JP5059600B2 - 扁平上皮細胞癌関連抗原を指標とする皮膚性状の評価方法 - Google Patents

Description

本発明は、細胞の扁平上皮細胞癌関連抗原（Ｓｑｕａｍｏｓ Ｃｅｌｌ Ｃａｒｃｉｎｏｍａ Ａｎｔｉｇｅｎ、以下「ＳＣＣＡ」と称す）を指標とした、皮膚状態の評価方法を提供する。

皮膚が正常の角化を行うと角質細胞で核が消滅する「脱核」という現象が生ずる。表皮角化細胞は基底層で増殖し、上層に移行して成熟し角層となる。しかしながら、例えば乾癬やアトピー皮膚炎といった皮膚病に罹り、正常な角化が行われない肌荒れした皮膚においては、角質細胞に核が未消化のまま残り、角質細胞が核を有した未熟な状態で角層中に存在することがあり、これを「不全角化」という。不全角化の現象は古くから知られているものの、不全角化が生じるメカニズムや生化学的な指標については知られていない。
扁平上皮細胞癌関連抗原（ＳＣＣＡ）は扁平上皮癌細胞から抽出される抗原であり、子宮頚部、肺、食道、皮膚の扁平上皮細胞癌で高い血中濃度を示し、扁平上皮細胞癌の診断によく利用されている（Ｈ．Ｋａｔｏ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ ４０：１６２１−１６２８（１９７７）；Ｎ．Ｍｉｎｏ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ ６２：７３０−７３４（１９８８））。特に、ＳＣＣＡの血中レベルは扁平上皮細胞癌の進行段階、悪性度、腫瘍の大きさなどに良好に相関するため、癌の早期発見のみならず、癌治療効果の評価や再発のおそれの診断などにおいて特に有効な癌マーカーである。
ＳＣＣＡはまた、乾癬表皮の上層において発現の亢進が認められることでも知られる（Ｔａｋｅｄａ Ａ．ら、Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．（２００２）１１８（１），１４７−１５４）。乾癬は皮膚病の一つであり、表皮細胞の増殖・分化異常と炎症細胞浸潤を特徴とする慢性、再発性の炎症性不全角化症である乾癬がある。乾癬は遺伝的素因に種々の環境因子が加わって発症すると考えられる（Ｈｏｐｓｏ−Ｈａｖｕ ｅｔ ａｌ．Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ（１９８３）１０９，７７−８５）。
ＳＣＣＡは染色体１８ｑ２１．３上にタンデムに並んでいる二つの遺伝子ＳＣＣＡ−１及びＳＣＣＡ−２遺伝子によりコードされる。それらによりコードされるタンパク質、ＳＣＣＡ−１及びＳＣＣＡ−２は共に分子量約４５０００のタンパクであり、高い相同性を示し、そのホモロジーは核酸レベルで９５％である。これらのＳＣＣＡはｏｖａｌｂｕｍｉｎ−ｓｅｒｉｎｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（ｏｖ−ｓｅｒｐｉｎ）ファミリーに属している。ｏｖ−ｓｅｒｐｉｎはセルピンス−パーファミリーの中でもユニークな特徴を有している。一般にセルピンは分泌されて細胞外で働くとされているが、ｏｖ−ｓｅｒｐｉｎは主に細胞内でも働くｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒである。
ＳＣＣＡ１はパパイン様システインプロテアーゼ阻害剤であるが、ＳＣＣＡ２はキモトリプシン様セリンプロテアーゼ阻害であり、相同性が高いにも関わらず反応部位のアミノ酸配列が異なるため、異なった特性を有することもある（Ｓｃｈｉｃｋ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９７）２７２１３，１８４９−５５）。乾癬などの疾患やＵＶによってＳＣＣＡ−１及びＳＣＣＡ−２が高発現することはわかっていたが、それらが皮膚性状においてどのように関与しているかは不明であった。

本発明者はＳＣＣＡが関与する表皮の生理学的メカニズムの解明を目的とする研究を行っていたところ、ＳＣＣＡの発現が乾癬などの不全角化の生じた皮膚において特異的に亢進しており、ＳＣＣＡが不全角化を含む皮膚の肌荒れ性状の一因であることを見出した。従って、ＳＣＣＡの発現が肌の性状の指標となると考え、本発明を完成するに至った。
本発明は、皮膚角層細胞の扁平上皮細胞癌関連抗原（ＳＣＣＡ）、詳しくはＳＣＣＡ−１及び／又はＳＣＣＡ−２、特にＳＣＣＡ−１の発現を指標とする、皮膚性状の評価方法を提供する。好ましくは、前記ＳＣＣＡの発現は、ＳＣＣＡに特異的な抗体を使用する酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）により実施する。より好ましい態様において、前記皮膚角層試料はテープストリッピングにより採取されたものである。
本発明の方法により、皮膚の性状、すなわち肌荒れ状態、不全角化状態などを生化学的レベルで判定することが可能となる。本発明の方法により判定される肌又は皮膚性状としては、肌荒れ、例えば紫外線照射を原因とする皮膚老化、皮膚バリアー機能低下に伴う肌保湿力の低下による乾燥肌、乾癬やアトピー性皮膚炎を原因とする不全角化、花粉症による肌荒れなど、さまざまな性状が挙げられる。

図１は、皮膚抽出物のウェスタンブロット分析を示す。Ｈ−９９抗体及びｈ１４Ｄ^１４６抗体を使用することにより、チモーゲン及び活性カスパーゼ−１４の存在を免疫ブロット法で分析した。１０μｇ（レーン１，２及び４）及び１μｇ（レーン３）の全皮膚抽出物、皮膚等価抽出物及び角化細胞抽出物を適用した。
図２は、精製カスパーゼ−１４の分析を示す。（Ａ）ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動後、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５クロマトグラフィーから得られた画分Ｎｏ．２５をＰＶＤＦ膜に移し、そしてクーマジーブリリアントブルーで染色した。１７ＫＤａ及び１１ＫＤａの２つのタンパク質バンドが示された。（Ｂ）Ｈ−９９、ｈ１４Ｄ^１４６及びＣ２０抗体を使用したウェスタンブロット分析。１７ＫＤａバンドがＨ９９抗体及びｈ１４Ｄ^１４６抗体の双方に対して陽性を示し、また１１ＫＤａバンドがＣ２０抗体で認識されることが示された。Ｍ：マーカー；１：Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５ Ｎｏ．２５；２：Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５ Ｎｏ．２６−２７，ｃｏｍｃ．
図３は、精製カスパーゼ−１４に対する種々の合成インヒビターの効果を示す。ヒトカスパーゼは現在１５種類が知られているが、各種カスパーゼに対するペプチドインヒビター（ＹＶＡＤ，ＶＤＶＡＤ，ＤＥＶＤ，ＶＥＩＤ，ＩＥＴＤ，ＬＥＨＤ，ＤＮＬＤ）、並びにシステインプロテイナーゼ（ＩＡＡ）及びセリンプロテイナーゼ（ＡＥＢＳＦ）に対するクラス特異的インヒビターと一緒に、カスパーゼ−１４をインキュベートした。１．３Ｍ クエン酸ナトリウム及び５ｍＭ ＤＴＴの存在においてＷＥＨＤ−ＭＣＡを基質として使用して、残留酵素活性を測定した。試験した酵素濃度はそれぞれ、５，２．５及び１．２５μＭとした。値は重複アッセイの平均値を表す。
図４は、（Ａ）ＩＣＡＤに対する精製カスパーゼ−１４の切断活性を示す。（Ｂ）ＦＬ３３１抗体を使用したウェスタンブロット分析を示す。３３ＫＤａ及び２７ＫＤａの切断生成物が示された。１０μＭ ＳＣＣＡ−１を用いた前インキュベーションによって、ＩＣＡＤ切断は完全に抑制された。コスモトロフィック塩の存在においてのみ、ＩＣＡＤ分解が観察された。アミノ末端に特異的な抗体を使用したウェスタンブロット分析は、カスパーゼ−１４との延長されたインキュベーション中にインタクトなＩＣＡＤ分子の消失を示した。混合物にＳＣＣＡ−１を添加すると、ＩＣＡＤ分解はもやは検出されず、１６時間のインキュベーション後、影響を受けないままであった（Ｂ）。（Ｃ）合成カスパーゼ基質に対する加水分解活性を、コスモトロピック塩の存在において調査した結果を示す。
