KR20030067696A - 질병의 진단 및 치료 - Google Patents

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KR20030067696A
KR20030067696A KR10-2003-7007501A KR20037007501A KR20030067696A KR 20030067696 A KR20030067696 A KR 20030067696A KR 20037007501 A KR20037007501 A KR 20037007501A KR 20030067696 A KR20030067696 A KR 20030067696A
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라치드 타지-아니니
크라에스 바빅
시몬 왈드
골든 듀프
미첼 콜크
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모렉큐랄 스킨케어 리미티드
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Abstract

본 발명은 개인의 접착 단백질, 프로테아제 또는 프로테아제 억제제를 암호화하는 핵산에서 돌연변이를 검출하는 것을 포함하는, 상피세포에서 비정상적인 세포-세포 접착과 관련된 질병 또는 그 질병에 대한 감수성을 진단하는 방법을 제공한다.

Description

질병의 진단 및 치료{Diagnosis and treatment of disease}
피부는 체내의 물을 유지하고 환경물질이 체내로 침투하는 것을 방지하는 장벽이다. 따라서 피부의 장벽기능은 내부 항상성의 유지에 필수적이다(Cork 1997). 표피는 기저층(또는 배아층)에서 분열에 의해 형성되는 밀접하게 팩킹된 각화세포층(keratinocytes)으로 구성된다. 각화세포가 극세포층 및 과립세포층으로 이동하여 감에 따라서, 이들은 분화되고 케라틴, 마이크로필라멘트 및 마이크로튜불스(microtubules)의 단단한 내부 구조가 형성된다. 각질층은 핵을 상실한 평탄화된 치사세포층으로 구성되며, 지질과 단백질의 복합 혼합물이다.
표피장벽은 각질층(stratum corneum)에 위치하며 각질세포(corneocyte) 사이의 강한 접착력에 의존한다 (Egelrud, 2000). 이러한 접착력은 코르네오데스모솜(corneodesmosomes)에 의해 매개된다 (Menton and Elisen, 1971 Chapman and Walsh, 1990; North et al. 1999). 코르네오데스모신(corneodesmosin)은 코르네오데스모솜의 당단백질이다.
표피층의 다른 성분은 라멜라 지질층이다. 이 지질은 과립세포층내의 라멜라체로 분비된다(Elias 1993). 과립세포층과 각질층 사이의 계면에서, 지질은 과립세포로부터 내부 각질세포 공간으로 추출된다. 이 지질은 고도로 조직된 멀티멜라 이층구조로 편성된다(Landmann 1988). 각질층은 각질세포가 형성하는 벽돌과 라멜라 지질이 형성하는 모르타르로된 벽돌벽처럼 가시화될 수 있다(Elias 1983). 각질세포는 물을 함유하는 물질인 천연 보습인자(NMR)를 함유하며, 이들은 그 속에 물을 함유하고 있다. 물 함량이 높으면 각질세포가 팽윤되어 이들 사이의 분열과 균열 형성을 방지한다. 피부의 유연함과 탄성은 이 물 함량과 직접적으로 관련된다. 보통의 건강한 각질층은 비교적 물 함량이 높다.
따라서, 각질층은 생존표피에서 각화세포의 증식과 분화에 의해 연속적으로 대체될 수 있는 장벽이다. 주어진 체내 위치에서 일정한 각질층 두께를 유지하기 위하여 각질층의 표면은 박리되는 동안 그 생산을 균형적으로 만드는 비율로 연속적으로 벗겨져야한다. 각질세포 박리 손상은 건선, 심상성좌창, 비늘선(ichthyosis) 및 모공각화증과 같은 다수의 질병을 특징으로 한다. 건선의 경우, 각질세포 박리손상은 각질층의 두께를 증가시켜 장벽이 흔히 증가된다. 심상성좌창의 일차적인 병리학적 증상은 각질세포의 박리손상의 결과로 생기는 모피지선(pilosebaceous unit)을 협소화한 것이다. 이러한 결함은 증가된 피지 생산비율과 관련되며 이차적 증상은 피지 부진을 포함한다.
본 발명은 질병의 진단과 치료에 관한 것이다. 보다 자세하게는, 본 발명은 피부 질병의 치료 및 진단, 및 그러한 치료 및/또는 진단을 위한 약제에 관한 것이다.
도 1은 아토피성 습진 환자로부터 얻은 SCCE 유전자의 엑손 V에 상응하는 AE2 서열의 크로마토그램의 일부를 도시한다. 4-bp 반복은 화살표로 표시되어 있다.
도 2는 도 2에 상응하는 폴리9 (대조군) 서열의 크로마토그램의 일부를 도시하며, 제2 반복(AACC)은 존재하지 않는다. 4-bp 싱글 반복은 화살표로 표시되어 있다.
도 3은 프라이머 F5 및 I/D RII (제1 최적화)를 사용한 10개 DNA 샘플의 PCR 생성물의 전기영동 겔을 도시한다. 예상된 PCR 생성물(457 bp)은 화살표로 표시되어 있다.
도 4는 PCR 반응 생성물의 겔 전기영동을 도시하며, 전체 엑손 5(제1 최적화)의 증폭 생성물인 800 bp의 "대조군" 증폭 생성물을 포함한다. 이 도면은 내부 대조군(800 bp-화살표로 표시)을 사용한 결과가 정당하는 것을 나타낸다.
도 5는 대조환자 및 습진 환자에서 시스타틴 A 프로모터의 전사 활성을 도시하는 그래프이다. 프로모터 영역의 PCR 생성물을 리포터 벡터(CAT)에 클로닝한다. 이들은 대조환자 및 습진환자 각각으로부터 얻은 서열 p cstappoly7rCAT, p cstappoly3r, CAT pcstappoly4r 및 CAT pcstape8fCAT p cstape5rCAT p cstape7rCAT를 포함한다. 형질감염된 SVHK 세포를 수집하고 추출물을 CAT 활성에 대해 평가한다.
도 6은 항-코르네오데스모신 항체로 프로빙된 웨스턴 블럿으로서, 건선표피로부터 추출된 단백질의 단백질분해 특성을 도시한다. PNL: 건선 비-병반 피부, PL: 건선 병반 피부, N: 정상 피부.
도 7은 항-플라코글로빈 항체로 프로빙된 웨스턴 블럿으로서, 건선표피로부터 추출된 단백질의 단백질분해 특성을 도시한다. PNL: 건선 비-병반 피부, PL: 건선 병반 피부, N: 정상 피부.
도 8은 항-데스모플라킨 항체로 프로빙된 웨스턴 블럿으로서, 건선표피로부터 추출된 단백질의 단백질분해 특성을 도시한다. PNL: 건선 비-병반 피부, PL: 건선 병반 피부, N: 정상 피부.
도 9는 항-데스모콜린 I 항체로 프로빙된 웨스턴 블럿으로서, 건선표피로부터 추출된 단백질의 단백질분해 특성을 도시한다. PNL: 건선 비-병반 피부, PL: 건선 병반 피부, N: 정상 피부.
도 10은 항-엔보플라킨 항체로 프로빙된 웨스턴 블럿으로서, 건선표피로부터 추출된 단백질의 단백질분해 특성을 도시한다. PNL: 건선 비-병반 피부, PL: 건선 병반 피부, N: 정상 피부.
도 11은 항-SCCE 항체로 프로빙된 웨스턴 블럿으로서, 건선표피로부터 추출된 단백질의 단백질분해 특성을 도시한다. PNL: 건선 비-병반 피부, PL: 건선 병반 피부, N: 정상 피부.
도 12는 항-SLPI 항체로 프로빙된 웨스턴 블럿으로서, 건선표피로부터 추출된 단백질의 단백질분해 특성을 도시한다. PNL: 건선 비-병반 피부, PL: 건선 병반 피부, N: 정상 피부.
도 13은 변형된 피부 장벽기능을 갖는 피부 조건에서 각질층의 표면에서 코르네오데스모솜 밀도의 정량화를 도시하는 그래프이다.
도 14는 프로테아제 효소로 처리되거나 또는 처리되지 않은 건선 환자로부터 얻은 테이프 스트립에서 코르네오데스모솜 밀도의 정량화를 도시하는 그래프이다.
도 15는 처리되지 않은 건선 생검의 절편을 도시한다. 두꺼워진 각질층(SC)에 존재하는 다수의 코르네오데스모솜은 각질세포층을 강하게 유지시킨다. 각질층 아래에 있는 눈에 보이는 세포층은 라벨링된다(V). 투과전자현미경 x 3300 배율.
도 16은 0.25% 키모트립신으로 16시간 동안 처리된 건선 생검의 절편을 도시한다. 각질세포층의 분리(극세포증)은 키모트립신에 의한 코르네오데스모솜의 분해에 기인한 것이 분명하다. 투과 전자 현미경 x 3300 배율.
도 17은 처리되지 않은 건선 생검(각질층)의 절편을 도시한다. 수많은 코르네오데스모솜이 보일 수 있으며, 이들의 일부는 백색 화살표로 나타낸다. 투과 전자 현미경, x 23000 배율.
도 18은 0.25% 키모트립신으로 16시간 동안 처리된 건선 생검의 각질층의 절편을 도시한다. 프로테아제 처리후에는 코르네오데스모솜이 훨씬 적게 보인다(흰색 화살표로 도시). 분해된 코르네오데스모솜의 일부 나머지도 또한 보일 수 있다(점선 백색 화살표). 투과 전자 현미경, x 23000 배율.
도 19는 재구성된 인간 표피 배양액의 절편(피부 상당체)을 도시한다. 왼쪽 패널: 완충염 용액으로 처리됨(대조군), 오른쪽 패널: 6 μM 펩티드 641로 처리됨.
도 20은 재구성된 인간 표피 배양액의 절편(피부 상당체)을 도시한다. 왼쪽 패널: 완충염 용액으로 처리됨(대조군), 오른쪽 패널: 6 μM 펩티드 642로 처리됨.
도 21은 재구성된 인간 표피 배양액의 절편(피부 상당체)을 도시한다. 왼쪽 패널: 완충염 용액으로 처리됨(대조군), 오른쪽 패널: 6 μM 펩티드 643으로 처리됨.
도 22는 재구성된 인간 표피 배양액의 절편(피부 상당체)을 도시한다. 왼쪽 패널: 완충염 용액으로 처리됨(대조군), 오른쪽 패널: 6 μM 펩티드 651로 처리됨.
도 23은 재구성된 인간 표피 배양액의 절편(피부 상당체)을 도시한다. 왼쪽 패널: 완충염 용액으로 처리됨(대조군), 오른쪽 패널: 6 μM 펩티드 653으로 처리됨.
도 24는 재구성된 인간 표피 배양액의 절편(피부 상당체)을 도시한다. 왼쪽 패널: 완충염 용액으로 처리됨(대조군), 오른쪽 패널: 2.5 ng/ml의 TNF-α로 처리됨.
도 25는 재구성된 인간 표피 배양액의 절편(피부 상당체)을 도시한다. 왼쪽 패널: 완충염 용액으로 처리됨(대조군), 오른쪽 패널: 2.5 ng/ml의 IL-1β로 처리됨.
상세한 기술
본 발명은 접착 단백질의 단백질분해 조절이 건강한 피부에 중요하다는 것을 나타낸다. 다양한 피부질병의 원인은 접착단백질의 단백질 분해 조절의 약화로 인하여, 증가되거나, 감소되거나 비정상적인 각질세포 접착을 유발하게된다. 이러한 비정상적 단백질분해는 다양한 원인에 의한 것으로 예컨대 접착 단백질 유전자에서의 돌연변이, 접착 단백질상에 작용하는 프로테아제에서의 돌연변이, 및/또는 이러한 프로테아제상에 작용하고 이들의 활성을 조절하는 프로테아제 억제제에서의 돌연변이를 포함한다.
본 발명은 이러한 질병의 치료와 예방이 접착 단백질의 단백질분해를 조절하는 것에 의해 달성될 수 있음을 나타낸다. 본 발명은 또한 접착 단백질, 프로테아제 및/또는 프로테아제 억제제에서의 돌연변이의 검출이 다양한 피부 질병을 진단하거나 및/또는 그러한 질병에 대한 감수성을 진단하는데 사용될 수 있다는 것을 나타낸다.
따라서, 본 발명은 예컨대 코르네오데스모신과 같은 접착 단백질을 암호화하는 유전자(S 유전자)에서의 돌연변이가 각질세포와 같은 상피세포 사이에서 접착을 감소시키거나 증가시켜 질병을 유발한다는 것을 나타낸다. 또한, 그러한 접착 단백질과 관련된 유전자, 예컨대 염색체 6p21상의 MHC 표피세포 유전자 클러스터 사이의 유전자에서 돌연변이도 또한 상피세포 사이의 접착을 감소시킨다. 본 발명은 +1243, +180 및 +619를 비롯한 다양한 위치에서 특정 돌연변이를 확인하며, 이들을 그룹 I 및 그룹 II 질병과 관련시킨다.
또한 본 발명은 단백질분해 효소를 암호화하는 유전자, 예컨대 q13 밴드에 있는 염색체 19상의 각질층 키모트립신 효소(SCCE) 및/또는 각질층 트립신 효소(SCTE) 유전자 및 염색체 17에서의 관련된 세린 프로테아제 유전자에서의 돌연변이는 이들 효소의 활성 향상을 초래하며, 그 결과 각질세포의 조기박리를 유발한다는 것을 나타낸다. 특히, 본 발명은 AACCAACC 서열이 아토피성 습진 및 기타 그룹 I 질병과 관련되어 있음을 확인한다.
또한, SKALP 및 SLPI와 같은 세린 프로테아제 억제제 유전자에서의 돌연변이는 박리과정을 조절할 수 없게 한다. 따라서, 예컨대 S, SCCE, SCTE, SKALP, SLPI 유전자 또는 이들 유전자의 조합에서의 돌연변이는 표피 장벽기능의 손상을 초래한다. 함께 생기는 유전자에서의 돌연변이는 표피 장벽기능 결함의 심각성을 증가시킨다.
따라서, 본 발명은 상피세포 사이의 비정상적인 세포-세포 결합을 검출함으로써 그러한 돌연변이와 관련된 질병을 진단하는 방법을 제공한다. 또한 본 발명은 이러한 프로테아제 및 프로테아제 억제제 유전자의 발현을 조절함으로써 상피세포사이의 비정상적인 세포-세포결합과 관련된 질병을 치료하는 방법을 제공한다.
질병의 "치료"라는 것은 질병의 증상의 경감을 포함하는 것으로 이해되어져야한다. 바람직하게는, 질병에 걸린 개인의 실질적으로 모든 증상이 경감되거나 제거된다. "질병"이라는 것은 증상뿐만 아니라 개인의 건강 또는 안녕에 나쁜 영향을 주는 어떤 조건도 포함하는 것으로 이해되어져야한다. 바람직하게는, 개인은 본 발명에 기재된 방법 및 조성물을 사용함으로써 질병이나 상태의 하나 이상의 증상이 사라지게된다. 바람직하게는, 개인은 정상적인 비감염 개인상태로 돌아간다. 이것을 상대적 임상변수를 이용한 내과의에 의해 평가될 수 있다.
유사하게, 질병의 "진단"이라는 것은, 질병 그 자체의 진단 뿐만 아니라 그 질병에 대한 감수성의 진단을 포함하는 것으로 이해되어져야한다. 본 명세서에 기재된 진단방법은 질병의 진단에 유용한 지시를 제공하는 방법으로서 이용될 수 있다.
특별히 언급하지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학 용어는 당해분야, 즉 세포배양, 분자유전학, 핵산 화학, 하이브리드 형성수법 및 생화학 분야에서 통상의 지식을 가진 사람에 의해 이해될 수 있는 것과 동일한 의미를 갖는다. 표준수법은 분자, 유전학 및 생화학적 방법(일반적으로 Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d ed. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. and Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology (1999) 4th Ed, John Wiley & Sons, Inc. 참고, 본 명세서에 참고문헌으로 포함됨), 화학적 방법, 약제학적 제형과 전달 및 환자의치료에 사용된다.
표피장벽기능
본 명세서에 기재된 방법 및 조성물은 주로 비정상적인 표피 장벽기능과 관련되거나 그것을 특징으로 하는 질병의 진단 및/또는 치료와 관련된다.
피부는 체내의 물을 유지하고 환경물질이 체내로 침투하는 것을 방지하는 장벽이다. 이러한 침투를 견디는 능력은 내부항상성의 유지에 필수적이다(Cork 1997). 표피는 기저층(배아층)에서의 분열에 의해 형성되는 밀접하게 팩킹된 각화세포층으로 구성된다. 각화세포가 극세포층 및 과립세포층으로 이동하여 감에 따라서, 이들은 분화되며 케라틴, 마이크로필라멘트 및 마이크로튜불스(microtubules)의 단단한 내부 구조가 형성된다. 표피내에서, 장벽기능은 전형적으로 각질층에 의해 나타나며 이것은 코르네오데스모솜(Menton and Elisen, 1971 Chapman and Walsh, 1990; North et al. 1999)에 의해 매개된 각질세포(Egelrud, 2000) 사이의 강한 접착력에 의존한다.
각질층은 핵을 상실한 평탄화된 치사세포층으로 구성되며, 지질과 단백질의 복합 혼합물이다. 각질층은 생존 표피에서 각화세포의 증식과 분화에 의해 연속적으로 대체될 수 있는 장벽이다. 주어진 체내 위치에서 일정한 각질층 두께를 유지하기 위하여 각질층의 표면은 박리되는 동안 그 생산을 균형있게하는 비율로 연속적으로 벗져져야한다. 본 명세서에서 사용된 용어인 표피의 "장벽기능" 또는 "표피 장벽기능"은 표피층이 외부 물질의 침투를 견디는 능력을 지칭하기 위한 것이다. 따라서, 본 발명의 방법과 조성물을 개인의 표피 장벽기능을 조절하는 것에 의해작용한다. 특히 본 명세서에 기재한 방법과 조성물은 질병을 치료 및/또는 진단하기 위해 사용될 수 있으며, 질병에 걸린 개인에서의 표피장벽은, 정상 개인에서 표피 장벽과 비교하여, 향상되거나 약화되게 조절된다.
장벽기능의 측정은 다양한 방식으로 실시될 수 있다. 예컨대, 프란츠 챔버 및 카다버 시스템(프란츠 챔버 침투 시스템으로 공지됨)이 사용될 수 있다. 이 시스템은 시스템을 통과하는 물질을 측정하는 것에 의해 장벽기능을 측정하며, 강인하고 신속하며 용이한 시스템이라는 점에서 이점이 있다.
손상된 장벽기능
손상된 장벽기능은 이하에 기재한 바와 같이 그룹 I 질병의 특징이다.
표피가 동일한 개인 또는 다른 개인로 부터의 정상적인 건강한 표피보다 외부물질을 더 잘 투과할 수 있으면, 그 장벽기능이 손상된 것이다. 따라서, 장벽기능이 손상된 표피는 다른 것에 비해 외부물질의 침투를 더 많이 허용한다. 바람직하게는, 장벽기능이 손상된 표피는 정상표피에 비하여 20%, 40%, 60%, 80% 또는 100% 이상 외부물질을 더 잘 투과시킬 수 있다. 바람직하게는, 정상 표피 장벽을 실질적으로 통과할 수 없는 분자는 장벽기능이 손상된 표피의 장벽을 통과할 수 있다.
침투성 또는 투과성의 증가는 바람직하게는 표피층을 통과할 수 있는 물질 또는 약물의 질량의 증가와 활성(화학적, 생물학적 또는 효소적 활성)의 증가에 반영된다. 따라서, 장벽기능이 손상된 표피는 바람직하게는 정상표피에 비하여 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100% 또는 그 이상의 물질과약물을 침투시킬 수 있다.
투과성 또는 침투성의 증가는 지연된 분자에 비하여 또는 다르게는 인가된 분자에 비교하여 증가된 분자 통과비율을 갖는 것에 반영될 수 있다. 이 비율, N은 여기서 기재된 방법 및 조성물을 사용하여 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100% 또는 그 이상으로 증가될 수 있다.
표피 장벽기능의 측정은 다양한 방식으로 실시될 수 있다. 유사하게, 물질 또는 조성물의 침투 수준 또는 정도는 당분야의 통상의 지식을 가진 사람에게 공지된 수법에 의해 측정될 수 있다. 예컨대, 활성 화합물 또는 트레이서 화합물을 방사성 표지시킨 다음 피부에 흡수된 방사성 표지된 화합물의 양을 측정하는 것은 당업자로 하여금 시험 화합물의 피부 침투를 측정하는 몇 개 방법을 이용하여 흡수된 조성물의 수준을 측정할 수 있게한다. 피부층을 통과하는 방사성표지된 화합물의 양도 또한 측정할 수 있다.
바람직한 구체예로서, 프란츠 챔버 및 카다버 시스템(프란츠 챔버 침투 시스템으로 공지)이 물질의 침투를 측정하기 위해 사용된다. 이 시스템은 피부편을 통하여 리셉타클액(receptacle fluid)으로 통과하는 방사성표지된 화합물 양의 측정을 가능하게함으로써 장벽기능을 측정한다. 프란츠 챔버는 강인하고, 신속하며 쉬운 시스템인 점에서 이점이 있고, 이하에 더 자세하게 기재한다.
향상된 장벽 기능
장벽 기능이 향상된 표피는 동일하거나 상이한 개인로부터 얻은 정상적인 건강한 표피에 비하여 외부물질을 덜 투과한다.
표피가 동일한 개인 또는 다른 개인로 부터의 정상적인 건강한 표피에 비하여 외부물질을 덜 통과하게 되면, 증가되거나 향상된 장벽기능을 갖는다. 따라서, 장벽기능이 손상된 표피는 다른 것에 비해 외부물질의 침투를 더 많이 허용한다. 바람직하게는, 이러한 표피는 정상 표피에 비하여 90%, 80%, 70%, 60%, 40%, 20%, 10%, 5% 또는 그 이하의 투과도로 외부물질을 덜 투과시킨다. 바람직하게는, 정상 장벽기능을 갖는 표피를 통과할 수 있는 분자는 증가되거나 또는 향상된 장벽기능을 갖는 표피를 실질적으로 통과할 수 없다.
침투성 또는 투과성의 감소는 바람직하게는 표피층을 통과할 수 있는 물질 또는 약물의 질량, 활성(화학적, 생물학적 또는 효소적 활성)의 감소에 반영된다. 따라서, 장벽기능이 향상된 표피는 바람직하게는 정상표피에 비하여 90% 이하, 보다 바람직하게는 80% 이하, 더욱 바람직하게는 70% 이하, 더욱 바람직하게는 60% 이하, 더욱 바람직하게는 50% 이하, 더욱 바람직하게는 40% 이하, 더욱 바람직하게는 30% 이하, 더욱 바람직하게는 20% 이하, 더욱 바람직하게는 10% 이하, 가장 바람직하게는 5% 이하의 물질과 약물의 침투를 가능하게 한다.
투과성 또는 침투성의 감소는 지연된 분자에 비하여 또는 다르게는 인가된 분자에 비교하여 감소된 분자 통과비율을 갖는 것에 반영될 수 있다. 이 비율, N은 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물을 사용하여 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100% 또는 그 이상으로 감소될 수 있다.
그룹 I 질병: 세포-세포 접착 감소와 관련됨
일개 구체예로서, 본 명세서에 기재된 방법은 세포-세포, 특히 상피세포, 특히 각질세포의 접착감소와 관련된 질병의 치료와 진단에 적합하다. 이러한 질병을 이후 "그룹 1 질병"으로 칭하며, 따라서 이러한 질병은 장벽기능의 손상 또는 감소와 관련된 질병이다.
그룹 1 질병에서, 3개의 서브-그룹이 확인될 수 있다. 각 그룹에서 손상된 장벽기능은 상피 장벽을 통한 비자연적물질의 침투를 허용한다. 비자연적물질이 상피 장벽을 통하여 침투하면, 그것은 숙주의 세포와 상호작용하여 질병 표현형을 나타내게된다.
그룹 1 질병의 제1 서브그룹(서브그룹 1.1)은 자극성물질, 앨러지 물질 또는 기타 비자연적물질의 침투를 허용하는 손상된 장벽을 특징으로 한다. 이들 비자연적물질은 체내의 면역계와 상호작용하여 비정상적인 감염 반응을 생성하고, 이것은 다시 조직 파괴를 유발한다. 비자연적물질에 대한 면역반응은 관련된 유전자경향의 결과로서 향상될 수 있다. 피부에 영향을 주는 이러한 질병의 예는 아토피성 습진, 지루성 습진, 자극성 접촉 피부염 및 앨러지 접촉 피부염을 포함한다. 폐에 영향을 주는 이러한 질병의 예는 아토피성 천식, 후 바이러스성 아스마/기관지성 과민반응, 만성 폐색 폐 질환을 포함한다. 장에 영향을 주는 이러한 질병의 예는 크론병, 궤양성 대장염, 복강 질병 및 펩신성 궤양을 포함한다.
그룹 1 질병의 제2 서브그룹(서브그룹 1.2)은 세균, 바이러스, 기타 미생물 또는 미생물 생성물, 예컨대 초항원성 외독소의 침투를 허용하는 손상된 장벽을 특징으로 한다. 미생물 및/또는 미생물 생성물은 질병으로 유도한다. 이러한 질병의 예는 아토피성 습진, 접촉 피부염, 농가진, 바이러스성 사마귀, 전염성연속증, 수막염(세균성 및 바이러스성) 및 헬리코박테리아 파이로리(Helicobacteria pylori)에 의해 유발되거나 그와 관련된 펩신성 궤양을 포함한다.
그룹 1 질병의 제3 서브그룹(서브그룹 1.3)은 발암물질의 침투를 허용하는 손상된 장벽을 특징으로 한다. 이러한 발암물질은 상피 간세포(stem cell) 집단에 용이하게 접근하여 형질전환을 유발할 수 있다. 발암물질은 다른 환경요인, 예컨대 자외선 조사에 의해 공-발암물질로서 작용한다. 피부에 영향을 주는 이러한 질병의 예는 흑색종, 비늘모양 세포 암, 기저세포 암, 피부 림프종 및 기타 피부 암을 포함한다. 장관에 영향을 주는 그러한 질병의 예는 전체 위장관의 악성종양을 포함한다. 폐의 악성종양은 폐에 영향을 주는 질병의 예이다.
그룹 I 질병의 치료
본 명세서에 기재된 방법 및 조성물에 따르면, 그룹 1 질병은 상피세포, 예컨대 피부 각질세포 사이의 접착감소에 기인한다. 이것은 상피세포, 예컨대 코르네오데스모신 사이의 접착을 조절하거나 그와 관련있는 접착 단백질의 발현, 활성 및/또는 분해에서의 변화; 접착 단백질을 분해시키는 프로테아제의 발현, 활성 및/또는 분해에서의 변화; 및/또는 접착 단백질을 분해시키는 프로페아제의 억제제의 발현, 활성 및/또는 분해에서의 변화의 결과로써 생길 수 있다. 본 발명자들은 상술한 임의 변화, 몇개의 변화 또는 모든 변화가 각질세포와 같은 상피세포 사이의 접착감소를 유발할 수 있다는 것을 발견하였다.
예컨대, 유전자 돌연변이의 결과로 그 구조가 변화된 접착 단백질은 감소된 접착 활성을 갖고 및/또는 단백질분해 효소(프로테아제)에 의한 분해되기가 더 쉽다. 따라서, 그룹 1 질병의 치료는 접착 단백질, 예컨대 코르네오데스모신의 발현을 향상시키는 것에 의해 영향을 받을 수 있다. 다르게는 또는 조합해서, 상기 치료는 접착 단백질의 접착활성 및/또는 프로테아제 내성을 향상시키는 것에 의해 실시될 수 있다. 따라서, 세포-세포 접착 감소에 관여되는 접착 단백질은 다른 접착 단백질 또는 향상된 접착활성 및/또는 프로테아제 내성을 갖는 제1 접착 단백질의 변이체로 대체되거나 보충될 수 있다.
또한, 프로테아제의 양, 활성 및/또는 생체 유용성의 증가는 접착 단백질의 증가된 분해를 유발할 수 있다. 따라서, 그룹 1 질병은 접착 단백질을 분해시키는 프로테아제의 발현 및/또는 활성을 감소시키는 것에 의해 치료될 수 있다. 예컨대, 이러한 프로테아제의 전사 및/또는 번역은 그룹 1 질병을 치료하는 수단으로서 하향 조절될 수 있다. 따라서, SCCE 및 SCTE와 같은 프로테아제의 발현은 전사 및/또는 번역 수준에서 감소되어 그룹 1 질병을 치료할 수 있다.
세포-세포 접착 감소의 결과로서 손상된 장벽기능은 접착 단백질을 분해시키는 프로테아제의 억제제의 양, 활성 및/또는 생체적합성이 감소된 경우에 생길 수 있다. 따라서, 상술한 변화중 어느 하나, 일부 또는 모두의 조합은 세포-세포 접착을 대폭 감소시켜 손상된 장벽기능을 초래한다.
따라서, 접착 단백질을 분해시킬 수 있는 프로테아제 활성을 억제시킬 수 있는 프로테아제 억제제의 발현 및/또는 활성은 상향조절되어 그룹 1 질병을 치료하는 수단으로 이용될 수 있다. 발현 및/또는 활성이 상향조절되는 프로테아제 억제제는 관심을 갖고 있는 프로테아제(즉, 접착 단백질의 단백질 분해에 관여되는 프로테아제)를 생리학적으로 억제시키는 천연의 프로테아제 억제제일 수 있다. 이러한 프로테아제 억제제를 이후 "일차"프로테아제 억제제로 칭한다. 따라서, 본 발명은 프로테아제 억제제(예컨대 SKALP 및 SLPI)의 전사 및/또는 번역을 활성화시켜 SCCE 및 SCTE와 같은 프로테아제의 활성을 감소시키는 것에 의해 그룹 1 질병을 치료하는 방법을 제공한다. 또한 제2 프로테아제 억제제(즉, 프로테아제 활성의 생리학적 조절에 보통 관여하지 않는 프로테아제 억제제)를 또한 이용하여 일차 프로테아제 억제제 활성을 보충하거나 및/또는 교체할 수 있다.
또한, 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물은 프로테아제 억제제 또는 프로테아제 억제제의 단편을 그룹 I 질병에 걸린 개인 또는 그룹 I 질병에 걸릴 우려가 있는 개인에 투여하는 것을 포함한다. 프로테아제 억제제 및/또는 단편은 천연 또는 합성 펩티드 형태로 투여될 수 있다. 바람직하게는, 상기 펩티드는 프로테아제 억제제의 활성 영역을 포함한다. 바람직하게는, 상기 펩티드는 1 이상의 프로테아제 활성을 억제할 수 있다. 적합한 펩티드는 분비성 류코프로테아제 억제제(SLPI), 엘라핀 프로테아제 억제제 3(PI3 또는 SKALP) 또는 시스타틴 A(CSTA)를 비롯한 프로테아제 억제제에 대하여 고안될 수 있다.
바람직하게는, 상기 펩티드는 CGKS (SB7a) 및 CGKS CVSPVKA (SB7b); KIIDGA; GDKIIDGA; GDKIID; KII; KIID; KIIDG; KIIDGA; LDPVD (651); KRDLK (652); LDPVDTPNP (653); LDPVDTPNPTRRKPG (654); CGKSCVSPVKA (644); CVSPVKA (643)으로 구성된 군으로부터 선택된다. 바람직한 구체예로서, 상기 펩티드는 펩티드 643, 펩티드 651 또는 펩티드 653을 포함한다.
또한 각질층 키모트립신/트립신 효소와 같은 프로테아제의 천연 억제제가 활성면에서 부족하거나 감소된 것으로 밝혀지면, 이들은 키모트립신, 콩 트립신 억제제, 카텝신 G, 또는 기타 당해 분야에 공지된 프로테아제 억제제와 같은 제2 프로테아제 억제제에 의해 교체되거나 보충될 수 있다. 일차 프로테아제 억제제는 항-류코프로테아제 및 엘라핀을 포함한다. 이러한 일차 및/또는 이차 프로테아제 억제제는 전신적으로 투여될 수 있거나, 또는 이하에 자세하게 기재된 약제학적 조성물 형태로 상피 표면에 도포될 수 있다.
피부를 일례로서 이용하면, 프로테아제 억제제는 상피세포 표면에 도포될 수 있고, 프로테아제 억제제는 예컨대 각질층 키모트립신 효소를 길항시킨다. 이러한 프로테아제 억제제는 에몰리엔트 기제로 제형화될 수 있다. 프로테아제 억제제는 코르네오데스모신과 같은 접착 단백질의 분해를 억제시키며, 그 결과 각질세포 사이의 결착을 증가시켜 표피 장벽의 구조 및/또는 내성을 향상시킨다.
프로테아제 억제제를 코딩하는 하나 이상의 유전자의 발현은 프로테아제 억제제 활성을 증가시키기 위해 이용될 수 있다. 예컨대, 본 발명은 프로테아제 억제제 활성을 감소시켜 접착 단백질의 단백질 분해를 감소시키는 예컨대 키로트립신, 콩 트립신 억제제, 카텝신 G, 또는 기타 프로테아제 억제제를 발현하는 발현 벡터를 피하(또는 기타) 주사하는 것을 제공한다. 또한, 상술한 바와 같이, 일차 프로테아제 억제제의 내인성 제조는 당분야에 공지된 수법에 의해 상대적 프로테아제 억제제 유전자의 전사 및/또는 번역을 상향조절하는 것에 의해 향상될 수 있다.
또한, 본 발명은 병원성 형태의 상피 또는 데스모솜 단백질(desmosomalprotein)의 탈활성화 및/또는 비-병원성 형태의 상피 또는 데스모솜 단백질의 활성화에 의해 그룹 1 질병을 치료하는 방법을 제공한다. 따라서, 이형접합 환자에서, 데스모솜 단백질, 예컨대 코르네오데스모신의 비-병원성 형태의 발현은 당분야의 통상의 지식에 의해 상향조절될 수 있다. 다르게는 또는 조합하여, 데스모솜 단백질, 예컨대 코르네오데스모신의 병원성 형태의 발현은 당분야의 통상의 지식에 의해 하향조절될 수 있다. 이러한 단백질의 병원성 및 비-병원성 형태는 유전자 분석 및 단백질 분석 프로파일과 같은 당분야의 공지 수법에 의해 확인될 수 있다.
그룹 I 질병의 진단
접착 단백질, 프로테아제 및/또는 프로테아제 억제제에서의 돌연변이는 그룹 I 질병과 관련된다. 이러한 돌연변이는 실시예 A1 내지 A6 및 B1 내지 B6에 자세하게 기재한다. 이들 돌연변이는, 관련 유전자, 핵산 또는 폴리펩티드에서 실시되어 그룹 I 질병을 진단할 수 있게된다.
그룹 II 질병: 세포-세포 접착력 증가와 관련됨.
다른 구체예로서, 본 명세서에 기재된 방법과 조성물은 상피 세포, 특히 각질세포의 세포-세포 접착 향상으로 특징지워진 질병의 치료와 진단에 적합하다. 이러한 질병을 본 명세서에서는 "그룹 2 질병"이라 칭한다. 따라서 그룹 2 질병은 증가된 또는 향상된 장벽기능의 질병이다.
그룹 II 질병
그룹 II 질병의 경우에는 건선, 비늘선, 심상성좌창 및 모공각화증을 포함한다.
그룹 II 질병은 상피세포, 예컨대 피부의 각질세포간의 접착증가에 기인할 수 있다. 접착증가는 각질층의 두께 증가를 초래한다. 예컨대 건선과 비늘선의 경우, 일반화된 각질층 두께 증가가 존재한다. 여드름의 경우 모피지선 입구에서 각질층의 국소적인 병반 두께 증가가 존재한다.
접착증가는 상피세포, 예컨대 코르네오데스모신의 접착을 조절하거나 관여하는 접착단백질의 발현, 활성 및/또는 분해에서의 변화; 접착단백질을 분해시키는 프로테아제의 발현, 활성 및/또는 분해에서의 변화; 접착단백질을 분해시키는 프로테아제의 억제제의 발현, 활성 및/또는 분해에서의 변화의 결과로 생길 수 있다. 본 발명자는 상술한 것중의 하나, 몇 개 또는 전부가 각질층과 같은 상피세포간의 접착증가를 초래할 수 있다는 것을 발견하였다.
예컨대 유전자 돌연변이의 결과로 그 구조가 변화된 접착단백질은 더욱 높은 접착성을 갖거나 및/또는 단백질분해효소(프로테아제)에 의한 분해에 덜 민감할 수 있다. 따라서 본 발명에 기재된 방법과 조성물은 향상된 접착활성을 갖는 돌연변이 접착단백질의 활성 및/또는 발현을 하향조절하는 것에 의해 그룹 2 질병 치료를 위해 사용될 수 있다. 따라서, 단백질분해 감소와 관련된 코르네오데스모신 단백질의 병원성 형태는 당해분야의 공지 방법에 의해 확인될 수 있다. 이들은 병반 층 포피의 외층내의 코르네오데스모신 단백질의 전체길이 형태(52-56kDa)에 상응할 수 있다. 코르네오데스모신의 병원성 형태는 정상 피부와 병반피부로부터 얻은 단백질 분해특징을 비교함으로써 확인할 수 있다. 예컨대 피부 스트립으로부터 얻고 코르네오데스모신을 인식하는 항체로 프로빙된 단백질 추출물을 사용한 웨스턴 블럿법이 이용될 수 있다. 코르네오데스모신 단백질의 병원성 형태는 또한 케이스-콘트롤 및 투과 불균형 시험(TDT; 실시예 참조)을 이용한 유전자 분석에 의해 확인할 수 있다. 예컨대 건선의 경우, 가장 가능성있는 병원성 형태는 CD2 일배체형 (Jenis 등, 1999)에 의해 암호화된 것이다. 이러한 병원성 형태의 전사는 전사 및/또는 번역 수준에서 차단될 수 있다. 코르네오데스모신의 병원성 형태에 대한 이형접합성 환자는 비-병원성 단백질 형태를 암호화하는 대립유전자를 활성화시키는 것에 의해 치료될 수 있다.
프로테아제의 양, 활성 및/또는 생체유용성의 감소는 접착단백질의 분해를 감소시킬 수 있다. 따라서, 그룹 2 질병은 접착단백질의 분해에 관여하는 프로테아제의 발현 및/또는 활성을 향상시키는 것에 의해 처리될 수 있다. 예컨대 이러한 단백질의 전사 및/또는 번역은 그룹 2 질병을 치료하는 수단으로서 상향조절될 수 있다.
세포-세포 접착증가는 접착단백질을 분해시키는 프로테아제의 억제제의 양, 활성 및/또는 생체유용성이 증가되면 생길 수 있다. 따라서, 상술한 변화의 하나, 몇 개 또는 전부는 세포-세포 접착향상을 초래할 수 있다.
따라서 접착단백질을 분해시킬 수 있는 프로테아제 활성을 억제시킬 수 있는 프로테아제 억제제의 발현 및/또는 활성은 그룹 1 질병을 치료하기 위한 수단으로부터 하향조절될 수 있다. 그 발현 및/또는 활성이 하향 조절되는 프로테아제 억제제는 전형적으로 관심을 갖고 있는 프로테아제(즉, 접착단백질의 단백질 분해에 관여하는 프로테아제)를 억제하는 천연의 프로테아제 억제제이다. 이러한 프로테아제억제제를 "일차"프로테아제 억제제로 칭한다. 프로테아제 억제제의 발현은 전사 및/또는 번역수준에서 영향을 받을 수 있다.
건선
본 명세서에 기재된 조성물 및 방법은 건선의 증상을 치료하거나 경감시키는데 적합하며, 본 발명자는 건선의 진단방법도 또한 제공한다.
건선은 은백색 비늘로 덮힌 감염되어 부은 피부병반으로 나타난다. 건선의 특징은 고름과 같은 수포(농포성 건선), 피부의 심각한 딱지(홍피증 건선), 방울과 같은 점(적상 건선) 및 매끈한 감염 병반(역 건선)을 포함한다.
건선의 원인은 현재까지 알려져있지 않지만, 유전자 성분에 의한 자동면역 피부 질병으로 알려져있다. 세 명중의 한명은 건선의 가족력이 있는 것으로 보고되지만, 유전 패턴은 없다. 그러나, 이 질병의 가족력을 갖지 않는 어린이가 건선에 걸리는 많은 경우가 있다. 사람이 실제로 건선을 발병하게될지 여부는 연쇄구균 목과 같은 전신성 감염, 피부 손상(Koebner 현상), 백신화, 특정 약품, 및 근육내 주사 또는 경우 스테로이드 약을 비롯한 "유발인자"에 의해 결정된다. 어떤 유발인자가, 건선을 유발하는 사람의 유전자 경향을 작극하게되면, 역으로 면역계는 과도하게 피부 세포 재생을 자극하게되는 것으로 추정된다.
피부 세포는 다음 두 가지 프로그램을 따르도록 프로그램되어 있다: 정상적인 성장 또는 상처 치유. 정상적인 성장 패턴의 경우, 피부 세포는 기저 세포층에서 성장하여 이들이 표피를 통하여 피부의 최외층인 각질층으로 이동하게된다. 이 러한 정상과정은 세포가 태어나서 죽을 때 까지 약 28일 걸린다. 피부가 상처를 입게되면, 상처 치유 프로그램(재생 성숙)이 자극되어서, 세포는 훨씬 더 빠른 속도로 제조되고, 혈액공급도 증가되어 부분적인 염증이 생긴다. 건선 병반은 성장 프로그램에서의 세포 성장을 특징으로 한다. 피부 세포(각화세포)가 정상 성장 프로그램에서 재생 성숙으로 변환되면, 세포는 만들진지 2 내지 4일안에 표면으로 보내어지고, 피부는 세포를 충분히 빠르게 박리시킨다. 피부세포가 과도하게 형성되어 증가된 비늘상 병반을 형성하게된다. 흔히 병반을 덮고 있는 백색 비늘("플라크")은 죽은 피부 세포로 구성되며, 병반의 적색은 피부 세포를 신속하게 분열시키는 영역에 혈액공급을 증가시키는 것에 의해 유발된다.
건선은 2개의 생물학적 특징을 갖는 유전적으로 결정된 피부질병이다. 첫째, 촉진되고 불완전한 분화와 관련된 표피 과증식이 존재한다. 둘째, T 림프구의 증가된 점증으로 인한 표피 및 진피에서의 현저한 염증과, 일부 경우, 호중구 미소농양의 형성도 존재한다. 건선의 많은 병인학적 특징은 표피 각질세포의 성장과 성숙에서 변화, 즉 피부 표면의 0.2 mm에서 생기는 표피세포의 증식 향상에 기인한다. 건선 병원학에 대한 전통적인 연구는 표피의 증식증가와 과형성에 집중되었다. 정상 피부에서, 세포가 기저층으로부터 과립층으로 이동하는데 걸리는 시간은 4 내지 5 주이다. 건선 병반에서 이 시간은, 세포 주기의 단축, 증식할 수 있는 세포의 절대 개수의 증가 및 실제로 분열하는 세포 비율 증가로 인하여 7배 내지 10배 감소된다. 실질적으로 정도가 적긴 하지만 임상치료를 받지 않은 건선환자의 피부에서는 과증식 현상도 발현된다.
건선의 일반적인 형태인 심상성 건선은 두꺼운 은색 비늘로 덮힌 잘 구분된홍피성 플라크를 특징으로 한다. 특징적인 발견은 동형 반응(Koebner 현상)인데, 이것은 피부 상처 부위에서 새로운 건선 병반이 생기는 것이다.
병반은 말단의 신근 표면에만 흔히 편재하며, 손톱이나 두피도 흔히 관계된다. 일반적인 형태는 연쇄구균에 의한 인두염 후에 흔히 생기는 질병형태인 적상 건선(guttate psoriasis) 및 손바닥과 발바닥 위에 또는 몸 전체에 분포된 2 내지 5mm 직경의 수많은 농포를 특징으로 하는 농포성 건선을 포함한다.
건선환자를 효과적으로 치료하기 위해 이용되는 방법은 눈으로 모니터링하는 것에 의해 및 사진판독에 의해 플라크를 분석하는 것을 포함한다. 목측 관찰은 PASI (Psoriasis Area and Severity Index) 스코어 (Fredericksson, A. J, Peterssonn B C Dermatologies 157: 238-2344 (1978) 참고)를 이용하여 실시한다.
영국국민의 약 2%가 건선환자이며 이것은 관절염(7 내지 25%)과 크론병과 관련이 있을 수 있다. 개인의 자기 자신감과 사회 활동에 대한 영향은 파괴적일 수 있다. 현재의 건선 치료법은 아직 제한적이며 전신적 치료는 나쁜 영향을 갖는다. 건선은 다양한 원인에 의한 질병이며 게놈 와이드 스캔(genome wide scans)에 의하여 6p21, 1q21, 4q, 19p 및 17q를 비롯한 몇 개의 염색체와 중요한 연관을 갖는다는 것을 알게되었다. 6p21에서, 가장 강하게 연관되는 것은 주요 조직적합성 영역(MHC)이다. MHC S 유전자(코르네오데스모신)는 HLA-C의 160 kb 텔로머에 위치하며 각질세포 분화에서 코르네오데스모솜의 성분으로서 발현된다.
여드름
본 명세서에 기재된 방법과 조성물은 여드름의 치료 및/또는 진단에 또한 적합하다.
여드름은 많은 환자를 괴롭히고 있으며 얼굴에 흔히 나타나는 보통의 감염성 피부질병이다. 다행히도, 이 질병은 발병에서 분석되는 수개월 또는 수년안에 흔히 사라지며, 치료법은 아니지만 처치법에 의해 다수의 환자에서 그 질병을 충분히 억제시킬 수 있다.
아주 심한 정도의 여드름 환자의 일부는 고단위 경구 테트라시클린, 댑손, 프레드니손 및 여자의 경우 에스트로겐의 사용을 비롯한 집중적인 치료 노력에도 거의 반응을 보이지 않거나 아무런 반응을 나타내지 않는 경우가 있다. 많은 경우, 상기 약물은 중간 정도의 치료효과만을 가지지만, 이들 약물의 부작용으로 인하여 유용성이 제한된다. 결절낭종성 여드름 환자는 얼굴 및 흔히 등과 가슴에 나타나는 큰 감염성의 화농성 결절로 고통받는다. 이들 외관 이외에, 병반은 말랑말랑하며 흔히 화농 삼출성 및 다량출혈성이다. 상처가 생기는 것은 피할 수 없다.
여드름 치료는 레티노이드를 국소적으로 또 전신적으로 투여하는 것을 포함한다. 올-트랜스-레티노산(트레티노인)의 국소 투여는 특히 여드름(comedones) 또는 위가 검은 여드름(blackhead)에 대해서는 일부 성공적으로 실시되었으나, 이 상태는 치료가 끝나면 되돌아가게된다.
여드름은 청소년의 15%가 임상적으로(여드름 전문) 또 85%가 생리학적으로 겪게되는 일반적인 피부 질병의 하나이다. 15% 환자에서, 치료를 요하는 여드름 주 병반은 25세까지 지속된다. 여드름은 모피지선 난포를 감염시키는 질병으로서 4개의 주요 병인학적 요인이 있다: 증가된 피지 생산, 모피지선의 과잉, 비정상적 세균 작용 및 감염 생성(Cunliffe 1989). 약한 여드름이라도 심리학적 영향이 크며 심각한 여드름의 경우 우울증과 자살도 유발할 수 있다. 여드름 환자의 실업율 16.5%는 대조군의 9.25%와 비교하여 높다. 여드름의 현재 치료법은 여러문제가 있다: 항생제에 대한 내성증가와 기형기인 물질(teratogenicity)을 비롯한 경구 이소트레티노인에 의한 주요 악영향, 뼈 성장 억제와 과지혈증. 여드름 치료는 피부과에서 6 내지 10% 신규 환자를 나타낸다.
접착 단백질
본 명세서에서 사용하는 용어 "접착단백질"은 세포간 접착을 매개하는 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드를 지칭하는 것으로 한다. 따라서, '접착 단백질"은 세포-세포 접착에 관여하는 모든 단백질을 포함한다.
바람직하게는, 접착단백질은 상피세포간의 세포-세포 상호작용을 매개하며, 즉 접착단백질은 상피세포 접착 단백질이다.
바람직하게는, 접착단백질은 표피세포간의 세포-세포 상호작용을 매개한다. 보다 자세하게는, 접착단백질은 각질세포 사이의 세포-세포 접착을 매개한다. 바람직하게는, 접착단백질은 코르네오데스모솜에 존재한다. 가장 바람직하게는, 접착 단백질은 데스모솜 단백질 또는 코르네오데스모솜 단백질이다.
접착 단백질은 표 D2.1 및 5.1에 나타낸 접착 단백질로 구성된 군으로부터 선택되는 것이 적합하다. 바람직하게는, 접착단백질은 다음으로 구성된 군으로부터 선택된다: 코르네오데스모신(AF030130), 데소플라킨 (XM_004463), 플라코글로빈 (NM_002230); (NM_021991), 데스모글레인 1 (XM_008810), 데스모콜린 1(MX_008687), 엔보플라킨 (XM_008135;U72543), 플렉틴 1 (NM000445), S100A2 (AI539439; M87068), 케라틴 6A (L42611), 케라틴 17 (Z19574), S100A8 (AI126134), S100A7 (AA586894), S100A9), GB: W72424), SPRR2A), GB:M21302), SPRR1B (M19888), SPRK (AI923984), HCR (BAA81890), SEEK1 (BAA88130), SPR1 (BAB63315), STG(BAA88132), 인보루크린 (NM_005547), 아넥신 A1/리포코르틴 (X05908), 콜라겐, 타이프 VI, 알파 3 (COL6A3) (NM_004369), 트리코히알린 (NM_005547) 및 로리크린 (XM_048902). GenBank 수탁번호는 괄호안에 표시되어 있다.
특히 바람직한 접착단백질은 임의의 데스모솜 단백질 코르네오데스모신(S로도 공지됨; AF030130), 데스모글레인 1 (XM_008810), 데스모콜린 1 (MX_008687), 데스모클라킨스 I 및 II (XM_004463), 플라코글로빈 (PG로도 공지됨; NM_002230) 및 플라코필린 (PP로도 공지됨)을 포함한다.
아주 바람직한 접착단백질은 코르네오데스모신, 데스모글레인 I, 데스모글레인 3, 플라코글로빈, 데스모플라킨, 데스모콜린 I, 엔보플라킨, 프롤린-풍부 단백질, 바람직하게는 소형 프롤린-풍부 단백질 (SPRR), SPRR2A, SPRR1B, SPRK, SPRR2E, SPRR2F, SPRR2B, SPRR2D, SPRR2C, SPRR2G, SPRR1A, SPRR3, SPRR4, 인보루크린 또는 로리크린을 포함한다.
표피세포간의 접착 증가 또는 감소를 유발하거나 그와 관련된 상술한 접착단백질에서 돌연변이 및 다형성은 실시예에 자세하게 기재된 방법에 의해 검출될 수 있다. 이러한 변화는 피부질병을 확인 또는 진단하거나 그러한 질병에 대한 감수성을 확인 또는 진단하는 수단으로서 검출될 수 있다.
코르네오데스모신(Corneodesmosin)
접착단백질에서의 돌연변이는 피부질병 또는 그러한 질병에 대한 감수성을 진단하는 수단으로서 검출될 수 있다. 아주 바람직한 구체예에서, 접착단백질은 코르네오데스모신이다.
