッド（Ｕｇｏ Ｂａｓｉｌｅ Ｎｏｒｔｈ Ａｍｅｒｉｃａ，Ｉｎｃ．から入手できる）を用いて、前庭運動機能を評価した。神経学的状態または傷害（例えば、上記のような外傷性脳傷害または脳内出血など）の実験的誘導の前日に、マウスは、６０秒間の指定の回転速度（１分あたり１６回転）での２回の連続した条件付け試行、続いて、加速する回転速度での３回の追加の試行を受けた。後者の３回の試行における回転シリンダーからの落下までの平均時間を、ベースライン潜時として記録した。傷害後、マウスは、加速する回転速度の３回の試行（１５分間の試行間間隔）での毎日連続する試験を受けた。ロッドからの落下までの平均潜時を記録し、ロッドを握ることができないマウスを、０秒の潜時としてスコア化した。

モーリス水迷路を用いる、神経学的欠陥を測定するための別の実験手順を開発した。手順は、可動プラットフォーム（７．５ｃｍ直径）を含み、粉乳で不透明化された２５〜２７℃の水で満たされた黒色アルミニウムプールを用いた。各トレーニングまたは試験セッションは、試行間の２０〜３０分間の間隔で１日あたり４回の試行からなった。試験の前日、マウスを、目に見えるプラットフォーム（旗を立てられ、象限慣れを最小限にするために試行ごとに異なる象限に位置したプラットフォーム、余分の迷路の視覚的合図なし）を用いて訓練して、操作および水泳にマウスを慣らし、かつ試験のゴール−プラットフォーム上に登ることにより水から逃れられること−をマウスに教えた。訓練日の後、マウスを、水表面より１ｃｍ下に沈められた、隠しプラットフォームを用いて試験した（４日間連続、全ての試行について西側象限に沈められたプラットフォームで、いくつかの余分な迷路視覚的合図を有する）。各試験について、マウスを縁に向けてプール内に置き、最大９０秒間、プラットフォームを捜させた。各試行について４つの異なる象限の１つにおいてマウスを出発させ、出発象限の順序を、毎日、ランダムに規定した。プラットフォームを見つけるまでの潜時および水泳速度を、コンピュータ制御のビデオトラッキングシステム（Ｅｔｈｏｖｉｓｉｏｎ ２．２．１４；Ｎｏｌｄｕｓ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｌｅｅｓｂｕｒｇ ＶＡから入手できる）を用いて記録した。

［外傷性脳傷害後の神経学的転帰へのＡｐｏＥ模倣ペプチドの効果］
実施例３に記載されているように、外傷性脳傷害が誘導されてから２時間後、さらには６時間後に、ＡｐｏＥ模倣ペプチド（配列番号３、０．０５ｍｇ／ｋｇまたは０．２ｍｇ／ｋｇ）または担体（食塩水）のいずれかをマウス群に尾静脈内注射した。各マウスを、実施例３に記載されているように、傷害前および傷害後に測定されたロトロッド潜時により前庭運動機能について試験した。０．０５ｍｇ／ｋｇまたは０．２ｍｇ／ｋｇのＡｐｏＥ模倣ペプチド（配列番号３）で処理された動物は、ロトロッド潜時の増加によって反映されているように、担体処理と比較して、前庭運動パフォーマンスの有意な向上を示した。図２参照。効果は、５日間の試験期間を通して持続した。データは、本明細書に開示されたペプチドが、外傷性脳傷害を処置するのに有用であることを示している。

