JPH0441782B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 ａ 産業上の利用分野 本発明は、溶液状態にあるヒトα₂−プラスミン
インヒビター（α₂−plasmin inhibitor，α₂−
antiplasmin）を免疫学的に測定する試薬及びそ
のキツトに関する。更に詳しくは、ヒトα₂−プラ
スミンインヒビターのそれぞれ異なる抗原決定部
位を特異的に認識して結合する２種類のモノクロ
ーナル抗体を用い、そのうちの１種類はヒトα₂−
プラスミンインヒビターにおけるプラスミンの線
維素溶解作用の阻止部位を特異的に認識して結合
し得るモノクローナル抗体を用いるサンドイツチ
法によるヒトα₂−プラスミンインヒビターの免疫
学的測定試薬及びそのキツトに関する。

ｂ 従来技術 ヒトのα₂−プラスミンインヒビターは、青木と
諸井によつて最初に単離・精製され、線維素溶解
酵素のプラスミン（plasmin）のエステラーゼ活
性を瞬間的に阻害する強力なプラスミンインヒビ
ターであり、11.7％の糖を含む分子量約67000の
１本鎖の糖蛋白質であることが知られている
〔Moroi ＆ Aoki；The Journal of
Biological Chemistry，251，5956−5965（1976）
参照〕。

一方ヒトのα₂−プラスミンインヒビターには３
種類の活性部位があることが知られている。第１
はプラスミンの線維素溶解作用を阻止する部位
（以下これを“リアクテイブサイド”ということ
がある）〔B.Wiman ＆ D.Collen；The
Journal of Biological Chemistry，254，9291〜
9297（1979）参照〕であり、第２はカルボキシル
基末端側のプラスミン結合部位〔B.Wiman ＆
D.Collen；European Journal of
Biochemistry，84，573−578（1978）参照〕であ
り、第３はアミノ基末端のフイブリン結合部位で
ある〔Y.Sakata，et al.，Thrombosis
Research，16 279〜282（1979）参照〕。

一方ヒトα₂−プラスミンインヒビターは、臨床
医学的にみて、肝実質細胞障害のときにその血中
レベルが低下する現象が知られており、特に非代
償期の肝硬変、激症肝炎などの時にはその血中レ
ベルは非常に顕著に低下することが報告されてい
る〔例えばN.Aoki ＆ T.Yamanaka，Clin
Chimica Acta 84，99−105（1978）参照〕。

また最近、ヒトα₂−プラスミンインヒビターの
理学的、生物学性質の解明が進み、ヒトα₂−プラ
スミンインヒビターは線維素溶解機構に対して特
異的に制御と調節を行なつており、その機構に対
して重要な作用をしていることが知られている
〔例えば青木延雄、醫学のあゆみ、126，147−155
（1983）参照〕。

従つて、血液中のヒトα₂−プラスミンインヒビ
ターの量を正確且つ簡便に測定することができれ
ば、種々の病気に対しその予防、診断に極めて役
立つことである。

従来知られたヒトα₂−プラスミンインヒビター
の測定方法として第１の方法は、ヒトα₂−プラス
ミンインヒビターに対する抗血清を用いる免疫拡
散法であり、第２の方法は検体試料に一定過剰の
プラスミンを加えヒトα₂−プラスミンインヒビタ
ーと結合していない残存プラスミン活性を測定す
る方法である。

しかし、前者の方法は、動物抗血清を用いるた
めに一定の活性を有する抗血清を安定して得るこ
とが極めて困難であり標準物質によつて活性を補
正して使用しなければならないという煩雑さがあ
つた。また免疫拡散に長時間を要するという欠点
があつた。さらに後者は、加えたプラスミンの残
存量を調べることによりヒトα₂−プラスミンイン
ヒビターの量を間接的に測定する方法であり、検
体試料中に存在する種々のプラスミン活性阻害物
質の影響を受け易く、ヒトα₂−プラスミンインヒ
ビターの量を直接測定していないから誤差を避け
るのは不可能と云つてよく、またこの方法では使
用するプラスミンの純度や安定性にも注意を払う
必要があつた。

ｃ 発明の構成 そこで本発明者らは、ヒトα₂−プラスミンイン
ヒビターに対するモノクローナル抗体について研
究を重ねたところ、ヒトα₂−プラスミンインヒビ
ターにおけるプラスミンの線維素溶解作用阻止部
位を特異的に認識し、ヒトα₂−プラスミンインヒ
ビターの線維素溶解阻止作用を抑制する活性を有
するモノクロ−ナル抗体を見出し、またこのモノ
クローナル抗体を産出するハイプリドーマ細胞を
創作し得、既に提案した。