코르네오데스모신 유전자는 아주 다형성이다. 지금까지 문헌에 19개의 변이체가 개시되어 있다(Kasahara 등 1996, Jenisch 등, 1999). 이들 다형성은 산발적이라기 보다는 고도로 보존되어 있어, 본 발명자들은 이들이 척추동물이 진화하는 동안 선택된 것으로 보고 있다. 피부의 장벽기능으로 인하여, 피부에 대한 강한 내성 및/또는 동적 기능을 부여하는 코르네오데스모신의 일부 형태가 선택되었다. 위치 +1243에서의 코르네오데스모신 변이체와 만성 플라크 건선(Tazi-Ahnini 등, 199b) 사이에 강한 관련이 나타났다. 이러한 관련은 적상 건선(Tazi-Ahnini 등, 199b)에서 더욱 강하였다. +1243 위치에서의 치환은 아미노산 변화 L394S를 초래한다. 본 발명자는 이러한 치환이 코르네오데스모신의 가공을 방해하여 박리 분열을 초래하는 것이라 보고 있다. 본 발명자들은 아미노산 변화(Ser143/Asp, Ser153/-, Leu180/Phe, Ser202/Phe, Ser401/Gly, Ser408/Ala, Gly409/Val, Ser410/Leu, Asp527/Asn)를 가져오는 코르네오데스모신 다형성의 9개가 각질세포 성숙과 박리과정에 중요한 역할을 한다는 것을 밝혀내었다. 이들 다형성의 스크리닝 방법은 Jenisch 등 1999 및 Guerrin 등, 2000에 의해 기재되어있다. 본 발명자는 코르네오데스모신의 단백질분해 과정과 정상 피부의 감도 사이에 강한 관련이 있고 또 장벽기능이 손상된 건선, 여드름, 습진을 비롯한 질병과도 강한 관련이 있다는 것을 나타낸다.
본 발명자는 실시예에서 코르네오데스모신에서의 돌연변이가 피부 질병, 특히 접착이 감소된 질병과 관련이 있다는 것을 나타낸다.
특히, 본 발명자들은 실시예에서, 코르네오데스모신 서열 (AF030130)의 위치 +1243에서의 T 뉴클레오티드가 피부 접착이 감소된 질병과 관련이 있다는 것을 나타낸다. 상기 위치에 T 뉴클레오티드가 존재하면 암호화되는 코르네오데스모신 폴리펩티드의 위치 394에서 트레오닌(T) 잔기를 초래한다. 이들중 하나 또는 양쪽을 검출하는 것은 상기 질병 진단에 이용될 수 있다.
따라서 본 발명은 개인에서 코르네오데스모신 핵산의 위치 +1243에서 T의 존재를 검출함으로써 개인에서 피부접착이 감소된 질병(그룹 I 질병) 또는 그러한 질병에 대한 감수성을 진단하는 것을 개시한다. 본 발명은 또한 개인에서 코르네오데스모신 폴리펩티드의 위치 394에서 트레오닌(T) 잔기를 검출함으로써 그러한 질병 또는 질병에 대한 감수성을 진단하는 방법을 제공한다. 그룹 I 질병은 개인에서 CD5 또는 CD6 코르네오데스모신 대립유전자를 검출하는 것에 의해 진단될 수 있다; CD5 및 CD6 대립유전자의 서열은 Jenisch 등, 1999에 기재되어 있다.
바람직하게는, 그룹 I 질병은 습진 또는 피부염이다. 보다 바람직하게는, 그룹 I 질병은 아토피성 습진 또는 포진성 피부염이다. 그룹 I 질병의 다른 예는 본 명세서에 별도의 부분에 기술한다.
다른 돌연변이는 실시예에서 코르네오데스모신 핵산의 +619 및 +180에서의돌연변이가 개시되어 있다; 이들 및 상응하는 폴리펩티드 변화는 그룹 I 또는 그룹 II 질병의 진단을 위해 검출될 수 있다. 코르네오데스모신을 이용한 다른 진단 및 치료방법은 실시예에 기재되어 있다.
프로테아제
본 명세서에 기재된 방법과 조성물에 사용될 수 있는 프로테아제는 다음을 포함한다: 세포소멸 관련 시스테인 프로테아제 (CASP14) mRNA (NM_012114), 트랜스글루타미나제 1 (TGM1)(M98447), TGM2 (XM_009482), TGM4 (XM_056203), TGM5 (XM_007529), TGM7 (NM_052955), TGM3 (L10386), 포스포리파제 A(2)(BC013384), CD47 항원 (X69398), 칼리크레인 8 (AB008390), AD024 단백질 (XM_002642), SCCE (XM_009002), 데펜신 베타2 (AF0711216), 인터페론 유도성 단백질 27 (X67325), 지방산 결합 단백질 FABP5 (M94856), SCTE (XM_009000), 칼리크레인 1, 직장/췌장/침선(KLK1) (XM_047300), 호모 사피엔스 칼리크레인 2, 프로스타틱 (KLK2) (XM_031757), 칼리크레인 3, (프로스테이트 특이 항원) (KLK3) (XM_031768), 칼리크레인 6 (뉴로신, 자임), (KLK6)(XM_055658), 칼리크레인 4 (프로스타제, 에나멜 매트릭스, 프로스테이트)(KLK4) (XM_008997), 막-형 세린 프로테아제 1 (AF133086), 인간 피부 콜라게나제 (M13509), 콜라게나제 MMP-1 (LOC116389), 콜라게나제 MMP-12 (U78045), 콜라게나제 MMP-9 (NM_004994), 콜라게나제 MMP-3 (U78045), 콜라게나제 MMP-28 (AF219624), 카스파제 7 (BC015799), 카스파제 5 (NM_004347), 카스파제-14 (NM_012114), 유비퀴틴 특이적 프로테아제 USP-5 (NM_003481), 유비퀴틴 특이적 프로테아제 USP-11 (NM_004651), 유비퀴틴 특이 프로테아제 USP 6 (NM_004505), 유비퀴틴 특이적 프로테아제 USP 26 (NM_031907), 유비퀴틴 특이적 프로테아제 (USP 28)(NM_020886), 26S 프로테아제 서브유닛 4, LILRB1 (AF004230), 전사 1의 시그널 변환제 및 활성화제, 91 kDa (STAT1)(977935), 프로테아좀(프로좀, 마크로파인) 서브유닛 6 (PSMA6)(X59417), TPS1 (NM_003293), TPSB1 (XM_016204), TPSG1 (XM_008123), 프로테아제 넥신-II (XM_047793), 넥신 전구체로부터 유도된 글리아 (P]07093), 26S 프로테아제 조절 서브유닛 S10B 및 PCOLN3 (XM_047524).
바람직하게는, 프로테아제는 접착 단백질, 바람직하게는 코르네오데스모신과 같은 표피 세포-세포 접착 단백질을 단백질분해시킬 수 있는 것이거나 그와 관련된 것이다. 따라서, 바람직한 구체예로서, 프로테아제는 각질층 키모트립신 효소(SCCE), 각질층 트립신 효소(SCCE) 칼리크레인 1, 칼리크레인 2, 칼리크레인 3, 칼리크레인 4, 칼리크레인 6 및 칼리크레인 8로 구성된 군으로부터 선택된 프로테아제를 포함한다.
각질층 키모트립신 효소(SCCE)
각질층 트립신 효소(SCTE)
각질층 키모트립신 효소(SCCE) 또는 칼리크레인 7(KLK7) 뿐만 아니라 각질층 트립신 효소(SCTE) 또는 칼리크레인 5 (KLK5)는 많은 세린 프로테아제 패밀리의 일원이다. 이들의 발현특징을 분석하면 이들의 피부 특이성을 제시해준다. 상기 두 효소는 기저위 각질세포 및 난포내 표피에서 발현되며 각질층의 생리학적 pH에서 최대 활성을 갖는다(Ekholm 등, 2000; Eugelrud, 1992, Ekholm 및 Eugelrud,1998).
SCCE 및 SCTE는 각질화되는 동안 각질층 세포외 공간으로 수송된다. SCCE는 불활성 전구체로서 생성되므로, SCCE에게 단백질 분해활성을 부여하기 위해서는 활성화 효소가 필요하다. SCTE는 SCCE 활성화에 관여하는 효소로 추정된다. SCCE 및 SCTE를 비롯한 칼리크레인 유전자 클러스터는 염색체 19q13.3-13.4에 지도화되어 있다. 이것은 적어도 6개의 구조적으로 또 진화적으로 관련된 멤버(KLK1, KLK2, KLK3, KLK4, SCCE 및 SCTE)를 포함한다. 이들 칼리크레인 유전자 각각은 본 명세서에 기재된 방법과 조성물에 사용될 수 있다.
그중에서 SCCE 및 SCTE는 주로 피부에서 발현된다. 이들은 뇌, 신장, 유선 및 침선과 같은 다른 조직에서도 발현된다(Yousef 등, 2000; Yousef 및 Diamandis, 1999).
본 발명자는 SCCE 핵산에서 AACCAACC의 존재가 피부접착 감소질병, 특히 습진(바람직하게는 아토피성 습진)과 관련되어 있음을 나타낸다. 따라서, 본 발명은 개인에서 SCCE 핵산의 AACC 반복서열 또는 AACCAACC 서열의 존재를 검출함으로써 개인에서 피부접촉 감소 관련 질병(그룹 I 질병) 또는 그러한 질병에 대한 감수성을 진단하는 방법을 제공한다.
SCCE 및 SCTE의 상동성, 특히 피부 및/또는 접촉단백질에 존재하는 상동성은 본 명세서에 기재된 진단방법 및 치료방법에 이용될 수 있다. 이러한 상동성은 SCCE 및/또는 SCTE 프로브(probe)를 사용한 통상의 라이브러리 스크리닝 뿐만 아니라 관련 서열을 사용한 데이터베이스 서치에 의해 확인될 수 있다.
본 발명의 방법 및 조성물에 유용한 기타 프로테아제의 예는 아미노펩티다제 M, 카르복시펩티다제 P, 카르복시펩티다제 Y, 카스파제 1,4,5, 카스파제 2,3,7, 카스파제 6,8,9, 키모트립신, 인자 Xa, 펩신, TEV, 트롬빈, 트립신 등을 포함한다.
프로테아제 억제제
본 발명자는 박리의 조절이 프로테아제(예컨대 SCCE 및 SCTE) 뿐만 아니라 이들의 억제제에 의해 제어됨을 나타낸다. 본 명세서에 기재된 방법과 조성물에 사용될 수 있는 프로테아제 억제제는 다음을 포함한다:
분비성 류코프로테아제 억제제 (SLPI) 및 엘라핀
인간의 표피에는 항류코프로테아제 (피부-유도된 항류코프로테아제) 및 엘라핀을 비롯한 몇 개의 세린 프로테아제가 존재한다. 항류코프로테아제는 강력한 SCCE 억제제이다. 엘라핀 프로테아제 억제제 3 (PI3 또는 SKALP)은 각질세포에서 생성되는 다른 세린 프로테아제 억제제이다. 이것은 건선 피부 병반의 각막층하의 층 및 베세트 증후군(Behcet's syndrome), 스위트 증후군, 괴저성농피증 및 피부 앨러지 맥관염과 같은 다른 피부질병에서 과발현된다(Tanaka 등 2000). 본 발명자는 SKALP 발현의 변화가 SCCE 및 SCTE 활성에 영향을 주어 건선 및 습진과 같은 피부질환에서 표피의 최외층 구조를 방해한다는 것을 발견하였다.
본 명세서에서 사용된 것과 같은 용어 "분비성 류코프로테아제 억제제", "SLPI" 및 "항류코프로테아제"는 각각 동일한 의미로 이용된다.
엘라핀은 또한 피부 유래 항류코프로테아제, SKALP 및 프로테아제 억제제 3 (PI3)으로 공지되어 있다. 따라서, 본 명세서에서 이용된 이들 용어는 각기 서로동일한 의미로 이용된다.
시스타틴 A
실시예는 시스타틴 A, 특히 시스타틴 A의 프로모터 영역에서 다양한 다형성의 존재를 나타낸다. 따라서 본 발명자는 이들 다형성의 존재 및/또는 부재를 검출함으로써 질병, 바람직하게는 그룹 I 및/또는 그룹 II 질병을 진단하는 방법을 제공한다.
본 발명자들은 실시예에서 시스타틴 A가 접촉 향상과 관련된 질병(예컨대 여드름 및 건선)에서 고도로 발현되고 또 피부 장벽에 결함이 있는 질병(예컨대 습진)에서 하향 조절된다는 것을 나타낸다. 따라서, 시스타틴 A의 활성 또는 수준은 그룹 I 질병을 치료하기 위한 수단으로서 상향조절될 수 있다. 시스타틴 A 수준 및/또는 활성은 그룹 II 질병을 치료하기 위한 수단으로서 하향조절될 수 있다.
따라서, 본 발명은 개인에서 시스타틴 A의 발현의 조절, 바람직하게는 하향조절을 검출함으로써, 개인에서 그룹 I 질병 또는 그룹 I 질병에 대한 감수성(바람직하게는 습진의 진단 또는 습진, 바람직하게는 아토피성 습진에 대한 감수성)을 진단하는 것을 개시한다.
본 발명은 또한 개인에서 시스타틴 A의 발현의 조절, 바람직하게는 상향조절을 검출함으로써, 개인에서 그룹 II 질병(습진 및/또는 건선) 또는 그룹 II 질병에 대한 감수성을 진단하는 것을 개시한다.
본 발명은 개인에서 시스타틴 A의 발현을 조절, 바람직하게는 상향조절함으로써, 개인에서 그룹 I 질병(습진 또는 습진, 바람직하게는 아토피성 습진에 대한감수성)을 치료하거나 예방하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 개인에서 시스타틴 A의 발현을 조절, 바람직하게는 하향조절함으로써, 개인에서 그룹 II 질병(습진 및/또는 건선) 또는 그룹 II 질병에 대한 감수성을 치료하거나 예방하는 방법을 제공한다.
작용물질 및 길항물질
본 명세서에 기재된 방법 및 조성물은 일개 구체예로서 프로테아제 또는 프로테아제 억제제의 활성을 차단하는 것에 의해 결정된다. 프로테아제 또는 프로테아제 억제제의 활성을 향상시킬 수 있는 물질을 그 활성의 작용물질이라 칭한다. 유사하게, 길항물질은 프로테아제 또는 프로테아제 억제제의 활성을 감소시킨다.
당해기술에 사용된 바와 같이, 용어 "길항물질"은 효소에 결합되어 효소의 활성을 억제하는 물질이라 한다. 그러나 본 명세서에서 사용된 용어는 분자에 결합되지 않더라도 분자의 활성을 억제하는 물질을 포괄적으로 지칭하는 것이다. 따라서, 이 용어는 프로테아제와 같은 단백질의 발현 또는 프로테아제 억제제와 같은 분자의 생합성, 또는 프로테아제 또는 프로테아제 억제제의 활성의 조절제의 발현에 영향을 주는 물질을 포함한다. 억제되는 특정 활성은 효소 또는 분자의 특징적인 활성, 예컨대 프로테아제 활성 또는 프로테아제 억제제 활성일 수 있다. 프로테아제 활성 및 프로테아제 억제제 활성의 측정은 당분야에 공지되어 있다.
길항물질은 관련 분자, 예컨대 프로테아제 효소 상의 하나 이상의 부위, 바람직하게는 프로테아제 효소의 촉매 부위에 경쟁적으로 결합될 수 있다. 바람직하게는, 이러한 결합은 그 분자와 다른 성분간의 상호작용(예컨대 프로테아제 효소와그의 기질간의 상호작용)을 차단한다. 그러나, 길항물질은 반드시 촉매부위에 결합될 필요는 없으며, 그 결합이 효소 또는 분자의 활성을 감소시키는 한, 다른 단백질(예컨대 효소와 복합물을 형성하는 단백질) 또는 세포상 또는 세포중의 다른 성분의 인접 위치에 결합될 수 있다.
프로테아제 효소와 같은 효소의 길항물질의 경우, 길항물질은 효소가 결합할 수 있는 효소의 기질 또는 그의 단편을 포함할 수 있다. 또한, 천연적으로 생성되거나 펩티드 합성에 의해 생성된 기질 전체 또는 기질의 단편이 사용되면 효소상의 결합부위에 대하여 기질과 경쟁하게된다. 다르게는 또는 부가적으로, 프로테아제 효소에 결합할 수 있는 면역글로불린(예컨대 모노클로날 항체 또는 폴리클로날 항체)이 사용될 수 있다. 길항물질은 상호결합을 방해할 수 있는 펩티드 또는 기타 소형 분자를 포함할 수 있다. 길항물질의 다른 예는 이하에 보다 자세하게 기재하며, 당업자라면 잘 알고 있을 것이다.
프로테아제 또는 프로테아제 억제제의 활성을 차단하는 것은 세포에서 프로테아제 또는 억제제의 발현 수준을 감소시키는 것에 의해 달성할 수 있다. 예컨대, 세포는 안티센스 화합물, 예컨대 프로테아제 또는 프로테아제 억제제 mRNA에 특이적인 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드와 처리될 수 있다. 접착 단백질의 병원성 형태의 발현 수준은 이렇게하여 조절될 수 있다.
본 명세서에서 이용된 용어 "길항물질"은 원자 또는 분자와 같은 물질을 포함하지만 이들에 한정되는 것은 아니며, 상기 분자는 무기 또는 유기, 생물학적 작동체 분자, 단백질, 폴리펩티드, 펩티드, 핵산, 펩티드 핵산(PNA), 바이러스, 바이러스상 입자, 뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드, 뉴클레오티드의 합성 유사체, 리보뉴클레오티드의 합성 유사체, 변형된 뉴클레오티드, 변형된 리보뉴클레오티드, 아미노산, 아미노산 유사체, 변형된 아미노산, 변형된 아미노산 유사체, 스테로이드, 프로테오글리칸, 지질, 지방산 및 탄수화물일 수 있다. 상기 물질은 용액중에 존재하거나 현탁액(예컨대 결정성, 콜로이드성 또는 다른 미립자 형태) 형태일 수 있다. 상기 물질은 단량체, 이합체, 올리고머 등의 형태이거나 착물 형태일 수 있다.
용어 "길항물질"은 비제한적인 구조 단백질, 효소, 사이토카인(인터페론 및/또는 인터루킨), 항생물질, 폴리클로날 또는 모노클로날 항체, 또는 Fv 단편과 같은 그의 유효 부분을 비롯한 단백질 폴리펩티드 또는 펩티드(이때 항체 또는 그의 부분은 천연, 합성 또는 인간화된 펩티드 호르몬, 리셉터, 시그널 분자 또는 기타 단백질일 수 있음); 비제한적인 올리고뉴클레오티드 또는 변형된 올리고뉴클레오티드, 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 변형된 안티센스 올리고뉴클레오티드, cDNA, 게놈 DNA, 인공 또는 천연 염색체(예컨대 효모 인공 염색체) 또는 그의 부분, mRNA, tRNA, rRNA 또는 리보자임을 비롯한 RNA, 또는 펩티드 핵산(PNA)를 포함하는 핵산; 바이러스 또는 바이러스상 입자; 변형되거나 변형되지 않을 수 있는 뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 또는 합성 유사체; 변형되거나 변형되지 않을 수 있는 아미노산 또는 그의 유사체; 비-펩티드 (예컨대 스테로이드) 호르몬; 프로테오글리칸; 지질; 또는 탄수화물을 포함한다. 폴리펩티드의 활성 부위를 결합 및 점유함으로써 정상적인 생물학적 활성이 억제되도록 촉매 부위가 기질에 접근될 수 없게 만드는 무기 및 유기 화학물질을 비롯한 소형 분자도 또한 포함될 수 있다.소형 분자의 예는 소형 펩티드 또는 펩티드상 분자를 포함하며, 이들에 한정되지 않는다.
길항물질은 프로테아제 또는 프로테아제 억제제를 절단하는 프로테아제 일 수 있다. 프로테아제의 예는 아미노펩티다제 M, 카르복시펩티다제 P, 카르복시펩티다제 Y, 카스파제 1,4,5, 카스파제 2,3,7, 카스파제 6,8,9, 키모트립신, 인자 Xa, 펩신, TEV, 트롬빈, 트립신 등을 포함한다.
안티센스 화합물
상술한 바와 같이, 길항물질은 세포에서 프로테아제 또는 프로테아제 억제제의 발현수준을 감소시킬 수 있는 안티센스 RNA 및 안티센스 DNA를 포함한 하나 이상의 안티센스 화합물을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 안티센스 화합물은 프로테아제 또는 프로테아제 억제제를 암호화하는 mRNA에 상보적인 서열을 포함한다.
바람직하게는, 안티센스 화합물은 올리고머 안티센스 화합물, 특히 올리고뉴클레오티드이다. 안티센스 화합물은 바람직하게는 프로테아제 또는 프로테아제 억제제를 암호화하는 하나 이상의 핵산과 특이적으로 하이브리드 형성한다. 본 명세서에 이용한 것과 같이, 용어 "프로테아제를 암호화하는 핵산" 또는 프로테아제 억제제를 암호화하는 핵산"은 프로테아제 또는 프로테아제 억제제를 암호화하는 DNA, 그러한 DNA로부터 전사된 RNA(전-mRNA 및 mRNA 포함) 및 이러한 RNA로부터 유도된 cDNA를 포함한다. 올리고머화합물과 그의 표적 핵산과의 특정 하이브리드 형성은 핵산의 정상 작용을 방해한다. 특이적으로 하이브리드 형성하는 화합물에 의한 표적 핵산의 이러한 기능 조절을 일반적으로 "안티센스"라 칭한다. 방해되는 DNA의작용은 복제 및 전사이다. 방해되는 RNA의 작용은 예컨대 RNA가 단백질 번역 위치로 이동되는 것, RNA로부터 단백질이 번역되는 것, RNA를 접합시켜 하나 이상의 mRNA 종을 생성하는 것, 및 RNA가 관여하거나 그에 의해 촉진될 수 있는 촉매학적 활성과 같은 모든 생명작용을 포함한다. 표적 핵산 작용을 방해하는 이러한 전체 효과는 프로테아제 또는 프로테아제 억제제의 발현을 조절하는 것이다. 본 명세서의 내용에서, "조절"이라는 말은 유전자의 발현의 증가(자극) 또는 감소(억제) 모두를 의미한다. 예컨대, 프로테아제의 억제제를 암호화하는 유전자의 발현 또는 프로테아제 억제제 활성, 또는 프로테아제의 발현의 억제제 또는 프로테아제 억제제는 증가될 수 있다. 그러나, 바람직하게는, 발현의 억제, 특히 프로테아제 또는 프로테아제 억제제 발현의 억제는 유전자 발현 조절의 바람직한 형태이며 mRNA가 바람직한 표적이다.
안티센스 구조물은 미국특허 6,100,090호(모니아 등) 및 Neckers 등, 1992,Crit Rev Oncog3(1-2): 175-231에 자세하게 기재되어 있으며, 이 문헌은 본 명세서에 참고문헌으로 포함되어 있다.
폴리펩티드
본 명세서에 기재된 방법 및 조성물은 일반적으로 다수의 폴리펩티드, 그의 단편, 상동체, 변이체 및 유도체를 제공한다. 적합한 유용 폴리펩티드는 접착 단백질, 프로테아제 또는 프로테아제 억제제, 그의 단편, 동족체, 변이체 또는 유도체이다.
따라서, 본 발명은 접착 단백질, 프로테아제 또는 프로테아제 억제제의 아미노산의 변이체, 상동체 또는 유도체 뿐만 아니라 이러한 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 변이체, 상동체 또는 변이체를 개시한다. 이들의 각각은 그룹 I 또는 그룹 II 질병의 치료 또는 진단에 사용될 수 있다.
바람직하게는, 본 명세서에 개시된 폴리펩티드, 변이체, 상동체, 단편 또는 유도체는 접착 단백질, 프로테아제 또는 프로테아제 억제제의 하나 이상의 특성, 바람직하게는 하나 이상의 생물학적 활성을 포함한다. 따라서, 상기 변이체 등은 바람직하게는 접착 단백질, 프로테아제 및 프로테아제 억제제 활성을 비롯한 하나 이상의 활성을 포함하며, 이들에 한정되는 것은 아니다.
상동체
본 명세서에 기재된 폴리펩티드는 임의 공급원, 예컨대 관련된 바이러스성/세균성 단백질, 세포성 상동체 및 합성 펩티드 뿐만 아니라 이들의 변이체 또는 유도체로부터 얻은 상동 서열을 포함한다. 따라서 폴리펩티드는 포유류(예컨대, 마우스, 레트 또는 토끼), 특히 영장류, 보다 특히 사람과 같은 동물을 비롯한 다른 종으로부터의 접착 단백질, 프로테아제 또는 프로테아제 억제제의 상동체를 암호화하는 것도 포함한다. 보다 자세하게는, 상동체는 인간 상동체를 포함한다.
본 명세서에서, 상동체 서열은 아미노산 수준에서 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 이상 동일, 바람직하게는 95% 또는 98% 이상 동일하고, 바람직하게는 50 또는 100개 이상, 바람직하게는 200, 300, 400 또는 500개 아미노산이 관련 서열과 일치하는 아미노산 서열을 포함한다.
특히, 상동성은 비필수 인접 서열에 비하여 단백질 작용에 필수적인 것으로공지된 서열 영역, 예컨대 단백질분해 및/또는 접착에 필수적인 서열에 대한 것이어야 한다. 이러한 것은 상동 서열이 아주 밀접하게 관련된 생물로부터 얻은 것일 때 특히 중요하다.
상동성은 유사성 면에서 간주될 수 있지만(즉, 유사한 화학적 특성/작용을 갖는 아미노산 서열), 본 발명의 내용에서는 서열 동일성 면에서 상동성을 발현하는 것이 바람직하다.
상동성 대조는 눈으로, 또는 보다 흔히 기성의 서열대조 프로그램을 이용하여 실시할 수 있다. 이들 시중에서 구입할 수 있는 컴퓨터 프로그램은 2개 이상의 서열 사이의 % 동일성을 산출할 수 있다.
% 동일성은 연속적인 서열, 즉 한 개 서열을 다른 서열과 정렬시켜 1개 서열중의 각 아미노산을 한번에 한 개 잔기씩 다른 서열중의 상응하는 아미노산과 직접적으로 비교하여 산출할 수 있다. 이것을 "언갭트(ungapped)" 정렬이라 부른다. 전형적으로, 이러한 언갭트 정렬은 비교적 짧은 잔기(예컨대 50 연속 아미노산 미만)에 대해서만 실시된다.
상기 방법은 아주 단순하고 규칙적인 방법이지만, 이 방법은 예컨대 동일한 한 쌍의 서열에서, 1개의 삽입 또는 결실이 정렬될 다음 아미노산 서열을 유발하는 경우, 글로벌 정렬이 실시될 때 % 상동성의 대규모 감소를 초래할 수 있는 것에 대해서는 전혀 고려하고 있지 않다. 따라서, 대부분의 서열대조법은 과도한 상동성을 부과함없이 가능한 삽입 및 결실을 고려한 최적 정렬을 생성하도록 고안된다. 이것은 서열 정렬에 "갭"을 삽입시킴으로써 국소적인 상동성 또는 유사성을 최대화하는것에 의해 달성될 수 있다.
그러나, 보다 복잡한 이들 방법은 정렬이 생기는 각 갭에 "갭 패널티"를 부과하게되어 동일한 개수의 동일한 아미노산의 경우, 가능한한 적은 갭을 갖는 서열 정렬 - 2개의 비교된 서열 사이의 관련성이 더 높은 것을 반영함 -은 많은 갭을 갖는 서열정렬에 비하여 더 높은 스코어를 얻을 것이다. 1개의 갭이 존재하는 것에 대해 비교적 높은 패널티를 부과하고 갭중에 있는 이후의 잔기에 대해 더 적은 패널티를 부과하는 "Affine gap cost"가 전형적으로 이용된다. 이것은 가장 널리 이용되는 갭 스코링 시스템이다. 갭 패널티가 높으면 당연히 갭이 더 적은 최적화된 정렬을 생성할 것이다. 대부분의 정렬 프로그램은 변형되는 갭 패널티를 허용한다. 그러나, 이러한 서열대조용 소프트웨어를 이용할 때 디폴트 값을 이용하는 것이 바람직하다. 예컨대, GCG 위스콘신 Bestfit 팩케이지(이하 참조)를 이용할 때, 아미노산 서열에 대한 디폴트 갭 패널티는 일개 갭에 대해 -12이고 또 각 연장에 대해 -4 이다.
따라서 최대 % 상동성 산출에는 갭 패널티를 고려한 최적 정렬의 생성이 필요하다. 이러한 정렬을 실시하기 위해 적합한 컴퓨터 프로그램은 GCG 위스콘신 Bestfit 팩케이지 (University of Wisconsin, U.S.A: Devereux 등, 1984, Nucleic Acids Research 12: 387)이다. 서열 대조를 실시할 수 있는 다른 소프트웨어의 예는 이들에 한정되는 것은 아니나, BLAST 팩케이지 (Ausubel 등, 1999 상기 참조 - Chapter 18), FASTA (Altschul 등, 1990, J. Mol. Biol., 403-410) 및 대조 도구 GENEWORKS suite를 포함한다. BLAST 및 FASTA는 오프라인 및 온라인 서칭(Ausubel등, 1999 상기 참조, 페이지 7-58 내지 7-60 참조)으로 구입할 수 있다. 그러나, GCG Bestfit 프로그램을 사용하는 것이 바람직하다.
최종 % 상동은 동일성 면으로 측정될 수 있지만, 정렬방법 그 자체는 전형적으로 전부 아니면 무의 쌍(pair) 대조를 기본으로 하지 않는다. 대신, 화학적 유사성 또는 진화 차를 기본한 각 쌍 대조에 스코어를 부과하는 등급이 주어진 유사성 스코어 매트릭스를 일반적으로 이용한다. 이러한 흔히 이용되는 매트릭스의 예는 BLOSUM62 매트릭스 - BLAST suite 프로그램에 대한 디폴트 매트릭스 - 이다. GCG 위스콘신 프로그램은 일반적으로 퍼블릭 디폴트 값 또는 제공되는 경우 고객 심볼 대조 테이블을 사용한다(더 자세한 것은 사용자 매뉴얼 참고바람). GCG 팩케이지용 퍼블릭 디폴트 값을 사용하거나, 다른 소프트웨어의 경우, BLOSUM62와 같은 디폴트 매트릭스를 사용하는 것이 바람직하다.
소프트웨어가 최적 정렬을 형성하면, % 상동성, 바람직하게는 % 서열 동일성을 산출할 수 있다. 소프트웨어는 서열대조의 일부로서 전형적으로 이를 실시하여 숫자 결과를 생성한다.
본 발명의 아미노산 서열에 관한 용어 "변이체" 또는 "유도체"는 한 개 (또는 그 이상)의 아미노산의 치환, 변이, 변형, 교체, 결실 또는 부가를 포함하며 생성한 아미노산 서열은 변형되지 않은 서열과 거의 동일한 활성, 바람직하게는 상기 나타낸 폴리펩티드와 동일한 활성을 갖는다.
실시예에 개시된 것을 비롯한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 또는 그의 단편 또는 그의 상동체는 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물에 사용되기 위해 변형될 수 있다. 전형적으로, 이러한 변형이 실시되어도 그 서열의 생물학적 활성은 유지한다. 아미노산 치환은 예컨대 1, 2 또는 3 내지 10, 20 또는 30 치환이 실시될 수 있고, 단 변형된 서열은 변형되지 않은 서열의 생물학적 활성을 유지한다. 다르게는, 변형을 신중하게 실시하여 본 명세서에 기재된 폴리펩티드의 1 이상의 기능적 도메인을 불활성화시킨다. 프로테아제의 기능적 도메인은 프로테아제 도메인 및 프로테아제 촉매 부위를 포함한다. 아미노산 치환은 비-천연산출 유사체의 사용을 포함함으로써 치료적으로 투여된 폴리펩티드의 혈장 반감기를 증가시킬 수 있다.
예컨대 하기 표에 따라서 보존적 치환을 실시할 수 있다. 두 번째 칸에 있는 동일 블록의 아미노산과 바람직하게는 세 번재 칸에서 동일 행에 있는 아미노산은 각각 치환될 수 있다.
단편
폴리펩티드는 또한 본 명세서에 기재한 폴리펩티드(예컨대 접착 단백질, 프로테아제 또는 프로테아제 억제제)의 전체 길이의 서열의 단편을 포함한다. 바람직하게는 단편은 하나 이상의 항원결정기를 포함한다. 항원결정기를 확인하는 방법은당업계에 잘 공지되어 있다. 단편은 적어도 6개 아미노산, 보다 바람직하게는 적어도 10개, 20개, 30개, 50개 또는 100개 아미노산을 포함한다.
바람직하게는
또는 관련 핵산 서열, 예컨대 접착 단백질, 프로테아제 또는 프로테아제 억제제를 암호화하는 핵산 서열로부터 얻은 다른 잔기로 구성된 군으로부터 선택된 단편을 포함한다.
접착 단백질, 프로테아제 및 프로테아제 억제제, 이들의 단편, 상동체, 변이체 및 유도체는 재조합 수단에 의해 제조될 수 있다. 그러나 이들은 고상 합성법과 같은 당업자에게 잘 공지된 수법을 이용한 합성적 수단에 의해서도 제조될 수 있다. 상기 단백질은 융합 단백질로서 제조되어 예컨대 추출 및 정제를 돕는다. 융합 단백질 파트너의 예는 글루타치온-S-트랜스퍼라제(GST), 6xHis, GAL4 (DNA 결합 및/또는 전사 활성 도메인) 및 β-갈락토시다제를 포함한다. 융합 단백질 파트너와 관심을 갖고 있는 단백질 서열 사이의 단백질분해성 절단부위를 포함하여 융합 단백질 서열을 제거할 수 있는 것이 유리하다. 바람직하게는, 융합 단백질은 관심을갖고 있는 서열의 단백질의 융합을 방해한다. 단백질은 동물 세포로부터 세포추출에 의해 정제함으로써 수득할 수 있다.
본 명세서에 기재된 폴리펩티드, 변형체, 상동체, 단편 및 유도체는 실질적으로 분리된 형태일 수 있다. 이러한 폴리펩티드는 단백질의 사용목적을 방해하지 않고 실질적으로 분리될 수 있는 담체 또는 희석제와 혼합될 수 있다. 변형체, 상동체, 단편 또는 유도체는 실질적으로 정제된 형태일 수 있으며, 이 경우, 정제내의 90% 이상, 예컨대 95%, 98% 또는 99%가 단백질인 정제내의 단백질을 일반적으로 포함한다.
본 명세서에 기재된 폴리펩티드, 변형체, 상동체, 단편 및 유도체는 라벨로 표지될 수 있다. 라벨은 폴리펩티드 등이 검출될 수 있도록 하는 적합한 라벨일 수 있다. 적합한 라벨은 방사성 동위원소, 예컨대125I, 효소, 항체, 폴리뉴클레오티드 및 비오틴과 같은 링커를 포함한다. 라벨링된 폴리펩티드는 면역분석과 같은 진단 과정에 이용되어 샘플중의 폴리펩티드의 양을 측정한다. 폴리펩티드 또는 라벨링된 폴리펩티드는 표준수법을 이용하여 동물이나 사람에서 상기 폴리펩티드에 대한 면역반응을 검출하기 위한 혈청학적 또는 세포-매개된 면역 에세이에 사용될 수 있다.
본 명세서에 기재되고 경우에 따라 라벨링된 폴리펩티드, 변형체, 상동체, 단편 또는 유도체는 고상, 예컨대 면역에세이 웰 또는 딥스틱(dipstick)의 표면에 고정될 수 있다. 이러한 라벨링된 및/또는 고정화된 폴리펩티드는 적합한 시약, 대조물, 지시사항등과 함께 적합한 용기에 키트로 포장될 수 있다. 이러한 폴리펩티드 및 키트는 면역에세이법에 의해 폴리펩티드 또는 이들의 대립유전자 또는 종 변이체에 대한 항체를 검출하는 방법에 사용될 수 있다.
면역에세이법은 당업자에게 잘 공지되어 있으며 일반적으로 다음을 포함한다: (a) 상기 단백질에 대한 항체에 의해 결합될 수 있는 항원결정기를 포함하는 폴리펩티드를 제공하고; (b) 항체-항원 착물 형성을 허용하는 조건하에서 생물학적 샘플을 상기 폴리펩티드와 함께 배양하며; 또 (c) 상기 폴리펩티드를 포함하는 항체-항원 착물이 형성되는지 측정한다.
본 명세서에 기재된 접착 단백질, 프로테아제 또는 프로테아제 억제제 폴리펩티드, 변이체, 상동체, 단편 및 유도체는 시험관내 또는 생체내 세포 배양계에 사용되어 질병에서의 이들의 작용을 비롯한 세포 기능에서 상응하는 유전자 및 상동체의 역할을 연구한다. 예컨대, 절단되거나 변형된 폴리펩티드는 세포로 도입되어 세포에서 생기는 정상 기능을 파괴한다. 폴리펩티드는 재조합 발현 벡터(이하 참조)로부터 폴리펩티드의 그 자리 발현에 의해 세포로 도입될 수 있다. 이러한 발현벡터는 경우에 따라 폴리펩티드의 발현을 제어하는 유도성 프로모터를 갖는다.
곤충세포 또는 포유동물 세포와 같은 적합한 숙주세포의 사용은 번역후 구조변형(예컨대 미리스톨화, 글리코실화, 절단화, 라피데이션 및 티로신, 세린 또는 트레오닌 포스포릴화)을 제공할 수 있으며 이는 재조합 발현 산물에 대한 최적 생물학적 활성을 부여하는데 필요할 수 있다. 본 명세서에 기재된 접착 단백질, 프로테아제 및 프로테아제 억제제 폴리펩티드, 변이체, 상동체, 단편 및 유도체는 에세이 시스템에서 사용되어 세포에서 폴리펩티드의 기능을 방해하거나 또는 향상시키는 후보 물질을 확인할 수 있다.
단편
본 발명은 본 명세서에 기재한 접착 단백질, 프로테아제 또는 프로테아제 억제제의 단편인 폴리펩티드 또는 펩티드와 핵산을 제공한다.
바람직하게는 이러한 핵산 및 폴리펩티드 단편은
또는 관련 서열(즉, 본 명세서에 기재된 서열)로부터의 더 많은 잔기로 구성된다. 바람직하게는, 이러한 단편은 생물학적 활성, 바람직하게는 접착 단백질, 프로테아제 또는 프로테아제 억제제 활성을 포함한다.
본 명세서에 기재된 방법 및 조성물에 사용하기 위한 핵산은 바이러스성 또는 비-바이러스성 DNA 또는 RNA 벡터를 포함할 수 있으며, 비-바이러스성 벡터는 플라스미드, 선형 핵산 분자, 인공 염색체, 응축된 입자 및 에피소말 벡터를 포함하며 이들에 한정되지 않는다. 이종 유전자의 발현은 플라스미드 DNA를 근육(Wolff J. A. 등, 1990, Science, 247: 1465-1468; Carson D. A. 등, 미국특허 5,580,859호), 흉선(Skykes 등, 1994, Human Gene Ther., 5: 837-844), 흑색종(Vile 등, 1993, Cancer Res., 53: 962-967), 피부 (Hengge 등, 1995, Nature Genet., 10: 161-166), 간(Hickman 등, 1994, Human Gene Therapy, 5: 1477-1483)에 주사한 후 및 기도 상피에 노출한 후(Meyer 등, 1995, Gene Therapy, 2: 450-460) 관찰되었다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "핵산"은 합성 및 천연기원의 DNA 및 RNA를 포함하는 것으로 이해되며, DNA 또는 RNA는 변형되거나 변형되지 않은 데옥시- 또는 디데옥시-뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 또는 그의 유사체를 함유할 수 있다. 핵산은 단일 또는 이중 가닥 DNA 또는 RNA, RNA/DNA 헤테로듀플렉스 또는 RNA/DNA 공중합체로 존재할 수 있고, 용어 "공중합체"는 리보뉴클레오티드 및 데옥시리보뉴클레오티드를 모두 포함하는 단일 핵산 가닥을 지칭한다.
본 명세서에서 용어 "합성"은 시험관에서 화학적 또는 효소적 합성에 의해 제조된 것으로 정의된다.
본 명세서에 기재된 방법 및 조성물에 따라 유용한 치료성 핵산 서열은 접착 단백질 뿐만 아니라 프로테아제, 프로테아제 억제제 등을 암호화하는 서열을 포함한다. 치료성 핵산 서열은 또한 핵 단백질, 세포질 단백질, 미토콘드리아 단백질, 분비된 단백질, 플라즈마막-관련 단백질, 혈청 단백질, 바이러스성 항원, 세균성 항원, 원생동물 항원 및 기생충 항원을 암호화하는 서열을 포함한다. 치료성 핵산 서열은 또한 단백질, 지질단백질, 당단백질, 인단백질 및 핵산을 암호화하는 서열을 포함한다(예컨대 리보자임 또는 안티센스 핵산과 같은 RNA). 헤머헤드 류의 리보자임은 가장 적게 공지된 것으로, 자신을 시험관 합성과 세포전달에 이용되게 한다(Sullivan, 1994에 의해 요약됨, J. Invest. Dermatol., 103: 85S-98S; Usman 등, 1996, Curr. Opin. Struct. Biol., 6: 527-533). 혼입될 수 있는 화합물은 단백질 또는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열에 의해서 제한된다. 당업자라면 보다 많은 단백질 및 폴리펩티드가 확인됨에 따라서 이들의 상응하는 유전자가 유전자 발현 벡터에 클론되어 수용성 환자 또는 기타 척추동물의 조직에 투여되어 그 조직에서 발현될 수 있다는 것을 숙지하고 있을 것이다.
핵산
본 명세서에 기재된 방법 및 조성물은 다수의 핵산과 함께 그의 단편, 상동체, 변이체 및 유도체를 제공한다. 적합하게 유용한 핵산은 접착 단백질, 프로테아제 또는 프로테아제 억제제를 암호화하는 핵산, 또는 그의 단편, 상동체, 변이체 또는 유도체를 포함한다.
본 명세서에 이용한 바와 같이, 용어 "폴리펩티드", "뉴클레오티드" 및 핵산은 각각 동일한 것을 지칭한다. "폴리뉴클레오티드"는 일반적으로 폴리리보뉴클레오티드 또는 폴리데옥시리보뉴클레오티드를 지칭하며, 변형되지 않은 RNA 또는 DNA 또는 변형된 RNA 또는 DNA일 수 있다. "폴리뉴클레오티드"는 단일 및 이중가닥 DNA, 단일 및 이중가닥 영역의 혼합물인 DNA, 단일 및 이중가닥 RNA, 및 단일 및 이중가닥 영역의 혼합물인 RNA, 단일가닥, 보다 바람직하게는 이중가닥 또는 단일 가닥 및 이중가닥 영역의 혼합물일 수 있는 DNA 및 RNA를 포함하는 하이브리드 분자를 포함하며, 이들에 한정되지 않는다. 또한 "폴리펩티드"는 RNA 또는 DNA를 포함하거나 또는 RNA 및 DNA 모두를 포함하는 삼중 가닥 영역을 지칭한다. 용어 폴리뉴클레오티드는 또한 하나 이상의 변형된 염기를 함유하는 DNA 및 RNA 및 주쇄가 안정성 또는 다른 이유로 인하여 변형된 DNA 또는 RNA를 포함한다. "변형된" 염기는 예컨대 트리틸화된 염기 및 이노신과 같은 흔치않은 염기를 포함한다. 다수의 변형이 DNA 및 RNA에 대하여 가해졌다; 따라서 "폴리뉴클레오티드"는 천연형태에서 발견되는 폴리뉴클레오티드의 화학적으로, 효소적으로 또는 대사학적으로 변형된 형태 뿐만 아니라 바이러스 및 세포의 특징적인 DNA 및 RNA의 화학형태를 포함한다. "폴리뉴클레오티드"는 또한 비교적 짧은 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 이들을 흔히 올리고뉴클레오티드라 칭한다.
유전자 암호의 축퇴의 결과로써 다양하고 상이한 폴리뉴클레오티드 및 핵산이 동일한 폴리펩티드를 암호화할 수 있다는 것은 당업자라면 잘 알고 있을 것이다. 또한, 통상의 수법을 이용하여, 본 명세서에 기재된 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 폴리펩티드 서열에 영향을 주지 않는 뉴클레오티드 치환을 실시할 수 있고 이는 폴리펩티드가 발현되는 특정 숙주 세포의 코돈 이용을 반영하는 것임을 당업자라면 잘 알고 있을 것이다.
본 발명자는 또한 관련 핵산의 단편, 상동체, 변이체 또는 유도체인 핵산을 제공한다(예컨대, 접착 단백질, 프로테아제 또는 프로테아제 억제제를 암호화하는 핵산).
변이체, 유도체 및 상동체
핵산 변이체, 단편, 유도체 및 상동체는 DNA 또는 RNA를 포함할 수 있다. 이들은 단일가닥 또는 이중가닥일 수 있다. 이들은 또한 합성 또는 변형된 뉴클레오티드를 내부에 포함하는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 다수의 상이한 타입의 올리고뉴클레오티드에 대한 변형법이 당업계에 공지되어 있다. 이들은 메틸포스포네이트 및 포스포로티오에이트 주쇄, 아크리돈 또는 폴리리신 사슬을 분자의 3' 및/또는 5' 말단에 부가하는 것을 포함한다. 상기 문헌의 목적을 위하여, 폴리뉴클레오티드는 당업계에서 유용한 방법에 의해 변형될 수 있다. 이러한 변형을 실시하여 생체내 활성을 증가시키거나 또는 목적하는 폴리뉴클레오티드의 수명을 증가시킬 수 있다.
폴리뉴클레오티드가 이중가닥이면, 듀플렉스의 양쪽 가닥, 개별 가닥 또는 이들 모두가 본 발명의 방법 및 조성물에 포함될 수 있다. 폴리뉴클레오티드가 단일가닥이면, 이 폴리뉴클레오티드의 상보적인 서열도 또한 포함하는 것으로 이해되어져야한다.
뉴클레오티드와 관련한 용어 "변이체", "상동체" 또는 "유도체"는 그 서열에 대하여 하나(또는 그 이상)의 핵산의 치환, 변이, 변형, 대체, 결실 또는 부가를 포함한다. 바람직하게는, 상기 변이체, 상동체 또는 유도체는 생물학적 활성을 갖는 폴리펩티드를 코드한다. 바람직하게는 접착 단백질, 프로테아제 및 프로테아제 억제제의 단편, 상동체, 변이체 및 유도체는 조절된 효소 활성, 예컨대 접착 단백질 활성(2개 세포를 접촉시킬 수 있는 능력), 프로테아제 활성 또는 프로테아제 억제제 활성을 포함한다. 예컨대, 본 발명은 변형되지 않은 폴리펩티드에 비교하여 더 낮은 접착 단백질, 프로테아제 또는 프로테아제 억제제 활성을 포함하는 상대적폴리펩티드의 단편, 상동체, 변이체 및 유도체를 제공한다. 특히, 본 발명은 감소되거나 향상된 접착 활성을 나타내는 접착 단백질의 단편, 상동체, 변이체 및 유도체를 제공한다. 프로테아제 및 프로테아제 억제제의 단편, 상동체, 변이체 및 유도체도 또한 제공되며, 이것은 감소되거나 향상된 프로테아제 또는 프로테아제 억제제 활성을 나타낸다.
접착 활성에 대한 에세이의 경우, 프로테아제 활성 및 프로테아제 억제제 활성은 당업자에게 공지되어 있다.
상술한 바와 같이, 서열 동일성에 관해서, "상동체"는 서열목록에 나타낸 관련 서열에 대하여 바람직하게는 5% 이상의 동일성, 10% 이상의 동일성, 15% 이상의 동일성, 20% 이상의 동일성, 25% 이상의 동일성, 30% 이상의 동일성, 35% 이상의 동일성, 40% 이상의 동일성, 45% 이상의 동일성, 50% 이상의 동일성, 55% 이상의 동일성, 60% 이상의 동일성, 65% 이상의 동일성, 70% 이상의 동일성, 75% 이상의 동일성, 80% 이상의 동일성, 85% 이상의 동일성, 90% 이상의 동일성 또는 95% 이상의 동일성을 갖는다. 따라서, 본 발명은 그룹 I 및 그룹 II 질병을 치료함에 있어서 상기와 같은 동일성을 갖는 접착 단백질, 프로테아제 및 프로테아제 억제제의 상동성을 용도를 제공한다.
보다 바람직하게는, 95% 이상의 동일성, 보다 바람직하게는 96% 이상의 동일성, 보다 바람직하게는 97% 이상의 동일성, 더욱 바람직하게는 98% 이상의 동일성, 더욱 바람직하게는 99% 이상의 동일성이 있을 수 있다. 뉴클레오티드 동일성 대조는 상술한 바와 같이 실시할 수 있다. 바람직한 서열 대조 프로그램은 상술한 바와같은 GCG 위스콘신 Bestfit 프로그램이다. 디폴트 스코어링 매트릭스는 각 동일한 뉴클레오티드에 대해 10점을 주고 각 매치되지 않는 뉴클레오티드에 대해 -9점을 부여한다. 디폴트 갭 생성 패널티는 -50이며 디폴트 갭 연장 패널티는 각 뉴클레오티드에 대해 -3이다.
하이브리드화
본 발명은 본 명세서에 개시된 서열, 또는 그의 변이체, 단편 또는 유도체, 또는 상술한 것의 보체에 선택적으로 하이브리드화될 수 있는 뉴클레오티드 서열을 개시한다. 뉴클레오티드 서열은 바람직하게는 적어도 15의 뉴클레오티드 길이, 보다 바람직하게는 적어도 20, 30, 40 또는 50개 뉴크레오티드 길이이다.
본 명세서에 사용한 용어 "하이브리드화"는 "핵산의 가닥이 염기쌍을 이루는 것을 통하여 상보 가닥과 결합하는 과정" 뿐만 아니라 중합효소 연쇄반응 기술로 실시되는 증폭과정을 포함한다.
본 명세서에 기재된 뉴클레오티드 서열, 그의 보체에 선택적으로 하이브리드화할 수 있는 폴리뉴클레오티드는 본 명세서에 기재된 대응하는 뉴클레오티드 서열에 대하여 40% 이상의 상동성, 45% 이상의 상동성, 50% 이상의 상동성, 55% 이상의 상동성, 60% 이상의 상동성, 65% 이상의 상동성, 70% 이상의 상동성, 75% 이상의 상동성, 80% 이상의 상동성, 85% 이상의 상동성, 90% 이상의 상동성 또는 95% 이상의 상동성을 나타낼 수 있다. 바람직하게는, 이러한 폴리뉴클레오티드는 일반적으로 본 명세서에 기재된 대응하는 뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 20개, 바람직하게는 적어도 25 또는 30, 예컨대 적어도 40, 60 또는 100개 또는 그 이상의 연속적인 뉴클레오티드 영역에 걸쳐서 70% 이상, 바람직하게는 80% 또는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 또는 98% 이상의 상동성을 나타낸다.
용어 "선택적으로 하이브리드화가능한"는 프로브로 사용된 폴리뉴클레오티드가 표적 폴리뉴클레오티드가 상기 백그라운드에서 프로브에 하이브리드화되는 조건하에서 사용된다는 것을 의미한다. 백그라운드 하이브리드화는 예컨대 cDNA 또는 게놈 DNA 라이브러리가 스크리닝될 때 존재하는 다른 폴리뉴클레오티드로 인하여 생길 수 있다. 이 경우, 백그라운드는 타겟 DNA에 의해 관찰되는 특이적인 상호작용으로서 10배 미만, 바람직하게는 100배 미만인 프로브와 라이브러리의 비특이적 DNA 멤버 간의 상호작용으로 생긴 시그널 수준을 의미한다. 상호작용의 세기는 예컨대 프로브를 예컨대32P로 방사성표지시켜 측정할 수 있다.
