TWI434039B - 以鱗狀細胞癌抗原為指標之皮膚性狀評估方法 - Google Patents

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Description

以鱗狀細胞癌抗原為指標之皮膚性狀評估方法
本發明係提供一種皮膚狀態之評估方法，其中以細胞之鱗狀細胞癌抗原(Squamous Cell Carcinoma Antigen，以下稱為"SCCA")為指標。
若皮膚進行正常角質化，則會產生於角質細胞中核消失之所謂"脫核"現象。表皮角質化細胞於基底層中增殖，且轉移至上層，於成熟後成為角質層。然而，例如於患有所謂牛皮癬或異位性皮膚炎之皮膚病而無法進行正常角質化之粗糙皮膚中，角質細胞中之核並未消失而殘留，角質細胞以有核之未成熟狀態存在於角質層中，此稱為"不完全角質化"。雖然不完全角質化現象早已知曉，但對於發生不完全角質化之機制或生物化學指標方面尚不知曉。
鱗狀細胞癌抗原(SCCA)係自鱗狀癌細胞中取出之抗原，於子宮頸部、肺、食道、皮膚之鱗狀細胞癌中顯示有較高之血液濃度，常用於鱗狀細胞癌之診斷(H.Kato等人，Cancer 40：第1621-1628頁(1977)；N.Mino等人，Cancer 62：第730-734頁(1988))。特別是，由於SCCA之血中濃度較好地與鱗狀細胞癌之進行階段、惡性度、腫瘤大小等相關，故而不但對於癌症早期發現而且對於癌治療效果評估或可能復發之診斷等，係特別有效之癌症指標。
又，已知，發現於牛皮癬表皮之上層中SCCA之表現亢進(Takeda A.等人，J.Invest.Dermatol.(2002)118(1)，第 147-154頁)。牛皮癬係皮膚病之一，現有以表皮細胞之增殖/分化異常及炎症細胞浸潤為其特徵之慢性、復發性炎症性不完全角質化症即牛皮癬。一般認為牛皮癬係由於遺傳因素中加上各種環境因素而發病(Hopso-Havu等人，British Journal of Dermatology(1983)109，第77-85頁)。
SCCA係由在染色體18q21.3上縱向排列之兩個基因SCCA-1及SCCA-2基因所編碼。由其等基因所編碼之蛋白質、SCCA-1及SCCA-2均係分子量約45000之蛋白，顯示出較高之同源性，以核酸水準表示其同源性為95%。該等SCCA屬於卵白蛋白-絲胺酸蛋白酶抑制劑(ov-serpin)族。ov-serpin於serpin(絲胺酸蛋白酶抑制物)超家族中亦具有其獨特之特徵。一般而言，serpin被分泌後於細胞外發揮作用，但ov-serpin係主要於細胞內亦可發揮作用之蛋白酶酶抑制劑。
SCCA1係木瓜酶(papain)樣半胱胺酸蛋白酶抑制劑，SCCA2係胰凝乳蛋白酶(chymotrypsin)樣絲胺酸蛋白酶抑制劑，儘管同源性高，但由於反應部位之胺基酸排列不同，故而亦具有不同之特性(Schick等人，J.Biol.Chem.(1997)27213，第1849-55頁)。雖已知由於牛皮癬等疾病或UV(紫外線)而導致SCCA-1及SCCA-2高表現，但其等與皮膚性狀有何關係尚不明瞭。
本發明者進行以闡明與SCCA相關之表皮生理學機制為目的之研究時發現，SCCA於牛皮癬等之產生不完全角質化 之皮膚中特異性地亢進，且SCCA係包含不完全角質化在內之皮膚粗糙性狀之一原因。因此，本發明者決定將SCCA之表現作為皮膚性狀之指標，且最終完成本發明。
本發明係提供一種皮膚性狀之評估方法，其係將皮膚角質層細胞之鱗狀細胞癌抗原(SCCA)，具體為SCCA-1及/或SCCA-2特別是SCCA-1之表現作為評估之指標。較好的是，上述SCCA之發現，係藉由使用SCCA特異性抗體之酶連結免疫分析法(ELISA法)而實施。於更好的實施方式中，上述皮膚角質層試料，係藉由帶式剝離而獲得者。
根據本發明之方法，可於生物化學水準對皮膚性狀，即皮膚粗糙狀態、不完全角質化狀態等進行判定。作為根據本發明之方法而判定之皮膚或皮膚性狀，可列舉：皮膚粗糙，例如由紫外線照射所導致皮膚老化、伴隨皮膚障壁功能下降之皮膚保濕能力下降所導致之皮膚乾燥、由牛皮癬或異位性皮膚炎所導致之不完全角質化、花粉症所導致之皮膚粗糙等各種性狀。
SCCA係如上述之於牛皮癬或UV照射皮膚中表現亢進之分子量約為45000之蛋白質。SCCA-1及SCCA-2之胺基酸排列以及將其等加以編碼之核酸排列，記載於Takeda A等人，J.Invest.Dermatol，118，第147-154頁(2002)(上述)中。
本發明之SCCA表現之測定，可依照可測定SCCA之任意方法，進行定量或定性測定。具體而言，利用SCCA特異性抗體之免疫測定方法，例如可列舉：利用酶標記之ELISA 法、利用放射性標記之RIA法、免疫比濁法、西方墨點法(westernblot)、乳膠凝集法、紅血球凝集法等各種方法。免疫測定法之方式，可列舉：競爭性結合法或三明治法。此外，SCCA之表現量之測定，亦可藉由測定於將其編碼之基因之細胞內被表現之量而進行。於此情形時，較好的是，藉由測定編碼細胞內之SCCA之mRNA之量而決定SCCA之表現。mRNA之萃取量之定量或定性測定，亦可依照業界所周知的例如PCR法、3SR法、NASBA法、TMA法等各種眾所周知的方法施行。另外，SCCA之表現，可藉由原位雜交法或經由其生物活性之測定而加以定性確定。
可以任意方法施行成為受檢體之皮膚角質層試料之採集，但就簡便性觀點而言，較好的是帶式剝離法。所謂帶式剝離，係指藉由將膠帶片貼附於皮膚表層且將其剝離，使皮膚角質層附著於所剝離之膠帶上而採集角質層試料之方法。若利用帶式剝離法，則僅採集一片角質層即可測定SCCA之表現，從而使得以SCCA作為指標之非侵害性皮膚粗糙、不完全角質化之評估方法成為可能。較好的帶式剝離方法係依照下述而進行，首先將皮膚表層以例如酒精等加以淨化以除去皮脂、污垢等，將切成適當大小(例如2×5cm)之膠帶片輕置於皮膚表面上，對全部膠帶施加均等之力將其壓平，其後以均等之力將膠帶剝離。膠帶可為市售之玻璃紙膠帶(Cellophane Tape)等，例如可使用Scotch Superstrength Mailing Tape(3M公司製造)、Cellophane Tape(Cellotape(註冊商標)，Nichiban有限公司)等。附著於 膠帶上之皮膚角質層試料中之SCCA，可藉由將膠帶片含浸於適當萃取液例如Tris-buffer(pH 8.0)(0.1M Tris-HCl，0.14M NaCl，0.1% Tween-20)中且萃取角質層，而自膠帶中分離/萃取出。