本発明者らは、かゝる新しく見出した前記モノ
クローナル抗体の特異的な作用を利用すれば、溶
液状態にあるヒトα₂−プラスミンインヒビターの
量を直接に且つ正確に測定し得ることを見出し本
発明に到達した。

すなわち、本発明は、サンドイツチ法による免
疫学的測定試薬において、不溶性担体に結合した
抗体とは、ヒトα₂−プラスミンインヒビターのそ
れぞれ異なる抗原決定部位を特異的に認識するも
のであり且つそのいずれか一方の抗体はヒトα₂−
プラスミンインヒビターにおけるリアクテイブサ
イトを特異的い認識して結合し得るモノクローナ
ル抗体であることを特徴とするヒトα₂−プラスミ
ンインヒビターに対するモノクローナル抗体を用
いたヒトα₂−プラスミンインヒビターの免疫学的
測定試薬であり、またそのキツトである。

一般に抗原の２つの異なつた位置に結合した抗
体を作つて抗原の有無又はその量を測定する方法
は、サンドイツチ法と呼ばれ、例えばワイド
（Wide）の「放射線免疫検定法
（Radioimunoassay Methods）」199−206（1970）
に記載されている。

かゝる本発明の免疫学的測定試薬は、使用する
２種類のモノクローナル抗体として、ヒトα₂−プ
ラスミンインヒビターのそれぞれ異なる抗原決定
部位を認識するものを使用し、特にその１種はヒ
トα₂−プラスミンインヒビターにおけるリアクテ
イブサイトを特異的に認識し得るモノクローナル
抗体を使用する。かくして本発明によれば、試薬
の品質差がなく、恒常的に精度よく溶液状態の
（例えば血漿中の）ヒトα₂−プラスミンインヒビ
ターを測定することが可能となる。また直接ヒト
α₂−プラスミンインヒビターを測定するので他の
挾雑物の影響は全く受けず正確に且つ短時間に測
定することができる。従つて、本発明によれば、
従来には存在しなかつたヒトα₂−プラスミンイン
ヒビターを正確且つ迅速に測定し得る試薬及びそ
のキツトが提供される。

次に本発明による測定試薬及びヒトα₂−プラス
ミンインヒビターの含有量の測定方法を具体的に
説明する。

ヒトα₂−プラスミンインヒビターに対するモノ
クローナル抗体（第１抗体）を適当な不溶性担体
（例えばプラスチツク容器）に固定化する（以下
これを“固定化抗体”という）。ついで不溶性担
体と測定しようとする試薬又は検体資料との非特
異的結合を避けるために適当な物質（例えば牛血
清アルブミン）で不溶性担体の表面を被覆する。

このようにして得られた第１抗体が固定化され
た不溶性担体を検体試料と一定時間及び温度で接
触させ反応させる。この間に固定化抗体（第１抗
体）と検体試料中のヒトα₂−プラスミンインヒビ
ターが結合する。ついで適当な洗浄液で洗つた
後、適当な標識物質で標識したヒトα₂−プラスミ
ンインヒビターに対するモノクローナル抗体（第
２抗体）の溶液（例えば水溶液）を、不溶性担体
における固定化抗体に結合したヒトα₂−プラスミ
ンインヒビターと一定時間及び温度で接触させ第
２抗体と反応させる。これを適当な洗浄液で洗
い、次いで不溶性担体上に存在する第２抗体に標
識された標識物質の量を測定する。かくしてその
値から検体試料中のα₂−プラスミンインヒビター
の量を算出することができる。

かくして本発明の測定試薬は、第１抗体が不溶
性担体に結合した固定化抗体と標識化された第２
抗体とより主として構成される。この試薬を能率
よく且つ簡便に利用するために、これら抗体以外
に種々の補助剤を含めてキツトを形成することが
できる。かゝる補助剤としては、例えば固体状の
試薬を溶解させるための溶解剤、不溶化担体を洗
浄するために使用される洗浄剤、抗体の標識物質
として酵素を使用した場合、酵素活性を測定する
ための基質、その反応停止剤などの免疫学的測定
試薬のキツトとして通常使用されるものが挙げら
れる。

本発明の測定試薬に使用される不溶性担体とし
ては、例えばポリスチレン、ポリエチレン、ポリ
プロピレン、ポリエステル、ポリアクリルニトリ
ル、弗素樹脂、架橋デキストラン、ポリサツカラ
イドなどの高分子、その他紙、ガラス、金属、ア
ガロース及びこれらの組合せなどを例示すること
ができる。

