JPH0535826B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 ａ 産業上の利用分野 本発明は、溶液状態にある、さらにはヒト血漿
中のヒトα₂−プラスミンインヒビター（α₂−
plasmin inhibitor、α₂−antiplasmin）を免疫学
的に測定する方法に関する。 ヒトα₂−プラスミンインヒビターのそれぞれ異
なる抗原決定部位を特異的に認識して結合する２
種類のモノクローナル抗体を用い、そのうちの１
種類は、ヒトα₂−プラスミンインヒビターにおけ
るプラスミンの線維素溶解作用の阻止部位を特異
的に認識して結合し得るモノクローナル抗体を用
いるサンドイツチ法によるヒトα₂−プラスミンイ
ンヒビターの免疫学的測定方法に関する。 更に詳しくは、前記いずれか一方の抗体を不溶
性担体に結合せしめ、標識抗体とヒトα₂−プラス
ミンインヒビターを含む試料とを同時に接触させ
ることによるヒトα₂−プラスミンインヒビターの
免疫学的測定方法に関する。 ｂ 従来技術 ヒトのα₂−プラスミンインヒビターは、青木と
諸井によつて最初に単離・精製され、線維素溶解
酵素のプラスミン（plasmin）のエステラーゼ活
性を瞬間的に阻害する強力なプラスミンインヒビ
ターであり、11.7％の糖を含む分子量約67000の
１本鎖の糖蛋白質であることが知られている
〔Moroi＆Aoki；The Journal of Biological
Chemistry、251、5956−5965（1976）参照〕。 一方ヒトのα₂−プラスミンインヒビターには３
種類の活性部位があることが知られている。第１
はプラスミンの線維素溶解作用を阻止する部位
（以下これを“リアクテイブサイド”ということ
がある）〔B.Wiman＆D.Collen；The Journal
of Biological Chemistry、254、9291〜9297
（1979）参照〕であり、第２はカルボキシル基末
端側のプラスミン結合部位〔B.Wiman＆D.
Collen；European Journal of Biochemistry、
84、573−578（1978）参照〕であり、第３はアミ
ノ基末端のフイブリン結合部位である〔Y.
Sakata、et al.、Thrombosis Research、16、
279〜282（1979）参照〕。 ヒトα₂−プラスミンインヒビターは、線維素溶
解機構に対して、特異的に制御と調節を行なつて
おり、その機構に対して重要な作用をしているこ
とが知られている〔例えば、青木延雄、医学のあ
ゆみ、126、147−155（1983）参照〕。 α₂−プラスミンインヒビターの低下の臨床的な
意義は重要であり、例えば、α₂−プラスミンイン
ヒビターが著しく減少すると、生じたプラスミン
活性が制御されず、血管損傷によつて形成された
止血血栓が血管壁の修復以前に溶解されてしま
い、止血がうまくいかなくなることが知られてい
る。 α₂−プラスミンインヒビターが低下する疾患お
よび病態としては、以下のことが知られている。
すなわち、消費による低下としては、汎発性血管
内凝固（DIC）、血栓溶解療法（ウロキナーゼ療
法等）が、また、産生の低下としては、肝実質障
害などがあげられる。特に、非代償期の肝硬変、
激症肝炎などの時には、その血中レベルは、非常
に顕著に低下することが報告されている〔例えば
N.Aoki＆T.Yamanaka、Clin Chimica Acta
84、99−105（1978）参照〕。 従つて、血液中のヒトα₂−プラスミンインヒビ
ターの量を正確且つ簡便に測定することができれ
ば、種々の病気に対しその予防、診断に極めて役
立つと考え得る。 従来知られたヒトα₂−プラスミンインヒビター
の測定方法として第１の方法は、ヒトα₂−プラス
ミンインヒビターに対する抗血清を用いる免疫拡