於本發明之較好的實施方式中，SCCA係藉由免疫測定方法，例如ELISA法進行測定。ELISA法中所使用之SCCA特異性抗體，既可為單株抗體亦可為多株抗體。單株抗體或多株抗體之製作方法為業界所熟知，例如記載於Lunstrum等人，J Biol.Chem.1986,261：第9042-9048頁；Hurle等人，J Cell Science 1994,107：第2623-2634頁中。
本發明之方法中，尤其好的是三明治免疫測定法。三明治免疫測定方法，例如可以如下之方式而實施。
將2種SCCA特異性抗體之一種作為初級抗體而固定於載體上。作為載體，較好的是固體載體，例如可列舉：可使用於免疫測定法中之作為固體載體而常用之任意載體，例如除成形為任意大小及形狀之苯乙烯或聚苯乙烯等高分子載體之外，還有該等以適當材料成形之反應容器，例如可列舉：ELISA培養皿之孔之內壁等。
對於上述初級抗體於載體上之固定化，可依照常用方法而進行，例如可藉由將上述初級抗體溶解於緩衝液，例如磷酸緩衝食鹽水(PBS)、硼酸緩衝液等中，使其被載體所吸附，而加以固定。又，例如亦可將與上述初級抗體結合之抗體或其他蛋白質(例如蛋白質C)預先固定於載體上，且使其與上述初級抗體接觸等。進而，為抑制非特異性結合， 較好的是於如此方式固定初級抗體之載體中，添加適當之阻斷劑(例如PBS-BSA)或市售之阻斷劑(例如Blocking solution(大日本製藥))，於約4至40℃、較好的是20至37℃下，藉由培養5分鐘至數日、較好的是10分鐘至24小時、更好的是10分鐘至3小時，而進行阻斷。
使用二級抗體，將上述2種SCCA特異性抗體之其他抗體進行標記。作為標記，可列舉：酶標記、放射線標記、螢光標記等。於進行酶標記之情形時，可使酶直接結合於二級抗體上而進行標記，或經由例如如同卵蛋白-生物素之相互反應性蛋白質而間接地以酶進行標記。酶對抗體等之結合，例如可藉由使用市售之硫醇導入基試劑，將硫醇基分別導入酶及應標記之抗體等中再將兩者進行S-S鍵合，而進行。作為酶，可列舉：辣根過氧化酶(Horseradish peroxidase)、鹼性磷酸酶、β-D-半乳糖酶(Galactosidase)等。於酶之檢測中，可使用對該酶為特異性基質。例如，於使用辣根過氧化酶之情形時，可使用TMB(3,3',5,5'-四甲基苯幷茚)或ABTS(2,2'--二[3-乙基苯幷噻唑啉磺酸鹽])等。
相關免疫測定，藉由將固定上述初級抗體之載體、上述標記之二級抗體、被檢試料混合且進行培養，使被檢試料中的SCCA與固定於載體上的初級抗體相結合，而使標記二級抗體與該SCCA分子結合。
如此般，標記化抗體於反映試料中之SCCA量之量下，經由固定於載體上之初級抗體及來自試料之SCCA，而固定於載體上。相關培養，係在適當緩衝液(例如PBS)中，於約4 至40℃下，較好的是於20至37℃下，進行5分鐘至數日，較好的是10分鐘至24小時，更好的是10分鐘至3小時之培養。
其次，進行自上述載體中分離未結合之標記化抗體之操作。於載體為固體載體之情形時，可藉由固液分離而簡單地進行該分離操作。於使用一定的已知量之標記二級抗體之情形時，可對結合於載體上之標記或未結合之標記或者該兩者進行測定。另一方面，於使用任意標記抗體之情形時，對結合於載體上之標記進行檢測、測定。對於檢測結合於載體上之標記，較好的是以清洗液，例如以加入適當表面活性劑之緩衝液(例如PBS-Tween20)清洗載體，於除去未結合之標記化抗體後再進行檢測。檢測可視標記種類而依照常用方法進行。
以下，列舉具體例更具體地說明本發明。再者，本發明並非限定於此者。
實施例 1. SCCA與不完全角質化之關係之闡明 材料及方法 材料
Ac-WEHD-MCA，Ac-YVAD-MCA，Ac-VDVAD-MCA，Ac-DEVD-MCA，Ac-VEID-MCA，Ac-IETD-MCA，Ac-LEHD-MCA係購自Peptide Institute，Inc.(日本，大阪府)。
苄氧羰基(Z)-YVAD-FMK、Z-VDVSD-FMK、Z-DEVD-FMK、Z-VEID-FMK、Z-IETD-FMK、Z-LEHD-FMK及Z-VAD-FMK係購自BioVision(Mountain View，CA)。重組蛋白水解 酶-1~10，係自BIOMOL Research Labs，Inc.(Plymouth Meeting，PA)獲得。
為檢測蛋白水解酶-14之原形以及大次單位，而使用H-99抗體(Santa Cruz Biotechnology，Inc)。H-99抗體，係與人蛋白水解酶-14之胺基酸24-122相對應之肽所產生的抗體，因此可與蛋白水解酶-14之原酶以及其被加工之形態即其大次單元產生反應。
為檢測蛋白水解酶-14之小次單元之，而使用C-20抗體(Santa Cruz公司)。裂解部位特異性抗體(hl4D146 )，係藉由使用與人蛋白水解酶-14之推定加工部位相當之合成五肽TVGGD以使兔免疫，而製成。
WEHD-MCA水解活性之測定
對Mikolajczyk J.等人，Biochemistry 43，第10560-9頁(2004)中所揭示方法作些許改變，以Ac-WEHD-MCA作為基質，而測定蛋白水解酶-14之活性。簡言之，即自45μL之0.1M之HEPES緩衝液(pH 7.5)、0.06M之NaCl、0.01%之CHAPS、5mM之DTT、1.3M之檸檬酸鈉及10μM之WEHD-MCA來製造分析混合物(全部以最終濃度表示)。於該混合物中添加酶試料(5μl)，且將其培養10~30分鐘。以150μl之0.1M一氯醋酸使反應停止，繼而使用Fluoroskan Ascent FL(Thermo Electron Co.，Wolsam，MA)藉由355nm之激發波長及460nm之發光波長進行測定。於抑制劑分析之情形時，藉由於室溫下於分析緩衝液中將蛋白水解酶-14及肽抑制劑進行15分鐘培養，繼而添加5μl之100μM之WEHD- MCA，而開始分析。
蛋白水解酶-14之純化