하이브리드화 조건은 Berger 및 Kimmel (1987, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology, Vol 152, Academic Press, San Diego CA)에 의해 지시된 바와 같이 핵산 결합 착물의 융점(Tm)을 기본으로 하며 "스트린젠시"는 이하에 설명한 바와 같이 정의한다.
최대 스트린젠시는 전형적으로 약 Tm-5℃ (프로브의 Tm의 5℃ 미만)에서 생기며; 높은 스트린젠시는 Tm으로부터 약 5℃ 내지 10℃ 미만에서 생기고; 중간정도의 스트린젠시는 Tm으로부터 약 10℃ 내지 20℃ 미만에서 생기며; 또 낮은 스트린젠시는 Tm으로부터 약 20℃ 내지 25℃에서 생긴다. 당업자가 잘 이해하는 바와 같이, 최대 스트린젠시 하이브리드화는 동일한 폴리뉴클레오티드 서열을 확인 또는검출하기 위해 사용될 수 있는 반면에, 중간정도(또는 낮은) 스트린젠시 하이브리드화는 유사하거나 관련된 폴리뉴클레오티드 서열을 확인하거나 검출하기 위해 사용될 수 있다.
바람직한 요지로서, 본 발명은 스트린젠트 조건하(예컨대 65℃ 및 0.1 x SSC {1 x SSC = 0.15 M NaCl, 0.015 M Na3시트레이트 pH 7.0)하에서, 접착 단백질, 프로테아제 또는 프로테아제 억제제 핵산, 단편, 변이체, 상동체 또는 유도체에 하이브리드화될 수 있는 뉴클레오티드 서열을 제공한다.
상동체, 변이체 및 유도체의 생성
본 발명의 서열과 100% 동일한 것은 아니나 접착 단백질, 프로테아제 및 프로테아제 억제제의 상동체, 변이체 및 유도체를 포함하는 폴리뉴클레오티드는 다양한 방식으로 얻을 수 있다. 이들 서열의 다른 변이체는 예컨대 다양한 개인, 예컨대 상이한 집단의 개인으로부터 얻은 DNA 라이브러리를 프로빙하는 것에 의해 얻을 수 있다. 예컨대, 상동체는 다른 개인 또는 다른 종으로부터 확인될 수 있다. 또한 재조합 핵산 및 폴리펩티드는 상동체에서 상응하는 위치를 확인하고, 이 문헌에 기재된 바와 같이 그 분자를 합성 또는 생성함으로써 제조할 수 있다.
또한, 접착 단백질, 프로테아제 및 프로테아제 억제제의 기타 바이러스성/세균성, 또는 세포성 상동체, 특히 포유동물(예컨대 래트, 마우스, 소 및 영장류 세포)에서 발견되는 세포성 상동체를 얻을 수 있고 또 일반적으로 그의 상동체 및 단편은 인간 접착 단백질, 프로테아제 또는 프로테아제 억제제에 선택적으로 하이브리드화될 수 있다. 이러한 상동체는 비-인간 접착 단백질, 프로테아제 및 프로테아제 억제제 핵산, 단편, 변이체 및 상동체를 고안하기 위해 사용될 수 있다. 당분야에서 공지된 수단에 의해 돌연변이를 실시하여 다른 변이체를 생성할 수 있다.
상동체의 서열은 그로부터 제조된 cDNA 라이브러리 또는 다른 동물 종으로부터의 게놈 DNA 라이브러리를 프로빙하고, 또 이러한 라이브러리를 접착 단백질, 프로테아제 또는 프로테아제 억제제 핵산, 단편, 변이체 및 상동체 전부 또는 전부, 또는 중간 내지 높은 스트린젠시 조건하의 다른 단편을 포함하는 프로브와 프로빙하는 것에 의해 얻을 수 있다.
유사한 고려사항은 본 명세서에 기재된 폴리펩티드 또는 뉴클레오티드 서열의 종 상동체 및 대립유전자 변이체 수득에도 적용된다.
변이체 및 균주/종 상동체는 축퇴 PCR을 이용하여 얻을 수 있으며, 상기 축퇴 PCR은 접착 단백질, 프로테아제 또는 프로테아제 억제제를 암호화하는 핵산 서열내에서 보존되는 아미노산 서열을 암호화하는 변이체 및 상동체내에 서열을 표적으로 하도록 고안된 프라이머를 사용한다. 보존된 서열은 예컨대 몇 개의 변이체/상동체로부터 얻은 아미노산 서열을 정렬시키는 것에 의해 예상할 수 있다. 서열 정렬은 당업계에 공지된 컴퓨터 소프트웨어를 이용하여 실시할 수 있다. 예컨대 GCG 위스콘신 PileUp 프로그램이 널리 이용되고 있다.
축퇴 PCR에 사용되는 프라이머는 하나 이상의 축퇴 위치를 함유하며 또 공지 서열에 대한 단일 서열 프라이머를 사용하여 서열을 클로닝하는데 사용된 스트린젠시 조건 보다 낮은 스트린젠시 조건에서 사용된다. 관련이 먼 생물로부터 얻은 서열 간의 전체 뉴클레오티드 상동성은 매우 낮을 것이므로 이들 상황에서 축퇴 PCR은 라벨링된 단편을 사용하여 라이브러리를 스크리닝하는 것 보다 선택 방법이 될 것이다.
또한, 상동서열은 BLAST suite 프로그램과 같은 탐색 앨고리즘을 이용하여 뉴클레오티드 및/또는 단백질 데이터베이스를 탐색하는 것에 의해 확인될 수 있다.
다르게는, 이러한 폴리뉴클레오티드는 특징화된 서열, 예컨대 접착 단백질, 프로테아제 및 프로테아제 억제제 핵산, 또는 그의 변이체, 상동체, 유도체 또는 단편을 부위 특이적 돌연변이에 의해 얻을 수 있다. 이러한 것은, 예컨대 폴리뉴클레오티드 서열이 발현되는 특정 숙주 세포에 대한 코돈 선호를 최적화하기 위하여 서열에서 침묵 코돈 변화가 필요한 경우, 유용할 것이다. 제한효소 인식 부위를 도입하기 위해, 또는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 폴리펩티드의 특성 또는 작용을 변화시키기 위하여 다른 서열 변화도 필요할 것이다.
상술한 폴리뉴클레오티드는 프라이머, 예컨대 PCR 프라이머, 증폭 반응에 대한 프라이머, 프로브, 예컨대 방사성 또는 비-방사성 라벨을 사용하여 통상의 수단으로 라벨로 라벨링된 프로브를 생성하기 위해 사용될 수 있거나, 또는 상기 폴리뉴클레오티드는 벡터에 클로닝될 수 있다. 이러한 프라이머, 프로브 및 기타 단편은 적어도 8, 9, 10 또는 15개, 바람직하게는 적어도 20, 예컨대 적어도 25, 30 또는 40개 뉴클레오티드 길이를 갖고, 이는 본 명세서에서 사용된 용어 "폴리뉴클레오티드"에 포함된다.
DNA 폴리뉴클레오티드 및 프로브와 같은 폴리뉴클레오티드는 재조합적으로,합성적으로 또는 당업자에게 공지된 임의 수단에 의해 제조될 수 있다. 이들은 또한 표준 수법에 의해 클로닝될 수 있다.
일반적으로, 프라이머는 소망하는 핵산 서열을 한번에 1개 뉴클레오티드씩 단계별로 제조하는 것을 포함하는 합성 수단에 의해 제조할 수 있다. 이를 실시하기 위한 자동화된 수법을 사용한 방법은 당업자에게 공지되어 있다.
더 긴 폴리뉴클레오티드는 재조합 수법, 예컨대 PCR (중합효소 연쇄 반응) 클로닝 수법을 이용하여 제조될 수 있다. 이것은 클로닝하려고하는 지질 표적 서열영역과 인접하는 프라이머 쌍(예컨대 약 15 내지 30개 뉴클레오티드)을 제조하고, 이들 프라이머를 동물 또는 인간 세포로부터 얻은 mRNA 또는 cDNA와 접촉시키고, 소망하는 영역을 증폭시키는 조건하에서 중합효소 연쇄반응을 실시하며, 증폭된 단편을 분리하고(예컨대 반응 혼합물을 아가로오스 겔상에서 정제하는 것에 의해) 또 증폭된 DNA를 회수하는 것을 포함한다. 상기 프라이머는 적합한 제한효소 인식부위를 함유하도록 고안됨으로써 증폭된 DNA가 적합한 클로닝 벡터에 클로닝될 수 있다.
폴리뉴클레오티드 또는 프라이머는 라벨링될 수 있다. 적합한 라벨은32P 또는35S와 같은 방사성동위원소, 효소 라벨, 또는 비오틴과 같은 기타 단백질 라벨을 포함한다. 이러한 라벨은 폴리뉴클레오티드 또는 프라이머에 부가될 수 있고 또 공지 수법에 의해 검출될 수 있다. 라벨링되거나 라벨링되지 않은 폴리뉴클레오티드 또는 프라이머 또는 그의 단편은 인간 또는 동물 체내에서 폴리뉴클레오티드를 검출하거나 서열확인하기 위한 핵산-기제 시험에서 당업자에 의해 이용될 수 있다.
이러한 검출 시험은 일반적으로 DNA 또는 RNA를 함유하는 생물학적 샘플을, 하이브리드형성 조건하에서, 폴리뉴클레오티드 또는 프라이머를 포함하는 프로브와 접촉시키고 또 프로브와 샘플중 핵산 사이에 형성된 이중가닥을 검출하는 것을 포함한다. 이러한 검출은 PCR과 같은 수법을 이용하거나 또는 고상 지지체상에 프로브를 고정시키고, 프로브와 하이브리드화되지 않는 샘플중의 핵산을 제거한 다음 프로브에 하이브리드화된 핵산을 검출하는 것에 의해 실시될 수 있다. 다르게는, 샘플 핵산은 고상 지지체상에 고정화될 수 있고, 이러한 지지체에 결합된 프로브의 양을 검출할 수 있다.
상기 및 기타 형식의 적합한 에세이 방법은 예컨대 WO89/03891호 및 WO90/13667호에서 찾을 수 있다.
뉴클레오티드를 서열확인하기 위한 시험은 타겟 DNA 또는 RNA를 함유하는 생물학적 샘플을 하이브리드를 생성하는 조건하에서 폴리뉴클레오티드 또는 프라이머를 포함하는 프로브와 접촉시키고 또 그 서열을 예컨대 생거 디데옥시 사슬 종결방법(Sambrook 등 참조)에 의해 결정하는 것을 포함한다.
이러한 방법은 일반적으로 적합한 시약 존재하에서, 타겟 DNA 또는 RNA에 상보적인 가닥을 합성하는 것에 의해 프라이머 길이를 늘이고 또 A, C, G 또는 T/U 잔기의 하나 이상에서 연장반응을 선택적으로 종결시키며; 가닥 연장을 허용하고 반응을 종결시키고; 연장된 생성물을 크기에 따라 분리하여 선택적 종결이 생긴 뉴클레오티드의 서열을 결정하는 것을 포함한다. 적합한 시약은 DNA 중합효소, 데옥시뉴클레오티드 dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP, 완충액 및 ATP를 포함한다. 디데옥시뉴클레오티드는 선택적 종결에 사용된다.
항체
본 발명은 코르네오데스모신 유전자에 의해 암호화되는 폴리뉴클레오티드/단백질상의 항원결정기 또는 돌연변이 항원결정기에 특이적으로 결합되는 폴리클로날 또는 모노클로날 항체를 제공한다. 항체의 제조시, 코르네오데스모신 유전자 및 그의 다형성에 의해 암호화되는 단백질(돌연변이 존재 또는 부재)은 면역원의 공급원으로 사용된다. 아미노산 서열 또는 돌연변이 펩티드 서열로부터 분리된 펩티드 아미노산 서열도 또한 면역원으로서 사용될 수 있다.
항체는 모노클로날이거나 폴리클로날일 수 있다. 유리하게는, 항체는 서열에 기본한 합성 펩티드에 대하여 제조되거나 또는 클로닝 수법에 의해 재조합적으로 제조되며 또는 천연 유전자 산물 및/또는 그의 부분은 분리되어 면역원으로 사용될 수 있다. 이러한 단백질 또는 펩티드는 Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., 1988에 일반적으로 기재된 것과 같은 당업자에게 공지된 표준 항체 제조 기술에 의해 항체를 제조하기 위해 사용될 수 있다.
폴리클로날 항체를 제조하기 위하여, 토끼나 염소 같은 숙주를, 필요에 따라 보조제가 담체에 커플링되어 있는 단백질 또는 펩티드로 면역화시킨다; 이 단백질에 대한 항체를 혈청으로부터 수집한다.
모노클로날 항체를 제조하기 위하여, 적합한 공여체, 일반적으로 마우스를단백질 또는 펩티드 단편으로 과면역화시키고 또 항체 생성 비장 세포를 분리하는 것을 포함한다. 이들 세포를 골수종 세포와 같은 영속적인 세포에 융합시켜 영속적이면서 필요한 항체를 분비하는 융합세포 하이브리드를 제공한다. 이 세포를 대량 배양하며, 배지로부터 모노클로날 항체를 수집한다.
항체는 고상 지지체 기질에 결합되거나 또는 검출가능한 성분에 콘쥬게이트되며, 이들 결합된 것 및 콘쥬게이트된 것 모두 당업자에게 공지되어 있다(형광성 또는 효소적 성분의 콘쥬게이트화에 대한 일반적 논의, Johnstone and Thorpe, Immunochemistry in Practice, Blackwell Scientific Publications, Oxford, 1982 참조). 항체가 고상 지지체 기질에 결합하는 것은 당분야에서 잘 공지되어 있다(일반적 논의의 경우 Harlow and Lane Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Publications, New York, 1988 참조). 검출가능한 성분은 비오틴, 금, 페리틴, 알칼리성 포스포타제, β-갈락토시다제, 퍼옥시다제, 우레아, 플루오레세인, 로다민, 트리튬,14C 및 요오드화도와 같은 형광성, 금속성, 효소적 및 방사성 마커를 포함할 수 있으며, 이들에 한정되지 않는다.
결합 불균형 분석
결합 불균형(LD) 분석은 질병 유전자를 맵핑하기 위한 강력한 도구이며 착물 특징을 조사하는데 특히 유용할 수 있다. LD 맵핑은 다음 기대를 기본으로한다: 일개 집단의 임의의 2개 멤버의 경우, 몇 세대간에 걸쳐 일어나는 재조합은 게놈과 섞여서 이들은 자신의 선조와 공통점이 적게된다. 그러나, 이들 개인이 선조로부터유전된 질병을 갖게된다면, 이 질병에 관련된 유전자 및 그를 둘러싸는 마커는 변화없이 유전되거나, 또는 조상으로부터 IBD("identical by descent")이다. 공유하는 영역(즉 IBD)의 크기는 영향을 받은 개인과 이들의 조상 사이의 세대 수와 반비례한다. 즉 "오래된" 집단은 미세한 규모의 맵핑에 적합하고 최근에 만들어진 집단은 LD를 사용하여 대략적인 질병 유전자를 확인하는데 적합하다(Houwen 등, 1994, 도 3 및 상세한 설명 참조). 분리된 집단은 전형적으로 선조의 수가 적기 때문에, 이들은 핀란드에서 실시된 몇 개의 성공적인 LD 연구(de la Chapelle, 1993)에 의해 지시되는 바와 같이 LD 연구에 특히 적합하다.
LD 분석은 몇 개 위치의 클로닝 시험에 사용(Kerem 등, 1989; MacDonald 등, 1992; Petrukhin 등, 1993; Hastbacka 등, 1992 및 1994)되었지만, 각 경우에서 초기 편재화는 통상의 결합법을 이용하여 얻었다. 위치 클로닝은 유전자의 생화학적 작용에 관한 것이 아니라, 유전자의 염색체상 위치를 기본으로한 유전자만의 분리를 말한다. Lander 및 Botstein (1986)은 LD 맵핑을 이용하여 통상의 결합분석없이, 질병 위치에 대하여 인간 게놈을 스크리닝하는데 사용될 수 있다고 제안하였다. 이 방법은 게놈 전반에 걸친 맵핑된 마커 세트를 얻을 있게될 때 까지는 실용적이지 않았다(Weissenbach 등, 1992). LD 맵핑을 이용한 게놈 스크리닝의 실행성은 출원인에 의해 제시된다.
상피에서 증가되거나 감소된 세포-세포 접착과 관련된 질병을 유발하는 유전자의 염색체상 위치를 확인하면 병력이 있는 가계의 개인을 진단, 치료 및 유전적 카운셀링을 용이하게할 수 있다.
이러한 질병의 심각성과 이 질병의 순수한 표현형 진단의 제한으로 인하여, 임상적 진단에 부응하는 유전학적으로 개인을 구분하여 이들의 유전형 서브타이프을 기본으로하여 적합한 요법을 결정하는 것이 요청되고 있다.
질병의 진단
본 발명은 비정상적인 상피 세포-세포 접착과 관련된 질병의 진단방법을 제공한다. 접착 단백질(예컨대 코르네오데스모신)을 암호화하는 유전자에서의 돌연변이는 각질세포와 같은 상피세포 간의 접착을 감소시키는 것으로 밝혀졌다. 이들 유전자에서의 일부 돌연변이는 접착 단백질의 변경된(전형적으로 감소된) 발현을 초래할 수 있거나, 감소된 접착 활성이나 더 높은 프로테아제 감도를 갖는 접착 단백질의 발현을 초래할 수 있다. 프로테아제 및 프로테아제 억제제 유전자에서의 다른 돌연변이는 실시예에 나타낸 바와 같이 질병과 관련이 있다. 이러한 돌연변이는 전형적으로 그룹 1 질병과 관련이 있고 또 이를 초래할 수 있으며, 감소된 세소-세포 접착은 표피의 장벽기능의 손상을 초래한다.
따라서, 그룹 1 질병은 접착 단백질의 발현수준을 결정하는 것에 의해 질병에 걸린 환자 또는 질병에 걸린 가능성 있는 환자에서 진단될 수 있으며, 접착단백질의 발현감소는 그룹 1 질병의 증상이다. 또한 본 발명은 상피세포-세포 접착에 관여한 접착 단백질의 접착 활성을 측정하는 것에 의해 그룹 1 질병을 진단하는 방법을 제공하며, 접착활성 감소는 그룹 1 질병의 증상이다. 본 발명은 또한 상피 세포-세포 접착에 관여하는 접착 단백질의 프로테아제 감도를 측정하는 것에 의해 그룹 1 질병의 진단방법을 제공하며, 이때 향상된 프로테아제 감도는 그룹 1 질병의증상이다. 본 발명은 또한 접착 단백질의 감소된 발현, 또는 감소된 접착활성 및/또는 증가된 프로테아제 감도를 갖는 접착단백질의 발현과 관련된 돌연변이의 존재를 측정하는 것에 의해 그룹 1 질병의 진단방법을 제공한다.
코르네오데스모신과 같은 접착 단백질을 암호화하는 유전자에서의 다른 돌연변이는 각질세포와 같은 상피세포사이의 접착증가를 초래한다. 이들 유전자에서의 일부 돌연변이는 접착 단백질의 발현증가, 또는 증가된 접착활성 또는 감소된 프로테아제 감도를 갖는 접착 단백질의 발현을 초래한다. 프로테아제 및 프로테아제 억제제 유전자에서의 돌연변이는 질병과 관련된 것으로 개시된다. 이들 돌연변이는 전형적으로 그룹 2 질병과 관련이 있으며, 이들은 향상된 세포-세포 접착을 초래한다.
따라서, 그룹 2 질병은 접착 단백질의 발현수준을 측정하는 것에 의해 질병에 걸린 환자 또는 질병에 걸린 가능성이 있는 환자로 진단될 수 있으며, 접착 단백질의 향상된 발현수준은 그룹 2 질병의 증상이다. 또한, 본 발명은 상피세포-세포 접착에 관여한 접착 단백질의 접착 활성을 측정하는 것에 의해 그룹 2 질병을 진단하는 방법을 제공하며, 증가된 접착활성은 그룹 2 질병의 증상이다. 본 발명은 또한 상피 세포-세포 접착에 관여하는 접착 단백질의 프로테아제 감도를 측정하는 것에 의해 그룹 2 질병의 진단방법을 제공하며, 이때 감소된 프로테아제 감도는 그룹 2 질병의 증상이다. 본 발명은 또한 접착 단백질의 증가된 발현, 또는 증가된 접착활성 및/또는 감소된 프로테아제 감도를 갖는 접착단백질의 발현과 관련된 돌연변이의 존재를 측정하는 것에 의해 그룹 2 질병의 진단방법을 제공한다.
바람직한 구체예에 따르면, 그룹 1 또는 그룹 2 질병의 진단은 코르네오데스모신 유전자에서Hph1 제한효소 부위의 존재 또는 부재의 검출에 의해 실시한다.
바람직하게는, 그룹 1 질병은 코르네오데스모신 유전자에서Hph1 부위의 부재를 검출하는 것에 의해 진단된다. 바람직하게는, 그룹 2 질병은 코르네오데스모신 유전자에서Hph1 부위의 존재를 검출하는 것에 의해 진단된다. 보다 바람직하게는,Hph1 부위의 부재로 진단된 그룹 1 질병은 습진 또는 크론병이고, 또Hph1 부위의 존재로 진단된 그룹 2 질병은 건선 또는 여드름이다.
다르게는 또는 조합하여, 본 발명은 코르네오데스모신 유전자에서 위치 +1243에서 T의 존재 또는 부재를 검출하는 것에 의해 그룹 1 또는 그룹 2 질병을 진단하는 방법을 제공한다. 바람직하게는, 그룹 1 질병은 코르네오데스모신 유전자에서 위치 +1243에서 T의 존재를 검출하는 것에 의해 진단된다. 바람직하게는, 그룹 2 질병은 코르네오데스모신 유전자에서 위치 +1243에서 T의 부재에 의해 진단된다. 보다 바람직하게는, 위치 +1243에서 T의 존재에 의해 진단된 그룹 1 질병은 습진 또는 크론병이고, 또 위치 +1243에서 T의 부재에 의해 진단된 그룹 2 질병은 건선 또는 여드름이다.
바람직하게는, 위치 +1243에서 T의 존재는 C 에서 T 로의 전이와 관련이 있다. 또한 위치 +1243에서 T의 부재는 T 에서 C 로의 전이와 관련이 있다.
당해 분야에 공지된 단백질의 프로테아제 감도를 측정하는 방법(Egelrud, 1993)는 상기 기재된 진단방법에 사용될 수 있다. 유사하게, 예컨대 SSCP, RFLP, SNP 등의 분석법을 이용하여 돌연변이를 검출하는 것은 당해 분야에 공지되어 있으며 이하에 자세히 기재한다.
접착단백질의 비정상적인(즉, 증가되거나 감소된) 단백질분해성 분해를 검출하는 것은 그룹 1 및 그룹 2 질병을 진단하기 위해 이용될 수 있다. 따라서, 접착 단백질의 단백질분해에 관여된 프로테아제의 발현 및/또는 활성 수준의 증가는 그룹 1 질병의 특징(진단성)이다. 따라서, 본 발명은 접착 단백질의 단백질분해에 관여된 프로테아제의 발현수준을 검출하는 것에 의해 그룹 1 질병을 진단하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 접착 단백질의 단백질분해에 관여된 프로테아제의 발현수준을 검출하는 것에 의해 그룹 1 질병을 진단하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 그룹 2 질병의 진단에 적합하다. 따라서, 그룹 2 질병을 진단하는 방법은 접착 단백질의 단백질분해에 관여된 프로테아제의 발현수준을 검출하는 것을 포함하며, 이때 프로테아제의 감소된 발현은 그룹 2 질병의 증상이다. 또한 본 발명은 접착 단백질의 단백질분해에 관여된 프로테아제의 발현수준을 검출하는 것에 의해 그룹 2 질병을 진단하는 방법을 제공하며, 이때 프로테아제의 감소된 발현은 그룹 2 질병의 증상이다.
접착단백질의 분해에 관여하는 프로테아제의 단백질분해 활성을 억제할 수 있는 프로테아제 억제제의 발현 및/또는 활성의 수준은 그룹 1 또는 그룹 2 질병을 진단하는 수단으로서 검출될 수 있다. 따라서, 프로테아제 억제제의 발현 및/또는 활성의 감소된 수준은 그룹 1 질병의 특징이다. 따라서, 그룹 1 질병을 진단하는 방법은 환자에서 프로테아제 억제제의 발현수준이 감소된 것을 검출하는 것을 포함한다. 유사하게, 그룹 1 질병을 진단하는 방법은 프로테아제 억제제의 활성수준을검출하는 포함하며, 이때 프로테아제 억제제의 활성의 감소된 수준은 그룹 1 질병의 증상이다.
다른 구체예로서, 그룹 2 질병을 진단하는 방법은 프로테아제 억제제의 발현 수준을 검출하는 것을 포함하며, 이때 프로테아제 억제제의 증가된 발현은 그룹 2 질병의 증상이다. 또한 그룹 2 질병을 진단하는 방법은 프로테아제 억제제의 활성수준을 검출하는 것을 포함하며, 이때 프로테아제 억제제의 증가된 활성은 그룹 2 질병의 증상이다.
프로테아제 및/또는 프로테아제 억제제의 발현 및/또는 활성의 검출은 유전자 수준, 즉 증가되거나 감소된 프로테아제/프로테아제 억제제 활성과 관련된 돌연변이를 검출하는 것에 의해 실시될 수 있음이 분명하다.
바람직하게는, 상기 방법으로 검출되거나 그 특성이 측정된 접착단백질은 코르네오데스모신이며, 바람직하게는 상기 유전자는 코르네오데스모신을 암호화하는 유전자이다. 바람직하게는, 검출된 프로테아제는 각질층 키모트립신 효소(SCCE) 또는 각질층 펩신 효소(SCTE)이다. 바람직하게는, 검출될 프로테아제 억제제는 항-류코프로테아제(SLPI) 또는 엘라핀 프로테아제 억제제 3 (PI3 또는 SKALP)이다.
바람직하게는, 검출된 프로테아제 억제제는 엘라핀이다. 용어 "높은", "증가된" 및 "향상된"이라는 것은 활성, 프로테아제 감도, 발현 등에 관한 것이며, 이들은 동일한 환자 또는 다른 개인로부터 얻은 정상적인 질병에 걸리지 않은 상피의 상응하는 특성과 비교한 것으로 이해해야한다. 유사하게, 용어 "더 낮은", "감소된" 또는 "저하된"은 정상의 질병에 걸리지 않은 상피와 비교한 상대적 수준을 지칭한다.
본 명세서에 기재된 방법 및 조성물에 적합한 진단방법의 비제한적인 특정 예를 다음에 나타낸다:
유전자 진단시험은 흥미를 갖고 있는 질병과 관련된 SNP에 대한 코르네오데스모솜성 단백질(예컨대 코르네오데스모솜), 프로테아제(SCCE, SCTE) 및 프로테아제 억제제(즉, SKALP, SLPI)를 암호화하는 유전자를 유전자형 결정(genotyping)하는 것에 의해 실시할 수 있다. 프라이머는 돌연변이 및/또는 다형성 측면에 위치하는 서열에 맞춰 고안된다. 프로테아제(SCCE, SCTE) 및 프로테아제 억제제 (즉, SKALP, SLPI)유전자의 서열은 Gene Jockey II 소프트웨어(Biosoft, 영국 캠브릿지 CB2 1LR 베이트만 스트리트 소재)를 이용하여 각 엑손의 단부에서 프라이머를 고안하기 위해 사용된다. PCR 증폭후, 돌연변이는 제한효소를 이용한 대립유전자 분석, TaqMan 분석법(이하에 설명)을 이용하거나 단순히 서열결정하는 것에 의해 검출될 수 있다.
간단히 말해, 25 ㎕ PCR 반응물은 8% 글리세롤, 200 μM 각 dATP, dGTP 및 dCTP, 400 μM dUTP, 1.25 U AmplitaqGold (퍼킨-엘머, 미국), 1.25U Uracil-N-Glycosylase (퍼킨-엘머, 미국), 5 mM MgCl2, 500-900 nM 각 프라이머를 포함한다. 이들 위치에서 대립유전자 분석은 광범위하게 검증된 방법인 5' 뉴클레아제 분석법(TaqManTM대립유전자 분석시험)을 이용하여 실시한다. 이 시험은 Taq 중합효소의 5' 뉴클레아제 활성과 PCR 동안 대립유전자에 하이브리드화되도록 고안된 2개프로브의 분해를 형광-공명 에너지 전달(FRET)에 의해 검출하는 것을 기본으로 한다. 이중형광 프로브는 ABI-PE (캐나다 포르스터 씨티; 영국 워링톤)에 의해 제공된다. 프로브와 프라이머 서열을 고안하고 프로브에는 카르복시플루오레세인(FAM) 및 카르복시-4,7,2',7'-테트라클로로플루오레세인(TET) 형광 염료로 5' 말단에서 및처(quencher) 카르복시테트라메틸로다민(TAMRA)으로 3'말단을 라벨링시킨다. FAM 및 TET 프로브의 농도는 사용된 프로브에 따라서 20-50 nM 및 50-350 nM 사이이다. 플레이트는 LS50-B 또는 PE7200 형광계로 스캐닝한다.
본 명세서에 이용된 용어 "중합효소 연쇄반응" 또는 "PCR"은 물리스 등에게 허여된 미국특허 4,683,195호 및 미국특허 4,683,202호에 기재된 PCR 과정을 지칭한다. 이 과정은 기본적으로 다음을 포함한다: (1) 추출된 DNA를 처리하여 단일가닥 상보적 가닥을 형성하고; (2) 한쌍의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 부가하며, 이때 쌍을 이루는 1개 프라이머는 실질적으로 센스 가닥의 서열의 일부와 실질적으로 상보적이고 또 그 쌍의 나머지 1개 프라이머는 상보적 안티센스 가닥에 있는 동일 서열의 상이한 부분과 실질적으로 상보적이며; (3) 쌍을 이룬 프라이머를 상보적 서열에 어닐링하고; (4) 어닐링된 프라이머를 각 프라이머의 3' 말단으로부터 각 프라이머에 어닐링된 가닥에 상보적인 연장 생성물을 합성하도록 동시에 연장시키고, 이때 상기 연장 생성물이 완성되면 분리한 후 다른 프라이머에 대한 연장 생성물 합성을 위한 주형으로서 사용하며; (5) 상기 주형으로부터 연장 생성물을 분리하여 단일가닥 분자를 얻고; 또 (6) 상기 단일가닥 분자를 다시 상술한 어닐링, 연장 및 분리단계를 반복하여 증폭시킨다.
생화학적 진단시험은 단백질분해 특성, N/C 말단 스크리닝, 효소기능 및/또는 활성의 스크리닝을 포함한다.
단백질분해 특징은 다음과 같이 실시된다. 코르네오데스모신의 모든 성숙한 형태를 인식할 수 있는 폴리클로날 항체를 생성한다. 환자로부터 얻은 스트립으로부터 각질층 추출물을 추출한다. 단백질 추출물을 SDS-PAGE 겔상에서 이동시켜 막으로 보내고 일차 항-코르네오데스모신 항체 및 라벨링된 제2 항체와 하이브리드화시킨다. 환자의 처리된 코르네오데스모신의 분자량을 대조군과 비교한다.
N-/C-말단의 스크리닝은 다음과 같이 실시한다. 환자 그룹에는 특정 형태의 데스모솜성/코르네오데스모솜성 단백질(예컨대 코르네오데스모신)이 존재하지만 대조군에는 존재하지 않는 경우 또는 그 반대의 경우, N-/C-말단 특이 항체를 제조하여 병원성 형태의 데스모솜성/코르네오데스모솜성 단백질(예컨대 코르네오데스모신)을 검출한다. 병원성 형태의 확인은 다음과 같이 실시할 수 있다. 상이한 형태의 코르네오데스모신은 음이온 교환 크로마토그래피 및 친화성 크로마토그래피비-변성 저장성 완충액 추출물(TEA 완충액 추출물)로부터 정제된다(Simon 등, 1997). 친화성 크로마토그래피의 용출 분획을 모아서, 동결건조시키고, SDS-PAGE에 의해 분리한다. 코르네오데스모신의 발병형태에 상응하는 밴드를 절단하고 내부 및 NH2-말단 아미노산 서열 분석에 의해 특징화한다.
효소 기능/활성에 대한 스크리닝은 다음과 같이 실시할 수 있다.
cDNA로부터 시험관에서 번역하는 동안 데스모솜/코르네오데스모솜 단백질(예컨대 코르네오데스모신)을 방사성표지시키고 37℃에서 1.5 내지 3시간 동안 프로테아제 효소(SCCE, SCTE)와 배양한다. SCCE 및 SCTE는 Egelrud, 1993 및 Brattsand 및 Egelrud, 1999(Egelrud, 1993; Brattsand and Egelrud, 1999)에 의해 기재된 바와 같이 분리된 발바닥 각질세포의 KCl 추출물을 사용하여 제조할 수 있다. SCCE는 SBT1 Affigel 15상에서 친화성 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있다. 다른 방법은 시험관에서 융합 단백질을 생성하고 면역친화성 칼럼(Ekholm 등, 2000)을 이용하여 정제하는 것이다. SDS-PAGE 및 방사선사진법을 이용하여 가수분해성 펩티드의 패턴을 분석한다. 방사선사진 밴드의 세기는 사진농도계로 정량하며 55 kDa (전체길이) 미만의 펩티드 분획을 산출한다. 활성은 초당 g 효소에 의해 처리된 기질의 몰로서 표시된다.
데스모솜 및 코르네오데스모솜
데스모솜은 상피세포 사이의 원반형 세포내 결합을 형성하는 대칭구조이다. 표피에서, 데스모솜은 각질세포간의 접착을 매개한다. 건선, 다양한 비늘선 및 피부 건조증에서, 코르네오데스모솜(표피의 상층에 있는 데스모솜)의 개수는 각질층에서 증가한다. 데스모글레인 및 데스모콜린과 같은 세포외 코어 도메인의 단백질내에 있는 코르네오데스모솜과 데스모플라킨 I 및 II, 플라코글로빈(PG) 및 플라코필린스(PP)을 비롯한 세포내 코르네오데스모솜 단백질 간의 상호결합을 보여주기 위해 면역전자 현미경을 이용한다(Cowin and Burke, 1996). 표피통합성에서 코르네오데스모솜 단백질의 중요성은 데스모플라킨 하플로결핍에 의해 유발된 수장족저 각피증(palmoplantar keratoderma)의 스트리에트 서브타입과 같은 유전병으로 나타난다(Armstrong 등, 1999). 로리크린 유전자에서의 돌연변이는 카미사(Camisa)의각피증을 초래한다. 코르네오데스모신은 코르네오데스모솜의 당단백질이다. 상이한 분자량 33-36, 40-46 및 52-56을 갖는 세가지 형태의 코르네오데스모신이 표피로 부터 분리되었다(시몬 등, 1997).
MHC 표피유전자 클러스터(염색체 6p21)내에서 코르네오데스모신/S 유전자 및 관련 유전자에서의 돌연변이는 각질세포 사이의 접착을 감소시킨다.
스크리닝 에세이
상술한 접착 단백질, 프로테아제 및 프로테아제 억제제를 사용하여 폴리펩티드에 결합되고 또 폴리펩티드를 활성화(작용물질)하거나 폴리펩티드의 활성을 억제하는(길항물질) 화합물의 스크리닝하였다. 따라서, 접착 단백질, 프로테아제 및 프로테아제 억제제는 예컨대 세포, 무세포 제제, 화학적 라이브러리, 및 천연 생성물 혼합물에서 소형 분자 기질과 리간드의 결합을 평가하는데 사용될 수 있다. 이들 기질과 리간드는 천연 기질 및 리간드일 수 있거나 구조적 또는 기능적 유사체일 수 있다. Coligan 등,Current Protocols in Immunology1(2): Chapter 5 (1991) 참조.
접착 단백질, 프로테아제 및 프로테아제 억제제는 그룹 I 및 그룹 II 질병과 같은 피부 감염병을 포함한 피부질병등 많은 병인을 비롯한 많은 생물학적 작용에 관여한다. 따라서, 접착단백질, 프로테아제 및 프로테아제 억제제를 자극하거나, 또는 반대로 접착 단백질, 프로테아제 및 프로테아제 억제제의 작용을 억제할 수 있는 화합물 및 약물을 찾는 것이 바람직하다. 일반적으로, 작용물질 및 길항물질이 본 명세서에 기재한 그룹 I 및/또는 그룹 II에 대해 치료 및 예방목적으로 사용된다.
접착 단백질, 프로테아제 및 프로테아제 억제제와 상호작용할 수 있는 후보 화합물의 디자인은 본 발명에 따른 폴리펩티드의 분자형태의 구조적 연구를 기본으로 할 수 있다. 특정의 다른 단백질과의 작용 부위를 결정하는 한가지 방법은 X-선 결정화법 또는 이차원 NMR법과 같은 물리적 구조 결정법이다. 이들은 아미노산 잔기 형태 분자 접촉 영역에 대한 안내를 제공할 것이다. 단백질 구조를 결정하기 위한 상세한 설명은 예컨대 Blundell and Johnson (1976) Protein Crystallography, Academic press, New York 참조.
다른 디자인은 표면상에서 접착 단백질, 프로테아제 및 프로테아제 억제제를 발현하는 적합한 세포를 생성하는 이론적 과정을 포함한 스크리닝 방법을 이용한다. 이러한 세포는 동물, 효모, 초파리 또는 대장균으로부터 얻은 세포를 포함한다. 폴리펩티드를 발현하는 세포(또는 발현된 폴리펩티드를 함유하는 세포막)을 시험 화합물과 접촉시켜 결합, 또는 작용반응의 자극 또는 억제를 관찰한다. 예컨대 제노퍼스 오오사이테스(Xenopus oocytes)에 접착 단백질, 프로테아제 및 프로테아제 억제제 또는 폴리펩티드중의 하나 이상을 암호화하는 mRNA를 주입하고, 시험 화합물에 노출시키는 것에 의해 유도된 전류를 이하에 상세하게 기재된 바와 같이 전압 클램프 측정법에 의해 측정한다.
후보 화합물이 단백질, 특히 항체 또는 펩티드이면, 후보 화합물의 라이브러리를 파아지 표시 수법에 의해 스크리닝할 수 있다. 파아지 표시는 재조합 박테리오파아지를 이용하는 분자 스크리닝법이다. 이 수법은 박테리오파아지를 후보 화합물의 라이브러리로부터 얻은 하나의 화합물을 암호화하는 유전자를 사용하여 형질전환시켜서 각 파아지 또는 파아지미드가 특정 후보 화합물을 발현하게하는 것을 포함한다. 형질전환된 박테리오파아지(바람직하게는 고형 지지체에 고정됨)는 적합한 후보 화합물을 발현하며 그의 파아지의 코트(coat)에 작용한다. 본 발명의 폴리펩티드 또는 펩티드에 결합할 수 있는 특정 후보 화합물은 친화성 상호작용을 기본으로한 선택법에 의해 다량으로 만든다. 성공적인 후보 물질을 특징화한다. 파아지는 표준 친화성 리간드 스크리닝 기술에 비하여 이점을 갖는다. 이러한 파아지 표면은 3차원 구조의 천연산출 형태와 아주 유사한 후보 물질을 나타낸다. 이러한 것은 스크리닝 목적에 보다 특이적이고 보다 친화성이 높은 결합력이 가능하게 한다.
화합물의 라이브러리를 스크리닝하는 다른 방법은 화합물의 라이브러리를 발현하는 재조합 DNA 분자로 안정하게 형질전환된 진핵생물 또는 원핵생물 숙주세포를 이용한다. 생존 또는 고정된 형태의 이러한 세포는 표준 결합-파트너 에세이에 사용될 수 있다. 세포성 반응을 검출하기 위한 민감한 방법을 기재하고 있는 Parce 등 (1989) Science 246: 243-247; 및 Owicki 등 (1990) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 87; 4007-4011 참조. 경쟁적 에세이법이 특히 유용한데, 화합물의 라이브러리를 발현하는 세포는 본 발명의 BACH 폴리펩티드에 결합하는 것으로 공지된 라벨링된 항체, 예컨대125I-항체와 접촉되거나 또는 배양되며, 결합 조성물에 대한 결합 친화성을 갖는 후보 화합물과 같은 시험 샘플을 측정한다. 폴리펩티드에 대한 결합되고 라벨링된 결합 파트너를 분리하여 결합정도를 평가한다. 결합된 샘플의 양은폴리펩티드에 대한 라벨링된 항체 결합량과 반비례한다.
수많은 수법중의 하나를 이용하여 자유 결합 파트너로부터 결합물을 분리하여 결합도를 평가한다. 이 분리 단계는 전형적으로 필터에 접착된 다음 세척, 플라스틱에 접착된 후 세척 또는 세포 막의 원심분리와 같은 과정을 포함할 수 있다.
다른 방법은 예컨대 형질전환된 진핵생물 또는 원핵생물 숙주세포로부터 추출된, 용해되거나, 정제되지 않거나 또는 용해되고 정제된 폴리펩티드 또는 펩티드를 사용할 수 있다. 이렇게하여 특이성이 증가하고, 자동화가능하며 약물 시험 처리량이 높은 이점을 갖는 "분자"결합 에세이법이 가능하다.
후보 화합물을 스크리닝하기 위한 다른 방법은 본 발명의 폴리펩티드와 같은 것에 대한 적합한 결합력을 갖는 신규 화합물에 대한 고 처리량 스크리닝법을 제공하는 방법을 포함하며, 1984년 9월 13일에 공개된 국제특허출원 WO84/03564호(Commonwealth Serum Labs)에 자세하게 기재되어 있다. 먼저, 다수의 상이한 소형 펩티드 시험 화합물을 고체 기질, 예컨대 플라스틱 핀 또는 기타 적합한 표면상에서 합성한다; Fodor 등 (1991) 참조. 이어 모든 핀을, 용해된 본 발명의 폴리펩티드와 반응시키고 세척한다. 다음 단계는 결합된 폴리펩티드를 검출하는 것을 포함한다. 폴리펩티드와 특이적으로 결합하는 화합물을 확인한다.
리간드 결합 에세이법은 약리학을 확인하는 직접적인 방법을 제공하며 높은 처리량 포맷에도 적합하다. 폴리펩티드에 대한 정제된 리간드는 결합연구를 위해 높은 특이적 활성으로 방사성표지된다(50-2000 Ci/밀리몰). 방사성표지 방법이 결합 파트너에 대한 리간드의 활성을 감소시키지 않는다는 것을 확인하였다. 완충액,이온, pH 및 뉴클레오티드와 같은 기타 조절자에 대한 에세이 조건을 최적화하여 모든 막 및 전체 세포 공급원에 대한 잡음비에 대한 작업가능한 시그널을 확립한다. 이들 에세이에서, 특정 결합은 전체 관련 방사성 활성에서 과량의 라벨링되지 않은 경쟁 리간드의 존재에서 측정된 방사성활성을 뺀 값으로 정의한다. 가능하면, 하나 이상의 경쟁 리간드를 이용하여 비특이적 잔기 결합을 확인한다.
상기 에세이는 후보 화합물의 결합을 단순히 시험하며, 폴리펩티드를 갖고 있는 세포에 대한 접착은 후보 화합물과 직접적으로 또는 간접적으로 관련된 라벨을 사용하거나 또는 라벨링된 경쟁자와 경쟁에 관여하는 에세이에 의해 검출한다. 또한, 이들 에세이법은 후보 화합물이, 그 표면에서 폴리펩티드를 갖고 있는 세포에 적합한 검출 시스템을 이용하여 폴리펩티드에 대한 결합에 의해 생성된 시그널을 유발하는지 여부를 시험할 수 있다. 활성화의 억제제는 일반적으로 공지 작용물질의 존재하에서 분석되고 또 후보 화합물의 존재에 의해 길항물질에 의한 활성화 효과를 관찰한다.
또한 상기 에세이법은 후보 화합물을 접착 단백질 프로테아제 또는 프로테아제 억제제 폴리펩티드를 함유하는 용액과 혼합하여 혼합물을 형성하는 단계, 혼합물중의 관련 단백질의 활성을 측정하는 단계 및 화합물의 활성을 표준과 비교하는 단계를 포함할 수 있다.
접착 단백질, 프로테아제 및 프로테아제 억제제를 암호화하는 CDNA, 단백질 및 단백질에 대한 항체는 세포에서 mRNA 및 단백질의 제조에 대한 부가 화합물의 효과를 측정하기 위한 배열 에세이에 이용될 수 있다. 예컨대, 당해 분야에 공지된표준방법에 의해 모노클로날 및 폴리클로날 항체를 사용하여 접착 단백질, 프로테아제 및 프로테아제 억제제의 분비량 또는 세포에서의 양을 측정하기 위해 ELISA법을 구성할 수 있으며, 이것은 적합하게 조작된 세포 또는 조직으로부터 접착 단백질, 프로테아제 및 프로테아제 억제제의 생산을 억제하거나 향상시킬 수 있는 물질(소위 길항물질 또는 작용물질)을 찾기 위해 사용될 수 있다. 스크리닝 에세이를 실시하기 위한 표준 방법은 당해 분야에 잘 공지되어 있다.
접착 단백질, 프로테아제 및 프로테아제 억제제의 길항물질의 예는 항체, 또는 어떤 경우, 뉴클레오티드 및 그의 유사체, 예컨대 퓨린 및 퓨린 유사체, 올리고뉴클레오티드 또는 접착 단백질, 프로테아제 및 프로테아제 억제제의 리간드와 밀접하게 연관된 단백질, 예컨대 리간드의 단편, 또는 폴리펩티드에 결합되지만 반응을 유발하지 않아 폴리펩티드의 활성이 방해되는 소형 분자를 포함한다.
따라서 본 발명은 접착 단백질, 프로테아제 및 프로테아제 억제제 폴리펩티드 및/또는 본 발명의 펩티드에 특이적으로 결합될 수 있는 화합물을 제공한다.
용어 "화합물"은 화학적 화합물(천연산출 또는 합성된), 즉 생물학적 마크로분자(예컨대 핵산, 단백질, 비-펩티드, 또는 유기 분자), 세균, 식물, 진균 또는 동물(특히 포유류) 세포 또는 조직과 같은 생물학적 물질로부터 만들어진 추출물, 또는 무기 요소 또는 분자를 지칭한다. 바람직하게는 상기 화합물은 항체이다.
실시할 스크리닝에 필요한 물질을 스크리닝 키트에 포장할 수 있다. 이러한 스크리닝 키트는 접착 단백질, 프로테아제 및 프로테아제 억제제 또는 접착 단백질, 프로테아제 및 프로테아제 억제제 폴리펩티드의 생산을 감소 또는 향상시키는화합물에 대한 작용물질, 길항물질, 리간드, 리셉터, 기질, 효소 등을 확인하는데 유용하다. 이러한 스크리닝 키트는 (a) 접착 단백질, 프로테아제 및 프로테아제 억제제 폴리펩티드; (b) 이러한 폴리펩티드를 발현하는 재조합 세포; (c) 이러한 폴리펩티드를 발현하는 세포 막; 또는 (d) 이러한 폴리펩티드에 대한 항체를 포함한다. 스크리닝 키트는 경우에 따라 지시사항을 포함할 수 있다.
프로테아제의 기질은 프로테아제 활성을 조절할 수 있는 물질을 분석하기 위해 사용될 수 있다. 예컨대, SCCE의 활성을 조절할 수 있는 분자를 확인하기 위한 에세이는 기질 S-2586 (MeO-Suc-Arg-Pro-Tyr-pNA)을 이용한다. S-2586은 분해되면 405 nm에서 흡수된다. 이 에세이에서, SCCE 및 S-2586은 후보 분자와 함께 배양된 다음 405 nm에서 흡수를 검출하여 기질의 분해를 검출한다. SCCE 및 기타 프로테아제의 억제제로서 사용될 수 있는 적합한 후보 분자는 405 nm에서 흡수가 감소되는 것을 포함한다.
발현 벡터
본 발명은 접착 단백질, 프로테아제 및 프로테아제 억제제 유전자의 핵산 서열 및 그의 부분 뿐만 아니라 그룹 1 및/또는 그룹 2 질병과 관련된 단백질 형태의 발현을 초래하는 돌연변이 서열에 기능적으로 결합된 대조 발현서열을 포함하는 벡터를 제공한다. 본 발명은 또한 이들 벡터로 형질전환된 적합한 진핵생물 및 원핵생물 세포로부터 선택된 숙주세포를 제공한다.
본 명세서에 기재된 방법 및 조성물을 사용하고, 접착 단백질, 프로테아제 및 프로테아제 억제제 전사물부터 유도되거나 DNA의 점 돌연변이, 결실, 삽입 또는재배열을 갖는 돌연변이된 서열 또는 정상형태의 전체 전사물을 함유하는 재조합 DNA 서열을 갖는 적합한 벡터를 사용하여 대장균(E.coli)을 비롯한 숙주세포를 형질전환시킬 수 있다. 이러한 형질전환된 세포는 관련 유전자의 작용 및 조절을 가능하게한다. 재조합적으로 형질전환된 숙주세포를 사용하면 접착 단백질, 프로테아제 및 프로테아제 억제제의 조절 메카니즘 연구가 가능하며, 특히 접착 단백질, 프로테아제 및 프로테아제 억제제 유전자 영역에서 돌연변이에 의해 방해된 유전자 기능의 연구도 가능하게된다.
벡터는 공지되어 있거나 또는 당업자에 의해 작성될 수 있으며 서열의 필요로하는 전사가 가능하도록 필요한 모든 발현 요소를 함유해야한다. 다른 특징은 상이한 형태의 핵산의 회수 메카니즘과 같이 벡터내에 함유될 수 있다. 파아지미드는 유용한 벡터의 특정 예인데, 그것은 플라스미드 또는 박테리오파아지 벡터를 사용하기 때문이다. 다른 벡터의 예는 박테리오파아지, 배큘로바이러스 및 레트로바이러스와 같은 바이러스, DNA 바이러스, 코스미드, 플라스미드 및 기타 재조합 벡터를 포함한다. 벡터는 또한 원핵생물 또는 진핵생물 숙주계에 사용하기 위한 요소를 또한 함유한다. 당분야의 통상의 지식을 가진 사람은 어떤 숙주계가 특정 벡터와 사용될 수 있는지 숙지하고 있을 것이다.
벡터는 당해분야의 다양한 공지 방법중의 하나에 의해 세포 또는 조직으로 도입될 수 있다. 이러한 방법은 샘브룩 등에 의한 Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Laboratory, New York (1992), Ausubel 등, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore,Md.(1989), Chang 등, Somatic Gene Therapy, CRC Press, Ann Arbor, Mich. (1995), Vega 등, Gene Targeting, CRC Press, Ann Arbor, Mich. (1995) 및 Gilboa 등 (1986)에 기재된 일반적으로 기재되어 있고, 예컨대 안정한 또는 일시적인 형질감염, 리포펙션(lipofection), 엘렉트로포레이션 및 재조합 바이러스성 벡터와의 감염을 포함한다. 감염에 의한 핵산의 도입은 다른 방법에 비하여 몇 개의 이점을 제공한다. 이들의 감염성으로 인하여 효율이 높다. 미국특허 5,487,992호 및 미국특허 5,464,764호 참조. 또한, 바이러스는 아주 특이화되어 있고 전형적으로 특정 세포 형태에서 감염 및 증식한다. 따라서, 이들의 천연 특성은 생체내 또는 조직 또는 세포 혼합 배양액에서 특정 세포 타입에 대한 벡터를 타겟팅하기 위해 사용될 수 있다. 바이러스성 벡터는 특정 리셉터 또는 리간드에 의해 변형되어 리셉터 매개된 경우에서 타겟 특이성을 변화시킨다.