また不溶性担体の形状としては、例えばトレイ
状、球状、繊維状、棒状、盤状、容器状、セル、
試験管などの種々の形状であることができる。

また標識物質としては放射性物質、酵素又は螢
光物質を使用するのが有利である。放射性物質と
しては ¹²⁵I、 ¹³¹I、 ¹⁴C、 ³Hなどを、酵素とし
てはアルカリ性フオスフアターゼ、パーオキシダ
ーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼなど、また螢光
物質としてはフルオレツセインイソチオシアネー
ト、テトラメチルローダミンイソチオシアネート
などを使用することができるが、これらは例示し
たものに限らず、免疫学的測定方法に使用されて
いるものであれば、他のものでも使用できる。

前述したように、本発明の測定試薬及びキツト
に使用される抗体の１つである“α₂−プラスミン
インヒビターにおけるプラスミンの線維素溶解作
用の阻止部位を特異的に認識して結合し得るモノ
クローナル抗体”は、本発明者らによつて初めて
見出され、先に特許出願された（昭和59年４月17
日出願：発明の名称“モノクローナル抗体、ハイ
ブリドーマ細胞及びモノクローナル抗体の製造方
法”特願昭59−75778（特開昭60−222426））。

本発明の前記モノクローナル抗体及びその製造
方法については前記特許出願明細書に詳細に説明
されているが、以下にその内容を簡単に説明す
る。

≪モノクローナル抗体及びその製造方法≫ Ａ 抗原の単離、精製； 抗原に用いるヒトα₂−プラスミンインヒビタ
ーは、前記青木と諸井の方法によりヒト血漿中
より単離精製された。

Ｂ ヒトα₂−プラスミンインヒビターによるマウ
スの免疫； 雄Balb／ｃマウスを用いるが、他の系
（strains）のマウスを使用することもできる。
その際、免疫計画及びヒトα₂−プラスミンイン
ヒビターの濃度は十分な量の抗原刺激を受けた
リンパ球が形成されるよう選ばれるべきであ
る。例えばマウスに少量のヒトα₂−プラスミン
インヒビターで或る間隔で腹腔に数回免疫の
後、さらに数回静脈に投与した。最終免疫の数
日後に融合の為に脾臓細胞を取り出す。

Ｃ 細胞融合 脾臓を無菌的に取り出し、それから単細胞懸
濁液を調製する。それらの脾臓細胞を適当なラ
インからのマウス骨髄腫細胞と適当な融合促進
剤の使用により細胞融合させる。脾臓細胞対骨
髄腫細胞の好ましい比率は約20：１〜約２：１
の範囲である。約10⁸個の脾臓細胞について0.5
〜1.5mlの融合媒体の使用が適当である。

細胞融合に用いる骨髄腫細胞は多く知られて
いるが、本発明では、P3−X63−Ag8−U1細
胞（以下P3−U1と略記する）〔Yelton，D.Eet
al.，Current Topics in Microbiolgy and
Immunology 81、１（1978）参照〕を用いた。
これは８−アザグアニン耐性の細胞ラインであ
り、酵素ヒポキサンチン−グアニンホスホリボ
シルトランスフエラーゼ（hypoxanthine−
guanine phosphoribosyl transferase）が欠失
しており、それゆえにHAT（ヒポキサンチン、
アミノプテリン、チミジン）培地中では生存し
ない。また、この細胞ラインはそれ自体抗体を
分泌しない、いわゆる非分泌型である。

好ましい融合促進剤としては、例えば平均分
子量が1000〜4000のポリエチレングリコールを
有利に使用できるが、この分野で知られている
他の融合促進剤を使用することもできる。

Ｄ 融合した細胞の選択； 別の容器内（例えばマイクロタイタープレー
ト）で未融合の脾臓細胞、未融合の骨髄腫細胞
および融合した細胞の混合物を、未融合の骨髄
腫細胞を支持しない選択培地で希釈し、未融合
の細胞を死滅させるのに十分な時間（約１週
間）培養する。培地は薬物抵抗性（例えば８−
アザグアニン抵抗性）で未融合の骨髄腫細胞を
支持しないもの（例えば前記HAT培地）が使
用される。この選択培地中では未融合の骨髄腫
細胞は死滅する。また未融合の脾臓細胞は非腫
瘍性細胞なのである一定期間後（約１週間後）
死滅する。これらに対して融合した細胞は骨髄
腫の親細胞の腫瘍性と親脾臓細胞の性質をあわ
せ持つために選択培地中で生存できる。