使用玻璃均質機，以含有0.14M之NaCl之0.1M之Tris-HCl(pH 8.0)對取自健康人腳踝之人角質化細胞(約14g)進行萃取。以15000g進行60分鐘離心分離後，獲得上清液。以Amicon Ultra(Millipore，MA)進行濃縮，以快速脫鹽(Fast Desalting)管柱HR10/10(Amersham Biosciences公司)進行脫鹽後，再將粗生成物塗布於HiPrep 16/10 Q XL管柱中。以20mM之Tris-HCl(pH 8.0)將管柱洗淨，繼而以0至1M之線性NaCl梯度將其溶離。對於溶離分，藉由使用抗蛋白水解酶-14抗體(H-99)(Santa Cruz Biotechnology，CA)及hl4D146 抗體之西方墨點法，而追蹤溶離分。又，於各溶離分中，測定Ac-Tyr-Glu-His-Asp-甲基-香豆素醯胺(WEHD-MCA)(Peptide Institute，Inc.日本大阪)之水解活性。將顯示為陽性之溶離分負載於以相同緩衝液使其平衡之Mono Q管柱中，以最大為1M之NaCl梯度使其溶離。進而藉由Mono S陽離子交換層析法將蛋白水解酶-14之溶離分加以分離。以20mM之乙酸緩衝液(pH 4.5)將管柱平衡，繼而以0~1M之NaCl梯度使其溶離。濃縮顯示陽性之溶離分，繼而將其負載於以25mM乙醇胺(pH 8.3)加以平衡之色譜聚焦法Mono P管柱中。一面使用46ml之Polybuffer(pH 5.0)形成pH 8至5之pH梯度，一面進行溶離。使用Superdex 75凝膠層析法進行蛋白水解酶-14之最終純化。以BioRad Protein Assay Kit(BioRad Lab，Hercules公司，CA)決定蛋白質濃度。
重組蛋白水解酶-14及SCCA-1之製備
藉由使用順方向引子：AGGATCCAATCCGCGGTCTTTGGAAGAGGAG(序列編號1)以及逆方向引子：TTTCTGCAGGTTGCAGATACAGCCGTTTCCGGAGGGTGC(序列編號2)之PCR，而使得編碼蛋白水解酶-14於cDNA自角質形成細胞cDNA中分離/放大。將PCR生成物於pQE-100 DoubleTag載體(Qiagen，Valencia，CA)中進行選殖，繼而於E.coli JM109中使其表現。
自牛皮癬cDNA基因庫(Takeda A等人，J.Invest.Dermatol.,118，第147-54頁(2002))中分離出SSCA1 cDNA，繼而將其於pQE30載體(Quiagen公司)中進行選殖。以Ni-NTA Agarose(Quiagen)及Mono Q層析法純化重組蛋白質。
免疫組織化學
在患者同意基礎上，藉由整形外科手術獲得人頭皮試驗片。以磷酸緩衝液(pH 7.4)中之4%三聚甲醛(PFA)將組織固定，將其包埋於石蠟中。製備薄切片，繼而於4℃下與適當抗體一起培養一夜。將過氧化酶-羊抗兔IgG結合物(Nichirei公司製造)作為二級抗體使用，使其與作為發色試劑之DAB反應。
於進行TUNEL陽性細胞及活性蛋白水解酶之雙重免疫檢測之情形時，將Texas Red(註冊商標)色素-抗兔IgG結合物(驢)作為二級抗體使用。TUNEL反應，係使用螢光素原位細胞凋亡檢測試劑盒(Roche Diagnostics)，且依照其製造商 提供的說明書而施行。
於進行ICAD之西方墨點分析及免疫組織化學分析之情形時，使用抗ICAD IgG(FL331，Santa Cruz Biotechnology公司)及DFF45/ICAD Ab-2(NeoMarkers，Fremont公司，CA)。
有報告稱，於活動性異位性皮膚炎(AD)患者之皮膚內，往往可觀察到已簇化之不完全角質化(Sakurai K.等人，J.Dermatol.Sci.30，第37-42頁(2002)；Piloto Valdes,L.等人，Allergol.Immunopathol.(Madr)18，第321-4頁(1990))。於本實驗中，使用非侵害性方法，調查於不完全角質化性皮膚中之ICAD及SCCA-1之局部存在。自AD或健康志願者之皮膚中採集淺表性角質化層，繼而使用醫療用黏接劑Aron Alpha A(Sankyo公司，Tokyo)以使其附著於玻璃載片上。若以3%多聚甲醛將其固定後，使0.1%之Triton X-100浸透於試料中，繼而以抗ICAD或抗SCCA-1抗體將該試料於4℃下進行一夜之免疫染色。分別將Alexa Fluor 400結合型抗兔(ICAD)或抗小鼠IgG(SCCA-1)作為二級抗體，經1小時後於室溫下使用。為使核酸可視化，將試料浸漬於0.1%碘化吡啶溶液中達5分鐘，繼而以PBS清洗3次。使用用於螢光觀察之Leica DMLA顯微鏡。
西方墨點法分析
藉由SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳法，以5~20%梯度之凝膠將蛋白質分離。於電泳後，將蛋白質轉錄於聚二氟亞乙烯膜(Immobilon-P、Millipore，Bedford，MA)上，繼而與含有H-99，hl4D146 或C20之抗蛋白水解酶-14抗體一起培養。以 過氧化物酶標記之抗兔IgG(Sigma公司)或抗羊IgG作為二級抗體使用，繼而藉由使用ECL-plus(Amersham公司)之化學發光法而使免疫反應性蛋白質可視化。
結果 以Asp146 加工角質化細胞中之蛋白水解酶-14
若根據西方墨點分析，對於H-99抗體僅檢測出角質化細胞萃取物中之17KDa之帶(圖2)。該結果與包含未經加工之30KDa形態之取自全皮膚或皮膚等效模型之萃取物之結果並不一致。該17KDa帶，被推斷為亦被hl4D146 抗體(圖2B)所識別之活性蛋白水解酶-14(pl7)之大次單元。該情形表明，蛋白水解酶-14之成熟，係藉由於最終分化之最終階段藉由Asp146 之開裂而達成。進而，於皮膚等效模型中，30KDa之帶亦可被H-99及hl4D146 抗體所識別，該情形表面於Asp146 中之切斷。
自角質化細胞萃取物中製備蛋白水解酶-14