散法であり、第２の方法は検体試料に一定過剰の
プラスミンを加えヒトα₂−プラスミンインヒビタ
ーと結合していない残存プラスミン活性を測定す
る方法である。 しかし、前者の方法は、動物抗血清を用いるた
めに一定の活性を有する抗血清を安定して得るこ
とが極めて困難であり標準物質によつて活性を補
正して使用しなければならないという煩雑さがあ
つた。また免疫拡散に長時間を要するという欠点
があつた。さらに後者は、加えたプラスミンの残
存量を調べることによりヒトα₂−プラスミンイン
ヒビターの量を間接的に測定する方法であり、検
体試料中に存在する種々のプラスミン活性阻害物
質の影響を受け易く、ヒトα₂−プラスミンインヒ
ビターの量を直接測定していないから誤差を避け
るのは不可能と云つてよく、またこの方法では使
用するプラスミンの純度や安定性にも注意を払う
必要があつた。 ｃ 発明の構成 本発明者らは、ヒトα₂−プラスミンインヒビタ
ーに対するモノクローナル抗体について研究を重
ねたところ、ヒトα₂−プラスミンインヒビターに
おけるプラスミンの線維素溶解作用阻止部位を特
異的に認識し、ヒトα₂−プラスミンインヒビター
の線維素溶解阻止作用を抑制する活性を有するモ
ノクローナル抗体を見出し、またこのモノクロー
ナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞を創作し
得、既に提案した。 また、さらに、サンドイツチ法による免疫学的
測定試薬において、不溶性担体に結合した抗体と
標識抗体とは、ヒトα₂−プラスミンインヒビター
のそれぞれ異なる抗原決定部位を特異的に認識す
るものであり且つそのいずれか一方の抗体は、ヒ
トα₂−プラスミンインヒビターにおけるリアクテ
イブサイト（活性部位）を特異的に認識して結合
し得るモノクローナル抗体であることを特徴とす
るヒトα₂−プラスミンインヒビターに対するモノ
クローナル抗体を用いたヒトα₂−プラスミンイン
ヒビターの免疫学的測定試薬及びキツトに関して
既に提案した。 本発明者は、かゝるサンドイツチ法による免疫
学的測定方法の改良について研究を重ねた結果、
本発明に到達したものである。すなわち、本発明
は不溶性担体に結合した抗体と標識抗体とは、ヒ
トα₂−プラスミンインヒビターのそれぞれ異なる
抗原決定部位を特異的に認識するものであり、且
つそのいずれか一方の抗体は、ヒトα₂−プラスミ
ンインヒビターにおけるプラスミンの線維素溶解
作用の阻止部位を認識し、かつプラスミン結合部
位及びフイブリン結合部位のいずれをも認識しな
いヒトα₂−プラスミンインヒビターの線維素溶解
阻止作用を抑制するモノクローナル抗体であり、
標識抗体とヒト血漿検体とを同時に不溶性担体に
結合した抗体に接触させることを特徴とする、ヒ
ト血漿検体中のα₂−プラスミンインヒビターの測
定方法である。 かくして本発明によれば、試薬の品質差がな
く、恒常的に精度よく溶解状態の（例えば血漿中
の）ヒトα₂−プラスミンインヒビターを簡単に測
定することが可能となる。 また直接ヒトα₂−プラスミンインヒビターを測
定するので、他の挟雑物の影響は全く受けず、正
確に且つ短時間に測定することができる。 次に本発明によるヒトα₂−プラスミンインヒビ
ターの含有量の測定方法を具体的に説明する。 ヒトα₂−プラスミンインヒビターに対するモノ
クローナル抗体（第１抗体）を適当な不溶性担体
（例えばプラスチツク容器）に固定化する（以下
これを“固定化抗体”という）。ついで不溶性担
体と測定しようとする試薬又は検体試料との非特
異的結合を避けるために、適当な物質（例えば牛
血清アルブミン）で不溶性担体の表面を被覆す
る。このようにして得られた第１抗体が固定化さ
れた不溶性担体を、検体試料（例えばヒト血漿）
と適当な標識物質で標識したヒトα₂−プラスミン
インヒビターに対するモノクローナル抗体（第２
