WO2006098523A1 - 扁平上皮細胞癌関連抗原を指標とする皮膚性状の評価方法 - Google Patents

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caspase
scca
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Chika Katagiri
Jotaro Nakanishi
Toshihiko Hibino
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Definitions

  • the present invention provides a method for evaluating a skin condition using a cell-related squamous cell carcinoma-associated antigen (Sduamous Cell Care inoma Antigen, hereinafter referred to as “SCCA”) as an index.
  • SCCA cell-related squamous cell carcinoma-associated antigen
  • nucleation occurs, in which the nucleus disappears in the corneocytes.
  • Epidermal keratinocytes proliferate in the basal layer, migrate to the upper layer, mature and become the stratum corneum.
  • the nucleus remains undigested in the keratinocytes, and the keratinocytes have nuclei. It may exist in the stratum corneum in an immature state, and this is called “keratosis”.
  • Squamous cell carcinoma-associated antigen is an antigen extracted from squamous cell carcinoma cells, and has a high blood concentration in squamous cell carcinomas of the cervix, lungs, esophagus, and skin. Diagnosis of squamous cell carcinoma Is often used for
  • SCCA is also found to be upregulated in the upper layers of the psoriatic epidermis.
  • Psoriasis is a skin disease, and there is psoriasis, a chronic, relapsing inflammatory akeratosis characterized by abnormal epithelial cell proliferation / differentiation and inflammatory cell infiltration. Psoriasis is thought to develop by adding various environmental factors to the genetic predisposition (Hopso-Havu et al. British Journal of Dermatology (1983) 109, 77-85).
  • S C C A is encoded by two genes, S C C A-1 and S C C A-2, arranged in tandem on chromosome 18 q 21.3.
  • the proteins encoded by them, S C C A-1 and S C C A-2, are both proteins with a molecular weight of about 45000 and show high homology, with a homology of 95% at the nucleic acid level.
  • S C CA belong to the family of ovalbu min-serine protease inhibitor (ov-serpin).
  • ov-serpin ovalbu min-serine protease inhibitor
  • ov-serpin has unique characteristics among the Servins family. In general, serpin is secreted and works outside the cell, but ov-serpin is a protease inhibitor that works mainly inside the cell.
  • SCCA 1 is a papain-like cysteine protease inhibitor
  • SCCA 2 is a chymotrypsin-like serine protease inhibitor. Although it has high homology, the amino acid sequence of the reaction site is different, so it may have different characteristics. (Schick et al. J. Biol. Chem.
  • the present inventor conducted research aimed at elucidating the physiological mechanism of the epidermis involved in SCCA. It was found that SCCA is one of the causes of the rough skin of the skin including keratinization. Therefore, it was considered that the expression of SCCA would be an index of skin properties, and the present invention was completed.
  • the present invention provides a method for evaluating skin properties, using the expression of squamous cell carcinoma-associated antigen (SCCA) of skin horny layer cells, specifically, SCCA-1 and / or SCC A_2, particularly SCCA-1 as an index .
  • SCCA squamous cell carcinoma-associated antigen
  • the expression of S C C A is performed by enzyme-linked immunosorbent assay (E L I S A) using an antibody specific for S C C A.
  • the skin stratum corneum sample is collected by tape stripping.
  • Skin or skin properties determined by the method of the present invention include rough skin, such as skin aging caused by ultraviolet irradiation, dry skin due to reduced skin moisturizing power due to reduced skin barrier function, psoriasis and atopic dermatitis. There are various properties such as keratinization and rough skin caused by hay fever.
  • Figure 1 shows a Western plot analysis of skin extracts.
  • the presence of zymogen and active caspase-14 was analyzed by immunoblotting by using H-99 antibody and hl4D 146 antibody.
  • 10 g (lanes 1, 2 and 4) and (lane 3) of whole skin extract, skin equivalent extract and keratinocyte extract were applied.
  • FIG. 2 shows the analysis of purified Caspase-14.
  • A After SDS polyacrylamide gel electrophoresis, obtained from Superdex 75 Fraction No. 25 was transferred to a PVDF membrane and stained with Coomassie Prilian Pull. Two protein bands, 17 KDa and llKDa, were shown.
  • B Western blot analysis using H-99, hl4D 146 and C20 antibodies. The 17 KDa band was positive for both the H99 antibody and the hl4D 146 antibody, and was recognized to be recognized by the UKDa band strength 20 antibody.
  • M Marker; l: Superdex 75 No.25; 2: Superdex 75 No.26-27, come.
  • Figure 3 shows the effect of various synthetic inhibitors on purified caspase-14.
  • Peptide inhibitors YVAD, VDVAD, DEVD, VE ID, IETD, LEHD, DNLD
  • cysteine proteinase IAA
  • seri Caspase-14 was incubated with a class-specific inhibitor for NPL proteinase (AEBSF). Residual enzyme activity was measured using WEHD-MCA as a substrate in the presence of 1.3 M sodium citrate and 5 mM DTT. The enzyme concentrations tested were 5, 2.5 and 1.25 M, respectively. The value represents the average value of duplicated assembly.
  • FIG. 4 shows (A) cleavage activity of purified caspase-14 against IC AD.
  • B Western plot analysis using FL 3 31 antibody. Cleavage products of 33 KDa and 27 KDa were shown. IC AD disconnection was completely suppressed by pre-incubation with 10 ⁇ MSCCA 1. ICAD degradation was observed only in the presence of cosmotrophic salt. Western blot analysis using an antibody specific for the amino terminal showed the disappearance of intact ICAD molecules during prolonged incubation with caspase-14. When SCCA-1 was added to the mixture, IC AD degradation was no longer detected and remained unaffected after 16 hours of incubation (B).
  • C Cosmotropic activity of hydrolyzing synthetic caspase substrate The result investigated in the presence of salt is shown.
  • FIG. 5 shows the localization of active caspase-14 and TUNEL positive cells.
  • Thin sections of normal human skin were stained with H-99 antibody (A), hl4D 146 antibody (B) and TUNE L (C).
  • Texas-Red was used for fluorescence detection (B).
  • Double staining for TUNEL and caspase was performed using FI TC for TUNE L and Texas Red for immunostaining.
  • D) shows a superimposed image
  • E shows a bright field.
  • FIG. 6 shows the co-localization of I CAD and keratinocytes. Thin sections of normal human skin were stained with the anti-I CAD antibody FL 3 31. Most nuclei in the lower epidermis were positive for this antibody.
  • ICAD was stained with antibodies on the superficial layer of keratinocytes derived from the skin of AD patients, positive sites of various sizes were shown (B). Nuclear staining with probidium iodide (PI) indicating a nuclear class evening was often observed (C). The bright field at the same site showed an overlapping scale on the surface (D). The superimposed image revealed that ICAD exists only at the keratosis site (E). A superimposed image of nuclear staining in bright field is also shown (F).
  • PI probidium iodide
  • FIG. 7 shows the co-localization of S C C A-1 and keratonuclei.
  • S C CA 1 was hardly detectable in normal skin sections.
  • S C C A-1 positive sites were shown (H). Only on these sites was a nuclear cluster (I).
  • the bright field is shown in (J).
  • the superimposed image shows that the SCC A-1 positive site preferably overlaps the site where undigested nuclei are present (K :).
  • Another superimposed image corresponding to S C CA 1 1 staining and bright field is also shown (L).
  • FIG. 8 shows the results of immunohistochemical examination showing the expression of SCCA in the epidermis of exposed and unexposed areas.
  • Figure 9 shows the occurrence of SCCA in normal skin and skin with psoriasis. The present immunohistochemical test results are shown.
  • FIG. 10 shows the results of SC CA expression in normal skin stratum corneum by the ELISA method.
  • Fig. 11 shows the comparison results of SCA expression levels in normal skin and psoriatic skin stratum corneum by the ELISA method.
  • Fig. 12 shows the comparison results of S CACA expression in normal skin and atopic dermatitis horny layer by ELISA method.
  • Fig. 13 shows the correlation between S C CA expression level and T E W L in normal skin.
  • Figure 14 shows the relationship between rough skin and the amount of SCCA-1 expression in hay fever skin.
  • Fig. 15 shows the correlation between rough skin in hay fever skin and increased expression of SCCA-1.
  • S C CA is a protein with a molecular weight of about 45,000 that is highly expressed in psoriasis and UV-irradiated skin.
  • the amino acid sequences of SCC A-1 and SCC A-2 and the nucleic acid sequences encoding them are described in Takeda A et al. J. Invest. Dermatol. 118, 147-154 (2002) (supra).
  • the measurement of SCCA expression according to the present invention can be carried out quantitatively or qualitatively according to any method capable of measuring SCCA.
  • immunoassay methods that use antibodies specific for SCCA, such as ELISA methods that use enzyme labels, RIA methods that use radioactive labels, immunoturbidimetric methods, Western plot methods, and latex agglutination methods And various methods such as hemagglutination.
  • Immunoassay methods include competitive methods and sandwich methods.
  • SC CA The expression level can also be determined by measuring the amount of the gene encoding it expressed in the cell. In this case, preferably, the expression of SCCA is determined by measuring the amount of mRNA encoding SCCA in the cell.
  • mRNA and quantitative or qualitative measurement of the amount thereof are also well known in the art, and can be performed by various well-known methods such as PCR, 3SR, NA SBA, and TMA.
  • SCCA expression can be qualitatively determined through in situ hybridization and measurement of its biological activity.
  • Samples of the skin stratum corneum can be collected by any method. However, the tape stripping method is preferable from the viewpoint of simplicity. Tape stripping is a method of collecting a stratum corneum sample by applying an adhesive tape strip to the skin surface, peeling it off, and attaching the skin stratum corneum to the peeled adhesive tape.
  • the tape stripping method it is possible to measure the expression of SCCA just by collecting a single layer of the stratum corneum, and it is possible to evaluate non-invasive rough skin and keratinization using SCCA as an index.
  • the preferred method of tape stripping is to first clean the surface of the skin with, for example, ethanol to remove sebum, dirt, etc., and lightly place a piece of adhesive tape cut to an appropriate size (for example 2X5cm) on the skin surface. It is done by applying a flat force and pressing it flat, and then peeling off the adhesive tape with a uniform force.
  • the adhesive tape may be a commercially available cellophane tape, for example, Scotch Superstrength Mailing Tape (manufactured by 3M), cellophane tape (cello tape (registered trademark); Nichiban Co., Ltd.) or the like.
  • a suitable extract such as Tris-buffer (pH 8.0) (0.1M Tris-HCl, 0.14M NaCl, 0.1% Tween- 20) and isolated from the tape by extracting the stratum corneum • Can be extracted.
  • S C C A is measured by an immunoassay method such as E L I S A.
  • the antibody specific for S C C A used in E L I S A may be a monoclonal antibody or a polyclonal antibody.
  • Methods for producing monoclonal antibodies and polyclonal antibodies are well known to those skilled in the art. For example, Lunstrum et el., J Biol. Chem. 198 6, 261: 9042-9048; Hurle et al. J Cell Science 1994, 107: 26 23- 2634.
  • Sandwich immunoassay is particularly preferred.
  • Sandwich immunoassay can be performed, for example, as follows.
  • the carrier is preferably a solid carrier.
  • any carrier commonly used in immunoassay may be used as the solid carrier.
  • a polymer carrier such as styrene or polystyrene molded into an arbitrary size and shape.
  • reaction containers made of these appropriate materials such as the inner wall of the ELISA plate well, can be mentioned.
  • the primary antibody can be immobilized on a carrier according to a conventional method.
  • the primary antibody is dissolved in a buffer solution such as phosphate buffered saline (PBS) or borate buffer and adsorbed on the carrier. Can be fixed.
  • PBS phosphate buffered saline
  • an antibody that binds to the primary antibody or other protein, such as protein C may be immobilized in advance on a carrier and contacted with the primary antibody.
  • an appropriate blocking agent such as PBS-BSA or a commercially available blocking agent such as Block Ace (Dainippon Pharmaceutical) is added to the carrier on which the primary antibody is immobilized in this manner.
  • the other antibody of the above-mentioned two types of SCC A is used as a secondary antibody and labeled.
  • labels include enzyme labels, radiation labels, and fluorescent labels.
  • the enzyme can be directly bound to the secondary antibody for labeling or indirectly with an enzyme via an interactive protein such as avidin-piotin.
  • the enzyme can be bound to the antibody, for example, by introducing a thiol group into each of the enzyme and the antibody to be labeled using a commercially available thiol-introducing group reagent and then bonding the two to each other through an S—S bond.