角質化細胞中之蛋白水解酶-14之大部分，係經加工之形態，因此推斷其係以活性型存在(Eckhart L.等人，J.Invest.Dermatol.115，第1148-51頁(2000)；Lippens S.等人，Cell Death Differ.7，第1218-24頁(2000)；Mikolajczyk，J.等人，Biochemistry 43，第10560-9頁(2004))，一般認為人角質化細胞係優異之蛋白水解酶-14純化源。然而，亦已知人角質化細胞中含有類蛋白水解酶-1酶(Takahashi T.，J.Invest.Dermatol.111，第367-72頁(1998))。蛋白水解酶-1之基質(例如WEHD-基質)，可被蛋白水解酶-1及蛋白水解酶-14兩者 水解。本發明者首先於1.3M檸檬酸鈉及5mM二硫代蘇糖醇之有無下，進行蛋白水解酶-1針對WEHD-MCA之水解試驗。有人確認WEHD-MCA不僅於標準蛋白水解酶試驗緩衝液中係蛋白水解酶-1之優異基質，而且於cosmotrophic離子存在下，蛋白水解酶-1無法水解該基質(未顯示資料)。因此，以針對WEHD-MCA之水解活性、針對H-99之反應性、及hl4D146 抗體之3個方法，分別對各溶離分進行了評估。表1表示連續層析法之結果。於使用HiPrep Q管柱進行最初之陰離子交換層析法後，顯示收率有170%之上升，且比活性約上升10倍。一般認為，該上升可能係由內源性抑制劑之蛋白水解酶-14之隔離所造成。若根據西方墨點分析，則顯示有溶離分No.16~20中含有分子量17KDa之H-99陽性且含有14D146 陽性帶。亦發現該等溶離分具有WEHD-MCA水解活性。繼而於Mono Q陰離子交換層析法中，依照17KDa之H-99陽性及hl4D146 陽性帶存在之判定，溶離分No.25~No.29中含有被加工形態之蛋白水解酶-14。僅該等溶離分顯示出WEHD-MCA水解活性。Mono S陽離子層析法及Mono P色譜聚焦法主要對除去雜質蛋白質有效，繼而各自之比活性分別提高3.5倍及7倍。又，此處僅H-99陽性及hl4D146 陽性之溶離分顯示出WEHD-MCA水解活性。於使用Superdex 75層析法之最終階段，分離出分子量為30KDa之峰，該峰與WEHD-MCA水解活性峰相一致。SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳法顯示該製備物中含有17KDa及11KDa之片段。前者對H-99抗體及hl4D146 抗體兩者呈陽性，後者被C20抗體識別。 該情形說明，人蛋白水解酶-14係作為包含大次單元(17KDa)及小次單元(11KDa)之異形二聚物而得以純化。又，Superdex 75凝膠層析法與其他蛋白水解酶不同，從而表示人角質化細胞中之蛋白水解酶-14以如活化型顆粒溶解酶B之單體形式而存在。表1總結了蛋白水解酶-14之純度。以約100mg可溶性蛋白質萃取物為起始，獲得了11.8μg純化蛋白質。比活性上升764倍，收率為9.1%。
純化蛋白水解酶-14之酶特性
本發明者對純化蛋白水解酶-14之酶特性進行了研究(圖3~4)。蛋白水解酶-14對於各種蛋白水解酶抑制劑例如：YVAD-FMK(蛋白水解酶-1抑制劑)、VDVAD-FMK(蛋白水解酶-2抑制劑)、DEVD-FMK(蛋白水解酶-3抑制劑)、IETD-FMK(蛋白水解酶-8抑制劑)、LEHD-FMK(蛋白水解酶-9抑制劑)及VAD-FMK(全-蛋白水解酶抑制劑)具有敏感性(圖3)。再者，對於VEID-FMK幾乎無效。特別是YVAD-FMK對蛋白水解酶-14活性顯示出極強之抑制效果。一般認為該情形可能係由於蛋白水解酶-1與蛋白水解酶-14之間的構造相似性所致。全-蛋白水解酶抑制劑VAD-FMK與VAD-FMK以相同程度抑制蛋白水解酶-14活性。針對半胱胺酸蛋白酶之群特異性抑制劑即碘乙酸(IAA)，或針對絲胺酸蛋白酶之群特異性抑制劑即4-(2-胺基乙基)苯磺醯氟(AEBSF)，於該研究中於試驗濃度下並未顯示有意義之抑制效果。
純化蛋白水解酶-14對於ICAD分解之效果
於蛋白水解酶-14之天然基質之摸索中，本發明者試驗了針對ICAD之蛋白水解酶-14之效果。其原因為，核之消失對於最終分化係一極重要之現象。若於通常之蛋白水解酶試驗緩衝液中與重組ICAD蛋白質一起將純化蛋白水解酶-14進行培養，則根據使用抗ICAD IgG之西方墨點分析之判定，純化蛋白水解酶-14對於ICAD並未顯示出任何水解活性(圖4A)。但，於Cosmotrophic鹽之存在下，因完整之ICAD蛋白質減少且2個主要分解生成物增加，故表示出純化蛋白 水解酶-14對於ICAD有選擇性分解作用。
SCCA-1抑制蛋白水解酶-14
雖然SCCA-1屬於serpin(絲胺酸蛋白酶抑制物)超家族，但是可抑制半胱胺酸蛋白酶，例如木瓜酶及細胞自溶酶L(Takeda A.等人，Biol.Chem.383，第1231-6頁(2002))。該情形揭示，SCCA-1為如Crm-A32 之固有之跨群抑制劑。因此，本發明者對SCCA-1能否抑制蛋白水解酶之成員進行了試驗。於蛋白水解酶-14之情形時，採用了Cosmotropick條件。即使將重組活性蛋白水解酶與SCCA-1一起培養，蛋白水解酶成員(1~10)中之任意者亦於酶活性方面均不受任何影響。與此相反，SCCA-1以劑量依存方式抑制蛋白水解酶-14對於WEHD-MCA之活性(圖4C)。SCCA-1亦抑制蛋白水解酶-14對ICAD之分解。即使延長培養時間，亦未顯示酶活性之恢復。該情形說明，蛋白水解酶-14與SCCA-1有較強之結合(圖4B)。
活性蛋白水解酶-14及TUNEL陽性細胞之局部存在
為研究蛋白水解酶-14是否與脫核步驟相關，本發明者進行了對活性蛋白水解酶-14及TUNEL之二重染色。如圖5A所示，含有原形及活性型之蛋白水解酶-14局部存在於正常人表皮內之棘細胞至角質化細胞中。該情形與先前所見一致(Lippens等人，(2000)，上述)。以hl4D146 抗體檢測出之活性蛋白水解酶-14，僅限定於角質化細胞及粒細胞之一部分(圖5B)。幾乎全部之角質化細胞被普遍染色。雖然TUNEL陽性細胞可於緊貼角質化層之下側觀察到，但多數該等陽 性細胞明顯受到限制(圖5C)。很有趣的是，TUNEL陽性細胞僅與hl4D146 陽性細胞一起局部存在。該情形說明，於該等細胞中產生了DNA片段化，而活性蛋白水解酶-14與該步驟有關。
不完全角質化性核中之ICAD及SCCA-1之共同局部存在