図５は、活性カスパーゼ−１４及びＴＵＮＥＬポジティブ細胞の局在を示す。正常なヒトの皮膚の薄い切片をＨ−９９抗体（Ａ）、ｈ１４Ｄ^１４６抗体（Ｂ）及びＴＵＮＥＬ（Ｃ）で染色した。Ｔｅｘａｓ−Ｒｅｄを蛍光検出（Ｂ）のために使用した。ＴＵＮＥＬにはＦＩＴＣを用い、そして免疫染色にはＴｅｘａｓ Ｒｅｄを用いて、ＴＵＮＥＬ及びカスパーゼのための二重染色を実施した。（Ｄ）は重畳画像、（Ｅ）は明視野を示す。
図６は、ＩＣＡＤ及び不全角化核の共局在を示す。正常なヒトの皮膚の薄い切片を抗ＩＣＡＤ抗体ＦＬ３３１で染色した。下表皮のほとんどの核はこの抗体に対して陽性を示した。ＡＤ患者皮膚に由来する角化細胞の表在層上のＩＣＡＤを抗体で染色したときには、種々のサイズの陽性部位が示された（Ｂ）。核クラスターを示すヨウ化プロピジウム（ＰＩ）による核染色がしばしば認められた（Ｃ）。同じ部位の明視野は、表面上のオーバーラップされたスケールを示した（Ｄ）。重畳画像は、不全角化部位においてのみＩＣＡＤが存在することを明らかにした（Ｅ）。明視野における核染色の重畳画像も示されている（Ｆ）。
図７は、ＳＣＣＡ−１及び不全角化核の共局在を示す。ＳＣＣＡ−１は、正常な皮膚切片内ではほとんど検出することができなかった。ＡＤ患者皮膚の表在層において、ＳＣＣＡ−１陽性部位は示された（Ｈ）。これらの部位上でのみ、核クラスターが認められた（Ｉ）。明視野を（Ｊ）に示す。重畳画像は、ＳＣＣＡ−１陽性部位が、好ましくは未消化核が存在する部位と重なることを示す（Ｋ）。ＳＣＣＡ−１染色及び明視野に対応する別の重畳画像も示す（Ｌ）。
図８は、露光及び非露光部位の表皮におけるＳＣＣＡの発現を示す免疫組織化学的検査結果を示す。
図９は、正常皮膚及び乾癬症に罹った皮膚におけるＳＣＣＡの発現を示す免疫組織化学的検査結果を示す。
図１０は、ＥＬＩＳＡ法による正常皮膚角層におけるＳＣＣＡ発現量結果を示す。
図１１は、ＥＬＩＳＡ法による正常皮膚と乾癬皮膚角層におけるＳＣＣＡ発現量の対比結果を示す。
図１２は、ＥＬＩＳＡ法による正常皮膚とアトピー性皮膚炎皮膚角層におけるＳＣＣＡ発現量の対比結果を示す。
図１３は、正常皮膚におけるＳＣＣＡ発現量とＴＥＷＬの相関を示す。
図１４は、花粉症皮膚における肌荒れとＳＣＣＡ−１発現量との関係を示す。
図１５は、花粉症皮膚における肌荒れとＳＣＣＡ−１の発現亢進との相関図を示す。

ＳＣＣＡは上述のとおり乾癬やＵＶ照射皮膚で発現の亢進している分子量約４５，０００のタンパク質である。ＳＣＣＡ−１及びＳＣＣＡ−２のアミノ酸配列並びにそれらをコードする核酸配列はＴａｋｅｄａ Ａ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１１８，１４７−１５４（２００２）（前掲）に記載されている。
本発明に係るＳＣＣＡの発現の測定は、ＳＣＣＡを測定することのできる任意の方法に従い、定量的又は定性的に実施することができる。具体的には、ＳＣＣＡに特異的な抗体を利用する免疫測定方法、例えば酵素ラベルを利用するＥＬＩＳＡ法、放射性ラベルを利用するＲＩＡ法、免疫比濁法、ウェスタンブロット法、ラテックス凝集法、赤血球凝集法等、様々な方法が挙げられる。免疫測定法の方式には競合法やサンドイッチ法が挙げられる。他に、ＳＣＣＡの発現量はそれをコードする遺伝子の細胞内において発現された量の測定により行うこともできる。この場合、好ましくは、ＳＣＣＡの発現は細胞内のＳＣＣＡをコードするｍＲＮＡの量を測定することにより決定する。ｍＲＮＡの抽出、その量の定量的又は定性的測定も当業界において周知であり、例えばＰＣＲ法、３ＳＲ法、ＮＡＳＢＡ法、ＴＭＡ法など、さまざまな周知の方法により実施することができる。他に、ＳＣＣＡの発現はｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法やその生物活性の測定を通じて定性的に決定することができる。
被検体となる皮膚角層試料の採取は任意の方法で実施することができるが、簡便性の観点からテープストリッピング法が好ましい。テープストリッピングとは、皮膚表層に粘着テープ片を貼付し、剥がし、皮膚角層をその剥がした粘着テープに付着させることで角層試料を採取する方法である。テープストリッピング法を利用すれば、角層をテープ一枚採取するだけでＳＣＣＡ発現の測定が可能となり、ＳＣＣＡを指標とした非侵襲性の肌荒れ、不全角化の評価方法が可能となる。テープストリッピングの好ましい方法は、まず皮膚の表層を例えばエタノールなどで浄化して皮脂、汚れ等を取り除き、適当なサイズ（例えば２×５ｃｍ）に切った粘着テープ片を皮膚表面の上に軽く載せ、テープ全体に均等な力を加えて平たく押さえ付け、その後均等な力で粘着テープを剥ぎ取ることで行われる。粘着テープは市販のセロファンテープなどであってよく、例えばＳｃｏｔｃｈ Ｓｕｐｅｒｓｔｒｅｎｇｔｈ Ｍａｉｌｉｎｇ Ｔａｐｅ（３Ｍ社製）、セロファンテープ（セロテープ（登録商標）；ニチバン株式会社）等が使用できる。粘着テープに付着した皮膚角層試料中のＳＣＣＡは、テープ片を適当な抽出液、例えばＴｒｉｓ−ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ８．０）（０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，０．１４Ｍ ＮａＣｌ，０．１％ Ｔｗｅｅｎ−２０）に浸漬し、角層を抽出することでテープから単離・抽出させることができる。
本発明の好ましい態様においては、ＳＣＣＡは免疫測定方法、例えばＥＬＩＳＡにより測定する。ＥＬＩＳＡにおいて使用するＳＣＣＡに特異的な抗体はモノクローナル抗体でもポリクローナル抗体でもよい。モノクローナル抗体やポリクローナル抗体の作成方法は当業者に周知であり、例えばＬｕｎｓｔｒｕｍ ｅｔ ｅｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９８６，２６１：９０４２−９０４８；Ｈｕｒｌｅ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９４，１０７：２６２３−２６３４に記載されている。
本発明に係る方法においては、サンドイッチ免疫測定法が特に好ましい。サンドイッチ免疫測定方法は例えば下記の通りに実施できる。
２種類のＳＣＣＡに特異的な抗体の一方を一次抗体として担体に固定化する。担体としては固体担体が好ましく、例えば固体担体として免疫測定法において常用される任意のものを使用してよく、例えば任意の大きさ、形状に成形されたスチレンやポリスチレンなどの高分子担体のほか、これらの適当な材料で成形した反応容器、例えばＥＬＩＳＡプレートのウェルの内壁などが挙げられる。
上記一次抗体の担体への固定化は常法に従って行うことができ、例えば上記一次抗体を緩衝液、例えばリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、ホウ酸緩衝液などに溶解して担体に吸着させることにより固定化することができる。また、例えば上記一次抗体に結合する抗体やその他のタンパク質、例えばプロテインＣをあらかじめ担体に固定化し、これを上記一次抗体と接触させる等してもよい。更に、非特異的な結合を抑えるため、このようにして一次抗体を固定化した担体に適当なブロッキング剤、例えばＰＢＳ−ＢＳＡや市販のブロッキング剤、例えばブロックエース（大日本製薬）を加え、約４〜４０℃、好ましくは２０〜３７℃で、５分から数日、好ましくは１０分から２４時間、より好ましくは１０分〜３時間インキュベーションすることによりブロッキングするのが好ましい。
上記２種類のＳＣＣＡに特異的な抗体の他方の抗体は二次抗体として使用し、標識する。標識としては、酵素標識、放射線標識、蛍光標識、などが挙げられる。酵素標識する場合、酵素を二次抗体に直接結合させて標識するか、または例えばアビジンービオチンのような相互反応性蛋白質を介して間接的に酵素で標識することもできる。酵素の抗体などへの結合は、例えば市販のチオール導入基試薬を利用して酵素及び標識すべき抗体などのそれぞれにチオール基を導入してから両者をＳ−Ｓ結合させることで行うことができる。酵素としては、ホースラディッシュパーオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼなどが挙げられる。酵素の検出は、その酵素に特異的な基質を用いて行うことができる。例えばホースラディッシュパーオキシダーゼを利用する場合、ＴＭＢ（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジンジン）やＡＢＴＳ（２，２’−アジン−ジ［３−エチルベンズチアゾリンスルホネート］）などが利用できる。