［外傷性脳傷害後の神経学的転帰へのＡｐｏＥ模倣ペプチドの効果］
実施例３に記載されているように、外傷性脳傷害が誘導されてから２時間後、さらには６時間後に、ＡｐｏＥ模倣ペプチド（配列番号４、０．０５ｍｇ／ｋｇ）または担体（食塩水）のいずれかをマウス群に尾静脈内注射した。各マウスを、実施例３に記載されているように、傷害前および傷害後に測定されたロトロッド潜時により前庭運動機能について試験した。０．０５ｍｇ／ｋｇのＡｐｏＥ模倣ペプチド（配列番号４）で処理された動物は、ロトロッド潜時の増加によって反映されているように、前庭運動パフォーマンスが向上した。図３参照。効果は、５日間の試験期間を通して持続した。実施例３に記載されているように、外傷性脳傷害が誘導されてから２時間後、さらには６時間後に、ＡｐｏＥ模倣ペプチド（配列番号４、０．０５ｍｇ／ｋｇまたは０．２ｍｇ／ｋｇ）または担体（食塩水）のいずれかを他のマウス群に尾静脈内注射した。各マウスを、実施例３に記載されているように、モーリス水迷路を用いて、傷害後２８日目、２９日目、３０日目、および３１日目に認知神経科学的パフォーマンスについて試験した。０．０５ｍｇ／ｋｇまたは０．２ｍｇ／ｋｇのいずれかでのＡｐｏＥ模倣ペプチド（配列番号４）で処理された動物は、水迷路潜時によって反映されているように、認知神経科学的転帰の改善を示した。図４参照。データは、本明細書に開示されたペプチドが、外傷性脳傷害を処置するのに有用であることを示している。

［脳内出血後の神経学的転帰へのＡｐｏＥ模倣ペプチドの効果］
実施例３に記載されているように、脳内出血が誘導されてから２時間後、さらには６時間後に、ＡｐｏＥ模倣ペプチド（配列番号４、０．０５ｍｇ／ｋｇ）または担体（食塩水）のいずれかをマウス群に尾静脈内注射した。各マウスを、実施例３に記載されているように、脳内出血が誘導される前および誘導された後に測定されたロトロッド潜時により前庭運動機能について試験した。０．０５ｍｇ／ｋｇのＡｐｏＥ模倣ペプチド（配列番号４）で処理された動物は、ロトロッド潜時の増加によって反映されているように、前庭運動パフォーマンスが向上した。図５参照。効果は、５日間の試験期間を通して持続した。データは、本明細書に開示されたペプチドが、脳内出血を処置するのに有用であることを示している。

［爆風損傷データ後の神経学的転帰へのＡｐｏＥ模倣ペプチドの効果］
爆風損傷マウス研究を、衝撃波管爆風モデルを用いて実施した。３本の衝撃波管の１セット（図７Ａ）を、実際的なピーク過剰圧、スケーリングされる持続時間、および衝撃量に関する一連の爆風条件を提供するように構築した。ペプチド試験について、１２４０ｍｍ長さ、７８ｍｍ直径の衝撃波管を用いた。ドライバーセクションは全ての試験について一定であり、対応するブラインドフランジと共にボルトで留められた２５ｍｍ厚さのスペーサーフランジ、およびドリヴンパイプに取り付けられるスリップオンフランジからなった。このドライバーセクションプロファイルは、管の過剰圧特性を変化させるために変わり得る。漏出を防ぐために、各フランジ間に全面形ガスケット（グラファイト／ブナＮ材）を据え付けた。ダイヤフラムは、ドライバースペーサーフランジと、ドリヴンセクションに取り付けられるフランジとの間に据え付けられた、いくつかのシートのポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）フィルムで構成された。ドライバーセクションは、ダイヤフラムが破裂するまでブラインドフランジの裏側の継手を通して高圧ヘリウムで満たされ、衝撃波を、ドリヴン管セクションへ下行させた。

衝撃波管を、３つの振動減衰Ｕボルトを用いて押出アルミニウムフレーム上に垂直に備え付けた。３つの埋め込み型ピエゾ抵抗性圧力トランスデューサ（ＰＴ）（Ｅｎｄｅｖｃｏ ８５３０Ｂ；Ｅｎｄｅｖｃｏ Ｃｏｒｐ．，Ｓａｎ Ｊｕａｎ Ｃａｐｉｓｔｒａｎｏ，ＣＡ）を、衝撃波管の開口端から６ｍｍはずして、直径の周囲に１２０°の間隔を空けて、置いた。管の壁厚さはＰＴの長さより薄いため、６ｍｍ厚さのカラー（１９ｍｍの長さ）が管の端の上にフィットし、ＰＴについての追加の備え付け支持を提供するように適所に溶接された。ダイヤフラムが破裂したときの破裂圧力を測定するために、追加のＰＴをドライバーセクション内に据え付けた。マウスに胸部保護を提供するためにアルミニウム取り付け具を用いた（図７Ｂ）。前の試験において、ピーク過剰圧および衝撃量は、１０分の１より少なく、減少した。ピーク入射過剰圧、正相期間、およびピーク入射衝撃量を、各試験について３つのエンドチューブＰＴにおいて記録した（データ未呈示）。ドライバー破裂圧力のレベルを、ダイヤフラム厚さの範囲（０．５８〜０．８４ｍｍ）を用いて調節し、ドライバーガスタンク圧力を、７．０ＭＰａに制御した。大気条件（温度、気圧、湿度）を、各試験の前に記録した。全てのセンサーを、５００ｋＨｚアンチエイリアス処理フィルターを用いて１ＭＨｚでサンプリングした。データを、４０ｋＨｚのカットオフ振動数をもつ８次ローパスバターワースフィルターを用いて後処理した。