於正常人上皮之縱剖面中，藉由使用FL331抗體，可知基底細胞及基底上細胞之核內主要是ICAD局部存在。細胞質於基底細胞至粒細胞中呈弱陽性。於角質化層中，針對ICAD之免疫反應性大幅降低。即使使用N末端之肽抗體DFF45/ICAD Ab-2，但事實上亦獲得相同之結果(未顯示資料)。於以抗ICAD抗體(FL-331)對AD患者之淺表性角質化層進行染色之情形時，各種大小之簇對該抗體顯陽性(圖6B)。使用PI之核染色顯示，不完全角質化之核常見於該等斑狀之島內(圖6C)。在淺表性角質化層之明視野中，顯示出有許多凹凸之粗糙表面(圖6D)。重疊圖像顯示，不完全角質化部位與ICAD陽性部位一致(圖6E及5F)。該等結果說明，於最終分化時，即使除去核但仍需要進行ICAD分解。
於正常皮膚之情形時，於顆粒層檢測出極低水平之SCCA-1(圖7G)。即使於患有活動性AD者之淺表性角質化層內，陽性部位之斑狀分佈亦可見明顯強之免疫染色(圖7H)。同樣地，SCCA-1陽性區與PI陽性核層即不完全角質化部位相一致(圖7J~L)。若對該等之結果進行總結則可說明，ICAD/CAD系在脫核過程中起主要作用，繼而SCCA-1作為抑制物與該反應有關。
討論
蛋白水解酶-14之大部分於表皮內得以表現，於其他組織內幾乎無表現(Van de Craen,M等人，Cell Death Differ.5，第836-46頁(1998))。根據先前之報告，角質形成細胞之最終分化係與蛋白水解酶-14之加工協同進行，該情形說明含有蛋白水解酶之蛋白酶活性亢進(Lippens，S等人，Cell Death Differ 7.第1218-24頁(2000)；Eckhart 1.Biochem.Biophys.Res.Commun.277，第655-9頁(2000)；Hu S.J.Biol.Chem 273，第29648-53頁(1988))。近期，Mikolajaczyk等人，(2004)前述)證實，顆粒溶解酶B、裂解蛋白水解酶-14於Cosmotropick鹽之存在下具有酶活性。於該研究中，本發明者為研究人蛋白水解酶-14於角質形成細胞分化之最終階段是否具有活性，嘗試進行了對來自完全分化之角質形成細胞中之蛋白水解酶-14進行純化。本發明者使用可分別識別大次單元、原形(H-99)(於Asp146 (hl4D146 )中具有推定蛋白水解酶裂解部位)及小次單元(C20)之3種抗體。最終製備物包含2個蛋白質帶，即被hl4D146 抗體識別之17KDa之蛋白質帶、及被C20抗體識別之11KDa之蛋白質帶。該等蛋白質帶，係活性蛋白水解酶-14之大次單元及小次單元。於純化步驟中，H-99陽性之17KDa帶與hl4D146 抗體一起被識別。該情形說明，大次單元終止於其羧基末端之Asp146 處。小次單元之胺基末端區域作為Lys153 -Asp-Ser-Pro-Gln而被鑒定，該情形說明，加工係於Ile152 與Lys153 之間進行。該部位作為蛋白水解酶成員，係奇特之裂解部位。該情形說明， 來自包皮萃取物之已免疫沈降之蛋白水解酶-14於相同部位被切斷，與Chien之其他發現(Biochem.Biophys.Res.Commun.2002 Aug 30；296(4)；第911-7頁)相一致。因此可得出以下結論：人蛋白水解酶-14作為高活性異形二聚物被均勻地純化。這說明蛋白水解酶-14之成熟，與2個部位Asp146 及Ile152 中之加工以及連接區Xxx147 及Ile152 內之6個殘基之去除有關。而且說明2個不同之裂解部位(一個為酸性，另一個為疏水性)之存在，蛋白水解酶-14之活化係藉由多個酶而以多階段進行。
純化蛋白水解酶-14之酶學特性極為獨特。純化蛋白水解酶-14對於已知的蛋白水解酶抑制劑顯示出較為廣泛之抑制劑感受性。特別是，蛋白水解酶1抑制劑YVAD-FMK顯示出最強之抑制作用。YVAD-FMK對於作為WEHD-MCA以及其他蛋白水解酶-1基質之YCAD-MCA顯示出最高活性。該情形說明，蛋白水解酶-1與蛋白水解酶-14之間存在密切關係。但，本發明者已確知，蛋白水解酶-14具有明顯不同之特性。本發明者初次闡明：SCCA-1係針對蛋白水解酶-14之內在性抑制劑。SCCA-1之最特異性之特性，係對於蛋白水解酶-14而言為顯著之特異性。蛋白水解酶1~10之其他成員並不受SCCA-1影響。於使用合成基質DEVD-MCA或天然基質ICAD時，SCCA-1並不抑制蛋白水解酶-3活性。這與Crm A形成對照。已知有，Crm A亦屬於serpin超家族，且可抑制包含蛋白水解酶-1及蛋白水解酶-8之多個蛋白水解酶(Gagliardini V.等人，Science 263，第826-8頁(1994))。已 知有，XIAP抑制蛋白水解酶-3，-7及-9(Srinivasula S.M.等人，Nature 410，第112-6頁(2001))。抗細胞凋亡性蛋白質p35抑制蛋白水解酶-1、-3、-6、-7、-8及-10，故而認為其具有更廣泛之範圍。該等抑制蛋白質Crm A、IAP及p35全部可抑制數個起始及執行蛋白水解酶之一部分，該情形說明該等分子與典型性細胞凋亡路徑之實行相關。另一方面，本發明者之結果強有力地說明，SCCA-1於通常之細胞凋亡現象中雖不為關鍵元素，但在以蛋白水解酶-14為媒介之脫核步驟中係重要之調節劑。
該步驟之分子機制尚未闡明。本發明者已明確，人蛋白水解酶-14於Cosmotropick鹽存在下可分解ICAD。ICAD(亦稱為DNA片段化因子"DFF45")係稱為活性蛋白水解酶型去氧核糖核酸水解酶(CAD)(或DFF40)之鎂依存性核酸內切酶之抑制劑。ICAD/CAD系在細胞凋亡性細胞死亡中之染色體DNA分解中起主要作用。與CAD結合之ICAD係作為非活性複合物形式而存在。蛋白水解酶-3對ICAD顯示出有限之蛋白質分解能力，且2個部位Asp117 及Asp224 處進行切斷。該切斷使CAD活化，且使DNA分解開始(Nagata S.Exp.Cell Res.256，第12-8頁(2000))。蛋白水解酶-3對於細胞凋亡時之大量細胞蛋白質之切斷並非必需，但對於ICAD之切斷則為必需(Tang D.等人，J.Biol.Chem.273，第28549-52(1998))。該情形揭示，蛋白水解酶-3對於DNA片段化極為重要，而其他執行蛋白水解酶即蛋白水解酶-6或7則不重要。令人感興趣的是，蛋白水解酶-14自ICAD中生成了類似12KDa及 35KDa之切斷片段。排列分析顯示係同一個裂解部位。