かかる免疫測定は、前記一次抗体を固定した担体、前記標識した二次抗体、被検試料を混合し、インキュベーションすることにより、担体に固定化された一次抗体に被検試料中のＳＣＣＡを結合せしめ、このＳＣＣＡ分子に標識二次抗体を結合せしめる。
このようにして、標識化抗体は、試料中のＳＣＣＡの量を反映した量において、担体に固定化された一次抗体と試料に由来するＳＣＣＡを介して担体上に固定される。かかるインキュベーションは、適当な緩衝液、例えばＰＢＳ中で約４〜４０℃、好ましくは２０〜３７℃で、５分から数日、好ましくは１０分から２４時間、より好ましくは１０分〜３時間行う。
次に、上記担体から未結合の標識化抗体を分離する操作を行う。担体が固体担体である場合、この分離操作は固液分離により簡単に行うことができる。一定の既知量の標識二次抗体を使用した場合、担体に結合した標識もしくは未結合の標識又はこの両者を測定することができる。他方、任意の標識抗体を使用した場合、担体に結合した標識を検出、測定する。担体に結合した標識を検出するには、好ましくは担体を洗浄液、例えば適当な界面活性剤の入った緩衝液、例えばＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０により洗浄して未結合の標識化抗体を除去した後に検出を行う。検出は標識の種類に依存して常法に従って行うことができる。
以下、具体例を挙げて、本発明を更に具体的に説明する。なお、本発明はこれにより限定されるものではない。

１．ＳＣＣＡと不全角化の関係の解明
材料及び方法
材料
Ａｃ−ＷＥＨＤ−ＭＣＡ、Ａｃ−ＹＶＡＤ−ＭＣＡ、Ａｃ−ＶＤＶＡＤ−ＭＣＡ、Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＭＣＡ、Ａｃ−ＶＥＩＤ−ＭＣＡ、Ａｃ−ＩＥＴＤ−ＭＣＡ、Ａｃ−ＬＥＨＤ−ＭＣＡはＰｅｐｔｉｄｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｉｎｃ．（日本、大阪府）から購入した。
ベンジルオキシカルボニル（Ｚ）−ＹＶＡＤ−ＦＭＫ、Ｚ−ＶＤＶＳＤ−ＦＭＫ、Ｚ−ＤＥＶＤ−ＦＭＫ、Ｚ−ＶＥＩＤ−ＦＭＫ、Ｚ−ＩＥＴＤ−ＦＭＫ、Ｚ−ＬＥＨＤ−ＦＭＫ及びＺ−ＶＡＤ−ＦＭＫは、ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ（Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ）から購入した。組換えカスパーゼ−１〜１０はＢＩＯＭＯＬ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｓ，Ｉｎｃ．（Ｐｌｙｍｏｕｔｈ Ｍｅｅｔｉｎｇ，ＰＡ）から得た。
カスパーゼ−１４のプロ形及び大サブユニットの検出のために、Ｈ−９９抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ）を使用した。Ｈ−９９抗体はヒトカスパーゼ−１４のアミノ酸２４−１２２に対応するペプチドに対し生起された抗体であり、従ってカスパーゼ−１４のプロ酵素及びそのプロセッシングされた形態、即ち、その大サブユニットと反応する。
カスパーゼ−１４の小サブユニットの検出のためには、Ｃ−２０抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）を使用した。開裂部位特異的抗体（ｈ１４Ｄ^１４６）は、ヒトカスパーゼ−１４の推定プロセッシング部位に相当する合成ペンタペプチドＴＶＧＧＤを用い、ウサギを免疫化することにより作成した。
ＷＥＨＤ−ＭＣＡ加水分解活性の測定
Ｍｉｋｏｌａｊｃｚｙｋ Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４３，１０５６０−９（２００４）に記載の方法に多少の変更を加え、Ａｃ−ＷＥＨＤ−ＭＣＡを基質として、カスパーゼ−１４活性を測定した。簡単には、アッセイ混合物を、４５μＬの０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）、０．０６Ｍ ＮａＣｌ、０．０１％ ＣＨＡＰＳ、５ｍＭ ＤＴＴ、１．３Ｍ クエン酸ナトリウム及び１０μＭ ＷＥＨＤ−ＭＣＡから作製した（全て、最終濃度で表示）。この混合物に酵素試料（５μｌ）を添加し、これを１０〜３０分間にわたってインキュベートした。反応を１５０μｌの０．１Ｍのモノクロロ酢酸により停止させ、そしてＦｌｕｏｒｏｓｋａｎ Ａｓｃｅｎｔ ＦＬ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｃｏ．，Ｗｏｌｓａｍ，ＭＡ）を用い、３５５ｎｍの励起波長及び４６０ｎｍの発光波長により測定を行った。インヒビターアッセイの場合、カスパーゼ−１４及びペプチドインヒビターを室温で１５分間、アッセイ緩衝液中でインキュベートし、そして５μｌの１００μＭ ＷＥＨＤ−ＭＣＡを添加することによりアッセイを開始した。
カスパーゼ−１４の精製
健常人の踵からこすり取ったヒト角化細胞（約１４ｇ）を、ガラスホモジナイザーを使用して、０．１４Ｍ ＮａＣｌを含有する０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で抽出した。６０分間にわたって１５，０００ｇで遠心分離した後、上澄みを得た。Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＭＡ）で濃縮し、Ｆａｓｔ Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ カラムＨＲ１０／１０（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で脱塩した後、粗生成物をＨｉＰｒｅｐ １６／１０ Ｑ ＸＬカラムに塗布した。カラムを２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で洗浄し、そして０〜１Ｍの線形ＮａＣｌ勾配で溶離させた。画分は抗カスパーゼ−１４抗体（Ｈ−９９）（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＣＡ）及びｈ１４Ｄ^１４６抗体を使用するウェスタンブロットにより追跡した。また、各画分についてＡｃ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ａｓｐ−メチル−クマリンアミド（ＷＥＨＤ−ＭＣＡ）（Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｉｎｃ．日本国大阪）に対する加水分解活性を測定した。陽性を示した画分を同緩衝液で平衡させたＭｏｎｏ Ｑカラムに載せ、これを最大１ＭのＮａＣｌ勾配で溶離させた。カスパーゼ−１４画分をさらにＭｏｎｏ Ｓ陽イオン交換クロマトグラフィーにより分離した。カラムを２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）で平衡にし、そして０〜１ＭのＮａＣｌ勾配で溶離させた。陽性を示した画分を濃縮し、そしてこれを２５ｍＭエタノールアミン（ｐＨ８．３）で平衡にしたクロマトフォーカシングＭｏｎｏ Ｐカラムに載せた。Ｐｏｌｙｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ５．０）４６ｍｌを使用し、ｐＨ８から５に至るｐＨ勾配を形成させながら、溶離を行った。カスパーゼ−１４はＳｕｐｅｒｄｅｘ ７５ゲルクロマトグラフィーを用い最終的に精製した。タンパク質濃度はＢｉｏＲａｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（ＢｉｏＲａｄ Ｌａｂ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）で決定した。
組換えカスパーゼ−１４及びＳＣＣＡ−１の調製
