JP2520424B2 - 血液線溶活性の測定方法 - Google Patents
血液線溶活性の測定方法Info
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- JP2520424B2 JP2520424B2 JP62165492A JP16549287A JP2520424B2 JP 2520424 B2 JP2520424 B2 JP 2520424B2 JP 62165492 A JP62165492 A JP 62165492A JP 16549287 A JP16549287 A JP 16549287A JP 2520424 B2 JP2520424 B2 JP 2520424B2
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Description
【発明の詳細な説明】 a.産業上の利用分野 本発明は、ヒト血液の線溶活性、線溶能の測定方法に
関する。さらに詳しくは、ヒト血漿あるいは血液に、α
2−プラスミンインヒビター（以下α2PIと称することが
ある）に対するモノクローナル抗体を加えて、α2PIの
線溶素溶解阻害活性を中和し、アクチベーター活性を測
定することで生体内線溶活性を把握する方法に関する。
さらに詳しくは、ヒト血漿あるいは血液に、α2PIに対
するモノクローナル抗体を加えて、α2PIの線維素溶解
阻害活性を中和し、トロンビン，Ca2+イオンで血漿ある
いは血液を凝固させ、形成したフィブリン塊の溶解時間
あるいはフィブリン分解物を測定することにより線溶活
性を測定し、かくして生態線溶異常の診断をする方法に
関するものである。
関する。さらに詳しくは、ヒト血漿あるいは血液に、α
2−プラスミンインヒビター（以下α2PIと称することが
ある）に対するモノクローナル抗体を加えて、α2PIの
線溶素溶解阻害活性を中和し、アクチベーター活性を測
定することで生体内線溶活性を把握する方法に関する。
さらに詳しくは、ヒト血漿あるいは血液に、α2PIに対
するモノクローナル抗体を加えて、α2PIの線維素溶解
阻害活性を中和し、トロンビン，Ca2+イオンで血漿ある
いは血液を凝固させ、形成したフィブリン塊の溶解時間
あるいはフィブリン分解物を測定することにより線溶活
性を測定し、かくして生態線溶異常の診断をする方法に
関するものである。
b.従来技術 ヒトのα2−プラスミンインヒビターは、青木と諸井
によって最初に単離・精製され、線維素溶解酵素のプラ
スミン（plasmin）のエステラーゼ活性を瞬間的に阻害
する強力なプラスミンインヒビターであり、11.7％の糖
を含む分子量約67,000の１本鎖の糖蛋白質であることが
知られている ［Moroi ＆ Aoki;The Journal of Biological Chemistr
y,251,5956−5965（1976）参照］。
によって最初に単離・精製され、線維素溶解酵素のプラ
スミン（plasmin）のエステラーゼ活性を瞬間的に阻害
する強力なプラスミンインヒビターであり、11.7％の糖
を含む分子量約67,000の１本鎖の糖蛋白質であることが
知られている ［Moroi ＆ Aoki;The Journal of Biological Chemistr
y,251,5956−5965（1976）参照］。
一方ヒトのα2−プラスミンインヒビターには３種類
の活性部位があることが知られている。第１はプラスミ
ンの線維素溶解作用阻害部位（以下これを“リアクティ
ブサイト”ということがある）［B.Wiman ＆ D.Collen;
The Journal of Biological Chemistry,254,9291−9297
（1979）参照］であり、第２はカルボキシル基末端側の
プラスミン結合部位［B.Wiman ＆ D.Collen;European J
ournal of Biochemistry,84,573−578（1978）参照］で
あり、第３はアミノ基末端のフィブリン結合部位である
［Y.Sakata,et al,Thrombosis Research,16,279−282
（1979）参照］。
の活性部位があることが知られている。第１はプラスミ
ンの線維素溶解作用阻害部位（以下これを“リアクティ
ブサイト”ということがある）［B.Wiman ＆ D.Collen;
The Journal of Biological Chemistry,254,9291−9297
（1979）参照］であり、第２はカルボキシル基末端側の
プラスミン結合部位［B.Wiman ＆ D.Collen;European J
ournal of Biochemistry,84,573−578（1978）参照］で
あり、第３はアミノ基末端のフィブリン結合部位である
［Y.Sakata,et al,Thrombosis Research,16,279−282
（1979）参照］。
ヒトα2−プラスミンインヒビターにおけるこれら３
種類の活性部位のうち、リアクティブサイトを抗原とし
て選択的に認識するモノクローナル抗体を提供できれ
ば、これを使用することによってヒトα2−プラスミン
インヒビターの線維素溶解阻害作用を直接抑え、プラス
ミノーゲンアクチベーター依存性の線溶をとらえること
ができるので非常に興味あることである。
種類の活性部位のうち、リアクティブサイトを抗原とし
て選択的に認識するモノクローナル抗体を提供できれ