野生型マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓ）を、１５匹の２つの群（ペプチド（配列番号４）注射を受けた群および溶媒のみを受けた対照群）において爆風に曝露した。神経学的欠陥を、上記のように、モーリス水迷路を用いて、傷害されたマウスにおいて測定した。モーリス水迷路を用いて決定されるように、ＡｐｏＥ模倣ペプチドの認知神経科学的パフォーマンスへの効力を、爆風損傷を有するマウスにおいて調べた（図８）。図８は、ＡｐｏＥ模倣ペプチドが爆風損傷後の認知神経科学的欠陥を低減することを示している。そのペプチドの投与は、前に学んだ隠しプラットフォームを有する象限における時間の増加（すなわち、Ｌａｓｋｏｗｉｔｚら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｔｒａｕｍａ、２４：１０９３〜１１０７（２００７）に記載されているように、保持能力を評価するためのプローブ試行）によって実証されているように、認知パフォーマンスの増強への傾向を生じた（データ未呈示）。正しい象限において２１．８±２．７秒を費やしたＡｐｏＥ模倣ペプチド（配列番号４）処理動物と比較して、溶媒処理動物は、正しい象限において１７．８±１．９秒を費やした（ｐ＝０．２４）。モーリス水迷路において学習の向上へ向かう傾向があった（ｐ＝０．０７）。プローブ試行においてパフォーマンスの向上へ向かう傾向があった（ｐ＝０．２５）。

マウス無呼吸データは、他の種に比べて、良いモデル系である可能性がある。爆風損傷モデルは、運動機能の回復において、および持続性早期認知欠陥において、鈍傷モデルとは異なった。ロトロッド結果に関して、爆風マウスは、運動機能を迅速に取り戻すようにみえた。偽と爆風後傷害状態との間に有意な欠陥はなかった。モーリス水迷路結果に関して、爆風マウスは、水迷路試行を通して、有意な認知欠陥を示した。

［静脈内送達についての血液中およびＣＮＳ中の薬物動態］
血漿中およびＣＮＳ中のＡｐｏＥ模倣ペプチドＶＳＲＲＲ（配列番号４）の量を以下のように決定した。
［ＬＣ／選択イオンモニタリング（ＳＩＭ）／ＭＳを用いるマウス血漿中のＶＳＲＲＲ定量化］
マウス血漿の４８μＬアリコートを量り取り、２ｍＬ ９６ウェルプレートの各ウェルに入れた。６μＬの安定同位体標識（ＳＩＬ）型のＶＳＲＲＲペプチド（「ＶＳＲＲＲ［１０］」、配列番号４）（５０ｍＭ重炭酸アンモニウム、ｐＨ８、緩衝液中５ピコモル／μＬ）を加えた。標準物質および品質対照（ＱＣ）については、５０ｍＭ重炭酸アンモニウム中の合成型ＶＳＲＲＲペプチド（「ＶＳＲＲＲ」、配列番号４）６μＬを加え、マウスＰＫ試料を含有する全てのウェルには等量の５０ｍＭ重炭酸アンモニウムを加えた。１１４０μＬの５０ｍＭギ酸アンモニウム、ｐＨ１０を加えて、１２００μＬの最終体積にした。以下のようなＯＡＳＩＳ（登録商標）ＨＬＢ固相抽出（ＳＰＥ）プロトコールを用いて塩およびタンパク質を除去した：
１．各ウェルへ５００μＬメタノール（ＭｅＯＨ）×１。
２．５００μＬ ２５％アセトニトリル（ＡＣＮ）／１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）×１（前溶出として）。
３．５００μＬ ＭｅＯＨ×１
４．５００μＬ ５０ｍＭギ酸アンモニウム×２
５．各試料混合物の１ｍＬを、ＯＡＳＩＳ（登録商標）ＨＬＢプレート（親水性親油性バランス化逆相吸着剤、Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐ．）上の対応するウェルへ直接ピペッティングし、十分にゆっくり減圧した
６．５００μＬ ５０ｍＭギ酸アンモニウム×１
７．５００μＬ １０％ＡＣＮ／５０ｍＭギ酸アンモニウム×２
８．５００μＬ ２５％ＡＣＮ／５０ｍＭギ酸アンモニウム×１
９．プレート収集洗浄液／通過画分を取り出し、収集プレートへ入れる
１０．ゆっくり減圧しながら、１００μＬ ２５％ＡＣＮ／１％ＴＦＡで溶出する×３。最終溶出液は約３００μＬのはずである。