  • Enzymes include horseradish peroxidase, alkaline phosphatase, and ⁇ 6 — D-galactosidase.
  • An enzyme can be detected using a substrate specific for the enzyme.
  • a substrate specific for the enzyme For example, when using horseradish peroxidase, TMB (3,3 ', 5,5, monotetramethylbenzidine) or ABTS (2,2'-azine-di [3-ethylbenzthiazolinesulfonate] ) Etc. are available.
  • the carrier immobilized with the primary antibody, the labeled secondary antibody, and the test sample are mixed and incubated to bind the SCCA in the test sample to the primary antibody immobilized on the carrier. Let the labeled secondary antibody bind to this SCCA molecule.
  • the labeled antibody is immobilized on the carrier via the primary antibody immobilized on the carrier and the SCCA derived from the sample in an amount that reflects the amount of SCCA in the sample.
  • a suitable buffer eg PBS, about 4-40 ° (: preferably 20-37, 5 minutes to several days, preferably 10 minutes to 24 hours, more preferably 10 minutes to 3 Do time.
  • an operation of separating unbound labeled antibody from the carrier is performed.
  • the carrier is a solid carrier, this separation operation can be easily performed by solid-liquid separation.
  • a certain known amount of labeled secondary antibody is used, the label bound to the carrier and / or unbound label can be measured.
  • the label bound to the carrier is detected and measured.
  • the carrier is preferably washed with a washing solution such as a buffer containing an appropriate surfactant.
  • the detection is performed after washing with P B S—Tween 20 to remove unbound labeled antibody.
  • Detection can be performed according to a conventional method depending on the type of label.
  • Ac-WEHD- MCA, Ac- YVAD- MCA, Ac- VDVAD- MCA, Ac-DEVD-MCA, Ac-VE ID-MCA, Ac_IETD- MCA, Ac-LEHD- MCA are Peptide Institute, Inc. Purchased from Osaka Prefecture).
  • Benzyloxycarbonyl (Z) -YVAD_FMK, Z-VDVSD-FMK ⁇ Z-DEVD-FMK, Z-VEID-FMK, Z_IETD_FMK, Z-LEHD-FMK and Z-VAD-FMK are BioV ision (Mountain View, CA ) Purchased from. Recombinant Cassase-1-10 obtained from SBIOMOL Research Labs, Inc. (Plymouth Meeting, PA). The H-99 antibody (Santa Cruz Biotechnology, Inc) was used for the detection of the proform and large subunit of caspase-14. The H-99 antibody is raised against a peptide corresponding to amino acids 24-122 of human caspase-14.
  • a cleavage site-specific antibody (M4D 146 ) was prepared by immunizing a rabbit with a synthetic pen peptide Peptide TVGGD corresponding to the putative processing site of Hitospurase 14.
  • reaction was stopped with 150 l of 0.1M monochloroacetic acid and measured using Fluoroskan Ascent FL (Thermo Electron Co., Wolsam, Mass.) With an excitation wavelength of 355 nm and an emission wavelength of 460 ⁇ m.
  • Fluoroskan Ascent FL Thermo Electron Co., Wolsam, Mass.
  • Inhibition assay was initiated by incubating caspase-14 and peptide inhibitor at room temperature for 15 minutes in Atsy buffer and adding 51 IOO M WEHD-MCA.
  • Human keratinocytes (about 14 g) scraped from a healthy man's sputum were extracted with 0.1 M Tris-HCl (pH 8.0) containing 0.14 M NaCl using a glass homogenizer. The supernatant was obtained after centrifugation at 000 g After concentration with Amicon Ultra (Millipore, MA) and desalting with Fast Desalting column HR10 / 10 (Amersham Biosciences), the crude product was purified with HiPrep 16/10 Q The column was applied to an XL column and the column was 20 mM Tris-HCl. Washed (pH 8.0) and eluted with a linear NaCl gradient of 0-1 M.
  • the column was equilibrated with 20 mM acetate buffer (pH 4.5) and eluted with a 0-1 M NaCl gradient.
  • the positive fraction was concentrated and loaded onto a Kumamoto Focusing Mono P column equilibrated with 25 mM ethanolamine (pH 8.3). Elution was performed using 46 ml of Polybuifer (pH 5.0) while forming a pH gradient from pH 8 to 5.
  • Caspase 14 was finally purified using Superdex 75 gel chromatography. Protein concentration was determined with the BioRad Protein Assay Kit (BioRad Lab, Hercules, CA).
  • CMA encoding caspase-14 was isolated from keratinocyte cMA by PCR using forward primer: AAGGATCC AATCCGCGGTCTTTGGAAGAGGAG (SEQ ID NO: 1) and reverse primer: TTTCTGCAGGTTGCAGATACAGCCGTTTCCGGAGGGTGC (SEQ ID NO: 2).
  • the PCR product was cloned into the pQE_100 DoubleTag vector (Qiagen, Valencia, CA) and expressed in E. coli JM109.
  • SSCA1 cMA was isolated from the psoriasis cMA library (Takeda A et al., J. Inve st. Dermatol., 118, 147-54 (2002)) and cloned into pQE30 Quiagen .
  • the recombinant protein was purified by Ni-NTA Agarose (Quiagen) and Mono Q chromatography. Immunohistochemistry
  • TUNEL reaction was performed using a fluorescein in situ cell death detection kit (Roche Diagnostics) according to the manufacturer's instructions.
  • ICAD Western blot and immunohistochemical analysis For ICAD Western blot and immunohistochemical analysis, anti-ICAD IgG (FL331, Santa Cruz Biotechnology) and DFF45 / ICAD Ab-2 (NeoMarkers, Fremont, CA) were used.
  • the sample was infiltrated with 0.1% Triton X-100, and the sample was immunostained at 4 with anti-ICAD or anti-SCCA-1 antibody overnight.
  • Alexa Fluor 400-conjugated anti-rabbit (IC AD) or anti-mouse IgG (SCCA-1) Each was used as a secondary antibody for 1 hour at room temperature.
  • IC AD Alexa Fluor 400-conjugated anti-rabbit
  • SCCA-1 anti-mouse IgG
  • Proteins were separated with a 5-20% gradient gel by SDS polyacrylamide gel electrophoresis. After electrophoresis, the protein was transferred onto a polyvinylidine difluoride membrane (iMiobilon-P, Millipore, Bedford, MA) and incubated with an anti-caspase 14 antibody containing H-99, hl4D 146 or C20. Peroxidase-labeled anti-rabbit Ig G (Sigma) or anti-goat IgG was used as secondary antibody, and immunoreactive proteins were visualized by chemiluminescence using ECL-plus (Amersham).
  • Caspase-14 in keratinocytes is processed by Asp 146
  • Caspase-1 substrates can be hydrolyzed by both caspase-1 and caspase-14.
  • the inventor first tested WEHD-MCA hydrolysis with caspase-1 in the presence or absence of 1.3 M sodium citrate and 5 mM dithiothreitol.
  • WEHD-MCA is an excellent substrate for caspase 1 in standard caspase assay buffer, it was confirmed that caspase 1 cannot hydrolyze this substrate in the presence of kosmotropic ions. (Data not shown). Therefore, each fraction was evaluated by three methods including hydrolytic activity against WEHD-MCA, reactivity with H-99, and hl4D 146 antibody. Table 1 shows the results of continuous chromatography.
  • caspase-14 was purified as a heterodimer consisting of a large subunit (17 KDa) and a small subunit (llKDa).
  • Superdex 75 gel chromatography showed that, unlike other caspases, caspase-14 in human keratinocytes exists as a monomer, such as the dalanzyme B activated form.
  • Table 1 summarizes the purification rate of caspase-14. Starting from about 1 OO mg of soluble protein extract, 11.8 g of purified protein was obtained. The specific activity increased 764 times and the yield was 9.1%.
  • Caspase-14 is a variety of caspase inhibitors, such as YVAD-FMK (force spa—1 inhibitor), VDVAD-FMK (caspase-2 inhibitor), DEVD-FMK (caspase-3 inhibitor), They were sensitive to IETD—FMK (Caspase 8 inhibitor), LEHD-FMK (Caspase 9 inhibitor) and VAD—FMK (pan—Caspase inhibitor) ( Figure 3). There was almost no effect of VEID-FMK. In particular, YVAD-FMK showed a very strong inhibitory effect on caspase 14 activity. This is probably due to the structural similarity between caspase-1 and caspase-14.
  • pan-caspaseinhibin VAD-FMK inhibited caspase-14 activity to the same extent as VAD-FMK.
  • a class-specific inhibitor of cysteine acetate (IAA) for cysteine proteinase, or 4- (2-aminoethyl) benzenesulfonyl fluoride, a class-specific inhibitor for serine protease. (AEBSF) showed no significant inhibitory effect at the test concentrations in this study.
  • SCCA-1 belongs to the serpin superfamily, but inhibits cysteine proteinases such as papain and cathebsin L (Takeda A. et al., Biol. Chem. 383, 1231-6 (2002)). This indicates that SCCA-1 is a unique cross-class inhibitor like Crm-A 32 . Therefore, the present inventor tested whether SCCA-1 can inhibit Caspa member. In the case of Kaspersee 14, the cosmotropic conditions were used. Even when the recombinant active caspase was incubated with SCCA-1, none of the caspase members 1-10) was affected by any enzyme activity. On the contrary
  • SCCA-1 inhibited caspase-14 activity against WEHD-MCA in a dose-dependent manner (Fig. 4C). SCCA-1 also inhibited ICAD degradation by caspase-14. Prolonged incubation did not show any recovery of enzyme activity. This suggests a strong bond between caspase 14 and S C C A-1 (Fig. 4 B).
  • caspase 14 including proform and active form was localized from spinous cells to keratinocytes in normal human epidermis. This is consistent with previous findings (Lippens et al., (2000), supra). Active caspase 14 detected with the hl4D 146 antibody was limited to a part of keratinocytes and granule cells (FIG. 5B). Most of the keratinocytes were ubiquitously stained. TUNEL positive cells were observed just below the keratinized layer, but many of these positive cells were significantly restricted (Figure 5C). Interestingly, T ⁇ EL positive cells are localized exclusively with hl4D U 6 positive cells. Existed. This suggests that DNA fragmentation has occurred in these cells and that active caspase-14 is involved in this process.
  • Caspase 14 is predominantly expressed in the epidermis and in other tissues Is rarely expressed (Van de Craen, M et al., Cell Death D if fer. 5, 836-46 (1998)).
  • Previous reports indicate that terminal differentiation of keratinocytes is linked to caspase 14 processing, suggesting increased caspase protease activity (Lippens, S et al., Cell Death Differ 7, 12 18-24 (2000); Eckhart 1. Biochem. Biophys. Res. Com Awakening. 277, 655-9 (2000); Hu SJ Biol. Chem 273, 29648-53 (1988)).
  • the final preparation consisted of two protein bands: a 17 KDa protein band recognized by the antibody and an llKDa protein band recognized by the C20 antibody. These protein bands are the large and small subunits of active caspase-14. During the purification process, an H-99 positive 17 KDa band was recognized along with the hl4D 146 antibody. This suggests that the large subunit ends with Asp H 6 at its force lupoxyl end. The amino subunit region of the small subunit was identified as Lys 153 -Asp-Ser_Pro -Gin, suggesting that processing occurs between Ue 152 and Lysi 53 . This site is a strange cleavage site for caspase members. This is due to the discovery of Chien et al.
  • caspase 14 was purified to homogeneity as a highly active heterodimer. It was suggested that caspase 14 maturation involves processing at two sites, Asp 146 and lie 152 , and removal of six residues in linker regions Xxx 147 and II e 152 . The presence of two different cleavage sites (one acidic and the other hydrophobic) also suggests that caspase 14 activation is performed in multiple steps by a number of enzymes.
  • caspase 14 The enzymatic properties of purified caspase 14 were very unique. Purified caspase-14 showed a broader inhibitor sensitivity than known caspase inhibitors. In particular, caspase 1 inhibitor YVAD-FMK showed the strongest inhibitory action. YVAD-FMK showed the highest activity against WEH D-MCA as well as another caspase-1 substrate, YCAD-MCA. This suggests a close relationship between caspase-1 and caspase-14. However, as the inventors have clarified, caspase-14 has significantly different properties. The present inventor has revealed for the first time that SCCA-1 is an endogenous inhibitor for caspase-14. The most specific property of SCCA-1 is its remarkable specificity for force Spersee 14. Other members of caspases 1-10 are not affected by SCCA-1.
  • SCCA-1 did not inhibit caspase-3 activity using the synthetic substrate DEVD-MCA or the natural substrate ICAD. This is in contrast to Crm A.