ば、これを使用することによってヒトα2−プラスミン
インヒビターの線維素溶解阻害作用を直接抑え、プラス
ミノーゲンアクチベーター依存性の線溶をとらえること
ができるので非常に興味あることである。
本発明者の一部により上記モノクローナル抗体は見出
され、既に特許出願されている（特開昭60−222426:発
明の名称；モノクローナル抗体，ハイブリドーマ細胞及
びモノクローナル抗体の製造方法）。
され、既に特許出願されている（特開昭60−222426:発
明の名称；モノクローナル抗体，ハイブリドーマ細胞及
びモノクローナル抗体の製造方法）。
近年、成人病における血液疾患として、凝固線溶異常
が話題を集め、取り上げられている。再現性の良い、簡
便な測定法の登場が期待されていた。
が話題を集め、取り上げられている。再現性の良い、簡
便な測定法の登場が期待されていた。
従来知られている線溶異常の検出法は、ユーグロブリ
ン溶解時間法（euglobulin lysis time;ELT）である。
血漿より分画されたユーグロブリン中にはフィブリノー
ゲン，プラスミノーゲン，プラスミノーゲンアクチベー
ターなどが含まれるが、このユーグロブリン溶解時間法
は、これにトロンビンを加えて37℃に保ち、形成される
フィブリン塊の溶解時間を測定するものである。
ン溶解時間法（euglobulin lysis time;ELT）である。
血漿より分画されたユーグロブリン中にはフィブリノー
ゲン，プラスミノーゲン，プラスミノーゲンアクチベー
ターなどが含まれるが、このユーグロブリン溶解時間法
は、これにトロンビンを加えて37℃に保ち、形成される
フィブリン塊の溶解時間を測定するものである。
この方法の欠点は、操作が頻雑で、測定時間もバラツ
キが多いという欠点にある。また最近、血中にプラスミ
ノーゲンアクチベーターインヒビターの存在が示され、
プラスミノーゲンアクチベーターが反映する線溶を調節
していると報告さている［Y.Sakata et al ;Blood 68,1
218−1223（1986）参照］。ユーグロブリン溶解時間法
のもう一つの欠点は、血漿をあらかじめ酸処理するた
め、このプラスミノーゲンアクチベーターインヒビター
が失活する点である。このインヒビターが多量に血中に
生成している症例ではユーグロブリン溶解時間法では、
正確に生態線溶をつかむことはできなかった。
キが多いという欠点にある。また最近、血中にプラスミ
ノーゲンアクチベーターインヒビターの存在が示され、
プラスミノーゲンアクチベーターが反映する線溶を調節
していると報告さている［Y.Sakata et al ;Blood 68,1
218−1223（1986）参照］。ユーグロブリン溶解時間法
のもう一つの欠点は、血漿をあらかじめ酸処理するた
め、このプラスミノーゲンアクチベーターインヒビター
が失活する点である。このインヒビターが多量に血中に
生成している症例ではユーグロブリン溶解時間法では、
正確に生態線溶をつかむことはできなかった。
c.発明の構成 そこで、本発明者は、前記モノクローナル抗体の性質
に着目し、血液線溶活性の測定法について研究を進め
た。
に着目し、血液線溶活性の測定法について研究を進め
た。
その結果、ヒトα2−プラスミンインヒビターに結合
しヒトα2−プラスミンインヒビターの線維素溶解阻害
活性を中和するモノクローナル抗体を、ヒト血液あるい
は血漿に加えることにより簡便に血液線溶活性が測定し
得ることを見出し本発明に到達した。
しヒトα2−プラスミンインヒビターの線維素溶解阻害
活性を中和するモノクローナル抗体を、ヒト血液あるい
は血漿に加えることにより簡便に血液線溶活性が測定し
得ることを見出し本発明に到達した。
かくして本発明によれば、ヒトα2−プラスミンイン
ヒビターに結合し、ヒトα2−プラスミンインヒビター
の線維素溶解阻害活性を中和するモノクローナル抗体
を、ヒト血液あるいは血漿に加えることによる血液線溶
活性の測定方法が提供される。
ヒビターに結合し、ヒトα2−プラスミンインヒビター
の線維素溶解阻害活性を中和するモノクローナル抗体
を、ヒト血液あるいは血漿に加えることによる血液線溶
活性の測定方法が提供される。
殊に本発明によれば、前記モノクローナル抗体をヒト
血液あるいは血漿に加えた後、該血液あるいは血漿を凝
固させ、その凝固物の溶解の状態を調べることによる血
液線溶活性の測定方法が提供される。
血液あるいは血漿に加えた後、該血液あるいは血漿を凝
固させ、その凝固物の溶解の状態を調べることによる血
液線溶活性の測定方法が提供される。
かかる本発明方法によれば、プラスミノーゲンアクチ
ベーター，プラスミノーゲンアクチベータインヒビター
による線溶の状態が、直接にかつ迅速に測定可能とな
る。殊に血栓症,DICにおける線溶亢進，糖尿病などにお
ける線溶低下など生体線溶活性の動態の指標として有効
である。本発明による測定方法は、α2−プラスミンイ
ンヒビター（α2PI）の線維素溶解阻止作用を抑制す
る、すなわち活性を中和するモノクローナル抗体を血漿
あるいは血液に添加することにより行われる。このモノ
クローナル抗体について、以下に説明する。
ベーター，プラスミノーゲンアクチベータインヒビター
による線溶の状態が、直接にかつ迅速に測定可能とな
る。殊に血栓症,DICにおける線溶亢進，糖尿病などにお
ける線溶低下など生体線溶活性の動態の指標として有効
である。本発明による測定方法は、α2−プラスミンイ
ンヒビター（α2PI）の線維素溶解阻止作用を抑制す
