JPH0344760B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

ａ 産業上の利用分野 本発明はヒトα₂−プラスミンインヒビター（α₂
−plasmin inhibitor；α₂−antiplasmin）に対す
るモノクローナル抗体、特にヒトα₂−プラスミン
インヒビターの線維素溶解作用阻害部位
（reactive site）を抗原として認識し、その結果
ヒトα₂−プラスミンインヒビターのプラスミンの
線維素溶解作用に対する阻害活性を抑制し、線溶
促進させる働きを有するモノクローナル抗体、及
び該モノクローナル抗体の製造方法に関するもの
である。 ｂ 従来技術 ヒトのα₂−プラスミンインヒビターは、青木と
諸井によつて最初に単離・精製され、線維素溶解
酵素のプラスミン（plasmin）のエステラーゼ活
性を瞬間的に阻害する強力なプラスミンインヒビ
ターであり、11.7％の糖を含む分子量約67000の
１本鎖の糖蛋白質であることが知られている
〔Moroi＆Aoki；The Journal of Biological
Chemistry、251、5956−5965（1976）参照〕。 一方ヒトのα₂−プラスミンインヒビターには３
種類の活性部位があることが知られている。第１
はプラスミンの線維素溶解作用阻害部位（以下こ
れを“リアクテイブサイト”ということがある）
〔B.Wiman＆D.Collen；The Journal of
Biological Chemistry、254、9291−9297（1979）
参照〕であり、第２はカルボキシル基末端側のプ
ラスミン結合部位〔B.Wiman＆D.Collen；
European Journal of Biochemistry、84、573
−578（1978）参照〕であり、第３はアミノ基末端
のフイブリン結合部位である〔Y.Sakata、et
al.、Thrombosis Research、16、279−282
（1979）参照〕。 ヒトα₂−プラスミンインヒビターにおけるこれ
ら３種類の活性部位のうち、リアクテイブサイト
を抗原として選択的に認識するモノクローナル抗
体を提供できれば、これを使用することによつて
ヒトα₂−プラスミンインヒビターの線維素溶解阻
害作用を直接抑え、線溶を促進することができる
ので血栓溶解促進剤として利用することができ
る。また、この抗体を用いることにより、溶液中
のα₂−プラスミンインヒビターあるいはα₂−プラ
スミンインヒビター・プラスミン複合体を測定す
ることも可能である。 ｃ 本発明の構成 本発明によれば、ヒトα₂−プラスミンインヒビ
ターに対するモノクローナル抗体であつて、ヒト
α₂−プラスミンインヒビターにおけるプラスミン
の線維素溶解作用の阻止部位を認識し、かつプラ
スミン結合部位及びフイブリン結合部位のいずれ
をも認識しないヒトα₂−プラスミンインヒビター
の線維素溶解阻止作用を抑制するモノクローナル
抗体および該抗体を産生するハイブリドーマ細胞
を培養して、該培養液中から、該抗体を分離する
ことを特徴とするヒトα₂−プラスミンインヒビタ
ーに対するモノクローナル抗体の製造方法が提供
される。 本発明の抗体を産生するハイブリドーマ細胞
は、ケーラーとミルシユタインの方法〔Ko¨hler
and Milstein、Nature256、495〜497（1975）〕と
して知られた手法によつて産生される。すなわ
ち、ヒトα₂−プラスミンインヒビターでマウスを
免疫した後、このマウスの脾臓細胞をマウスミエ
ローマ細胞と融合させ、得られたハイブリドーマ
細胞は、マイクロタイタープレート（microtiter
plates）に固定されたヒトα₂−プラスミンインヒ
ビターと反応する抗体に対し系統的に検査し選択
される。このようにしてヒトα₂−プラスミンイン
ヒビターに対する抗体を合成し、分泌するハイブ
リドーマ細胞を選別する。得られたハイブリドー