  • Crm A also belongs to the serpin superfamily and is known to be able to suppress a number of caspases, including caspase 1-1 and caspase 8 (Gagliardini V. et al., Science 263, 826-8 (1994)) 0 XI ⁇ caspase-3, one 7 and - 9 are known to inhibit (.
  • I CAD also referred to as the DNA fragmentation factor “DFF 45”
  • DFF 45 the DNA fragmentation factor
  • CAD caspase-activated DNase
  • IC AD bound to CAD exists as an inactive complex.
  • Caspase 3 shows limited protein degradation relative to ICAD and cleaves at two sites, Asp 117 and Asp 224 .
  • Caspase-3 is not necessarily required for cleavage of large amounts of cellular proteins during apoptosis, but is essential for cleavage of IC AD (Tang D. et al., J. Biol. Chem. 273, 28549- 52 (1998)). This indicates that caspase-13 is crucial for DNA fragmentation, and other running caspases, ie caspases 6 and 7, are not important. Interestingly, Caspase 14 is similar to IC AD, 12KDa and 35KDa A fragment was generated. Sequence analysis showed the same cleavage site.
  • Caspa 14 can be a perfect replacement for caspase-3.
  • caspase 14 can degrade IC AD, it is clearly different from proapo-one cis caspase 3 for the following reasons.
  • overexpression of caspase 14 does not induce apoptotic cell death (Van de Craen. Cell Death Differ. 5, 838-46 (1 998)). This is in contrast to Caspaise.
  • force spas-14-14 is not activated by various apoptotic stimuli (Lippens et al. (2000), supra). The initiating caspase or other caspase member was unable to process pro-caspase-14. This is consistent with previous findings (Lippens et al. (2000), supra).
  • caspase-14 Activation occurs only during terminal differentiation (E ckhart L. et al., (2000), supra).
  • caspase-14 synthesis is limited to differentiating keratinocytes in adult tissues (Ec khart L. Biochem. Biophys. Res. Commun. 277, 655-9 (2000)).
  • the ability of caspase-14 for IC AD cleavage is regulated by force spase-14, which is regulated in a significantly different manner than caspase-3.
  • CAD degradation requires unusually high concentrations of Cosmoto ⁇ pick ions.
  • caspase-14 is a member of the Caspazese that regulates its activation by the keratin rhino differentiation program.
  • SCCA-1 is hardly expressed.
  • strong expression has been reported in the psoriatic epidermis, oral mucosa and esophagus (Takeda A. et al., J. Invest. Dermatol. 118, 147-54 (2002)).
  • these tissues are associated with keratosis.
  • the present inventor has revealed that intense staining of SCCA-1 is also found at the keratinization site.
  • SC CA-1 and I CAD were always co-localized at the same site where the nuclear assembly was present.
  • caspase 14 activation is not controlled by the apoptotic program, but through the control of the differentiation program.
  • many proteinases are also activated, including serine, cysteine and aspartic proteinases. Trypsin-like and chymotrypsin-like serum proteinases have been suggested to play a role in detaching the outermost keratinocytes.
  • Some cysteine proteinases, such as cathebsins B and L, are upregulated in differentiated keratinocytes.
  • Cathebsin D, aspartate proteinase has also been suggested to play a role in keratinocyte shedding. These enzymes may be involved in other differentiation mechanisms, such as caspase-14 activation.
  • caspase-14 secretory-derived protein
  • Loss is apoptotic, but strongly suggests that it is a distinct change that occurs via IC AD degradation at the final stage of keratinocyte differentiation.
  • this process shares several apoptotic factors, this is not a cell death process that leads to the elimination of damaged cells, but rather completes the entire structure for the primary function of the barrier. This is the intended configuration process.
  • Abnormal expression of caspase 14 or SCCA-1 directly affects the differentiation program, resulting in keratinization and disruption of barrier function.
  • Anti-SCCA-1 monoclonal antibody and anti-SCCA-2 monoclonal antibody were obtained from Santa Cruz Biotechnology, CA, USA.
  • Epidermal biopsy was fixed with cold acetone according to AM e X procedure (Sato Y. et al. Am. J. Pathol., 125, 431-435 (1986)) and then embedded in paraffin. Sections were deparaffinized with xylene, washed with acetone and then PBS. Next, non-specific binding sites on the sections were blocked with 10% normal goat serum (Histofine, Tokyo, Japan). Anti-SCCA-1 monoclonal antibody (diluted 1: 500), and anti-SCCA-2 monoclonal antibody purified as described above.
  • the skin stratum corneum sample was collected by applying a transparent adhesive tape (Cello Tape (registered trademark) (NICHI BAN)) to the skin surface and then peeling it off.
  • This tape with cutaneous horny layer is cut and immersed in an extraction buffer (0.1M Tris-HCl (pH8.0), 0.14M NaCK 0.1% Tween-20, lml), sonication (20 sec x 4) To prepare a sample extract.
  • Polyclonal anti-SCCA antibody (diluted 1: 1000) diluted in PBS was dispensed into each well of a 96-well ELISA plate, left at room temperature overnight, and allowed to bind to the plate solid phase. Thereafter, in order to inhibit non-specific binding to the plate, the plate was incubated for 1 hour in a blocking solution (a solution prepared by diluting Plocase with PBS_Tween20, 3001 / well).
  • a blocking solution a solution prepared by diluting Plocase with PBS_Tween20, 3001 / well.
  • the sample extract 50 ⁇ 1 was added to each well of the ELISA plate and reacted at 37 ° C for 2 hours.
  • Monoclonal anti-SCC A_1 antibody (diluted 1: 1000) or monoclonal anti-SCCA-2 antibody (diluted 1: 1000) was added and reacted at 37 ° C for 1 hour.
  • the secondary antibody horseradish peroxidase-labeled anti-mouse, react at 37 ° C for 1 hour, wash with 0.1% Tween-20 PBS, substrate 3 ', 3', 5 ', 5 '—
  • TM B tetramethylbenzidine
  • TM BP eroxid Color was developed using ase EIA substratekit (BIO-RAD) and measured at 630 nm.
  • T EWL transdermal transpiration moisture
  • T EWL of the specimen normal human face and inner arm was measured using T EWAmeter (TM120).
  • Fig. 8 shows the upper arm (24 years old), hip (46 years old), thigh (human 75), which are non-exposed areas (relatively exposed to sunlight) as epidermal specimens.
  • the epidermis derived from the age group), and the epidermis derived from the parts (hito 20 years old, 76 years old) and the eyelids (hito 82 years old), which are exposed parts (parts that are relatively exposed to sunlight), are collected. This is a result of microscopic observation using an anti-SCCA polyclonal antibody that binds to both SCCA_1 and SCCA-2 as an antibody. From Fig. 8, it can be seen that S C CA is markedly enhanced in the upper epidermis of exposed areas that are always exposed to more harsh environments such as exposure to ultraviolet light compared to non-exposed areas.
  • FIG. 9 shows the expression of S C C A — 1 and 2 in the normal upper epidermis (50-year-old male) and the upper epidermis with psoriasis.
  • both SCCA-1 and 2 are weakly expressed in normal skin, whereas SCCA-1 and 2 are significantly expressed in skin with psoriatic inflammatory keratosis. showed that.
  • the individual stratum corneum was collected by tape stripping each of the skin of the individual exhibiting normal skin properties (non-exposed site: inner arm) and the skin of a patient suffering from psoriasis.
  • SCCA-1 and SCCA-2 The expression level of was measured by ELISA. As the skin area of patients suffering from psoriasis, the rash area with itching, the rash area without itching, and the rash area were examined. The results are shown in Figure IV.
  • SCCA-1 and 1-2 are almost absent in the stratum corneum of normal individuals, whereas the stratum corneum in the affected area of patients with psoriasis is associated with or without itching. Regardless, a marked increase in the expression of SCCA-1 and 1-2 was observed. In patients with psoriasis, S C C A-1 and-2 were hardly expressed in the skin area where no psoriasis symptoms were observed (non-rash area).
  • Each stratum corneum was sampled by tape stripping each of the skin of an individual exhibiting normal skin properties (non-exposed site: inner arm) and the skin of a patient suffering from atopic dermatitis.
  • the expression levels of SCCA-1 and SCCA-2 were measured by ELISA.
  • SC CA-1 and 1-2 there is almost no expression of SC CA-1 and 1-2 in the stratum corneum of normal individuals, whereas in the stratum corneum in the affected area of patients suffering from atopic dermatitis, it is the rash site Regardless of whether it was a rash site or not, there was a marked increase in the expression of SCCA-1 and 1-2. Therefore, in the case of atopic dermatitis, even before the onset of atopic dermatitis, it is possible to diagnose the disease by using SCC A-1 and 2 or 1 as indices. This can be determined by using SCCA as an index to determine the susceptibility to atopic dermatitis, and it can be prevented or dealt with early (eg, before onset).
  • S C CA expression level was measured by E L I S A ′, and T EWL as a skin physiology parameter was also investigated, and the correlation between S C CA expression level and TEWL was investigated.
  • the result is shown in FIG. SCCA-1 and TEWL have a Pearson correlation coefficient of 0.876, and SCCA-2 and TEWL have a Pearson correlation coefficient of 0.600, both of which show a significant correlation, and therefore have a high TEWL and skin properties. It was found that the expression level of SC CA-1 was particularly high in both SC CA-1 and 1-2 when the condition was relatively poor.
  • Each stratum corneum was collected by applying tape stripping to the skin of individuals with normal skin properties (control) and the skin of patients suffering from hay fever.
  • control normal skin properties
  • SC CA-1 the skin roughness in hay fever skin
  • SC CA-1 the expression level of SC CA-1 were measured by ELISA.
  • Figure 14 shows the relationship between rough skin in hay fever skin and TEWL (A) And the relationship (B) with the expression level of SCCA 1 is shown.
  • SCC A_1 is an index of rough skin caused by hay fever.
  • TEWL deteriorates, that is, the barrier function decreases, and systemic inflammatory reaction and increased SCCA may deteriorate the barrier function of the body. It was suggested.
  • FIG 15 shows the correlation between rough skin and increased SCCA-1 expression in hay fever skin.
  • SCCA-1 and TEWL had a Pearson correlation coefficient of 0.8086, indicating a significant correlation. Therefore, it became clear that the expression level of SCCA-1 increases as the function of the skin barrier decreases due to hay fever, that is, as the rough skin condition worsens.

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Abstract

本発明は、皮膚角層細胞の扁平上皮細胞癌関連抗原（ＳＣＣＡ）の発現を指標とする、皮膚性状の評価方法を提供する。

Description

明 細 書 扁平上皮細胞癌関連抗原を指標とする皮膚性状の評価方法 技術分野
本発明は、 細胞の扁平上皮細胞癌関連抗原 （Sduamous Cell Care inoma Antigen, 以下 「 S C C A」 と称す）を指標とした、 皮膚状態 の評価方法を提供する。 背景技術
皮膚が正常の角化を行うと角質細胞で核が消滅する 「脱核」 とい う現象が生ずる。 表皮角化細胞は基底層で増殖し、 上層に移行して 成熟し角層となる。 しかしながら、 例えば乾癬やア トピー皮膚炎と いった皮膚病に罹り、 正常な角化が行われない肌荒れした皮膚にお いては、 角質細胞に核が未消化のまま残り、 角質細胞が核を有した 未熟な状態で角層中に存在することがあり、 これを 「不全角化」 と いう。 不全角化の現象は古くから知られているものの、 不全角化が 生じるメカニズムや生化学的な指標については知られていない。 扁平上皮細胞癌関連抗原 （ S C C A) は扁平上皮癌細胞から抽出 される抗原であり、 子宮頸部、 肺、 食道、 皮膚の扁平上皮細胞癌で 高い血中濃度を示し、 扁平上皮細胞癌の診断によく利用されている
(H. Kato et al. Cancer 40:1621-1628 (1977)； N. Mino et al. Cancer 62: 730-734 (1988) ) 。 特に、 S C C Aの血中レベルは扁 平上皮細胞癌の進行段階、 悪性度、 腫瘍の大きさなどに良好に相関 するため、 癌の早期発見のみならず、 癌治療効果の評価や再発のお それの診断などにおいて特に有効な癌マーカ一である。
S C C Aはまた、 乾癬表皮の上層において発現の亢進が認められ ることでも知られる （Takeda A. ら、 J. Invest. Dermatol. (2002 ) 118 (1), 147-154) 。 乾癬は皮膚病の一つであり、 表皮細胞の増 殖 · 分化異常と炎症細胞浸潤を特徴とする慢性、 再発性の炎症性不 全角化症である乾癬がある。 乾癬は遺伝的素因に種々の環境因子が 加わって発症すると考えられる （Hopso - Havu et al. British Jour nal of Dermatology (1983) 109, 77-85) 。
S C C Aは染色体 18 q 21.3上にタンデムに並んでいる二つの遺伝 子 S C C A— 1及び S C C A— 2遺伝子によりコードされる。 それ らによりコードされるタンパク質、 S C C A— 1及び S C C A— 2 は共に分子量約 45000のタンパクであり、 高い相同性を示し、 その ホモロジ一は核酸レベルで 95%である。 これらの S C C Aは ovalbu min-ser ine protease inhibitor (ov-serpin) ファミ リ一に属して いる。 ov- serpinはセルビンス一パ一フアミ リーの中でもユニーク な特徴を有している。 一般にセルピンは分泌されて細胞外で働く と されているが、 ov- serpinは主に細胞内でも働く protease inhibito rである。
S C C A 1 はパパイン様システィンプロテア一ゼ阻害剤であるが 、 S C C A 2はキモトリブシン様セリンプロテアーゼ阻害であり、 相同性が高いにも関わらず反応部位のアミノ酸配列が異なるため、 異なった特性を有することもある （Schick et al. J. Biol. Chem.