る、すなわち活性を中和するモノクローナル抗体を血漿
あるいは血液に添加することにより行われる。このモノ
クローナル抗体について、以下に説明する。
本発明のモノクローナル抗体はケーラーとミルシュタ
インの方法［Ｋhler and Milstein,Nature 256,495−
497（1975）］として知られた手法によって産生され
る。すなわち、ヒトα2−プラスミンインヒビターでマ
ウスを免疫した後、このマウスの脾臓細胞をマウスミエ
ローマ細胞と融合させ、得られたハイブリドーマ細胞
は、マイクロタイタープレート（microtiter plates）
に固定されたヒトα2−プラスミンインヒビターと反応
する抗体に対し系統的に検査し選択される。このように
してヒトα2−プラスミンインヒビターに対する抗体を
合成し、分泌するハイブリドーマ細胞を選別する。得ら
れたハイブリドーマ細胞を無血清培地中で培養し、その
培養上清中に分泌されたヒトα2−プラスミンインヒビ
ターに対する抗体は、フィブリンプレート（fibrin pla
tes）上でヒトα2−プラスミンインヒビターの線維素溶
解阻害作用を抑える活性について検査を行なう。その結
果、ヒトα2−プラスミンインヒビターの線維素溶解阻
止作用を特異的に抑える活性を有するモノクローナル抗
体を産生するハイブリドーマ細胞が単離された。
インの方法［Ｋhler and Milstein,Nature 256,495−
497（1975）］として知られた手法によって産生され
る。すなわち、ヒトα2−プラスミンインヒビターでマ
ウスを免疫した後、このマウスの脾臓細胞をマウスミエ
ローマ細胞と融合させ、得られたハイブリドーマ細胞
は、マイクロタイタープレート（microtiter plates）
に固定されたヒトα2−プラスミンインヒビターと反応
する抗体に対し系統的に検査し選択される。このように
してヒトα2−プラスミンインヒビターに対する抗体を
合成し、分泌するハイブリドーマ細胞を選別する。得ら
れたハイブリドーマ細胞を無血清培地中で培養し、その
培養上清中に分泌されたヒトα2−プラスミンインヒビ
ターに対する抗体は、フィブリンプレート（fibrin pla
tes）上でヒトα2−プラスミンインヒビターの線維素溶
解阻害作用を抑える活性について検査を行なう。その結
果、ヒトα2−プラスミンインヒビターの線維素溶解阻
止作用を特異的に抑える活性を有するモノクローナル抗
体を産生するハイブリドーマ細胞が単離された。
本発明のモノクローナル抗体は、かかるハイブリドー
マ細胞が産生する産出物から得られる。かくして得られ
たモノクローナル抗体は、ヒトα2−プラスミンインヒ
ビターのリアクティブサイトに対して単一特異的（mono
specitic）に作用する。
マ細胞が産生する産出物から得られる。かくして得られ
たモノクローナル抗体は、ヒトα2−プラスミンインヒ
ビターのリアクティブサイトに対して単一特異的（mono
specitic）に作用する。
次に本発明のハイブリドーマ細胞を産生する具体的方
法について詳細に説明する。
法について詳細に説明する。
A.抗原の単離・精製； 抗原に用いるヒトα2−プラスミンインヒビターは前
記青木と諸井の方法によりヒト血漿中より単離精製され
た。
記青木と諸井の方法によりヒト血漿中より単離精製され
た。
B.ヒトα2−プラスミンインヒビターによるマウスの免
疫 雄Balb/cマウスを用いるが、他の系（strains）のマ
ウスを使用することもできる。その際、免疫計画及びヒ
トα2−プラスミンインヒビターの濃度は十分な量の抗
原刺激を受けたリンパ球が形成されるよう選ばれるべき
である。例えばマウスに少量のα2−プラスミンインヒ
ビターで或る間隔で腹腔に数回免疫の後、さらに数回静
脈に投与した。最終免疫の数日後に融合の為に脾臓細胞
を取り出す。
疫 雄Balb/cマウスを用いるが、他の系（strains）のマ
ウスを使用することもできる。その際、免疫計画及びヒ
トα2−プラスミンインヒビターの濃度は十分な量の抗
原刺激を受けたリンパ球が形成されるよう選ばれるべき
である。例えばマウスに少量のα2−プラスミンインヒ
ビターで或る間隔で腹腔に数回免疫の後、さらに数回静
脈に投与した。最終免疫の数日後に融合の為に脾臓細胞
を取り出す。
C.細胞融合 脾臓を無菌的に取り出し、それから単細胞懸濁液を調
製する。それらの脾臓細胞を適当なラインからのマウス
骨髄腫細胞と適当な融合促進剤の使用により細胞融合さ
せる。脾臓細胞対骨髄細胞の好ましい比率は約20:1〜約
2:1の範囲である。約108個の脾臓細胞について0.5〜1.5
mlの融合媒体の使用が適当である。
製する。それらの脾臓細胞を適当なラインからのマウス
骨髄腫細胞と適当な融合促進剤の使用により細胞融合さ
せる。脾臓細胞対骨髄細胞の好ましい比率は約20:1〜約
2:1の範囲である。約108個の脾臓細胞について0.5〜1.5
mlの融合媒体の使用が適当である。
細胞融合に用いる骨髄腫細胞は多く知られているが、
本発明ではP3−X63−Ag8−U1細胞（以下P3−U1と略記す
る）［Yelton,D.E.et al.,Current Topics in Microbio
logy and Immunology,81,1（1978）参照］を用いた。こ
れは、８−アザグアニン耐性の細胞ラインであり、酸素
ヒポキサンチン−グアニンホスホリポシルトランスフェ
ラーゼ（hypoxanthineguanine phosphoribosyl transfe