당해 분야에 공지된 재조합 방법은 센스, 안티센스 또는 타겟 핵산의 트리플렉스 억제를 달성하기 위해 사용될 수 있다. 예컨대, 안티센스 핵산을 함유하는 벡터는 단백질 또는 안티센스 메시지를 발현하여 타겟 핵산의 발현과 그 활성을 감소시킨다.
안티센스 핵산을 도입하여 발현하기 위한 DNA 바이러스성 벡터의 특정 예는 아데노바이러스 유도된 벡터인 Adenop53TK 이다. 이 벡터는 양성 또는 음성 선택을 위한 허피스(herpes) 바이러스 티미딘 키나제(TK) 유전자 및 안티센스 서열과 같은 소망하는 재조합 서열에 대한 발현 카세트를 발현한다. 이 벡터는 아데노바이러스 리셉터를 갖는 세포를 감염시키기 위해 사용될 수 있다. 이 벡터 뿐만 아니라 유사한 소망하는 작용을 나타내는 다른 벡터는 예컨대 세포, 조직 또는 인간 검체의 시험관내 또는 생체내 세포 배양액에서 세포의 혼합된 집단을 처리하기 위해 사용될 수 있다.
안전성을 확실히하고 또 치료 효율을 향상시키기 위하여 벡터에 다른 특징을 부가할 수 있다. 이러한 특징은 예컨대 재조합 바이러스로 감염된 세포에 대해 음성적으로 선택하기 위해 사용될 수 있는 마커(marker)를 포함한다. 이러한 음성 선택 마커의 예는 항-바이러스성 간시클로비어(gancyclovir)에 민감성을 부여하는 상술한 TK 유전자이다. 음성 선택은 항생물질의 부가를 통하여 자살을 유발하기 때문에 감염이 제어되는 것을 의미한다. 이러한 보호는 예컨대 돌연변이가 생기면 바이러스성 벡터 또는 서열의 변형된 형태를 생성하도록하고 세포성 형질전환이 일어나지 않도록 한다. 발현을 특정 세포 타입에만 한정시키는 특징도 또한 포함될 수 있다. 이러한 특징은 예컨대 소망하는 세포 타입에 특이적인 프로모터 및 조절 요소를 포함한다.
재조합 바이러스성 벡터는 이들이 측생(lateral) 감염 및 타겟팅 특이성과 같은 이점을 제공하기 때문에, 소망하는 핵산의 생체내 발현에 유용한 벡터이다. 측생감염은 레트로바이러스의 생활환에 고유한 것이고, 또 단일 감염된 세포가 분리는 되지만 이웃하는 세포를 감염시키지 않는 많은 후대 비리온을 생성하는 과정이다. 그 결과는 많은 영역이 신속하게 가염되게되고, 그 대부분은 원래의 바이러스성 입자에 의해 감염된 것이 아니다. 이것은 감염제가 딸 후대에게만 전해지는 수직형태의 감염과는 대조적이다. 바이러스성 벡터는 또한 측생적으로 분포되지 않게 제조될 수 있다. 이러한 특징은, 소망하는 목적이 특정 유전자를 타겟으로하는 세포의 일정 위치에 도입하려는 경우 유용할 수 있다.
상술한 바와 같이, 바이러스는 숙주 방어 메카니즘을 벗어나도록 발전된 아주 특수한 감염제이다. 전형적으로, 바이러스는 특정 세포 타입에서 감염되고 증식한다. 바이러스성 벡터의 타겟팅 특이성은 소정 세포 타입을 특이적으로 타겟으로하는 천연 특이성을 이용함으로써 재조합 유전자를 감염 세포로 보낸다. 본 명세서에 기재된 방법에 사용되는 벡터는 타겟팅될 소망하는 세포에 따라 다르다. 예컨대, 상피세포 특이적 벡터는 피부 질병의 치료에 사용될 수 있다. 마찬가지로, 폐의 질병 또는 병원성 상태를 치료하려는 경우, 폐 세포 및 그 전구체, 바람직하게는 폐 세포의 특정 유형에 특이적인 바이러스성 벡터를 사용하여야한다.
레트로바이러스 벡터는 감염성 입자로서 또는 감염의 단일한 초기 단계를 실시하도록 작성될 수 있다. 전자의 경우, 바이러스의 게놈은 새로운 바이러스 단백질 및 RNA를 합성하기 위해 필요한 모든 유전자, 조절 서열 및 팩케이징 시그널을 유지하도록 변형된다. 이들 분자가 합성되면, 숙주세포는 RNA를 포장해서 다른 감염 단계를 거칠 수 있는 새로운 바이러스성 입자로 보낸다. 이 벡터의 게놈은 소망하는 재조합 유전자를 암호화하고 발현하도록 조작될 수 있다. 비-감염성 바이러스성 벡터의 경우, 벡터 게놈은 보통 성숙되어 RNA가 바이러스 입자로 캡슐화하는데 필요한 바이러스성 팩케이징 시그널을 파괴한다. 이러한 시그널이 없으면, 형성된 어떤 입자도 게놈을 함유하지 않으므로 후속 감염을 실시할 수 없다. 특정 유형의 벡터는 목적하는 용도에 따라 다를 것이다. 실제 벡터는 또한 공지되어 있고 당해분야에서 용이하게 구입할 수 있거나 공지된 방법에 의해 당업자가 작성할 수 있다.
바이러스성 벡터를 사용하는 경우, 그 과정은 타겟 특이성의 이점을 이용할 것이므로 질병 부위에 국소적으로 투여할 필요는 없다. 그러나, 국소투여는 보다 더 빠르고 보다 효과적인 치료일 수 있으므로 정맥주사 또는 피하주사에 의해 검체에 투여할 수 있다. 바이러스성 벡터를 척추액에 주사하는 것도 신경퇴행 질병의 경우의 투여모드의 하나이다. 주사에 이어, 바이러스성 벡터는 이들이 감염에 대한 적합한 타겟 특이성을 갖는 숙주 세포를 인식할 때 까지 순환할 것이다.
리포좀과 같은 형질감염 매개체도 상술한 비-바이러스성 벡터를 접종 영역내의 수용 세포로 도입하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 형질감염 매개체는 당업자에게 공지되어있다.
트랜스제닉 생물
본 발명은 그룹 1 및 그룹 2 질병의 표현형을 나타낼 수 있는 트랜스제닉 및 녹아웃(knockout) 생물의 작성을 제공한다.
본 발명은 트랜스제닉 코르네오데스모신 유전자 및 돌연변이 코르네오데스모신 유전자 동물 및 세포성(세포주) 모델 뿐만 아니라 녹아웃 모델의 제조방법을 제공한다. 트랜스제닉 모델은 코르네오데스모신 서열 뿐만 아니라 그룹 1 및 그룹 2 질병과 관련된 유전자의 돌연변이도 포함하는 모델이다. 본 발명은 또한 트랜스제닉 및/또는 돌연변이 접착 단백질, 프로테아제 또는 프로테아제 억제제 유전자를 포함하는 동물 및 세포성 (세포주) 모델 뿐만 아니라 녹아웃 모델을 제공한다. 트랜스제닉 모델은 접착 단백질, 프로테아제 또는 프로테아제 억제제의 서열 뿐만 아니라 그룹 1 및 그룹 2 질병과 관련된 유전자의 돌연변이를 갖는 모델이다.
이러한 모델은 당해분야의 표준 방법에 의해 작성하며 다음 문헌에 기재되어 있다: 미국특허 5,487,992호, 5,464,764호, 5,387,742호, 5,360,735호, 5,347,075호, 5,298,422호, 5,288,846호, 5,221,778호, 5,175,385호, 5,175,384호, 5,175,383호, 4,736,866호 및 Burke and Olson, (1991), Cpecchi, (1989), Davies 등, (1992), Dickinson 등, (1993), Huxyley 등, (1991), Jakobovits 등, (1993), Lamb 등, (1993), Rothstein, (1991), Schedl 등, (1993), Strauss 등, (1993). 또한 특허출원 WO 94/23049호, WO93/14200호, WO 94/06908호, WO94/28123호도 정보를 제공한다. 참고. Hogan 등 "Manipulating the Mouse Embryo" Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd Edition (1994).
유전적 진단
본 발명은 그룹 1 또는 그룹 2 질병에 관여되거나, 코르네오데스모신과 같은 접착 단백질의 단백질분해의 비정상적인 조절과 관련된 접착 단백질, 프로테아제 또는 프로테아제 억제제 유전자의 결함을 갖는 보균자를 진단하고 검출하는 방법을 개시한다.
본 발명은 또한 유전자 및 유전자 산물의 비정상적 복제를 검출하는 방법을 제공한다. 결함 유전자에 의해 또는 그에 의해 암호화되는 단백질의 제거 또는 결함을 갖는 보균자의 확인은 유전자 보균자를 보다 초기에, 보다 일정하게 진단할 수 있게된다. 따라서, 질병의 보균자는 그룹 1 또는 그룹 2 질병으로 될 가능성이있기 때문에, 이들에 대해 더 우수한 감독과 처리 순서를 개시할 수 있다.
간단히 말해, 상기 방법은 시험체로부터 샘플을 얻는 단계, 적합한 시험물질을 샘플로부터 분리하는 단계 및 표적 핵산 서열 또는 유전자 산물을 분석하는 단계를 포함한다. 상기 샘플은 유전자 물질 및/또는 단백질이 당해분야의 표준 방법에 의해 분리되는 조직 또는 체액일 수 있다. 예컨대 DNA는 혈액으로부터 분리될 수 있다.
보다 자세하게는, 보균자 검출 방법은 세포 또는 체액 샘플을 시험체로부터 분리하는 것을 포함한다. 세포성 샘플을 얻기 위한 통상의 방법은 구강세정액 또는 모근을 수집하는 것을 포함한다. 세포 샘플은 출생전 진단의 경우 양막 또는 태반 세포 또는 조직일 수 있다. 조 DNA는 당해 분야의 통상의 수법에 의해 세포로부터(또는 다르게는 분리된 단백질) 얻을 수 있다. 분리된 타겟 DNA는 당해분야에 공지된 수법에 의해 유전자 서열로부터 유도된 적합한 프라이머를 사용하여 PCR 분석(다르게는, 단백질의 웨스턴 블럿 분석)한다. 이 PCR 산물은 검체의 유전자형 질병 상태를 평가하기 위하여 적합한 서열 변형이 존재하는지 시험될 수 있다.
시편은 면역조직화학 및 면역세포화학 염색법(일반적으로, Stites and Terr, Basic and Clinical Immunology, Appleton and Lange, 1994), ELISA, RIA, 이뮤노블럿, 웨스턴 블럿팅, 면역침강법, 작용 에세이 및 단백질 절단 시험에 의해 폴리펩티드/단백질에 대해 에세이할 수 있다. 바람직한 구체예로서, 웨스턴 블럿팅, 작용 에세이 및 단백질 절단시험(Hogervorst 등, 1995)이 이용된다. 타겟 핵산 서열에 상보적인 mRNA는 그 자리에서 하이브리드형성법, 노던 블럿팅법 및 역전사-중합효소 연쇄반응법에 의해 에세이될 수 있다. 핵산 서열은 그 자리에서 하이브리드 형성법, 서던 블럿법, 단일가닥 구조 다형성, 특정 프라이머를 사용한 PCR 증폭 및 DNA-칩 분석에 의해 확인될 수 있다(Kawasaki, 1990; Sambrook, 1992; Lichter 등, 1990; Orita 등, 1980; Fodor 등, 1993; Pease 등, 1994).
ELISA 에세이법은 당업자에게 잘 공지되어 있다. 폴리클로날 및 모노클로날 항체 모두가 이 에세이법에 사용될 수 있다. 경우에 따라 당업자에게 공지된 방사성면역분석법(RIA)과 같은 기타 면역분석법이 사용될 수 있다. 유용한 면역분석법은 특허문헌과 과학문헌에 광범위하게 기재되어 있다. 참조, 예컨대 미국특허 3,791,932호; 3,839,153호; 3,850,752호; 3,850,578호; 3,853,987호; 3,867,517호; 3,879,262호; 3,901,654호; 3,935,074호; 3,984,533호; 3,996,345호; 4,034,074호; 4,098,876호; 4,879,291호; 5,011,771호 및 5,281,521호 및 Sambrook 등, 1992.
본 명세서에 기재된 기존의 돌연변이 데이터는 그룹 1 및 그룹 2 질병을 이형 대립유전자에 의해 특징짓는 것을 나타낸다. 따라서, 성공적인 돌연변이 스크리닝은, 제한된 서브세트에 집중되기 보다는, 코르네오데스모신 또는 기타 접착 단백질, 프로테아제 또는 프로테아제 억제제 유전자에서 모든 가능한 뉴클레오티드 변형을 검출할 수 있는 것이 중요하다. PCR 증폭된 DNA 또는 RNA의 직접적인 스크리닝 또는 DNA 칩 하이브리드화(Fodor 등, 1993; Pease 등, 1994)를 포함한 방법은 당업자에게 공지된 다른 적합한 방법과 함께 이용될 수 있다.
상기 진단방법을 이용하기 위하여, 타겟 폴리뉴클레오티드 서열(또는 다르게는 단백질)의 존재 또는 부재를 확인하기 위한 메카니즘을 포함하는 것이 유리하다. 진단 및 실험 과정을 기본한 많은 하이브리드 형성의 경우, 특정 폴리뉴클레오티드 서열의 존재 또는 부재를 검출하거나 가시화하기 위해 라벨이나 태그(tag)를 사용한다. 전형적으로, 올리고머 프로브는32P 또는32S (샘브룩, 1992)과 같은 방사성동위원소를 사용하여 라벨링하며, 이러한 방사성동위원소는 방사선사진법과 같은 당해분야에 공지된 방법에 의해 검출될 수 있다. 올리고머 프로브는 또한 방사성사진법(샘브룩, 1992)에 의해 검출될 수 있는 케미일루미네센트(chemiluminescent) 물질과 같은 비-방사성 방법으로 라벨링될 수 있다. 또한 라벨링 및 검출을 기본으로한 효소-기질도 사용될 수 있다. 라벨링은 말단 라벨링, 화학적 라벨링과 같은 당해분야에 공지된 메카니즘, 또는 라른 라벨링된 올리고뉴클레오티드와 하이브리드 형성하는 것에 의해 실시될 수 있다(샘브룩, 1992). 이들 라벨링 및 검출방법은 단지 예시한 것이고 당해 분야에 공지된 모든 방법의 완전한 리스트를 제공하는 것은 아니다.
검출 목적을 위한 라벨의 도입은 라벨을 하이브리드 하기 전에 프로브에 부착시키는 것에 의해 달성될 수 있다.
다른 방법은 프로브를 가하기 전에 타겟 DNA를 고체 지지체에 결합시키는 단계를 포함한다. 이 고체 지지체는 니트로셀룰로오스 또는 나일론과 같은 막 재료 또는 비이드와 같이, 타겟 DNA를 결합시킬 수 있는 물질일 수 있다. 타겟 DNA를 고체 지지체에 결합시킨 후 프로브 올리고머를 가한다.
그룹 1 및 그룹 2 보균자 또는 감염된 개인을 검출하기 위하여 기능적 에세이를 이용할 수 있다.
본 발명은 또한 코르네오데스모신 유전자의 결함을 진단 및 검출하기 위한 키트를 제공한다. 이 키트는 그룹 1 또는 그룹 2 질병을 유발하는 결함 코르네오데스모신 유전자의 유전자 서열에 상보적인 분자 프로브, 및 상기 분자 프로브와 결함 유전자의 하이브리드 형성을 검출함으로써 결함 유전자의 존재를 지시하는 적합한 라벨을 포함한다. 이 분자 프로브는 돌연변이 서열에 상보적인 DNA 서열을 갖는다. 다르게는, 상기 키트는 돌연변이 단백질을 검출하기 위한 시약 및 항체를 함유할 수 있다.
결함 접착 단백질, 프로테아제 또는 프로테아제 억제제 유전자를 검출 및 진단하기 위한 키트에 있어서, 그룹 1 또는 그룹 2 질병을 유발하는 결함 접착 단백질, 프로테아제 또는 프로테아제 억제제의 유전자 서열에 상보적인 분자 프로브, 및 상기 분자 프로브와 결함 유전자의 하이브리드 형성을 검출함으로써 결함 유전자의 존재를 지시하는 적합한 라벨을 포함한다. 상기 분자 프로브는 돌연변이 서열에 상보적인 DNA 서열을 갖는다. 다르게는, 상기 키트는 돌연변이 단백질을 검출하기 위한 시약 및 항체를 함유할 수 있다.
다형성 또는 돌연변이에 대한 DNA를 분석하기 위해 몇 개의 상이한 방법이 흔히 사용된다. 가장 자세한 방법은 DNA 서열결정화하여 실제 염기를 결정하는 것이다(Maxam and Gilbert, 1977; Sanger 등, 1977). 이러한 방법은 가장 정교하지만, 비용이 비싸고 시간소모적인 방법이다.
다형성에 대한 DNA 분석에는 제한효소 맵핑(mapping) 분석법이 또한 사용될수 있다. 제한효소에 대한 인식부위를 변화시킬 부위에서 공지된 다형성을 기대하는 경우, DNA를 상기 제한효소로 분해시켜서 그 단편을 겔상에서 또는 서던 블럿법으로 분석하여 다형성의 존재 또는 부재를 검출한다. 이 유형의 분석은 총 삽입 또는 결함의 존재 또는 부재를 결정하는데 유용하다. 대립유전자 특이적 올리고뉴클레오티드를 사용한 하이브리드화는 공지 다형성의 존재를 결정하기 위한 또 다른 방법이다.
따라서 개인중의 특정 DNA 서열, 예컨대 코르네오데스모신을 암호화하는 유전자는 예컨대 DNA 서열의 결실, 복제된 서열의 삽입, 서열의 전환, 또는 단일 뉴클레오티드를 다른 뉴클레오티드로 전환하는 것과 같은 많은 상이한 변화를 거친다. 특정 DNA 서열에서의 변화는 4-6 뉴클레오티드의 특정 DNA 서열을 인식하는 제한효소를 사용하여 추적될 수 있다. 제한효소는 그의 특정 인식 서열에서 DNA를 절단(분해)하여 백만개 정도의 조각을 생성한다. 제한효소에 의해 인식되는 서열을 인식될 수 없는 서열로 변화시키는 상이함이 존재하면, 그 영역을 절단하여 생성된 DNA 조각은 상이한 크기를 가질 것이다. 그러므로 주어진 영역으로부터 얻은 다양한 단편 크기는 그 영역에 있는 정확한 DNA 서열에 따라 다를 것이다. 생성된 단편에서의 변이를 "제한단편 길이 다형성"(RFLP)이라 칭한다. 상이한 변이체 DNA 서열을 나타내는 다양한 크기의 단편은 크기별로 분해된 DNA를 아가로오스 겔상에서 분리시키고 이들에 방사성라벨링된 DNA 프로브에 어닐링시키는 것에 의해 개별 단편을 가시화할 수 있다. 각 개인은 2개의 상이한 형태의 특정 서열을 가질 것이다. 2개의 상동체가 동일한 다형성 형태를 갖고 있다면, 1개의 밴드가 보일 것이다. 집단내의 특정 DNA 마커에 2개 형태 이상의 다형성이 존재할 수 있지만, 한 가족에서 4가지 형태가 가능하다; 각각 부모로부터 2개. 각 어린이는 각 부모로부터 1개 형태의 다형성을 물려받는다. 따라서, 각 염색체 영역의 기원은 추적될 수 있다(모계인지 부계인지).
또한 RT-PCR을 실시한 다음 제한 엔도뉴클레아제 핑거프린팅(endonuclease fingerprinting)(REF)를 실시할 수 있다. REF는 단일가닥 형태 다형성(SSCP)법의 변형이며, 2 kb 길이 이하의 DNA 단편에서 서열 변화를 효과적으로 검출할 수 있다(Liu and Sommer, 1995).
공지 유전자내의 다형성의 존재를 결정하기 위한 질량 분광광도계의 사용은 미국특허 5,869,242호에 기재되어 있다.
단일 가닥 형태 다형성(SSCP) 분석은 다형성을 검출하기 위한 신속하고 효과적인 방법이다(Dean 등, Cell 61: 863, 1990; Glavac and Dean, Hum. Mutation 2: 404, 1993; Poduslo 등, Am. J. Hum. Genet. 49: 106, 1992). SSCP에서, 겔상의 비정상적인 가닥 이동성은 유전자에서의 돌연변이와 관련이 있다.
다형성의 유전자 분석은 예컨대 미국특허 5,552,28호, 5,654,13, 5,670,33호, 5,807,67호, 5,858,66호, 5,691,15호, 5,922,57호, 5,972,60호, 6,136,53호 및 5,955,26호에 자세하게 기재되어 있다.
상기 참고문헌에 기재된 방법은 본 명세서에 기재된 진단방법에 사용될 수 있다.
약제학적 조성물
본 발명은 그룹 1 또는 그룹 2 질병을 치료하기 위한 하나 이상의 물질을 포함하는 약제학적 조성물을 기재한다.
그룹 1 질병을 치료하기 위한 물질은 프로테아제 억제제 및 그의 단편을 포함하며, 이들은 실시예에서 항-프로테아제 활성을 포함하는 것으로 확인된 것, 예컨대 항-류코프로테아제(SLPI) 및 엘라핀 프로테아제 억제제 3(PI3 또는 SKALP)와 같은 일차 프로테아제 억제제 및/또는 예컨대 키모트립신, 콩 트립신 억제제, 카텝신 G 등과 같은 이차 프로테아제 억제제 뿐만 아니라 당해 분야에 공지된 기타 프로테아제 억제제를 포함한다. 그룹 1 질병을 치료하기 위해 유용한 다른 물질은 프로테아제 억제제의 작용물질, 예컨대 상술한 프로테아제 억제제의 작용물질 뿐만 아니라 프로테아제의 길항물질, 예컨대 각질층 키모트립신 효소(SCCE) 및/또는 각질층 트립신 효소(SCTE)를 포함한다.
그룹 2 질병을 치료하기 위한 물질은 각질층 키모트립신 효소(SCCE) 및 각질층 트립신 효소(SCTE)와 같은 프로테아제 뿐만 아니라 상술한 프로테아제의 작용물질을 포함한 프로테아제 작용물질을 포함한다. 그룹 2 질병을 치료하기 위한 물질은 프로테아제 억제제의 길항물질, 예컨대 항-류코프로테아제(SLPI) 및 엘라핀 프로테아제 억제제 3(PI3 또는 SKALP)의 길항물질 등을 포함한다.
상기 물질을 포함하는 조성물 또는 물질 단독이 투여될 수 있지만, 약제 제제로서 활성성분을 배합할 수 있다. 상기 조성물은 상기 물질, 구조적으로 관련된 화합물 또는 그의 산성 염을 포함할 수 있다. 약제학적 제제는 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 유효량의 물질을 포함한다. "유효량의" 물질은 그룹1 또는 그룹 2 질병의 적어도 하나의 증상을 경감시키기에 충분한 양을 말한다. 상기 유효량은 치료하거나 경감시키고자하는 특정 질병 또는 증상 뿐만아니라 환자의 연령과 체중, 그 질병진행상태, 환자의 건강상태, 증상의 심각도, 및 상기 물질이 단독으로 투여되는지 아니면 다른 치료제와 조합되어 투여되는지 등의 요인을 고려하여 결정할 수 있다.
적합한 약제학적으로 허용되는 담체는 당해분야에 공지되어 있고 또 약제학적 제제의 소망하는 형태 및 투여형태에 따라 다를 것이다. 예컨대, 이들은 충전제, 결합제, 습윤제, 분해제, 표면활성제, 윤활제 등과 같은 희석제 또는 부형제를 포함할 수 있다. 전형적으로, 담체는 고체, 액체 또는 증발가능한 담체이거나, 그의 조합일 수 있다. 각 담체는 제제의 다른 성분과 함께 사용될 수 있고 환자에게 해를 주지 않는 의미로 "허용가능"해야한다. 담체는 숙주에게 투여될 때 나쁜 반응(예컨대 면역반응)을 유발하지 않고 생물학적으로 수용될 수 있어야한다.
약제학적 조성물은 국소투여 및 경구투여되기에 적합한 조성물을 포함하며, 감염된 조직이 주로 피부 또는 표피(예컨대 건선 및 기타 표피 질병)일 때 국소제제가 바람직하다. 국소제제는 처리될 피부 표면과의 직접 접촉에 의해 조성물을 외부적으로 도포하는 약제학적 형태를 포함한다. 국소투여를 위한 통상적인 약제 형태는 소크(soak), 연고, 크림, 로션, 페이스트, 겔, 스틱, 스프레이, 에어로솔, 배쓰오일, 용액 등을 포함한다. 국소도포법은 다양한 부형제에 의해 전달되며, 부형제의 선택이 중요하고 일반적으로 처리될 질병이 급성인지 만성인지와 관련되어 있다. 예컨대, 급성 피부 증식 질병은 일반적으로 수성 건조 제제로 치료하지만, 만성 피부 증식 질병은 수화 제제로 치료한다. 소크는 급성 습식발진을 가장 쉬운 건조방법이다. 용액(수성 현탁액중의 분말) 및 용액(용매에 용해된 약물)은 머리 및 지간형무좀 영역에 이상적이다. 연고 또는 물-속-오일 유제는 건식 비늘모양 발진에 적합한 가장 효과적인 보습제이지만, 기름기가 많고 또 특정 병반 위치에서는 경우에 따라 다르다. 적합하게는, 이들은 특히 약물 조성물의 병반침투를 증가시키기는 것이 바람직할 때 밴드를 이용하여 도포될 수 있다. 크림이나 오일-속-물 유제 및 겔은 흡수가능하고 환자에게 가장 화장품에 적합하다. (Guzzo 등, Goodman & Gilman's Pharmacological Basis of Therapeutics, 9th Ed., p.1593-15950 (1996)). 크림 제제는 일반적으로 석유, 라놀린, 폴리에틸렌 글리콜, 무기 오일, 글리세린, 이소프로필 팔미테이트, 글리세릴 스테아레이트, 세테아릴 알코올, 토코페릴 아세테이트, 이소프로필 미시스테이트, 라놀린 알코올, 시메티콘, 카르보멘, 메틸클로로이소티아졸리논, 메틸이소티아졸리논, 시클로메티콘 및 히드록시프로필 메틸셀룰로오스와 같은 성분 뿐만 아니라 그의 혼합물을 포함한다.
국소투여용의 다른 제제는 샴푸, 비누, 쉐이크 로션등을 포함하며, 두피와 같은 하부 피부상에 잔류물을 남기도록 제제화된다(Arndt 등, Dermatology In General Medicine 2: 2838 (1993)).
일반적으로, 국소제제의 약물 조성물의 농도는 조성물 중량의 약 0.5 내지 50중량%, 바람직하게는 약 1 내지 30%, 보다 바람직하게는 약 2 내지 20중량%, 가장 바람직하게는 약 5 내지 10중량%이다. 사용된 농도는 초기에는 상한 범위로 사용되고, 치료가 진행됨에 따라서 농도를 감소시키거나 제제의 투여를 덜 빈번하게할 수 있다. 국소투여는 하루에 2회 도포될 수 있다. 그러나, 훨씬 많은 양의 투여량으로 하루에 1번 투여하거나 더 적은 투여량으로 더 자주 투여하는 것도 효과적일 수 있다. 각질층은 저장소로서 작용할 수 있고 장시간에 걸쳐서 성장 피부층까지로 약물의 점진적인 침투를 가능하게한다.
국소투여에서, 충분한 양의 약물이 환자의 피부에 침투해야 소망하는 약물학적 효과를 얻을 수 있다. 일반적으로 약물이 피부로 흡수되는 것은 약물 성질, 부형제의 특징 등의 작용에 의한 것이라 알려져 있다. 세 개의 주요 변수가 흡수율 또는 상이한 국소 약물의 유량 또는 상이한 부형제에서 동일한 약물의 유량에서의 차이를 결정한다; 부형제에서의 약물의 농도, 각질층과 부형제 사이의 약물의 분배 계수 및 각질층에서 약물의 확산계수. 치료를 효과적으로 하기 위해, 약물은 피부의 장벽 기능에 관여하는 각질층을 통과해야한다. 일반적으로, 시험관 피부 침투에서 효과를 발휘하는 국소제제는 생체내에서도 효과적이다. 오스트렌가 등(J.Pharm. Sci., 60: 1175-1179 (1971))은 생체내에서 국소적으로 투여된 스테로이드는 시험관내에서 인간 피부의 피부절로의 스테로이드 침투율에 비례한다.
피부학적으로 허용되며 약물과 상용성인 피부 침투 향상제를 제제에 혼입시켜 활성 화합물이 피부 표면으로부터 표피 각화세포로 침투되는 것을 향상시킬 수 있다. 활성 화합물의 피부로의 흡수를 증가시키는 피부 향상제는 유효 치료에 필요한 약물의 양을 감소시키고 또 제제의 지속 효과를 더 길게 제공한다. 피부 침투 향상제는 당분야에 공지되어 있다. 예컨대 디메틸 술폭시드(미국특허 3,711,602호); 올레산, 1,2-부탄디올 계면활성제(Cooper, J. Pharm. Sci., 73:1153-1156 (1984)); 에탄올 및 올레산 또는 올레일 알코올의 조합물(EP 267,617호), 2-에틸-1,3-헥산디올 (WO 87/03490); 데실 메틸 술폭시드 및 Azone.RTM (Hadgraft, Eur. J. Drug. Metab. Pharmacokinet, 21: 165-173 (1996)); 알코올, 술폭시드, 지방산, 에스테르, Azone.RTM, 피롤리돈, 우레아 및 폴리올(Kalbitz 등, Pharmazie, 51: 619-637 (1996)).
1,8-시네올, 메톤, 리모넨 및 네로리돌과 같은 테르펜(Yamane, J. Pharmacy & Pharmacology, 47: 978-989 (1995)); Azone.RTM 및 Transcutol (Harrison 등, Pharmaceutical Res. 13: 542-546 (1996)); 및 올레산, 폴리에틸렌 글리콜 및 프로필렌 글리콜 (Singh 등, Pharmazie, 51: 741-744 (1996))은 활성성분의 피부 침투를 향상시키는 것으로 공지되어 있다.
약물 또는 조성물의 침투정도는 당업자에게 공지된 기술에 의해 측정할 수 있다. 예컨대, 활성 화합물을 방사성라벨링한 다음 피부에 의해 흡수된 방사성라벨링된 화합물의 양을 측정함으로써 시험 화합물의 피부 침투를 결정하는 몇 개 방법중의 하나를 이용하여 흡수된 조성물의 양을 측정할 수 있다. 피부 침투 연구에 관련된 문헌은 Reifenrath, W. G 및 G H Hawkins를 포함한다. 경피(percutaneous) 침투를 측정하기 위한 동물 모델로서 위닝 요크셔 돼지(Weaning Yorkshire Pig). In: Swine in Biomedical Research (M. E. Tumbleson, Ed.) Plenum, New York, 1986, 및 Hawkins, G. S. Methodology for the Execution of In Vitro Skin Penetration Determinations. In: Methods for Skin Absorption, B W Kemppainen 및 W G Reifenrath, Cosmetics & Toiletries, 110: 3-9 (1995).
일부 투여의 경우, 장기 지속형 약물 또는 당업자에게 공지된 제제, 예컨대 중합체를 사용한 조성물을 투여하는 것이 바람직하다. 이 약물은 피부 패치(Junginer, H.E. in Acta Pharmaceutica Nordica 4: 117 (1992); Thacharodi 등, in Biomaterials 16: 145-148 (1995); Niedner R., in Hautarzt 39: 761-766 (1988)) 또는 당업자에게 공지된 방법에 따른 밴드에 혼입됨으로서 처리될 영역으로의 약물전달 효율을 증가시킨다.
경우에 따라, 국소제제는 추가의 부형제를 가질 수 있다; 메틸파라벤, 벤질 알코올, 소르브산 또는 4급 암모늄 화합물과 같은 보존제; EDTA와 같은 안정화제, 부틸화 히드록시톨루엔 또는 부틸화된 히드록스아니솔과 같은 산화방지제, 및 시트레이트 및 포스페이트와 같은 완충제.
약제 조성물은 정제, 캅셀 또는 용액 형태의 경구 제제로 투여될 수 있다. 유효량의 경구 제제는, 증식성 질병, 암 또는 광노화 등의 증상이 경감될 때 까지 매일 1 내지 3회 환자에게 투여한다. 이 약물의 유효량은 환자의 연령, 체중 및 상태에 따라서 다를 것이다. 일반적으로, 약물의 매일 경구투여량은 1200 mg 미만이고 또 100 mg 보다는 많다. 바람직한 매일 경구 투여량은 약 300 내지 600 mg 이다. 경구 제제는 보통 단위 투여 형태로 존재하며 적합한 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 제제화되어 소망하는 투여형태를 얻을 수 있다. 전형적인 단위 투여 형태는 정제, 환약, 분말, 용액, 현탁액, 유제, 과립, 캅셀, 좌약을 포함한다. 일반적으로, 이러한 제제는 액체 담체 또는 미세하게 나눠진 고체 담체 또는 이들 모두와 상기 약물 조성물을 균일하게 및 긴밀하게 접촉시키고, 필요한 경우, 생성물을 성형시키는 것에 의해 제조한다. 활성성분은 액체, 분말, 정제 또는 캅셀 형태의 다양한 기본물질에 혼입되어 피부 증식 질병을 치료하기 위한 유효량의 활성성분을 생성한다.
본 명세서에 사용하기에 적합한 다른 치료제는 목적에 효과적인 상용성 약물, 또는 상기 약물 제제에 상보적인 약물이다. 예컨대, 제제를 사용한 치료는 코르티코스테로이드, 칼시포트린, 코울타르 제제를 사용한 국소치료, 메토트렉세이트, 레티노이드, 시클로스포린 A 및 포토케모쎄라피와 같은 전신적 처리를 비롯한 다른 치료법과 조합될 수 있다. 조합 치료는 급성 또는 심각한 피부 증식 질병의 치료에 특히 중요하다. 조합 치료에 이용된 제제는 동시에 투여되거나, 또는 후속적으로 다른 치료를 실시하여 조합 효과를 얻을 수 있다.
발명의 다른 요지
본 발명의 다른 요지는 이하 단락 번호로 나타낸다; 본 발명은 이들 특징을 포함하는 것으로 이해되어야한다.
단락 1. 세포간 접착에 관여하는 접착 단백질의 단백질분해를 조절하는 것을 포함하는, 상피세포에서 비정상적인 세포-세포 접착과 관련된 질병에 걸린 환자의 치료방법.
단락 2. 단락 1에 있어서, 접착 단백질이 데스모솜 단백질인 방법.
단락 3. 단락 1 또는 2에 있어서, 접착 단백질이 코르네오데스모신인 방법.
단락 4. 단락 1 내지 3중 어느 하나에 있어서, 상피세포가 각질세포인 방법.
단락 5. 단락 1 내지 4중 어느 하나에 있어서, 접착 단백질의 단백질분해의조절이 접착단백질의 단백질분해에 관여된 프로테아제의 발현, 활성 및/또는 분해를 조절하는 것을 포함하는 방법.
단락 7. 단락 1 내지 5중 어느 하나에 있어서, 접착 단백질의 단백질분해의 조절이 접착단백질의 단백질분해에 관여된 프로테아제의 활성을 억제하는데 관여하는 프로테아제 억제제의 발현, 활성 및/또는 분해를 조절하는 것을 포함하는 방법.
단락 8. 세포간 접착에 관여하는 접착단백질의 발현 및/또는 활성을 조절하는 것을 포함하는, 상피세포에서 비정상적인 세포-세포 접착과 관련된 질병에 걸린 환자의 치료방법.
단락 9. 단락 8에 있어서, 접착 단백질의 발현이 전사수준 또는 번역수준, 또는 이들 모두에서 조절되는 방법.
단락 10. 단락 1 내지 9중 어느 하나에 있어서, 질병이 세포-세포 접착 감소와 관련되고, 또 접착 단백질의 단백질분해는 프로테아제 억제제의 투여; 프로테아제의 길항물질의 투여; 프로테아제 억제제의 작용물질의 투여; 프로테아제의 발현 감소; 프로테아제의 활성감소; 프로테아제 억제제의 발현증가; 프로테아제 억제제의 활성증가 중의 하나 이상의 방법에 의해 감소되는 방법.
단락 11. 단락 1 내지 9중 어느 하나에 있어서, 질병이 세포-세포 접착 증가와 관련되고, 또 접착 단백질의 단백질분해는 프로테아제의 투여; 프로테아제의 작용물질의 투여; 프로테아제 억제제의 길항물질의 투여; 프로테아제의 발현증가; 프로테아제의 활성증가; 프로테아제 억제제의 발현감소; 프로테아제 억제제의 활성감소 중의 하나 이상의 방법에 의해 증가되는 방법.
단락 12. 개인의 코르네오데스모신 유전자에서 돌연변이를 검출하는 것을 포함하는, 상피세포에서 비정상적인 세포-세포 접착과 관련된 질병의 진단방법.
단락 13. 단락 12에 있어서, 질병이 세포-세포 접착 감소와 관련되고, 또 개인의 코르네오데스모신에서Hph1제한효소 부위의 부재를 검출하거나, 개인의 코르네오데스모신 유전자의 위치 +1243에서 T의 존재를 검출하는 것을 포함하는 방법.
단락 14. 단락 1 내지 10, 12 또는 13에 있어서, 질병이 다음으로 구성된 군으로부터 선택되는 방법:
아토피성 습진, 지루성 습진, 자극성 접촉 피부염, 앨러지 접촉 피부염, 폐 아토피성 천식, 후 바이러스성 아스마, 기관지성 과민반응, 만성 폐색 폐 질환, 크론(Crohn)병, 궤양성 대장염, 복강 질병, 펩신의 궤양, 농가진, 바이러스성 사마귀, 전염성연속증, 세균성 수막염, 바이러스성 수막염, 헬리코박테리아 파이로리(Helicobacteria pylori)와 관련된 펩신 궤양, 피부 흑색종, 비늘모양 세포암, 기저세포 암, 피부 림프종, 피부암, 위장관의 악성종양 및 폐의 악성종양.
단락 15. 단락 12에 있어서, 질병이 세포-세포 접착 증가와 관련되고 또 개인의 코르네오데스모신에서Hph1제한효소 부위의 존재를 검출하거나, 개인의 코르네오데스모신 유전자의 위치 +1243에서 T의 부재를 검출하는 것을 포함하는 방법.
단락 16. 단락 1 내지 9, 11, 12 또는 15에 있어서, 질병이 건선, 비늘선, 심상성좌창 및 모공각화증으로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
발명의 요약
본 발명자는 코르네오데스모솜 단백질의 단백질분해가 박리에 관련된 주요 방법인 것을 나타낸다.
따라서, 본 발명자는 코르네오데스모솜 단백질의 증가되거나, 손상되거나 또는 비정상적인 단백질분해가 몇 개의 피부 질병과 관련되어 있다는 것을 발견하였다. 특히, 본 발명자는 접착 단백질의 단백질분해 증가가 장벽기능 손상을 특징으로 하는 질병에 관련되고 또 접착 단백질의 단백질분해 감소가 각질세포의 박리손상을 특징으로 하는 질병에 관련된다는 것을 발견하였다. 본 발명자는 또한 접착 단백질을 암호화하는 유전자에서의 돌연변이가 상피세포의 접착을 감소시킨다는 것을 나타낸다.
본 발명의 제1 요지에 따르면, 본 발명자는 개인의 접착 단백질, 프로테아제 또는 프로테아제 억제제를 암호화하는 핵산에서의 돌연변이를 검출하는 것을 포함하는, 상피세포에서 비정상적인 세포-세포 접착과 관련된 질병을 진단하거나 그 질병에 대한 감수성을 진단하는 방법을 제공한다.
본 발명의 제2 요지에 따르면, 접착 단백질, 프로테아제 또는 프로테아제 억제제 폴리펩티드 또는 이러한 것을 암호화하는 핵산에서 다형성(polymorphism)의 존재 또는 부재를 검출하는 것을 포함하며 상기 다형성은 그룹 I 질병과 관련되는 것을 특징으로 하는, 개인에서 그룹 I 질병을 진단하거나 그룹 I 질병에 대한 감수성을 진단하는 방법이 제공된다.
바람직하게는, 상기 접착 단백질은 표 D2.1 및 5.1에 나타낸 접착 단백질로 구성된 군으로부터 선택되며, 바람직하게는 코르네오데스모신, 데스모글레인 I, 데스모글레인 3, 플라코글로빈, 데스모플라킨, 데스모콜린 I 및 엔보플라킨, 세린 풍부 단백질, 바람직하게는 소형 프롤린-풍부 단백질(SPRR), SPRR2A, SPRR1B, SPRK, SPRR2E, SPRR2F, SPRR2B, SPRR2D, SPRR2C, SPRR2G, SPRR1A, SPRR3, SPRR4, 인보루크린 또는 로리크린이다.
바람직하게는, 프로테아제는 표 D3.1 및 6.1에 나타낸 프로테아제로 구성된 군으로부터 선택되며, 바람직하게는 각질층 키모트립신 효소(SCCE) 또는 각질층 트립신성 효소(SCTE)이다.
바람직하게는, 프로테아제 억제제는 표 D4.1 및 7.1에 나타낸 프로테아제 억제제로 구성된 군으로부터 선택되고, 바람직하게는 분비성 류코프로테아제 억제제(SLPI), 엘라핀 프로테아제 억제제 3 (PI3 또는 SKALP) 또는 시스타틴 A(CSTA)이다.
바람직하게는, 그룹 I 질병은 아토피성 습진, 지루성 습진, 자극성 접촉 피부염, 앨러지 접촉 피부염, 폐 아토피성 천식, 후 바이러스성 아스마, 기관지성 과민반응, 만성 폐색 폐 질환, 크론(Crohn)병, 궤양성 대장염, 복강 질병, 펩신의 궤양, 농가진, 바이러스성 사마귀, 전염성연속증, 세균성 수막염, 바이러스성 수막염, 헬리코박테리아 파이로리(Helicobacteria pylori)와 관련된 펩신 궤양, 피부 흑색종, 비늘모양 세포암, 기저세포 암, 피부 림프종, 피부암, 위장관의 악성종양 및 폐의 악성종양으로 구성된 군으로부터 선택된다.
본 발명의 제3 요지에 따르면, 본 발명은 한 개인에서 접착 단백질, 프로테아제 또는 프로테아제 억제제 또는 그의 단편의 존재, 부재 또는 조절되는 정도를검출하는 것을 포함하는, 한 개인에서 그룹 I 질병 또는 그룹 I 질병에 대한 감수성을 진단하는 방법을 제공한다.
본 발명의 제4 요지에 따르면, 세포간의 접촉에 관여하는 접착 단백질의 발현 및/또는 활성을 상향조절하거나, 또는 접착단백질의 단백질분해를 하향조절하는 것을 포함하는 그룹 I 질병을 치료하거나 또는 예방하는 방법이 제공된다.
바람직하게는, 상기 치료방법은 접착 단백질의 발현 및/또는 활성이 전사수준 또는 번역수준 또는 이들 모두에서 상향조절되는 방법이다.
다르게는 또는 부가적으로는, 접착 단백질의 단백질분해에 관여된 프로테아제의 발현, 활성 및/또는 분해가 하향조절된다.
또한, 다르게는 또는 부가적으로, 접착 단백질의 단백질 분해에 관여된 프로테아제의 활성을 억제하는데 관여되는 프로테아제 억제제의 발현 및/또는 활성은 상향조절되고, 및/또는 프로테아제 억제제의 분해는 하향조절된다.
접착단백질의 단백질분해는 하나 이상의 이하에 기재된 것에 의해 감소될 수 있다: 프로테아제 억제제 또는 그의 단편의 투여; 프로테아제의 길항물질 또는 그의 단편의 투여; 프로테아제 억제제의 작용물질의 투여; 프로테아제의 발현감소; 프로테아제의 활성감소; 프로테아제 억제제의 발현증가; 프로테아제 억제제의 활성 증가.
본 발명의 제6 요지로서 본 발명은 질병과 관련되지 않은 형태의 접착 단백질, 프로테아제 또는 프로테아제 억제제, 또는 그의 단편 치료 유효량을 그룹 I 질병에 걸린 환자 또는 그룹 I 질병에 걸릴 가능성이 있는 환자에게 투여하는 것을포함하는, 그룹 I 질병을 치료하거나 예방하는 방법을 제공한다.
바람직하게는, 상기 방법은 프로테아제 활성을 억제시킬 수 있는 프로테아제 억제제 또는 그의 단편을 투여하는 것을 포함한다.
바람직하게는, 상기 방법은 SLPI의 단편, 바람직하게는 다음으로 구성된 군으로부터 선택되는 펩티드를 투여하는 것을 포함한다: CGKS (SB7a) 및 CGKS CVSPVKA (SB7b); KIIDGA; GDKIIDGA; GDKIID; KII; KIID; KIIDG; KIIDGA; LDPVD (651); KRDLK (652); LDPVDTPNP (653); LDPVDTPNPTRRKPG (654); CGKSCVSPVKA (644); CVSPVKA (643), 가장 바람직하게는 펩티드 643, 펩티드 651 또는 펩티드 653.
다르게는 또는 부가적으로, 상기 방법은 TNF-α 및/또는 IL-β의 투여를 포함한다.
바람직하게는, 그룹 I 질병은 습진, 바람직하게는 아토피성 습진이거나, 또는 피부염, 바람직하게는 허피스상 피부염이다.
본 발명의 제7 요지에 따르면, 접착 단백질, 프로테아제 또는 프로테아제 억제제 폴리펩티드, 또는 이를 암호화하는 핵산에서 다형성의 존재 또는 부재를 검출하는 것을 포함하며, 상기 다형성은 그룹 II 질병과 관련된 것을 특징으로 하는, 개인에서 그룹 II 질병을 진단하거나 또는 그룹 II 질병에 대한 감수성을 진단하는 방법이 제공된다.
본 발명의 제8 요지에 따르면, 세포 사이의 접착에 관여하는 접착 단백질의 발현 및/또는 활성을 하향조절하거나, 또는 접착 단백질의 단백질분해를 상향조절하는 것을 포함하는, 그룹 II 질병을 치료 또는 예방하는 방법이 제공된다.
바람직하게는, 접착 단백질의 발현 및/또는 활성은 전사수준 또는 번역수준 또는 이들 모두에서 하향조절된다.
다르게는 또는 부가적으로, 접착 단백질의 단백질분해에 관여된 프로테아제의 발현, 활성 및/또는 분해는 상향조절된다.
또한, 다르게는 또는 부가적으로, 접착 단백질의 단백질분해에 관련된 프로테아제의 활성을 억제하는데 관여하는 프로테아제 억제제의 발현 및/또는 활성은 하향조절되고, 및/또는 프로테아제 억제제의 분해는 상향조절된다.
바람직하게는, 접착 단백질의 단백질분해는 하나 이상의 이하의 것에 의해 향상된다: 프로테아제 또는 그의 단편의 투여; 프로테아제의 작용물질의 투여; 프로테아제 억제제의 길항물질의 투여; 프로테아제의 발현증가; 프로테아제의 활성 증가; 프로테아제 억제제의 발현감소; 프로테아제 억제제의 활성감소.
본 발명의 제9 요지로서, 본 발명은 질병과 관련되지 않은 형태의 접착 단백질, 프로테아제 또는 프로테아제 억제제, 또는 그의 단편 치료 유효량을 그룹 II 질병에 걸린 환자 또는 그룹 II 질병에 걸릴 가능성이 있는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 그룹 II 질병을 치료하거나 예방하는 방법을 제공한다.
바람직하게는, 상기 방법은 접착 단백질 또는 그의 단편의 투여를 포함한다.
바람직하게는, 상기 방법은 데스모콜린 I의 단편, 바람직하게는 펩티드 641 서열을 포함하는 펩티드, 또는 데스모플라킨의 단편, 바람직하게는 펩티드 642 서열을 포함하는 펩티드를 투여하는 것을 포함한다.
본 발명의 제10 요지에 따르면, 접착 단백질, 프로테아제 또는 프로테아제 억제제와, 바람직하게는 접착 단백질, 프로테아제 또는 프로테아제 억제제의 질병 관련 형태와 특이적으로 반응할 수 있는 모노클로날 항체 또는 폴리클로날 항체가 제공된다.
본 발명의 제11 요지에 따르면, 접착 단백질, 프로테아제 또는 프로테아제 억제제 펩티드를 후보 화합물과 접촉시킨 다음 후보 화합물이 접착 단백질, 프로테아제 또는 프로테아제 억제제와 결합하는지 여부를 측정하는 것을 포함하는, 접착 단백질, 프로테아제 또는 프로테아제 억제제에 결합할 수 있는 분자를 확인하는 방법이 제공된다.
본 발명의 제12 요지에 따르면, 상기 요지에 따른 방법에 의해 확인된 화합물이 제공된다.
본 발명의 제13 요지에 따르면, (a) 접착 단백질을 제공하고; (b) 프로테아제를 제공하며; (c) 후보 분자 존재하에서 접착 단백질을 프로테아제에 노출시키며; 또 (d) 프로테아제에 의한 접착 단백질 분해의 존재 또는 부재를 측정하는 것을 포함하는 프로테아제의 활성을 조절할 수 있는 분자를 확인하는 방법이 제공된다.
본 발명의 제14 요지에 따르면, 프로테아제에 의해 접착 분자의 분해를 향상시킬 수 있는, 본 발명의 제13 요지에 따른 방법에 의해 확인된 화합물의 그룹 II 질병을 치료하기 위한 용도가 제공된다.
본 발명의 제15 요지에 따르면, 프로테아제에 의한 접착 분자의 분해를 억제시킬 수 있는, 본 발명의 제13 요지에 따른 방법에 의해 확인된 화합물의 그룹 I 질병을 치료하기 위한 용도가 제공된다.
본 발명의 제16 요지에 따르면, 이종 접착 단백질, 프로테아제 또는 프로테아제 억제제, 바람직하게는 질병과 관련된 형태의 접착 단백질, 프로테아제 또는 프로테아제 억제제를 발현하는 비-인간 트랜스제닉 동물이 제공된다. 본 발명의 제17 요지에 따르면, 접착 단백질, 프로테아제 또는 프로테아제 억제제를 조절된 수준, 바람직하게는 상향조절 또는 하향조절된 정도로 발현하는 비-인간 트랜스제닉 동물이 제공된다. 본 발명의 제18 요지에 따르면, 접착 단백질, 프로테아제 또는 프로테아제 억제제를 실질적으로 발현하지 않는 비-인간 트랜스제닉 동물이 제공된다. 이러한 동물은 피부 질병, 바람직하게는 그룹 I 또는 그룹 II 질병에 대한 모델로서 사용될 수 있다.
실시예 A: 접착단백질 다형성
실시예 A1. 코르네오데스모신(S) 유전자 다형성의 확인
표준 방법에 따라서 전혈액으로부터 게놈 DNA를 추출하고 100 ng/㎕로 저장하였다. 위치 +1243에서 T를 C로 전이하는 1개의 보고된 엑손 다형성을 분석하였다(Ishihara 등, 1996, Tazi-Ahnini 등, 1999a, 1999b).