(1997) 27213, 1849-55) 。 乾癬などの疾患や U Vによって S C C A— 1及び S C C A— 2が高発現することはわかっていたが、 それ らが皮膚性状においてどのように関与しているかは不明であった。 発明の開示
本発明者は S C C Aが関与する表皮の生理学的メカニズムの解明 を目的とする研究を行っていたところ、 S C C Aの発現が乾癬など の不全角化の生じた皮膚において特異的に亢進しており、 S C C A が不全角化を含む皮膚の肌荒れ性状の一因であることを見出した。 従って、 S C C Aの発現が肌の性状の指標となると考え、 本発明を 完成するに至った。
本発明は、 皮膚角層細胞の扁平上皮細胞癌関連抗原 （ S C C A) 、 詳しくは S C C A— 1及び/又は S C C A_ 2、 特に S C C A— 1の発現を指標とする、 皮膚性状の評価方法を提供する。 好ましく は、 前記 S C C Aの発現は、 S C C Aに特異的な抗体を使用する酵 素結合免疫吸着アツセィ （E L I S A) により実施する。 より好ま しい態様において、 前記皮膚角層試料はテープス トリ ッビングによ り採取されたものである。
本発明の方法により、 皮膚の性状、 すなわち肌荒れ状態、 不全角 化状態などを生化学的レベルで判定することが可能となる。 本発明 の方法により判定される肌又は皮膚性状としては、 肌荒れ、 例えば 紫外線照射を原因とする皮膚老化、 皮膚バリアー機能低下に伴う肌 保湿力の低下による乾燥肌、 乾癬やア トピー性皮膚炎を原因とする 不全角化、 花粉症による肌荒れなど、 さまざまな性状が挙げられる
図面の簡単な説明
図 1は、 皮膚抽出物のウェスタンプロッ ト分析を示す。 H- 99抗体 及び hl4D146抗体を使用することにより、 チモーゲン及び活性カス パーゼ- 14の存在を免疫プロッ ト法で分析した。 10 g (レーン 1 , 2及び 4 ) 及び (レーン 3 ) の全皮膚抽出物、 皮膚等価抽出 物及び角化細胞抽出物を適用した。
図 2は、 精製カスパ一ゼ- 14の分析を示す。 （A) SDSポリアクリ ルアミ ドゲル電気泳動後、 Superdex 75ク口マトグラフィ一から得 られた画分 No.25を PVDF膜に移し、 そしてクーマジープリ リアント プル一で染色した。 17KDa及び llKDaの 2つのタンパク質バンドが示 された。 （B) H- 99、 hl4D146及ぴ C20抗体を使用したウエスタンブ 口ッ ト分析。 17KDaバンドが H99抗体及び hl4D146抗体の双方に対し て陽性を示し、 また UKDaバンド力 20抗体で認識されることが示さ れた。 M:マーカー； l:Superdex 75 No.25； 2： Superdex 75 No.26-27, come.
図 3は、 精製カスパーゼ- 14に対する種々の合成インヒピターの 効果を示す。 ヒ トカスパーゼは現在 15種類が知られているが、 各種 カスパ一ゼに対するペプチドインヒビター（YVAD, VDVAD, DEVD, VE ID, IETD, LEHD, DNLD)、 並びにシスティンプロティナ一ゼ（IAA)及 びセリ ンプロティナ一ゼ（AEBSF)に対するクラス特異的インヒビ夕 一と一緒に、 カスパーゼ -14をインキュベートした。 1.3M クェン酸 ナトリウム及び 5mM DTTの存在において WEHD- MCAを基質として使用 して、 残留酵素活性を測定した。 試験した酵素濃度はそれぞれ、 5， 2.5及び 1.25 Mとした。 値は重複アツセィの平均値を表す。
図 4は、 （A) I C ADに対する精製カスパーゼ- 14の切断活性 を示す。 （B ) F L 3 3 1抗体を使用したウエスタンプロッ ト分析 を示す。 33KDa及び 27KDaの切断生成物が示された。 10^M S C C A 一 1 を用いた前インキュベーショ ンによって、 I C AD切断は完全 に抑制された。 コスモトロフィ ック塩の存在においてのみ、 I C A D分解が観察された。 ァミノ末端に特異的な抗体を使用したウェス タンブロッ ト分析は、 カスパーゼ— 14との延長されたインキュベー シヨン中にインタク トな ICAD分子の消失を示した。 混合物に S C C A— 1 を添加すると、 I C AD分解はもやは検出されず、 16時間の インキュベーショ ン後、 影響を受けないままであった （B ) 。 ( C ) 合成カスパーゼ基質に対する加水分解活性を、 コスモトロピック 塩の存在において調査した結果を示す。
図 5は、 活性カスパーゼ- 14及び T U N E Lポジティブ細胞の局 在を示す。 正常なヒ トの皮膚の薄い切片を H— 99抗体（A)、 hl4D146 抗体（B)及び TUNE L (C)で染色した。 Texas-Redを蛍光検出（B )のために使用した。 TUNE Lには F I TCを用い、 そして免疫 染色には Texas Redを用いて、 T U N E L及びカスパーゼのための 二重染色を実施した。 （D)は重畳画像、 （E)は明視野を示す。
図 6は、 I C AD及び不全角化核の共局在を示す。 正常なヒ トの 皮膚の薄い切片を抗 I CAD抗体 F L 3 3 1で染色した。 下表皮の ほとんどの核はこの抗体に対して陽性を示した。 A D患者皮膚に由 来する角化細胞の表在層上の I CADを抗体で染色したときには、 種々のサイズの陽性部位が示された（B)。 核クラス夕一を示すヨウ 化プロビジゥム （PI)による核染色がしばしば認められた（C)。 同じ 部位の明視野は、 表面上のオーバ一ラップされたスケールを示した (D)。 重畳画像は、 不全角化部位においてのみ ICADが存在すること を明らかにした（E)。 明視野における核染色の重畳画像も示されて いる （F)。
図 7は、 S C C A— 1及び不全角化核の共局在を示す。 S C CA 一 1は、 正常な皮膚切片内ではほとんど検出することができなかつ た。 AD患者皮膚の表在層において、 S C C A— 1陽性部位は示され た（H)。 これらの部位上でのみ、 核クラスタ一が認められた（ I )。 明視野を（J)に示す。 重畳画像は、 S C CA— 1陽性部位が、 好ま しくは未消化核が存在する部位と重なることを示す（K：)。 S C CA 一 1染色及び明視野に対応する別の重畳画像も示す（L)。
図 8は、 露光及び非露光部位の表皮における S C CAの発現を示 す免疫組織化学的検査結果を示す。
図 9は、 正常皮膚及び乾癬症に罹った皮膚における S C C Aの発 現を示す免疫組織化学的検査結果を示す。
図 1 0は、 E L I S A法による正常皮膚角層における S C CA発 現量結果を示す。
図 1 1は、 E L I S A法による正常皮膚と乾癬皮膚角層における S C CA発現量の対比結果を示す。
図 1 2は、 E L I S A法による正常皮膚とア トピー性皮膚炎皮膚 角層における S C CA発現量の対比結果を示す。
図 1 3は、 正常皮膚における S C C A発現量と T E W Lの相関を 示す。
図 1 4は、 花粉症皮膚における肌荒れと S C CA— 1発現量との 関係を示す。
図 1 5は、 花粉症皮膚における肌荒れと S C CA— 1の発現亢進 との相関図を示す。 発明を実施するための最良の形態
S C C Aは上述のとおり乾癬や UV照射皮膚で発現の亢進してい る分子量約 45, 000のタンパク質である。 S C C A— 1及び S C C A — 2のアミノ酸配列並びにそれらをコードする核酸配列は Takeda A et al. J. Invest. Dermatol. 118, 147-154 (2002) (前掲） に記 載されている。
本発明に係る S C C Aの発現の測定は、 S C C Aを測定すること のできる任意の方法に従い、 定量的又は定性的に実施することがで きる。 具体的には、 S C C Aに特異的な抗体を利用する免疫測定方 法、 例えば酵素ラベルを利用する E L I S A法、 放射性ラベルを利 用する R I A法、 免疫比濁法、 ウエスタンプロッ ト法、 ラテックス 凝集法、 赤血球凝集法等、 様々な方法が挙げられる。 免疫測定法の 方式には競合法やサンドイッチ法が挙げられる。 他に、 S C CAの 発現量はそれをコードする遺伝子の細胞内において発現された量の 測定により行うこともできる。 この場合、 好ましくは、 S C C Aの 発現は細胞内の S C C Aをコードする mR NAの量を測定すること により決定する。 mRNAの抽出、 その量の定量的又は定性的測定 も当業界において周知であり、 例えば P C R法、 3 S R法、 NA S B A法、 TMA法など、 さまざまな周知の方法により実施すること ができる。 他に、 S C C Aの発現は in s i tuハイブリダィゼ一ショ ン法やその生物活性の測定を通じて定性的に決定することができる 被検体となる皮膚角層試料の採取は任意の方法で実施することが できるが、 簡便性の観点からテープス トリ ツビング法が好ましい。 テープス トリ ツビングとは、 皮膚表層に粘着テープ片を貼付し、 剥 がし、 皮膚角層をその剥がした粘着テープに付着させることで角層 試料を採取する方法である。 テープス トリツビング法を利用すれば 、 角層をテープ一枚採取するだけで S C C A発現の測定が可能とな り、 S C C Aを指標とした非侵襲性の肌荒れ、 不全角化の評価方法 が可能となる。 テープス トリツビングの好ましい方法は、 まず皮膚 の表層を例えばエタノールなどで浄化して皮脂、 汚れ等を取り除き 、 適当なサイズ （例えば 2X5cm) に切った粘着テープ片を皮膚表面 の上に軽く載せ、 テープ全体に均等な力を加えて平たく押さえ付け 、 その後均等な力で粘着テープを剥ぎ取ることで行われる。 粘着テ —ブは市販のセロファンテープなどであってよく、 例えば Scotch S uperstrength Mailing Tape (3M社製） 、 セロファンテープ （セロ テープ （登録商標） ； ニチバン株式会社） 等が使用できる。 粘着テ —プに付着した皮膚角層試料中の S C C Aは、 テープ片を適当な抽 出液、 例えば Tris - buffer (pH 8.0) (0.1M Tris-HCl, 0.14M NaCl, 0. 1% Tween- 20)に浸漬し、 角層を抽出することでテープから単離 • 抽出させることができる。
本発明の好ましい態様においては、 S C C Aは免疫測定方法、 例 えば E L I S Aにより測定する。 E L I S Aにおいて使用する S C C Aに特異的な抗体はモノクローナル抗体でもポリクローナル抗体 でもよい。 モノクローナル抗体やポリクローナル抗体の作成方法は 当業者に周知であり、 例えば Lunstrum et el. , J Biol. Chem. 198 6, 261: 9042-9048; Hurle et al. J Cell Science 1994, 107: 26 23- 2634に記載されている。
本発明に係る方法においては、 サンドィツチ免疫測定法が特に好 ましい。 サンドィツチ免疫測定方法は例えば下記の通りに実施でき る。
2種類の S C C Aに特異的な抗体の一方を一次抗体として担体に 固定化する。 担体としては固体担体が好ましく、 例えば固体担体と して免疫測定法において常用される任意のものを使用してよく、 例 えば任意の大きさ、 形状に成形されたスチレンやポリスチレンなど の高分子担体のほか、 これらの適当な材料で成形した反応容器、 例 えば E L I S Aプレートのゥエルの内壁などが挙げられる。
上記一次抗体の担体への固定化は常法に従って行う ことができ、 例えば上記一次抗体を緩衝液、 例えばリ ン酸緩衝食塩水 （P B S ) 、 ホウ酸緩衝液などに溶解して担体に吸着させることにより固定化 することができる。 また、 例えば上記一次抗体に結合する抗体やそ の他のタンパク質、 例えばプロテイン Cをあらかじめ担体に固定化 し、 これを上記一次抗体と接触させる等してもよい。 更に、 非特異 的な結合を抑えるため、 このようにして一次抗体を固定化した担体 に適当なブロッキング剤、 例えば P B S— B S Aや市販のブロッキ ング剤、 例えばブロックエース （大日本製薬） を加え、 約 4〜 4 0 °C、 好ましくは 2 0〜 3 7でで、 5分から数日、 好ましくは 1 0分 から 2 4時間、 より好ましくは 1 0分〜 3時間インキュベーショ ン することによりブロッキングするのが好ましい。