真空遠心機を用いて、ＳＰＥ溶出液を乾燥させた。その試料を、１％アセトニトリル（ＡＣＮ）、０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、および０．０２％ヘプタフルオロ酪酸（ＨＦＢＡ）を含有する５０μＬの緩衝液中で復元させた。２マイクロリットルの復元した試料を、高分解能の精密質量タンデム質量分析計に連結されたナノスケールキャピラリーＬＣによって分析した。具体的には、ＮａｎｏＬｏｃｋＳｐｒａｙ（商標）（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐ．）およびｎａｎｏＡｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ（登録商標）システム（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐ．）を有するエレクトロスプレーイオン化源を、ナノスケールＬＣカラム（１．７μｍ ＢＥＨ１３０ Ｃ１８ １５０μｍ ＩＤ×１００ｍｍ長、Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐ．）、１０分間の０．１％ギ酸を含む３％〜１９％ＡＣＮの勾配で用い（移動相Ａ＝０．１％ギ酸／０．００１％ＨＦＢＡ）、１６．５分間の総ＬＣランタイム、流速＝１．８μＬ／分、および３５℃カラム温度であった。ＳＹＮＡＰＴ（商標）Ｇ１ ＨＤＭＳ（商標）高分解能質量分析計（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐ．）を用いた。フルスキャンＭＳデータが、３６０ＤａにおけるＥｎｈａｎｃｅｄ Ｄｕｔｙ Ｃｙｃｌｅスキャン機能を用いて、５０〜４０００Ｄａの質量範囲にわたって得られた。

ＶＳＲＲＲおよびＶＳＲＲＲ［１０］量を、高分解能における二重荷電イオンの選択イオンクロマトグラムの曲線下面積（ＡＵＣ）を測定することによって定量化した（ｍ／ｚ ３５７．７および３６２．７）。最終ＶＳＲＲＲ定量化量を、ＡＵＣの比（ＶＳＲＲＲ／ＶＳＲＲＲ［１０］）を用いて決定した。５匹の動物からの比を時点ごとに平均し、較正標準を用いて標準曲線を作成した。ＱＣ試料の二重反復アリコートを、分析再現性を決定するためにＬＣ／ＭＳにより三重反復で分析した。

図９は、０．８ｍｇ／ｋｇのペプチドの単回投与後の時間経過に対する血漿試料中のペプチド量を示している。定量下限（ＬＬＯＱ）が示されている。表４は、静脈内（ＩＶ）の結果を示す。