rase）がけっしつしており、それゆえHAT（ヒポキサン
チン，アミノプテリン，チミジン）培地中では生存しな
い。また、この細胞ラインは、それ自体抗体を分泌しな
い、いわゆる非分泌型である。
本発明ではP3−X63−Ag8−U1細胞（以下P3−U1と略記す
る）［Yelton,D.E.et al.,Current Topics in Microbio
logy and Immunology,81,1（1978）参照］を用いた。こ
れは、８−アザグアニン耐性の細胞ラインであり、酸素
ヒポキサンチン−グアニンホスホリポシルトランスフェ
ラーゼ（hypoxanthineguanine phosphoribosyl transfe
rase）がけっしつしており、それゆえHAT（ヒポキサン
チン，アミノプテリン，チミジン）培地中では生存しな
い。また、この細胞ラインは、それ自体抗体を分泌しな
い、いわゆる非分泌型である。
好ましい融合促進剤としては例えば平均分子量が1,00
0〜4,000のポリエチレングリコールを有利に使用できる
が、この分野で知られている他の融合促進剤を使用する
こともできる。本発明の実施例では平均分子量1,540の
ポリエチレングリコールを用いた。
0〜4,000のポリエチレングリコールを有利に使用できる
が、この分野で知られている他の融合促進剤を使用する
こともできる。本発明の実施例では平均分子量1,540の
ポリエチレングリコールを用いた。
D.融合した細胞の選択； 別の容器内（例えばマイクロタイタープレート）で未
融合の脾臓細胞，未融合の骨髄腫細胞および融合した細
胞の混合物を、未融合の骨髄腫細胞を支持しない選択培
地で希釈し、未融合の細胞を死滅させるのに十分な時間
（約１週間）培養する。培地は薬物抵抗性（例えば８−
アザグアニン抵抗性）で未融合の骨髄腫細胞を支持しな
いもの（例えば前記HAT培地）が使用される。この選択
培地中では未融合の骨髄腫細胞は死滅する。この未融合
の脾臓細胞は非腫瘍性細胞なのである一定期間後（約１
週間後）死滅する。これらに対して融合した細胞は骨髄
腫の親細胞の腫瘍性と親脾臓細胞の性質をあわせ持つた
めに選択培地中で生存できる。
融合の脾臓細胞，未融合の骨髄腫細胞および融合した細
胞の混合物を、未融合の骨髄腫細胞を支持しない選択培
地で希釈し、未融合の細胞を死滅させるのに十分な時間
（約１週間）培養する。培地は薬物抵抗性（例えば８−
アザグアニン抵抗性）で未融合の骨髄腫細胞を支持しな
いもの（例えば前記HAT培地）が使用される。この選択
培地中では未融合の骨髄腫細胞は死滅する。この未融合
の脾臓細胞は非腫瘍性細胞なのである一定期間後（約１
週間後）死滅する。これらに対して融合した細胞は骨髄
腫の親細胞の腫瘍性と親脾臓細胞の性質をあわせ持つた
めに選択培地中で生存できる。
E.各容器中のヒトα2−プラスミンインヒビターに対す
る抗体の確認； かくしてハイブリドーマ細胞が検出された後、その培
養上清を採取し、ヒトα2−プラスミンインヒビターに
対する抗体について酵素免疫定量法（Enzyme Linked Im
muno Sorbent Assay）によりスクリーニングする。
る抗体の確認； かくしてハイブリドーマ細胞が検出された後、その培
養上清を採取し、ヒトα2−プラスミンインヒビターに
対する抗体について酵素免疫定量法（Enzyme Linked Im
muno Sorbent Assay）によりスクリーニングする。
F.ヒトα2−プラスミンインヒビターに対する活性を持
つ抗体を産生するハイブリドーマ細胞の選択； ヒトα2−プラスミンインヒビターに対する抗体を産
生しているハイブリドーマ細胞を、無血清培地で培養し
て得られた、抗体を含んだ培養上清液を濃縮し、ヒトα
2−プラスミンインヒビターと共に一定時間インキュベ
ートした。さらにこのヒトα2−プラスミンインヒビタ
ー混合液にプラスミンを加え、フィブリンプレート上に
のせ、フィブリン溶解面積を測定した。このようにし
て、ヒトα2−プラスミンインヒビターに対する活性を
持つ抗体を産生するハイブリドーマ細胞を選択する。
つ抗体を産生するハイブリドーマ細胞の選択； ヒトα2−プラスミンインヒビターに対する抗体を産
生しているハイブリドーマ細胞を、無血清培地で培養し
て得られた、抗体を含んだ培養上清液を濃縮し、ヒトα
2−プラスミンインヒビターと共に一定時間インキュベ
ートした。さらにこのヒトα2−プラスミンインヒビタ
ー混合液にプラスミンを加え、フィブリンプレート上に
のせ、フィブリン溶解面積を測定した。このようにし
て、ヒトα2−プラスミンインヒビターに対する活性を
持つ抗体を産生するハイブリドーマ細胞を選択する。
G.目的の抗体を産生するハイブリドーマ細胞のクローン
化； 目的の抗体を産生するハイブリドーマ細胞を適当な方
法（例えば限定希釈法）でクローン化すると、抗体は２
つの異った方法で産生される。その第１の方法によれば
ハイブリドーマ細胞を一定時間適当な培地で培養するこ
とにより、その培養上清からそのハイブリドーマ細胞の
産生するモノクローナル抗体を得ることができる。第２
の方法によればハイブリドーマ細胞は同質遺伝子又は半
同質遺伝子を持つマウスの腹腔に注射することができ
る。一定時間後の宿主動物の血液中及び腹液中及び腹水
中より、そのハイブリドーマ細胞の産生するモノクロー
ナル抗体を得ることができる。あるいは適当な液体培地
（例えば10％牛胎児血清を含むRPMI1640）中で上記ハイ