カスパーゼ−１４をコードするｃＤＮＡを順方向プライマー：ＡＡＧＧＡＴＣＣＡＡＴＣＣＧＣＧＧＴＣＴＴＴＧＧＡＡＧＡＧＧＡＧ（配列番号１）及び逆方向プライマー：ＴＴＴＣＴＧＣＡＧＧＴＴＧＣＡＧＡＴＡＣＡＧＣＣＧＴＴＴＣＣＧＧＡＧＧＧＴＧＣ（配列番号２）を使用するＰＣＲによってケラチノサイトｃＤＮＡから単離・増幅した。ＰＣＲ生成物をｐＱＥ−１００ ＤｏｕｂｌｅＴａｇベクター（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）中にクローニングし、そしてＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９中で発現させた。
ＳＳＣＡ１ ｃＤＮＡを乾癬ｃＤＮＡライブラリー（Ｔａｋｅｄａ Ａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，１１８，１４７−５４（２００２））から分離し、そしてｐＱＥ３０ベクター（Ｑｕｉａｇｅｎ）中にクローニングした。組換えタンパク質をＮｉ−ＮＴＡ Ａｇａｒｏｓｅ（Ｑｕｉａｇｅｎ）及びＭｏｎｏ Ｑクロマトグラフィーで精製した。
免疫組織化学
ヒト頭皮試験片を患者の同意のもと、形成外科手術により得た。組織をリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中の４％パラホルムアルヒド（ＰＦＡ）で固定し、パラフィン中に包埋した。薄切片を調製し、そして４℃で一晩にわたって適切な抗体と一緒にインキュベートした。ペルオキシダーゼ接合ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ニチレイ社製）を二次抗体として使用し、発色試薬としてのＤＡＢと反応させた。
ＴＵＮＥＬ陽性細胞及び活性カスパーゼの二重免疫検出の場合、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ（登録商標）色素接合抗ウサギＩｇＧ（ロバ）を二次抗体として使用した。ＴＵＮＥＬ反応はフルオレセインｉｎ ｓｉｔｕ細胞死検出キット（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を使用し、その製造者の指示書に従って実施した。
ＩＣＡＤのウェスタンブロット及び免疫組織化学分析の場合、抗ＩＣＡＤ ＩｇＧ（ＦＬ３３１，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）及びＤＦＦ４５／ＩＣＡＤ Ａｂ−２（ＮｅｏＭａｒｋｅｒｓ，Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）を使用した。
活性アトピー性皮膚炎（ＡＤ）患者の皮膚内には、クラスター化した不全角化が往々にして観察されることが報告されている（Ｓａｋｕｒａｉ Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．Ｓｃｉ．３０，３７−４２（２００２）；Ｐｉｌｏｔｏ Ｖａｌｄｅｓ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ａｌｌｅｒｇｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．（Ｍａｄｒ）１８，３２１−４（１９９０））。本実験においては、非侵襲的方法を用い、不全角化性皮膚におけるＩＣＡＤ及びＳＣＣＡ−１の局在を調べた。ＡＤ又は健常有志の皮膚から表在性角化層を採取し、そして医療用接着剤Ａｒｏｎ Ａｌｐｈａ Ａ（Ｓａｎｋｙｏ Ｃｏ．，Ｔｏｋｙｏ）を使用してスライドガラス上に付着させた。３％パラホルムアルデヒドで固定したあと、試料に０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を浸透させ、そしてこの試料を抗ＩＣＡＤ又は抗ＳＣＣＡ−１抗体で一晩にかけて４℃で免疫染色した。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４００接合型抗ラビット（ＩＣＡＤ）又は抗マウスＩｇＧ（ＳＣＣＡ−１）をそれぞれ二次抗体として、１時間にわたって室温で使用した。核の視覚化のために、試料を０．１％ヨウ化ピリジウム溶液中に５分間浸漬し、そしてＰＢＳで３回洗浄した。蛍光観察のために、Ｌｅｉｃａ ＤＭＬＡ顕微鏡を使用した。
ウェスタンブロット分析
ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法により、５〜２０％勾配のゲルでタンパク質を分離した。電気泳動後、タンパク質をポリビニリジンジフルオライド膜（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）上に転写し、そしてＨ−９９，ｈ１４Ｄ^１４６又はＣ２０を含む抗カスパーゼ−１４抗体と一緒にインキュベートした。ペルオキシダーゼ標識抗ウサギＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ）又は抗ヤギＩｇＧを二次抗体として使用し、そして免疫反応性タンパク質をＥＣＬ−プラス（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用い化学発光法で視覚化させた。
結果
角化細胞中のカスパーゼ−１４はＡｓｐ^１４６でプロセッシングされる
ウェスタンブロット分析によると、Ｈ−９９抗体は角化細胞抽出物中の１７ＫＤａのバンドしか検出しなかった（図２）。この結果は、プロセッシングされていない３０ＫＤａの形態を含む、全皮膚又は皮膚等価モデル由来の抽出物についての結果とは一致しない。この１７ＫＤａバンドはｈ１４Ｄ^１４６抗体（図２Ｂ）でも認識され、活性カスパーゼ−１４（ｐ１７）の大サブユニットであると推定される。このことは、カスパーゼ−１４の成熟が、終末分化の最終段階中にＡｓｐ^１４６での開裂によって達成されることを示唆する。さらに、３０ＫＤａのバンドが、皮膚等価モデルにおいて、Ｈ−９９及びｈ１４Ｄ^１４６抗体によっても認識され、このことは、Ａｓｐ^１４６における切断を示唆する。
角化細胞抽出物からのカスパーゼ−１４の調製
角化細胞中のカスパーゼ−１４の大部分はプロセッシングされた形態、それ故、活性型で存在すると推定されるので（Ｅｃｋｈａｒｔ Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１１５，１１４８−５１（２０００）；Ｌｉｐｐｅｎｓ Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｄｉｆｆｅｒ．７，１２１８−２４（２０００）；Ｍｉｋｏｌａｊｃｚｙｋ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４３，１０５６０−９（２００４））、ヒト角化細胞は優れたカスパーゼ−１４精製源であると考えられる。しかしながら、ヒト角化細胞がカスパーゼ−１様酵素を含有することも知られている（Ｔａｋａｈａｓｈｉ Ｔ．，Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１１１，３６７−７２（１９９８））。カスパーゼ−１の基質、例えばＷＥＨＤ−基質は、カスパーゼ−１及びカスパーゼ−１４の両者によって加水分解することができる。本発明者は先ず、１．３Ｍクエン酸ナトリウム及び５ｍＭジチオスレイトールの有無で、カスパーゼ−１によるＷＥＨＤ−ＭＣＡ加水分解を試験した。ＷＥＨＤ−ＭＣＡは標準のカスパーゼアッセイ緩衝液中でカスパーゼ−１の優れた基質であるにもかかわらず、コスモトロピックイオンの存在下では、カスパーゼ−１はこの基質を加水分解できないことが確認された（データーは示さない）。従って、それぞれの画分を、ＷＥＨＤ−ＭＣＡに対する加水分解活性、Ｈ−９９に対する反応性、及びｈ１４Ｄ^１４６抗体といった３通りの方法で評価した。表１は、連続クロマトグラフィーの結果を示す。ＨｉＰｒｅｐ Ｑカラムを使用した最初の陰イオン交換クロマトグラフィーの後、収率は１７０％の上昇を示し、比活性は約１０倍上昇した。この上昇はおそらく、内在性のインヒビターからのカスパーゼ−１４の隔離によるものと考えられる。ウェスタンブロット分析によれば、画分Ｎｏ．１６〜２０は分子量１７ ＫＤａのＨ−９９陽性且つ１４Ｄ^１４６陽性バンドを含有することが示された。これらの画分は、ＷＥＨＤ−ＭＣＡ加水分解活性も認められた。続くＭｏｎｏ Ｑ陰イオン交換クロマトグラフィーにおいて、画分Ｎｏ．２５〜Ｎｏ．２９は、１７ ＫＤａのＨ−９９陽性且つｈ１４Ｄ^１４６陽性バンドの存在による判定に従い、プロセッシングされた形態のカスパーゼ−１４を含有する。これらの画分だけがＷＥＨＤ−ＭＣＡ加水分解活性を示した。Ｍｏｎｏ Ｓ陽イオンクロマトグラフィ及びＭｏｎｏ Ｐクロマトフォーカシングは主だった夾雑タンパク質を除去するのに有効であり、そして比活性はそれぞれにより３．５倍及び７倍上昇させた。ここでもまた、Ｈ−９９陽性且つｈ１４Ｄ^１４６陽性画分だけがＷＥＨＤ−ＭＣＡ加水分解活性を示した。Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５クロマトグラフィーによる最終段階は分子量３０ ＫＤａのピークを分離し、このピークはＷＥＨＤ−ＭＣＡ加水分解活性ピークと一致した。ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法は、この調製物が１７ＫＤａ及び１１ＫＤａの断片を含むことを示した。前者はＨ−９９抗体及びｈ１４Ｄ^１４６抗体の両者に対して陽性を示し、後者はＣ２０抗体で認識された。このことは、ヒトカスパーゼ−１４が大サブユニット（１７ＫＤａ）及び小サブユニット（１１ＫＤａ）から成るヘテロダイマーとして精製されたことを示唆する。また、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５ゲルクロマトグラフィーは、他のカスパーゼとは異なり、ヒト角化細胞中のカスパーゼ−１４はグランザイムＢ活性化型のようにモノマーとして存在することを示した。表１はカスパーゼ−１４の精製率をまとめている。約１００ｍｇの可溶性タンパク質抽出物から出発して、精製タンパク質１１．８μｇを得た。比活性は７６４倍上昇し、収率は９．１％であった。
精製カスパーゼ−１４の酵素特性
精製カスパーゼ−１４の酵素特性を調べた（図３〜４）。カスパーゼ−１４は様々なカスパーゼインヒビター、例えばＹＶＡＤ−ＦＭＫ（カスパーゼ−１インヒビター）、ＶＤＶＡＤ−ＦＭＫ（カスパーゼ−２インヒビター）、ＤＥＶＤ−ＦＭＫ（カスパーゼ−３インヒビター）、ＩＥＴＤ−ＦＭＫ（カスパーゼ−８インヒビター）、ＬＥＨＤ−ＦＭＫ（カスパーゼ−９インヒビター）及びＶＡＤ−ＦＭＫ（ｐａｎ−カスパーゼインヒビター）に対する感受性を有した（図３）。なお、ＶＥＩＤ−ＦＭＫの効果はほとんどなかった。とりわけＹＶＡＤ−ＦＭＫは、カスパーゼ−１４活性に対して極めて強力な阻害効果を示した。このことはおそらく、カスパーゼ−１とカスパーゼ−１４との間の構造類似性によるものと考えられる。ｐａｎ−カスパーゼインヒビターＶＡＤ−ＦＭＫは、ＶＡＤ−ＦＭＫと同程度にカスパーゼ−１４活性を抑制した。システインプロテイナーゼに対するクラス特異的インヒビターであるヨード酢酸（ＩＡＡ）、又はセリンプロテイナーゼに対するクラス特異的インヒビターである４−（２−アミノエチル）ベンゼンスルホニルフルオリド（ＡＥＢＳＦ）は、この研究における試験濃度では有意な阻害効果を示さなかった。
ＩＣＡＤ分解に対する精製カスパーゼ−１４の効果
カスパーゼ−１４の天然基質の模索中に、本発明者はＩＣＡＤに対するカスパーゼ−１４の効果を試験した。というのも、核の消失は終末分化にとって極めて重要な事象の１つであるからである。通常のカスパーゼアッセイ緩衝液中で組換えＩＣＡＤタンパク質と共に精製カスパーゼ−１４をインキュベートすると、抗ＩＣＡＤ ＩｇＧを用いたウェスタンブロット分析による判定によれば、精製カスパーゼ−１４はＩＣＡＤに対し何ら加水分解活性を示さなかった（図４Ａ）。しかし、コスモトロピック塩の存在下では、インタクトなＩＣＡＤタンパク質が減少し、２つの主要な分解生成物が増加することから、精製カスパーゼ−１４はＩＣＡＤに対して限定的な分解作用を示した。ＳＣＣＡ−１によりカスパーゼ−１４が阻害される
ＳＣＣＡ−１はセルピン超科に属するものの、システインプロテイナーゼ、例えばパパイン及びカテプシンＬを阻害する（Ｔａｋｅｄａ Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３８３，１２３１−６（２００２））。このことは、ＳＣＣＡ−１がＣｒｍ−Ａ^３２のような固有のクロスクラスインヒビターであることを示す。従って、本発明者はＳＣＣＡ−１がカスパーゼメンバーを阻害できるかどうかを試験した。カスパーゼ−１４の場合、コスモトロピック条件を利用した。組換え活性カスパーゼをＳＣＣＡ−１と共にインキュベートしても、カスパーゼメンバー（１〜１０）のいずれも酵素活性について何ら影響を受けなかった。これとは逆に、ＳＣＣＡ−１は用量依存式にカスパーゼ−１４のＷＥＨＤ−ＭＣＡに対する活性を抑制した（図４Ｃ）。ＳＣＣＡ−１はカスパーゼ−１４によるＩＣＡＤ分解も阻害した。インキュベーションを延長しても、酵素活性の回復を示すことはなかった。このことは、カスパーゼ−１４とＳＣＣＡ−１との強い結合を示唆する（図４Ｂ）。
活性カスパーゼ−１４及びＴＵＮＥＬ陽性細胞の局在
カスパーゼ−１４が脱核プロセスに関与するかどうかを調べるため、本発明者は、活性カスパーゼ−１４及びＴＵＮＥＬの二重染色を行った。図５Ａに示すとおり、プロ形及び活性型を含むカスパーゼ−１４は、正常ヒト表皮内の有棘細胞から角化細胞にかけて局在していた。このことは過去の所見（Ｌｉｐｐｅｎｓ ｅｔ ａｌ．，（２０００）、前掲）と合致する。ｈ１４Ｄ^１４６抗体で検出された活性カスパーゼ−１４は、角化細胞及び顆粒細胞の一部に限定されていた（図５Ｂ）。角化細胞のほとんどは遍在的に染色された。ＴＵＮＥＬ陽性細胞は、角化層のすぐ下側に観察されたが、これらの陽性細胞の多くは著しく制限された（図５Ｃ）。興味深いことに、ＴＵＮＥＬ陽性細胞は、専らｈ１４Ｄ^１４６陽性細胞と共に局在していた。このことは、これらの細胞中でＤＮＡ断片化が起きており、活性カスパーゼ−１４がこのプロセスに関与していることを示唆している。
不全角化性核におけるＩＣＡＤ及びＳＣＣＡ−１の共局在
正常なヒト上皮の縦断面では、ＦＬ３３１抗体を使用することで、基底細胞及び基底上細胞の核内にＩＣＡＤの局在が主にあることがわかる。細胞質は、基底細胞から顆粒細胞において弱く陽性を示した。角化層においては、ＩＣＡＤに対する免疫反応性は大幅に低減した。Ｎ末端ペプチド抗体ＤＦＦ４５／ＩＣＡＤ Ａｂ−２を使用しても事実上同じ結果が得られた（データーは示さず）。ＡＤ患者の表在性角化層を抗ＩＣＡＤ抗体（ＦＬ−３３１）で染色した場合、様々なサイズのクラスター領域がこの抗体に対して陽性を示した（図６Ｂ）。ＰＩによる核染色は、不全角化性の核がこれらの斑状の島内に常に見いだされることを示した（図６Ｃ）。表在性角化層の明視野は、凹凸の多い粗い表面を示した（図６Ｄ）。重畳画像は、不全角化部位がＩＣＡＤ陽性部位と一致することを示した（図６Ｅ及び５Ｆ）。これらの結果は、終末分化において核を排除するのにＩＣＡＤ分解が必要とされることを示唆する。
正常な皮膚の場合、極めて低レベルのＳＣＣＡ−１が顆粒層内で検出された。活性ＡＤを有する表在性角化層内でも、陽性部位の斑状分布が顕著な強い免疫染色が見いだされた（図７Ｈ）。同様に、ＳＣＣＡ−１陽性領域は、ＰＩ陽性の核の層、即ち不全角化部位と一致した（図７Ｊ〜Ｌ）。これらの結果をまとめると、ＩＣＡＤ／ＣＡＤ系が脱核プロセスの主要な役割を果たし、そしてＳＣＣＡ−１はサプレッサーとしてこの反応に関与することを示唆する。
考察
カスパーゼ−１４は大部分が表皮内で発現され、その他の組織内ではほとんど発現されない（Ｖａｎ ｄｅ Ｃｒａｅｎ，Ｍ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｄｉｆｆｅｒ．５，８３６−４６（１９９８））。過去の報告によれば、ケラチノサイトの終末分化はカスパーゼ−１４のプロセッシングと連携しているとのことであり、このことは、カスパーゼの有するプロテアーゼ活性の亢進を示唆する（Ｌｉｐｐｅｎｓ，Ｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｄｉｆｆｅｒ ７，１２１８−２４（２０００）；Ｅｃｋｈａｒｔ ｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２７７，６５５−９（２０００）；Ｈｕ Ｓ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２７３，２９６４８−５３（１９８８））。最近、Ｍｉｋｏｌａｊａｃｚｙｋ ｅｔ ａｌ．，（２００４）前掲）は、グランザイムＢ切断カスパーゼ−１４がコスモトロピック塩の存在下で酵素的に活性であることを実証した。この研究において、本発明者は、ヒトカスパーゼ−１４がケラチノサイト分化の最終段階において活性であるかどうかを調べるために、完全に分化されたケラチノサイトからのカスパーゼ−１４の精製を試みた。本発明者は、大サブユニット、プロ形（Ｈ−９９）（Ａｓｐ^１４６（ｈ１４Ｄ^１４６）に推定カスパーゼ切断部位を有する）及び小サブユニット（Ｃ２０）をそれぞれ認識する３種の抗体を使用した。最終調製物は２つのタンパク質バンド、すなわちｈ１４Ｄ^１４６抗体によって認識された１７ＫＤａのタンパク質バンド、及びＣ２０抗体によって認識された１１ＫＤａのタンパク質バンドから成った。これらのタンパク質バンドは、活性カスパーゼ−１４の大及び小サブユニットである。精製工程の間、Ｈ−９９陽性の１７ＫＤａのバンドが、ｈ１４Ｄ^１４６抗体と一緒に認識された。このことは、大サブユニットがそのカルボキシル末端においてＡｓｐ^１４６で終わることを示唆している。小サブユニットのアミノ末端領域はＬｙｓ^１５３−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎとして同定され、このことは、プロセッシングがＩｌｅ^１５２とＬｙｓ^１５３との間で生じることを示唆する。この部位はカスパーゼメンバーとしては奇異な切断部位である。このことは、包皮抽出物から免疫沈降させたカスパーゼ−１４が同じ部位で切断を示すという、Ｃｈｉｅｎ他の発見（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２００２ Ａｕｇ ３０；２９６（４）；９１１−７）と合致する。従って、ヒトカスパーゼ−１４は高活性ヘテロダイマーとして均質に精製されたと結論付けた。カスパーゼ−１４の成熟には、２つの部位Ａｓｐ^１４６及びＩｌｅ^１５２におけるプロセッシング、並びにリンカー領域Ｘｘｘ^１４７及びＩｌｅ^１５２内の６つの残基の除去が関与するものと示唆された。２つの異なる切断部位（一方は酸性、他方は疎水性）の存在はまた、カスパーゼ−１４の活性化が多数の酵素により多段階的に行われることを示唆する。
精製カスパーゼ−１４の酵素学的特性は極めて独自のものであった。精製カスパーゼ−１４は、既知のカスパーゼインヒビターに対し比較的広いインヒビター感受性を示した。とりわけ、カスパーゼ１インヒビターＹＶＡＤ−ＦＭＫが最も強い阻害作用を示した。ＹＶＡＤ−ＦＭＫはＷＥＨＤ−ＭＣＡ並びに別のカスパーゼ−１基質であるＹＣＡＤ−ＭＣＡに対して最も高い活性を示した。このことは、カスパーゼ−１とカスパーゼ−１４との密な関係を示唆する。しかし、本発明者が明らかにしたところでは、カスパーゼ−１４は顕著に異なる特性を有している。本発明者は、ＳＣＣＡ−１がカスパーゼ−１４に対する内在性インヒビターであることを初めて解明した。ＳＣＣＡ−１の最も特異的な特性は、カスパーゼ−１４に対する著しい特異性である。カスパーゼ１〜１０の他の構成員がＳＣＣＡ−１による影響を受けることはない。合成基質ＤＥＶＤ−ＭＣＡ又は天然基質ＩＣＡＤを使用して、ＳＣＣＡ−１がカスパーゼ−３活性を阻害することはなかった。これはＣｒｍ Ａとは対照的である。Ｃｒｍ Ａもセルピン超科に属し、カスパーゼ−１及びカスパーゼ−８を含む多数のカスパーゼを抑制することができることで知られる（Ｇａｇｌｉａｒｄｉｎｉ Ｖ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６３，８２６−８（１９９４））。ＸＩＡＰはカスパーゼ−３，−７及び−９を阻害することで知られる（Ｓｒｉｎｉｖａｓｕｌａ Ｓ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４１０，１１２−６（２００１））。抗アポトーシス性タンパク質ｐ３５はカスパーゼ−１，−３，−６，−７，−８及び−１０を阻害することから、より広いスペクトルを有すると考えられる。これらの阻害タンパク質Ｃｒｍ Ａ，ＩＡＰ及びｐ３５の全てがいくつかの開始及び実行カスパーゼの一部を抑制し得るという事実は、これらの分子が典型的なアポトーシス経路の実行に関与していることを示唆する。他方、本発明者の結果が強く示唆しているのは、ＳＣＣＡ−１が通常のアポトーシス事象におけるキープレーヤーではないが、カスパーゼ−１４により媒介される脱核プロセスにおける重要なレギュレーターである、ということである。
このプロセスの分子メカニズムは解明されていなかった。本発明者は、ヒトカスパーゼ−１４がコスモトロピック塩の存在下において、ＩＣＡＤを分解できることを明らかにした。ＩＣＡＤ（ＤＮＡ断片化因子「ＤＦＦ４５」とも称される）は、カスパーゼ活性化型ＤＮアーゼ（ＣＡＤ）（又はＤＦＦ４０）と称されるマグネシウム依存性エンドヌクレアーゼに対するインヒビターである。ＩＣＡＤ／ＣＡＤ系は、アポトーシス性細胞死中の染色体ＤＮＡの分解において主要な役割を演じる。ＣＡＤに結合したＩＣＡＤは、不活性複合体として存在する。カスパーゼ−３は、ＩＣＡＤに対し限られたタンパク質分解を示し、２つの部位Ａｓｐ^１１７及びＡｓｐ^２２４で切断する。この切断はＣＡＤを活性化し、ＤＮＡ分解を開始させる（Ｎａｇａｔａ Ｓ．Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．２５６，１２−８（２０００））。カスパーゼ−３はアポトーシスの際の大量の細胞タンパク質の切断にとっては必ずしも必要でないが、ＩＣＡＤの切断にとっては必須である（Ｔａｎｇ Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３，２８５４９−５２（１９９８））。このことは、カスパーゼ−３がＤＮＡ断片化に極めて重要であり、他の実行カスパーゼ、即ちカスパーゼ−６や７は重要ではないことを示す。興味深いことに、カスパーゼ−１４はＩＣＡＤから、１２ＫＤａ及び３５ＫＤａの似たような切断断片を生成した。配列分析は同一の切断部位を示した。このことは、カスパーゼ−１４がカスパーゼ−３の完璧な代替物となり得ることを示唆している。カスパーゼ−１４はＩＣＡＤを分解し得るものの、下記の理由から、プロアポトーシスカスパーゼ−３とは明らかに異なる。第１に、カスパーゼ−１４の過剰発現はアポトーシス性細胞死を誘導しない（Ｖａｎ ｄｅ Ｃｒａｅｎ．Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｄｉｆｆｅｒ．５，８３８−４６（１９９８））。このことはカスパーゼ−３とは対照的である。第２に、カスパーゼ−１４は種々のアポトーシス性刺激では活性化されない（Ｌｉｐｐｅｎｓ ｅｔ ａｌ．（２０００）、前掲）。開始カスパーゼ又はその他のカスパーゼメンバーは、プロ−カスパーゼ−１４をプロセッシングすることができなかった。このことは過去の所見と一致する（Ｌｉｐｐｅｎｓ ｅｔ ａｌ．（２０００）、前掲）。活性化は終末分化においてのみ発生する（Ｅｃｋｈａｒｔ Ｌ．ｅｔ ａｌ．，（２０００）、前掲）。第３に、カスパーゼ−１４の合成は、成人組織における分化中のケラチノサイトに限定される（Ｅｃｋｈａｒｔ Ｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２７７，６５５−９（２０００））。また、ＩＣＡＤ切断に対するカスパーゼ−１４の能力は、カスパーゼ−３とは顕著に異なる様式で調節される。カスパーゼ−１４によるＩＣＡＤ分解は、異常な高濃度のコスモトロピックイオンを必要とする。このようなイオン濃度では、他のカスパーゼはほとんど活性ではなかった。総合的に見て、カスパーゼ−１４は、ケラチノサイト分化プログラムがその活性化を調節することから、カスパーゼメンバーの中では特殊な位置づけにあるように考えられる。
ケラチノサイト終末分化におけるＩＣＡＤ／ＣＡＤ系の関与は、ｉｎ ｖｉｖｏ実験によってさらに裏づけされる。免疫組織化学的研究は、ＩＣＡＤが基底ケラチノサイトから有棘ケラチノサイトにかけて核内に存在し、顆粒細胞で消失し、核の消失は終末分化の際に起こることが示された。ＡＤ患者の表在性表皮内には、ＩＣＡＤの強い免疫染色が斑状部位に示された。これらの領域は若干粗い表面を有し、半透明性が低い。まさにこれらの領域上に、ＰＩ陽性な、未消化の核の集合が共局在していた。他の領域が抗ＩＣＡＤ抗体で染色されることはなかった。また、ＡＤ患者の皮膚からのテープストリッピング試料はインタクトなＩＣＡＤタンパク質の存在を示したが、健常人の抽出物中では検出されることはなかった。これらの結果は、ＩＣＡＤが終末分化の際の脱核プロセスに関与していることを示唆する。
正常な表皮ではＳＣＣＡ−１はほとんど発現されない。他方、乾癬表皮、口腔粘膜及び食道においては、強い発現が報告されている（Ｔａｋｅｄａ Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１１８，１４７−５４（２００２））。興味深いことには、これらの組織には不全角化が伴っている。本発明者は、不全角化部位にはＳＣＣＡ−１の強い染色も見いだされることを明らかにした。さらに、ＳＣＣＡ−１及びＩＣＡＤは、核の集合が存在する箇所と同じ部位に常に共局在していた。ＳＣＣＡ−１又はＩＣＡＤが陰性である他の表皮表面部分はなかったので、不全角化部位におけるこれらの分子の共局在は、これらの分子が脱核プロセスの抑制に関与することを示唆する。パン−カスパーゼインヒビターＶＡＤ−ＦＭＫにより、皮膚等価モデルにおいて核が消失しなくなることが報告されている（Ｗｅｉｌ他、１９９９）。ＶＡＤ−ＦＭＫが最も強力なカスパーゼ−１４インヒビターの１つであるという本発明者の発見は、カスパーゼ−１４がおそらくこの反応における候補であるという可能性を高める。カスパーゼ−１４は、乾癬皮膚の不全角化部位内ではダウンレギュレートされ、また口腔表皮内には存在しない。口腔表皮では、核の消失は何らかの形で損なわれるか、或いは行われない（Ｌｉｐｐｅｎｓ ｅｔ ａｌ．，（２０００）、前掲）。興味深いことには、ＳＣＣＡ−１はこれらの組織内でアップレギュレートされる。おそらく、これらの分子の異常発現は、核の恒久的な存在などを含む、不完全な分化を引き起こすものと考えられる。
皮膚内のカスパーゼ−１４の活性化メカニズムは全体的によくわかっていない。皮膚又は皮膚等価モデルにおいてのみ活性化が観察され、細胞培養系では観察されない（Ｅｃｋｈａｒｔ Ｌ．ｅｔ ａｌ．（２０００）、前掲）。実際に、本発明者は種々の条件を試した。これらの条件には、血清の添加、集密になってからカルシウムの存在下もしくは非存在下での１４日目までの培養期間の延長、カルシウムイオノフォアＡ２３１８７による処理、又は多くの分化マーカーをアップレギュレートするのに十分な３０分間にわたる空気暴露を含む。これらの分化刺激は顕著なカスパーゼ−１４ｍＲＮＡ発現を誘導するものの、カスパーゼ−１４活性を引き起こすのに効果的な刺激はなかった（データーは示さない）。活性化プロセスは厳密に制御され、単層培養中で強く抑制される。層化及び空気暴露がその活性化に必要と思われる。カスパーゼ−１４の活性化は、アポトーシスプログラムによってではなく、分化プログラムによる制御を介して行われるのが明らかである。終末分化プロセス中には、セリン、システイン及びアスパラギン酸プロテイナーゼを含む多くのプロテイナーゼも活性化される。トリプシン様及びキモトリプシン様血清プロテイナーゼは、最も外側の角化細胞を脱落させる役割を演じることが示唆されている。システインプロテイナーゼの一部、例えばカテプシンＢ及びＬは分化されたケラチノサイト中でアップレギュレートされる。カテプシンＤ、アスパラギン酸プロテイナーゼもまた、角化細胞を脱落させる役割を演じることが示唆されている。これらの酵素は他の分化メカニズム、例えばカスパーゼ−１４の活性化に関与することがある。
以上をまとめると、本発明者は、ヒト角化細胞抽出物からカスパーゼ−１４を精製した。カスパーゼ−１４は核の消失を誘導し、この消失はアポトーシス様であるが、しかしケラチノサイト分化の最終段階でＩＣＡＤ分解を介して生じる区別可能な変化であることが強く示唆される。このプロセスはいくつかのアポトーシス性因子を共有するものの、これは損傷された細胞の排除を招く細胞死プロセスではなく、主要な役割であるバリアー機能のための構造全体を完成することを目的とした構成プロセスである。カスパーゼ−１４又はＳＣＣＡ−１の異常発現は分化プログラムに直接的に影響を及ぼし、その結果、不全角化及びバリアー機能崩壊が生じる。
２．皮膚角層細胞のＳＣＣＡの発現を指標とする、皮膚性状の評価材料と方法
（１）抗体
ＳＣＣＡ−１及び２の両者を認識するポリクローナル抗体は、乾癬表皮の鱗屑から精製したＳＣＣＡ（ＳＣＣＡ−１及びＳＣＣＡ−２）を用いて、ポリクローナル抗体を作製した。乾癬表皮の鱗屑抽出物（抽出液：０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），０．１４Ｍ ＮａＣｌ）を遠心後、上清をＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−２００，ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ，Ｍｏｎｏ Ｑ，Ｍｏｎｏ Ｓ，Ｍｏｎｏ Ｐ，Ｓｕｐｅｒｒｏｓｅ ６にて精製し、これを抗原として、ウサギを感作動物として用いた。
抗−ＳＣＣＡ−１モノクローナル抗体及び抗−ＳＣＣＡ−２モノクローナル抗体はＳａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＣＡ，ＵＳＡより入手した。
（２）免疫組織化学的検査
表皮生検をＡＭｅＸ手順（Ｓａｔｏ Ｙ．ｅｔ ａｌ．Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．，１２５，４３１−４３５（１９８６））に従い、冷却アセトンで固定してからパラフィンの中に包埋した。切片をキシレンで脱パラフィン処理し、アセトン、次いでＰＢＳで洗浄した。次にその切片の非特異的結合部位を１０％正常ヤギ血清（Ｈｉｓｔｏｆｉｎｅ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）でブロックした。
表皮切片を抗−ＳＣＣＡ−１モノクローナル抗体（１：５００に希釈）、上記のとおりに精製した抗−ＳＣＣＡ−２モノクローナル抗体（１：５００に希釈）又は抗−ＳＣＣＡポリクローナル抗体（１：５００に希釈）のそれぞれとインキュベーションした。ＰＢＳで洗浄後、切片をＤＡＫＯ Ｅｎｖｉｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＤＡＫＯ Ｃｏｒｐ．，ＣＡ，ＵＳＡ）で発色させた後に、ヘマトキシリンでカウンター染色して観察した。
（３）ＥＬＩＳＡ
皮膚角層試料は透明粘着テープ（セロテープ（登録商標）（ＮＩＣＨＩＢＡＮ））を皮膚表面に貼付したのち剥離するテープストリッピングにより採取した。皮膚角層の付着したこのテープを裁断、抽出バッファー（０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），０．１４Ｍ ＮａＣｌ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ−２０，１ｍｌ）に浸漬、超音波処理（２０ ｓｅｃ×４）にかけ、試料抽出液を作製した。
ＰＢＳに希釈したポリクローナル抗ＳＣＣＡ抗体（１：１０００に希釈）を１００μｌずつ、９６穴ＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに分注し、一晩室温におき、プレートの固相に結合させた。その後、プレートへの非特異的な結合を阻害するために、ブロッキング溶液（ブロックエースをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ ２０で希釈した溶液、３００μｌ／ウェル）にて１時間インキュベートした。
上記試料抽出液５０μｌをＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに添加し、３７℃で２時間反応させた。モノクローナル抗ＳＣＣＡ−１抗体（１：１０００に希釈）又はモノクローナル抗ＳＣＣＡ−２抗体（１：１０００に希釈）を添加して３７℃で１時間反応させた。次に、二次抗体、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗マウスを添加して３７℃で１時間反応させ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ−２０ ＰＢＳで洗浄後、基質３′，３′，５′，５′−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を添加して、ＴＭＢ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ＥＩＡ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｋｉｔ（ＢＩＯ−ＲＡＤ社）を用いて発色させ、６３０ｎｍで測定を行った。
（４）皮膚の経皮蒸散水分量（ＴＥＷＬ）の測定
検体（正常人の顔面及び内腕）のＴＥＷＬは、ＴＥＷＡｍｅｔｅｒ（ＴＭ１２０）を用いて測定を行った。
結果
（１）免疫組織化学的検査
図８は、表皮検体として、非露光部位（比較的日光に晒される機会の少ない部位）である上腕部（ヒト２４歳）、臀部（ヒト４６歳）、太腿部（ヒト７５歳）由来の表皮、及び露光部位（比較的日光に晒される機会の多い部位）である頬部（ヒト２０歳、７６歳）、目瞼（ヒト８２歳）由来の表皮を採取し、抗体としてＳＣＣＡ−１及びＳＣＣＡ−２の両者に結合する抗−ＳＣＣＡポリクローナル抗体を用い、顕微鏡観察した結果である。図８から、非露光部位と比べ、紫外線への暴露などといったより過酷な環境に常に晒されている露光部位の表皮上層においてＳＣＣＡが顕著に亢進していることがわかる。
図９は、正常表皮上層（５０歳男性）及び乾癬に罹った表皮上層のＳＣＣＡ−１及び２の発現を示す。図から明らかな通り、正常皮膚ではＳＣＣＡ−１及び２共に弱い発現しか示さないのに対し、炎症性不全角化症である乾癬に罹った皮膚では、ＳＣＣＡ−１及び２ともに顕著な発現を示した。
以上より、正常な皮膚角層に比べ、露光部位や不全角化の生じた皮膚部位においてＳＣＣＡの発現の顕著な亢進が認められた。
（２）ＥＬＩＳＡ
１）正常皮膚角層におけるＳＣＣＡ発現量
正常な皮膚性状を示す露光部位の皮膚（顔面及び頬部）及び正常な皮膚性状を示す非露光部位（内腕）に対しテープストリッピングを施すことでそれぞれの角層を採取し、ＳＣＣＡ−１及びＳＣＣＡ−２の発現量をＥＬＩＳＡにより測定した。その結果を図１０に示す。
非露光部位に比べ、露光部位でのＳＣＣＡ−１及び２の発現が顕著に亢進していることがわかる。従って、ＥＬＩＳＡ法により、正常な性状を示すとはいえ、過酷な環境に常に晒されている露光部位の表皮上層の方が、非露光部位と比べ、ＳＣＣＡ、特にＳＣＣＡ−１が顕著に亢進していることが定量的に判定できる。
２）乾癬皮膚角層におけるＳＣＣＡ発現量
正常な皮膚性状を示す個体の皮膚（非露光部位：内腕）及び乾癬に罹った患者の皮膚の各々に対しテープストリッピングを施すことでそれぞれの角層を採取し、ＳＣＣＡ−１及びＳＣＣＡ−２の発現量をＥＬＩＳＡにより測定した。乾癬に罹った患者の皮膚部位として、痒みを伴った被疹部位、痒みの伴わない被疹部位、及び無疹部位を試験した。その結果を図１１に示す。
正常個体の皮膚角層においてはＳＣＣＡ−１及び−２の発現はほとんど認められないのに対し、乾癬に罹った患者の被疹患部における角層では、痒みを伴うか伴わないかにかかわらず、ＳＣＣＡ−１及び−２の発現の顕著な亢進が認められた。なお、乾癬患者でも、乾癬症状の認められない皮膚部位（無疹部）においては、ＳＣＣＡ−１及び−２の発現はほとんど認められなかった。
３）アトピー性皮膚炎皮膚角層におけるＳＣＣＡ発現量
正常な皮膚性状を示す個体の皮膚（非露光部位：内腕）及びアトピー性皮膚炎に罹った患者の皮膚の各々に対しテープストリッピングを施すことでそれぞれの角層を採取し、ＳＣＣＡ−１及びＳＣＣＡ−２の発現量をＥＬＩＳＡにより測定した。アトピー性皮膚炎に罹った患者の皮膚部位として、被疹部位及び無疹部位を試験した。その結果を図１２に示す。
正常個体の皮膚角層においてはＳＣＣＡ−１及び−２の発現はほとんど認められないのに対し、アトピー性皮膚炎に罹った患者の患部における角層では、被疹部位であるか無疹部位であるかにかかわらず、ＳＣＣＡ−１及び−２の発現の顕著な亢進が認められた。従って、アトピー性皮膚炎の場合、アトピー性皮膚炎の発症前であっても、ＳＣＣＡ−１及び／又は−２を指標とすることで、その疾患の診断を行うことが可能である。このことは、ＳＣＣＡを指標とすれば、アトピー性皮膚炎の罹りやすさを判定でき、その予防又は早期（例えば発症前）対処が可能となる。
４）ＳＣＣＡ発現量と経皮蒸散水分量（ＴＥＷＬ）との相関
皮膚角層についてＥＬＩＳＡによりＳＣＣＡ発現量を測定するとともに、皮膚生理パラメーターとしてのＴＥＷＬも調べ、ＳＣＣＡ発現量とＴＥＷＬとの相関を調べた。その結果を図１２に示す。ＳＣＣＡ−１とＴＥＷＬとではＰｅａｒｓｏｎ相関係数が０．８７６であり、ＳＣＣＡ−２とＴＥＷＬとではＰｅａｒｓｏｎ相関係数が０．６００であり、ともに有意な相関が認められ、従ってＴＥＷＬが高く、肌の性状が比較的悪い状態のとき、ＳＣＣＡ−１及び−２ともに、特にＳＣＣＡ−１の発現量が高くなることがわかった。
５）花粉症皮膚角層におけるＳＣＣＡ発現量
正常な皮膚性状を示す個体の皮膚（コントロール）及び花粉症による肌荒れを患った患者の皮膚の各々に対しテープストリッピングを施すことでそれぞれの角層を採取し、花粉症皮膚における肌荒れとＴＥＷＬとの関係を調べるとともに、花粉症皮膚における肌荒れとＳＣＣＡ−１の発現量をＥＬＩＳＡにより測定した。皮膚部位として、内腕（非露光部）及び額（露光部）を選定した。
図１４は花粉症皮膚における肌荒れと、ＴＥＷＬとの関係（Ａ）、及びＳＣＣＡ１発現量との関係（Ｂ）を示す。この図から明らかなとおり、花粉症によりＴＥＷＬの有意な上昇が認められ、皮膚バリアー機能の低下が生じ、肌荒れ状態となった皮膚では、正常個体に比べ、ＳＣＣＡ−１の発現が顕著に亢進していることが認められた。従って、ＳＣＣＡ−１が花粉症による肌荒れの指標となることが明らかとされた。また、花粉症皮膚では、日光の当たらない内腕でもＴＥＷＬの悪化、即ちバリアー機能の低下が認められ、全身の炎症反応とＳＣＣＡの亢進が身体のバリアー機能を悪化させていることが示唆された。図１５は花粉症性皮膚における肌荒れ皮膚とＳＣＣＡ−１の発現亢進との相関関係を示す。ＳＣＣＡ−１とＴＥＷＬとではＰｅａｒｓｏｎ相関係数が０．８０８６であり、有意な相関が認められた。従って、花粉症により皮膚バリアー機能が低下し、即ち肌荒れ状態が悪化しているほど、ＳＣＣＡ−１の発現量が高くなることが明らかとなった。
従って、肌荒れの発症前であっても、ＳＣＣＡを指標とすれば、花粉症による肌荒れの罹りやすさを判定でき、その予防又は早期（例えば発症前）対処が可能となる。また、花粉症皮膚において不全角化が生じていることは全く新たな知見であり、花粉症皮膚におけるバリアー機能の悪化や不全角化がＳＣＣＡに起因していることは注目に値する。
［配列表］

Claims (5)

1. 皮膚角層細胞の扁平上皮細胞癌関連抗原（ＳＣＣＡ）の発現を指標とし、皮膚性状が、紫外線照射を原因とする皮膚老化、及び皮膚関連バリアー機能低下に伴う肌保湿力の低下による乾燥肌からなる群から選らばれる、皮膚性状の評価方法。
2. 皮膚角層細胞の扁平上皮細胞癌関連抗原（ＳＣＣＡ）の発現を指標とし、皮膚性状が、アトピー性皮膚炎を原因とする不全角化、及び花粉症による肌荒れからなる群から選らばれ、皮膚が上記性状を示す前にその性状の罹りやすさを予知する、皮膚性状の評価方法。
3. 前記ＳＣＣＡの発現を、ＳＣＣＡに特異的な抗体を使用する酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）により実施する、請求項１又は２記載の方法。
4. 前記皮膚角層試料がテープストリッピングにより採取されたものである、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
5. ＳＣＣＡがＳＣＣＡ−１である、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。