上記 2種類の S C C Aに特異的な抗体の他方の抗体は二次抗体と して使用し、 標識する。 標識としては、 酵素標識、 放射線標識、 蛍 光標識、 などが挙げられる。 酵素標識する場合、 酵素を二次抗体に 直接結合させて標識するか、 または例えばアビジン一ピオチンのよ うな相互反応性蛋白質を介して間接的に酵素で標識することもでき る。 酵素の抗体などへの結合は、 例えば市販のチオール導入基試薬 を利用して酵素及び標識すべき抗体などのそれぞれにチオール基を 導入してから両者を S — S結合させることで行うことができる。 酵 素としては、 ホースラディ ッシュパーォキシダ一ゼ、 アルカリ性ホ スファ夕ーゼ、 ^6 — D—ガラク トシダーゼなどが挙げられる。 酵素 の検出は、 その酵素に特異的な基質を用いて行う ことができる。 例 えばホースラディ ッシュパーォキシダ一ゼを利用する場合、 T M B ( 3， 3 ' , 5 , 5 ， 一テトラメチルベンジンジン） や A B T S ( 2 , 2 ' ーァジン - ジ [ 3—ェチルベンズチアゾリンスルホネート ] ) などが利用できる。
かかる免疫測定は、 前記一次抗体を固定した担体、 前記標識した 二次抗体、 被検試料を混合し、 インキュベーショ ンすることにより 、 担体に固定化された一次抗体に被検試料中の S C C Aを結合せし め、 この S C C A分子に標識二次抗体を結合せしめる。
このようにして、 標識化抗体は、 試料中の S C C Aの量を反映し た量において、 担体に固定化された一次抗体と試料に由来する S C C Aを介して担体上に固定される。 かかるインキュベーショ ンは、 適当な緩衝液、 例えば P B S中で約 4〜40° (：、 好ましくは 20〜37 で、 5分から数日、 好ましくは 1 0分から 24時間、 より好ましくは 1 0 分〜 3時間行う。 次に、 上記担体から未結合の標識化抗体を分離する操作を行う。 担体が固体担体である場合、 この分離操作は固液分離により簡単に 行うことができる。 一定の既知量の標識二次抗体を使用した場合、 担体に結合した標識もしくは未結合の標識又はこの両者を測定する ことができる。 他方、 任意の標識抗体を使用した場合、 担体に結合 した標識を検出、 測定する。 担体に結合した標識を検出するには、 好ましくは担体を洗浄液、 例えば適当な界面活性剤の入った緩衝液
、 例えば P B S— Tw e e n 2 0により洗浄して未結合の標識化抗 体を除去した後に検出を行う。 検出は標識の種類に依存して常法に 従って行う ことができる。
以下、 具体例を挙げて、 本発明を更に具体的に説明する。 なお、 本発明はこれにより限定されるものではない。 実施例
1. S C C Aと不全角化の関係の解明
材料及び方法
材料
Ac - WEHD- MCA、 Ac- YVAD- MCA、 Ac- VDVAD- MCA、 Ac-DEVD-MCA, Ac-VE ID - MCA、 Ac_IETD- MCA、 Ac-LEHD- MCAは Pep t ide Institute, Inc. (日 本、 大阪府）から購入した。
ベンジルォキシカルポニル（Z)- YVAD_FMK、 Z-VDVSD-FMK^ Z-DEVD- FMK、 Z- VEID- FMK、 Z_IETD_FMK、 Z- LEHD- FMK及び Z- VAD- FMKは、 BioV ision (Mountain View, CA)から購入した。 組換えカスパ一ゼ- 1〜 10 SBIOMOL Research Labs, Inc. (Plymouth Meeting, PA)から得た。 カスパーゼ— 14のプロ形及び大サブュニッ トの検出のために、 H- 99抗体（Santa Cruz Biotechnology, Inc)を使用した。 H- 99抗体は ヒ トカスパーゼ— 14のアミノ酸 24- 122に対応するペプチドに対し生 起された抗体であり、 従ってカスパーゼー 14のプロ酵素及びそのプ ロセッシングされた形態、 即ち、 その大サブユニッ トと反応する。 カスパーゼ— 14の小サブュニッ 卜の検出のためには、 C- 20抗体（S anta Cruz)を使用した。 開裂部位特異的抗体（M4D146)は、 ヒ トカ スパーゼー 14の推定プロセッシング部位に相当する合成ペン夕ぺプ チド TVGGDを用い、 ゥサギを免疫化することにより作成した。
WEHD- MC A加水分解活性の測定
Mikolajczyk J. et al. , Biochemistry 43, 10560-9 (2004)に記 載の方法に多少の変更を加え、 Ac_WEHD- MCAを基質として、 カスパ ーゼー 14活性を測定した。 簡単には、 アツセィ混合物を、 45^Lの 0 • 1M HEPES緩衝液（pH 7.5)、 0.06M NaCK 0.01% CHAPS, 5mM DTT、 1 .3M クェン酸ナトリウム及び IO M WEHD- MCAから作製した（全て、 最終濃度で表示）。 この混合物に酵素試料（5 1)を添加し、 これを 1 0〜30分間にわたってィンキュベ一卜した。 反応を 150 lの 0. 1Mの モノクロ口酢酸により停止させ、 そして Fluoroskan Ascent FL (The rmo Electron Co. , Wolsam, MA)を用い、 355nmの励起波長及び 460η mの発光波長により測定を行った。 インヒビ夕一アツセィの場合、 カスパーゼ— 14及びべプチドインヒビ夕一を室温で 15分間、 アツセ ィ緩衝液中でィンキュペートし、 そして 5 1の IOO M WEHD - MCAを 添加することによりアツセィを開始した。
カスパーゼー 14の精製
健常人の踵からこすり取ったヒ ト角化細胞（約 14g〉を、 ガラスホ モジナイザーを使用して、 0.14M NaClを含有する 0.1M Tris-HCl (pH 8.0)で抽出した。 60分間にわたって 15， 000gで遠心分離した後、 上 澄みを得た。 Amicon Ultra (Millipore, MA)で濃縮し、 Fast Desalt ing カラム HRlO/10 (Amersham Biosciences)で脱塩した後、 粗生成 物を HiPrep 16/10 Q XLカラムに塗布した。 カラムを 20mM Tris-HCl (pH 8.0)で洗浄し、 そして 0〜 1 Mの線形 NaCl勾配で溶離させた。 画分は抗カスパーゼ— 14抗体（H- 99) (Santa Cruz Biotechnology, C A)及び hMD146抗体を使用するウエスタンブロッ トにより追跡した 。 また、 各画分について Ac- Tyr- Glu-His- Asp-メチル -クマリ ンアミ ド （WEHD- MCA) (Peptide Institute, Inc. 日本国大阪）に対する加水 分解活性を測定した。 陽性を示した画分を同緩衝液で平衡させた Mo no Q カラムに載せ、 これを最大 1 Mの NaCl勾配で溶離させた。 力 スパーゼ一 14画分をさらに Mono S陽イオン交換クロマ トグラフィー により分離した。 カラムを 20mM酢酸緩衝液（pH4.5)で平衡にし、 そ して 0〜 1 Mの NaCl勾配で溶離させた。 陽性を示した画分を濃縮し 、 そしてこれを 25mMエタノールァミン（pH 8.3)で平衡にしたク口マ ト フオーカシング Mono Pカラムに載せた。 Polybuifer (pH 5.0) 46ml を使用し、 pH8から 5に至る pH勾配を形成させながら、 溶離を行つ た。 カスパーゼー 14は Superdex 75 ゲルクロマトグラフィーを用い 最終的に精製した。 タンパク質濃度は BioRad Protein Assay Kit ( BioRad Lab, Hercules, CA)で決定した。
組換えカスパーゼ— 14及び S C C A— 1 の調製
カスパーゼ— 14をコ一ドする cMAを順方向プライマー ： AAGGATCC AATCCGCGGTCTTTGGAAGAGGAG (配列番号 1 ) 及び逆方向プライマ一 ： TTTCTGCAGGTTGCAGATACAGCCGTTTCCGGAGGGTGC (配列番号 2 ) を使用 する PCRによってケラチノサイ ト cMAから単離 ' 増幅した。 PCR生成 物を pQE_100 DoubleTag ベクター（Qiagen, Valencia, CA)中にクロ —ニングし、 そして E. coli JM109中で発現させた。
SSCA1 cMAを乾癬 cMAライブラリ一 （Takeda A et al. , J. Inve st. Dermatol. , 118, 147 - 54 (2002) )から分離し、 そして pQE30べク 夕一（Quiagen)中にクロ一ニングした。 組換えタンパク質を Ni- NTA Agarose (Quiagen)及び Mono Qクロマトグラフィ一で精製した。 免疫組織化学
ヒ ト頭皮試験片を患者の同意のもと、 形成外科手術により得た。 組織をリン酸緩衝液（pH7.4)中の 4 %パラホルムアルヒ ド （PFA)で固 定し、 パラフィ ン中に包埋した。 薄切片を調製し、 そして 4°Cで一 晩にわたって適切な抗体と一緒にインキュベートした。 ペルォキシ ダ一ゼ接合ャギ抗ゥサギ IgG (ニチレイ社製）を二次抗体として使用 し、 発色試薬としての D A Bと反応させた。
TUN E L陽性細胞及び活性カスパーゼの二重免疫検出の場合、 Texas Red (登録商標） 色素接合抗ゥサギ IgG (ロバ）を二次抗体とし て使用した。 T UN E L反応はフルォレセイン in situ 細胞死検出 キッ ト （Roche Diagnostics)を使用し、 その製造者の指示書に従つ て実施した。
I C ADのウェスタンブロッ ト及び免疫組織化学分析の場合、 抗 ICAD IgG(FL331, Santa Cruz Biotechnology)及び DFF45/ICAD Ab-2 (NeoMarkers, Fremont, CA)を使用した。
活性アトピー性皮膚炎 （AD) 患者の皮膚内には、 クラスター化 した不全角化が往々にして観察されることが報告されている （Saku rai K. et al. , J. Dermatol. Sci. 30, 37-42 (2002)； Piloto Val des, L. et al. , Al lergol. Immunopathol. (Madr) 18, 321-4 (199 0)) 。 本実験においては、 非侵襲的方法を用い、 不全角化性皮膚に おける I C AD及び S C C A— 1 の局在を調べた。 AD又は健常有 志の皮膚から表在性角化層を採取し、 そして医療用接着剤 Aron Alp ha A(Sankyo Co. , Tokyo)を使用してスライ ドガラス上に付着させ た。 3 %パラホルムアルデヒ ドで固定したあと、 試料に 0.1% Trito n X- 100を浸透させ、 そしてこの試料を抗 I C AD又は抗 S C C A ― 1抗体で一晩にかけて 4でで免疫染色した。 Alexa Fluor 400接 合型抗ラビッ ト （ I C AD) 又は抗マウス IgG ( S C C A— 1 ) を それぞれ二次抗体として、 1時間にわたって室温で使用した。 核の 視覚化のために、 試料を 0. 1%ヨウ化ピリジゥム溶液中に 5分間浸漬 し、 そして P B Sで 3回洗浄した。 蛍光観察のために、 Leica DMLA 顕微鏡を使用した。
ウエスタンブロッ ト分析
SDSポリアクリルアミ ドゲル電気泳動法により、 5〜 20%勾配のゲ ルでタンパク質を分離した。 電気泳動後、 タンパク質をポリ ビニリ ジンジフルオライ ド膜（iMiobilon- P、 Millipore, Bedford, MA)上 に転写し、 そして H- 99， hl4D146又は C20を含む抗カスパーゼー 14抗 体と一緒にインキュベートした。 ペルォキシダーゼ標識抗ゥサギ Ig G (Sigma)又は抗ャギ IgGを二次抗体として使用し、 そして免疫反応 性タンパク質を ECL-プラス （Amersham)を用い化学発光法で視覚化さ せた。
結果
角化細胞中のカスパーゼ一 14は Asp146でプロセッシングされる