該情形說明，蛋白水解酶-14可成為蛋白水解酶-3之完善替代物。蛋白水解酶-14可分解ICAD，然而由於下述原因而與原細胞凋亡蛋白水解酶-3明顯不同。第一，蛋白水解酶-14之過度表現並不誘發細胞凋亡性死亡(Van de Craen.Cell Death Differ.5，第838-46頁(1998))。該情形與蛋白水解酶-3形成對照。第二，蛋白水解酶-14在各種細胞凋亡性刺激下並不活化(Lippens等人，(2000)，前述)。起始蛋白水解酶或其他蛋白水解酶成員，無法對原蛋白水解酶-14進行加工。該情形與過去所見一致(Lippens等人，(2000)，上述)。活化僅於最終分化時產生(Eckhart L.等人，(2000)，上述)。第三，蛋白水解酶-14之合成，限定於成人組織中之分化中之角質形成細胞(Eckhart L.Biochem.Biophys.Res.Commun.277，第655-9頁(2000))。又，ICAD對蛋白水解酶-14之切斷能力，可以與蛋白水解酶-3顯著不同之方式進行調節。使用蛋白水解酶-14對ICAD進行分解，需要異常高濃度之Cosmotropick離子。於如此之離子濃度下，其他蛋白水解酶幾乎無活性。總體而言，一般認為，因蛋白水解酶-14以角質形成細胞分化程式來調節其活化，故其於蛋白水解酶成員中具有特殊之地位。
角質形成細胞最終分化中之ICAD/CAD系之關係，可藉由體內(in vivo)實驗進一步得到證實。免疫組織化學研究揭示，ICAD存在於由基底角質形成細胞至棘角質形成細胞核內，於粒細胞中消失，且核之消失發生於最終分化之時。 於AD患者之淺表性表皮內，於斑狀部位顯示出較強之ICAD免疫染色。該等區域具有若干之粗表面，且半透明性低。進而於該等區域上，共同局部存在有PI陽性之未消化核之集合。其他區域並不被抗ICAD抗體染色。又，取自AD患者皮膚之帶式剝離試料，雖顯示出完整ICAD蛋白質之存在，但並無可於健康人之萃取物中檢測出之情形。該等結果說明，ICAD與最終分化時之脫核步驟有關。
於正常表皮中，SCCA-1幾乎並不得以表現。另一方面，報告有其於牛皮癬表皮、口腔黏膜及食道中有較強表現(Takeda A.等人，J.Invest.Dermatol.118，第147-54頁(2002))。有趣的是，該等組織中伴有不完全角質化。本發明者瞭解到，於不完全角質化部位亦可見較強SCCA-1染色。進而，SCCA-1及ICAD常共同局部存在於與核之集合存在部位相同之部位處。由於SCCA-1或ICAD為陰性之其他表皮表面部分並不存在，故而於不完全角質化部位該等分子之共同局部存在說明該等分子與脫核步驟之抑制有關。有報告稱，藉由泛蛋白水解酶抑制劑VAD-FMK，於皮膚等效模型中核並不消失(Weil等，1999)。VAD-FMK為一種最強之蛋白水解酶-14抑制劑之本發明者的發現，提高了蛋白水解酶-14可於該反應中成為候補者之可能性。蛋白水解酶-14於牛皮癬皮膚不完全角質化部位內減量，且並不存在於口腔表皮內。於口腔表皮中，核消失或以任何形式損失或不進行。(Lippens等人，(2000)，上述)。有趣的是，SCCA-1於該等組織內被上調節。一般認為，該等分子之異常表現， 可能是由包含核之恆久存在等之不完全分化所引起。
皮膚內之蛋白水解酶-14之活化機制尚未充分知曉。僅於皮膚或皮膚等效模型中觀察到活化，而於細胞培養系中卻觀察不到(Eckhart L.等人，(2000)，上述)。實際上，本發明者試驗了各種條件。該等條件包含：血清之添加、聚集後於存在或不存在鈣之條件下培養至第14日之培養期之延長、使用鈣離子載體(calcium ionophore)A23187之處理、或雖有較多地向上調節分化標記但充分暴露於空氣中達30分鐘。該等分化刺激雖誘發顯著的蛋白水解酶-14 mRNA表現，但對引發蛋白水解酶-14活性卻無有效的刺激(未顯示資料)。活化步驟被嚴密控制，於單層培養中受到較強之抑制。可認為分層化以及暴露於空氣，對於其活化係必要者。現明確，蛋白水解酶-14之活化，係經由分化程式而並非細胞凋亡程式進行控制。於最終分化步驟中，亦可使含有絲胺酸、半胱胺酸及天冬醯胺酸蛋白酶之多個蛋白酶活化。這說明，類胰島素及類糜蛋白酶血清蛋白酶，發揮使最外側之角質化細胞脫落之作用。半胱胺酸蛋白酶之一部分，例如細胞自溶酶(cathepsin)B及L，於經分化之角質形成細胞中被向上調節。這說明，細胞自溶酶D、天冬醯胺酸蛋白酶亦發揮使角質化細胞脫落之作用。該等酶與其他分化機制，例如蛋白水解酶-14之活化有關。
總結以上內容，本發明者自人角質化細胞萃取物中純化出蛋白水解酶-14。明顯說明，蛋白水解酶-14誘發核消失，且該消失呈細胞凋亡樣，但於角質形成細胞分化最終階段 其係經由ICAD分解所產生之可區別之變化。該步驟雖共有數個細胞凋亡性因子，但這並非導致受損細胞的排除之細胞死亡步驟，而是以完成實現用於主要作用即障壁功能之構造整體為目的之構成步驟。蛋白水解酶-14或SCCA-1之異常表現可直接影響分化程式，其結果是產生不完全角質化及障壁功能喪失。
2.以皮膚角質層細胞之SCCA表現為指標之對皮膚性狀之評估 材料及方法 (1)抗體
對於識別SCCA-1及2兩者之多株抗體，使用自牛皮癬表皮之皮屑中所純化之SCCA(SCCA-1及SCCA-2)而製作多株抗體。將牛皮癬表皮皮屑萃取物(萃取液：0.1M之Tris-HCl(pH 8.0)，0.14M之NaCl)離心後，將上清液純化成Sephacryl S-200、DEAE Sepharose、Mono Q、Mono S、Mono P、Superrose 6，且將其作為抗原，使用兔作為敏化動物。
抗-SCCA-1單株抗體及抗-SCCA-2單株抗體，係購自Santa Cruz Biotechnology，CA，USA。
(2)免疫組織化學檢查
依照AMeX步驟(Sato Y.等人，Am.J.Pathol.,125，第431-435頁(1986))，進行表皮活組織檢查，將其以冷卻丙酮加以固定後包埋於石蠟中。以二甲苯將切片進行除石蠟處理，以丙酮繼而以PBS將其洗淨。其次以10%之正常羊血清(Histofine，Tokyo，Japan)對該切片之非特異性結合部位進 行阻滯。