［治療用ペプチド、ＶＳＲＲＲに関するマウス脳ＰＫ−試料調製手順］
マウス脳の重さを１．５ｍＬ Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆチューブ内で計った。脳全体を１４ｍＬ培養チューブへ移した。組織湿重量１００ｍｇあたり２．５ｐｍｏｌ／ｍＬのＳＩＬペプチドを含む５０ｍＭギ酸アンモニウム（ｐＨ１０）中の８Ｍ尿素の１ｍＬを加えた。標準対照およびＱＣのために、脳組織１００ｍｇ（１％）あたり１０μＬのペプチド標準物質を９９０μＬの前述の緩衝液と共に加えて、組織１００ｍｇあたり１ｍＬの総体積になった。Ｔｉｓｓｕｅ Ｔｅａｒｏｒを各試料に約２０秒間、用いた。１．５ｍＬの試料を２ｍＬ Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆチューブに移した。各試料を、バーストあたり５秒間の３回のバーストでプローブ超音波処理した。その後、試料を３７℃で３０分間、加熱した。試料を１５，０００ｒｐｍで３０分間、遠心分離した。各チューブの底にはほとんど沈殿物が見られず、（１．５ｍＬの総体積から）１ｍＬの試料をピペッティングして、ＯＡＳＩＳ（登録商標）プレート上に直接入れる場合、回避された。血漿試料についての上記のＯａｓｉｓ（登録商標）ＨＬＢ固相抽出（ＳＰＥ）プロトコールを用いて、塩およびタンパク質を除去した。抽出後、Ｓｐｅｅｄ Ｖａｃ内で試料を乾燥させ、２５μＬの１％ＡＣＮ／０．１％ＴＦＡ／０．０２％ＨＦＢＡ中で復元させた。３μＬの試料を、フルスキャンＭＳ方法を用いるＳＹＮＡＰＴ（商標）Ｇ２ ＨＤＭＳ（商標）（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐ．）へ注入し、合計１６．５分間のランタイムであった。関心対象のペプチド（複数可）を、３〜８分間の間、モニターした。

表５および図１０は、０．８ｍｇ／ｋｇのペプチドの単回投与後の時間経過に対する５匹の動物由来のＣＮＳ試料におけるペプチドの平均量を示す。図１０は、１．４ｐｇ／ｍｇでの定量下限を示す。

表６は、２つの３分時点の脳および２つの１０分時点の脳における分析物濃度を示す。分析物濃度を、一点内部標準定量化から計算した。予備データはＣＮＳ透過を示唆している。分析物濃度を、１．４ｐｇ分析物／ｍｇ組織から８９．２ｐｇ／ｍｇの間（２×段階希釈）での試料を用いて作成された７点標準曲線較正曲線式から計算した。脳分析物についての動物間再現性は高い（２１％より大きいＣＶ）。単回投与された脳における薬物分子Ｃ_ｍａｘは、約９ｐｇ分析物／ｍｇ組織である。

［マウス脳卒中研究におけるＡｐｏＥ模倣ペプチドの効果］
［局所虚血−再灌流モデル］
非定型的中大脳動脈閉塞（ＭＣＡＯ）モデル（Ｈｕａｎｇら，（１９９４）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６５：１８８３〜１８８５；Ｌａｓｋｏｗｉｔｚら，（１９９７）Ｊ．Ｃｅｒｅｂ．Ｂｌｏｏｄ Ｆｌｏｗ Ｍｅｔａｂ．，１７：７５３〜７５８）を用いて、脳卒中後の神経学的機能への模倣ペプチドの効果を決定し、脳卒中の治療剤としてのペプチドの効力を評価した。マウスに４．６％イソフルランを麻酔導入した後、気管内挿管し、肺に３０％Ｏ_２／７０％Ｎ_２中１．６％イソフルランで機械的人工換気を施した。正中頸部皮膚切開により右総頸動脈を同定した。外頸動脈を結紮し横切開した。翼口蓋動脈の起点が目に見えるようになる遠位まで内頸動脈を解体した。シリコーンで薄くコーティングされた鈍化の先端を有する６−０ナイロンモノフィラメントを近位外頸動脈断端へ挿入し、内頸動脈中へ１１ｍｍ進め、中大脳動脈を閉塞した。９０分後、血液灌流を回復させるためにフィラメントを除去し、皮膚切口を縫合糸で閉じた。イソフルランを中断し、自発呼吸の回復時、マウスから抜管した。傷害後のマウスを酸素富化環境（ＦＩＯ_２＝５０％）に１時間置き、その後ケージに戻した。直腸温度を連続的にモニターし、手順の間中、表面加熱／冷却で３７℃にサーボ制御した。

［運動欠陥の試験］
２つの群の１０〜１２週齢の雄Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊマウスである、対照群（ｎ＝１２）およびＶＲ−５５処理群（ｎ＝９）にＭＣＡＯを施した。対照群マウスには、再灌流傷害の３０分後および６時間後に１００μＬの滅菌生理食塩水溶媒を尾静脈内注射し、ＶＲ−５５処理群マウスには、再灌流傷害の３０分後および６時間後に１００μＬの滅菌生理食塩水溶媒およびＶＲ−５５（配列番号４、０．０５ｍｇ／ｋｇ）を尾静脈内注射した。