프라이머 S15 (5'CATTGCATTCCAGCCAGTGG3') 및 S16 (5'AACTGGAGCTGCTGCTGAAGGA3')를 사용하여 다형성 위치(+1243)를 증폭시켰다. PCR을 괴상으로 제조하고 50 mM KCL, 20 mM 트리스-HCL, 1.5 mM MgCl2, 200 μM 각 dNTP, 1.2 μM 각 프라이머, 1U Taq 중합효소 (Gibco BRL, 영국 페이즐리) 및 200 ng의 게놈 DNA를 포함하는 25 ㎕ 부피의 알리쿼트로 나누었다. 써모사이클링(thermocycling) 조건은 95℃에서 2분, 95℃에서 1분간 28주기, 58℃에서 1분 및 72℃에서 15초. 증폭은 72℃에서 15분에 완료되었다.
제한분해는 10 ㎕의 PCR 산물 및 2.5 U의HphI및 적합한 제조자의 완충액 (New England Biolabs, 영국 히친)을 함유하는 20 ㎕ 반응물로 37℃에서 철야로 실시하였다. 2% 아가로오스를 사용한 전기영동에 의해 대립유전자 구별을 실시하였다.HphI분해는 대립유전자1의 경우 123+89 bp를 생성하였고, 대립유전자2는 절단하지 못하였다(212bp).
대립유전자
이하 실시예에서, "대립유전자1"은 위치 +1243에서 뉴클레오티드 잔기가 C인 대립유전자를 지칭한다. 이러한 대립유전자에 의해 암호화된 단백질은 수탁번호L20815를 갖는 폴리펩티드 서열 번호를 이용하는 아미노산 서열의 위치 394에서 세린(S) 잔기를 갖는다.
유사하게, "대립유전자2"는 위치 +1243에서 뉴클레오티드 잔기가 T인 대립유전자를 지칭한다. 이러한 대립유전자에 의해 암호화된 단백질은 수탁번호 L20815를 갖는 폴리펩티드 서열번호를 이용하는 아미노산 서열의 위치 394에서 로이신 잔기를 갖는다.
아미노산 위치 번호는 GenBank 수탁번호 GB: L20815 또는 AF030130으로 표시된 코르네오데스모신 서열의 번역개시코돈(+1, ATG)을 지칭한다. 따라서, 예컨대 +1243에서 C를 T로 치환하는 것은 GB 서열 L20815에 따른 위치 394에서 S를 F로의 아미노산 변화를 유발하는 반면, 동일한 뉴클레오티드 치환은 GB 서열 AF030130에 따른 위치 410에서 S를 F로의 아미노산 변화를 가져온다.
통계학적 분석
질병 집단 및 대조군 집단을 2 x 3 테이블을 이용하여 대조하고, 대립유전자1에 대한 개별 상동접합체를 대조군 및 환자 집단에서 택일적 대립유전자(대립유전자2)에 대한 개별 상동접합체를 비교함으로써 위험성(odd ratio)을 산출하였다. 대립유전자2에 대한 χ2시험을 실시하고, 각 유전형 그룹에서 추정되는 질병 감수성 대립유전자의 개수를 산출하였다.
실시예 A2. 코르네오데스모신(S) 유전자 +1243 다형성과 아토피성 습진과의 관계
이 실시예에서는, 특별히 언급하지 않는 한, 코르네오데스모신 서열에 있는 아미노산 위치는 GenBank 서열 L20815의 번호를 참조하여 제공한다.
이 실시예는 위치 +1243의 코르네오데스모신의 뉴클레오티드 잔기가 T로서, 코르네오데스모신 폴리펩티드(L20815)의 위치 394에서의 로이신(T) 잔기의 존재를 초래하는 코르네오데스모신 대립유전자2는 아토피성 습진과 관련이 있다는 것을 나타낸다.
+1243 다형성의 대립유전자 분포는 아토피성 습진 및 대조군(n=154 및 550, 각각) 모두에서 상술한 바와 같이 평가하였다. 대조군 및 환자군 모두는 하디 와인버그균형(Hardy Weinberg equilibrium)이다. 하기 표 A2.1은 대조군 및 아토피성 습진 환자군에서 각 유전형의 관찰치(A) 및 기대치(B)를 나타낸다.
A) 관찰치
B) 기대치
표 A2.1: 대조군 및 아토피성 습진 환자군에서 대립유전자 11, 12 및 22의대립유전자 분포. A: 관찰치; B: 기대치.
대조군 및 환자군에서 기대치와 관찰치 사이의 전체적 차이는 통계학적으로 그리 심하지 않다. 그러나, 미소한 대립유전자 증가가 있었다(대립유전자2, 52/44.2 = 1.2). 대립유전자1(공통 대립유전자)는 습진으로부터 보호되는 형이고, 이 때문에 본 발명자는 개인을 대립유전자 12 및 11을 갖는 개인을 1개 서브그룹으로 하고 대립유전자 22를 갖는 개인을 다른 서브그룹으로 나누었다(하기 표 A2.2 참조).
표A2.2: 대조군 및 아토피성 습진 환자군에서 대립유전자 11 및 12/22의 대립유전자 분포.
대립유전자 1의 보균에 대한 대립유전자 2에 대한 χ2시험을 실시하였다. 코르네오데스모신 유전자(+1243) 다형성과 아토피성 습진의 대립유전자 2 사이에 현저한 관계가 발견되었다 [OR = 1.36 (0.93, 1.99)].
따라서 본 발명자는 개인의 코르네오데스모신 핵산의 위치 +1243에서 T의 존재, 또는 개인의 코르네오데스모신 폴리펩티드(L20815)의 위치 394에서 로이신(L) 잔기의 존재, 또는 이들 모두를 검출하는 것에 의해, 개인에서 그룹 I 질병 또는 그룹 I 질병에 대한 감수성(바람직하게는 습진 또는 아토피성 습진과 같은 습진에 대한 감수성)을 진단하는 방법을 제공한다.
실시예 A3. 코르네오데스모신(S) 유전자 +1243 다형성과 피부염과의 관계
이 실시예에서는, 특별히 언급하지 않는 한, 코르네오데스모신 서열에 있는 아미노산 위치는 GenBank 서열 L20815의 번호를 참조하여 제공한다.
이 실시예는 위치 +1243의 코르네오데스모신의 뉴클레오티드 잔기가 T로서, 코르네오데스모신 폴리펩티드(L20815)의 위치 394에서의 로이신(T) 잔기의 존재를 초래하는 코르네오데스모신 대립유전자2는 허피스상피부염과 관련이 있다는 것을 나타낸다.
+1243 다형성의 대립유전자 분포는 허피스상피부염 및 대조군(n=154 및 550, 각각) 모두에서 상술한 바와 같이 평가하였다. 대조군 및 환자군 모두는 하디 와인버그균형(Hardy Weinberg equilibrium)이다.
A) 관찰치
B) 기대치
표 A3.1: 대조군 및 허피스상 피부염 군에서 대립유전자 11, 12 및 22의 대립유전자 분포.
희소한 대립유전자(대립유전자2, 26/14.6 = 1.78)의 증가가 있었다. 오직 1명의 환자가 대립유전자1(공통 대립유전자)에 대한 동형접합성이다. 이러한 대립유전자는 대조군에서 아주 빈번하기 때문에 보호형으로 보여진다.
표 A3.2: 대조군 및 허피스상 피부염군에서 대립유전자 11 및 12/22의 대립유전자 분포
대립유전자 2의 보균에 대하여 대립유전자 1에 대한 χ2시험을 실시하였다. S 유전자(+1243) 다형성과 허피스상피부염 사이에는 현저한 관계가 밝혀졌다[OR = 13.10 (1.79, 95.85); p＜0.0001].
따라서 본 발명은 개인의 코르네오데스모신 핵산의 위치 +1243에서 T의 존재, 또는 개인의 코르네오데스모신 폴리펩티드(L20815)의 위치 394에서 로이신(L) 잔기의 존재, 또는 이들 모두를 검출하는 것에 의해 개인에서 그룹 I 질병 또는 그룹 I 질병에 대한 감수성(바람직하게는 피부염 또는 바람직하게는 허피스상 피부염과 같은 피부염에 대한 감수성)을 진단하는 방법을 제공한다.
위치 +1243에서 대립유전자 2 또는 T는 아토피성 습진에 비교하여 허피스상 피부염에 대하여 더 높은 위험을 나타내는데, 이는 +1243에서 개별 이형접합체가 높은 피부염 발병 위험성을 갖기 때문이다.
실시예 A4. 결합 불균형 분석(Linkage Disequilibrium Analysis)
이 실시예에서는, 특별히 언급하지 않는 한, 코르네오데스모신 서열에 있는 아미노산 위치는 GenBank 서열 L20815의 번호를 참조하여 제공한다.
위치+1243에 있는 C는 위치 +619 및 +1240dp 각각 있는 T 및 G와 불균형 관계에 있다는 것은 이미 알려져있었다(Tazi-Ahnini 등, 1999a; Allen 등, 1999). 이 결합 불균형은 코르네오데스모신의 코딩 서열내에 있는 다른 위치에도 연장된다. 또한 투과 불균형 시험(TDT)를 이용한 페디그리(pedigree) 분석법을 이용함으로써, Jenisch와 그의 동료들은 코르네오데스모신 유전자의 6개의 상이한 아미노산 서열을 암호화하는 6개의 상이한 대립유전자를 확인하였다(Jenisch 등, 1999).
그룹 I 질병
본 발명은 대립유전자 5(CD5) 및 대립유전자 6(CD6)내에서 위치 +1243에 있는 T(leu)가 CD5의 A(asp), AGT(ser), T(phe), A(ser), T(ser), T(leu), G(asp) 및 T(asn) 및 CD6의 A(asp), 결실(-), T(phe), A(ser), T(ser), T(leu), G(asp) 및 C(asp)와 강한 결합 불균형을 나타냄을 보여준다. 이들 변이체는 각각 위치 +442, +468, +619, +1215, +1236, +1243, +1515 및 +1593에 있다.
본 발명은 이들 변이체와 아토피성 습진이 강한 관련이 있다는 것을 발견하였다. 따라서, 상기 수록한 위치 +1243(대립유전자 2)에서 T와의 결합 불균일인 것으로 나타난 변화의 검출은 뉴클레오티드 T(+1243) 또는 아미노산 L(L20815의 394) 의 검출 대신 또는 부가적으로 이용될 수 있다.
따라서 본 발명은 상기 변화의 하나 이상을 검출하는 것에 의해, 개인에서그룹 I 질병 또는 그룹 I 질병에 대한 감수성, 바람직하게는 습진 또는 피부염, 보다 바람직하게는 아토피성 습진 또는 허피스상 피부염 또는 이들 질병에 대한 감수성을 진단하는 방법을 제공한다.
따라서, 본 발명은 하기 표 A4.1에 나타낸 바와 같이 코르네오데스모신 핵산의 관련 부분에서 하기 잔기중의 하나 이상을 검출하는 것에 의해, 그룹 I 질병, 또는 그룹 I 질병에 대한 감수성을 진단하는 방법을 제공한다.
표 A4.1. 코르네오데스모신 다형성 및 그룹 I 질병. (1): GenBank 서열 L20815에 따른 아미노산 위치 번호; (2): GenBank 서열 AF030130에 따른 아미노산 위치.
그룹 II 질병
본 발명은 코르네오데스모신의 대립유전자 2(CD2)에서 위치 +1243에 있는 C(Ser)는 CD2의 G(Ser), AGT(ser), T(phe), A(ser), T(ser), C(Ser), G(asp) 및 T(asn)과 강한 결합 불균형을 나타냄을 보여준다. 이들 변이체는 각각 위치 +442, +468, +619, +1215, +1236, +1243, +1515 및 +1593에 있다.
본 발명은 이들 변이체와 심상성좌창과 강한 관련이 있다는 것을 발견하였다. 따라서, 상기 수록한 위치 +1243(대립유전자 1)에서 T와의 결합 불균일인 것으로 나타난 변화의 검출은 뉴클레오티드 C(+1243) 또는 아미노산 S(L20815의 394) 의 검출 대신 또는 부가적으로 이용될 수 있다.
따라서 본 발명은 상기 변화의 하나 이상을 검출하는 것에 의해, 개인에서 그룹 II 질병 또는 그룹 II 질병에 대한 감수성, 바람직하게는 여드름 및/또는 건선, 보다 바람직하게는 심상성좌창 및/또는 건선, 또는 이들 질병에 대한 감수성을 진단하는 방법을 제공한다.
따라서, 본 발명은 하기 표 A4.2에 나타낸 바와 같이 코르네오데스모신 핵산또는 폴리펩티드의 관련 위치에서 하기 잔기중의 하나 이상을 검출하는 것에 의해, 그룹 II 질병, 또는 그룹 II 질병에 대한 감수성을 진단하는 방법을 제공한다.
표 A4.2. 코르네오데스모신 다형성 및 그룹 II 질병. (1): GenBank 서열 L20815에 따른 아미노산 위치 번호; (2): GenBank 서열 AF030130에 따른 아미노산 위치.
상기 핵산변화는 코르네오데스모신의 아미노산 서열에서의 변화를 초래한다. 따라서, 관련 핵산 위치에서 뉴클레오티드 잔기의 검출은 이들의 효과를 검출하는 것에 의해, 즉 암호화된 폴리펩티드 서열에서 상응하는 변화를 검출하는 것에 의해달성될 수 있다. 따라서, 예컨대 특정 핵산 프로브 또는 분해성 효소(예컨대HphI)를 사용하여 핵산 서열의 위치 +1243에서 다형성을 검출하는 대신 또는 부가적으로, 위치 394에 있는 L 잔기와 위치 394에 있는 S 잔기 사이를 구별지을 수 있는 모노클로날 항체를 사용할 수 있다.
본 발명은 상기 표 A4.2에 나타낸 바와 같이, 코르네오데스모신 폴리펩티드의 관련 위치에서 하나 이상의 상기 잔기를 검출하는 것에 의해 그룹 I 질병, 또는 그룹 I 질병에 대한 감수성을 진단하는 것을 제공한다. 본 발명은 또한 상기 표 A4.2에 나타낸 바와 같이, 코르네오데스모신 폴리펩티드의 관련 위치에서 하나 이상의 상기 잔기를 검출하는 것에 의해 그룹 II 질병, 또는 그룹 II 질병에 대한 감수성을 진단하는 것을 제공한다.
요약
본 발명은 증가된 감수성을 나타내는 코르네오데스모신 유전자내의 마커와 아토피성 습진 및 허피스상 피부염과의 관계를 나타내었다. +1243에서 C를 갖는 코르네오데스모신 대립유전자(대립유전자 1)는 건선 및 심상성좌창과 관련되어 있으며, 이는 2개의 대립유전자가 상이한 감수성을 나타낸다는 것을 제시한다. 대립유전자 2(L394)는 장벽 기능장애(예컨대 피부염, 크론병)와 관련되고 대립유전자 1(S394)은 손상된 박리(예컨대 건선, 여드름)와 관련된다.
본 발명은 또한 코르네오데스모신 유전자의 +1243에서의 다형성과 아토피성 습진과 피부염과의 관계를 나타내었다. 위치 +1243에서의 치환은 아미노산 변화 L394S를 나타낸다. 이 이론에 국한되는 것은 아니나, 상기 치환은 코르네오데스모신의 처리를 방해하여 박리를 증가시키는 것으로 추정된다.
본 발명은 아미노산 변화(Ser143/Asp, Ser153/-, Ser202/Phe, Ser401/Gly, Ser408/Ala, S410/L, Asp527/Asn; GB 서열 AF030130에 따른 위치) 또는 (Ser127/Asp, Ser137/-, Ser186/Phe, Ser385/Gly, Ser392/Ala, S394/L, Asp511/Asn; GB 서열 L20815에 따른 위치)를 갖는 다형성이 각화세포 성숙 및 박리 과정에 중요한 작용을 한다는 것을 발견하였다. 이들 다형성을 스크리닝하는 방법은 Jenisch 등, 1999 및 Guerrin 등, 2001에 의해 기재되어 있다. 따라서 본 발명은 코르네오데스모신의 단백질분해 과정과 정상피부의 감도, 및 질병에 걸린 피부의 통합성 사이에 강한 관계가 있다는 것을 나타내며, 건선, 여드름 및 피부염을 포함한 장벽기능에서의 손상이 있다.
실시예 A5. 위치 180에서 코르네오데스모신(S) 유전자 다형성
본 실시예에서는, 특별히 언급하지 않는 한, 코르네오데스모신 서열의 아미노산 위치는 GenBank 서열 L20815에서의 번호를 참조하여 제공된 것이다.
+180 코르네오데스모신 유전자 다형성의 확인
위치 180에서의 S 유전자 변이체는 클론된 S 대립유전자의 자동서열분석에 의해 확인하였다(Guerring 등, 2001). 위치 +180에서 C에서 T로의 핵산변화는 위치 40(L20815)에서 L에서 F로의 아미노산 변화를 초래한다. 이 아미노산은 포유류종에서 고도로 보존된다. 인간, 마우스 및 돼지의 S 서열을 서열정렬하면, 하기 표 A5.1에 나타낸 바와 같이 상기 서열 사이에 L40이 보존됨을 보여준다.
표 A5.1. 코르네오데스모신 서열의 정렬. 아미노산 번호는 GenBank 수탁번호 L20815에서 서열번호를 참조하여 제시한 것이다. 위치 180에서 C에서 T로의 핵산치환은 GB 서열 AF030130에 따른 코르네오데스모신 단백질의 위치 56에서 L에서 F로의 아미노산 변화를 초래한다.
키모트립신 단백질분해
코르네오데스모신의 단편에 상응하며 위치 40에서 및 그 주변에 있는 아미노산(L20815; 뉴클레오티드 서열상의 위치 180에 상응함)을 포함하는 펩티드를 합성하였다. 이 펩티드를 적합한 완충액중의 키모트립신에 노출시키고, 분해산물을 확인하였다. 키모트립신은 C-말단의 펩티드결합을 절단하여 F, Y 또는 W 잔기를 생성하지만, L 잔기를 생성하는 C-말단은 절단하지 않는 것으로 알려져 있다.
펩티드 P1 및 P2 (크기 38 아미노산, L20815의 위치 40에서 L 및 F 포함)를 키모트립신에 노출시켰다. 펩티드 P1은 서열을 갖는 반면에, 펩티드 P2는 서열을 갖는다.
L20815의 위치 40에서 L을 갖는 펩티드 P1은 2개의 단백질분해 산물을 생성한다는 것이 밝혀졌다:. 그러나, L20815의 위치 40에서 F를 갖는 펩티드 P2는 세 개의 소형 펩티드를 생성하였다:. 상기 결과는http://www.expasy.ch/.에서 ExPASy Molecular Biology Server를 이용하여 확인하였다. P1 및 P2 서열을 갖는 펩티드는 키모트립신에 의해 상이하게 분해될 것으로 예상된다.
이것은 L에서 F로의 아미노산 변화가 코르네오데스모신내에서 새로운 키모트립신 부위를 생성함을 보여준다. 이것은 각화세포 분화와 박리동안 코르네오데스모신 성숙에 중요한 효과를 갖는다. 본 발명은 코르네오데스모신에서 L에서 F로의 아미노산 다형성과 질병 표현형의 관계를 기재한다.
따라서, 본 발명은 개인의 코르네오데스모신 폴리펩티드에서 프로테아제 분해 부위의 존재를 검출하는 것에 의해 개인에서 그룹 I 질병 또는 그룹 I 질병에 대한 감수성(바람직하게는 피부염 또는 바람직하게는 허피스상 피부염, 바람직하게는 습진, 바람직하게는 아토피성 습진과 같은 피부염에 대한 감수성)을 진단하는 방법을 개시한다. 프로테아제 부위의 검출은 펩티드 서열상에서 실시될 수 있거나, 또는 프로테아제 부위를 암호화하는 핵산변화를 검출할 수 있다. 바람직하게는, 프로테아제 분해 부위는 SCCE 또는 SCTE의 분해 부위이다.
그룹 I 질병
본 발명은 특히 위치 40에서 L에서 F로의 아미노산 치환이 그룹 I 질병(예컨대 습진 및/또는 피부염)과 관련있다는 것을 발견하였다. 이 치환은 코르네오데스모신 핵산의 위치 180에서 C에서 T로의 변화에 의해 유발되었다.
본 발명은 개인의 코르네오데스모신의 위치 40에서 F의 존재를 검출하는 것에 의해 개인에서 그룹 I 질병 또는 그룹 I 질병에 대한 감수성(바람직하게는 피부염 또는 바람직하게는 허피스상 피부염, 바람직하게는 습진, 바람직하게는 아토피성 습진과 같은 피부염에 대한 감수성)을 진단하는 방법을 제공한다.
본 발명은 개인의 코르네오데스모신 핵산의 위치 180에서 T의 존재를 검출하는 것에 의해 개인에서 그룹 I 질병 또는 그룹 I 질병에 대한 감수성(바람직하게는 피부염 또는 바람직하게는 허피스상 피부염, 바람직하게는 습진, 바람직하게는 아토피성 습진과 같은 피부염에 대한 감수성)을 진단하는 방법을 제공한다.
그룹 II 질병
본 발명은 특히 위치 40에서 L에서 F로의 아미노산 치환이 그룹 II 질병(예컨대 건선 및/또는 여드름)과 관련있다는 것을 발견하였다. 이 치환은 코르네오데스모신 핵산의 위치 180에서 T에서 C로의 변화에 의해 유발되었다. 위치 40에서 대립유전자 L은 여드름 및 건선과 같은 접착증가를 갖는 질병(그룹II)과 관련있다. 코르네오데스모신 폴리펩티드의 위치 40에서 L의 존재는 프로테아제에 의한 단백질분해 과정에 견디는 단백질을 만든다.
따라서 본 발명은 개인의 코르네오데스모신 폴리펩티드의 위치 40에서 L의 존재를 검출하는 것에 의해 개인에서 그룹 II 질병 또는 그룹 II 질병에 대한 감수성(바람직하게는 건선 또는 여드름 또는 건선 또는 여드름에 대한 감수성)을 진단하는 방법을 제공한다.
본 발명은 개인의 코르네오데스모신 핵산의 위치 180에서 C의 존재를 검출하는 것에 의해 개인에서 그룹 II 질병 또는 그룹 II 질병에 대한 감수성(바람직하게는 건선 또는 여드름 또는 건선 또는 여드름에 대한 감수성)을 진단하는 방법을 제공한다.
실시예 A6. +619 코르네오데스모신 유전자 다형성의 확인
본 발명은 위치 +619에서 C에서 T로의 아미노산 치환이 L20815에서의 번호에 따른 위치 186 및 AF030130에서의 번호에 따른 위치 202에서 S에서 F로의 아미노산 변화를 초래한다는 것을 나타낸다. 이것은 코르네오데스모신 단백질내에 새로운 키모트립신 부위를 만든다. 본 발명자는 위치 186에서의 세린이 포유류종에서 고도로 보존됨을 발견하였다.
본 발명은 또한 위치 186에서의 F가 습진 및 피부염과 같은 손상된 피부 장벽기능과 관련있다는 것을 나타내었다. 위치 186에서의 F는 코르네오데스모신 폴리펩티드의 CD5 및 CD6에서 발견되었다.
그룹 I 질병
본 발명은 개인의 코르네오데스모신 펩티드의 위치 186에서 F의 존재를 검출하는 것에 의해 개인에서 그룹 I 질병 또는 그룹 I 질병에 대한 감수성(바람직하게는 피부염 또는 바람직하게는 허피스상 피부염, 바람직하게는 습진, 바람직하게는 아토피성 습진과 같은 피부염에 대한 감수성)을 진단하는 방법을 제공한다.
본 발명은 개인의 코르네오데스모신 핵산의 위치 619에서 T의 존재를 검출하는 것에 의해 개인에서 그룹 I 질병 또는 그룹 I 질병에 대한 감수성(바람직하게는 피부염 또는 바람직하게는 허피스상 피부염, 바람직하게는 습진, 바람직하게는 아토피성 습진과 같은 피부염에 대한 감수성)을 진단하는 방법을 제공한다.
그룹 II 질병
본 발명은 위치 186에서 F에서 S로의 아미노산 치환이 그룹 II 질병(예컨대 건선 및/또는 여드름)과 관련있다는 것을 발견하였다. 이 치환은 코르네오데스모신 핵산의 위치 619에서 T에서 C로의 변화에 의해 유발되었다.
따라서 본 발명은 개인의 코르네오데스모신 폴리펩티드의 위치 186에서 S의 존재를 검출하는 것에 의해 개인에서 그룹 II 질병 또는 그룹 II 질병에 대한 감수성(바람직하게는 건선 또는 여드름 또는 건선 또는 여드름에 대한 감수성)을 진단하는 방법을 제공한다.
본 발명은 개인의 코르네오데스모신 핵산의 위치 619에서 C의 존재를 검출하는 것에 의해 개인에서 그룹 II 질병 또는 그룹 II 질병에 대한 감수성(바람직하게는 건선 또는 여드름 또는 건선 또는 여드름에 대한 감수성)을 진단하는 방법을 제공한다.
치료
코르네오데스모신 또는 기타 접착 단백질로부터 유도되거나 또는 그를 포함하는 폴리펩티드, 바람직하게는 부가적인 프로테아제 분해 부위를 갖는 폴리펩티드는 피부 장벽기능이 손상된 환자(그룹 I 질병)를 치료하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 펩티드는 바람직하게는 피부 장벽을 침투할 수 있고 또 바람직하게는 약 ＜800 Da 미만의 분자량을 갖는다. 이 펩티드는 바람직하게는 다음 서열을 포함한다.
이들 펩티드는 이들이 위치 40에서 F를 함유하는 천연 코르네오데스모신 또는 위치 186에서 F를 함유하는 천연 코르네오데스모신을 모방하기 때문에 프로테아제(예컨대 SCCE 및 SCTE)의 타겟으로 될 수 있다.
따라서, 상기 서열을 포함하거나 상기 서열로부터 유도된 펩티드는 코르네오데스모신 및 기타 접착 단백질의 단백질분해의 경쟁적 억제제로서 작용할 수 있으므로 정상 피부 장벽을 회복할 수 있다.
실시예 B: 프로테아제에서의 다형성 및 프로테아제 억제제 유전자
실시예 B1. 각질층 키모트립신 효소(SCCE) 다형성의 확인
각질층 키모트립신 효소(SCCE)를 암호화하는 DNA 서열은 수탁번호 AF166330하의 NCBI 파일서버(www.ncbi.nlm.nih.gov/) 로부터 확인할 수 있다. 동일한 공급원으로부터, SCCE DNA 서열의 5개의 엑손 서열을 얻고 또 GeneJockey 프로그램(BIOSOFTR, 영국)을 이용하여 특정 프라이머를 고안하였다.
다형성의 확인
SCCE 유전자의 5개 엑손을 돌연변이 및/또는 다형성에 대해 스크리닝하였다. 이들 초기 발견을 기초로하여, 엑손 I 및 V에 연구를 집중하기로 결정하였는데, 이는 전자에서는 아무것도 초기에 검출되지 않고 또 후자는 AACC 중복 삽입의 존재를 보여주기 때문이다.
따라서, 다형성 분석을 촉진시키기 위하여, 본 발명자는 9명의 건강한(대조군) 개인로부터 얻은 SCCE 유전자의 2개 엑손을, 특정 프라이머 F1, R1, F5 및 R5를 사용하여 별도의 중합효소 연쇄반응 산물로 증폭시켰다.
프라이머 서열은 다음과 같다:
(하기 표 B1.1 참조). 각 엑손의 서열 조성의 차이로 인하여(예컨대 이들의 GC 함량), 2개의 엑손을 변형하기 위해 상이한 조건이 이용되었다; 이들 조건은 하기 표에 특정되어 있다.
엑손 I의 경우, 게놈 DNA 증폭은 2 ㎕ Taq 중합효소 완충액(x1)(Gibco; x10), 0.8㎕ MgCl2(2 mM)(Gibco; 50 mM), 1.6 ㎕ dNTP (10 mM)(프로메가), 0.1 ㎕ W-1 (Gibco; 1%), 0.1 ㎕ Taq 중합효소 (Gibco; 0.5 μ), 1 ㎕ 프라이머 F1 (2μM; 초기 농도. 20 μM), 1 ㎕ 프라이머 R1 (2μM; 초기 농도. 20 μM), 1㎕ DNA 주형(100 ng/㎕) 및 12.4 ㎕ 멸균 H2O를 함유하는 20 ㎕ PCR 반응물을 사용하여 실시하였다.
엑손 V의 경우, 게놈 DNA는 2 ㎕ Pfx 중합효소 완충액(x1)(Gibco; x10), 0.8㎕ MgCl2(2 mM)(Gibco; 50 mM), 1.6 ㎕ dNTP (10 mM)(프로메가), 2 ㎕ PCR 향상제 용액 (x1)(Gibco; x10), 0.06 ㎕ Pfx 중합효소 (Gibco; 250 μ), 1 ㎕ 프라이머 F5 (2μM; 초기 농도. 20 μM), 1 ㎕ 프라이머 R5 (2μM; 초기 농도. 20 μM), 1㎕ DNA 주형(100 ng/㎕) 및 10.54 ㎕ 멸균 H2O를 함유하는 20 ㎕ PCR 반응물에 의해 증폭하였다.
PCR 증폭은 40-웰 써모사이클(TECHNEGENIUS; Scientific Laboratories Supp. Ltd)에서 다음 조건하에서 실시하였다: 98℃에서 5분(1주기), 97℃에서 1분간, 57℃(엑손 V) 또는 60℃(엑손I)에서 30초, 72℃에서 1분(35주기), 74℃에서 5분 및 15℃에서 유지. 2개 엑손의 증폭에 사용된 프라이머 및 PCR 조건의 개요는 하기 표 B1.1에 나타낸다.
표 B1.1. SCCE 유전자의 엑손 I 및 V의 증폭 및 서열결정화에 사용된 프라이머 및 조건.
아가로오스 겔 전기영동
증폭된 산물은 아가로오스 겔 전기영동에 의해 분리하였다. 하기 방법은 1x TAE (4,900 ml의 멸균 H2O + 100 ml 50x TAE 저장액: 242 g의 트리스 염기, 빙초산 57.1 ml, 100ml의 0.5M EDTA로 pH8로 조정)중, 1.5% 아가로오스 겔에 대해 표준 겔 전기영동 수법을 기본으로 한다.
1.5 g의 아가로오스는 마이크로웨이브 오븐에서 가열하는 것에 의해 100 ml 1x TAE에 충분히 용해시키고, 4 ㎕의 에티듐 브로마이드를 부가한 후, 용액을 혼합한 다음 냉수하에서 조심스럽게 냉각시켰다. 동시에, 트레이 단부를 테이핑하는 것에 의해 겔 트레이를 제조하고 콤브(comb)를 위치시켜 소망하는 위치에서 웰이 형성되게한다. 용융된 아가로오TM를 겔 트레이에 부은 다음 실온에서 고화시켰다. 먼저 콤브를, 이어 테이프를 제거한 후, 트레이내에 있는 겔을 수평 겔 탱크에 넣고, 1x TAE 완충액으로 덮었다(수 mm).
10%(v/v) 로딩 완충액(0.25% 브로모페놀 블루, 0.25% 크실렌 시아놀 및 25% 피콜)을 함유하는 DNA 샘플은 그 밀도가 증가하며, 이어 겔내에 형성된 웰로 로딩하였다. 보통 웰에는 보다 분명한 결과로 나올 수 있는 가능한한 많은 양의 샘플을 로딩한다. 탱크의 양성(적색) 및 음성(흑색) 말단을 파워 팩(power pack)(Bio-Rad, Pac 300)에 연결시키고 겔에 일정한 전압(100V)을 가하였다. DNA는 음성 전극으로부터 양성 전극으로까지 이동하며 약 40분 후, DNA 밴드는 자외선광(UV; 306nm)하에 가시화된다.
TAE 아가로오스 겔로부터 DNA의 추출 및 정제
겔로부터 DNA 밴드를 추출하기 전에 초기 단계는 아가로오스 오염원으로부터 DNA를 정제하는데 필요한 물질인 글래스울(glasswool)을 제조하는 것이다. 염격한 유리 장치를 이용하여, 적합한 양의 글래스울(Sigma)을 2 ml 디메틸클로로시탄 및 98 ml의 클로로포름을 함유하는 100 ml 용액에 담구고, 발연 컵보드에서 하룻밤 방치하였다. 그 다음 날, 적셔진 글래스울을 메탄올로 1회, 순수한 물로 3회 세척한 다음 사용하기 전에 블롯-건조시켰다.
건조된 글래스울을 튜브에 넣고, 관심을 두고 있는 DNA 밴드를 확인하고 깨끗한(에탄올로 세척) 외과용 메스를 이용하여 겔로부터 DNA 밴드를 절단해내어 0.5 ml 에펜도르프관에 넣었다. 이들 관의 바닥을 작은 주사기로 구멍을 뚫고 적당량(튜브의 2/3를 덮는)의 실리콘화된 글래스울로 채웠다. 글래스울 및 잘라진 DNA 밴드를 함유하는 0.5 ml 에펜도르프관을 1.5 ml 에펜도르프관에 넣고 6,000 rpm으로 15분간 원심분리시켰다.
이어 0.5 ml 에펜도르프관을 버리고 용출된 DNA를 에탄올로 석출시키고, 0.1 부피(용출된 DNA의 부피에 대하여)의 3M 아세트산나트륨, 2부의 100% 에탄올 및 1 ㎕의 글리코겐을 각 용출된 DNA 용액에 부가하였다. 이 용액을 -70℃에 60분간 또는 4℃에서 철야로 방치시켜 침전을 형성시켰다. 석출된 용액을 14,000 rpm에서 15분간 원심분리시키고, 상층액을 버리며 펠릿을 200 ㎕의 70% 에탄올로 세척하였다. 나중에 얻은 용액을 14,000 rpm에서 5분간 원심분리시고, 그 상층액을 다시 버리며, 펠릿을 실온에서 수 시간 동안 방치하여 건조시켰다. 펠릿이 완전히 건조(에탄올 흔적이 검출되지 않음)되면, 이들을 10 ㎕의 H2O에 재현탁시켰다.
정제된 PCR 산물의 서열결정 분석
정제된 PCR 산물을 서열결정 하기 전에, 재현탁된 샘플에 충분한 양의 DNA(즉 ＞500 ng)가 존재하는지에 대해 결정할 필요가 있다. 이를 위하여, 각 현탁액 2 ㎕ 및 멸균수 98 ㎕를 함유하는 100 ㎕의 스펙(spec) 용액을 제조하고 그의 흡수는 블랭크 샘플에 대한 분광광도계로 측정하였다. DNA 농도는 다음 방정식을 이용하여 산출하였다:
DNA 농도(ng) = O.D x 0.05 x 희석 계수 x 잔류 DNA 용액의 ㎕
적합한 양의 DNA를 갖는 것으로 밝혀진 재현탁액 샘플은, Termination Cycle Sequencing Ready Reaction인 BigDyeTM을 사용하여 디-데옥시 서열분석하며, 이때 분석은 ABI PrismTM377 DNA 서열결정기(Applied BiosystemsTM)상에서 실시한다. 마지막으로, 가능한 다형성을 검출하기 위하여, GeneJockey 프로그램(BIOSOFTR, 영국)으로부터 얻은 뉴클레오티드 멀티-정렬 프로그램을 이용하여, 상기 생성된 서열을 서로 비교하거나 SCCE(수탁번호 AF166330)의 상응하는 서열과 비교한다.
환자 개인 및 대조군 개인의 고용
영국 쉐필드에 있는 피부과 병원으로부터 상기 목적을 위한 20명의 아토피성 습진 환자를 고용하였다. 각 환자는 아토피성 습진의 진단을 확인하기 위하여 개별적으로 숙련된 피부과 의사로부터 검진받았다.
본 연구에 이용된 질병 집단과 인종적으로 일치하는(백인, 북부 영국) 건강한 대조군으로부터 얻은 DNA를 Trent Blood Transfusion service (쉐필드)로부터 헌혈자로 부터 얻었다. 표준 수법에 따라 상기 개인로부터 얻은 전체 혈액으로부터 게놈 DNA를 추출하고 99-웰 마이크로티터 플레이트에 저장하였다. 이때 각 웰은 500 ㎕의 상이한 DNA 용액(100 ng/㎕)을 함유한다.
DNA 분석 및 PCR을 기본한 에세이
검출된 4-bp (AACC) 삽입/결실 다형성의 대립유전자 구별을 위해, 2개의 상이한 프라이머를 고안하며, 1개(I/D R1)는 1개의 AACC 반복으로 구성되며 나머지하나(I/D R2)는 2개의 AACC 반복을 갖는다.
표 B1.2. PCR을 기본한 에세이- 사용한 프라이머 및 조건
프라이머의 제조
2개의 별도의 PCR 반응에서 역방향 프라이머로서 사용된 프라이머는 건조 용액으로 얻었기 때문에, 이들은 사용하기 전에 에탄올 석출시킬 필요가 있다. 각 프라이머를 200 ㎕ TE 완충액에 재현탁시키고 완전히 혼합한 후, 100 ㎕의 프라이머 용액을 1.5 ml 에펜도르프관에 넣었다. 이 에펜도르프관에 10 ㎕ 3M 아세트산나트륨 (pH 4.8) 및 330 ㎕의 100% 에탄올을 부가하고 전체 용액을 -70℃에서 60분간 또는 철야로 방치시켜 석출시켰다. 석출이 완료된 후, 용액을 5분간 마이크로퓨지(microfuge)시키고, 상층액은 버리고 펠릿은 200 ㎕의 70% 에탄올로 세척한다. 후자를 2분간 마이크로퓨지시키고 그 상층액은 버리고 펠릿은 방치하여 건조시켰다. 다음 단계는 펠릿을 100 ㎕의 H2O에 재현탁시키는 것이다. 앞에서와 같이 용액중의 DNA의 흡수를 시험하기 위해 분광분석을 실시한다. μ몰/리터의 프라이머 용액을 산출하기 위해 이하 방정식을 사용하였다.
(O.D260x 희석계수 x 0.033)/몰Wt (프라이머) x 106= μ몰/리터
상기 얻은 값을 20으로 나누면 20 μM 용액으로 되는 프라이머 용액의 희석계수가 된다. 각 역방향 프라이머는 엑손 V에 사용된 것과 동일한 패턴의 PCR 반응 혼합물 및 써모사이클링 조건을 이용하고, 어닐링 온도와 Mg++농도에 관해서는 상기 표 B1.2에 자세하게 나타낸 바와 같이 변형시켜 농도기 표 전체 엑손 V의 증폭에 사용된 정방향 프라이머(F5)와 조합하여 사용된다.
통계학적 분석
질병군 및 대조군을 2 x 3 테이블을 이용하여 비교하였다. 대조군에서, SCCE 대립유전자 I/대립유전자 II 다형성의 대립유전자 분포는 Hardy-Weinberg 평형이다. 투여량 효과의 가능성을 조사하기 위하여, 이형접합체 및 동형접합체에 대한 위험성(Ors)은, 이들 위험성을 택일적 대립유전자에 대한 개별 동형접합성에 대한 위험성과 비교하는 것에 의해, 개별적으로 산출한다.
투여량 효과는, 희소한 대립유전자(대립유전자 II)에 대한 개별 상동접합성에 대한 위험성(ORs)이 동일한 대립유전자에 대한 개별 이형접합성의 위험성보다 더 크면 분명한 것이다. 따라서, 트렌드의 χ2분석을 실시하며 각 유전형 군에서 추정되는 감수성 대립유전자의 수를 세고 피셔(Fisher)의 정확한 p-값을 산출하였다.
실시예 B2. 각질층 키모트립신 효소(SCCE) 다형성과 아토피성 습진과의 관계
인트론 IV 및 엑손 V SNP 다형성의 확인
본 발명자는 SCCE 유전자의 엑손 I 및 V를 돌연변이 또는 다형성이 존재하는지 스크리닝하였다. 이들 다형성을 검출하기 위하여, 적합한 프라이머를 고안하고 이상적인 증폭을 실시하도록 적합한 써모사이클링 조건을 최적화하였다. 엑손 I 및 V에 대한 크기-기대되는 밴드(382 bp 및 800 bp)를 상기 실시예에 기재된 바와 같이 선택하고 정제하며 또 상응하는 서열은 이들의 증폭에 사용된 것과 동일한 프라이머를 사용하여 ABI DNA 서열결정기로부터 얻었다.
GeneJockey 소프트웨어 팩케이지(BIOSOFT, 영국)로부터 구입한 멀티-정렬 프로그램을 이용하여, 본 발명자는 몇 명의 정상인 및 환자로부터 얻은 엑손 V DNA 서열의 정렬을 실시하였다. 그 결과는 다음과 같다.
AE2, KLKex5-3F 및 KLK7ex5AE7/F는 아토피성 습진 환자에 상응하는 반면에,3, 7 및 9는 대조군 개인로부터 얻어 F5 프라이머를 사용하여 서열결정한 것이다. 중요한 뉴클레오티드 차이는 가능한 SNP를 진한 글씨체로 강조한 반면, AACC 삽입 또는 결실은 밑줄그어져 있다.
3 대조군 샘플을 서열결정하는 것에 의해서는 엑손 1에서 SNP가 검출되지 않았다. 정렬시키면 상이한 개인로부터 얻은 SCCE 유전자의 특정 뉴클레오티드 서열 사이에는 현저한 차이가 있음을 보여주는데, 이는 SNP의 존재를 제시한다(하기 표 B2.1 참조). 예컨대, SNP(A→C)는 인트론 IV의 콘센서스 영역의 염기 253에서 발견되었다. 또한 2개의 SNP(G→T 및 A→C)가 엑손 V의 콘센서스 서열의 염기 580 및 607에서 확인되었다. 이들은 모두 SCCE 유전자에 의해 암호화되는 mRNA에서 아미노산 변화를 초래한다.
표 B2.1. SCCE 유전자의 엑손 I 및 V의 SNP의 위치
아토피성 습진 샘플에서 엑손 V AACC 삽입/결실 다형성의 확인
상기 설명한 바와 같은 서열정렬은 아토피성 습진 환자(AE2로 표시)의 SCCE 서열의 엑손 V의 4-bp 반복(AACC)(게놈 위치: 7,634-7,637 bp)이 존재함을 나타내며, 이는 데이터베이스로부터 얻은 SCCE의 서열에 상응한다.
그러나, 상기 반복은 다른 정렬된 서열의 일부에서 검출되지 않는데, 이는 그 서열에 따라서 삽입 또는 결실이 존재함을 의미한다.
도 1은 SCCE 유전자의 엑손 V에 상응하는 AE2 서열의 일부의 크로마토그램을 도시하며, 이것은 삽입/결실을 나타낸다. 대조군 개인으로 부터 얻은 상응하는 크로마토그램은 도 2에 도시한 바와 같다. GGTT로 나타낸 제2 반복(AACC)이 존재하지 않음은 크로마토그램의 서열로부터 분명히 알 수 있다.
사례-대조 연구
본 발명은 1개 반복(AACC) 대립유전자를 갖는 개인과 2개 반복(AACCAACC) 대립유전자를 갖는 개인을 구별하기 위해 특정 프라이머를 사용한 PCR을 기본한 에세이법을 고안하였다. 이들 프라이머는 이들이 DNA 서열과 상보적이도록 고안되었다. 이들 프라이머는 제2 반복(AACC)이 한 개 프라이머에는 존재하지 않는 것을 제외하고는 동일한 서열을 갖는다(상기 실시예 B1 참조).
따라서, 만약 조사중인 샘플의 서열이 1개 반복체를 갖고 있지 않다면, 하이브리드화는 불완전할 것이므로 증폭은 생기지 않을 것이다. 이 경우, 그러한 서열의 증폭은 택일적인 대립유전자(즉, 서열내에 2개의 반복체를 갖는 대립유전자)를 사용하여 발생할 수 있을 것이다. 2개 프라이머를 사용한 증폭은 조사한 샘플에 상응하는 개인이 양쪽 대립유전자에 대해 이형접합성이라는 것을 나타낸다. 단순화하기 위해, 본 발명자는 서열내에 1개 반복체를 갖는 대립유전자인 대립유전자 I 및 2개의 반복체(AACCAACC)를 갖는 대립유전자인 대립유전자 II를 고안하였다.
2개 대립유전자를 구별하는 PCR의 최적화
대립유전자 1(1개 반복체 대립유전자) 및 대립유전자 2(2개 반복체 대립유전자)의 대립유전자 분포를 결정하기 위하여, 본 발명자는 특정 프라이머를 사용한 직접적인 PCR 에세이법을 고안하였다(상기 실시예 B1 참조). 건강한 개인 및 환자를 스크리닝하기 전에, 정확하고 효과적인 결과를 얻기 위해 PRC 조건의 최적화가 필요하다.
제1 최적화
제1 최적화를 위해, 2.5 mM Mg++및 60℃(어닐링 온도)의 특정 조건에서 엑손 V의 써모사이클링 조건하에서 프라이머 F5 및 I/D RII를 사용하였다. 이를 위하여, 10개 DNA 샘플을 연구에 사용하며, 그 하나는 AE2 서열(서열내에 2개의 반복체 대립유전자를 함유하는 것으로 이미 알려짐 - 도 1 참조)이고 9개 대조군 개인(폴리1-9로 표시)은 서열내에 1개 반복체 대립유전자를 함유하는 것으로 밝혀졌다(도 2 참조).
이러한 결과는 샘플 2, 3, 7 및 9에서 증폭이 존재하지 않는 것을 나타낸다. 그러나, 이것은 이들 서열에 2개 반복체가 존재하지 않기 때문이 아니라, 나쁜 DNA 품질 또는 비특이적 PCR 조건 때문일 가능성이 있다. 이러한 가능성을 배제시키기 위하여, 본 발명자는 다른 PCR 반응 세트를 실시하였는데, 이 PCR 반응은 800 bp의 "대조" 증폭 산물, 즉 전체 엑손 5의 증폭 산물을 포함한다(즉, 프라이머 F5 및 R5, 2 mM Mg++및 57℃). 생성한 겔을 도 3에 도시하며, 본 발명자의 앞에서 말한 최적화가 정확하며 대립유전자 구별 결과가 타당했음을 보여준다.
제2 최적화
제2 최적화는 동일한 DNA 샘플, 프라이머 F5 및 I/D RI 및 PCR 조건(2.5 mM Mg++및 61℃)의 사용을 포함한다. 예상되는 바와 같이, AE2 레인에는 아무런 밴드가 없는 반면에, 증폭이 전혀 일어나지 않은 샘플 2, 3, 7 및 9에 대해서는 밴드가 확인되었다. 제2 최적화의 결과는 도 4에 도시되어 있다.
최적화된 조건을 이용한 대조군 및 아토피성 습진 샘플의 유전자형 결정(Genotyping)
양쪽 프라이머에 대한 상술한 최적화된 조건을 이용한 직접적인 PCR법을 이용하여, 본 발명자는 SCCE 유전자의 2개의 구별되는 대립유전자의 대립유전자 분포를 밝히기 위해 건강한 샘플 및 아토피성 습진 샘플을 스크리닝하였다.
대조군 밴드가 존재하는 반응의 결과를 실제 스크리닝 결과와 함께 하기 표 B2.2에 나타낸다.
표 B2.2. 아토피성 습진 및 대조군에서 SCCE AACC/AACCAACC 다형성의 대립유전자 분포.
통계학적 분석
아토피성 습진 및 대조군에서 SCCE AACC/AACCAACC 다형성의 대립유전자 분포는 상기 표 B2.2에 나타낸다. 대조군에 대조적으로 환자군에서는 희소한 대립유전자(대립유전자 2)의 대립유전자 빈도가 현저히 증가하였다. 대조군에서 희소한 대립유전자 (빈도 = 0.43)은 질병에 걸린 군에서는 더 흔히 있는 대립유전자(빈도 = 0.75)이다. 이러한 다형에 대해 투여량 효과가 분명하기 때문에, 희소한 대립유전자에 대한 위험성(ORs)은 이형접합성의 위험성 보다 훨씬 더 크다. 따라서 χ2시험을 실시하였다. SCCE-대립유전자 II 변이체 및 아토피성 습진 사이에는 강한 연관이 발견되었다[p=0.0104, OR = 7.00 (9% 신뢰 간격 (1.74, 28.17))].
결론
본 발명은 AACCAACC 삽입을 갖는 SCCE 대립유전자가 환자 그룹에서 더 흔하다는 것을 나타낸다. 80%의 습진환자는 1 또는 2개의 SCCE AACCAACC 대립유전자를 갖고 있고 70%가 이 대립유전자에 대해 이형접합체이며 오직 25%가 상기 대립유전자에 대해 상동접합체이다. AACCAACC를 포함하는 SCCE 대립유전자는 습진과 관련이 있다는 것을 나타내었다.
본 발명은 3'UTR에서의 삽입이 mRNA의 안정성에 대하여 강한 효과를 갖는다는 것을 나타낸다. 따라서 SCCE의 생성양이 변화되면 코르네오데스모솜 단백질분해 과정에 영향을 준다. 이것은 피부 장벽 항상성을 손상시켜 습진에 의한 임상적 표현형을 초래한다.
SCCE 삽입은 민감한 피부(예컨대 습진)를 갖는 환자를 진단하는데 이용될 수 있다. 이러한 진단은 치료처리에도 아주 유용하다. 예컨대, 삽입이 SCCE 단백질생성 감소와 관련되면, 상기 치료는 SCCE 생리학적 농도를 증가시키는데 집중한다(예컨대, SLPI의 억제 또는 피부에 대한 약제학적 로션에 SCCE의 사용). 그러나, SCCE 유전자의 삽입이 피부에서 SCCE 농도 증가와 관련되면, 치료는 피부에 바를 로션에서 SLPI 및/또는 SLPI 펩티드 및/또는 SCCE 항체를 적용하는 것에 의해 SCCE의 내생 농도롤 감소시키는데 집중된다.
따라서 본 발명은 개인의 SCCE 핵산에서 AACCAACC 서열의 존재를 검출하는 것에 의해, 개인에서 그룹 I 질병 또는 그룹 I 질병에 대한 감수성(바람직하게는 습진 또는 아토피성 습진과 같은 습진에 대한 감수성)을 진단하는 방법을 개시한다. 본 발명은 또한 SCCE 게놈 서열(GB: AF166330)에서 위치 7634-7637에 상응하는 위치에서 AACC 서열을 검출하는 것에 의해 상기와 같은 진단을 실시하는 것을 개시한다. 바람직하게는, 진단은 개인의 mRNA 또는 게놈 DNA상에서 실시할 수 있다. 바람직하게는, AACC 서열은 SCCE 게놈 서열(GB: AF166330)의 위치 7634-7637에서 검출된다.
특정 위치에서 AACCAACC의 부재의 검출은 그룹 II 질병, 바람직하게는 건선 및/또는 여드름에 대한 감수성을 진단 또는 검출하는데 이용될 수 있다.
실시예 B3. 분비성 류코프로테아제 억제제(SLPI) 다형성의 확인
SLPI의 프로모터에서 돌연변이의 검출
본 발명은 TATA 시그널, CAAT 시그널 및 2개의 CRE-유사 서열을 포함하는 SLPI의 프로모터 영역의 약 1500 bp를 스크리닝하였다.