ブリドーマ細胞を一定時間培養し、その培養上清中よ
り、そのハイブリドーマ細胞の再生するモノクローナル
抗体を得ることができる。
化； 目的の抗体を産生するハイブリドーマ細胞を適当な方
法（例えば限定希釈法）でクローン化すると、抗体は２
つの異った方法で産生される。その第１の方法によれば
ハイブリドーマ細胞を一定時間適当な培地で培養するこ
とにより、その培養上清からそのハイブリドーマ細胞の
産生するモノクローナル抗体を得ることができる。第２
の方法によればハイブリドーマ細胞は同質遺伝子又は半
同質遺伝子を持つマウスの腹腔に注射することができ
る。一定時間後の宿主動物の血液中及び腹液中及び腹水
中より、そのハイブリドーマ細胞の産生するモノクロー
ナル抗体を得ることができる。あるいは適当な液体培地
（例えば10％牛胎児血清を含むRPMI1640）中で上記ハイ
ブリドーマ細胞を一定時間培養し、その培養上清中よ
り、そのハイブリドーマ細胞の再生するモノクローナル
抗体を得ることができる。
H.線溶活性の測定； 次に、該モノクローナル抗体（α2PIの活性を中和す
るモノクローナル抗体）を用いて線溶活性を測定する方
法について述べる。
るモノクローナル抗体）を用いて線溶活性を測定する方
法について述べる。
ヒト血漿100μｌをプラスチック製試験管に入れる。
上記，α2PIに対するモノクローナル抗体を終濃度1.6μ
Ｍになるように加え、さらにトロンビン10単位とCaCl2
2mMを添加し、フィブリン塊を形成させる。ガラス棒で
フィブリン塊をつぶし、血漿中に浮かべ、室温で放置す
る。経時的にフィブリン塊の浮かんでいる血漿を採取
し、フィブリン分解物（FDP）プラスミノーゲンアクチ
ベーター（ｔ−PA）を測定する。あるいはフィブリン塊
の溶解時間を測定する。これらの測定値は抗プラスミン
活性を排除し、かつ直接に生体線溶活性を反映するもの
である。従って本発明による血液線溶活性測定方法によ
れば、例えばガンの所期にプラスミノーゲンアクチベー
ターが多量に産生している患者の線溶亢進や、妊婦にお
けるプラスミノーゲンアクチベーターインヒビター（PA
I）による線溶低下の把握、また血栓症の予防，診断に
使用することができる。
上記，α2PIに対するモノクローナル抗体を終濃度1.6μ
Ｍになるように加え、さらにトロンビン10単位とCaCl2
2mMを添加し、フィブリン塊を形成させる。ガラス棒で
フィブリン塊をつぶし、血漿中に浮かべ、室温で放置す
る。経時的にフィブリン塊の浮かんでいる血漿を採取
し、フィブリン分解物（FDP）プラスミノーゲンアクチ
ベーター（ｔ−PA）を測定する。あるいはフィブリン塊
の溶解時間を測定する。これらの測定値は抗プラスミン
活性を排除し、かつ直接に生体線溶活性を反映するもの
である。従って本発明による血液線溶活性測定方法によ
れば、例えばガンの所期にプラスミノーゲンアクチベー
ターが多量に産生している患者の線溶亢進や、妊婦にお
けるプラスミノーゲンアクチベーターインヒビター（PA
I）による線溶低下の把握、また血栓症の予防，診断に
使用することができる。
以下実施例を掲げ、本発明を詳細に説明する。実施例
で使用しているα2PIに結合し、α2PIの抗プラスミン活
性を中和する（線維素溶解阻害作用を抑制する）モノク
ローナル抗体は特開昭60−222426号公報に記載されてい
るモノクローナル抗体1D10C1を用いた。
で使用しているα2PIに結合し、α2PIの抗プラスミン活
性を中和する（線維素溶解阻害作用を抑制する）モノク
ローナル抗体は特開昭60−222426号公報に記載されてい
るモノクローナル抗体1D10C1を用いた。
実施例１ ヒトα2−プラスミンインヒビターに対するモノクロ
ーナル抗体によるヒトα2−プラスミンインヒビター活
性の抑制； 本実施例は、ヒトα2−プラスミンインヒビターによ
るプラスミンの不活性化に及ぼす、α2−プラスミンイ
ンヒビターに対するモノクローナル抗体の効果を調べた
ものである。
ーナル抗体によるヒトα2−プラスミンインヒビター活
性の抑制； 本実施例は、ヒトα2−プラスミンインヒビターによ
るプラスミンの不活性化に及ぼす、α2−プラスミンイ
ンヒビターに対するモノクローナル抗体の効果を調べた
ものである。
α2−プラスミンインヒビター0.15μＭと適当な濃度
になるように希釈したα2−プラスミンインヒビターに
対するモノクローナル抗体（1D10C1）を２％牛血清アル
ブミン溶液［0.05Mトリス緩衝液（pH7.4）,0.15M NaC
l］中で37℃,30分間インキュベーションし、４℃で一晩
放置した。
になるように希釈したα2−プラスミンインヒビターに
対するモノクローナル抗体（1D10C1）を２％牛血清アル
ブミン溶液［0.05Mトリス緩衝液（pH7.4）,0.15M NaC
l］中で37℃,30分間インキュベーションし、４℃で一晩
放置した。
この反応混液60μｌとプラスミン溶液（0.47μＭ）20
μｌを混ぜ、0.05Mトリス緩衝液（pH7.4,0.15M NaClを
含む）を加えて全量を500μｌとし、37℃で20分間イン
キュベーションした。次に3.5mM合成基質Ｓ−2251（Ｈ
−Ｄ−バリル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−リジル−ｐ−ニトロ
アニリド・二塩酸塩）を200μｌ加え、分光光度計（Bec
kman,DU−８）によって単位時間当りの405nmの波長にお
ける吸光度の変化を測定した。対照としてプラスミンの