抗体）とを同時に、好ましくは両者の混合溶液を
一定時間及び一定温度で接触させ反応させる。つ
いで適当な洗浄液で洗つた後、不溶性担体上に存
在する第２の抗体に標識された標識物質の量を測
定する。かくしてその値から、検体試料中のα₂−
プラスミンインヒビターの量を算出することがで
きる。 かゝる本発明による測定方法（one step法）
は、第１抗体が固定化された不溶性担体を検体試
料と一定時間及び一定温度で反応させ、次いで適
当な洗浄液で洗つた後、標識した第２抗体と反応
させる測定方法（two step法）に比べて、短時
間で且つ簡便に測定し得る利点がある。 本発明の測定試薬に使用される不溶性担体とし
ては、例えば、ポリスチレン、ポリエチレン、ポ
リプロピレン、ポリエステル、ポリアクリルニト
リル、フツ素樹脂、架橋デキストラン、ポリサツ
カライドなどの高分子、その他紙、ガラス、金
属、アガロース及びこれらの組合せなどを例示す
ることができる。 また不溶性担体の形状としては、例えばトレイ
状、球状、繊維状、棒状、盤状、容器状、セル、
試験管などの種々の形状であることができる。 また、標識物質としては、放射性物質、酵素又
は蛍光物質を使用するのが有利である。放射生物
質としては、¹²⁵I、¹³¹I、¹⁴C、³Hなどを、酵素として
はアルカリ性フオスフアターゼ、パーオキシダー
ゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼなど、また蛍光物
質としてはフルオレツセインイソチオシアネー
ト、テトラメチルローダミンイソチオシアネート
などを使用することができるが、これらは例示し
たものに限らず、免疫学的測定方法に使用されて
いるものであれば、他のものでも使用できる。 前述したように、本発明の測定方法に使用され
る抗体の１つである“ヒトα₂−プラスミンインヒ
ビターにおけるプラスミンの線維素溶解作用の阻
止部位を認識し、かつプラスミン結合部位及びフ
イブリン結合部位のいずれをも認識しないヒトα₂
−プラスミンインヒビターの線維素溶解阻止作用
を抑制するモノクローナル抗体”は、本発明者ら
によつて初めて見出され、先に特許出願された
（昭和59年４月17日出願：発明の名称“モノクロ
ーナル抗体及びモノクローナル抗体の製造方法”、
特願昭59−75778号（特開昭60−222426号））。 本発明の前記モノクローナル抗体及びその製造
方法については前記特許出願明細書に詳細に説明
されているが、以下にその内容を簡単に説明す
る。 ≪モノクローナル抗体及びその製造方法≫ Ａ 抗原の単離、精製； 抗原に用いるヒトα₂−プラスミンインヒビタ
ーは、前記青木と諸井の方法によりヒト血漿中
より単離精製された。 Ｂ ヒトα₂−プラスミンインヒビターによるマウ
スの免疫； 雄Balb／ｃマウスを用いるが、他の系
（strains）のマウスを使用することもできる。
その際、免疫計画及びヒトα₂−プラスミンイン
ヒビターの濃度は十分な量の抗原刺激を受けた
リンパ球が形成されるよう選ばれるべきであ
る。例えばマウスに少量のヒトα₂−プラスミン
インヒビターで或る間隔で腹腔に数回免疫の
後、さらに数回静脈に投与した。最終免疫の数
日後に融合の為に脾臓細胞を取り出す。 Ｃ 細胞融合 脾臓を無菌的に取り出し、それから単細胞懸
濁液を調製する。それらの脾臓細胞を適当なラ
インからのマウス骨髄腫細胞と適当な融合促進
剤の使用により細胞融合させる。脾臓細胞対骨
髄腫細胞の好ましい比率は約20：１〜約２：１
の範囲である。約10⁸個の脾臓細胞について0.5
〜1.5mlの融合媒体の使用が適当である。 細胞融合に用いる骨髄腫細胞は多く知られて
いるが、本発明では、P3−X63−Ag8−U1細
胞（以下P3−U1と略記する）〔Yelton、D.E
et al.、Current Topics in Microbiology
and lmmunology 81、１（1978）参照〕を用い
た。これは８−アザグアニン耐性の細胞ライン
であり、酵素ヒポキサンチン−グアニンホスホ
リボシルトランスフエラーゼ（hypoxanthine
−guanine phosphoribosyl transferase）が欠
失しており、それゆえにHAT（ヒポキサンチ
ン、アミノブテリン、チミジン）培地中では生
存しない。また、この細胞ラインはそれ自体抗
体を分泌しない、いわゆる非分泌型である。 好ましい融合促進剤としては、例えば平均分
子量が1000〜4000のポリエチレングリコールを
有利に使用できるが、この分野で知られている
他の融合促進剤を使用することもできる。 Ｄ 融合した細胞の選択； 別の容器内（例えばマイクロタイタープレー
ト）で未融合の脾臓細胞、未融合の骨髄腫細胞
および融合した細胞の混合物を、未融合の骨髄
腫細胞を支持しない選択培地で希釈し、未融合
の細胞を死滅させるのに十分な時間（約１週
間）培養する。培地は薬物抵抗性（例えば８−
アザグアニン抵抗性）で未融合の骨髄腫細胞を
支持しないもの（例えば前記HAT培地）が使
用される。この選択培地中では未融合の骨髄腫
細胞は死滅する。また未融合の脾臓細胞は非腫
瘍性細胞なのである一定期間後（約１週間後）
死滅する。これらに対して融合した細胞は骨髄
腫の親細胞の腫瘍性と親脾臓細胞の性質をあわ
せ持つために選択培地中で生存できる。 Ｅ 各容器中のα₂−プラスミンインヒビターに対
する抗体の確認； かくしてハイブリドーマが細胞が検出された
後、その培養上清を採取し、ヒトα₂−プラスミ
ンインヒビターに対する抗体について酵素免疫
定量法（Enzyme Linked Immuno Sorbent
Assay）によりスクリーニングする。 Ｆ α₂−プラスミンインヒビターに対する活性を
持つ抗体を産出するハイブリドーマ細胞の選
択； ヒトα₂−プラスミンインヒビターに対する抗
体を産生しているハイブリドーマ細胞を、無血
清培地で培養して得られた抗体を含んだ培養上
澄液を濃縮し、ヒトα₂−プラスミンインヒビタ
ーと共に一定時間インキユベートした。さらに
このα₂−プラスミンインヒビターに対する抗体
の混合液にプラスミンを加え、フイブリンプレ
ート上にのせ、フイブリン溶解面積を測定し
た。このようにして、α₂−プラスミンインヒビ
ターに対する活性を持つ抗体を産生するハイブ
リドーマ細胞を選択する。 Ｇ 目的の抗体を産生するハイブリドーマ細胞の
クローン化； 目的の抗体を産生するハイブリドーマ細胞を
適当な方法（例えば限定希釈法）でクローン化
すると、抗体は２つの異なつた方法で産生され
る。その第１の方法によればハイブリドーマ細
胞一定時間適当な培地で培養することによりそ
の培養上澄から、そのハイブリドーマ細胞の産
生するモノクローナル抗体を得ることができ
る。第２の方法によればハイブリドーマ細胞は
同質遺伝子又は半同質遺伝子を持つマウスの腹
腔に注射することができる。一定時間後の宿主
動物の血液中及び腹水中より、そのハイブリド
ーマ細胞の産出するモノクローナル抗体を得る
ことができる。 上記の如くして得られたモノクローナル抗体
は、ヒトα₂−プラスミンインヒビターにおけるプ
ラスミンの線維素溶解作用の阻止部位を特異的に
認識し、その部位に選択的に結合する。 本発明の測定試薬においては、かゝるモノクロ
ーナル抗体を第１抗体或いは第２抗体のいずれか
に使用する。すなわち、前記モノクローナル抗体
は、不溶性担体に結合させて固定化抗体として使
用することもできるし、また標識物質を付けて標
識抗体としても使用することもできる。 前記モノクローナル抗体と共に使用される他の
抗体としては、α₂−プラスミンインヒビターにお
ける線維素溶解作用阻止部位以外の部位を認識
し、結合し得るものであればよい。 以上本発明によれば、ヒトα₂−プラスミンイン