상이한 민족에 속하고 피부질병의 병력이 없는 사람으로부터 10개 샘플을 얻고, 아토피성 습진, 심상성좌창 및 심상성건선의 각 환자로부터 10개 샘플을 얻었다. 이들 샘플 각각을 적합한 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 스크리닝하였다. 먼저, SLPI 프로모터 서열(Gene Bank 수탁번호; M74444)은 조절요소에 대해 스크리닝하였다. 2개의 CRE(시클릭 AMP 반응 요소)-유사 서열이 발견되었다. 시클릭 AMP 반응 요소(CRE)는 NF-IL6 및 CREB(Tsukada 등, 1994)와 같은 전사요소에 의해 인식된다. CRE에서의 돌연변이점은 IL1-베타 자극을 현저하게 감소시킨다(Potter 등, 2000). SPLI는 IL-1 베타 및 TNF-알파 모두에 의해 상향조절된다는 것이 밝혀졌다(Tanaka 등, 2000, 본 연구에서 치료부분 참조).
TATA 시그널(-27/-21), CAAT 시그널(-87/-83)(아베 등, 1991에 의해 보고) 및 2개의 CRE-유사 1(ttgctgtca; -907/-898) 및 CRE-유사 2(tacgtacgtca; -1157/-1146) 서열을 함유하는 SLPI 프로모터 영역 주위를 스크리닝하였다. 전사 개시점 위치(+1; 서열중 위치 1374에 있는 C)를 기준으로 위치번호가 정해졌다. SLPI의 프로모터 영역의 서열을 이하에 나타낸다:
CRE-유사 위치는 진하게 표시한다. TATA-박스 및 ATG는 밑줄이 그어져 있다.
PCR 조건은 다음과 같다: 94℃/3분 1주기; 94℃/30초 45주기; 어닐링 온도/30초; 72℃/45초; 72℃/10분 1주기; 이후 계속 4℃. PCR에 사용된 프라이머는 하기 표 B3.1에 나타낸다.
표 B3.1
SLPI 프로모터의 각 단편을 증폭하기 위한 최적화된 Mg2+농도 및 어닐링 온도는 하기 표 B3.2에 나타낸다.
표 B3.2
PCR 스크리닝 과정을 이용하여, 본 발명은 하기 표 B3.3에 나타낸 바와 같은 SLPI에서의 돌연변이를 확인하였다.
표B3.3. 인간의 SLPI 서열에서의 돌연변이. 다형성 위치는 밑줄 그어져 있다.**-이들은 사용된 제2 PCR 단편으로부터 얻은 것이다.***- 부록 B에 있는 참고문헌 참조.
다양한 다형성 및 확인된 대립유전자 사이의 질병 관계는 하기 표 B3.4에 나타낸다.
표B3.4. SLPI에서 질병관계. 없음: 대립유전자가 동일한 빈도로 존재함. 블랭크: 그 카테고리의 샘플이 상기 위치에 존재하지 않음.***- 그 대립유전자만이 그 위치와 샘플 세트에 존재함.
질병 진단을 위한 SLPI 다형성의 검출
본 발명은 상기 표 B3.4에 나타낸 SLPI에서 다형성을 검출하는 것에 의해, 질병, 바람직하게는 감염성 피부 질병을 진단하는 방법을 제공한다.
특히, 본 발명은 하기 표 B3.5에 나타낸 바와 같은 SLPI에서의 다형성을 검출하는 것에 의해 질병, 바람직하게는 감염성 피부질병을 진단하는 방법을 제공한다:
표 B3.5
다음 세 개의 하부 영역에서, 위치 번호는 수탁번호 M74444 또는 부록 B에 있는 SLPI 서열에 있는 번호를 참조한 것이다.
여드름의 진단
특히, 본 발명은 SLPI의 위치 1300에서 G 잔기의 존재 또는 SLPI의 위치 1418에서 C 잔기의 존재 또는 이들 모두를 검출하는 것을 포함하는, 개인에서 그룹 II 질병, 바람직하게는 여드름을 진단하는 방법을 개시한다.
건선의 진단
본 발명은 SLPI의 위치 291에서 G 잔기의 존재; SLPI의 위치 292/293에서 G 잔기의 부재; SLPI의 위치 1325에서 G 잔기의 존재, SLPI의 위치 1418에서 C 잔기의 존재로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 다형성의 존재를 검출하는 것을 포함하는, 개인에서 그룹 II 질병, 바람직하게는 건선을 진단하는 방법을 개시한다.
습진의 진단
본 발명은 SLPI의 위치 280에서 T 잔기의 존재; SLPI의 위치 292/293에서 G 잔기의 존재; SLPI의 위치 1235/1236에서 C 잔기의 존재; SLPI의 위치 1384/1385에서 C 또는 A 잔기의 부재로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 다형성의 존재를 검출하는 것을 포함하는, 개인에서 그룹 I 질병, 바람직하게는 습진을 진단하는 방법을 개시한다.
실시예 B4. 시스타틴 A (CSTA) 프로모터 다형성의 확인
시스타틴 A (CSTA)는 염색체좌 3q21에 위치하는 각질층에서 표현된 시스테인 단백질분해효소 억제제이다. 이 영역은 건선, 아토피성 피부염 및 기타 자동면역 질병의 감수성좌(위치)를 함유한다(Cookson 등, 2001, Lee 등, 2000, Becker 등, 1998).
인간 시스타틴 A의 프로모터에서 돌연변이의 검출
본 발명은 상이한 민족군이며 피부 질병의 병력이 없는 사람으로부터 취한 10개 샘플, 각기 아토피성 습진, 심상성좌창 및 심상성 건선 환자로부터 취한 10개 샘플에서 TATA 시그널 및 CAAT 서열을 포함하는 시스타틴 A (CSTA)의 프모모터 영역의 500-1000 bp를 스크리닝하였다.
PCR 조건은 다음과 같다: 94℃/3분 1주기; 94℃/30초 45주기; 어닐링 온도/30초; 72℃/45초; 72℃/10분 1주기; 이후 계속 4℃. PCR에 사용된 프라이머는 하기 표 B4.1에 나타낸다.
4개 영역 각각을 증폭하기 위해 최적화된 Mg2+농도 및 어닐링 온도는 하기 표 B4.2에 나타낸다.
PCR 스크리닝 과정을 이용하여, 본 발명은 하기 표 B4.3에 나타낸 바와 같은 인간의 시스타틴 A 영역에서 돌연변이를 확인하였다.
표 B4.3. 인간의 시스타틴 A 서열에서의 돌연변이.**- 이 표에 주어진 위치는 위치 1로서 엑손 1의 5'말단을 이용한다. 모든 다른 위치는 이에 대한 상대적인 값이다.
인트론 1의 5' 및 3' 부분 사이의 공개된 서열에는 갭이 존재하므로, 2개의 시스타틴 A 서열, CystA.1 및 CystA.2를 참조하여 뉴클레오티드 서열 번호를 붙인다. 서열 CystA.2, 위치 1은 인트론 1의 공개된 3' 부분의 개시부위이다. 위치 번호부여에 이용된 서열은 세미콜론 앞에 "1"(CystA.1의 경우) 또는 "2"(CystA.2의경우)로 표시한다. 따라서, 예컨대 "2;2246"은 CystA.2의 서열에서 위치 2446을 나타낸다. CystA.1 및 CystA.2에 대한 참조서열은 하기 부록 A에 나타낸다.
확인된 다양한 다형성 및 대립유전자 사이의 질병관계는 하기 표 B4.4에 나타낸다.
표 B4.4. 시스타틴 A 대립유전자에서 질병관계. 없음: 대립유전자가 동일 빈도로 존재함. 블랭크: 그 카테고리의 샘플이 그 위치에서는 존재하지 않음.***- 이 대립유전자만이 그 위치 및 그 샘플세트에 존재함.
** 표에 주어진 위치들은 위치 1로서 엑손 1의 5' 단부를 이용한다. 다른 모든 위치들은 이 위치에 상대적이다. 인트론 1의 5'와 3' 섹션들 사이의 공개 서열은 두개의 시스타틴 A 서열인 CystA.1과 CystA.w를 기준으로 만들어졌다. 서열 CystA.2의 위치 1은 공개된 인트론 1의 3' 섹션의 시작부에 있다. 위치 넘버링에 사용된 서열은 (CystA.1에 대해) "1"로 또는 (CystA.2에 대해) "2"로 세미콜론 앞에 표시된다. 따라서, 예컨대 "2:2446"은 CystA.2)의 서열에서 위치 2446를 의미한다. CystA.1과 CystA.2의 기준서열은 이하의 첨부 A에 나타난다.
질병 진단을 위한 시스타틴 A 다형성 검출
표 B4.4에서 확인된 시스타틴 A의 다형성의 검출에 의한 질병 진단법, 바람직하게는 염증성 피부질환의 진단법이 제공된다.
여드름의 진단
특히, 그룹 II 질병, 바람직하게는 개개인의 여드름의 진단법으로서, CystA.1의 위치 110에서 G 잔기의 존재, CystA.1의 위치 96에서 C 잔기의 존재, CystA.1의 위치 71에서 A 잔기의 존재, CystA.1의 위치 20에서 G 잔기의 존재, CystA.1의 위치 17에서 T 잔기의 존재, CystA.1의 위치 13에서 C 잔기의 존재, CystA.1의 위치 10에서 T 잔기의 존재, CystA.1의 위치 8에서 T 잔기의 존재로 이루어지는 군으로부터 선택된 임의의 다형성들을 검출하는 방법을 개시한다.
또, 그룹 II 질병, 바람직하게는 개개인의 여드름의 진단법으로서, CystA.1의 위치 73에서 G 잔기의 부재, CystA.1의 위치 76, 77에서 TG의 부재, CystA.1의 위치 6에서 C 잔기의 부재로 이루어지는 군으로부터 선택된 임의의 다형성들을 검출하는 방법을 개시한다.
이들 두가지 진단법을 결합할 수도 있다.
건선의 진단
그룹 II 질병, 바람직하게는 개개인의 건선의 진단법으로서, CystA.1의 위치 270에서 G 잔기의 부재, CystA.1의 위치 73에서 G 잔기의 존재, CystA.1의 위치 15에서 C 잔기의 부재, CystA.1의 위치 6에서 C 잔기의 부재, CystA.1의 위치 4에서 G 잔기의 부재, CystA.1의 위치 7에서 G 잔기의 부재로 이루어지는 군으로부터 선택된 임의의 다형성들을 검출하는 방법을 개시한다.
습진의 진단
그룹 I 질병, 바람직하게는 개개인의 습진, 더 바람직하게는 아토피성 습진진단법으로서, CystA.1의 위치 120과 121에서 AC의 부재, CystA.1의 위치 110에서 G 잔기의 부재, CystA.1의 위치 85에서 t 잔기의 존재, CystA.1의 위치 73에서 G 잔기의 존재, CystA.1의 위치 72에서 A 잔기의 부재, CystA.1의 위치 60에서 T의 부재, CystA.1의 위치 15에서 C의 부재, CystA.1의 위치 14에서 A 잔기의 부재, CystA.1의 위치 13에서 C 잔기의 부재, CystA.1의 위치 6에서 C 잔기의 부재, CystA.1의 위치 5에서 T 잔기의 부재, CystA.1의 위치 4에서 G 잔기의 부재, CystA.1의 위치 7에서 G 잔기의 부재로 이루어지는 군으로부터 선택된 임의의 다형성들을 검출하는 방법을 개시한다.
실시예 B5. 시스타틴 A(CSTA) 암호서열의 확인
다형성
인간 시스타틴 A의 암호서열에서 돌연변이 검출
시스타틴 A 암호서열은 전술한 바와 같이 다형성을 위한 PCR을 이용해 스크린된다. 확인된 다형성들이 표 B4.3, B4.4에 나타나있다.
실시예 B6. 프로모터(promoter) 활동 분석
엑슨 1 서열을 이용해 인간 유전자 데이타베이스를 조사하여 RPl1-299J3 클론(AC083798)에서 CSTA 프로모터 영역을 확인한다. 이 서열에서 잠재적인 TATA, CAAT 신호를 확인한다. 이들 신호는 아래의 CSTA 5' 서열에서 굵은체로 표시된다.
프로모터 서열에는 4개의 규칙적인 영역들이 위치하는데, 3개의 TPA 반응요소(TRE-1, TRE-2, TRE-3)과 하나의 Ap-2 사이트이다. TPA나 12-O-테트라디카놀포볼-13-아세테이트는 효과적인 단백질 키나제 C 활성제이고 AP-2는 인핸서-결합 단백질이다.
CSTS의 5' 영역
프로모터 영역 1
조절샘플과 환자의 CSTA의 프로모터 영역 1의 서열을 아래와 같이 정렬
위의 정렬에서, TRE-1, TRE-2 서열들에 밑줄을 그었고, *는 돌연변이 위치를 표시한다. Cstaconr은 GB AC083798 서열로부터의 서열이다. Cstape2f, cstape1rf, cstape8f는 습진환자의 서열이다. Cstapp6f, cstapp8f는 건선환자의 서열이다.
프로모터 영역 2
조절샘플과 환자의 CSTA의 프로모터 영역 2의 서열을 아래와 같이 정렬.
위의 정렬에서 AP-2 서열을 밑줄표시하고, *는 돌연변이 위치를 나타낸다. cstappoly7r, cstapolyp3r, cstappoly4r, cstappoly6r은 서로 다른 인종군의 서열이다. cstaconr은 GenBank AC083798 서열로부터의 서열이다. cstapa2r, cstapa1r은 여드름 환자의 서열이다. cstapp7r, cstapp6r, cstapp4r은 건선환자의 서열이다.
시스타틴 A의 프로모터 영역에는 환자에게만 존재하고 조절샘플에는 없는 돌연변이 지점들이 여러개 있다. 여드름과 건선 샘플들은 프로모터 서열에서 가장 큰변화를 보이므로; 이 영역은 정상인과 비교해 환자에게는 변동이 있다. 여드름(cstapa3f)과 건선(cstape8) 환자들의 시스타틴 A 프로모터의 TRE-2 영역에 G의 삽입이 있어, 비정상 장벽을 갖는 질병(예; 여드름, 건선)에서는 CSTA 프로모터 활동이 변한다.
따라서, 본 발명자들은 질병, 바람직하게는 피부질환, 더 바람직하게는 염증성 피부질환의 진단법으로서, 시스타틴 A 핵산의 TRE-2 영역의 G 잔기의 존재를 검출하는 진단법을 제공한다.
프로모터 활동
다음 실험을 실시하여 시스타틴 A의 발현시 이들 프로모터와 암호 서열 다형성의 영향을 확인한다.
PCR 클론화 전략
본 발명자들은 프로모터 영역에서 두개의 프라이머인 정방향 5'GCTTCCTCCATATCTGTA3'과 역방향 5'AGATAAGCCTCCAGGTATC3'를 디자인했고, 정상인(cstappoly4r, cstappoly3r, cstappoly7r)과 습진환자(cstape8f, cstape5r, cstape7r)의 DNA를 사용해 PCR을 실시했다. 클론화 전략은 1998년 다카하시 일행이 설명한 것과 비슷하다. PCR 제품들은 PCR™2.1 vector(캘리포니아 산디에고시의 Invitrogen)으로 아클론화되고, 재조합 플라스미드의 HindIII/XbaI-digested fragments가 프로모터가 없는 0-CAT 플라스미드에 삽입된다.
5㎍의 Fragments-CAT 플라스미드들을 이용해 Lipofectin을 이용한 리포좀 방법으로 105SVHK 세포들을 트랜스펙트한다. 48시간 뒤, 세포들을 모아 CAT 분석을 실시했다.
결과
그 결과가 도 5에 도시되었다.
조절 프로모터와 비교해 습진환자의 시스타틴 프로머터의 활동은 상당히 감소되었다(도 5 참조). 그 결과, 피부장벽 항상성에 CSTA가 포함되었다고 추측된다. CSTA는 결함피부장벽(예; 습진)을 갖는 질병에서 하향조절된다. CSTA의 상향조절은 상피세포들 사이의 접착력 증가를 가져온다. 이렇게 되면, CSTA가 피부장벽이 커진 질병에 포함될 수도 있다고 본다.
따라서, CSTA의 프로모터 영역에서의 돌연변이의 검출을 비정상 피부장벽(예; 습진이나 I군에 속한 질병)을 갖는 환자의 진단에 활용한다. 이 진단법은 적당한 치료를 확인하기 위한 중요한 단계이다. 예컨대 습진환자에게 돌연변이(TRE-2 서열 TGGATGCA에 G 삽입)가 검출되면, CSTA가 아주 약한 활성을 갖고 환자의 피부에 CSTA의 억제활성을 모방하는 펩티드의 조합을 적용하면 이 경우 가장 적절한 치료가 될 것이다.
실시예 C: 단백질분해 프로필/데스모솜형 및 코르네오데스모솜형 단백질의 프로테아제 매개 성숙
실시예 C1. 재조합 SCTE 생산
SCTE(Stratum Corneum Tryptic Enzyme)를 클론화하고 활성 형태로 발현시켜전체 효소활성을 갖도록 한다.
사용된 발현벡터
고도로 단백질 구현을 달성하기 위해 그리고 정제를 할 수 있도록 서로 다른 벡터시스템을 이용해 발현을 달성했다. 3개의 벡터 시스템들을 이용했다.
곤충 세포시스템: 말단부에 His-Tag가 없음; 해독틀에 따라, Invitrogen 벡터-pMT/V5-HisA, B, 또는 C를 이용한다. S2 곤충(Drosophila) 세포에서의 발현; Hansson 일행에 개시된 것과 같은 정제(1994).
레트로바이러스(retroviral) 시스템; Clontech 레트로바이러스 벡터(pLNCX2) 단백질이 마우스 유암세포에서 발현되고 Hansson 일행에 개시된 것과 같이 정제된다(1994).
pcDNA3.1 시스템; C-말단부에 His-Tag; Invitrogen 벡터(3개의 ORF를 갖는 pcDNA3.1)를 사용. 단백질의 발현은 COS-7 세포(아프리카 녹색원숭이 신장세포). 역전사-폴리머라제 사슬 반응(RT-PCR).
개방된 해독틀을 덮는 PCR 프라이머가 수동으로, 즉 SCTE 서열(GB:AF168768)을 이용한 관찰로 고안된다. 모든 프라이머들은 Invitrogen에서 구입된다.
정방향(5'에서 3'으로): GGA AAT CAG GTG CAG CG
역방향(5'에서 3'으로); GAT GAC TCA GGA GTT GGC
인간의 표피의 전체 RNA는 Applied Biosystems Gold RNA PCR 키트로 cDNA에 역전사된다. RT 사이클은 25℃에서 10분동안의 잡종번식을 포함한다. PCR은 2.0mMMg2+를 갖는 Applied Biosystems Gold Taq Polymerase를 이용해 40 사이클로 실시했다. 각각의 PCR 사이클은 10분의 변성동안 95℃에서 Taq 활성화: 30초동안 94도에서 어닐링: 1분동안 58.8도에서 연신: 20초동안 72도에서 어닐링/연신: 7분동안 72도에서 어닐링/연신으로 구성된다.
PCR 증폭은 1.5% 한천겔에서 확인된다. PCR 산물은 Stratagene Strataprep PCR 정제키트를 이용해 다른 PCR 혼합 조성물로부터 정제된다. 정제된 SCTE PCR 산물은 제한효소 PCR Resriction Enzyme Site Flanked PCR용의 주형으로 사용된다.
곤충세포 벡터 pMT/V5-His (Introgen, Cat#K4120-20)은 클론용으로 선택된다. 이 벡터는 3개의 해독틀 A, B, C에서 얻을 수 있다. 각각의 해독틀로 인해, C-말단부 펩티드의 발현과 함께 클론이 촉진된다. SCTE DNA 곤충의 개시코돈에 대해 올바른 해독틀을 선택한다.
벡터의 다중 클론 사이트 둘레에서 SCTE 개시코돈과 같이 해독틀에 있는 제한효소(RE) 사이트들이 선택된다. SCTE DNA 서열은 NIH 웹사이트(www.nih.go.jp/~jun/research/anal.html)에서 찾을 수 있는 Webcutter 프로그램을 이용해 제한효소 사이트의 존재를 위해 스크린된다. SCTE 서열에서는 볼 수 없지만 벡터에서는 볼 수 있는 이들 제한효소 사이트들은 잠재적으로 사용할 수 있다.
SCTE 개시코돈은 pMT/V5-HisC 벡터와 같이 해독틀에 있는 것으로 발견된다. Kpn1이 개시코돈에서 첫번째 제한효소로 선택된다. Not1은 정지코돈 뒤의 두번째프라이머로 선택된다. Kpn1과 Not1 측면에 위치하는 SCTE PCR 산물을 생성하도록 정방향 및 역방향 SCTE PCR 프라이머들에 제한효소 사이트들이 병합된다. 이들 사이트로 인해 이 서열을 벡터에 삽입할 수 있다:
SCTE 정방향 제한효소 프라이머(5'에서 3'으로)
ATTAGTA-GGGTAG-ATGGCTACAGCAAGACCC
랜덤 서열-Kpn1 제한효소 서열-SCTE 개시코돈 서열
SCTE 정방향 RE 프라이머(5'에서 3'으로)
ATTAGTA GGTACC ATGGCTACAGCAAGACCC
랜덤 서열 Kpn1 RE 서열 SCTE 개시코돈 서열
SCTE 역방향 RE 프라이머(3'에서 5'로)
1) TCCAGGCCAACTC CTGA GCGGCCGC ATATTA
2) SCTE 정지코돈 서열 Not1 RE 서열 랜덤 서열
SCTE 역방향 RE 프라이머(5'에서 3'으로)(보충)
TAATATGCGGC CGCTCAGGAG TTGGCCTGGA
표준 프라이머 PCR의 SCTE PCR 산물은 제한효소-프라이머 PCR의 주형으로 사용된다. PCR 상태는 57도 내지 67도 사이의 임의의 어닐링 온도에서 2.5mM Mg2+이다. SCTE-제한효소 PCR 산물은 제조업자 추천 프로토콜(Promega)에 따른 대응 제한효소(Kpn1, Not1)와 같이 소화된다. 소화된 SCTE-제한효소 PCR 산물은 한천겔 전기영동에 의해 제한효소 혼합물로부터 정제되고, DNA는 Qiagen QiaexII 한천겔 추출키트를 이용해 한천겔로부터 정제된다. SCTE 삽입은 이제 준비된 벡터에 대한 결찰용으로 준비된다.
PMT/V5-HisC 벡터 증식 및 제한효소 소화
pMT/V5-HisC 벡터는 Invitrogen TOP10 화학개질 E.Coli 세포(Invitrogen, Cat #4040-10)에서 증식된다. 그 프로토콜은 TOP10 정보책자에 기재되어 있는바: 1㎕의 벡터를 TOP10 세포가 담긴 병에 첨가한다(이 세포는 해동되었다). 다음, 부드럽게 혼합한다. 얼음에서 5분 내지 30분동안 배양한다. 42도에서 30초 동안 흔들지 않고 세포를 가열한다. 바로 냉동한다. 다음, 실온의 SOC 완충액 250㎕를 첨가한다. 튜브를 단단히 밀봉하고 1시간동안 37도에서 수평으로 흔든다. 형질전환주 혼합물 50㎕를 새로운 한천배지에 골고루 뿌려준 다음 밤새도록 37도에서 배양한다. 하나의 군체를 집어내서 암피실린-LB를 접종하는데 사용했고, 그 배양체를 37도로 밤새 배양했다. 글리세롤 스톡은 이 배양체로 만들어진다. 증식된 pMT/V5-HisC 벡터는 제조업자가 추천한 프로토콜에 따라 Qiagen DNA Mini-Prep 키트를 이용해 박테리아로부터 정제된다.
정제된 벡터는 SCTE-제한효소 PCR 산물처럼 Kpn1과 Not1으로 소화된다. 소화된 벡터 역시 한천겔 전기영동에 의해 제한효소 혼합물로부터 정제되고, DNA는 Qiagen QiaExII 한천겔 추출키트를 이용해 한천겔로부터 정제된다. 이 벡터는 이제 준비된 SCTE 삽입에 대한 결찰용으로 준비된다.
pMT/V5-HisC 및 SCTE 벡터 결찰
SCTE는 효소 T4-DNA 리가제(Gibco, Cat#15224-017)을 이용해 pMT/V5-HisC 벡터에 결찰된다. 결찰은 다음 프로토콜에 따라 DNA 삽입물:벡터가 5:1의 비율로 실행되었는바: DNA리가제(1 U/㎕) 1㎕, 2x 결찰 완충액 4㎕, SCTE 삽입물(X ㎍/㎕), pMT 벡터(20㎕이하). 결찰반응은 16도에서 밤새도록 배양되었다( 16도의 얼음물에 띄운채). 결찰반응은 0.7% 한천겔로 평가했다(결찰되지 않은 조절샘플과 비교). 성분 E-Coli 세포들은 결찰된 SCTE/벡터 구성물과 함께 증식용으로 변환되었다.
E-Coli 세포의 증식으로 TOP10 세포들은 제조업자의 프로토콜에 따라 구성과 함께 변환된다. 변환된 세포들은 암피실린-한천배지로 뿌려지고 밤새도록 37도에서 배양되었다. 하나의 군체를 이용해 암피실린-LB를 접종했고, 배양체를 밤새도록 37도에서 배양했다. 글리세롤 스톡은 이 배양체로 만들어졌다. 이 구성물은 Qiagen DNA Mini-Prep 키트를 이용해 정제된다.
S2 곤충세포의 지질 트랜스펙션
S2 곤충세포(드로소필라, Invitrogen의 Cat #R690-07)를 제조업자의 지시대로 태아장딴지 혈청과 페니실린-스트렙토마이신으로 보충된 DES(Drosophila Expression Medium, Cat #Q500-01)에서 배양했다. Cellfectin(Invitrogen, Cat #10362-010)을 이용해 트랜스펙션을 실행하고, 다시 제조업자의 프로토콜에 따라 리포좀을 형성했다.
SCTE 단백질 발현의 유도/안정된 세포계 형성
pMT/V5-HisC 벡터는 금속유도성(유산동으로 유도) 프로모터, MT(metallothionein)를 갖는데, 이로인해 표적유전자를 S2 세포에 고도로 발현할 수 있다. 세포내의 단백질 발현은 유산동으로 유도되고, 500㎛의 최종농도에 첨가된다. 이 세포들을 하루 내지 4일동안 배양한 다음, 유도하고, 수확/저장하여 더 분석했다. 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(PAGE) 분석법으로 유도된 세포와 유도되지 않은 세포의 전체 단백질을 비교해 재조합 단백질 발현이 일어났는지의 여부를 판단했다.
안정된 세포계 형성
SCTE 단백질이 S2 세포에서 발현되었음을 보여준 뒤, 안정된 세포계를 형성해 발현을 확장한다. 이들 세포는 블라스티시딘을 생성하고, 이것은 원핵 및 진핵 시스템에서 단백질 번역 억제제이다. 블라스티시딘에 대한 저항은 SCTE/pMT/V5-HisC 구성과 pCoBlast 선택벡터(Invitroen, Cat#1K5150-01)이 같이 S2 세포로 트랜스펙션된 뒤에 생긴다. 이 프로토콜은 DES(Drosophila expression system) 매뉴얼에서 볼 수 있으며, 이 매뉴얼에는 모든 DES 시약이 첨부되어 있다. 블라스티시딘(25㎍/㎖)을 이용해 안정된 트랜스펙션을 선택했다.
단백질 발현의 스케일업
대형 플라스크를 이용해 단백질 정제를 하기 위해 발현을 스케일업한다. S2 세포가 동봉된 Invitrogen 매뉴얼에는 이를 위한 상세사항이 있다. FPLC로 정제를 실행한다. 다른 단편들을 모아 재조합 단백질의 존재를 분석한다.
실시예 C2. 재조합 SCCE의 생성
SCCE(Stratum Corneum Chymotryptic Enzyme)가 클론화되고, 전체 효소활성을 갖도록 활성 형태로 발현된다.
역전사-폴리머라제 사슬반응(RT-PCR)
개방 해독틀을 덮는 PCR 프라이머를 수동으로, 즉 SCCE 서열(GB:NM005046)을 이용한 관찰로 고안한다. 모든 프라이머들은 Invitrogen에서 구입된다.
정방향(5'에서 3'으로): CGG GCT CCA TGG CAA GAT C
역방향(5'에서 3'으로): GCG TCC TCA CTC CTG TGC
인간의 표피의 전체 RNA는 Applied Biosystems Gold RNA PCR 키트로 cDNA로 역전사된다. RT 사이클은 전술한 바와 같이 SCTE용으로서, 2.0mM Mg2+를 이용하고 40 사이클이며, PCR 사이클은 전술한 바와같이 SCTE용이지만, 어닐링은 60도에서 1분동안 했다.
PCR 측면의 재조합 효소사이트
올바른 해독틀과 다중 클론사이트 둘레의 제한효소 사이트들을 SCCE DNA 삽입체의 개시코돈에 대해 선택한다. SCCE DNA 서열은 Webcutter 프로그램을 이용해 제한효소 사이트의 존재를 위해 스크린되고, 제한효소 사이트들은 전술한 바와 같이 선택된다. SCCE 개시코돈은 pMT/V5-HisA 와 같이 해독틀에 있음이 발견되었다. EcoR1은 개시코돈에서 첫번째 제한효소로 선택되고, Xho1은 정지코돈 이후 두번째 프라이머로 선택된다.
제한효소 사이트들은 정역 SCCE PCR 프라이머들에 병합되어 EcoR1rhk Xho1 측면의 SCCE PCR 산물을 생성한다. 이들 사이트때문에 서열을 벡터에 삽입하 수 있다:
SCCE 정방향 제한효소 프라이머(5'에서 3'으로).
GCC AGC-GAA TTC-ATGCA AGA TCC CT CTC
랜덤 서열-EcoR1 제한효소 서열-SCCE 개시코돈 서열
SCCE 역방향 제한효소 프라이머(5'에서 3'으로)
ATGAAAAAGCATCGCTAA-CTCGAG-AGCACT
SCCE 정지코돈 서열-Xho1 제한효소 서열-랜덤 서열
SCCE 역방향 제한효소 프라이머(5'에서 3'으로)(보충)
AGTGCTCTCG AGTTAGCGAT GCTTTTCAT
표준 프라이머 PCR의 SCCE PCR 산물은 제한효소-프라이머 PCR의 주형으로 사용된다. PCR 상태는 62도의 어닐링 온도에서 2.0mM Mg2+이다. SCCE-제한효소 PCR 산물은 제조업자 추천 프로토콜(Promega)에 따른 대응 제한효소(EcoR1, Xho1)와 같이 소화된다. 소화된 SCCE-제한효소 PCR 산물은 한천겔 전기영동에 의해 제한효소 혼합물로부터 정제되고, DNA는 Qiagen QiaexII 한천겔 추출키트를 이용해 한천겔로부터 정제된다. SCCE 삽입은 이제 준비된 pMT/V5-HisA 벡터에 대한 결찰용으로 준비된다.
대형 플라스크를 이용해 단백질 정제를 하기 위해 발현을 스케일업한다. S2 세포가 동봉된 Invitrogen 매뉴얼에는 이를 위한 상세사항이 있다. FPLC로 정제를 실행한다. 다른 단편들을 모아 재조합 단백질의 존재를 분석한다. SCCE의 발현과 정제에 대한 더이상의 자세한 사항은 Hansson 일행이 설명했는바(1994, J.Biol. Chem. 269(30), 19420-19426), 여기서는 프로테아제 효소 SCCE의 정제를 설명한다.
실시예 C3. 재조합 SCCE 및 SCTE로 접착단백질 분열
재조합 ProSCCE가 생산되어 전술한 바와 같이 정제된다. 재조합 ProSCCE는 한천-경계 트립신으로 활성화되고, 이에 대해서는 Basttsand & Egelrud(1999)에 설명되어 있다.
지연제(TENP-40 완충 추출물)의 존재하에 인간 표피에서 단백질을 추출하고 4시간 동안 37도에서 활성 SCCE와 같이 배양한다. 라엠리의 샘플 완충액을 첨가한 뒤 2분동안 끓여 반응을 정지시킨다. 이 단백질은 코르네오데스모솜 단백질에 대한 항체와 함께 면역블로트된다.
SCCE에 의한 접착단백질의 분열
재조합 SCCE는 접착단백질, 특히 코르네오데스모신, 플라코글로빈, 데스모글레인, 데스모플라킨, 엔보플라킨, 데스모콜린을 분열시킬 수 있음을 본 실시예로 알 수 있다. 따라서, 이들 접착단백질은 프로테아제의 기질이다.
SCCE와 코르네오데스모신: 재조합 SCCE에 의해 코르네오데스모신이 단백질분해됨이 발견되었다. 코르네오데스모신의 원래 형태는 분자량 50 kDA 내지 56 kDA이다. 2시간의 배양 뒤, 코르네오데스모신의 주 형태는 36, 46-43 kDA이다.
SCCE와 플라코글로빈: 재조합 SCCE에 의해 플라코글로빈이 단백질분해됨이 발견되었다. 플라코글로빈의 원래 형태는 분자량 85 kDA 내지 75 kDA이다. 2시간 내지 4시간의 배양 뒤, 플라코글로빈의 주 형태는 70kDA이다.
SCCE와 데스모글레인: 재조합 SCCE에 의해 데스모글레인이 단백질분해됨이 발견되었다. 2시간 내지 4시간의 배양 뒤, 데스모글레인의 주 형태는 95, 80 kDA이고, 이것은 160kDA 형태의 단백질분해물이다.
SCCE와 데스모플라킨: 재조합 SCCE에 의해 데스모플라킨이 단백질분해됨이 발견되었다. 데스모플라킨의 원래 형태는 분자량 190 내지 250 kDA이다. 2시간 내지 4시간의 배양 뒤, 데스모플라킨의 주 형태는 120-180 kDA와 75-80 kDA이다.
SCCE와 엔보플라킨: 재조합 SCCE에 의해 엔보플라킨이 단백질분해됨이 발견되었다. 엔보플라킨의 원래 형태는 분자량 124 내지 209 kDA이다. 2시간 내지 4시간의 배양 뒤, 엔보플라킨의 주 형태는 100-120 kDA, 60-80 kDA, 50-55 kDA이다.
SCCE와 데스모콜린: 재조합 SCCE에 의해 데스모콜린이 단백질분해됨이 발견되었다. 데스모콜린의 원래 형태는 분자량 70 내지 80 kDA이다. 2시간 내지 4시간의 배양 뒤, 데스모콜린의 주 형태는 60-70 kDA와 50-60 kDA이다.
SCTE에 의한 접착단백질의 분열
재조합 SCCE는 접착단백질, 특히 코르네오데스모신, 플라코글로빈, 데스모글레인, 데스모플라킨, 엔보플라킨, 데스모콜린을 분열시킬 수 있음을 본 실시예로 알 수 있다. 따라서, 이들 접착단백질은 프로테아제의 기질이다.
SCTE와 코르네오데스모신: 재조합 SCTE에 의해 코르네오데스모신이 단백질분해됨이 발견되었다. 2시간의 배양 뒤, 코르네오데스모신의 주 형태는 36, 46-43 kDA이다.
SCTE와 플라코글로빈: 재조합 SCTE에 의해 플라코글로빈이 단백질분해됨이 발견되었다. 2시간 내지 4시간의 배양 뒤, 플라코글로빈의 주 형태는 70kDA이다.
SCTE와 데스모글레인: 재조합 SCTE에 의해 데스모글레인이 단백질분해됨이발견되었다. 2시간 내지 4시간의 배양 뒤, 데스모글레인의 주 형태는 95, 80 kDA이고, 이것은 160kDA 형태의 단백질분해물이다.
SCTE와 데스모플라킨: 재조합 SCTE에 의해 데스모플라킨이 단백질분해됨이 발견되었다. 2시간 내지 4시간의 배양 뒤, 데스모플라킨의 주 형태는 120-180 kDA와 75-80 kDA이다.
SCTE와 엔보플라킨: 재조합 SCTE에 의해 엔보플라킨이 단백질분해됨이 발견되었다. 2시간 내지 4시간의 배양 뒤, 엔보플라킨의 주 형태는 100-120 kDA, 60-80 kDA, 50-55 kDA이다.
SCTE와 데스모콜린: 재조합 SCCE에 의해 데스모콜린이 단백질분해됨이 발견되었다. 2시간 내지 4시간의 배양 뒤, 데스모콜린의 주 형태는 60-70 kDA와 50-60 kDA이다.
실시예 C4. 단백질분해 프로필 물질 및 방법
폴리크로날 항체 생산
KLH(keyhole limpet hemocyanin)와 결합된 합성펩티드의 주사로 Corneodesmosin, SCCE, 엔보플라킨, 데스모플라킨, 데스모콜린 1, SLPI에 대한 항체를 토끼에게서 생산한다.
펩티드는 표준 과정을 이용해 KLH에 결합된다. 펩티드는 다음과 같은 아미노산 서열을 포함하도록 고안되었고, 이들 서열은 표 C4.1과 같이 관련 GenBank 서열로부터 구했다.
표 C4.1 굵은체 C는 결합용으로 합성되었고 원래의 서열에는 존재하지 않음.
1일째 KLH 토끼에 결합된 펩티드를 토끼에 주사한다. 간단한 프로토콜에 따른다. 1일째: (스탠딩 상태에서는 분리되지 않는) 에멀션이 형성될 때까지 23G의 바늘을 통해 여러번 주사하여 약 150㎕(300㎍의 짝 함유)를 같은 체적의 Freunds Complete Adjuvant와 혼합한다. 25G 바늘을 사용해 토끼에 피하주사했다. 22일째, 이상을 반복하되 Freunds Complete Adjuvant를 사용했다. 43일째, 이상을 정확히 반복했다. 53일째, 귀정맥으로부터 첫번째 테스트 혈액을 취했다. 필요하다면 추가로 혈액을 재공급한다.
모노크로날 항체
접착단백질 항원에 대한 모노크로날 항체는 독일 Biotechanc에서 구입했다. 이 항체는 PG5.1(플라코글로빈(NM-021991))에 관련된 항-플라코글로빈 항체와, Dsg1, Dsg2에 관한 항-데스모글라인1(XM-008810) 항체를 포함한다.
표피에서 단백질 추출
삼각형 조각으로 떼어낸 피부로부터 단백질을 추출해 선형반흔을 만든다. 이것은 진단용으로 병리학자에게 보내지는 유방절제 시편에서 떼어낸 피부가 아니다. 모든 샘플들은 흉부암의 절제물로서 세필드 대학에서 치료에 참여한 여자환자들로부터 채취한 것이다. 환자들의 동의를 얻었다.
흉부수술로 생긴 흉부 생검을 트립신 용액 A(Life Technology, 프랑스)로 4도에서 18시간동안 배양하여 진피에서 표피를 분리했다. 이들 표피를 두 부분으로 나눈다. 한 부분은 단백질 추출용이고, 나머지는 RNA 추출요이다. 박리된 피부를 56도에서 인-완충 살린에서 5분동안 가열한다. 이 표피는 다음과 같은 같은 체적의 완충액(각 완충액에서 3배)의 얼음에서 균질화되는바: 40mM Tris-HCl, pH 7.5, 10mM EDTA, 0.25mM 페닐메틸설포닐 플루오라이드, 2 ㎍/㎖의 아프로티민, 펩스타틴 A, 류펩틴(TE 완충액), 0.5% 논디뎃 P-40을 함유한 완충액(TE-Nonidet P-40 완충액).
다양한 농도의 우레아(4, 6, 8 M)를 함유한 원래 체적의 TE 완충액의 1/3에서 추출된 3 부분으로 펠릿이 분할된다. 각각의 추출 후, 15,000xg에서 15분동안 균질액을 구성하고, 상청액을 사용할 때까지 영하 30도로 유지한다. 끝으로, 8M 우레아내의 최종 추출물에 해당하는 펠릿을 35mM Tris-HCl, pH 6.8, 8M 우레아, 50mM 디티오트라이토, 5% 글리세롤, 0.25mM 페닐메틸설포닐 플루오라이드,각각 2 ㎍/㎖의 아프로틴, 펩스타틴 A, 류펩틴(TUDTT 완충액)에서 균질화한 다음, 30분동안 95도에서 배양하고, 전술한대로 원심분리했다(이 방법은 원래 Simon 일행이 설명했음, 1997). 단백질 농도는 Coomassie Plus 단백질 분석법(아일랜드 록포드의 Pierre Chemical)으로 측정했다.
각질층에서 단백질 추출
Guerrin 일행이 설명한 방법으로 각질층에서 단백질을 추출한다. 간단히, 건선 환자의 정상피부나 병든 피부에 테이프 스트립을 붙인다. 이 테이프 스트립을 아세톤에서 배양하고, 원심분리법(500xg, 1분)으로 조직을 회복시키며, 아세톤으로 세척하고 공기건조했다. 분말을 2% SDS와 50mM DTT를 함유한 62,5mM Tris-HCl, pH6.8에서 10분동안 끓인 뒤, 이 용액을 원심분리한다(10,000xg, 10분).
정상인과 건선환자 군의 각질층에서 단백질을 추출한 다음, corneodesmosomal 단백질에 대한 특정 항체를 사용한 Western bolts로 분석했다. 표피에서 추출된 단백질의 프로필은 정상인과 질환자(건선환자) 사이에 차이가 있음을 알 수 있다.
Western blot
표피와 각질층 생검(1㎍ 이하)의 단백질을 10% SDS_폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)으로 분리한다. 전기영동 이후, 단백질을 니트로셀룰로스 막으로 전기이전한다. 이런 막을 밤새도록 Blotto(3% 우유분말, 2% BSA, TBS내의 0.1% Tween 20)에서 4도로 밤새도록 차단했다. 이들 막을 실온에서 3시간동안 교반하면서 후술하는 일차 항체로 탐침한다. 플라코글로빈과 데스모글라인에 대해 검출된 마우스 모노클로날 항체를 Progen(독일 Heidelberg) 제품으로 구입하고, Blotto에서 희석된 5㎍/㎖ 농도로 사용한다. 데스모콜린, 데스모플라킨, SLPI, SCCE, S 단백질, 엔보플라킨(영국 세필드 대학의 항체연구소)중에서 지정된 펩티드에 대해 검출된 토끼 폴리크로날 항체를 1:250 희석하여 사용한다. 이들 막을 2x5분동안 Blotto에서 세척하고 이차항체의 존재하에 배양하거나, 미국 캘리포니아 소재 산타크루즈 바이오테크놀러지사에서 판매하는 항마우스나 항토끼 IgG HRP 로 1:1000으로 희석하여 실온에서 1시간동안 교반한다. 이들 막을 3x5분동안 TBS=Plus™western blotting 검출시스템(영국 Little Chalfont, Amersham Pharmacia Biotech)을 이용해 단백질을 검출했다.
실시예 C5. 표피에서 추출된 단백질의 건선 단백질분해 프로필
정상인과 건산환자군의 표피(병변피부와 비병변피부)로부터 단백질을 전술한 바와 같이 추출하고 코르네오데스모솜 단백질에 대한 특정 항체를 이용한 Western blot로 분석했다. 표피추출 단백질의 프로필은 정상인과 건선환자와 비병변 피부에서 차이가 있음을 보여준다.
코르네오데스모솜 단백질분해 프로필
데스모/코르네오데스모솜 단백질 분해의 결핍은 정상피부에 비해 건선피부에서 코르네오데스모솜 단백질의 성숙한 형태의 양이 상당히 감소되었음을 반영한다. 단백질분해 결핍으로 인해, 세포는 피부 표면에서 서로 달라붙게 되어, 세포분리를 방해한다.
예컨대, 36, 46-43 kDa 형태의 코르네오데스모솜는 정상피부에서의 각질층의 일반적 형태이고 52-56 kDa 형태는 정상 각질층에서는 아주 희귀하다. 건선피부에서의 코르네오데스모솜 단백질분해 프로필은 다르다. 따라서, 건선피부에서, 52-56 kDa 형태의 코르네오데스모솜는 건선환자의 피부에서는 많이 보이는 형태이고 각질층에 많이 보인다. 이는, 건선피부에서 단백질분해가 부족함을 의미한다.
그 결과가 도 6에 보인다.
따라서, 본 발명자들은 그룹 II 질병이나, 이런 질병으로 의심될만한 것의진단법을 개시하는데, 전술한 변화를 검출해, 바람직하게는 변조된 레벨의 존재, 바람직하게는 개인의 코르네오데스모솜 폴리펩티드가 52-56 kDa에 있는지의 여부를 검출해 진단하는 방법을 개시한다. 본 발명자들은 또한 그룹 II 질병이나 이런 질병으로 의심될만한 것(건선이나 건선 의심)의 진단법을 개시하는데, 변조된 레벨의 부재, 바람직하게는 개인의 코르네오데스모솜 폴리펩티드가 36 kDa, 46-43 kDa에 있는지 또는 그 밑의 값에 있는지를 검출해 진단하는 방법을 개시한다.
이 진단은 36 kDa, 46-43 kDa, 52-56 kDa 폴리펩티드의 상대적 량을 분석하여 이루어질 수도 있다.
바람직하게, 관련된 폴리펩티드들을 개인의 표피에서 검출한다.
데스모글레인 I 단백질분해 프로필
비슷한 결과가 데스모글레인 I(DGI)에서도 얻어진다. 정상피부의 표피에서 가장 많은 형태의 DGI은 95, 80 kDa로서, 160kDa 형태의 단백질분해물이다. 그러나, 건선피부의 각질층에서 가장 많은 형태는 160kDa이다. 이것은, 건선피부에서는 DGI의 단백질분해가 부족함을 의미한다.
따라서, 본 발명자들은 그룹 II 질병이나, 이런 질병으로 의심될만한 것(건선이나 건선 의심)의 진단법을 개시하는데, 전술한 변화를 검출해, 바람직하게는 변조된 레벨의 존재, 바람직하게는 개인의 데스모글레인의 폴리펩티드가 160kDa의 높은 레벨에 있는지의 여부를 검출해 진단하는 방법을 개시한다. 이 진단은 변조된 레벨의 부재, 바람직하게는 개인의 데스모글레인 I 폴리펩티드가 95와 80 kDa중의 하나나 둘다의 낮은 레벨에 있는지를 검출하여 이루어질 수도 있다.
이 진단은 80 kDa, 95 kDa, 160 kDa 폴리펩티드의 상대적 량을 분석하여 이루어질 수도 있다.. 이 진단은 또한 개인의 160 kDa 데스모글레인 I 폴리펩티드의 단백질분해 부족을 검출하여 이루어질 수도 있다.
바람직하게, 관련 폴리펩티드들은 개인의 표피에서 검출된다.
데스모글레인 3 단백질분해 프로필
데스모글레인 3(Dsg3)도 단백질분해 감소를 보인다. 두개의 단백질분해 단편 55kDa, 100kDa에 대응하는 밴드들은 정상피부의 각질층에 비해 건선피부의 각질층에서 약하다. 두개의 단편 모두 세포질 도메인에 대해 검출된 동일한 항체에 반응한다. 80kDa의 다른 밴드는 Dsg3의 단백질분해물이 건선피부에 비해 정상피부에 더 강력한 것으로 나타난다.
따라서, 본 발명자들은 그룹 II 질병이나, 이런 질병으로 의심될만한 것(건선이나 건선 의심)의 진단법을 개시하는데, 전술한 변화를 검출해, 바람직하게는 변조된 레벨의 부재, 바람직하게는 개인의 데스모글레인 3 폴리펩티드가 55kDa, 80kDa, 100kDa의 어느것에 있는지의 여부를 검출해 진단하는 방법을 개시한다.
바람직하게, 관련 폴리펩티드들은 개인의 표피에서 검출된다.
플라코글로빈 단백질분해 프로필
플라코글로빈도 정상인에 비해 건선환자의 표피에서는 단밸질분해가 상당히 감소됨을 보여준다
그 결과가 도 7에 보인다.
플라코글로빈의 항체는 3개의 밴드 85, 75, 70 kDa를 보인다. 70, 75 kDa는피부세포에서 SCCE, SCTE와 같이 단백질분해로 분열된 선천적인 단백질(85 kDa)의 단백질분해 형태이다. 70kDa는 건선피부(병변 및 비병변)에서 아주 강하고 정상표피에서는 거의 볼 수 없다. 건선피부와 정상피부는 두개의 다른 프로필을 보인다. 70kDa 밴드는 건선의 진단에 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명자들은 그룹 II 질병이나, 이런 질병으로 의심될만한 것(건선이나 건선 의심)의 진단법을 개시하는데, 전술한 변화를 검출해, 바람직하게는 변조된 레벨의 존재, 바람직하게는 개인의 플라코글로빈 폴리펩티드가 70kDa의 높은 레벨에 있는지의 여부를 검출해 진단하는 방법을 개시한다. 본 발명자들은 또한 그룹 II 질병이나, 이런 질병으로 의심될만한 것(건선이나 건선 의심)의 진단법을 개시하는데, 변조된 레벨의 부재, 바람직하게는 플라코글로빈 폴리펩티드가 75kDa의 낮은 레벨에 있는지의 여부를 검출해 진단하는 방법을 개시한다.
이 진단은 85kDa, 75kDa, 70kDa 폴리펩티드의 상대적 량을 분석하여 이루어질 수도 있다.
바람직하게, 관련 폴리펩티드들은 개인의 표피에서 검출된다.
데스모플라킨 단백질분해 프로필
데스모플라킨은 코르네오데스모솜의 세포질판의 성분이다. 피부세포와 신호전달 사이의 응집에 있어서 당단백질이 관련되었다고 본다.
그 결과가 도 8에 보인다.
데스모플라킨의 폴리크로날 항체를 이용해, 본 발명자들은 3개의 밴드 190-250, 120-180, 75-80 kDa를 보았다. 190-250 및/또는 120-180은 질환자에 비해 정상인에게서 강하게 발현된다. 75-80 kDa는 190-250 및/또는 120-180의 단백질분해 형태로서, 데스모플라킨이 건선피부에서 적절히 단백질분화되지 않았음을 보여준다. 이 프로필들은 건선과 같은 접착 증가를 갖는 질환을 확인하는데 이용될 수 있다.
따라서, 본 발명자들은 그룹 II 질병이나, 이런 질병으로 의심될만한 것(건선이나 건선 의심)의 진단법을 개시하는데, 전술한 변화를 검출해, 바람직하게는 변조된 레벨의 부재, 바람직하게는 개인의 데스모플라킨 폴리펩티드가 190-250, 120-180의 낮은 레벨에 있는지의 여부를 검출해 진단하는 방법을 개시한다. 이 진단은 75-80kDa, 190-250kDa 및/또는 120-180kDa 폴리펩티드의 상대적 량을 분석하여 이루어질 수도 있다. 이 진단은 개인의 85kDa 데스모플라킨 폴리펩티드의 부족을 검출하여 이루어질 수도 있다.
바람직하게, 관련 폴리펩티드들은 개인의 표피에서 검출된다.
데스모콜린 1 단백질분해 프로필
데스모콜린 1(Dsc1)은 정상표피의 기저상부층에서 강하게 발현된다.
그 결과가 도 9에 보인다.
데스모콜린의 항체는 정상표피에서 분자량으로 3개의 Dsc1 정보, 즉 70-80, 60-70, 50-60 kDa를 보인다. 병변과 비병변을 포함한 건선피부의 표피에서는 두개의 밴드만이 검출되는바, 건선피부에서는 단백질분해 과정이 부족함을 알 수 있다. 50-60 kDa 밴드의 부재는 건선과 같은 접착력증가를 갖는 질환의 단백질분해 진단에 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명자들은 그룹 II 질병이나, 이런 질병으로 의심될만한 것(건선이나 건선 의심)의 진단법을 개시하는데, 전술한 변화를 검출해, 바람직하게는 변조된 레벨의 부재, 바람직하게는 개인의 데스모콜린 1 폴리펩티드가 50-60의 낮은 레벨에 있는지의 여부를 검출해 진단하는 방법을 개시한다.
이 진단은 70-80kDa, 60-70kDa 및 50-60kDa 폴리펩티드의 상대적 량을 분석하여 이루어질 수도 있다.