マ細胞を無血清培地中で培養し、その培養上清中
に分泌されたヒトα₂−プラスミンインヒビターに
対する抗体は、フイブリンプレート（fibrin
plates）上でヒトα₂−プラスミンインヒビターの
線維素溶解阻害作用を抑える活性について検査を
行なう。その結果、ヒトα₂−プラスミンインヒビ
ターにおけるプラスミンの線維素溶解作用の阻止
部位を認識し、かつプラスミン結合部位及びフイ
ブリン結合部位のいずれをも認識しないヒトα₂−
プラスミンインヒビターの線維素溶解阻止作用を
抑制するモノクローナル抗体を産生するハイブリ
ドーマ細胞が単離された。 本発明のモノクローナル抗体は、かゝるハイブ
リドーマ細胞が産生する産出物から得られる。か
くして得られたモノクローナル抗体は、ヒトα₂−
プラスミンインヒビターのリアクテイブサイトに
対して単一特異的（monospecific）に作用する。 次に本発明の抗体を産生するハイブリドーマ細
胞を産生する具体的方法について詳細に説明す
る。 Ａ 抗原の単離、精製； 抗原に用いるヒトα₂−プラスミンインヒビタ
ーは前記青木と諸井の方法によりヒト血漿中よ
り単離精製された。 Ｂ ヒトα₂−プラスミンインヒビターによるマウ
スの免疫； 雄Balb／ｃマウスを用いるが、他の系
（strains）のマウスを使用することもできる。
その際、免疫計画及びヒトα₂−プラスミンイン
ヒビターの濃度は十分な量の抗原刺激を受けた
リンパ球が形成されるよう選ばれるべきであ
る。例えばマウスに少量のα₂−プラスミンイン
ヒビターで或る間隔で腹腔に数回免疫の後、さ
らに数回静脈に投与した。最終免疫の数日後に
融合の為に脾臓細胞を取り出す。 Ｃ 細胞融合； 脾臓を無菌的に取り出し、それから単細胞懸
濁液を調製する。それらの脾臓細胞を適当なラ
インからのマウス骨髄腫細胞と適当な融合促進
剤の使用により細胞融合させる。脾臓細胞対骨
髄腫細胞の好ましい比率は約20：１〜約２：１
の範囲である。約10⁸個の脾臓細胞について0.5
〜1.5mlの融合媒体の使用が適当である。 細胞融合に用いる骨髄腫細胞は多く知られて
いるが、本発明ではP3−X63−Ag8−U1細胞
（以下P3−U1と略記する）〔Yelton、D.E.et
al.、Current Topics in Microbiology and
Immunology、81、１（1978）参照〕を用いた。
これは、８−アザグアニン耐性の細胞ラインで
あり、酵素ヒポキサンチン−グアニンホスホリ
ボシルトランスフエラーゼ（hypoxanthine−
guanine phosphoribosyl transferase）が欠失
しており、それゆえにHAT（ヒポキサンチン、
アミノプテリン、チミジン）培地中では生存し
ない。また、この細胞ラインは、それ自体抗体
を分泌しない、いわゆる非分泌型である。 好ましい融合促進剤としては例えば平均分子
量が1000〜4000のポリエチレングリコールを有
利に使用できるが、この分野で知られている他
の融合促進剤を使用することもできる。本発明
の実施例では平均分子量1540のポリエチレング
リコールを用いた。 Ｄ 融合した細胞の選択； 別の容器内（例えばマイクロタイタープレー
ト）で未融合の脾臓細胞、未融合の骨髄腫細胞
および融合した細胞の混合物を、未融合の骨髄
腫細胞を支持しない選択培地で希釈し、未融合
の細胞を死滅させるのに十分な時間（約１週
間）培養する。培地は薬物抵抗性（例えば８−
アザグアニン抵抗性）で未融合の骨髄腫細胞を
支持しないもの（例えば前記HAT培地）が使
用される。この選択培地中では未融合の骨髄腫
細胞は死滅する。この未融合の脾臓細胞は非腫
瘍性細胞なのである一定期間後（約１週間後）
死滅する。これらに対して融合した細胞は骨髄
腫の親細胞の腫瘍性と親脾臓細胞の性質をあわ
せ持つために選択培地中で生存できる。 Ｅ 各容器中のヒトα₂−プラスミンインヒビター
に対する抗体の確認； かくしてハイブリドーマ細胞が検出された