みを反応させた試料とモノクローナル抗体を加えずにヒ
トα2−プラスミンインヒビターとプラスミンを反応さ
せた試料についても同様に吸光度の変化を調べた。モノ
クローナル抗体を加えずにプラスミンと反応させた時の
α2−プラスミンインヒビターの活性を100％とし、計算
した。
μｌを混ぜ、0.05Mトリス緩衝液（pH7.4,0.15M NaClを
含む）を加えて全量を500μｌとし、37℃で20分間イン
キュベーションした。次に3.5mM合成基質Ｓ−2251（Ｈ
−Ｄ−バリル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−リジル−ｐ−ニトロ
アニリド・二塩酸塩）を200μｌ加え、分光光度計（Bec
kman,DU−８）によって単位時間当りの405nmの波長にお
ける吸光度の変化を測定した。対照としてプラスミンの
みを反応させた試料とモノクローナル抗体を加えずにヒ
トα2−プラスミンインヒビターとプラスミンを反応さ
せた試料についても同様に吸光度の変化を調べた。モノ
クローナル抗体を加えずにプラスミンと反応させた時の
α2−プラスミンインヒビターの活性を100％とし、計算
した。
図１は、モノクローナル抗体のα2PI活性に及ぼす影
響を示したものである。縦軸はα2PI活性を、横軸は反
応させたモノクローナル抗体とα2PIのモル比を表して
いる。
響を示したものである。縦軸はα2PI活性を、横軸は反
応させたモノクローナル抗体とα2PIのモル比を表して
いる。
MCAと記してあるものは、以降、α2PIに対するモノク
ローナル抗体を示す。
ローナル抗体を示す。
実施例２ α2PIに対するモノクローナル抗体によるフィブリン
塊溶解（１） プラスチック試験管に入れたヒト血漿100μｌにα2PI
に対するモノクローナル抗体1D10C1を0.4,0.8,1.6μＭ
の濃度になるように加え、混合した。125I標識化フィブ
リノーゲン（５×105cpm/μｌ）２μl,トロンビン10単
位，Ca2+イオン2mMを添加し、フィブリン塊を形成さ
せ、ガラス棒で押しつぶされた後、同じ試験管に残存す
る血漿中に浮かべた。室温で放置し、2,4,6,8,24時間後
に各々血漿を２μｌずつサンプリングし、フィブリン塊
が溶解して血漿中に出てくる125I標識化されたFDP（Fib
rin Degradation Product;フィブリン分解物）をガンマ
カウンターで測定した。図２に、フィブリン塊溶解を表
わす。横軸は反応時間を、縦軸は生成した125I-FDPの割
合をすなわち線溶活性（％）を示している。例えば活性
100％はフィブリン塊が100％溶解したことを示す。
塊溶解（１） プラスチック試験管に入れたヒト血漿100μｌにα2PI
に対するモノクローナル抗体1D10C1を0.4,0.8,1.6μＭ
の濃度になるように加え、混合した。125I標識化フィブ
リノーゲン（５×105cpm/μｌ）２μl,トロンビン10単
位，Ca2+イオン2mMを添加し、フィブリン塊を形成さ
せ、ガラス棒で押しつぶされた後、同じ試験管に残存す
る血漿中に浮かべた。室温で放置し、2,4,6,8,24時間後
に各々血漿を２μｌずつサンプリングし、フィブリン塊
が溶解して血漿中に出てくる125I標識化されたFDP（Fib
rin Degradation Product;フィブリン分解物）をガンマ
カウンターで測定した。図２に、フィブリン塊溶解を表
わす。横軸は反応時間を、縦軸は生成した125I-FDPの割
合をすなわち線溶活性（％）を示している。例えば活性
100％はフィブリン塊が100％溶解したことを示す。
α2PIに対するモノクローナル抗体を加えないとフィ
ブリン塊はα2PIの働きで守られて全く溶解しない。一
方、モノクローナル抗体を添加し、α2PIの抗プラスミ
ン作用を中和すると、フィブリン塊の抗体の濃度に依存
して溶解しやすくなった。α2PIに対するモノクローナ
ル抗体を1.6μＭ加えた場合、24時間反応後の線溶活性
は90％、すなわち90％フィブリン塊が溶解した。
ブリン塊はα2PIの働きで守られて全く溶解しない。一
方、モノクローナル抗体を添加し、α2PIの抗プラスミ
ン作用を中和すると、フィブリン塊の抗体の濃度に依存
して溶解しやすくなった。α2PIに対するモノクローナ
ル抗体を1.6μＭ加えた場合、24時間反応後の線溶活性
は90％、すなわち90％フィブリン塊が溶解した。
実施例３ α2PIに対するモノクローナル抗体によるフィブリン
塊溶解（２） プラスチック試験管に入れたヒト血液100μｌと同じ
血液から分離した、血漿100μｌにα2PIに対するモノク
ローナル抗体1D10C1をそれぞれ1.6μＭの濃度になるよ
うに加え、混合した。125 I標識化フィブリノーゲン（５×105cpm/μｌ）２μ
l,トロンビン10単位，Ca2+イオン2mMを添加し、フィブ
リン塊を形成させ、ガラス棒で押しつぶした後、同じ試
験管に残存する血液中あるいは血漿中に浮かべた。室温
で放置し、2,4,6,8,24時間後に各々２μｌずつサンプリ
ングし、フィブリン塊が溶解して血液あるいは血漿中に
出てくる125I標識化されたFDP（Fibrin Degradation Pr
oduct;フィブリン分解物）をガンマカウンターで測定し
た。図３にフィブリン塊溶解を表わす。横軸は反応時間
を、縦軸は生成した125I-FDPの割合を、すなわち線溶活
性（％）を示している。例えば活性100％はフィブリン