Ｅ 各容器中のα₂−プラスミンインヒビターに対
する抗体の確認； かくしてハイブリドーマが細胞が検出された
後、その培養上清を採取し、ヒトα₂−プラスミ
ンインヒビターに対する抗体について酵素免疫
定量法（Enzyme Linked Immuno Sorbent
Assay）によりスクリーニングする。

Ｆ α₂−プラスミンインヒビターに対する活性を
持つ抗体を産出するハイブリドーマ細胞の選
択； ヒトα₂−プラスミンインヒビターに対する抗
体を産生しているハイブリドーマ細胞を、無血
清培地で培養して得られた抗体を含んだ培養上
澄液を濃縮し、ヒトα₂−プラスミンインヒビタ
ーと共に一定時間インキユベートした。さらに
このα₂−プラスミンインヒビターに対する抗体
の混合液にプラスミンを加え、フイブリンプレ
ート上にのせ、フイブリン溶解面積を測定し
た。このようにして、α₂−プラスミンインヒビ
ターに対する活性を持つ抗体を産生するハイブ
リドーマ細胞を選択する。

Ｇ 目的の抗体を産生するハイブリドーマ細胞の
クローン化； 目的の抗体を産生するハイブリドーマ細胞を
適当な方法（例えば限定希釈法）でクローン化
すると、抗体は２つの異なつた方法で産生され
る。その第１の方法によればハイブリドーマ細
胞を一定時間適当な培地で培養することにより
その培養上清から、そのハイブリドーマ細胞の
産生するモノクローナル抗体を得ることができ
る。第２の方法によればハイブリドーマ細胞は
同質遺伝子又は半同質遺伝子を持つマウスの腹
腔に注射することができる。一定時間後の宿主
動物の血液中及び腹水中より、そのハイブリド
ーマ細胞の産出するモノクローナル抗体を得る
ことができる。

上記の如くして得られたモノクローナル抗体
は、ヒトα₂−プラスミンインヒビターにおけるプ
ラスミンの線維素溶解作用の阻止部位を特異的に
認識し、その部位に選択的に結合する。

本発明の測定試薬においては、かゝるモノクロ
ーナル抗体を第１抗体或いは第２抗体のいずれか
に使用する。すなわち、前記モノクローナル抗体
は、不溶性担体に結合させて固定化抗体として使
用することもできるし、また標識物質を付けて標
識抗体としても使用することもできる。

前記モノクローナル抗体と共に使用される他の
抗体としては、α₂−プラスミンインヒビターにお
ける線維素溶解作用阻止部位以外の部位を認識
し、結合し得るものであればよい。

以上本発明によれば、ヒトα₂−プラスミンイン
ヒビターを含む検体（例えばヒト血漿）中のその
インヒビターの量を正確に且つ容易に測定するこ
とが可能である。

以下実施例を掲げて本発明を詳述する。

実施例 １ 本実施例で使用した第１及び第２抗体は、本発
明者らが先に出願した明細書（昭和59年４月17日
付出願；発明の名称“モノクローナル抗体、ハイ
ブリドーマ細胞及びモノクローナル抗体の製造方
法”特願昭59−75778（特開昭60−222426））に記
載された方法によつて得られた下記のものを使用
した。

第１抗体 前記出願明細書の実施例３において得られた
抗体名“1D10C1”を使用し、これを下記の如
く不溶性担体（マイクロタイタープレート）に
固定化させて用いた。この抗体はα₂−プラスミ
ンインヒビターにおけるプラスミンの線維素溶
解作用の阻止部位（リアクテイブサイト）を特
異的に認識し得るモノクローナル抗体である。

第２抗体 前記出願明細書の実施例３において得られた
抗体名“1B10G11”を使用した。この抗体は
α₂−プラスミンインヒビターにおけるリアクテ
イブサイト以外の部位を特位的に認識するモノ
クローナル抗体であり、アルカリ性フオスフア
ターゼで標識化して使用した。

濃度20μg／mlのヒトα₂−プラスミンインヒビ
ターにおけるリアクテイブサイトを特異的に認識
するモノクローナル抗体（1D10C1）をマイクロ
タイタープレート上に４℃で一晩放置し固定し
た。これに１％牛血清アルブミンを含む緩衝液
（15mM Na₂CO₃、35mM NaHCO₃、3mM
NaN₃）を加え室温で４時間放置した後、１％牛
血清アルブミンを含む洗浄液（20mMリン酸緩衝
液、0.135M NaCl、2mM NaN₃、0.05％
Tween20）で５回洗浄した。次に希釈用溶液
（20mMリン酸緩衝液、0.135M NaCl）で種々の
濃度となるように希釈したα₂−プラスミンインヒ
ビターを加え、室温で４時間放置した。