對表皮切片分別進行抗-SCCA-1單株抗體(稀釋至1：500)、如上述方式純化之抗-SCCA-2單株抗體(稀釋至1：500)或抗-SCCA多株抗體(稀釋至1：500)之培養。以PBS加以洗淨後，以DAKO Envision System(DAKO Corp.,CA,USA)使切片著色，之後以蘇木精(hematoxylin)加以對比染色，再行觀察。
(3)ELISA
皮膚角質層試料，係藉由將透明膠帶(Scotch tape(註冊商標)(NICHIBAN公司))貼附於皮膚表面後再將其剝離之帶式剝離而採集。將皮膚角質層上所附著之該膠帶剪斷後，將其浸漬於萃取緩衝液(0.1M之Tris-HCl(pH 8.0)，0.14M之NaCl、0.1%之Tween-20，1ml)中，之後施加超音波處理(20sec×4)，而製作試料萃取液。
將稀釋於PBS中之多株抗SCCA抗體(稀釋至1：1000)各100μl分別注入96孔ELISA培養皿之各孔中，於室溫下放置一夜，使其與培養皿中之固相結合。其後，為抑制培養皿中之非特異性結合，而以使用阻斷溶液(以PBS-Tween 20稀釋Block Ace後之溶液，300μl/孔)之條件進行1小時培養。
將50μl之上述試料萃取液添加入ELISA培養皿之各孔中，於37℃下反應2小時。添加單株抗SCCA-1抗體(稀釋至1：1000)或單株抗SCCA-2抗體(稀釋至1：1000)，於37℃下反應1小時。其次，添加二級抗體、辣根過氧化酶標記抗小鼠，於37℃下反應1小時，以0.1%之Tween-20 PBS洗淨後， 添加基質3',3',5',5'-四甲基聯苯胺(TMB)，之後使用TMB Peroxidase EIA substrate kit(BIO-RAD公司)使其著色，於630nm下進行測定。
(4)皮膚之經皮蒸發水分量(TEWL)之測定
檢體(正常人之面部及內側手腕)之TEWL，係使用TEWA儀(TM120)進行測定。
結果 (1)免疫組織化學檢查
圖8係，採集取自非曝光部位(於日光下曝曬機會較少之部位)即上腕部(人，24歲)、臀部(人，46歲)、大腿部(人，75歲)之表皮，及取自曝光部位(於日光下曝曬之機會較少之多個部位)即臉頰(人，20歲，76歲)、眼瞼(人，82歲)之表皮作為表皮檢體，且使用與SCCA-1及SCCA-2兩者結合之抗-SCCA多株抗體作為抗體而進行顯微鏡觀察之結果。由圖8可知，與非曝光部位相比，在暴露於紫外線等更嚴酷環境下常常曝曬之曝光部位之表皮上層中，SCCA明顯亢進。
圖9表示，正常表皮上層(50歲男性)及患有牛皮癬之表皮上層之SCCA-1及2之表現。如圖中所表明，雖然在正常皮膚中SCCA-1及2共同顯示出較弱之表現，但在患有炎症性不完全角質化症即牛皮癬之皮膚中，其SCCA-1及2則共同顯示出顯著之表現。
根據以上內容可明確，與正常皮膚角質層相比，於曝光部位或發生不完全角質化之皮膚部位中SCCA之表現顯著亢進。
(2)ELISA 1)於正常皮膚角質層中之SCCA表現量
藉由對表現正常皮膚性狀之曝光部位之皮膚(面部及臉頰)及表現正常皮膚性狀之非曝光部位(內側手腕)實施帶式剝離，而採集各自之角質層，藉由ELISA法測定SCCA-1及SCCA-2之表現量。其結果示於圖10。
現已知，與非曝光部位相比，曝光部位之SCCA-1及2之表現顯著亢進。因此，可藉由ELISA法而定量地判定：雖然顯示正常性狀，但經常於更嚴酷環境下曝曬之曝光部位表皮上層，與非曝光部位相比，其中SCCA特別是SCCA-1明顯地亢進。
2)於牛皮癬皮膚角質層中之SCCA表現量
藉由對於表現正常皮膚性狀之個體皮膚(非曝光部位：內側手腕)及患牛皮癬患者之皮膚分別實施帶式剝離而採取各自之角質層，且藉由ELISA法測定SCCA-1及SCCA-2之表現量。對作為患牛皮癬患者之皮膚部位之、伴有搔癢之皮疹部位、不伴有搔癢之皮疹部位、及無疹部位進行了試驗。其結果示於圖11。
於正常個體之皮膚角質層中，幾乎並未發現SCCA-1及-2之表現，相此相對，於患牛皮癬患者之皮疹患部之角質層中，無論是否伴有搔癢均發現SCCA-1及-2表現之明顯亢進。再者，牛皮癬患者中，在未發現牛皮癬症狀之皮膚部位(無疹部)，幾乎未發現SCCA-1及-2之表現。
3)於異位性皮膚炎之皮膚角質層中之SCCA表現量
藉由對表現正常皮膚性狀之個體皮膚(非曝光部位：手腕內側)及患異位性皮膚炎患者之皮膚各自實施帶式剝離而採取各自之角質層，且藉由ELISA法測定SCCA-1及SCCA-2之表現量。對於患異位性皮膚炎患者之皮膚部位，試驗了被疹部位及無疹部位。其結果示於圖12。
於正常個體之皮膚角質層中幾乎未發現SCCA-1及-2之表現，與此相對，於患異位性皮膚炎患者之患部之角質層中，無論被疹部位或無疹部位，均發現SCCA-1及-2表現之明顯亢進。因此，於異位性皮膚炎之情形時，即使於異位性皮膚炎之發病前，亦可藉由將SCCA-1及/或-2作為指標，而進行該疾病之診斷。於該情形時，若以SCCA為指標，則可判定出異位性皮膚炎之易患性，從而可進行預防或早期(例如發病前)處理。
4)SCCA表現量與經皮蒸發水分量(TEWL)之關係
藉由ELISA法對皮膚角質層之SCCA表現量進行測定，同時亦對作為皮膚生理參數之TEWL進行研究，從而對SCCA表現量與TEWL之關係進行研究。其結果示於圖12。SCCA-1與TEWL之Pearson相關係數為0.876，SCCA-2與TEWL之Pearson相關係數為0.600，並且發現了有意義之相關；因此可知，於TEWL較高而皮膚性狀較差之狀態時，SCCA-1及-2同時尤其是SCCA-1表現量升高。
5)花粉症皮膚角質層中之SCCA表現量
藉由對於表現正常皮膚性狀之個體皮膚(對照)及患花粉症而致皮膚粗糙患者之皮膚分別實施帶式剝離，而採取各 自之角質層，同時於研究花粉症皮膚中之皮膚粗糙與TEWL之關係時，藉由ELISA測定花粉症皮膚中皮膚粗糙及SCCA-1之表現量。作為皮膚部位，選定內側手腕(非曝光部)及額部(曝光部)。
圖14表示於花粉症皮膚中皮膚粗糙與TEWL之關係(A)、以及與SCCA1表現量之關係(B)。如該圖所表明，發現由花粉症所致TEWL之有意義之升高，並產生皮膚障壁功能下降；於變為皮膚粗糙狀態之皮膚中，與正常個體相比，發現SCCA-1之表現明顯亢進。因此表明：SCCA-1可作為由花粉症所致皮膚粗糙之指標。又，於花粉症皮膚中，即使於日光無法照射到之手腕內側，亦發現有TEWL之惡化即障壁功能下降，從而說明全身炎症反應及SCCA亢進可使身體障壁功能產生惡化。圖15表示花粉症性皮膚中粗糙皮膚與SCCA-1表現亢進之相關關係。SCCA-1與TEWL之Pearson相關係數為0.8086，發現有意義之相關。因此表明，由花粉症導致皮膚障壁功能愈下降即皮膚粗糙狀態愈惡化，則SCCA-1之表現量愈升高。