前に上記で記載されているように、自動ロトロッド（Ｕｇｏ Ｂａｓｉｌｅ、Ｃｏｍｅｒｉｏ、Ｉｔａｌｙ）を用いて、前庭運動機能を評価した。ＭＣＡＯの前日、マウスは、６０秒間の指定の回転速度（１６ｒｐｍ）での２回の連続した条件付け試行、続いて、加速する回転速度での３回の追加の試行を受けた。後者の３回の試行における回転シリンダーからの落下までの平均時間を、ベースライン機能性ロトロッド潜時として記録した。ＭＣＡＯ後の１日目から開始し、マウスは、加速する回転速度の３回の試行（１５分間の試行間間隔）での毎日連続する試験を受けた。ロッドからの落下までの平均潜時を記録した。回転するロッドを握ることができないマウスを、０秒の潜時に割り当てた。

図１２Ａおよび１２Ｂに示されているように、対照マウスおよびＶＲ−５５処理マウスは、類似したベースライン機能性ロトロッド潜時を有した。対照マウスは２１７±２０秒のベースライン機能性ロトロッド潜時を有し（「食塩水」）、ＶＲ−５５処理マウスは２１４±２２秒のベースライン機能性ロトロッド潜時を有した（「ＶＲ−５５」）。傷害後１日目において、対照マウスおよびＶＲ−５５処理マウスはまた、類似した機能性ロトロッド潜時を有した。しかしながら、傷害後３日目において、ＶＲ−５５処理マウスは、対照マウスと比較して、機能性ロトロッド潜時の向上を示した。ＶＲ−５５処理マウスは２１６±２６秒の機能性ロトロッド潜時を有し、対照マウスは１６１±３２秒の機能性ロトロッド潜時を有した。これらの結果は、炎症応答に二次的な遅発性神経細胞傷害の低減と一致している。

処理マウスは、組織学的評価項目の向上を示すことが予想される。本明細書に記載された他の模倣ペプチドは、様々な用量で投与されるであろうし、同様に、マウス脳卒中のＭＣＡＯモデルにおいて機能性および組織学的評価項目の向上を示すことが予想される。

Claims (10)

1. ＶＳＲＫＲ（配列番号２）、
   ＶＳＫＲＲ（配列番号３）、
   ＶＳＲＲＲ（配列番号４）、
   ＶＡＲＫＬ（配列番号５）、
   ＲＨＫＫＬ（配列番号６）、
   ＲＨＫＲＲ（配列番号９）、または
   ＶＡＲＲＬ（配列番号１０）
   から選択されるいずれかの配列からなる、５アミノ酸長の単離されたペプチドまたはその塩。
2. Ｎ末端がアセチル化されている、及び／または、Ｃ末端がアミド化されている、請求項１に記載の単離されたペプチドまたはその塩。
3. Ｎ末端がアセチル化され、Ｃ末端がアミド化されているＶＳＲＲＲである、請求項１に記載の単離されたペプチドまたはその塩。
4. Ｎ末端がアセチル化され、Ｃ末端がアミド化されているＶＳＫＲＲである、請求項１に記載の単離されたペプチドまたはその塩。
5. 請求項１〜４のいずれか１項に記載の単離されたペプチドまたはその塩を含む医薬組成物。
6. 薬学的に許容される担体、溶媒、希釈剤、または補助剤をさらに含む、請求項５に記載の組成物。
7. 対象において炎症を低減するための、請求項５または６に記載の組成物。
8. 前記組成物が、注射、吸入、経皮、静脈内、鼻腔内、頭蓋内、および／またはくも膜下の経路によって投与するためのものである請求項７に記載の組成物。
9. 対象において神経学的状態を処置するための、請求項５または６に記載の組成物。
10. 前記神経学的状態が、外傷性ＣＮＳ傷害、くも膜下出血、頭蓋内出血、脳卒中、実験的アレルギー性脳脊髄炎、多発性硬化症、神経炎症、慢性神経学的疾患、ＡＬＳ、認知症、ニューロパシー、パーキンソン病、およびアルツハイマー病の少なくとも１つから選択される、請求項９に記載の組成物。