その後前記洗浄液で５回洗浄し、さらにアルカ
リ性フオスフアターゼで標識したα₂−プラスミン
インヒビターにおけるリアクテイブサイト以外の
部位を認識するモノクローナル抗体（1B10G11）
を329ng／mlの濃度で加え４℃で一晩放置した。
前記洗浄液で洗浄後アルカリ性フオスフアターゼ
基質溶液を１mg／mlの濃度で加え、ELISA
ANALYZER〔東洋測器(株)製ETY−96〕で405nm
の波長における１分間当りの吸光度変化を測定し
た。その結果を添付図面第１図に示した。この図
面からα₂−プラスミンインヒビターの濃度と吸光
度変化との関係は直線関係になることが理解でき
る。従つてα₂−プラスミンインヒビターにおける
リアクテイブサイトを特異的に認識するモノクロ
ーナル抗体をサンドイツチ法における一つの抗体
として使用することによつて、α₂−プラスミンイ
ンヒビターの量を容易に測定することができる。

実施例 ２ 濃度20μｇ／mlのヒトα₂−プラスミンインヒビ
ターにおけるリアクテイブサイトを特異的に認識
するモノクローナル抗体（1D10C1）をマイクロ
タイタープレート上に４℃で一晩放置し固定化し
た。これに１％牛血清アルブミンを含む緩衝液
（15mM Na₂CO₃、35mM NaHCO₃、3mM
NaN₃）を加え、室温で４時間放置した後、１％
牛血清アルブミンを含む洗浄液（20mMリン酸緩
衝液、0.135M NaCl、2mM NaN₃、0.05％
Tween20）で５回洗浄した。次に希釈用溶液
（20mMリン酸緩衝液、0.135示NaCl）で種々の
濃度となるように希釈した検体（ヒト血漿）を加
え、室温で４時間放置した。

その後前記洗浄液で５回洗浄し、さらにアルカ
リ性フオスフアターゼで標識したヒトα₂−プラス
ミンインヒビターにおけるリアクテイブサイト以
外の部位を認識するモノクローナル抗体
（1B10G11）を329nｇ／mlの濃度で加え、４℃で
一晩放置した。前記洗浄液で洗浄後アルカリ性フ
オスフアターゼ基質溶液１mg／mlを加え、前記
ELISA ANALYZERを用いて405nmの波長にお
ける１分間当りの吸光度変化を測定した。その結
果を添付図面第２図に示した。この第２図から検
体（ヒト血漿）の希釈率と吸光度変化とは直線関
係にあることが理解できる。検体600倍希釈標品
の吸光度変化の値が6.2×10^-3であることから、
この検体中のヒトα₂−プラスミンインヒビター濃
度は74.0μｇ／ml（1.1μM）であつた。

【図面の簡単な説明】

第１図及び第２図は、いずれも本発明の実施例
における検体中のヒトα₂−プラスミンインヒビタ
ーの濃度で吸光度変化との関係を示すものであ
る。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ サンドイツチ法による免疫学的測定試薬にお
   いて、不溶性担体に結合した抗体と標識抗体と
   は、ヒトα₂−プラスミンインヒビターのそれぞれ
   異なる抗原決定部位を特異的に認識するものであ
   り且つそのいずれか一方の抗体はヒトα₂−プラス
   ミンインヒビターにおけるプラスミンの線維素溶
   解作用の阻止部位を特異的に認識して結合し得る
   モノクローナル抗体であることを特徴とするヒト
   α₂−プラスミンインヒビターに対するモノクロー
   ナル抗体を用いたヒトα₂−プラスミンインヒビタ
   ーの免疫学的測定試薬。 ２ 該不溶性担体が、プラスチツク容器、プラス
   チツクビーズ、ガラスビーズ又は金属粒子である
   第１項記載の測定試薬。 ２ 該標識抗体が、酵素、放射性同位元素又は螢
   光物質で標識化された抗体である第１項記載の測
   定試薬。 ４ 不溶性担体に結合した抗体と標識抗体を含
   み、これら抗体はヒトα₂−プラスミンインヒビタ
   ーのそれぞれ異なる抗原決定部位を特異的に認識
   するものであり且つそのいずれか一方の抗体はヒ
   トα₂−プラスミンインヒビターにおけるプラスミ
   ンの線維素溶解作用の阻止部位を特異的に認識し
   て結合し得るモノクローナル抗体であり、これに
   (a)溶解剤、(b)洗浄剤及び酵素で標識化した抗体を
   用いる場合には、(c)酵素活性を測定するための基
   質及びその反応停止剤を組合せてなる免疫学的測
   定のためのキツト。