塊が100％溶解したことを示す。
塊溶解（２） プラスチック試験管に入れたヒト血液100μｌと同じ
血液から分離した、血漿100μｌにα2PIに対するモノク
ローナル抗体1D10C1をそれぞれ1.6μＭの濃度になるよ
うに加え、混合した。125 I標識化フィブリノーゲン（５×105cpm/μｌ）２μ
l,トロンビン10単位，Ca2+イオン2mMを添加し、フィブ
リン塊を形成させ、ガラス棒で押しつぶした後、同じ試
験管に残存する血液中あるいは血漿中に浮かべた。室温
で放置し、2,4,6,8,24時間後に各々２μｌずつサンプリ
ングし、フィブリン塊が溶解して血液あるいは血漿中に
出てくる125I標識化されたFDP（Fibrin Degradation Pr
oduct;フィブリン分解物）をガンマカウンターで測定し
た。図３にフィブリン塊溶解を表わす。横軸は反応時間
を、縦軸は生成した125I-FDPの割合を、すなわち線溶活
性（％）を示している。例えば活性100％はフィブリン
塊が100％溶解したことを示す。
血液にα2PIに対するモノクローナル抗体を加えてフ
ィブリン塊を形成させても、血漿の時と同様にフィブリ
ン塊は溶解する。このことは、血漿分離操作を行なうこ
となく、採血後、簡便に線溶活性が測定できることを意
味する。
ィブリン塊を形成させても、血漿の時と同様にフィブリ
ン塊は溶解する。このことは、血漿分離操作を行なうこ
となく、採血後、簡便に線溶活性が測定できることを意
味する。
実施例２及び３において使用したヒト血液，血漿は健
常人から採取したものである。本測定法は抗体を加えて
抗プラスミン作用を抑えているため、直接、血液あるい
は血漿中のプラスミノーゲンアクチベーター（TPA）と
プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター（PAI）
の作用が反映する線溶活性をフィブリン塊溶解（Clotly
sis）という形で見ている。各種疾患において、例えば
６時間後のフィブリン分解物（FDP）の測定値の大小
は、線溶亢進あるいは低下を表わすものである。またフ
ィブリン塊溶解時間の長短でも、線溶異常の把握が容易
に可能である。
常人から採取したものである。本測定法は抗体を加えて
抗プラスミン作用を抑えているため、直接、血液あるい
は血漿中のプラスミノーゲンアクチベーター（TPA）と
プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター（PAI）
の作用が反映する線溶活性をフィブリン塊溶解（Clotly
sis）という形で見ている。各種疾患において、例えば
６時間後のフィブリン分解物（FDP）の測定値の大小
は、線溶亢進あるいは低下を表わすものである。またフ
ィブリン塊溶解時間の長短でも、線溶異常の把握が容易
に可能である。
実施例４ 本測定法を用いた、各種疾患における線溶活性の測定 実施例３において測定した方法に従い、各種疾患にお
ける線溶活性の測定を行なった。
ける線溶活性の測定を行なった。
患者血漿はAPL,AMMOL（白血病）,DIC（汎発性血管内
凝固症），肺ガンであり、各疾患由来の血漿を用い、正
常血漿を対照に測定を行なった。図４に測定結果をまと
めて示した。縦軸が本測定法によって得られたΔFDP量
（単位μg/ml）であり、横軸が免疫学的手法（ELISA）
によって求めたｔ−PA（プラスミノーゲンアクチベータ
ー）量（単位ng/ml）である。各測定値をプロットし、
相関から直線を引くと、各種疾患の線溶動態が明らかに
なる。すなわち、DICでは、健常人に比べて、本測定法
における活性値（この例ではΔFDP）が低く、静脈内に
形成した血栓が溶解し難い状態にあることがわかる。生
化学的には、生成したｔ−PAがそのインヒビターによっ
て阻害されていることが考えられる。また肺ガンなどの
ガンの症例においては、ｔ−PAの血中濃度は多いが、本
測定法における活性値は低く、DICを併発する可能性が
あるものと予診できる。生化学的にはガン組織細胞で産
生されたｔ−PAは、同様に多量に産生されたインヒビタ
ーにより活性を中和され、血栓溶解を有効に行えないこ
とが考えられる。
凝固症），肺ガンであり、各疾患由来の血漿を用い、正
常血漿を対照に測定を行なった。図４に測定結果をまと
めて示した。縦軸が本測定法によって得られたΔFDP量
（単位μg/ml）であり、横軸が免疫学的手法（ELISA）
によって求めたｔ−PA（プラスミノーゲンアクチベータ
ー）量（単位ng/ml）である。各測定値をプロットし、
相関から直線を引くと、各種疾患の線溶動態が明らかに
なる。すなわち、DICでは、健常人に比べて、本測定法
における活性値（この例ではΔFDP）が低く、静脈内に
形成した血栓が溶解し難い状態にあることがわかる。生
化学的には、生成したｔ−PAがそのインヒビターによっ
て阻害されていることが考えられる。また肺ガンなどの
ガンの症例においては、ｔ−PAの血中濃度は多いが、本
測定法における活性値は低く、DICを併発する可能性が
あるものと予診できる。生化学的にはガン組織細胞で産
生されたｔ−PAは、同様に多量に産生されたインヒビタ
ーにより活性を中和され、血栓溶解を有効に行えないこ
とが考えられる。
以上、実施例１〜４において述べて来たように、本測
定法では、生体内の線溶動態（異常・亢進・低下）を迅
速かつ簡便に測定することが出来る。
定法では、生体内の線溶動態（異常・亢進・低下）を迅
速かつ簡便に測定することが出来る。