ヒビターを含む検体（例えばヒト血漿）中のその
インヒビターの量を正確に且つ容易に測定するこ
とが可能である。 以下実施例を掲げて本発明を詳述する。 実施例 １ 本実施例で使用した第１及び第２抗体は、本発
明者らが先に特許出願された（昭和59年４月17日
出願：発明の名称“モノクローナル抗体及びモノ
クローナル抗体の製造方法”、特願昭59−75778号
（特開昭60−222426号））に記載された方法によつ
て得られた下記のものを使用した。 第１抗体 前記出願明細書の実施例３において得られた抗
体名“1D10C1”を使用し、これを下記の如く不
溶性担体（マイクロタイタープレート）に固定化
させて用いた。この抗体はα₂−プラスミンインヒ
ビターにおけるプラスミンの線維素溶解作用の阻
止部位（リアクテイブサイト）を特異的に認識し
得るモノクローナル抗体である。 第２抗体 前記出願明細書の実施例３において得られた抗
体名“1B10G11”を使用した。この抗体はα₂−
プラスミンインヒビターにおけるリアクテイブサ
イト以外の部位を特異的に認識するモノクローナ
ル抗体であり、アルカリ性フオスフアターゼで標
識化して使用した。 濃度20μｇ／mlのヒトα₂−プラスミンインヒビ
ターにおけるリアクテイブサイトを特異的に認識
するモノクローナル抗体（1D10C1）をマイクロ
タイタープレート上に４℃で一晩放置し、固定化
した。これに0.5％牛血清アルブミンを含むリン
酸緩衝食塩水（以下0.5％BSA−PBSと略する）
を加え、室温で２時間放置後、0.5％BSA−PBS
で３回洗浄した。次にリン酸緩衝食塩水（PBS）
で希釈したヒト血漿と、濃度329nｇ／mlのアル
カリ性フオスフアターゼ標識したモノクローナル
抗体（1B10G11）を混合した溶液を加え、室温
で２時間反応した。0.5％BSA−PBSで洗浄後、
アルカリ性フオスフアターゼ基質溶液を1.0mg／
mlの濃度で加え、20分間室温で反応後、
MICROPLATEPHOTOMETERで波長405nｍ
における吸光度を測定した。精製α₂−プラスミン
インヒビター標品を用いて検量線を作成し、その
検量線から、患者血漿検体中のα₂−プラスミンイ
ンヒビター量（μｇ／ml）を算出した。添付図面
に検量線を示し、患者血漿検体中のα₂−プラスミ
ンインヒビター量を下記表にまとめて示す。 α₂−プラスミンインヒビター（α₂−PI）の濃
度と吸光度との関係は直線性があり、この測定法
によれば血漿中のα₂−プラスミンインヒビター量
を正確に測定することができる。 【表】 【表】 【表】

【図面の簡単な説明】

添付図面は、検体中のヒトα₂−プラスミンイン
ヒビターの濃度と吸光度との関係を示すものであ
る。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ サンドイツチ法による免疫学的測定方法にお
   いて、不溶性担体に結合した抗体と標識抗体と
   は、ヒトα₂−プラスミンインヒビターのそれぞれ
   異なる抗原決定部位を特異的に認識するものであ
   り、且つそのいずれか一方の抗体は、ヒトα₂−プ
   ラスミンインヒビターにおけるプラスミンの線維
   素溶解作用の阻止部位を認識し、かつプラスミン
   結合部位及びフイブリン結合部位のいずれをも認
   識しないヒトα₂−プラスミンインヒビターの線維
   素溶解阻止作用を抑制するモノクローナル抗体で
   あり、標識抗体とヒト血漿検体とを、不溶性担体
   に結合した抗体に同時に接触させることを特徴と
   する、ヒト血漿検体中のα₂−プラスミンインヒビ
   ターの測定方法。 ２ 該標識抗体が、酵素、放射性同位元素又は蛍
   光物質で標識化された抗体である特許請求の範囲
   第１項記載のヒトα₂−プラスミンインヒビターの
   測定方法。