後、その培養上清を採取し、ヒトα₂−プラスミ
ンインヒビターに対する抗体について酵素免疫
定量法（Enzyme Linked Immuno Sorbent
Assay）によりスクリーニングする。 Ｆ ヒトα₂−プラスミンインヒビターに対する活
性を持つ抗体を産生するハイブリドーマ細胞の
選択； ヒトα₂−プラスミンインヒビターに対する抗
体を産生しているハイブリドーマ細胞を、無血
清培地で培養して得られた、抗体を含んだ培養
上澄液を濃縮し、ヒトα₂−プラスミンインヒビ
ターと共に一定時間インキユベートした。さら
にこのヒトα₂−プラスミンインヒビター混合液
にプラスミンを加え、フイブリンプレート上に
のせ、フイブリン溶解面積を測定した。このよ
うにして、ヒトα₂−プラスミンインヒビターに
対する活性を持つ抗体を産生するハイブリドー
マ細胞を選択する。 Ｇ 目的の抗体を産生するハイブリドーマ細胞の
クローン化； 目的の抗体を産生するハイブリドーマ細胞を
適当な方法（例えば限定希釈法）でクローン化
すると、抗体は２つの異なつた方法で産生され
る。その第１の方法によればハイブリドーマ細
胞を一定時間適当な培地で培養することによ
り、その培養上清からそのハイブリドーマ細胞
の産生するモノクローナル抗体を得ることがで
きる。第２の方法によればハイブリドーマ細胞
は同質遺伝子又は半同遺伝子を持つマウスの腹
腔に注射することができる。一定時間後の宿主
動物の血液中及び腹水中より、そのハイブリド
ーマ細胞の産生するモノクローナル抗体を得る
ことができる。 以下実施例を掲げ本発明を詳細に説明する。 実施例 １ (1) ヒトα₂−プラスミンインヒビターの調製 前記、青木及び諸井の方法に従い、ヒト血漿
2360mlからヒトα₂−プラスミンインヒビター
7.7mgを得た。 (2) マウスの免疫 雄のBalb／ｃマウスをヒトα₂−プラスミン
インヒビター100μｇと完全なフロイントのア
ジユバント（Complete Freund′s adjuvant）
とのエマルジヨン（emulsion）で21日間の間
隔をおいて２回腹腔に免疫した。さらに７日後
及び88日後にヒトα₂−プラスミンインヒビター
30μｇを生理食塩水とともに静脈に追加投与し
た。最終免疫の４日後にその脾臓細胞を細胞融
合のために用いた。 (3) 脾臓細胞の懸濁液の調製 脾臓を無菌的に取り出し、ステンレス製メツ
シユを通過させることにより単細胞懸濁液が得
られた。細胞をＬ−グルタミン0.39ｇ／、硫
酸カナマイシン0.2ｇ／及びNaHCO₃2.0ｇ／
を補充したRPMI−1640培地（GIBCO製）
に移した。増殖した細胞をRPMI−1640で３回
洗浄しRPMI−1640培地に再懸濁させた。 (4) 骨髄腫細胞の調製 マウス骨髄腫細胞P3−U1は、Ｌ−グルタミ
ン0.39ｇ／、硫酸カナマイシン0.2ｇ／、
NaHCO₃2.0ｇ／及び10％のウシ胎児血清で
補充されたRPMI−1640培地（10％FCS−
RPMI−1640と略記する）中で培養した。骨髄
腫細胞は細胞融合の時点に細胞分裂の対数期に
あつた。 (5) 細胞融合 脾臓細胞と骨髄腫細胞とを10：１の比率で無
血清RPMI−1640培地中に懸濁し、５分間約
200ｇで遠心分離した。上澄液培地を除去した
後、沈降物を平均分子量1540の50％ポリエテレ
ングリコール溶液（PH8.2）１mlと共に２分間
37℃でインキユベーシヨンした。次いで無血清
RPMI−1640培地９mlを加え、細胞を５分間注
意深く再懸濁した。次いでこの懸濁液を５分間
約200ｇで遠心分離し、その後８×10⁶細胞／ml
の濃度が得られるように10％FCS−RPMI−
1640培地に再懸濁し、次いで96マイクロウエル
プレート上に分配した（ウエル１個につき約
100μ）。この融合細胞は37℃において５％
CO₂を使用して培養した。 (6) ヒトα₂−プラスミンインヒビターに対する抗