바람직하게, 관련 폴리펩티드들은 개인의 표피에서 검출된다.
엔보플라킨 단백질분해 프로필
엔보플라킨은 껍질로 둘러싸인 단백질이다. 피부세포들 사이의 접착력에 중요한 단백질이다.
그 결과가 도 10에 보인다.
엔보플라킨의 항체는 4개의 밴드 124-209, 100-120, 60-80, 50-55 kDa를 보였다. 100-120, 60-80, 50-55는 선천적인 엔보플라킨의 단백질분해 형태에 대응될 수 있다. 건선피부(병변)에서는 60-80과 50-55 kDa 밴드만이 발현된다. 이들 두개의 형태는 건선과 같이 접착력이 증가되는 질환의 진단에 이용될 수 있다.
따라서, 본 발명자들은 그룹 II 질병이나, 이런 질병으로 의심될만한 것(건선이나 건선 의심)의 진단법을 개시하는데, 전술한 변화를 검출해, 바람직하게는 변조된 레벨의 존재, 바람직하게는 개인의 엔보플라킨 폴리펩티드가 60-80 및/또는 50-55의 높은 레벨에 있는지의 여부를 검출해 진단하는 방법을 개시한다. 본 발명자들은 또한 그룹 II 질병이나, 이런 질병으로 의심될만한 것(건선이나 건선 의심)의 진단법을 개시하는데, 전술한 변화를 검출해, 바람직하게는 변조된 레벨의 부재, 바람직하게는 개인의 엔보플라킨 폴리펩티드가 124-209 및/또는 100-120의 낮은 레벨에 있는지의 여부를 검출해 진단하는 방법을 개시한다.
이 진단은 124-209kDa, 100-120kDa, 60-80kDa 및 50-55kDa 엔보플라킨 폴리펩티드의 상대적 량을 분석하여 이루어질 수도 있다.
바람직하게, 관련 폴리펩티드들은 개인의 표피에서 검출된다.
SCCE 이소폼
SCCE는 정상피부에 비해 건선피부의 각질층에 다르게 발현된다.
SCCE의 항체는 정상피부에서는 두개의 강력한 밴드 80-90, 70-75 kDa를 보인다. 건선피부(병변)에서는 70-75 kDa 밴드만이 검출되고, 더 높은 분자량의 특별한 밴드(124-209)는 건선병변피부에서 검출된다. SCCE의 예상 사이즈는 약 30kDa이다. SCCE는 트랜스글루타미나제에 의해 껍질 안으로 삽입될 수 있다. 이렇게 되면 SCCE의 MW가 예상보다 높아진다. 124-209 밴드는 건선과 같이 접착력이 증가되는 질환의 진단에 이용될 수 있다.
그 결과가 도 11에 보인다.
따라서, 본 발명자들은 그룹 II 질병이나, 이런 질병으로 의심될만한 것(건선이나 건선 의심)의 진단법을 개시하는데, 전술한 변화를 검출해, 바람직하게는 변조된 레벨의 존재, 바람직하게는 개인의 SCCE 폴리펩티드가 124-209 kDa의 높은 레벨에 있는지의 여부를 검출해 진단하는 방법을 개시한다. 본 발명자들은 또한 그룹 II 질병이나, 이런 질병으로 의심될만한 것(건선이나 건선 의심)의 진단법을 개시하는데, 전술한 변화를 검출해, 바람직하게는 변조된 레벨의 부재, 바람직하게는 개인의 SCCE 폴리펩티드가 80-90kDa의 낮은 레벨에 있는지의 여부를 검출해 진단하는 방법을 개시한다.
이 진단은 80-90kDa, 70-75kDa 폴리펩티드의 상대적 량을 분석하여 이루어질 수도 있다.
바람직하게, 관련 폴리펩티드들은 개인의 표피에서 검출된다.
SLPI 프로필
SLPI는 정상피부에 비해 건선피부의 각질층에 강하게 발현된다.
SCCE의 항체는 두개의 밴드 90-100, 70-80 kDa를 보인다. 70-80 kDa는, SLPI가 병변피부에서처럼 건선피부에서 상향조절됨을 보여준다.
그 결과가 도 12에 보인다.
SLPI 단백질의 예상 Mw는 20kDa이다. SLPI를 껍질안에 삽입하고 다른 피부세포 단백질에 트랜스글루타미나제로 가교결합할 수 있다. 90-100kDa 밴드는 병변과 비병변 피부를 포함한 건선피부에서만 검출된다. 따라서, 건선과 같이 접착력이 증가하는 질환의 진단에 이용할 수 있다.
따라서, 본 발명자들은 그룹 II 질병이나, 이런 질병으로 의심될만한 것(건선이나 건선 의심)의 진단법을 개시하는데, 전술한 변화를 검출해, 바람직하게는 변조된 레벨의 존재, 바람직하게는 개인의 SLPI 폴리펩티드가 90-100 kDa의 높은 레벨에 있는지의 여부를 검출해 진단하는 방법을 개시한다. 본 발명자들은 또한 그룹 II 질병이나, 이런 질병으로 의심될만한 것(건선이나 건선 의심)의 진단법을 개시하는데, 전술한 변화를 검출해, 바람직하게는 변조된 레벨의 부재, 바람직하게는 개인의 SLPI 폴리펩티드가 20dDa 낮은 레벨에 있는지의 여부를 검출해 진단하는 방법을 개시한다.
이 진단은 90-100kDa, 20kDa 폴리펩티드의 상대적 량을 분석하여 이루어질 수도 있다.
바람직하게, 관련 폴리펩티드들은 개인의 표피에서 검출된다.
실시예 C6. 각질층에서 추출된 단백질의 건선 단백질분해 프로필
정상인과 건산환자군의 각질층(병변피부와 비병변피부)으로부터 단백질을 전술한 바와 같이 추출하고 코르네오데스모솜 단백질에 대한 특정 항체를 이용한 Western blot로 분석했다. 표피추출 단백질의 프로필은 정상인과 건선환자와 비병변 피부에서 차이가 있음을 보여준다.
코르네오데스모솜 단백질분해 프로필
데스모/코르네오데스모솜의 단백질분해의 결핍은 정상피부에 비해 건선피부에서 코르네오데스모솜 단백질의 성숙한 형태의 양이 상당히 감소되었음을 반영한다. 단백질분해 결핍으로 인해, 세포는 피부 표면에서 서로 달라붙게 되어, 세포분리를 방해한다. 예컨대, 36, 46-43 kDa 형태의 코르네오데스모솜는 정상피부의 각질층의 일반적 형태이고 52-56 kDa 형태는 정상 각질층에서는 아주 희귀하다. 건선피부에서의 코르네오데스모솜 단백질분해 프로필은 다르다. 따라서, 건선피부에서, 52-56 kDa 형태의 코르네오데스모솜는 건선환자의 피부에서는 많이 보이는 형태이고 각질층에 많이 보인다. 이는, 건선피부에서 단백질분해가 부족함을 의미한다.
따라서, 본 발명자들은 그룹 II 질병이나, 이런 질병으로 의심될만한 것(건선이나 건선 의심)의 진단법을 개시하는데, 전술한 변화를 검출해, 바람직하게는 변조된 레벨의 존재, 바람직하게는 개인의 코르네오데스모솜 폴리펩티드가 52-56 kDa에 있는지의 여부를 검출해 진단하는 방법을 개시한다. 본 발명자들은 또한 그룹 II 질병이나 이런 질병으로 의심될만한 것(건선이나 건선 의심)의 진단법을 개시하는데, 변조된 레벨의 부재, 바람직하게는 개인의 코르네오데스모솜 폴리펩티드가 36 kDa, 46-43 kDa에 있는지 또는 그 밑의 값에 있는지를 검출해 진단하는 방법을 개시한다.
이 진단은 36 kDa, 46-43 kDa, 52-56 kDa 폴리펩티드의 상대적 량을 분석하여 이루어질 수도 있다.
바람직하게, 관련된 폴리펩티드들을 개인의 표피에서 검출한다.
데스모글레인 I 단백질분해 프로필
비슷한 결과가 데스모글레인 I(DGI)에서도 얻어진다. 정상피부의 표피에서 가장 많은 형태의 DGI은 95, 80 kDa로서, 160kDa 형태의 단백질분해물이다. 그러나, 건선피부의 각질층에서 가장 많은 형태는 160kDa이다. 이것은, 건선피부에서는 DGI의 단백질분해가 부족함을 의미한다.
따라서, 본 발명자들은 그룹 II 질병이나, 이런 질병으로 의심될만한 것(건선이나 건선 의심)의 진단법을 개시하는데, 전술한 변화를 검출해, 바람직하게는 변조된 레벨의 존재, 바람직하게는 개인의 데스모글레인의 폴리펩티드가 160kDa의 높은 레벨에 있는지의 여부를 검출해 진단하는 방법을 개시한다. 이 진단은 변조된레벨의 부재, 바람직하게는 개인의 데스모글레인 I 폴리펩티드가 95와 80 kDa중의 하나나 둘다의 낮은 레벨에 있는지를 검출하여 이루어질 수도 있다.
이 진단은 80 kDa, 95 kDa, 160 kDa 폴리펩티드의 상대적 량을 분석하여 이루어질 수도 있다.. 이 진단은 또한 개인의 160 kDa 데스모글레인 I 폴리펩티드의 단백질분해 부족을 검출하여 이루어질 수도 있다.
바람직하게, 관련 폴리펩티드들은 개인의 표피에서 검출된다.
데스모글레인 3 단백질분해 프로필
데스모글레인 3(Dsg3)도 단백질분해 감소를 보인다. 두개의 단백질분해 단편 55kDa, 100kDa에 대응하는 밴드들은 정상피부의 각질층에 비해 건선피부의 각질층에서 약하다. 두개의 단편 모두 세포질 도메인에 대해 검출된 동일한 항체에 반응한다. 80kDa의 다른 밴드는 Dsg3의 단백질분해물이 건선피부에 비해 정상피부에 더 강력한 것으로 나타난다.
따라서, 본 발명자들은 그룹 II 질병이나, 이런 질병으로 의심될만한 것(건선이나 건선 의심)의 진단법을 개시하는데, 전술한 변화를 검출해, 바람직하게는 변조된 레벨의 부재, 바람직하게는 개인의 데스모글레인 3 폴리펩티드가 55kDa, 80kDa, 100kDa의 어느것에 있는지의 여부를 검출해 진단하는 방법을 개시한다.
바람직하게, 관련 폴리펩티드들은 개인의 표피에서 검출된다.
데스모플라킨 단백질분해 프로필
데스모플라킨의 폴리크로날 항체를 이용해, 본 발명자들은 3개의 밴드 190-250, 120-180, 75-80 kDa를 보았다. 190-250 및/또는 120-180은 질환자에 비해 정상인에게서 강하게 발현된다. 75-80 kDa는 190-250 및/또는 120-180의 단백질분해 형태로서, 데스모플라킨이 건선피부에서 적절히 단백질분화되지 않았음을 보여준다. 이 프로필들은 건선과 같은 접착 증가를 갖는 질환을 확인하는데 이용될 수 있다.
따라서, 본 발명자들은 그룹 II 질병이나, 이런 질병으로 의심될만한 것(건선이나 건선 의심)의 진단법을 개시하는데, 전술한 변화를 검출해, 바람직하게는 변조된 레벨의 존재, 바람직하게는 개인의 코르네오데스모솜 폴리펩티드가 52-56의 높은 레벨에 있는지의 여부를 검출해 진단하는 방법을 개시한다. 본 발명자들은 또한 그룹 II 질병이나, 이런 질병으로 의심될만한 것(건선이나 건선 의심)의 진단법을 개시하는데, 변조된 레벨의 부재, 바람직하게는 개인의 코르네오데스모솜 폴리펩티드가 36, 46-43의 낮은 레벨에 있는지의 여부를 검출해 진단하는 방법을 개시한다.
이 진단은 36, 46-43, 52-56 폴리펩티드의 상대적 량을 분석하여 이루어질 수도 있다.
바람직하게, 관련 폴리펩티드들은 개인의 표피에서 검출된다.
데스모글레인 I 단백질분해 프로필
비슷한 결과가 데스모글레인 I(DGI)에서도 얻어진다. 정상피부의 표피에서 가장 많은 형태의 DGI은 95, 80 kDa로서, 160kDa 형태의 단백질분해물이다. 그러나, 건선피부의 각질층에서 가장 많은 형태는 160kDa이다. 이것은, 건선피부에서는 DGI의 단백질분해가 부족함을 의미한다.
따라서, 본 발명자들은 그룹 II 질병이나, 이런 질병으로 의심될만한 것(건선이나 건선 의심)의 진단법을 개시하는데, 전술한 변화를 검출해, 바람직하게는 변조된 레벨의 존재, 바람직하게는 개인의 데스모글레인의 폴리펩티드가 160kDa의 높은 레벨에 있는지의 여부를 검출해 진단하는 방법을 개시한다. 이 진단은 변조된 레벨의 부재, 바람직하게는 개인의 데스모글레인 I 폴리펩티드가 95와 80 kDa중의 하나나 둘다의 낮은 레벨에 있는지를 검출하여 이루어질 수도 있다.
이 진단은 80 kDa, 95 kDa, 160 kDa 폴리펩티드의 상대적 량을 분석하여 이루어질 수도 있다.. 이 진단은 또한 개인의 160 kDa 데스모글레인 I 폴리펩티드의 단백질분해 부족을 검출하여 이루어질 수도 있다.
바람직하게, 관련 폴리펩티드들은 개인의 표피에서 검출된다.
데스모글레인 3 단백질분해 프로필
데스모글레인 3(Dsg3)도 단백질분해 감소를 보인다. 두개의 단백질분해 단편 55kDa, 100kDa에 대응하는 밴드들은 정상피부의 각질층에 비해 건선피부의 각질층에서 약하다. 두개의 단편 모두 세포질 도메인에 대해 검출된 동일한 항체에 반응한다. 80kDa의 다른 밴드는 Dsg3의 단백질분해물이 건선피부에 비해 정상피부에 더 강력한 것으로 나타난다.
따라서, 본 발명자들은 그룹 II 질병이나, 이런 질병으로 의심될만한 것(건선이나 건선 의심)의 진단법을 개시하는데, 전술한 변화를 검출해, 바람직하게는 변조된 레벨의 부재, 바람직하게는 개인의 데스모글레인 3 폴리펩티드가 55kDa, 80kDa, 100kDa의 어느것에 있는지의 여부를 검출해 진단하는 방법을 개시한다.
바람직하게, 관련 폴리펩티드들은 개인의 표피에서 검출된다.
데스모플라킨 단백질분해 프로필
데스모플라킨의 폴리크로날 항체를 이용해, 본 발명자들은 3개의 밴드 190-250, 120-180, 75-80 kDa를 보았다. 190-250 및/또는 120-180은 질환자에 비해 정상인에게서 강하게 발현된다. 75-80 kDa는 190-250 및/또는 120-180의 단백질분해 형태로서, 데스모플라킨이 건선피부에서 적절히 단백질분화되지 않았음을 보여준다. 이 프로필들은 건선과 같은 접착 증가를 갖는 질환을 확인하는데 이용될 수 있다.
따라서, 본 발명자들은 그룹 II 질병이나, 이런 질병으로 의심될만한 것(건선이나 건선 의심)의 진단법을 개시하는데, 전술한 변화를 검출해, 바람직하게는 변조된 레벨의 부재, 바람직하게는 개인의 데스모플라킨의 폴리펩티드가 190-250, 120-180의 낮은 레벨에 있는지의 여부를 검출해 진단하는 방법을 개시한다. 이 진단은 75-80, 190-250 및/또는 120-180 폴리펩티드의 상대적 량을 분석하여 이루어질 수도 있다. 이 진단은 또한 개인의 85kDa 데스모플라킨 폴리펩티드의 단백질분해 부족을 검출하여 이루어질 수도 있다.
바람직하게, 관련 폴리펩티드들은 개인의 표피에서 검출된다.
플라코글로빈 단백질분해 프로필
플라코글로빈의 항체는 3개의 밴드 85, 75, 70 kDa를 보인다. 70, 75 kDa는 피부세포에서 SCCE, SCTE와 같이 단백질분해로 분열된 선천적인 단백질(85 kDa)의 단백질분해 형태이다. 70kDa는 건선피부(병변 및 비병변)에서 아주 강하고 정상표피에서는 거의 볼 수 없다. 건선피부와 정상피부는 두개의 다른 프로필을 보인다. 70kDa 밴드는 건선의 진단에 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명자들은 그룹 II 질병이나, 이런 질병으로 의심될만한 것(건선이나 건선 의심)의 진단법을 개시하는데, 전술한 변화를 검출해, 바람직하게는 변조된 레벨의 존재, 바람직하게는 개인의 플라코글로빈 폴리펩티드가 70kDa의 높은 레벨에 있는지의 여부를 검출해 진단하는 방법을 개시한다. 본 발명자들은 또한 그룹 II 질병이나, 이런 질병으로 의심될만한 것(건선이나 건선 의심)의 진단법을 개시하는데, 변조된 레벨의 부재, 바람직하게는 플라코글로빈 폴리펩티드가 75kDa의 낮은 레벨에 있는지의 여부를 검출해 진단하는 방법을 개시한다.
이 진단은 85kDa, 75kDa, 70kDa 폴리펩티드의 상대적 량을 분석하여 이루어질 수도 있다.
바람직하게, 관련 폴리펩티드들은 개인의 표피에서 검출된다.
데스모콜린 1 단백질분해 프로필
데스모콜린 1(DGIV/V)은 정상표피의 기저상부층에서 강하게 발현된다.
데스모콜린의 항체는 정상표피에서 분자량으로 3개의 Dsc1 정보, 즉 70-80, 60-70, 50-60 kDa를 보인다. 병변과 비병변을 포함한 건선피부의 표피에서는 두개의 밴드만이 검출되는바, 건선피부에서는 단백질분해 과정이 부족함을 알 수 있다. 50-60 kDa 밴드의 부재는 건선과 같은 접착력증가를 갖는 질환의 단백질분해 진단에 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명자들은 그룹 II 질병이나, 이런 질병으로 의심될만한 것(건선이나 건선 의심)의 진단법을 개시하는데, 전술한 변화를 검출해, 바람직하게는 변조된 레벨의 부재, 바람직하게는 개인의 데스모콜린 1 폴리펩티드가 50-60의 낮은 레벨에 있는지의 여부를 검출해 진단하는 방법을 개시한다.
이 진단은 70-80kDa, 60-70kDa 및 50-60kDa 폴리펩티드의 상대적 량을 분석하여 이루어질 수도 있다.
바람직하게, 관련 폴리펩티드들은 개인의 표피에서 검출된다.
실시예 C7. 각질층에서 추출된 단백질의 습진 단백질분해 프로필
정상인과 습진환자군의 각질층으로부터 단백질을 전술한 바와 같이 추출하고 코르네오데스모솜 단백질에 대한 특정 항체를 이용한 Western blot로 분석했다. 표피추출 단백질의 프로필은 정상인과 습진환자 사이에 차이가 있음을 보여준다.
코르네오데스모솜 단백질분해 프로필
습진피부에서의 데스모/코르네오데스모솜 단백질분해의 증가는 정상피부에 비해 습진피부에서 코르네오데스모솜 단백질의 미성숙 형태의 양이 상당히 증가되었음을 반영한다. 단백질분해 증가로 인해, 세포는 피부 표면에서 서로 달라붙게 되어, 세포분리를 방해한다.
예컨대, 36, 46-43 kDa 형태의 코르네오데스모솜는 정상피부에서의 각질층의 일반적 형태이고 52-56 kDa 형태는 정상 각질층에서는 아주 희귀하다. 건선피부에서의 코르네오데스모솜 단백질분해 프로필은 다르다. 따라서, 습진피부에서는 코르네오데스모솜의 단백질분해의 증가가 있으므로, 36, 46-43 kDa 형태의 코르네오데스모솜는 습진환자의 피부에서는 많이 보이는 형태이다. 습진피부에서의 단백질분해의 증가가 보인다.
따라서, 본 발명자들은 그룹 I 질병이나, 이런 질병으로 의심될만한 것(습진이나 습진의심)의 진단법을 개시하는데, 전술한 변화를 검출해, 바람직하게는 변조된 레벨의 존재, 바람직하게는 개인의 코르네오데스모솜 폴리펩티드가 36, 46-43 kDa의 높은레벨에 있는지의 여부를 검출해 진단하는 방법을 개시한다. 본 발명자들은 또한 그룹 I 질병이나 이런 질병으로 의심될만한 것(습진이나 습진의심)의 진단법을 개시하는데, 변조된 레벨의 부재, 바람직하게는 개인의 코르네오데스모솜 폴리펩티드가 52-56 kDa의 낮은레벨에 있는지를 검출해 진단하는 방법을 개시한다.
이 진단은 36 kDa, 46-43 kDa, 52-56 kDa 폴리펩티드의 상대적 량을 분석하여 이루어질 수도 있다.
바람직하게, 관련된 폴리펩티드들을 개인의 표피에서 검출한다.
데스모글레인 I 단백질분해 프로필
비슷한 결과가 데스모글레인 I(DGI)에서도 얻어진다. 정상피부의 각질층에서 가장 많은 형태의 DGI은 95, 80 kDa로서, 160kDa 형태의 단백질분해물이다. 습진피부의 각질층에서는 95, 80 kDa 형태의 증가가 있는데, 이것은 DGI의 단백질분해 과정이 습진피부에서는 증가됨을 의미한다.
따라서, 본 발명자들은 그룹 I 질병이나, 이런 질병으로 의심될만한 것(습진이나 습진 의심)의 진단법을 개시하는데, 전술한 변화를 검출해, 바람직하게는 변조된 레벨의 존재, 바람직하게는 개인의 폴리펩티드가 95, 80 kDa의 높은 레벨에 있는지의 여부를 검출해 진단하는 방법을 개시한다. 이 진단은 변조된 레벨의 부재, 바람직하게는 개인의 데스모글레인 I 폴리펩티드가 160kDa의 낮은 레벨에 있는지를 검출하여 이루어질 수도 있다.
이 진단은 80 kDa, 95 kDa, 160 kDa 폴리펩티드의 상대적 량을 분석하여 이루어질 수도 있다.. 이 진단은 또한 개인의 160 kDa 데스모글레인 I 폴리펩티드의 단백질분해의 존재를 검출하여 이루어질 수도 있다.
바람직하게, 관련 폴리펩티드들은 개인의 표피에서 검출된다.
데스모글레인 3 단백질분해 프로필
데스모글레인 3(Dsg3)도 단백질분해 증가를 보인다. 두개의 단백질분해 단편 55kDa, 100kDa에 대응하는 밴드들은 정상피부의 각질층에 비해 습진피부의 각질층에서 강하다. 두개의 단편 모두 세포질 도메인에 대해 검출된 동일한 항체에 반응한다. 80kDa의 다른 밴드는 Dsg3의 단백질분해물이 습진피부에 비해 정상피부에 더 약한 것으로 나타난다.
따라서, 본 발명자들은 그룹 I 질병이나, 이런 질병으로 의심될만한 것(습진이나 습진 의심)의 진단법을 개시하는데, 전술한 변화를 검출해, 바람직하게는 변조된 레벨의 존재, 바람직하게는 개인의 데스모글레인 3 폴리펩티드가 55kDa, 80kDa, 100kDa의 어느것에 있는지의 여부를 검출해 진단하는 방법을 개시한다.
바람직하게, 관련 폴리펩티드들은 개인의 표피에서 검출된다.
플라코글로빈 단백질분해 프로필
플라코글로빈의 항체는 3개의 밴드 85, 75, 70 kDa를 보인다. 70, 75 kDa는 피부세포에서 SCCE, SCTE와 같이 단백질분해로 분열된 선천적인 단백질(85 kDa)의단백질분해 형태이다. 70kDa는 습진피부(병변 및 비병변)에서 아주 약하고 정상표피에서는 거의 볼 수 없다. 85, 75 kDa는 정상피부에 비해 습진피부에서 아주 강하다. 85, 70 kDa 밴드는 습진의 진단에 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명자들은 그룹 I 질병이나, 이런 질병으로 의심될만한 것(습진이나 습진 의심)의 진단법을 개시하는데, 전술한 변화를 검출해, 바람직하게는 변조된 레벨의 부재, 바람직하게는 개인의 플라코글로빈 폴리펩티드가 70kDa의 높은 레벨에 있는지의 여부를 검출해 진단하는 방법을 개시한다. 본 발명자들은 또한 그룹 I 질병이나, 이런 질병으로 의심될만한 것(건선이나 건선 의심)의 진단법을 개시하는데, 변조된 레벨의 존재, 바람직하게는 플라코글로빈 폴리펩티드가 85 및/또는 75kDa의 높은 레벨에 있는지의 여부를 검출해 진단하는 방법을 개시한다.
이 진단은 85kDa, 75kDa, 70kDa 폴리펩티드의 상대적 량을 분석하여 이루어질 수도 있다.
바람직하게, 관련 폴리펩티드들은 개인의 표피에서 검출된다.
데스모콜린 1 단백질분해 프로필
데스모콜린 1(DGIV/V)은 정상표피의 기저상부층에서 강하게 발현된다.
데스모콜린의 항체는 정상표피에서 분자량으로 3개의 Dsc1 정보, 즉 70-80, 60-70, 50-60 kDa를 보인다. 병변과 비병변을 포함한 습진피부의 표피에서는 50-60 kDa 밴드가 강하게 발현되는데, 이것은 습진피부에서는 데스모콜린 1의 단백질분해가 증가함을 의미한다. 50-60 kDa 밴드의 높은 발현은 습진과 같이 피부장벽 결함을 갖는 질환의 단백질분해 진단에 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명자들은 그룹 I 질병이나, 이런 질병으로 의심될만한 것(습진이나 습진 의심)의 진단법을 개시하는데, 전술한 변화를 검출해, 바람직하게는 변조된 레벨의 존재, 바람직하게는 개인의 데스모콜린 1 폴리펩티드가 50-60의 높은 레벨에 있는지의 여부를 검출해 진단하는 방법을 개시한다.
이 진단은 70-80kDa, 60-70kDa 및 50-60kDa 폴리펩티드의 상대적 량을 분석하여 이루어질 수도 있다.
바람직하게, 관련 폴리펩티드들은 개인의 표피에서 검출된다.
실시예 D: 유전자 조절
실시예 D1. 올리고누클레오티드 배열을 이용해 분석한 건선에서의 접착단백질, 프로테아제, 프로테아제 억제 유전자의 발현
데스모솜와 코르네오데스모솜 접착 단백질, 프로테아제 및 프로테아제 억제유전자들을 포함한 Affymetrix 올리고누클레오티드 배열을 이용했다. 이들 유전자는 실시예 D2-D7의 표에 기재되어 있다.
건선, 여드름, 불가리스, 비늘선(ichtyosis), 모공각화증, 아토피성 습진, 크론병, 피부흑색종, 비늘모양 세포암, 기저세포암, 피부림프종, 피부암, 위장관의 악성종양, 폐의 악성종양을 갖는 환자의 관련 및 무관 피부로부터의 생검들을 피부에서 얻는다. 이들 생검은 또한 무관한 조절혈액 제공자로부터 얻을 수도 있다.
RNA는 각 샘플로부터 추출되고, 병변, 비병변 및 정상피부 각각으로부터 50, 20, 15㎍씩 얻었다. cRNA를 준비하는데는 약 10㎍을 사용하고, 표에 기재된 유전자의 프로브들을 포함한 Affymetrix U95A 배열에 대한 잡종혼합에 2㎍을 사용한다.
발현 레벨에 대한 평균 편차로 이미지 강도를 커버하여 각 유전자의 발현레벨을 반영하는데 GENECHIP 소프트웨어를 이용한다. 정상 피부에서의 유전자의 발현을 기준으로 이용하고, 그 결과를 하기 표에 기재한다.
실시예 D2. 올리고누클레오티드 배열을 이용해 분석한 건선에서의 코르네오데스모솜의발현
건선환자에서 설명한 바와 같이 건선증 피부(관련) 및 건선증 없는 피부(무관)을 이용해 코르네오데스모솜의 발현을 분석한다. 질환(관련 및 무관)에서의 각 유전자의 발현레벨을 정상피부의 발현에 비교한다.
그 결과를 밑의 표 D2.1에 표시했다. ++ 정상발현; +++ 강력발현; ++++ 고도발현, + 하향조절
따라서, 본 발명자들은 그룹 II 질병이나; 이런 질병으로 의심될만한 것(건선이나 건선 의심)의 진단법을 개시하는데; 발현의 변화를 검출해; 바람직하게는 S/코르네오데스모신(AF030130); 데스플라킨(XM_004463); 플라코글로빈(NM_002230; GB:NM_021991); 데스모글레인 1(XM_008810); 데스모콜린 1(MX_008687); 엔보플라킨(XM_008135;U72543); 펙틴 1(NM000445); S100A2(AI539439;M87068); 케라틴 6A(L42611); 케라틴 17(Z19574); S100A8(AI126134); S100A7(AA586894); S100A9(GB;W72424); SPRR2A(GB:M21302); SPRR1B(M19888); SPRK(AI923984); HCR(BAA81890); SEEK1(BAA88130); SPR1(BAB63315); STG(BAA88132);인볼루크린(NM_005547); 아넥신 A1/리포코르틴(X05908); 콜라겐, 타입 V1, 알파3(COL6A3)(NM_004369); 트리코히알린(NM_005547); 로리크린(XM_048902)로 이루어지는 군에서 선택된 폴리펩티드나 핵산의 발현의 상향조절에 의해 진단하는 방법을 개시한다.
실시예 D3
올리고누클레오티디 어레이를 사용하여 검정한 건선에서의 프로테이나제 유전자의 발현
프로테이나제 유전자의 발현을 건선 병변 피부("관련됨") 및 건선 비-병변 피부("비관련됨")의 건선 환자에서 이하 기재된 바와 같이 검정하였다. 질환에서의 각각의 유전자 발현 수준을 정상 피부에서의 발현과 비교하였다.
결과를 이하 표 D3.1에 기재하였다. 기호 ++: 정상 발현; 기호 +++: 강한 발현; ++++: 높은 발현; + 정상 이하
표 D3.1
본 발명자들은 따라서 트랜스글루타미나제 1(TGM1)(M98447); TGM2(XM-009482); TGM4 (XM-05623);TGM5 (XM-007529);TGM7 (NM-052955);TGM3 (L10386); 포스포리파아제 A(2)(BC013384); CD47 항원(X69398); 칼릴크레인 8(AB008390): AD024 단백질 (XM-002642); 디펜신 베타2 (AF0711216); 인터페론 a 유도성 단백질 27(X67325); 지방산 결합 단백질 FABP5(M94856); SCTE (XM-009000); 칼릴크레인 1, 신장/췌장/침샘(KLK1)(XM-047300); 호모사피언스 칼릴크레인 2, 전립선 (KLK2)(XM-031757); 칼릴크레인 3, (전립선 특이적 항원)(KLK3)(XM-031768); 칼릴크레인 6(뉴로신, 자임)(KLK6)(XM-055658); 칼릴크레인 4 (프로스타제, 에나멜 매트릭스, 전립선)(KLK4)(XM-008997); 막-타입 혈청 프로테아제 1(AF133086); 콜라게나제 MMP-1(LOC116389); 콜라게나제 MMP-12 (U78045); 콜라게나제 MMP-(NM-004994);콜라게나제 MMP-3(U78045); 콜라게나제 MMP-28(AF219624); 카스파제 7(BC015799); 카스파제 5(NM-004347); 카스파제-14(NM-012114); 유비퀴틴 특이적 프로테아제 USP-5 (NM-003481); 유비퀴틴 특이적 프로테아제 USP-11(NM-004651); 유비퀴틴 특이적 프로테아제 USP 6(NM-004505); 유비퀴틴 특이적 프로테아제 USP 26(NM-031907); 유비퀴틴 특이적 프로테아제 (USP 28)(NM-020886); 26S 프로테아제 서브단위 4(L02426); LILRB1 (AF004230); 시그날 도입제 및 전사 활성화제 1, 91kDa (STAT1)(977935); 프로테아좀(프로좀, 맥크로페인) 서브단위 6 (PSMA6)(X59417); TPSB1(XM-016204); 프로테아제 넥신-II(XM-047793); 글리아 유도된 넥신 전구체(P07093); 및 26S 프로테아제 조절성 서브단위 S10B;PCOLN3(XM-047524)로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩티드 또는 핵산의 발현 조절, 바람직하게는, 상향 발현 조절을 검출함으로써, 피검자에서의 그룹 II 질환의 진단 또는 그룹 II 질환에 대한 민감성을 검정하였다.
본 발명자들은 아포프토시스 관련된 시스테인 프로테아제 (CASP14)mRNA(NM-012114), SCCE (XM-009002), 사람 피부 콜라게나제 (M13509); TPS1 (NM-003293); 및TPSG1(XM-008123)으로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩티드 또는 핵산의 발현 조절, 바람직하게는, 상향 발현 조절을 검출함으로써, 피검자에서의 그룹 II 질환의 진단 또는 그룹 II 질환에 대한 민감성을 검정하였다.
실시예 D4
올리고누클레오티드 어레이를 사용하여 검정한 건선에서의 프로테아제 억제제 유전자의 발현
프로테이나제 억제제 유전자의 발현을 건선 병변 피부("관련") 및 건선 비-병변 피부("비관련")의 건선 환자에서 이하 기재된 바와 같이 검정하였다. 질환(관련 및 비관련)에서의 각각의 유전자 발현 수준을 정상 피부에서의 발현과 비교하였다.
결과를 이하 표 D4.1에 기재하였다. 기호 ++: 정상 발현; 기호 +++: 강한 발현; ++++: 높은 발현; + 정상 이하
표 D4.1
본 발명자들은 따라서 SLPI(04502); SKALP(XM-009524); L10343); CSTA(NM-005213; AA570193); SCCA(S66296); SCCA2(U19557); 플라스미노겐 활성화제 억제제타입 1(X04729; X04731); PAI2(AF071400); SERPINA5 (NM-000624); 플라스미노겐 타입 2 (L19066); TIMP(D11139); TIMP-1 (NM-003254); TIMP-2 (NM-003255); TIMP-3 (E13880); TIMP-4(NM-003256); TIM9a(AF150100); TIM9b(AF150105); 시스타틴 A (AA570193); 시스타틴 M/E (NM-001323); 다가 프로테아제 억제제 WFIKKN (AF422194); C1 억제제(SERPING1)(XM-046218); 프로테아제 억제제, 쿠니츠 타입 (Kunitz type), 2(SPINT2)(XM-032280); 혈청 프로테아제 억제제 카잘 타입 4(Kazal type 4)(SPINK4) (XM-SPINK4) (XM-005539); 프로테이나제 억제제, 클라드 B (오발부민), 구성원 9 (XM-053642); 혈청(또는 시스테인)프로테이나제 억제제, 클라드); B (오발부민), 구성원 6(XM-047984); 에핀-1(EPPIN)(AF286368); 에핀-2(EPPIN) (AF286369); 에핀-3(EPPIN)(AF286370); 쿠니츠 및 WAP 도메인 1(eppin) 유사 혈청 프로테아제 억제제 (SPINLW1)(NM-020398); 스파르크/오스테오넥틴, cwcv 및 카잘 유사 도메인 프로테오글리칸(테스티칸)(SPOCK)(NM-004598); 프로테아제 억제제 쿠니츠 타입 1(SPINT1)(XM-056836); PI12(X009756); HIV-1 프로테아제에 대한 사람 면역결핍 바이러스 타입 1 유전자(AB020923); HIV-1 프로테아제에 대한 사람 면역결핍 바이러스 타입 1 유전자(AB020924); 조직 인자 경로 억제제 2(TFPI2)(NM-006528); 분비된 포스포단백질 2, 24kD(SPP2)(NM-006944); 카텝신 F(CTSF (NM-003793); 혈청(또는 시스테인)프로테이나제 억제제, 클라드 A (알파-1 항프로테이나제, 항트립신), 구성원 6 (SERPINA6)(NM-001756); 혈청(또는 시스테인)프로테이나제 억제제, 클라드 B (오발부민), 구성원 3 (SERSPINB3)(NM-006919); 혈청 (또는 시스테인)프로테이나제 억제제, 클라드 A (알파-1 항프로테이나제, 항트립신), 구성원 3 (SERPINA3)(NM-001085); 호모사피언스 혈청(또는 시스테인)프로테이나제 억제제, 클라드 B(오발부민), 구성원 13(XM-008743); 혈청(또는 시스테인)프로테이나제 억제제, 클라드 B(오발부민), 구성원 5(SERPINB5)(XM-008742); RelA 관련된 억제제(XM-057693); DNA 결합 1의 억제제, 우세한 네거티브 나선-루프-나선 단백질(ID1)(XM-046179); 혈청(또는 시스테인)프로테이나제 억제제, 클라드 E(넥신, 플라스미노겐 활성화제 억제제 타입 1), 구성원 (SERPINE1)(XM-054850); 시클린 의존성 키나아제 억제제 2B(p15, 억제 CDK4)(CDKN2B)(NM-004936); 유사 시클린 의존성 키나아제 억제제 2B (p15. 억제 CDK4)(BC014469); 혈청(또는 시스테인)프로테이나제 억제제, 클라드 B (오발부민), 구성원 7(SERPINB7)(XM-008745); 활성화된 STAT 단백질 PIASy(PIASY)의 단백질 억제제(NM-016149); 활성화된 STAT 단백질 PIASy(LOC95830)의 유사 단백질 억제제(XM-016864); PKC-강화된 PP1 억제 단백질(PPP1R14A)(AY050668); DNA 결합 3의 억제제, 우세한 네거티브 나선-루프-나선 단백질(ID3)(NM-002167); 클라드 A (알파-1 항프로테이나제, 항트립신)(XM-028358); 혈청(또는 시스테인)프로테이나제 억제제, 클라드 H (열 쇼크 단백질 47), 구성원 1 (SERPONH1)(NM-004353); 허핀(hurpin)에 대한 PI13 유전자(혈청 프로테아제 억제제)(AJ278717); 프로테아제 억제제 5(마스핀)(PI5)(XM-008742); PAI-2(A32415)로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩티드 또는 핵산의 발현 조절, 바람직하게는, 상향 발현 조절을 검출함으로써, 피검자에서의 그룹 II 질환의 진단 또는 그룹 II 질환에 대한 민감성을 검정하였다.
본 발명자들은 추가로 hbc750 사람 췌장 랑게스한스 섬(T11141; T10920) 폴리펩티드 또는 핵산의 발현 조절, 바람직하게는, 하향 발현 조절을 검사함으로써, 피검자에서의 그룹 II 질환의 진단 또는 그룹 II 질환에 대한 민감성(바람직하게는 건선 또는 건선에 대한 민감성)을 검정하였다.
실시예 D5
올리고누클레오티드 어레이를 사용하여 검정한 습진에서의 코르네오데스모좀 유전자의 발현
코르네오데스모좀 유전자의 발현을 습진 병변 피부("관련") 및 습진 비-병변 피부("비관련")의 습진 환자에서 이하 기재된 바와 같이 검정하였다. 질환(관련 및 비관련)에서의 각각의 유전자 발현 수준을 정상 피부에서의 발현과 비교하였다.
결과를 이하 표 D5.1에 기재하였다. 기호 ++: 정상 발현; 기호 +++: 강한 발현; ++++: 높은 발현; + 정상 이하
표 D5.1
본 발명자들은 따라서 케라틴 6A(L42611); 케라틴 17(Z19574); 아넥신 A1/리포코르틴(X05908); 및 콜라겐, 타입 VI, 알파 3(COL6A3)(NM-004369)로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩티드 또는 핵산의 발현 조절, 바람직하게는, 상향 발현 조절을 피검자에서 검사함으로써, 피검자에서의 그룹 1 질환의 진단 또는 그룹 1 질환에 대한 민감성(바람직하게는 습진 또는 습진에 대한 민감성)을 검정하였다.
또한, 본 발명자들은 S/코르네오데스모신(AF030130); 데소플라킨(XM-004463); 플라코글로빈(NM-002230)(NM-021991); 데스모글레인 1(XM-008810); 데스모콜린 1(MX-008687); 엔브플라킨(XM-008135)(U72543); 플렉틴 1(NM000445); S100A2(AI539439)(M87068); S100A8(AI126134); S100A7(AA586894); S100A9); GB:72424); SPRR2A); GB:M21302); SPRR1B(M19888); SPRK(AI923984); HCR(BAA81890); SEEK1(BAA88130); SPR1(BAB63315); STG(BAA88132); 인볼루크린(NM-005547); 트리코하이알린(NM-005547); 및 로리크린(XM-048902)로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩티드 또는 핵산의 발현 조절, 바람직하게는, 상향 발현 조절을 피검자에서 검사함으로써, 피검자에서의 그룹 1 질환의 진단 또는 그룹 1 질환에 대한 민감성(바람직하게는 습진 또는 습진에 대한 민감성)을 검정하였다.
실시예 D6
올리고누클레오티드 어레이를 사용하여 검정한 습진에서의 프로테아제 유전자의 발현
프로테아제 유전자의 발현을 관련된 피부(습진 병변 피부), 비-관련된 피부(습진 비-병변 피부), 및 정상 피부의 환자에서 이하 기재된 바와 같이 검정하였다. 질환(관련 및 비관련)에서의 각각의 유전자 발현 수준을 정상 피부에서의 발현과 비교하였다.
결과를 이하 표 D6.1에 기재하였다. 기호 ++: 정상 발현; 기호 +++: 강한 발현; ++++: 높은 발현; + 정상 이하
표 D6.1
본 발명자들은 따라서 아포프토시스 관련된 시스테인 프로테아제(CASP14) mRNA(NM-012114); TGM5 (XM-007529); 포스포리파아제 A(2)(BC013384); CD47 항원(X69398); 칼릴크레인 8(AB008390): AD024 단백질 (XM-002642); SCCE(XM-009002); 디펜신 베타2 (AF0711216); 인터페론 a 유도성 단백질 27(X67325); 지방산 결합 단백질 FABP5(M94856); SCTE (XM-009000); 칼릴크레인 1, 신장/췌장/침샘(KLK1)(XM-047300); 호모사피언스 칼릴크레인 2, 전립선 (KLK2)(XM-031757); 칼릴크레인 3, (전립선 특이적 항원)(KLK3)(XM-031768); 칼릴크레인 6(뉴로신, 자임)(KLK6)(XM-055658); 칼릴크레인 4 (프로스타제, 에나멜 매트릭스, 전립선)(KLK4)(XM-008997); 막-타입 혈청 프로테아제 1(AF133086); 사람 피부 콜라게나제 (M13509); 콜라게나제 MMP-1(LOC116389); 콜라게나제 MMP-12 (U78045); 콜라게나제 MMP-(NM-004994); 콜라게나제 MMP-3(U78045); 콜라게나제 MMP-28(AF219624); 카스파제 7(BC015799); 카스파제 5(NM-004347); 카스파제-14(NM-012114); 유비퀴틴 특이적 프로테아제 USP-5 (NM-003481); 유비퀴틴 특이적 프로테아제 USP-11(NM-004651); 유비퀴틴 특이적 프로테아제 USP 6(NM-004505); 센1(NM-003293); TPSB1(XM-016204); TPSG1(XM-008123); 프로테아제 넥신-II(XM-047793); 글리아 유도된 넥신 전구체(P07093); 및 26S 프로테아제 조절성 서브단위 S10B(Q92524); 및 PCOLN3(XM-047524)로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩티드 또는 핵산의 발현 조절, 바람직하게는, 상향 발현 조절을 검사함으로써, 피검자에서의 그룹 1 질환의 진단 또는 그룹 1 질환에 대한 민감성을 검정하였다.
본 발명자들은 추가로 트랜스글루타미나제 1(TGM1)(M98447); TGM2(XM-009482); TGN4(XM-056203); TGM7 (NM-052955); TGM3(L10386); 유비퀴틴 특이적 프로테아제 USP 26(NM-031907); 유비퀴틴 특이적 프로테아제(USP 28) (NM-020886); 26S 프로테아제 서브단위 4(L02426); LILRB1 (AF004230); 시그날 도입제 및 전사 1의 활성화제, 91kDa(STAT1)(977935); 및 프로테아제 (프로좀, 맥크로페인) 서브단위 6(PSMA6)(X59417)로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩티드 또는 핵산의 발현 조절, 바람직하게는, 하향 발현 조절을 검사함으로써, 피검자에서의 그룹 1 질환의 진단 또는 그룹 1 질환에 대한 민감성(바람직하게는, 습진 또는 습진에 대한 민감성)을 검정하였다.
실시예 D7
올리고누클레오티드 어레이를 사용하여 검정한 습진에서의 프로테아제 억제제 유전자의 발현
프로테이나제 억제제 유전자의 발현을 습진 환자 관련된 피부(습진 병변 피부), 습진 환자 비관련된 피부(습진 비병변 피부) 및 정상 피부에서 이하 기재된 바와 같이 검정하였다. 질환(관련 및 비관련)에서의 각각의 유전자 발현 수준을 정상 피부에서의 발현과 비교하였다.
결과를 이하 표 D7.1에 기재하였다. 기호 ++: 정상 발현; 기호 +++: 강한 발현; ++++: 높은 발현; + 정상 이하
표 D7.1
본 발명자들은 따라서 hbc750 사람 췌장 랑게르한스 섬(T11141; T10920);TIMP-4(NM-003256); TIM9a(AF150100); 플라스미노겐 활성화제 억제제 타입 2(l19066); 다가 프로테아제 억제제 WFIKKN (AF422194); 에핀-1(EPPIN)(AF286368); 에핀-2(EPPIN) (AF286369); 에핀-3(EPPIN) (AF286370); 스파르크/오스테오넥틴, cwcv 및 카잘 유사 도메인 프로테오글리칸(테스티칸)(SPOCK)(NM-004598); PI12(AH009756); HIV-1 프로테아제에 대한 사람 면역결핍 바이러스 타입 1 유전자(AB020923); 분비된 포스포단백질 2, 24kD(SPP2)(NM-006944); 및 시클린 의존성 키나아제 억제제 2B(p15, 억제 CDK4)(CDKN2B)(NM-004936)로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩티드 또는 핵산의 발현 조절, 바람직하게는, 하향 발현 조절을 검사함으로써, 피검자에서의 그룹 1 질환의 진단 또는 그룹 1 질환에 대한 민감성을 검정하였다.
본 발명자들은 따라서 SLPI(X04502); SKALP(XM-009524); L10343); CSTA(NM-005213; AA570193); SCCA(S66296); SCCA2(U19557); 플라스미노겐 활성화제 억제제 타입 1(X04729; X04731); PAI2(AF071400); SERPINA5 (NM-000624); TIMP(D11139); TIMP-1 (NM-003254); TIMP-2 (NM-003255); TIMP-3 (E13880); TIM9b(AF150105); 시스타틴 A (AA570193); 시스타틴 M/E (NM-001323); C1 억제제(SERPING1)(XM-046218); 프로테아제 억제제, 쿠니츠 타입 Kunitz type), 2(SPINT2)(XM-032280); 혈청 단백질 억제제, 카잘 타입 4(Kazal type 4)(SPINK4) (XM-SPINK4) (XM-005539); 프로테이나제 억제제, 클라드 B (오발부민), 구성원 9 (XM-053642); 혈청(또는 시스테인)프로테이나제 억제제, 클라드); B (오발부민), 구성원 6(XM-047984); 쿠니츠 및 WAP 도메인 1(eppin) 유사 혈청 프로테아제 억제제 (SPINLW1)(NM-020398); 프로테아제 억제제 쿠니츠 타입 1(SPINT1)(XM-056836); HIV-1 프로테아제에 대한 사람 면역결핍 바이러스 타입 1 유전자(AB020924); 조직 인자 경로 억제제 2(TFPI2)(NM-006528); 카텝신 F(CTSF (NM-003793); 혈청(또는 시스테인)프로테이나제 억제제, 클라드 A (알파-1 항프로테이나제, 항트립신), 구성원 6 (SERPINA6)(NM-001756); 혈청(또는 시스테인)프로테이나제 억제제, 클라드 B (오발부민), 구성원 3 (SERSPINB3)(NM-006919); 혈청 (또는 시스테인)프로테이나제 억제제, 클라드 A (알파-1 항프로테이나제, 항트립신), 구성원 3 (SERPINA3)(NM-001085); 호모사피언스 혈청(또는 시스테인)프로테이나제 억제제, 클라드 B(오발부민), 구성원 13(XM-008743); 혈청(또는 시스테인)프로테이나제 억제제, 클라드 B(오발부민), 구성원 5(SERPINB5)(XM-008742); RelA 관련된 억제제(XM-057693); DNA 결합 1의 억제제, 우세한 네거티브 나선-루프-나선 단백질(ID1)(XM-046179); 혈청(또는 시스테인)프로테이나제 억제제, 클라드 E(넥신, 플라스미노겐 활성화제 억제제 타입 1), 구성원 (SERPINE1)(XM-054850); 유사 시클린 의존성 키나아제 억제제 2B (p15. 억제 CDK4)(BC014469); 혈청(또는 시스테인)프로테이나제 억제제, 클라드 B (오발부민), 구성원 7(SERPINB7)(XM-008745); 활성화된 STAT 단백질 PIASy(PIASY)의 단백질 억제제(NM-016149); 활성화된 STAT 단백질 PIASy(LOC95830)의 유사 단백질 억제제(XM-016864); PKC-강화된 PP1 억제 단백질(PPP1R14A)(AY050668); DNA 결합 3의 억제제, 우세한 네거티브 나선-루프-나선 단백질(ID3)(NM-002167); 클라드 A (알파-1 항프로테이나제, 항트립신)(XM-028358); 혈청(또는 시스테인)프로테이나제 억제제, 클라드 H (열 쇼크 단백질 47), 구성원 1 (SERPONH1)(NM-004353); 허핀(hurpin)에 대한 PI13 유전자(혈청 프로테아제 억제제)(AJ278717); 프로테아제 억제제 5(마스핀)(PI5)(XM-008742); 및 PAI-2(A32415)로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩티드 또는 핵산의 발현 조절, 바람직하게는, 상향 발현 조절을 검출함으로써, 피검자에서의 그룹 1 질환의 진단 또는 그룹 1 질환에 대한 민감성을 검정하였다.
실시예 D8
반-정량적 RT-PCR
표피로부터 RNA 추출
RNA 추출을 알앤이지 키트(RNeasy kit)(QIAGEN)을 사용하면서 제조자의 지시에 따라서 수행하였다. RNA는 증식성 및 분환된 케라티노사이트로부터 주출하고, 또한 정상 표피 및 건선 병변 및 비병변 표피로부터 추출하였다. 정량화는 3가지의 상이한 희석액의 RT를 사용함으로써 수행하여 각각의 샘플에 대하여 PCR을 수행하였다.
정상, 건선 및 습진 피부에서의 코르네오데스모좀, 프로테아제 및 프로테아제 억제제의 RT-PDR
다양한 코르네오데스모좀, 프로테아제 및 프로테아제 억제제 유전자의 발현 수준을 정상, 건선 및 습진 피부(관련된 및 비관련된)에 대한 RT-PCR에 의해서 검정하였다. 피검자로부터의 관련된 및 비관련된 피부에서의 발현수준을 정상, 즉, 질환이 없는 피부에서의 상응하는 발현과 비교하였다. 건정된 코르네오데스모좀, 프로테아제 및 프로테아제 억제제 유전자는 각각 표 D2.1 및 D5.1; D3.1 및 D6.1; D4.1 및 D7.1에 기재된 것들이다.