ウエスタンブロッ ト分析によると、 H-99抗体は角化細胞抽出物中 の 17KDaのバンドしか検出しなかった （図 2 ) 。 この結果は、 プロ セッシングされていない 30KDaの形態を含む、 全皮膚又は皮膚等価 モデル由来の抽出物についての結果とは一致しない。 この 17KDaバ ンドは hl4D146抗体 （図 2 B) でも認識され、 活性カスパーゼ— 14( p 17)の大サブユニッ トであると推定される。 このことは、 カスパー ゼー 14の成熟が、 終末分化の最終段階中に Asp146での開裂によつて 達成されることを示唆する。 さらに、 30KDaのバンドが、 皮膚等価 モデルにおいて、 H- 99及び h D146抗体によっても認識され、 この ことは、 Asp146における切断を示唆する。
角化細胞抽出物からのカスパ一ゼ一 14の調製
角化細胞中のカスパーゼ— 14の大部分はプロセッシングされた形 態、 それ故、 活性型で存在すると推定されるので （Eckhart L. et al. , J. Invest. Dermatol. 115, 1148-51 (2000)； Lippens S. ei al. , Cell Death Differ. 7, 1218-24 (2000)； Mikolajczyk, J. e t al. , Biochemistry 43, 10560-9 (2004) ) 、 ヒ ト角化細胞は優れ たカスパーゼー 14精製源であると考えられる。 しかしながら、 ヒ ト 角化細胞がカスパーゼー 1様酵素を含有することも知られている （ Takahas i T. , J. Invest. Dermatol. Ill, 367-72 (1998) ) 。 カス パ一ゼ一 1の基質、 例えば WEHD-基質は、 カスパーゼ— 1及びカス パーゼー 14の両者によって加水分解することができる。 本発明者は 先ず、 1.3M クェン酸ナトリウム及び 5 mM ジチオスレィ トールの有 無で、 カスパーゼ— 1 による WEHD- MCA加水分解を試験した。 WEHD- M CAは標準のカスパーゼァッセィ緩衝液中でカスパーゼー 1 の優れた 基質であるにもかかわらず、 コスモトロピックイオンの存在下では 、 カスパーゼー 1はこの基質を加水分解できないことが確認された (データーは示さない）。 従って、 それぞれの画分を、 WEHD- MCAに対 する加水分解活性、 H- 99に対する反応性、 及び hl4D146抗体といつ た 3通りの方法で評価した。 表 1 は、 連続クロマトグラフィーの結 果を示す。 HiPrep Q カラムを使用した最初の陰イオン交換クロマ トグラフィ一の後、 収率は 170%の上昇を示し、 比活性は約 10倍上昇 した。 この上昇はおそらく、 内在性のインヒビ夕一からのカスパー ゼー 14の隔離によるものと考えられる。 ウェスタンプロッ ト分析に よれば、 画分 No.16〜20は分子量 17 KDaの H- 99陽性且つ 14D146陽性 バンドを含有することが示された。 これらの画分は、 WEHD- MCA加水 分解活性も認められた。 続く Mono Q 陰イオン交換クロマトグラフ ィ一において、 画分 No.25〜No.29は、 17 KDaの H- 99陽性且つ M4D14 6陽性パンドの存在による判定に従い、 プロセッシングされた形態 のカスパーゼ— 14を含有する。 これらの画分だけが WEHD- MCA加水分 解活性を示した。 Mono S陽イオンクロマトグラフィ及び Mono Pクロ マトフォーカシングは主だった夾雑タンパク質を除去するのに有効 であり、 そして比活性はそれぞれにより 3. 5倍及び 7倍上昇させた。 ここでもまた、 H- 99陽性且つ h 14D 1 4 6陽性画分だけが WEHD- MC A加水 分解活性を示した。 Supe rdex 75クロマトグラフィーによる最終段 階は分子量 30 KDaのピークを分離し、 このピークは WEHD- MCA加水分 解活性ピークと一致した。 SDSポリアクリルアミ ドゲル電気泳動法 は、 この調製物力 7KDa及び l lKDaの断片を含むことを示した。 前者 は H- 99抗体及び 1114D1 4 6抗体の両者に対して陽性を示し、 後者は C 20 抗体で認識された。 このことは、 ヒ トカスパーゼ— 14が大サブュニ ッ ト （17KDa)及び小サブュニッ ト （l lKDa)から成るヘテロダイマ一と して精製されたことを示唆する。 また、 Supe rdex 75ゲルクロマト グラフィ一は、 他のカスパーゼとは異なり、 ヒ ト角化細胞中のカス パ一ゼ— 14はダランザィム B活性化型のようにモノマ一として存在 することを示した。 表 1 はカスパーゼ一 14の精製率をまとめている 。 約 l OOmgの可溶性タンパク質抽出物から出発して、 精製タンパク 質 1 1. 8 gを得た。 比活性は 764倍上昇し、 収率は 9. 1%であった。
カスパーゼー 14の精製のまとめ
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精製カスパーゼー 14の酵素特性
精製カスパーゼー 14の酵素特性を調べた （図 3〜 4 ) 。 カスパー ゼ一 14は様々なカスパーゼインヒビター、 例えば YVAD- FMK (力スパ —ゼ一 1インヒビ夕一）、 VDVAD-FMK (カスパーゼ一 2インヒビ夕一 ) 、 DEVD- FMK (カスパーゼ— 3インヒビ夕一） 、 IETD— FMK (カスバ ーゼー 8インヒビ夕一） 、 LEHD -FMK (カスパーゼー 9インヒビ夕 ―) 及び VAD— FMK (pan—カスパーゼインヒビ夕一）に対する感受性 を有した （図 3 ) 。 なお、 VEID— FMKの効果はほとんどなかった。 とりわけ YVAD- FMKは、 カスパーゼー 14活性に対して極めて強力な阻 害効果を示した。 このことはおそらく、 カスパ一ゼ一 1 とカスパー ゼ— 14との間の構造類似性によるものと考えられる。 pan -カスパー ゼインヒビ夕一 VAD - FMKは、 VAD- FMKと同程度にカスパーゼ一 14活性 を抑制した。 システィンプロティナ一ゼに対するクラス特異的イン ヒビ夕一であるョード酢酸（I AA)、 又はセリンプロティナ一ゼに対 するクラス特異的インヒビ夕一である 4- (2-ァミノェチル）ベンゼン スルホニルフルオリ ド （AEBSF)は、 この研究における試験濃度では 有意な阻害効果を示さなかった。
I C AD分解に対する精製カスパーゼ— 14の効果
カスパーゼー 14の天然基質の模索中に、 本発明者は I C ADに対 するカスパーゼ— 14の効果を試験した。 というのも、 核の消失は終 末分化にとって極めて重要な事象の 1つであるからである。 通常の カスパーゼアツセィ緩衝液中で組換え I C ADタンパク質と共に精 製カスパーゼ— 14をインキュベートすると、 抗 ICAD IgGを用いたゥ エスタンブロッ ト分析による判定によれば、 精製カスパーゼー 14は I C ADに対し何ら加水分解活性を示さなかった （図 4 A) 。 しか し、 コスモトロピック塩の存在下では、 インタク 卜な I C ADタン パク質が減少し、 2つの主要な分解生成物が増加することから、 精 製カスパーゼー 14は I C ADに対して限定的な分解作用を示した。 S C C A— 1 によりカスパーゼ一 14が阻害される
S C C A— 1はセルピン超科に属するものの、 システィンプロテ イナーゼ、 例えばパパイン及びカテブシン Lを阻害する （Takeda A . et al.， Biol. Chem. 383, 1231-6 (2002) ) 。 このことは、 S C C A— 1が Crm- A32のような固有のクロスクラスインヒピタ一であ ることを示す。 従って、 本発明者は S C C A— 1がカスパ一ゼメン バーを阻害できるかどうかを試験した。 カスパーゼー 14の場合、 コ スモトロピック条件を利用した。 組換え活性カスパーゼを S C C A - 1 と共にィンキュベ一トしても、 カスパーゼメンバ一 〜 10)の いずれも酵素活性について何ら影響を受けなかつた。 これとは逆に
、 S C C A - 1は用量依存式にカスパーゼ— 14の WEHD- MCAに対する 活性を抑制した（図 4 C) 。 SCCA— 1はカスパーゼ— 14による I C A D分解も阻害した。 インキュベーショ ンを延長しても、 酵素活性の 回復を示すことはなかった。 このことは、 カスパーゼー 14と S C C A— 1 との強い結合を示唆する （図 4 B) 。
活性カスパーゼ— 14及び TUNEL陽性細胞の局在
カスパーゼ— 14が脱核プロセスに関与するかどうかを調べるため 、 本発明者は、 活性カスパーゼ— 14及び TUNELの二重染色を行った 。 図 5 Aに示すとおり、 プロ形及び活性型を含むカスパーゼー 14は 、 正常ヒ ト表皮内の有棘細胞から角化細胞にかけて局在していた。 このことは過去の所見（Lippens et al. , (2000)、 前掲）と合致する 。 hl4D146抗体で検出された活性カスパーゼー 14は、 角化細胞及び 顆粒細胞の一部に限定されていた（図 5 B)。 角化細胞のほとんどは 遍在的に染色された。 TUNEL陽性細胞は、 角化層のすぐ下側に観察 されたが、 これらの陽性細胞の多くは著しく制限された（図 5 C)。 興味深いことに、 T丽 EL陽性細胞は、 専ら hl4DU 6陽性細胞と共に局 在していた。 このことは、 これらの細胞 で DNA断片化が起きてお り、 活性カスパーゼ一 14がこのプロセスに関与していることを示唆 している。
不全角化性核における I C AD及び S C C A— 1の共局在
正常なヒ ト上皮の縦断面では、 FL331抗体を使用することで、 基 底細胞及び基底上細胞の核内に I C ADの局在が主にあることがわ かる。 細胞質は、 基底細胞から顆粒細胞において弱く陽性を示した 。 角化層においては、 I C ADに対する免疫反応性は大幅に低減し た。 Ν末端ペプチド抗体 DFF45/ICAD Ab-2を使用しても事実上同じ 結果が得られた（データーは示さず） 。 AD患者の表在性角化層を 抗 ICAD抗体（FL-331)で染色した場合、 様々なサイズのクラスター領 域がこの抗体に対して陽性を示した （図 6 B) 。 P I による核染色 は、 不全角化性の核がこれらの斑状の島内に常に見いだされること を示した （図 6 C) 。 表在性角化層の明視野は、 凹凸の多い粗い表 面を示した （図 6 D) 。 重畳画像は、 不全角化部位が I C AD陽性 部位と一致することを示した （図 6 E及び 5 F) 。 これらの結果は 、 終末分化において核を排除するのに I C AD分解が必要とされる ことを示唆する。
正常な皮膚の場合、 極めて低レベルの S C C A— 1が顆粒層内で 検出された。 活性 ADを有する表在性角化層内でも、 陽性部位の斑 状分布が顕著な強い免疫染色が見いだされた（図 7 H)。 同様に、 S (3 八ー 1陽性領域は、 P I 陽性の核の層、 即ち不全角化部位と一 致した（図 7 J〜L)。 これらの結果をまとめると、 I C AD/C A D系が脱核プロセスの主要な役割を果たし、 そして S C C A— 1は サブレッサーとしてこの反応に関与することを示唆する。
考察
カスパーゼー 14は大部分が表皮内で発現され、 その他の組織内で はほとんど発現されない （Van de Craen, M et al. , Cell Death D if fer. 5, 836-46 (1998) ) 。 過去の報告によれば、 ケラチノサイ トの終末分化はカスパーゼー 14のプロセッシングと連携していると のことであり、 このことは、 カスパーゼの有するプロテアーゼ活性 の亢進を示唆する （Lippens, S et al. , Cell Death Differ 7, 12 18-24 (2000)； Eckhart 1. Biochem. Biophys. Res. Com醒. 277, 655-9 (2000) ； Hu S. J. Biol. Chem 273, 29648-53 (1988) ) 。 最 近、 Mikolajaczyk et al. , ( 2004) 前掲） は、 グランザィム B切 断カスパーゼー 14がコスモト口ピック塩の存在下で酵素的に活性で あることを実証した。 この研究において、 本発明者は、 ヒ トカスパ ーゼー 14がケラチノサイ ト分化の最終段階において活性であるかど うかを調べるために、 完全に分化されたケラチノサイ トからのカス パーゼー 14の精製を試みた。 本発明者は、 大サブユニッ ト、 プロ形 (H - 99) (Asp146 (hl4D146)に推定カスパーゼ切断部位を有する） 及 び小サブュニッ ト （C20)をそれぞれ認識する 3種の抗体を使用した 。 最終調製物は 2つのタンパク質バンド、 すなわち 抗体に よって認識された 17KDaのタンパク質バンド、 及び C20抗体によって 認識された llKDaのタンパク質バンドから成った。 これらのタンパ ク質バンドは、 活性カスパーゼ— 14の大及び小サブュニッ トである 。 精製工程の間、 H- 99陽性の 17KDaのバンドが、 hl4D146抗体と一緒 に認識された。 このことは、 大サブユニッ トがその力ルポキシル末 端において AspH 6で終わることを示唆している。 小サブユニッ トの ァミノ末端領域は Lys153-Asp- Ser_Pro - Ginとして同定され、 このこ とは、 プロセッシングが Ue152と Lysi 53との間で生じることを示唆 する。 この部位はカスパーゼメンバーとしては奇異な切断部位であ る。 このことは、 包皮抽出物から免疫沈降させたカスパーゼー 14が 同じ部位で切断を示すという、 Chien他の発見（Biochem. Biophys. Res. Commun. 2002 Aug 30 ; 296 (4) ; 91卜 7)と合致する。 従って、 ヒ トカスパーゼー 14は高活性へテロダイマーとして均質に精製された と結論付けた。 カスパーゼー 14の成熟には、 2つの部位 Asp146及び lie152におけるプロセッシング、 並びにリンカ一領域 Xxx147及び II e152内の 6つの残基の除去が関与するものと示唆された。 2つの異 なる切断部位（一方は酸性、 他方は疎水性）の存在はまた、 カスパー ゼー 14の活性化が多数の酵素により多段階的に行われることを示唆 する。
精製カスパーゼー 14の酵素学的特性は極めて独自のものであった 。 精製カスパーゼ一 14は、 既知のカスパーゼインヒビ夕一に対し比 較的広いインヒビター感受性を示した。 とりわけ、 カスパーゼ 1ィ ンヒビター YVAD- FMKが最も強い阻害作用を示した。 YVAD-FMKは WEH D - MCA並びに別のカスパーゼ— 1基質である YCAD- MCAに対して最も 高い活性を示した。 このことは、 カスパーゼ- 1とカスパーゼ一 14と の密な関係を示唆する。 しかし、 本発明者が明らかにしたところで は、 カスパーゼ— 14は顕著に異なる特性を有している。 本発明者は 、 S C C A— 1がカスパーゼ— 14に対する内在性インヒビ夕一であ ることを初めて解明した。 S C C A— 1 の最も特異的な特性は、 力 スパーゼー 14に対する著しい特異性である。 カスパーゼ 1〜 10の他 の構成員が S C C A— 1 による影響を受けることはない。 合成基質 DEVD- MCA又は天然基質 I C ADを使用して、 S C C A— 1がカスパ —ゼ— 3活性を阻害することはなかった。 これは Crm Aとは対照的 である。 Crm Aもセルピン超科に属し、 カスパ一ゼ一 1及びカスパ ーゼー 8を含む多数のカスパーゼを抑制することができることで知 られる (Gagliardini V. et al. , Science 263, 826-8 (1994) ) 0 XI ΑΡはカスパーゼー 3， 一 7及び— 9 を阻害することで知られる （Sri nivasula S. M. et al. , Nature 410, 112-6 (2001) ) 0 抗アポトー シス性タンパク質 p35はカスパーゼ— 1， 一 3， 一 6, - 7 , - 8 及び一 10を阻害することから、 より広いスぺク トルを有すると考え られる。 これらの阻害タンパク質 Crm A, IAP及び p35の全てがいく つかの開始及び実行カスパーゼの一部を抑制し得るという事実は、 これらの分子が典型的なアポトーシス経路の実行に関与しているこ とを示唆する。 他方、 本発明者の結果が強く示唆しているのは、 S C CA— 1が通常のアポトーシス事象におけるキ一プレーヤ一では ないが、 カスパーゼ— 14により媒介される脱核プロセスにおける重 要なレギユレ一夕一である、 ということである。
このプロセスの分子メカニズムは解明されていなかった。 本発明 者は、 ヒ トカスパーゼ— 14がコスモトロピック塩の存在下において 、 I CADを分解できることを明らかにした。 I CAD (DNA断 片化因子 「D F F 4 5」 とも称される） は、 カスパーゼ活性化型 D Nァ一ゼ（CAD) (又は D F F 4 0 ) と称されるマグネシウム依 存性エンドヌクレア一ゼに対するインヒビタ一である。 I C A Dノ C AD系は、 アポ卜一シス性細胞死中の染色体 DN Aの分解におい て主要な役割を演じる。 C ADに結合した I C ADは、 不活性複合 体として存在する。 カスパーゼー 3は、 I CADに対し限られた夕 ンパク質分解を示し、 2つの部位 Asp117及び Asp 224で切断する。 こ の切断は CADを活性化し、 DNA分解を開始させる （Nagata S. Exp. Cell Res. 256, 12-8 (2000) ) 。 カスパーゼ一 3はアポトー シスの際の大量の細胞タンパク質の切断にとっては必ずしも必要で ないが、 I C ADの切断にとっては必須である （Tang D. et al. , J. Biol. Chem. 273, 28549-52 (1998) ) 。 このことは、 カスパーゼ 一 3が D N A断片化に極めて重要であり、 他の実行カスパーゼ、 即 ちカスパーゼー 6や 7は重要ではないことを示す。 興味深いことに 、 カスパーゼー 14は I C ADから、 12KDa及び 35KDaの似たような切 断断片を生成した。 配列分析は同一の切断部位を示した。 このこと は、 カスパ一ゼ一 14がカスパーゼ— 3の完璧な代替物となり得るこ とを示唆している。 カスパーゼー 14は I C ADを分解し得るものの 、 下記の理由から、 プロアポ卜一シスカスパーゼー 3 とは明らかに 異なる。 第 1 に、 カスパーゼー 14の過剰発現はアポトーシス性細胞 死を誘導しない （Van de Craen. Cell Death Differ. 5， 838-46 (1 998) ) 。 このことはカスパ一ゼ一 3 とは対照的である。 第 2 に、 力 スパ一ゼ— 14は種々のアポトーシス性刺激では活性化されない （Li ppens et al. (2000)、 前掲） 。 開始カスパーゼ又はその他のカス パーゼメンバーは、 プロ一カスパ一ゼ一 14をプロセッシングするこ とができなかった。 このことは過去の所見と一致する （Lippens et al. (2000)、 前掲） 。 活性化は終末分化においてのみ発生する （E ckhart L. et al. , (2000)、 前掲） 。 第 3に、 カスパーゼ— 14の合 成は、 成人組織における分化中のケラチノサイ トに限定される （Ec khart L. Bioc em. Biophys. Res. Commun. 277, 655-9 (2000) ) 。 また、 I C AD切断に対するカスパーゼ一 14の能力は、 カスパーゼ 一 3 とは顕著に異なる様式で調節される 力スパーゼ— 14による I
C AD分解は、 異常な高濃度のコスモト Πピックイオンを必要とす
•3 0 しのようなイオン濃度では、 他の力スパ一ゼはほとんど活性で はなかつた。 総合的に見て、 カスパーゼ ― 14は 、 ケラチノサイ 卜分 化プログラムがその活性化を調節することから 、 カスパ一ゼメンバ
—の中では特殊な位置づけにあるように考えられる。
ケラチノサイ ト終末分化における I C AD/C AD系の関与は、 in vivo実験によってさらに裏づけされる。 免疫組織化学的研究は 、 I C ADが基底ケラチノサイ 卜から有棘ケラチノサイ トにかけて 核内に存在し、 顆粒細胞で消失し、 核の消失は終末分化の際に起こ ることが示された。 A D患者の表在性表皮内には、 I C A Dの強い 免疫染色が斑状部位に示された。 これらの領域は若干粗い表面を有 し、 半透明性が低い。 まさにこれらの領域上に、 P I陽性な、 未消 化の核の集合が共局在していた。 他の領域が抗 I C AD抗体で染色 されることはなかった。 また、 A D患者の皮膚からのテープス トリ ッビング試料はインタク トな I C A Dタンパク質の存在を示したが 、 健常人の抽出物中では検出されることはなかった。 これらの結果 は、 I CADが終末分化の際の脱核プロセスに関与していることを 示唆する。
正常な表皮では S C C A— 1はほとんど発現されない。 他方、 乾 癬表皮、 口腔粘膜及び食道においては、 強い発現が報告されている (Takeda A. et al. , J. Invest. Dermatol. 118, 147-54 (2002) ) 。 興味深いことには、 これらの組織には不全角化が伴っている。 本 発明者は、 不全角化部位には S C C A— 1の強い染色も見いだされ ることを明らかにした。 さらに、 S C CA— 1及び I CADは、 核 の集合が存在する箇所と同じ部位に常に共局在していた。 S C CA 一 1又は I CADが陰性である他の表皮表面部分はなかったので、 不全角化部位におけるこれらの分子の共局在は、 これらの分子が脱 核プロセスの抑制に関与することを示唆する。 パン-カスパーゼィ ンヒビ夕ー VAD-FMKにより、 皮膚等価モデルにおいて核が消失しな くなることが報告されている （Weil他、 1999)。 MD- FMKが最も強力 なカスパーゼー 14インヒピ夕一の 1つであるという本発明者の発見 は、 カスパーゼ一 14がおそらく この反応における候補であるという 可能性を高める。 カスパーゼ— 14は、 乾癬皮膚の不全角化部位内で はダウンレギュレートされ、 また口腔表皮内には存在しない。 口腔 表皮では、 核の消失は何らかの形で損なわれるか、 或いは行われな い （Lippens et al. , (2000)、 前掲） 。 興味深いことには、 S C C A— 1はこれらの組織内でアップレギユレ一卜される。 おそらく、 これらの分子の異常発現は、 核の恒久的な存在などを含む、 不完全 な分化を引き起こすものと考えられる。
皮膚内のカスパーゼ一 14の活性化メカニズムは全体的によくわか つていない。 皮膚又は皮膚等価モデルにおいてのみ活性化が観察さ れ、 細胞培養系では観察されない （Eckhar t L. e t a l . (2000)、 前 掲） 。 実際に、 本発明者は種々の条件を試した。 これらの条件には 、 血清の添加、 集密になってからカルシウムの存在下もしくは非存 在下での 14日目までの培養期間の延長、 カルシウムィオノフォア A2 3 187による処理、 又は多くの分化マーカ一をアップレギュレートす るのに十分な 30分間にわたる空気暴露を含む。 これらの分化刺激は 顕著なカスパーゼ— 14mRNA発現を誘導するものの、 カスパーゼ— 14 活性を引き起こすのに効果的な刺激はなかった （データーは示さな い） 。 活性化プロセスは厳密に制御され、 単層培養中で強く抑制さ れる。 層化及び空気暴露がその活性化に必要と思われる。 カスパー ゼー 14の活性化は、 アポトーシスプログラムによってではなく、 分 化プログラムによる制御を介して行われるのが明らかである。 終末 分化プロセス中には、 セリ ン、 システィン及びァスパラギン酸プロ ティナ一ゼを含む多くのプロティナ一ゼも活性化される。 トリプシ ン様及びキモトリブシン様血清プロティナ一ゼは、 最も外側の角化 細胞を脱落させる役割を演じることが示唆されている。 システィン プロティナーゼの一部、 例えばカテブシン B及び Lは分化されたケ ラチノサイ ト中でアップレギュレートされる。 カテブシン D、 ァス パラギン酸プロティナーゼもまた、 角化細胞を脱落させる役割を演 じることが示唆されている。 これらの酵素は他の分化メカニズム、 例えばカスパーゼ— 14の活性化に関与することがある。
以上をまとめると、 本発明者は、 ヒ ト角化細胞抽出物からカスパ ーゼ— 14を精製した。 カスパーゼ— 14は核の消失を誘導し、 この消 失はアポトーシス様であるが、 しかしケラチノサイ ト分化の最終段 階で I C AD分解を介して生じる区別可能な変化であることが強く 示唆される。 このプロセスはいくつかのアポトーシス性因子を共有 するものの、 これは損傷された細胞の排除を招く細胞死プロセスで はなく、 主要な役割であるバリア一機能のための構造全体を完成す ることを目的とした構成プロセスである。 カスパーゼー 14又は S C C A— 1 の異常発現は分化プログラムに直接的に影響を及ぼし、 そ の結果、 不全角化及びバリアー機能崩壊が生じる。
2. 皮膚角層細胞の S C C Aの発現を指標とする、 皮膚性状の評価 材料と方法
( 1 ) 抗体
S C C A— 1及び 2の両者を認識するポリクロ一ナル抗体は、 乾 癬表皮の鱗屑から精製した S C C A ( S C C A— 1及び S C C A— 2 ) を用いて、 ポリクローナル抗体を作製した。 乾癬表皮の鱗屑抽 出物 （抽出液 ： 0. 1M Tris_HCl (pH8.0) , 0. 14M NaCl)を遠心後、 上 清を Sephacryl S-200, DEAE Sepharose, Mono Q, Mono S, Mono P, Superrose 6にて精製し、 これを抗原として、 ゥサギを感作動物と して用いた。
抗ー S C C A— 1モノクローナル抗体及び抗— S C C A— 2モノ クローナル抗体は Santa Cruz Biotechnology, CA, USAより入手し た。
( 2 ) 免疫組織化学的検査
表皮生検を AM e X手順 （Sato Y. et al. Am. J. Pathol. , 125 ， 431-435 (1986) ) に従い、 冷却アセトンで固定してからパラフィ ンの中に包埋した。 切片をキシレンで脱パラフィ ン処理し、 ァセト ン、 次いで P B Sで洗浄した。 次にその切片の非特異的結合部位を 1 0 %正常ャギ血清（Histof ine， Tokyo, Japan)でブロックした。 表皮切片を抗一 S C C A— 1·モノクローナル抗体 （1 ： 500に希釈 ) 、 上記のとおりに精製した抗— S C C A— 2モノクローナル抗体
(1 ： 500に希釈） 又は抗ー S C C Aポリクローナル抗体 （1 ： 500に 希釈） のそれぞれとインキュベーショ ンした。 P B Sで洗浄後、 切 片を DAKO E n v i s i o n S y s t e m (DAKO Corp.， CA,
USA)で発色させた後に、 へマトキシリンでカウンター染色して観 察した。
( 3 ) E L I S A
皮膚角層試料は透明粘着テープ （セロテープ （登録商標） （NICHI BAN)) を皮膚表面に貼付したのち剥離するテープス トリ ツビングに より採取した。 皮膚角層の付着したこのテープを裁断、 抽出バッフ ァ一 (0.1M Tris-HCl (pH8.0) , 0.14M NaCK 0.1% Tween-20, lml ) に浸漬、 超音波処理 （20 sec x 4 ) にかけ、 試料抽出液を作製 した。
P B Sに希釈したポリクローナル抗 S C C A抗体 （ 1： 1000に希釈 ) を 100 l ずつ、 96穴 E L I S Aプレー トの各ゥエルに分注し、 一晩室温におき、 プレートの固相に結合させた。 その後、 プレート への非特異的な結合を阻害するために、 ブロッキング溶液 （プロッ クエースを P B S _T w e e n 2 0で希釈した溶液、 300 1/ゥェ ル） にて 1時間インキュベートした。
上記試料抽出液 50^ 1 を E L I S Aプレー卜の各ゥエルに添加し 、 37°Cで 2時間反応させた。 モノクローナル抗 S C C A_ 1抗体 （ 1:1000に希釈） 又はモノクローナル抗 S C C A— 2抗体 （ 1:1000に 希釈） を添加して 37°Cで 1時間反応させた。 次に、 二次抗体、 西洋 ヮサビペルォキシダーゼ標識抗マウスを添加して 37°Cで 1時間反応 させ、 0.1% Tween- 20 PBSで洗浄後、 基質 3', 3', 5', 5'—テトラ メチルベンジジン （TM B) を添加して、 TM B P e r o x i d a s e E I A s u b s t r a t e k i t (BIO-RAD社） を用いて 発色させ、 630 nmで測定を行った。
( 4 ) 皮膚の経皮蒸散水分量 （T EWL) の測定
検体 （正常人の顔面及び内腕） の T EWLは、 T EWAm e t e r (TM120)を用いて測定を行った。
糸口
( 1 ) 免疫組織化学的検査
図 8は、 表皮検体として、 非露光部位 （比較的日光に晒される機 会の少ない部位） である上腕部 （ヒ ト 24歳） 、 臀部 （ヒ ト 46歳） 、 太腿部 （ヒ ト 75歳） 由来の表皮、 及び露光部位 （比較的日光に晒さ れる機会の多い部位） である類部 （ヒ ト 20歳、 76歳） 、 目瞼 （ヒ ト 82歳） 由来の表皮を採取し、 抗体として S C C A _ 1及び S C C A — 2の両者に結合する抗ー S C C Aポリクローナル抗体を用い、 顕 微鏡観察した結果である。 図 8から、 非露光部位と比べ、 紫外線へ の暴露などといったより過酷な環境に常に晒されている露光部位の 表皮上層において S C C Aが顕著に亢進していることがわかる。
図 9は、 正常表皮上層 （50歳男性） 及び乾癬に罹った表皮上層の S C C A_ 1及び 2の発現を示す。 図から明らかな通り、 正常皮膚 では S C C A— 1及び 2共に弱い発現しか示さないのに対し、 炎症 性不全角化症である乾癬に罹った皮膚では、 S C C A— 1及び 2 と もに顕著な発現を示した。
以上より、 正常な皮膚角層に比べ、 露光部位や不全角化の生じた 皮膚部位において S C C Aの発現の顕著な亢進が認められた。
( 2 ) E L I S A
1 ) 正常皮膚角層における S C C A発現量
正常な皮膚性状を示す露光部位の皮膚 （顔面及び頰部） 及び正常 な皮膚性状を示す非露光部位 （内腕） に対しテープス トリ ツビング を施すことでそれぞれの角層を採取し、 S C C A— 1及び S C C A 一 2の発現量を E L I S Aにより測定した。 その結果を図 10に示す 非露光部位に比べ、 露光部位での S C C A— 1及び 2の発現が顕 著に亢進していることがわかる。 従って、 E L I S A法により、 正 常な性状を示すとはいえ、 過酷な環境に常に晒されている露光部位 の表皮上層の方が、 非露光部位と比べ、 S C C A、 特に S C C A— 1が顕著に亢進していることが定量的に判定できる。
2 ) 乾癬皮膚角層における S C C A発現量
正常な皮膚性状を示す個体の皮膚 （非露光部位 ： 内腕） 及び乾癬 に罹った患者の皮膚の各々に対しテープス トリツビングを施すこと でそれぞれの角層を採取し、 S C C A— 1及び S C C A— 2の発現 量を E L I S Aにより測定した。 乾癬に罹った患者の皮膚部位とし て、 痒みを伴った被疹部位、 痒みの伴わない被疹部位、 及び無疹部 位を試験した。 その結果を図 Πに示す。
正常個体の皮膚角層においては S C C A— 1及び一 2の発現はほ とんど認められないのに対し、 乾癬に罹った患者の被疹患部におけ る角層では、 痒みを伴うか伴わないかにかかわらず、 S C C A— 1 及び一 2の発現の顕著な亢進が認められた。 なお、 乾癬患者でも、 乾癬症状の認められない皮膚部位 （無疹部） においては、 S C C A - 1及び— 2の発現はほとんど認められなかった。
3 ) ア トピー性皮膚炎皮膚角層における S C C A発現量
正常な皮膚性状を示す個体の皮膚 （非露光部位 ： 内腕） 及びア ト ピー性皮膚炎に罹った患者の皮膚の各々に対しテープス トリ ッピン グを施すことでそれぞれの角層を採取し、 S C C A— 1及び S C C A— 2の発現量を E L I S Aにより測定した。 アトピー性皮膚炎に 罹った患者の皮膚部位として、 被疹部位及ぴ無疹部位を試験した。 その結果を図 12に示す。
正常個体の皮膚角層においては S C CA— 1及び一 2の発現はほ とんど認められないのに対し、 ァトピー性皮膚炎に罹った患者の患 部における角層では、 被疹部位であるか無疹部位であるかにかかわ らず、 S C C A— 1及び一 2の発現の顕著な亢進が認められた。 従 つて、 アトピー性皮膚炎の場合、 ア トピー性皮膚炎の発症前であつ ても、 S C C A— 1及びノ又は一 2を指標とすることで、 その疾患 の診断を行うことが可能である。 このことは、 S C CAを指標とす れば、 ア トピー性皮膚炎の罹りやすさを判定でき、 その予防又は早 期 （例えば発症前） 対処が可能となる。
4) S C C A発現量と経皮蒸散水分量 （TEWL) との相関
皮膚角層について E L I S Aにより S C CA発現量を測定すると ともに'、 皮膚生理パラメ一夕一としての T EWLも調べ、 S C CA 発現量と TEWLとの相関を調べた。 その結果を図 12に示す。 S C C A - 1 と TEWLとでは Pearson相関係数が 0.876であり、 S C C A— 2と T EWLとでは Pearson相関係数が 0.600であり、 ともに有 意な相関が認められ、 従って TEWLが高く、 肌の性状が比較的悪 い状態のとき、 S C CA— 1及び一 2ともに、 特に S C CA— 1の 発現量が高くなることがわかった。
5) 花粉症皮膚角層における S C C A発現量
正常な皮膚性状を示す個体の皮膚 （コントロール） 及び花粉症に よる肌荒れを患った患者の皮膚の各々に対しテープス トリ ツビング を施すことでそれぞれの角層を採取し、 花粉症皮膚における肌荒れ と TEWLとの関係を調べるとともに、 花粉症皮膚における肌荒れ と S C CA— 1の発現量を E L I S Aにより測定した。 皮膚部位と して、 内腕 （非露光部） 及び額 （露光部） を選定した。
図 14は花粉症皮膚における肌荒れと、 TEWLとの関係 （A) 、 及び S C C A 1発現量との関係 （B) を示す。 この図から明らかな とおり、 花粉症により T EWLの有意な上昇が認められ、 皮膚バリ ァ一機能の低下が生じ、 肌荒れ状態となった皮膚では、 正常個体に 比べ、 S C C A— 1の発現が顕著に亢進していることが認められた 。 従って、 S C C A_ 1が花粉症による肌荒れの指標となることが 明らかとされた。 また、 花粉症皮膚では、 日光の当たらない内腕で も T E W Lの悪化、 即ちバリアー機能の低下が認められ、 全身の炎 症反応と S C C Aの亢進が身体のバリアー機能を悪化させているこ とが示唆された。 図 15は花粉症性皮膚における肌荒れ皮膚と S C C A— 1 の発現亢進との相関関係を示す。 S C C A— 1 と T EWLと では Pearson相関係数が 0.8086であり、 有意な相関が認められた。 従って、 花粉症により皮膚バリア一機能が低下し、 即ち肌荒れ状態 が悪化しているほど、 S C C A— 1 の発現量が高くなることが明ら カゝとなった。
従って、 肌荒れの発症前であっても、 S C C Aを指標とすれば、 花粉症による肌荒れの罹りやすさを判定でき、 その予防又は早期 （ 例えば発症前） 対処が可能となる。 また、 花粉症皮膚において不全 角化が生じていることは全く新たな知見であり、 花粉症皮膚におけ るバリァー機能の悪化や不全角化が S C C Aに起因していることは 注目に値する。

Claims

請 求 の 範 囲
1. 皮膚角層細胞の扁平上皮細胞癌関連抗原 （ S C C A) の発現 を指標とする、 皮膚性状の評価方法。
2. 前記 S C C Aの発現を、 S C C Aに特異的な抗体を使用する 酵素結合免疫吸着アツセィ （E L I S A) により実施する、 請求項 1記載の方法。
3. 前記皮膚角層試料がテープス トリ ッビングにより採取された ものである、 請求項 1又は 2記載の方法。
4. 前記皮膚性状が、 紫外線照射を原因とする皮膚老化、 皮膚バ リァ一機能低下に伴う肌保湿力の低下による乾燥肌、 乾癬又はァ ト ピー性皮膚炎を原因とする不全角化、 及び花粉症による肌荒れから なる群から選ばれる、 請求項 1〜 3のいずれか 1項記載の方法。
5. S C C Aが S C C A— 1である、 請求項 1〜 4のいずれか 1 項記載の方法。
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