体産生ハイブリドーマ細胞の選択及び培養 細胞融合の１日後にHAT培地をウエル１個
につき100μを加えた。以後２日間隔で半分
量の培地を新たなHAT培地と交換して培養し
た。８日後、ハイブリドーマ細胞の培養上澄液
中のヒトα₂−プラスミンインヒビターに対する
抗体について酵素免疫定量法によりスクリーニ
ングをおこなつた。スクリーニングに用いられ
た抗原はヒトα₂−プラスミンインヒビター、第
２抗体はアルカリフオスフアターゼ（alkali
phosphatase）標識付のウサギ抗マウス抗体で
あつた。 総数349個のウエルの全てが酵素免疫定量法
により陽性であり、α₂−プラスミンインヒビタ
ーに対する抗体を産生しているという結果が得
られた。 細胞の増殖が活発になつたと観察されたと
き、HT培地を加えた。１日間隔で計４回HT
培地を用いて培地交換をおこない、その後は通
常の10％FCS−RPMI−1640培地を用いて培養
した。 実施例 ２ （ヒトα₂−プラスミンインヒビターに対する抗
体を産生するハイブリドーマ細胞の選択） 上記ヒトα₂−プラスミンインヒビターに対する
抗体を産生しているハイブリドーマ細胞中からヒ
トα₂−プラスミンインヒビターの線維素溶解阻害
活性を抑える働きを持つた抗体を産生するハイブ
リドーマ細胞を次の方法でスクリーニングした。 各ウエルのハイブリドーマを10％FCS−RPMI
−1640培地中で培養し、細胞数を約２×10⁷個と
した。この細胞を５分間約200ｇで遠心分離し、
培養上澄液を除去した後、細胞を無血清RPMI−
1640培地10mlで洗浄した。さらに５分間約200ｇ
で遠心分離し、上澄液を除去し、細胞を２−メル
カプトエタノール5.0ml／、インシユリン7.5
ml／、トランスウエリン5.0ml／、エタノー
ルアミン5.0ml／、ナトリウムセレナイト5.0
ml／、Ｌ−グルタミン0.39ｇ／、硫酸カナマ
イシン0.2ｇ／、Hepes2.38ｇ／及び
NaHCO₃1.5ｇ／で補充されたRPMI−1640：
Dulbecco′sMEM：Ham′sF−12（２：１：１）の
混合無血清培地（以下これを“MITES培地”と
略記する）10mlに懸濁し、３日間培養した。 培養上澄液を回収し、これを25倍に濃縮した。
この濃縮液を25μにヒトα₂−プラスミンインヒ
ビター0.4μｇを加え、37℃で30分間インキユベー
シヨンした。次いでプラスミノーゲン0.025ユニ
ツト及びウロキナーゼ0.031ユニツトを加え液量
を40μとした。このうち10μをフイブリンプ
レートにのせた。フイブリンプレートは、37℃、
湿度95％以上の条件下で18時間静置し溶解した面
積を測定した。 その結果、1D10ハイブリドーマ細胞の産生す
る抗体に加えたヒトα₂−プラスミンインヒビター
の線維素溶解阻害活性を完全に抑える働きが見出
された。 実施例 ３ ハイブリドーマ細胞のクローニング； ヒトα₂−プラスミンインヒビターに対する抗体
の活性試験において陽性の結果を示したハイブリ
ドーマ細胞（1D10）を次の方法でクローン化し
た。 1D10細胞を96ウエルマイクロタイタープレー
トの１ウエルあたり0.9細胞となるよう希釈し、
Balb／ｃマウス胸線細胞をフイーダー細飽とし
て加えプレートに分配し10％FCS−RPMI−1640
培地で培養した。顕微鏡下で観察し、確実にシン
グルセルコロニーであることを認めた。ハイブリ
ドーマ細胞の培養上澄液中のヒトα₂−プラスミン
インヒビターに対する抗体につき酵素免疫定量法
によりスクリーニングをおこなつた。 総数26個のウエルが酵素免疫定量法により陽性
でありヒトα₂−プラスミンインヒビターに対する
モノクローナル抗体を産生していた。 モノクローナル抗体の精製； 大量のヒトα₂−プラスミンインヒビターに対す
るモノクローナル抗体を産生させるために、約
10⁷個のハイブリドーマ細胞をプリスタンで前処
理したBalb／ｃマウスに腹腔内注射した。約１
週間後採取された腹水液よりEyらの方法〔P.L.
Ey.S.J.Prowse and C.R.Jenkin、
Immunochemistry、15、429−436（1978）参照〕
に従いプロテインＡ−セフアロース4B（proteinA
−Sepharose4B）カラムを用いて抗体を精製し
た。腹水液2.5mlよりヒトα₂−プラスミンインヒ
ビターに対するモノクローナル抗体20mgを得た。 精製したモノクローナル抗体の特徴； 精製したモノクローナル抗体の特定のクラス
を、クラス特異性抗マウス抗血清を使用してオク
タロニーゲル拡散試験で決定した。その結果を下
記表１に示した。ここで抗体名1D10C1、
1D10F10、1D10−1F5、1D10B11および1D10−
2H8は、1D10ハイブリドーマ細胞からクローニ
ングして得られたモノクローナル抗体である。ま
た抗体名1B10C4および1B10G11は、実施例１で
得られたハイブリドーマ細胞の１つである1B10
ハイブリドーマ細胞からクローニングして得られ
たモノクローナル抗体である。ヒトα₂−プラスミ
ンインヒビターに対する抗体は、その多くがＨ鎖
r₁、Ｌ鎖Ｋであつた。

【表】 実施例 ４ ヒトα₂−プラスミンインヒビターに対する抗体
によるヒトα₂−プラスミンインヒビター活性の
抑制 ヒトα₂−プラスミンインヒビター1μｇと各モ
ノクローナル抗体5μｇを0.05Mリン酸緩衝生理食
塩水（以下PBSと略す）50μに溶解させ、37℃
で30分間インキユベーシヨンした。次いでプラス
ミノーゲン0.025ユニツト及びウロキナーゼ0.031
ユニツトを加え液量を60μとした。このうち
10μをフイブリンプレートにのせた。フイブリ
ンプレートは37℃、湿度95％以上の条件下で18時
間静置し、溶解した面積を測定した。その結果を
下記表２に示した。なお下記表の値は、プラスミ
ノーゲン0.025ユニツトとウロキナーゼ0.031ユニ
ツトによる溶解面積を100％とした時の相対値で
ある。ここで、抗体名1D10−1H2は、1D10ハイ
ブリドーマ細胞からクローニングして得られたモ
ノクローナル抗体である。

【表】 実施例 ５ ヒトα₂−プラスミンインヒビターとフイブリン
の結合に及ぼすヒトα₂−プラスミンインヒビタ
ーに対するモノクローナル抗体の効果 I¹²⁵標識したヒトα₂−プラスミンインヒビター
0.01μMとα₂−プラスミンインヒビターに対する
モノクローナル抗体0.05μMを２％牛血清アルブ
ミン−0.05Mトリス緩衝液（PH7.4）−0.15M
NaClを加えて、37℃で30分間インキユベーシヨ
ン後、４℃で一晩放置した。この抗原−抗体反応
混液に、265ｍMCaCl₂、7μMフイブリノーゲン
画分、２ユニツト／mlトロンビンを加え、全量で
100μとし37℃で30分間インキユベーシヨンし
た。凝固物（フイブリン塊）の形成が認められ
た。30分後に200ｍＭ EDTAを100μ加え、カ
ルシウムイオンを除いた後、竹串でこの凝固物を
巻き取つた。竹串に巻き取つた凝固物は５分間、
３回洗浄液〔２％BSA、0.05Mトリス緩衝液（PH
7.4）、0.15M NaCl、２ｍＭ EDTA〕で洗つ
た。最後に凝固物を竹串から試験管に回収し、凝
固物の放射活性（cpm）を測定した。元の反応混
液中の放射活性に対する凝固物の放射活性の割合
を表３に示す。 なお表３中に通常の市販のマウスIgGを比較抗