図１は、本発明のモノクローナル抗体のα2PI活性に及
ぼす影響を示したものであり、図２及び図３はフィブリ
ン塊（凝固物）の溶解状態と反応時間の関係を示したも
のであり、図４は、各種疾患におけるｔ−PA量とフィブ
リン分解量との関係を示したものである。
ぼす影響を示したものであり、図２及び図３はフィブリ
ン塊（凝固物）の溶解状態と反応時間の関係を示したも
のであり、図４は、各種疾患におけるｔ−PA量とフィブ
リン分解量との関係を示したものである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭60−222426（ＪＰ，Ａ) 特開 昭61−97230（ＪＰ，Ａ) 特開 昭58−209999（ＪＰ，Ａ) Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，251 （19），Ｐ．5956−5965，（1976)
Claims (2)
- 【請求項１】ヒトα2−プラスミンインヒビターにおけ
るプラスミンの線維素溶解作用の阻止部位を認識し、か
つ、プラスミン結合部位およびフィブリン結合部位のい
ずれをも認識しない、ヒトα2−プラスミンインヒビタ
ーの線維素溶解阻止作用を抑制するモノクローナル抗体
を、ヒト血液あるいは血漿に加えることを特徴とするヒ
ト血液線溶活性の測定方法。 - 【請求項２】ヒトα2−プラスミンインヒビターにおけ
るプラスミンの線維素溶解作用の阻止部位を認識し、か
つ、プラスミン結合部位およびフィブリン結合部位のい
ずれをも認識しない、ヒトα2−プラスミンインヒビタ
ーの線維素溶解阻止作用を抑制するモノクローナル抗体
を、ヒト血液あるいは血漿に加えた後、該血液あるいは
血漿を凝固させ、凝固物の溶解の状態を調べることを特
徴とする血液線溶活性の測定方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62165492A JP2520424B2 (ja) | 1987-07-03 | 1987-07-03 | 血液線溶活性の測定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62165492A JP2520424B2 (ja) | 1987-07-03 | 1987-07-03 | 血液線溶活性の測定方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6410173A JPS6410173A (en) | 1989-01-13 |
| JP2520424B2 true JP2520424B2 (ja) | 1996-07-31 |
Family
ID=15813428
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62165492A Expired - Fee Related JP2520424B2 (ja) | 1987-07-03 | 1987-07-03 | 血液線溶活性の測定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2520424B2 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5810523A (en) * | 1995-02-28 | 1998-09-22 | Kabushiki Kaisha Miyanaga | Apparatus for drilling a hole having an undercut space |
| WO2023074864A1 (ja) * | 2021-10-29 | 2023-05-04 | 国立大学法人浜松医科大学 | 血漿中線溶抵抗性活性の評価方法 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| NL8201987A (nl) * | 1982-05-13 | 1983-12-01 | Tno | Werkwijze voor het bepalen van de activiteit van plasminogeenactivator van het weefseltype, alsmede voor gebruik bij deze werkwijze geschikte combinatie van het "kit"-type. |
| JPS6197230A (ja) * | 1984-10-18 | 1986-05-15 | Teijin Ltd | ヒトα↓２―プラスミンインヒビターに対する選択的吸着体 |
| JPS60222426A (ja) * | 1984-04-17 | 1985-11-07 | Teijin Ltd | モノクローナル抗体及びモノクローナル抗体の製造方法 |
-
1987
- 1987-07-03 JP JP62165492A patent/JP2520424B2/ja not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５１（１９），Ｐ．５９５６−５９６５，（１９７６） |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS6410173A (en) | 1989-01-13 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |