ES2594885T3 - Método para evaluar una enfermedad de la piel utilizando un antígeno relacionado con el carcinoma de células escamosas como medida - Google Patents

Método para evaluar una enfermedad de la piel utilizando un antígeno relacionado con el carcinoma de células escamosas como medida Download PDF

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Abstract

Un método para evaluar la susceptibilidad de una piel a una enfermedad de la piel seleccionada entre el grupo que consiste en: dermatitis atópica y rugosidad de la piel causada por la hipersensibilidad al polen, caracterizada porque se utiliza como marcador la promoción de la expresión del antígeno del carcinoma de células escamosas (SCCA) en las células del estrato córneo de la piel y se mide la expresión del antígeno del carcinoma de células escamosas (SCCA) en una muestra del estrato corneo de la piel.

Description

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Propiedades enzimáticas de la caspasa-14 purificada
Se examinaron las propiedades enzimáticas de la caspasa-14 purificada (Fig. 3 y 4). La caspasa-14 exhibió sensibilidad a una variedad de inhibidores de la caspasa incluyendo YVAD-FMK (inhibidor de la caspasa-1), VDVAD-FMK (inhibidor de la caspasa-2), DEVD-FMK (inhibidor de la caspasa-3), IETD-FMK (inhibidor de la caspasa-8), LEHD-FMK (inhibidor de la caspasa-9) y VAD-FMK (inhibidor de pan-caspasa) (Fig. 3). El DIEV-FMK no tenía prácticamente ningún efecto. El YVAD-FMK mostró el efecto inhibidor más potente contra la actividad de la caspasa-14. Esto es probablemente debido a la similitud estructural entre la caspasa-1 y la caspasa-14. El inhibidor de pan-caspasa VAD-FMK inhibió la actividad de la caspasa-14 a aproximadamente al mismo nivel que VAD-FMK. El ácido yodoacético (IAA), inhibidor específico de clase para cisteína proteasa o el inhibidor específico de clase fluoruro 4-(2-aminoetil) de bencenosulfonilo (AEBSF) para serin proteasa no mostraron efecto inhibidor significativo en las concentraciones de ensayo en este experimento.
Efecto de la caspasa-14 purificada en la descomposición de ICAD
Los presentes inventores evaluaron el efecto de la caspasa-14 sobre ICAD, en el curso de la búsqueda de los sustratos naturales de la caspasa-14, puesto que la desaparición de los núcleos es un evento muy importante para la diferenciación final. Cuando la caspasa-14 purificada se incubó junto con la proteína ICAD recombinante en un tampón de ensayo habitual de caspasa, el análisis por electrotransferencia de Western usando anticuerpos IgG anti-ICAD no mostró absolutamente ninguna de las actividades hidrolíticas de la caspasa-14 purificada por ICAD (Fig. 4A). En presencia de una sal cosmotrópica, sin embargo, la proteína ICAD intacta se redujo y se incrementaron los dos productos principales de descomposición, lo que indica que la caspasa-14 purificada tiene un efecto limitado sobre la descomposición de ICAD.
La caspasa-14 se inhibe por SCCA-1
A pesar de queSCCA-1 pertenece a la superfamilia de la serpina, inhibe a las cisteína proteasas tales como la papaína y catepsina L (Takeda A. et al., Biol. Chem. 383, 1231-6 (2002)). Esto indica que SCCA-1 es un inhibidor dual inherente similar a Crm-A32. Por tanto, los presentes inventores probaron si SCCA-1 puede o no inhibir los miembros de las caspasas. Se utilizaron condiciones cosmotrópicas para la caspasa-14. Cuando las caspasas activas recombinantes se incuban junto con el SCCA-1, ningún miembro de las caspasas (1-10) se vio afectado en la actividad enzimática. Sin embargo, SCCA-1 inhibió la actividad de la caspasa-14 contra WEHD-MCA de una manera dependiente de la dosis (Fig. 4C). SCCA-1 también inhibió la descomposición de ICAD por la caspasa-14. La actividad de la enzima no se recuperó incluso con una incubación mas prolongada. Esto sugiere una unión fuerte entre la caspasa-14 y SCCA-1 (Fig. 4B).
La localización de caspasa-14 activa y de células TUNEL positivas
Con el fin de determinar si la caspasa-14 está implicada o no en el proceso de desnucleación, los presentes inventores llevaron a cabo la doble tinción de la caspasa-14 activa y TUNEL. Como se muestra en la Fig. 5A, la caspasa-14, que incluye la proforma y la forma activa se localizó tanto en las células escamosas cornificadas como en las células epidermis humana normales. Esto está en concordancia con los hallazgos anteriores (Lippen S. et al., (2000), ibid). La caspasa-14 activa que se detectó con el anticuerpo h14D146 se limita a algunas células cornificadas y granulocitos (Fig. 5B). La mayoría de las células cornificadas se tiñeron de forma ubicua. Se observaron células TUNEL positivas justo debajo de la capa cornificada, pero la mayoría de estas células positivas estaba altamente confinadas (Fig. 5C). Curiosamente, las células TUNEL positivas estaban completamente localizadas junto a las células positivas para h14D146. Esto sugiere que se había producido la fragmentación del ADN en las células, y que la caspasa-14 activa está implicada en el proceso.
Co-localización de ICAD y SCCA-1 en los núcleos de paraqueratosis
En secciones transversales del epitelio humano normal, el uso del anticuerpo FL331 demuestra que la mayor parte de ICAD esta localizado en los núcleos de células basales y de células suprabasales. Los citoplasmas resultaban débilmente positivos tanto en células basales como en las células granulares. La inmunorreactividad para ICAD en la capa córnea se redujo drásticamente. Esencialmente se han encontrado los mismo resultados incluso cuando se utiliza el anticuerpo DFF45/ ICAD Ab-2 específico del péptido N-terminal (datos no mostrados). Cuando la capa cornificada superficial del paciente AD se tiñó con anticuerpos anti-ICAD (FL-331), zonas de agrupaciones de diversos tamaños resultaron positivas para el anticuerpo (Fig. 6B). La tinción nuclear con PI indica que los núcleos paraqueratósicos estaban siempre presentes en las zonas como islas (Fig. 6C). El campo claro de la capa cornificada superficial mostró una superficie rugosa muy irregular (Fig. 6D). La imagen superpuesta mostró concordancia entre los sitios paraqueratósicos y los sitios positivos para ICAD (Fig. 6E y 5F). Estos resultados sugieren que la descomposición de ICAD es necesaria para la eliminación de los núcleos en la diferenciación terminal.
En el caso de la piel normal, se detecta un nivel muy bajo de SCCA-1 en la capa granular. También se observó inmunotinción con una distribución irregular significativamente alta de los sitios positivos en la capa córnea superficial con AD activa (Fig. 7H). Del mismo modo, las zonas positivas para SCCA-1 coincidían con la capas de núcleos positivos para PI, es decir, los sitios de paraqueratosis (Fig. 7J-L). Para resumir los resultados, el sistema
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2. Evaluación de enfermedades de la piel como un indicador de la expresión de SCCA por las células del estrato córneo de la piel
Materiales y métodos
(1) Los anticuerpos
Se prepararon anticuerpos policlonales que reconocen tanto SCCA-1 y 2 usando SCCA (SCCA-1 y SCCA-2) purificado a partir de las escamas de la epidermis psoriásica. Después de centrifugar los extracto de escamas de la epidermis psoriásica (extracto: 0,1 M Tris-HCl (pH 8,0), 0,14 M NaCl), el sobrenadante se purificó con Sephacryl S200, DEAE Sepharosa, Mono Q, Mono S, Mono P, Superosa 6 y se usó como antígeno para la inmunización de conejos.
El anticuerpo monoclonal anti-SCCA-1 y el anticuerpo monoclonal anti-SCCA-2 se obtuvieron de Santa Cruz Biotechnology, CA, EE.UU.
(2) Examen inmunohistoquímico
Los especímenes de epidermis se fijaron con acetona fría y después se incluyeron en parafina, de acuerdo con el protocolo de Amex (Sato Y. et al. Am. J. Pathol., 125, 431-435 (1986)). Las secciones se desparafinaron con xileno y se enjuagaron con acetona y después con PBS. Los sitios de unión no específicos de las secciones se bloquearon con 10% de suero de cabra normal (Histofine, Tokio, Japón).
Las secciones de epidermis fueron incubadas con un anticuerpo monoclonal anti-SCCA-1 (dilución 1:500), con un anticuerpo monoclonal anti-SCCA-2 (1: 500 dilución) purificado como se describió anteriormente o con un anticuerpo policlonal anti-SCCA (dilución 1:500). Después de enjuagar con PBS, las secciones se colorean con un Sistema Envision de DAKO (DAKO Corp., CA, EE.UU.) y posteriormente se realizas la contratinción con hematoxilina y se observa.
(3) ELISA
Las muestras del estrato córneo de la piel se obtuvieron mediante cintas adhesivas, en donde la cinta adhesiva transparente (Cellotape <> por Nichiban) fue adhiere a la superficie de la piel y luego se despega. Después de adherirse al estrato córneo de la piel, la cinta se corta, se sumerge en un tampón de extracción (0,1 M Tris-HCl (pH 8,0), 0,14 M NaCl, 0,1% Tween-20, 1 ml), y se sometió a tratamiento con ultrasonidos (20 sec x 4) para preparar un extracto de la muestra.
Se dispensó el anticuerpo policlonal de SCCA diluido con PBS (dilución 1: 1000) 100 l en cada pocillo de una placa de ELISA de 96 pocillos y se dejó reposar durante la noche a temperatura ambiente para la unión a la fase sólida de la placa. Con el fin de inhibir la unión no específica a la placa, se realizó una incubación durante 1 hora con una disolución de bloqueo (disolución de Blockace diluida con PBS-Tween 20, 300 l / pocillo).
Se añadieron 50 l de extracto de la muestra a cada pocillo de la placa de ELISA, y la reacción se llevó a cabo a 37º C durante 2 horas. Se añadió el anticuerpo monoclonal de SCCA-1 (dilución 1:1000) o el anticuerpo monoclonal de SCCA-2 (dilución 1:1000) y la reacción se continuó a 37º C durante 1 hora. A continuación, se añadió el anticuerpo secundario anti-ratón marcado con peroxidasa de rábano picante para su reacción a 37º C durante 1 hora, y después de enjuagar con 0,1% de Tween-20 PBS, se añadió tetrametilbencidina (TMB) a los 3', 3', 5', 5', se utilizó un kit de sustrato TMB de EIA Peroxidase (BIO-RAD) para colorear, y la medición se realizó a 630 nm.
Medición de la pérdida de agua transepidérmica (TEWL)
La medida de TEWL de los ejemplares (cara humana y parte interna del brazo sanos) se llevó a cabo utilizando un TEWAmeter (TM120).
Resultados
(1) Examen inmunohistoquímico
La Fig. 8 muestra los resultados de la observación al microscopio de los especímenes de la epidermis de la parte superior del brazo (humano, de 24 años), de la cadera (humano, de 46 años de edad) y del muslo (humano, 75 años de edad) como zonas no expuestas (zonas que están expuestas a la luz solar relativamente con poca frecuencia), y de los especímenes de la epidermis de la mejilla (humanos, edades 20, 76) y del párpado (humano, 82 años) como zonas expuestas (zonas que están expuestas a la luz solar con relativa frecuencia), utilizando como anticuerpo el anticuerpo policlonal anti-SCCA que se une a SCCA-1 y a SCCA-2. De la Fig. 8 se aprecia que SCCA aumentaba significativamente en la epidermis superior de las zonas expuestas que están constantemente expuestas a condiciones más duras, tales como los rayos ultravioleta, en comparación con las zonas no expuestas.
La Fig. 9 muestra la expresión de SCCA-1 y 2 en la epidermis superior normal (50 años de edad, hombre) y en la epidermis superior psoriásica. Como muestran claramente estas fotografías, SCCA-1 y 2 se expresaron sólo
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