因此，即使於皮膚粗糙發病前，若以SCCA作為指標，則亦可判定由花粉症所致皮膚粗糙之易患性，從而可預防或進行早期(例如發病前)處理。又，值得關注的是，於花粉症皮膚中產生不完全角質化係全新之見解，而花粉症皮膚中之障壁功能之惡化或不完全角質化係以SCCA為起因。
圖1A，B表示對皮膚萃取物之西方墨點分析。藉由使用 H-99抗體及hl4D146 抗體，依免疫墨點法對酶原及活性蛋白水解酶-14之存在加以分析。使用10μg(通道1、2及4)及1μg(通道3)之全皮膚萃取物、皮膚等價萃取物及角質化細胞萃取物。
圖2A，B表示對純化蛋白水解酶-14之分析。(A)為於SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳後，將自Superdex 75層析法所獲得之溶離分No.25移至PVDF(聚偏氟乙稀)膜，繼而以考馬斯亮藍(Coomasie Brilliant Blue)進行染色。表現出17KDa及11KDa之兩個蛋白質群。(B)係使用H-99、hl4D146 及C20抗體之西方墨點分析。17KDa帶對H99抗體及hl4D146 抗體雙方呈陽性，且表示11KDa帶可被C20抗體識別。M：標記；1：Superdex 75 No.25；2：Superdex 75 No.26-27，comc。
圖3表示各種合成抑制劑對純化蛋白水解酶-14之效果。現已知有15種人蛋白水解酶，但仍與針對各種蛋白水解酶之肽抑制劑(YVAD、VDVAD、DEVD、VEID、IETD、LEHD、DNLD)，以及針對半胱胺酸蛋白酶(IAA)、絲胺酸蛋白酶(AEBSF)之群特異性抑制劑一起來培養蛋白水解酶-14。於1.3M檸檬酸鈉及5mM DTT存在時，使用WEHD-MCA作為基質，測定殘留酶活性。試驗之酶濃度分別為5、2.5及1.25μM。值表示重複分析之平均值。
圖4A-C表示(A)針對ICAD(核酸水解酶抑制劑)之純化蛋白水解酶-14之切斷活性。(B)表示使用FL331抗體之西方墨點分析。顯示有33KDa及27KDa之切裂生成物。藉由使用10μM之SCCA-1前之培養，而完全抑制ICAD切斷。於僅存 在Cosmotrophic鹽時，觀察到ICAD分解。使用針對胺基末端之特異性抗體之西方墨點分析揭示：於與蛋白水解酶-14之延長培養期中，完整的ICAD分子消失。若於混合物中添加SCCA-1，則亦無法檢測出ICAD分解，於16小時之培養後，仍為未受影響之狀態(B)。(C)表示於存在Cosmotrophic鹽時，對於針對合成蛋白水解酶基質之水解活性進行調查之結果。
圖5A-E表示活性蛋白水解酶-14及TUNEL陽性細胞之局部存在。以H-99抗體(A)、hl4D146 抗體(B)及TUNEL(細胞凋亡染色試劑)(C)將正常人皮膚之薄切片進行染色。為進行螢光檢測(B)而使用Texas-Red。於TUNEL中，使用FITC(螢光素異硫氰酸酯)，於免疫染色中使用Texas Red，實施對TUNEL及蛋白水解酶之二重染色。
圖6B-F表示ICAD及不完全角質化核之共同局部存在。以抗ICAD抗體FL331將正常人皮膚之薄切片進行染色(A)。幾乎全部之下表皮之核均對該抗體呈陽性。以抗體將取自AD(老年癡呆症)患者皮膚之角質化細胞之表層上之ICAD進行染色時，顯示出各種大小之陽性部位(B)。使用顯示核酸簇之碘化丙啶(PI)而經常看見核酸染色(C)。在相同部位之明視野中，顯示有獲得表面上重疊之規模(D)。重疊圖像，僅於不完全角質化部位才存在ICAD(E)。於明視野中亦表現出核酸染色之重疊圖像(F)。
圖7H-L表示SCCA-1及不完全角質化核之共同局部存在。SCCA-1於正常皮膚切片(A)內幾乎未檢測出(A)。於AD 患者皮膚之淺表層中，顯示出SCCA-1陽性部位(B)。僅於該等部位上，發現核酸簇(C)。明視野示於(D)。重疊圖像，較好的是顯示SCCA-1陽性部位與未消化之核酸所存在之部位重疊(E)。亦顯示有SCCA-1染色及對應於明視野之其他重疊圖像(F)。
圖8表示於曝光及非曝光部位之表皮上SCCA之表現之免疫組織化學檢查結果。
圖9表示於正常皮膚及患牛皮癬症皮膚上SCCA之表現之免疫組織化學檢查結果。
圖10表示使用ELISA法之於正常皮膚角質層中SCCA之表現量結果。
圖11表示使用ELISA法之正常皮膚及牛皮癬皮膚角質層中SCCA表現量之對比結果。
圖12表示使用ELISA法之正常皮膚及異位性皮膚炎之皮膚角質層中SCCA表現量之對比結果。
圖13表示正常皮膚中之SCCA表現量與TEWL之相關性。
圖14A，B表示於花粉症皮膚中之皮膚粗糙與SCCA-1之表現量之關係。
圖15表示於花粉症皮膚中之皮膚粗糙與SCCA-1之表現亢進之相關性圖。
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<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 反置引子
<400> 2

Claims (5)

  1. 一種皮膚性狀評估方法，其係將皮膚角質層細胞之鱗狀細胞癌抗原(SCCA)之表現作為指標，該皮膚性狀係選自由紫外線照射所致皮膚老化、及皮膚障壁功能下降伴隨之皮膚保濕能力下降所致之皮膚乾燥所組成之群者。
  2. 一種皮膚性狀評估方法，其係將皮膚角質層細胞之鱗狀細胞癌抗原(SCCA)之表現作為指標，在皮膚顯現下述性狀之前預測該性狀之易患性，該性狀係選自由起因於異位性皮膚炎之不完全角質化、及由花粉症所致皮膚粗糙所組成之群者。
  3. 如請求項1或2之皮膚性狀評估方法，其中藉由使用SCCA特異性抗體之酶結合免疫吸附試驗(ELISA)而施行對上述SCCA表現之評估。
  4. 如請求項1或2之皮膚性狀評估方法，其中上述皮膚角質層試料係藉由帶式剝離而採取者。
  5. 如請求項1或2之皮膚性狀評估方法，其中SCCA係SCCA-1。
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