体として使用した結果を併せて示した。

【表】 この結果から各ヒトα₂−プラスミンインヒビタ
ーに対するモノクローナル抗体はヒトα₂−プラス
ミンインヒビターのフイブリン結合部位を認識し
ていないモノクローナル抗体であることがわか
る。 実施例 ６ （ヒトα₂−プラスミンインヒビターのリアクテ
イブサイトを認識するモノクローナル抗体の検
索） 本実施例はヒトα₂−プラスミンインヒビターに
よるプラスミンの不活性化に及ぼすα₂−プラスミ
ンインヒビターに対するモノクローナル抗体の効
果を調べたものである。 α₂−プラスミンインヒビター0.15μMとα₂−プ
ラスミンインヒビターに対するモノクローナル抗
体0.75μMを２％牛血清アルブミン溶液〔0.05M
トリス緩衝液（PH7.4）、0.15M NaCl〕中で37℃、
30分間インキユベーシヨンし、４℃で一晩放置し
た。 この反応混液60μとプラスミン溶液
（0.47μM）20μを混ぜ、0.05Mトリス緩衝液
（PH7.4）、0.15M NaClを加えて全量を500μと
したものを各サンプルについて２本ずつ用意し、
37℃２分又は20分間インキユベーシヨンした。次
に3.5ｍＭ合成基質Ｓ−2251（Ｈ−Ｄ−バリル−Ｌ
−ロイシル−Ｌ−リジル−ｐ−ニトロアニリド・
二塩酸塩）を200μ加え、分光光度計
（Beckman、DU−８）によつて単位時間当りの
405nｍの波長における吸光度の変化を測定した。
対照としてプラスミンのみを反応させた試料とモ
ノクローナル抗体を加えずにヒトα₂−プラスミン
インヒビターとプラスミンを反応させた試料につ
いても同様に吸光度の変化を調べた。その結果を
下記表４に示した。

【表】

【表】 以上実施例５及び６の結果から本発明のモノク
ローナル抗体はヒトα₂−プラスミンインヒビター
のリアクテイブサイトを特異的に認識し、プラス
ミン結合部位及びフイブリン結合部位のいずれを
も認識していないことがわかつた。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ ヒトα₂−プラスミンインヒビターに対するモ
   ノクローナル抗体であつて、ヒトα₂−プラスミン
   インヒビターにおけるプラスミンの線維素溶解作
   用の阻止部位を認識し、かつプラスミン結合部位
   及びフイブリン結合部位のいずれをも認識しない
   ヒトα₂−プラスミンインヒビターの線維素溶解阻
   止作用を抑制するモノクローナル抗体。 ２ 1D10ハイブリドーマ細胞から得られる第１
   項記載のモノクローナル抗体。 ３ ヒトα₂−プラスミンインヒビターで免疫され
   たマウスから得られた脾臓細胞と、マウスミエロ
   ーマ細胞とを融合させ、ヒトα₂−プラスミンイン
   ヒビターにおけるプラスミンの線維素溶解作用の
   阻止部位を認識し、かつプラスミン結合部位及び
   フイブリン結合部位のいずれをも認識しないヒト
   α₂−プラスミンインヒビターの線維素溶解阻止作
   用を抑制するモノクローナル抗体を産生するハイ
   ブリドーマ細胞を取得し、該ハイブリドーマ細胞
   を培養して、該培養液中から、該抗体を分離する
   ことを特徴とするヒトα₂−プラスミンインヒビタ
   ーに対するモノクローナル抗体の製造方法。 ４ 1D10ハイブリドーマ細胞を用いる第３項記
   載の製造方法。