결과
RT-PCR 결과는 상기 실시예에 상세하게 기재된 바와 같이 발현 변화를 광범위하게 나타내고 있다. 올리고누클레오티드 어레이에 의해서 검정된 다양한 코르네오데스모좀, 프로테아제, 및 프로테아제 억제제 유전자의 발현 수준 연구 결과는 따라서 발현된 정보 수준의 직접 검정에 의해서 확인된다.
실시예 E: 처리
실시예 E1
테입 스트립을 사용하여 검정한 코르네오데스모좀 밀도
전달 전자 현미경 분석을 위한 테입 스트립의 제조
테입 스트립을 문헌[Guerrin et al., 1998]에 기재된 방법에 따라서 제조하였다.
피부 상태 습진, 건선, 피부염 및 건선을 앓고 있는 환자와 대조 환자로부터의 테입 스트립의 작은 조각을 4℃의 카르노브스키 정착제(Karnovsky fixative)(0.1M 인산염 완충액 pH7.4중의 2% 파라포름알데히드, 2.5% 글루타르알데히드)중에 2시간 동안 정착시켰다. 샘플을 이어서 10% 수크로스을 함유한 0.1M 인산염 완충액(pH7.4)중에 3회 세척하는데 각각 4℃에서 30분 동안 세척하였다.
2차 고정을 2% 테트록시드 수용액중에서 1시간 동안 실온하에서 수행하였다. 실온하에서 일련의 구배비의 에탄올로 탈수시켰다(75% 에탈올로 15분; 95% 에탄올로 15분; 100% 에탄올로 15분 동안 2회 세척; 황산염화구리 무수물로 건조시킨 100% 에탄올로 15분).
수지 함침을 위해, 샘플을 우선 15분 간격을 두고 중간물질 용매인 프로필렌 옥시드중에 위치시켰다. 그 후, 실온하에서 프로필렌 옥시드:아랄다이트 수지의 50:50 혼합물중에 침투시켰다. 샘플을 실온하에서 6-8시간 동안 완전 강도의 아랄다이트 수지에 위치시켰다. 생검부를 48시간 동안 60℃하에서 신선한 아랄다이트 수지로 함침시켰다. 함침을 위한 아랄다이트 수지는 1ml의 수지 혼합물당 CY212 아랄타이트: 도데세닐 숙신산 무수물(DDSA)의 50:50 혼합물과 한방울의 n-벤질디메틸아민(BDMA) 촉진제로 구성되어 있다.
초박절편(70-90nm)을 초박절편기로 절단하였다. 절편을 5분 동안 50% 에탄올중의 3% 우라닐 아세테이트로 염색한 후, 2분 동안 레이놀드의 리드 시트레이트(Reynold's Lead Cirtrate)로 염색하였다. 절편을 80Kv의 촉진 전압하에서 필립스 CM10 투과 전자 현미경을 사용하여 시험하였다. 전자현미경 사진을 아그파 사이언티아 23D56D EM 필름상으로 기록하였다.
코르네오데스모좀 밀도(코르네오데스모좀을 총 현미경 사진 영역으로 나눔으로써 수득된 영역)를 각각의 조건의 테이프 스트립의 전자 현미경 사진에서 측정하였다.
각질층 환자의 프로테아제로의 처리
정상적 및 손상된 각질층으로부터의 3x3mm의 테이프 스트립을 10x 농축된 단백질가수분해 완충액(10mM 인산염화나트륨 완충액, pH 7.2, 0.15M NaCl)중의 22-50nM 재조합 SCCE 또는 SCTE와 1-6시간 동안 37℃하에서 배양하였다. 반응을 중단하고, 상기 설명된 바와 같이 코르네오데스모좀 계수를 위한 전자 현미경 분석을 위해 스트립을 고정시켰다.
결과
본 실시예의 결과는 도 13에 도시되어 있다.
건선 및 좌창에 걸린 환자의 상부 각질층에서 코르네오데스모좀의 밀도는 정상적인 피부와 비교하여 현저하게 증가하였다. 피부염 및 습진 환자의 각질층의 모르네오데스모좀의 밀도는 현저하게 감소하였다.
실시예 E2. 건선 피부로부터의 테이프 스티립의 프로테아제로의 처리
정상 개체 및 건선 개체로부터의 테이프 스트립을 수득하였으며, 설명된 바와 같이 처리하였다. 코르네오데스모좀 밀도는 상기와 같이 분석하였다.
결과
본 실험의 결과는 도 14에 도시되어 있다.
많은 코르네오데스모좀이 비처리된 각질층과 비교하여 처리된 각질층에서 현저하게 감소되었다. 이러한 실험은 코르네오데스모좀 수와 SCCE 또는 SCTE에 의한 단백질가수분해간에 직접적인 관계를 입증해준다.
논의
프로테아제(예를 들어, SCCE/SCTE)를 사용하여, 피부 배리어가 증가된(즉, 그룹 Ⅱ 질환)된 환자의 각질층에서 코르네오데스모좀의 수를 감소시키는 것을 입증하였다. 따라서, 본 발명자들은 각질층 결합력이 증가된 환자에서 일반적인 피부 배리어의 형성을 증진시키는 신규한 처리법을 제안하였다.
실시예 E3. 프로테아제로의 건선 환자 피부 생검 처리
모집
로얄 할람셔어 병원(Royal Hallamshire Hospital)의 피부과에서 건 선에 걸린 환자를 확인하고, 모집하였다. 40세를 초과하고, 활성 건선의 증상을 나타내며, 전신 길항제로 처리되지 않은 환자를 선별하였다. 류마티스 열, 인공 판막 또는 관절 대체물을 갖는 환자는 자동적으로 제외시켰다. MREC 승인(MREC/98/4/018)하에 각각의 환자로부터 동의하에서 모든 정보를 수득하였다. 처리 전에 생검 부위의 국부적 처리를 2중 동안 생략하였다.
과정
모든 생검을 수술실에서 피부과 전문의에 의해 수행하였다. 살균 처리를 수행하고, 전 과정에 걸쳐 살균/1회용 장치를 사용하였다. 2개의 피부 생검부를 각각의 환자의 등 하부에서 취하였으며, 하나는 활성 만성 반건성 영역으로부터 취하고, 다른 하나는 이로부터 10cm 이상 떨어진 관련되지 않은 부분에서 취하였다. 등 하부를 멸균액으로 세척하고, 국부 마취제를 생검하려는 부위에 주입시켰다. 약 1.5cm 내지 0.5cm의 타원을 손상 및 비손상 피부로부터 절제하고, PBS 용액이 담긴 용기에 넣었다. 상처부위를 깊은 봉합을 위한 장선 및 얕은 봉합을 위한 에틸론을 사용하여 봉합하였다(상처당 2 또는 3개의 땀을 사용). 수술 후, 상처부위를 멸균 드레싱으로 덮고, 집에 보내기 전에 30분 동안 관찰하였다. 2주 후에 봉합선을 제거하였다.
프로테아제 처리
하기 과정은 무균 상태하에서 수행하였다. 건선 피부 생검부를 외과용 멸균 메스를 사용하여 2조각으로 잘랐다. 생검부의 반은 24웰 플레이트의 한 웰에 2ml의 0.25% 키모트립신(피부 유지 배지로부터 10x 원액으로 희석됨, 시킨에틱(Skienthic))에 넣었다. 다른 반은 첨가제 없이 2ml의 유지 배지에서 배양하였다. 웰 플레이트를 37℃에서 16시간 동안 인큐베이팅하였다. 그 후, 두 생검 단편을 PBS로 2회 린스하고, 하기와 같이 전자현미경 관찰을 위해 고정시켰다.
전자현미경 처리
피부 생검 샘플을 카르노브시크 고정제(0.1M 인산염 완충액중의 2.5% 글루테르알데히드, 2% 파라포름알데히드, pH 7.4)중에서 2시간 동안 4℃하에 고정시켰다. 그 후, 샘플을 10% 수크로스를 함유하는 0.1M 인산염 완충액(pH 7.4)으로 30분 동안 4℃에서 3회 세척하였다.
2차 고정을 2% 테트록시드 수용액중에서 1시간 동안 실온하에서 수행하였다.실온하에서 일련의 구배비의 에탄올로 탈수시켰다(75% 에탈올로 15분; 95% 에탄올로 15분; 100% 에탄올로 15분 동안 2회 세척; 황산염 구리 무수물로 건조시킨 100% 에탄올로 15분).
수지 함침을 위해, 샘플을 우선 15분 간격을 두고 중간물질 용매인 프로필렌 옥시드중에 위치시켰다. 그 후, 실온하에서 프로필렌 옥시드:아랄다이트 수지의 50:50 혼합물중에 침투시켰다. 샘플을 실온하에서 6-8시간 동안 완전 강도의 아랄다이트 수지에 위치시켰다. 생검부를 48시간 동안 60℃하에서 신선한 아랄다이트 수지로 함침시켰다. 함침을 위한 아랄다이트 수지는 1ml의 수지 혼합물당 CY212 아랄타이트: 도데세닐 숙신산 무수물(DDSA)의 50:50 혼합물과 한방울의 n-벤질디메틸아민(BDMA) 촉진제로 구성되어 있다.
초박절편(70-90nm)을 초박절편기로 절단하였다. 절편을 5분 동안 50% 에탄올중의 3% 우라닐 아세테이트로 염색한 후, 2분 동안 레이놀드의 리드 시트레이트(Reynold's Lead Cirtrate)로 염색하였다. 절편을 80Kv의 촉진 전압하에서 필립스 CM10 투과 전자 현미경을 사용하여 시험하였다. 전자현미경 사진을 아그파 사이언티아 23D56D EM 필름상으로 기록하였다.
결과
결과는 도 15, 16, 17 및 18에 도시되어 있다.
도 15에는 비처리된 건선 생검이 도시되어 있다. 도 16은 0.25% 키모트립신으로 16시간 동안 처리된 건선 생검부가 각질층을 스플리팅시킨다(극세포해리)는 것을 보여준다. 이는 키모트립신에 의한 코르네오데스모좀의 분해로 인한 것이다.도 17은 비처리된 건선 생검 절편을 나타낸다(각질층). 많은 코르네오데스모좀이 관찰될 수 있으며, 이중 일부는 흰색 화살표로 가리켰다. 도 18은 16시간 동안 0.25% 키모트립신으로 처리된 건산 생검의 각질층에서, 프로테아제 처리 후 더 적은 코르네오데스모좀이 더 적게 보인다(흰색 화살표). 분해된 코르네오데스모좀의 일부 잔여물 또한 볼 수 있다(점선의 흰색 화살표).
논의
키모트립신 및 대조군(비처리된 건선 장애 피부)으로 치리된 건선 장애 생검을 비교하여, 키모트립신 처리된 샘플에서 상피 세포 층의 현저한 스플리팅(극세포해리)가 나타났다. 이는 각질층의 더 낮은 부분 및 각질층과생존 상피세포의 접합부에서 존재한다. 피부 배리어의 분해는 증가된 배리어 작용(즉, 그룹 Ⅱ 질환) 예를 들어, 건조(본원에 상세히 설명된 바와 같이) 및 좌창으로 인한 질환을 치료하는데 사용될 수 있다.
실시예 E4. 피부 동등물의 프로테아제로의 처리
재료
재구성된 사람 상피세포 배양물 및 유지 배지를 스킨에틱 티슈 컬쳐 래보러토리(Skinethic Tissure Culture Laboratories, Nice)로부터 구입하였다. 키모트립신을 시그마 케미컬로부터 구입하였다.
방법
1ml의 실온하의 스킨에틱 유지 배지를 6-웰 조직 배양 플레이트의 각각의 웰에 첨가하였다(피부 동등물당 하나의 웰). 피부 동등물을 함유하는 세포 배양 삽입물을 멸균 포르셉(forcep)을 사용하여 아가로스 수송 배지로부터 제거하고, 공기 버블이 형성되지 않는 웰에 넣었다. 웰 플레이트를 37℃하의 5% CO2의 습식 인큐베이터에 넣었다. 24시간 후, 배지를 교환하고, 적당하게 처리하였다. 200㎕의 각가의 처리물을 하기와 같은 피부 동등물의 표면에 도포하였다: 대조군-완충된 염 용액; 10% 소태 혈청; 0.25% 키모트립신; 6μM 펩티드 643.
모든 시약은 1리터의 하기 물질을 포함하는 완충된 염 용액중에서 정확한 농도로 구성되어 있다: 0.142g Na2HPO4, 1.802 글루코스, 7.149g HEPES, 0.224g KCl, 7.597g NaCl, pH 7.4
모든 배양물을 16시간 동안 37℃하에서 처리하였다.
광학 현미경 처리
피부 동등물 및 막을 외과용 매스를 사용하여 세포 배양 삽입물로부터 절단하였다. 동등물을 24시간 동안 4℃하에서 인산염 완충된 염수중에서 10% 포름알린(3.7% 포름알데히드)중에서 고정시켰다. 샘플을 PBS로 3번 세척하였다. PBS를 샘플로부터 따라내고, 샘플을 70% 에탄올로 3x5분, 95% 에탄올로 2x5분, 100% 에탄올로 2x5분 동안 탈수시켰다. 그 후, 샘플을 5분 동안 자일렌에 넣고, 침투를 위해 5분 동안 용융된 파라핀중에 위치시켰다. 샘플을 각각의 단계 동안 때때로 진탕시켰다. 그 후, 동등물을 함침된 몰드중의 더 많은 용융된 파라핀중에 배향시키고, 1시간 동안 고정시켰다.
각각의 블록의 5㎛ 절편을 취하고, 유리 현미경 슬라이트에 모았다. 슬라이드를 50℃하에서 밤새 건조시켰다.
조직연구를 위한 메타톡실린 및 에오신 염색
2x5분 동안 자일렌중에 위치시킨 슬라이드를 세척하여 원하지 않는 파라핀을 제거하였다. 그 후, 슬라이드를 하기 각각에서 5분 동안 위치시켜 재탈수시켰다; 2x100% 에탄올, 1x95% 에탄올, 1x70% 에탄올. 그 후, 슬라이드를 흐르는 물에서 1분 동안 린스하였다. 길스 헤마톡실린(2분)으로 염색하고, 물로 2분 동안 린스하고, 1% 에오신에서 5분동안 위치시키고, 물로 간단하에 린스하였다. 샘플을 한번 더 70% 에탄올중에 30초, 95% 에탄올중에 30초 및 100%의 에탄올중에 1분 및 2분 위치시켜 탈수시켰다. 그 후, 슬라이드를 1분 동안 자일렌중에 위치시킨 후, 현미경용 DPX 마운탠트와 커버스립을 탑재시켰다.
슬라이드를 40x 대물 렌즈를 사용하여 광학 현미경으로 관찰하고, 전형적인 이미지를 시놉틱스 악퀴스 프로를 사용한 PC상으로 나타내었다.
결과
키모트립신(0.25%)은 각질층의 배리어를 분해시켰다. 층은 "더욱 푸석푸석(looser)"해 졌으며, 생육가능한 세포층으로부터 떨어져나갔다. 따라서, 키모트립신은 모르네오데스모좀을 분해시킨다.
피부 동등물을 SCCE 또는 SCTE로 처리할 경우, 유사한 효과가 관찰되었다. 따라서, 프로테아제 예컨대, 키모트립신, SCCE 및 SCTE는 각질층 두께가 증가되는 건선 및 좌창과 같을 질환을 치료하는데 사용될 수 있다. 본원에 도시된 이러하 효소는 세포층과 연결된 코르네오데스모좀을 분해하여 각질층 배리어의 두께를 감소시킨다.
실시예 E5. SLPI 프로테아제 억제제 펩티드로의 피부 동등물 처리
재료
17일 재구성된 사람 상피세포 배양물 및 유지 배지를 스키에틱 티슈 컬쳐 래보러토리로부터 구입하였다. NUNC 조직 배양물 플라스틱웨어를 라이프 테크롤로니스로부터 수득하였다.
피부 배이러 형성에서 중요한 단백질 영역에 상응하는 많은 펩티드를 표준 방법을 사용하여 합성하였다. 펩티드는 하기 표 E5.1에 기재된 바와 같다.
펩티드 643, 651 및 653은 동일한 단백질(SLPI)의 상이한 영역에 상응한다. 종양괴사인자-α(TNF-α) 및 인터루킨-1β(IL-β)를 칼바이오켐으로부터 구입하였다.
표 E5.1
방법
1ml의 실온하의 스킨에틱 유지 배지를 6-웰 조직 배양 플레이트의 각각의 웰에 첨가하였다(피부 동등물당 하나의 웰). 피부 동등물을 함유하는 세포 배양 삽입물을 멸균 포르셉(forcep)을 사용하여 아가로스 수송 배지로부터 제거하고, 공기 버블이 형성되지 않는 웰에 넣었다. 웰 플레이트를 37℃하의 5% CO2의 습식 인큐베이터에 넣었다. 24시간 후, 배지를 교환하고, 적당하게 처리하였다. 200㎕의 각가의 처리물을 하기와 같은 피부 동등물의 표면에 도포하였다: 대조군-완충된 염 용액; 10% 소태 혈청; 0.25% 키모트립신; 6μM 펩티드 643.
모든 시약은 1리터의 하기 물질을 포함하는 완충된 염 용액중에서 정확한 농도로 구성되어 있다: 0.142g Na2HPO4, 1.802 글루코스, 7.149g HEPES, 0.224g KCl, 7.597g NaCl, pH 7.4
200㎕의 하기 치료제를 피부 동등물의 표면에 도포하였다: (1) 대조군-완충된 염 용액; (2) 6μM 펩티드 641; (3) 6μM 펩티드 642; (4) 6μM 펩티드 643; (5) 6μM 펩티드 651; (6) 6μM 펩티드 653.
하기 치료제를 원액(10㎍/ml TNF-α, 1㎍/m IL-1β)로부터 1ml의 배지로 희석시키고, 배지 교체 동안 웰에 첨가하였다: (7) 2.5ng/ml TNF-α; 및 (8) 75ng/ml IL-1β.
모든 배양물을 16시간 동안 37℃하에서 처리하였다.
결과
결과를 도 19 내지 25에 도시하였다.
혈청은 트립신 및 키모트립신의 억제제를 포함하는 많은 프로테아제 억제제를 함유한다. 피부 동등물 이외에, 10% 혈청이 각질층의 두께를 감소시키는 것으로 나타났다.
도 19는 6μM의 펩티드 641을 첨가하면 각질층이 더욱 침투가능해 진다는 것을 보여준다.
도 20은 6μM의 펩티드 642를 첨가하면 각질층이 더욱 침투가능해 진다는 것을 보여준다.
도 21은 피부 배양물에 펩티드 643의 첨가한 후에, 더욱 현저한 효과가 관찰됨을 보여준다. 이러한 펩티드는 SLPI의 짧은 영역을 의태한다. 이러한 짧은 영역(7개의 아미노산)으로 인해, SCCE 및 SCTE를 포함하는 프로테아제 효소를 특이적으로 억제하는 각질층을 침투하는 것이 가능하게 된다. 관찰된 전반적인 효과는 각질층을 두께를 두껍게하여, 피부 배리어를 증가시킨다는 것이다.
도 22는 6μM의 펩티드 651(SLPI)의 첨가가 각질층의 두께를 증가시켜, 결국 피부 배리어를 증가시킨다는 것을 보여준다.
도 23은 6μM의 펩티드 653(SLPI)의 첨가가 각질층의 두께를 증가시켜, 결국 피부 배리어를 증가시킨다는 것을 보여준다.
따라서, 단백질 억제제 및 이들의 단편은 손상된 피부 배리어 기능을 포함하는 증상을 갖는 질환(예를 들어, 피부염, 습진)의 신규한 치료법을 제공한다. 포함된 신규한 펩티드는 이들의 작은 크기 및 침투성, 및 피부 배리어 두께의 증가에 영향을 끼치기 때문에 손상된 피부 배리어를 갖는 피부 질환 치료제로서 사용될 수있다.
도 24는 2.5ng/ml TNF-α의 첨가가 각질층의 두께를 증가시키고, 피부 배리어를 증가시킨다는 것을 보여준다.
도 24는 2.5ng/ml IL-1β의 첨가가 각질층의 두께를 증가시키고, 피부 배리어를 증가시킨다는 것을 보여준다.
논의
데모콜린 및 메노플라킨의 펩티드 641 및 642의 의태 영역 두 단백질은 코르네오데스모좀을 구성하며, 이들의 세포 구조는 각질층의 세포 결합에 영향을 끼친다.
피부 동등물을 이러한 펩티드로 처리할 경우, 피부 배리어의 피륙이 병형되고, 더욱 침투가능하게 된다. 따라서, 펩티드 641 및 642는 증가된 각질 결합을 포함하는 증상을 갖는 질환(예를 들어, 건선 및 좌창, 즉 모든 그룹 Ⅱ 질환)에 대한 신규한 치료제로서 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명자는 유착 단백질 또는 이들의 단편을 개체 투여하는 것을 포함하여, 개체의 그룹 Ⅱ 질한, 바람직하게는 건선 및/또는 좌창의 치료 또는 예방 방법을 제공한다. 바람직하게는, 데스모콜린의 단편 또는 데스모플라킨의 단편을 투여하며; 더욱 바람직하게는, 펩티드 641 및/또는 펩티드 642를 포함하는 펩티드를 투여한다.
펩티드 643, 651 및 653을 피부 동등물에 투여하면, 각질층 두께가 증가되었다. 이러한 펩티드는 SLPI의 의태 영역 즉, 프로테아제 각질층 키모트립신 효소 및각질층 트립신 효소(각각 SCCE 및 SCTE )의 억제제로서 설계되었다. 이러한 효소는 각질층의 데스모좀을 분해하여, 세포 접착을 감소시킨다. 각질층 두께의 증가는 펩티드 643, 651 및 653이 프로테아제를 억제한다는 것을 보여준다. 가장 현저한 효과는 피부 배양물에 펩티드 643을 첨가한 후에 관찰되었다. 이러한 펩티드는 SLPI의 짧은 영역을 의태한다. 이러한 짧은 영역(7개 아미노산)으로 인해, 이는 프로테아제 효소 SCCE 및 SCTE를 특이적으로 억제하는 각질층에 침투가능해진다.
TNFa 및 IL-1β는 이들이 SLPI와 같은 프로테아제 억제제의 활성화제이기 때문에, 또한 습진 및 피부염과 같은 접착 감소와 관련된 질환을 치료하는데 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명자는 개체에 프로테아제 억제제 또는 이들의 단편을 투여하는 것을 포함하여, 개체의 그룹 Ⅰ 질환, 바람직하게는 습진 및/또는 피부염, 더욱 바람직하게는 아토피성 피부염 및/또는 포진성 피부염을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 바람직하게는, SLPI의 단편이 투여되며; 더욱 바람직하게는, 서열 펩티드 643 및/또는 펩티드 651 및/또는 펩티드 653을 포함하는 펩티드가 투여된다.
SLPI의 억제제 효과를 의태하는, SLPI 유전자뱅크 서열(X04502)로부터 유도된 펩티드의 완전한 리스트는 하기와 같다: CGKS(SB7a) 및 CGKS CVSPVKA(SB7b); KIIDGA; GDKIIDGA; GDKIID; KII; KIID; KIIDG; KIIDGA; LDPVD(651); KRDLK(652); LDPVDTPNP(653); LDPVDTPNPTRRKPG(654); CGKSCVSPVKA(644); CVSPVKA(643). 따라서, 이러한 펩티드는 그룹 Ⅰ 질환의 치료 또는 예방에 사용될 수 있다.
실시예 E6. 피부 동등물의 기타 프로테아제 억제제로의 처리
방법
피부 동등물(+ 및 - 억제제)을 24시간 동안 억제제와 함께 배양하였다. 피부 동등물은 조직학적 섹션 제조에 취해진다. 그 후, 섹션을 광학 현미경 및 전자 현미경으로 분석하였다.
SLPI
SLPI(500nM)를 배양된 피부 동등물에 첨가하고, 24h 동안 배양하였다. 피부 동등물(+ 및 - SLPI)을 섹션 제조에 취하였다. 그 후, 섹션을 광학 현미경 및 전자 현미경으로 분석하였다.
SLPI로의 처리는 각질층의 두께를 증가시키고, 피부 배리어을 증가시켰다. 따라서, SLPI는 그룹 Ⅰ 질환 예컨대, 습진 및 피부염을 치료하는데 사용될 수 있다.
항-SCCE 항체
SCCE 항체를 배양된 피부 동등물에 첨가하고, 24시간 동안 배양하였다. 피부 동등물(+ 및 - SCCE 항체)은 섹션 제조에 취하였다. 그 후, 섹션을 광학 현미경 및 전자 현미경으로 분석하였다.
항-SCCE 항체로의 처리는 각질층의 두께를 증가시키고, 피부 배리어을 증가시켰다. 따라서, 항-SCCE 항체는 그룹 Ⅰ 질환 예컨대, 습진 및 피부염을 치료하는데 사용될 수 있다.
항-SCTE 항체
SCTE 항체를 배양된 피부 동등물에 첨가하고, 24시간 동안 배양하였다. 피부동등물(+ 및 - SCCE 항체)은 섹션 제조에 취하였다. 그 후, 섹션을 광학 현미경 및 전자 현미경으로 분석하였다.
항-SCTE 항체로의 처리는 각질층의 두께를 증가시키고, 피부 배리어을 증가시켰다. 따라서, 항-SCCE 항체는 그룹 Ⅰ 질환 예컨대, 습진 및 피부염을 치료하는데 사용될 수 있다.
실시예 E7. 프로테아제 억제제로 습진에 걸린 개체의 치료법
방법
SPLI 프로테아제 억제제를 지원자의 정상적인 사람 피부로부터 추출하였다. 대안적으로, 개체로부터 프로테아제 억제제를 코드화하는 핵산 서열을 PCR 또는 라이브러리 스크리닝을 통해 클로닝하였다. 개체의 프로테아제 서열을 발현 벡터로 클로닝시키고, 재조합 프로테아제 억제제를 발현시키고, 통상적이고 공지된 방법으로 정제하였다.
그 후, 개체를 연화 크림 베이스로 제형화시켰다. 두 손가락끝 단위의 이러한 제형을 지원자 팔의 2x3cm 피부 영역에 도포하였다. 영역을 플라스틱 캡슐로 덮고, 면붕대로 봉하였다. 14일 후 크림을 동일한 부위에 재도포하였다.
14일째에, 컵을 제거하고, 1x0.5cm 타원 피부 생검부를 처리된 영역으로부터 취하고, 반대 팔의 비처리된 영역으로부터 유사한 생검부를 취하였다.
결과
대조군과 비교한 처리된 생검부의 조직학적 시험은 각질층의 표면 부분에서 각질층의 두께가 느슨하게 점착되어 있음을 보여주었다. 이는 건선 플라크의 상부의 특징을 상기시켰다. 생존 상피세포내에서, 부전각화증이 생겼으며, 두께가 두꺼워졌다. 또한, 이러한 특징은 건선 장애에서 관찰되는 것과 유사하였다.
논의
SPLI 프로테아제 억제제의 첨가에 대한 피부의 두께 증가는 손상된 피부 배리어 기능을 포함한 증상을 갖는 질환(예를 들어, 습진, 피부염)의 치료에 유용한 것을 알 수 있다.
실시예 F: 형질전환체
실시예 F1. 코르네오데스모신을 과다발현하는 형질전환된 마우스
본 발명자들은 비정상적인 피부 배리어를 갖는 형질전환 마우스를 생성시키기 위해 마우스에서 코르네오데스모신 유전자를 과다발현시켰다.
코르네오데스모신 단편의 발생
5'UTR, 전체 ORF 및 3'UTR을 함유하는 전방향 5'ccgtgcagtccgagatg3' 및 역방향 5'gatatagtgtatgtgcttg3'을 포함하는 프라이머 세트를 사용하여 상피세포로부터 단리된 mRNA로부터 cDNA를 생성시켰다. PCR 생성물(1659bp)을 정제하였다(상기 설명된 바와 같이). 변형된 프라이머를 사용하여 정제된 생성물을 주쇄로서 사용하였다. 이들 프라이머는 이들 5'말단에서 NotI 부위를 함유한다.
PCR 생성물을 NotI 제한 효소와 4시간 동안 37℃에서 제한된 1% 아가로스 겔로부터 정제하였다. 설계된 생성물을 인볼루크린 발현 카세트로 삽입시키고, 형질전환 유전자 단편을 모 플라스미드로부터 절제하고, 정제하였다. 정제된 단편은 난모세포 주입을 위해 5mg/ml의 농도의 멸균 PBS중에 현탁시켰다.
인볼루크린 발현 카세트
인볼루크린 발현 카세트는 문헌[Carroll et al, 1993 and 1996]에 설명된 바와 같이 3.7-kb 인볼루크린 서열(인볼루크린 프로모터의 2.5kb), 원숭이 바이러스 40(SV 40) 인트론 및 SV40 폴리아데닐화 서열을 포함한다. 간단하게는, -2500 내지 +1240(숫자는 전사 개시 부위(+1)의 업스트림(-) 및 다운스트림(+)에 기초한 숫자임)의 3740bp 힌드 Ⅲ 단편은 인트론 1의 공여체 및 수용체 부위를 포함하는 인볼루크린 유전자의 인트론 1, 엑손 1, 근접 영역 TATAA, 원위 영역을 함유한다(Carroll et al, 1993).
동물 표현형
코르네오데스모신을 과다발현하는 마우스를 벗겨져 떨어지는 피부가 두껍다. 이러한 변화는 다리, 귀 및 머리에서 가장 현저하였다. 손상된 피부의 조직연구는 연장되고, 아래가 클럽 모양이 되는 상피세포의 극세포증을 나타내었다. 또한, 상피내세에서 부전각화증 및 각화증이 발견되었다. 각질층이 비늘이 벗겨지는 표면에서 두꺼워졌다. 이러한 특징을 건선 피부에서 관찰되는 일부 변화와 유사하였다.
미만성 탈모가 코르네오데스모신 마우스에서 전개되었다. 이는 두 번째 달 후에 더욱 확실해졌다.
조직학 및 면역조직화학
성별 및 몸체 부위에 따라 매칭된 형질전환 및 형질전환-음성 마우스로부터의 조직을 모든 조직 연구에 사용하였다. 조직학적 분석을 위해, 조직을 포르몰-염수에서 밤새 고정시키고, 파리핀으로 함침시키고, 섹션화시키고, 헤마톡실린 및 에오신으로 염색하였다. 클로로아세테이트 에스테라아제를 호중구에 대한 조직화학 마아커로서 사용하였다. TUNEL을 정상적인 마우스 및 형질전환된 마우스의 파리핀 섹션에서 수행하였다(Carroll et al, 1995). 피부는 두꺼웠으며, 마우스의 등 피부의 조직학적 섹션은 상피세포의 두께의 현저한 증가를 나타내었다. 피부 배리어는 건선 피부에서 관찰된 바와 같이 이러한 동물에서 증가하였다.
면역조직화학 분석은 마우스 코르네오데스모신에 특이적인 항체(1:40 희석)로 수행하였다. 1차 항체를 아비딘 DH 및 바이오티닐화된 염색 시스템을 사용하여 2차 항체에 의해 검출하였다(Vectasatain ABC kit, USA). 염색은 매치된 대조군과 비교하여 형질전환된 동물의 피부에서 코르네오데모신의 높은 발현이 나타난다는 것을 보여준다. 이러한 코르네오데모신의 과다발현은 주로 형질전환된 동물 피부의 수프라바살 층에서 관찰되었다.
실시예 F2. SCCE를 과다발현하는 형질전환 마우스
본 발명자들은 심각한 비정산(손상) 피부 배리어를 갖는 형질전환 마우스를 생성시키기 위해 마우스에서 SCCE를 과다발현시켰다.
상이한 SCCE 하플로타입을 5'UTR, 전체 ORF 및 3'UTR을 함유하는 전방향(5'에서 3'): CGG GCT CCA TGG CAA GAT C 및 역방향(5'에서 3'): GCG TCC TCA CTC CTG TGC를 포함하는 프라이머 세트를 사용하여 손상된 상피세포로부터의 RNA를 사용하여 증폭시켰다. PCR 생성물을 정제하였다(상기 설명된 바와 같이). 변형된 프라이머를 사용하여 정제된 생성물을 주쇄로서 사용하였다. 이들 프라이머는 이들 5'말단에서 NotI 부위를 함유한다. PCR 생성물을 NotI 제한 효소와 4시간 동안 37℃에서 1% 아가로스 겔로부터 정제하였다. 설계된 생성물을 인볼루크린 발현 카세트로 삽입시키고, 형질전환 유전자 단편을 모 플라스미드로부터 절제하고, 정제하였다. 정제된 단편은 난모세포 주입을 위해 5mg/ml의 농도의 멸균 PBS중에 현탁시켰다.
동물 표현형
SCCE를 과다발현하는 성인 마우스는 피부 배리어에서 비정상적이다. 수프라층에서 SCCE를 과다발현하는 동물은 널리 퍼진 피부 물집에 본재한다. 피부 배리어 손상은 SCCE 비질환 대립 유전자를 과다발현하는 동물과 비교해 이러한 동물에서 더욱 현저하였다.
조직학 및 면역조직화학
형질전환 및 형질전환-음성 마우스로부터의 조직을 상기 설명된 바와 같이 매칭시키고, 처리하였다.
피부는 두꺼웠으며, 마우스의 등 피부의 조직학적 섹션은 상피세포의 두께의 현자한 증가를 나타내었다. 이러한 동물에서 피부 배리어가 습진 세포에서 관찰되는 바와 같이 손상되었다.
면역조직화학 분석은 마우스 SCCE에 특이적인 항체(1:40 희석)로 수행하였다. 1차 항체를 아비딘 DH 및 바이오티닐화된 염색 시스템을 사용하여 2차 항체에 의해 검출하였다(Vectasatain ABC kit, USA). 염색은 매치된 대조군과 비교하여 형질전환된 동물의 피부에서 SCCE의 높은 발현이 나타난다는 것을 보여준다. 이러한 SCCE의 과다발현은 주로 형질전환된 동물 피부의 수프라바살 층에서 관찰되었다.
수프라바살 층에서 SCCE를 과다발현하는 동물은 건조한 벗겨지기 쉬운 피부를 갖는다. 피부의 조직학적 실험은 상피세포에서의 스플릿을 밝혀내었다. 이러한 극세포해리는 키모트립신으로 처리된 피부 동등물 배양물에서 관찰된 것과 유사하였다(본 연구의 처리 부분 참조). 스플릿은 과립층내에서, 과립층과 가시층 사이에서, 각화된 세포와 과립 세포 사이에서 발생한다. 또한, 각질층내에 스플릿이 발생할 수 있다.
SCCE 형질전환(+/+) 마우스의 상피세포는 한배새끼의 짭보다 더 두꺼웠다. 이러한 두께 증가는 모든 몸체 부위에서 발견되었다. 본 발명자는 염료 침투 분석을 사용하여 SCCE 형질전환 마우스에서 상피세포 배이러의 완정성을 시험하였다(Hardman et al., 1998; Marshall et al., 2000). SCCE +/+ 형질전환 마우스는 배이러 기능의 국부적 손실을 나타내는 많은 검은 점을 나타내었다.
실시예 F3. SLPI를 과다발현하는 형질전환 마우스
5'UTR 전체 ORF 및 3'UTR을 함유하는 전방향 5'ctcctgccttcaccatgaag3' 및 역방향 5'cagagcctcctccatatg3'을 포함하는 프라이머 세트를 사용하여 상피세포로부터 단리된 mRNA로부터 cDNA를 생성시켰다. PCR 생성물을 정제하였다(상기 설명된 바와 같이).
변형된 프라이머를 사용하여 정제된 생성물을 주쇄로서 사용하였다. 이들 프라이머는 이들 5'말단에서 NotI 부위를 함유한다. PCR 생성물을 NotI 제한 효소와 4시간 동안 37℃에서 제한된 1% 아가로스 겔로부터 정제하였다. 설계된 생성물을 인볼루크린 발현 카세트로 삽입시키고, 형질전환 유전자 단편을 모 플라스미드로부터 절제하고, 정제하였다. 정제된 단편은 난모세포 주입을 위해 5mg/ml의 농도의멸균 PBS중에 현탁시켰다.
동물 표현형
SLPI를 과다발현하는 성인 마우스는 피부가 비정상적이다. SLPI는 형질전환 동물의 상피세포의 수프라층에서 발현된다; 이는 형질전환 마우스가 건선 피부와 유사한 표현형을 갖는다는 것을 보여준다.
조직학 및 면역조직화학
성별 및 몸체 부위에 따라 매칭된 형질전환 및 형질전환-음성 마우스로부터의 조직을 모든 조직 연구에 사용하였다. 조직학적 분석을 위해, 조직을 포르몰-염수에서 밤새 고정시키고, 파리핀으로 함침시키고, 섹션화시키고, 헤마톡실린 및 에오신으로 염색하였다. 클로로아세테이트 에스테라아제를 호중구에 대한 조직화학 마아커로서 사용하였다. TUNEL을 정상적인 마우스 및 형질전환된 마우스의 파리핀 섹션에서 수행하였다(Carroll et al, 1995). 피부는 두꺼웠으며, 마우스의 등 피부의 조직학적 섹션은 상피세포의 두께의 현저한 증가를 나타내었다. 피부 배리어는 건선 피부에서 관찰된 바와 같이 이러한 동물에서 증가하였다.
면역조직화학 분석은 마우스 SLPI에 특이적인 항체(1:40 희석)로 수행하였다. 1차 항체를 아비딘 DH 및 바이오티닐화된 염색 시스템을 사용하여 2차 항체에 의해 검출하였다(Vectasatain ABC kit, USA). 염색은 매치된 대조군과 비교하여 형질전환된 동물의 피부에서 SLPI의 높은 발현이 나타난다는 것을 보여준다. 이러한 코르네오데모신의 과다발현은 주로 형질전환된 동물 피부의 수프라바살 층에서 관찰되었다.
부록 A : 시스타틴 A 참조 서열
시스타틴 A.1(시스타틴 A 서열 1) 서열
위치 1은 엑손 1의 시작부이다. 엑손에는 밑줄을 그었다.
시스타틴 A.2 (시스타틴 A 서열 2) 서열
위치1은 니트른1의 3'섹션의 시작부이다. 니트론1의 5'내지 3'섹션간의 공개된 서열에는 갭이 있으며, 따라서, 두 개의 서열을 사용하였다.
부록 B : SLIP 참조 서열
SLIP 참조서열. 이 서열의 위치1은 NCBI M7444의 위치1에 상응한다.
참고문헌
본 문헌에 언급된 각각의 출원 및 특허, 및 상기 각각의 출원 및 특허를 수행하는 동안 포함된 인용되거나 참조된 각각의 문헌("출원 인용 문헌") 및 상기 각각의 출원 및 특허 및 모든 출원 인용 문헌에 인용되거나 언급된 모든 생성물에 대한 사용설명서 또는 카탈로그는 본원에 참고 문헌으로 인용되었다. 게다가, 본원에 언급된 모든 문헌 및 본원에 언급된 문헌에 인용되거나 참조된 모든 문헌, 및 본원에 인용되거나 언급된 모든 생성물에 대한 사용 설명서 또는 카탈로그는 본원에 참고 문헌으로 인용되었다.
본 발명의 설명된 방법 및 시스템의 다양한 변형 및 변화가 본 발명의 범위 및 사상을 벗어나지 않으면서 당업자에게는 자명할 것이다. 본 발명이 바람직한 특정 구체예와 관련되어 설명되었지만, 본 발명은 이러한 특정 구체예에 부당하게 제한되지 않는다는 것을 이해해야 한다. 실제로, 본 발명을 수행하기 위핸 설명된 방식의 다양한 변형은 분자생물학 또는 관련 분야의 당업자에 자명할 것이며, 이는 청구범위내에 있다.

Claims (84)

  1. 개인의 접착 단백질, 프로테아제 또는 프로테아제 억제제를 암호화하는 핵산에서의 돌연변이를 검출하는 것을 포함하는, 상피세포에서 비정상적인 세포-세포 접착과 관련된 질병 또는 그 질병에 대한 감수성을 진단하는 방법.
  2. 접착 단백질, 프로테아제 또는 프로테아제 억제제 폴리펩티드 또는 이러한 것을 암호화하는 핵산에서 다형성(polymorphism)의 존재 또는 부재를 검출하는 것을 포함하며, 상기 다형성은 그룹 I 질병과 관련된 것을 특징으로 하는, 개인에서 그룹 I 질병 또는 그룹 I 질병에 대한 감수성을 진단하는 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 접착 단백질은 표 D2.1 및 5.1에 나타낸 접착 단백질로 구성된 군으로부터 선택되며, 바람직하게는 코르네오데스모신, 데스모글레인 I, 데스모글레인 3, 플라코글로빈, 데스모플라킨, 데스모콜린 I, 엔보플라킨, 세린 풍부 단백질, 바람직하게는 소형 프롤린-풍부 단백질(SPRR), SPRR2A, SPRR1B, SPRK, SPRR2E, SPRR2F, SPRR2B, SPRR2D, SPRR2C, SPRR2G, SPRR1A, SPRR3, SPRR4, 인보루크린 또는 로리크린인 방법.
  4. 제1항 내지 제3항중 어느 한 항에 있어서, 프로테아제는 표 D3.1 및 6.1에 나타낸 프로테아제로 구성된 군으로부터 선택되며, 바람직하게는 각질층 키모트립신 효소(SCCE) 또는 각질층 트립신성 효소(SCTE)인 방법.
  5. 제1항 내지 제4항중 어느 한 항에 있어서, 프로테아제 억제제는 표 D4.1 및 7.1에 나타낸 프로테아제 억제제로 구성된 군으로부터 선택되며, 바람직하게는 분비성 류코프로테아제 억제제(SLPI), 엘라핀 프로테아제 억제제 3 (PI3 또는 SKALP) 또는 시스타틴 A(CSTA)인 방법.
  6. 제1항 내지 제5항중 어느 한 항에 있어서, 그룹 I 질병은 아토피성 습진, 지루성 습진, 자극성 접촉 피부염, 앨러지 접촉 피부염, 폐 아토피성 천식, 후 바이러스성 아스마, 기관지성 과민반응, 만성 폐색 폐 질환, 크론(Crohn)병, 궤양성 대장염, 복강 질병, 펩신의 궤양, 농가진, 바이러스성 사마귀, 전염성연속증, 세균성 수막염, 바이러스성 수막염, 헬리코박테리아 파이로리(Helicobacteria pylori)와 관련된 펩신 궤양, 피부 흑색종, 비늘모양 세포암, 기저세포 암, 피부 림프종, 피부암, 위장관의 악성종양 및 폐의 악성종양으로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
  7. 제1항 내지 제6항중 어느 한 항에 있어서,
    상기 질병은 그룹 I 질병을 포함하고, 또
    상기 방법은 개인에서 (a) 코르네오데스모신 핵산의 위치 +1243에서 T의 존재; (b) 코르네오데스모신 핵산의 위치 +1243에서HphI제한효소부위의 부재; (c) 코르네오데스모신 폴리펩티드(L20815)의 위치 394에서 로이신(L) 잔기의 존재; 및(d) 상기 (c)를 초래하는 코르네오데스모신 핵산에서의 돌연변이중의 하나 또는 그 이상을 검출하는 것을 포함하는 방법.
  8. 제1항 내지 제7항중 어느 한 항에 있어서,
    상기 질병은 그룹 I 질병을 포함하고, 또
    상기 방법은 개인에서 (a) 코르네오데스모신 핵산의 위치 +1243에서 T의 존재; (b) 코르네오데스모신 폴리펩티드(L20815)의 위치 394에서 로이신(L) 잔기의 존재; 및 (c) 상기 (b)를 초래하는 코르네오데스모신 핵산에서의 돌연변이중의 하나 또는 그 이상을 검출하는 것을 포함하는 방법:
  9. 제1항 내지 제8항중 어느 한 항에 있어서, 상기 질병은 그룹 I 질병을 포함하고, 또 상기 방법은 코르네오데스모신 핵산 또는 폴리펩티드의 관련 부분에서 하기 뉴클레오티드 하나 이상 또는 하기 아미노산 하나 이상을 검출하는 것을 포함하는 방법:
    표에서, "잔기 위치 (1)"은 수탁번호 L20815에 따른 서열의 번호를 지칭하는것이고, 또 "잔기 위치(2)"는 수탁번호 AF030130에 따른 서열의 번호를 지칭함.
  10. 제1항 내지 제9항중 어느 한 항에 있어서, 상기 질병은 그룹 I 질병을 포함하고, 또 상기 방법은, Jenisch 등(1999), Tissue Antigens, 54: 439-449에 기재된 바와 같이, 개인에서 CD5 코르네오데스모신 대립유전자 또는 CD6 코르네오데스모신 대립유전자를 검출하는 것을 포함하는 방법.
  11. 제1항 내지 제10항중 어느 한 항에 있어서,
    상기 질병은 그룹 I 질병을 포함하고, 또
    상기 방법은 개인에서 (a) 코르네오데스모신 핵산의 위치 180에서 T의 존재; (b) 수탁번호 L20815를 갖는 코르네오데스모신 폴리펩티드의 위치 40에서 F의 존재; (c) 수탁번호 AF030130을 갖는 코르네오데스모신 폴리펩티드의 위치 56에서 F의 존재; 및 (d) 상기 (b) 또는 (c)를 초래하는 코르네오데스모신 핵산에서의 돌연변이중의 하나 또는 그 이상을 검출하는 것을 포함하는 방법.
  12. 제1항 내지 제11항중 어느 한 항에 있어서,
    상기 질병은 그룹 I 질병을 포함하고, 또
    상기 방법은 개인에서 (a) 코르네오데스모신 핵산의 위치 619에서 T의 존재; (b) 코르네오데스모신 폴리펩티드의 위치 186에서 F의 존재; 및 (c) 상기 (b)를 초래하는 코르네오데스모신 핵산에서의 돌연변이중의 하나 또는 그 이상을 검출하는것을 포함하는 방법.
  13. 제1항 내지 제12항중 어느 한 항에 있어서,
    상기 질병은 그룹 I 질병을 포함하고, 또
    상기 방법은 개인의 SCCE 핵산에서, 바람직하게는 SCCE 게놈 서열(GB: AF166330)중의 위치 7634-7637에 대응하는 위치에서 AACCAACC 서열의 존재를 검출하는 것을 포함하는 방법.
  14. 제1항 내지 제13항중 어느 한 항에 있어서,
    상기 질병은 그룹 I 질병, 바람직하게는 아토피성 습진을 포함하고, 또
    상기 방법은 (a) SLPI 핵산의 위치 280에서 T 잔기의 존재; (b) SLPI 핵산의 위치 292/293에서 G잔기의 존재; (c) SLPI 핵산의 위치 1235/1236에서 C 잔기의 존재; (d) SLPI 핵산의 위치 1384/1385에서 C 또는 A 잔기의 부재; 및 (d) 상기 내용에 상응하는 SLPI 폴리펩티드에서 다형성으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 다형성의 존재를 검출하는 것을 포함하는 방법.
  15. 제1항 내지 제14항중 어느 한 항에 있어서,
    상기 질병은 그룹 I 질병, 바람직하게는 습진, 보다 바람직하게는 아토피성 습진을 포함하고, 또
    상기 방법은 시스타틴 A 핵산의 위치 122 및 121에서 AC의 부재, 시스타틴 A핵산의 위치 110에서 G의 부재, 시스타틴 A 핵산의 위치 85에서 a t 잔기의 존재, 시스타틴 A 핵산의 위치 73에서 G 잔기의 존재, 시스타틴 A 핵산의 위치 72에서 A 잔기의 부재, 시스타틴 A 핵산의 위치 60에서 T의 부재, 시스타틴 A 핵산의 위치 15에서 C의 부재, 시스타틴 A 핵산의 위치 14에서 A 잔기의 부재, 시스타틴 A 핵산의 위치 13에서 C 잔기의 부재, 시스타틴 A 핵산의 위치 6에서 C 잔기의 부재, 시스타틴 A 핵산의 위치 5에서 T 잔기의 부재, 시스타틴 A 핵산의 위치 4에서 G 잔기의 부재 및 시스타틴 A 핵산의 위치 7에서 G 잔기의 부재로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 다형성의 존재를 검출하는 것을 포함하며,
    상기 위치 번호는 시스타틴 A 서열 CystA.1를 참조하여 매긴 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 시스타틴 A 핵산의 TRE-2 영역에서 G 잔기의 존재를 검출하는 것을 포함하는, 질병, 바람직하게는 피부 질병, 바람직하게는 피부염증 질병, 바람직하게는 습진을 진단하는 방법.
  17. 개인에서 접착 단백질, 프로테아제 또는 프로테아제 억제제, 또는 그의 단편의 존재, 부재 또는 조절된 수준을 검출하는 것을 포함하는, 개인에서 그룹 I 질병 또는 그룹 I 질병에 대한 감수성을 진단하는 방법.
  18. 제16항 또는 제17항에 있어서,
    상기 방법은 개인에서 (a) 36 kDa, 46-43 kDa 및 52-56 kDa 코르네오데스모신 폴리펩티드의 상대적 풍푸함; (b) 하나 이상의 36, 46-43 kDa 코르네오데스모신 폴리펩티드의 존재 또는 증가된 수준; (c) 52-56 kDa 코르네오데스모신 폴리펩티드의 부재 또는 조절된 수준, 바람직하게는 아주 적은 수준중의 하나 또는 그 이상을 검출하는 것을 포함하는 방법.
  19. 제16항 내지 제18항중 어느 한 항에 있어서,
    상기 방법은 개인에서 (a) 80 kDa, 95 kDa 및 160 kDa 데스모글레인 I 폴리펩티드의 상대적 풍부함; (b) 하나 이상의 95 및 80 kDa 폴리펩티드의 존재 또는 증가된 수준; (c) 160 kDa 데스모글레인 I 폴리펩티드의 감소된 수준; (d) 160 kDa 데스모글레인 I 폴리펩티드의 단백질분해중의 하나 또는 그 이상을 검출하는 것을 포함하는 방법.
  20. 제16항 내지 제19항중 어느 한 항에 있어서,
    상기 방법은 55 kDa 데스모글레인 3 폴리펩티드, 80 kDa 데스모글레인 3 폴리펩티드 및 100 kDa 데스모글레인 3 폴리펩티드중 하나 이상의 존재 또는 증가된 수준을 검출하는 것을 포함하는 방법.
  21. 제16항 내지 제20항중 어느 한 항에 있어서,
    상기 방법은 개인에서 (a) 85 kDa, 75 kDa 및 70 kDa 플라코글로빈 폴리펩티드의 상대적 풍부함; (b) 70 kDa 플라코글로빈 폴리펩티드의 부재 또는 감소된 수준; (c) 85 kDa 플라코글로빈 및/또는 75 kDa 플라코글로빈 폴리펩티드의 존재 또는 증가된 수준중의 하나 또는 그 이상을 검출하는 것을 포함하는 방법.
  22. 제16항 내지 제21항중 어느 한 항에 있어서,
    상기 방법은 개인에서 (a) 70-80 kDa, 60-70 kDa 및 50-60 kDa 데스모콜린 1 폴리펩티드의 상대적 풍부; 및 (b) 50-60 kDa 데스모콜린 1 폴리펩티드의 존재 또는 증가된 수준중의 하나 또는 이상을 검출하는 것을 포함하는 방법.
  23. 제16항 내지 제22항중 어느 한 항에 있어서,
    상기 폴리펩티드 또는 단편은 개인의 표피, 바람직하게는 피부 생검 형태로 체외에서, 또는 개인의 각질층에, 바람직하게는 테이프 스트립 형태로 검출되는 방법.
  24. 제16항 내지 제23항중 어느 한 항에 있어서, 케라틴 6A (L42611); 케라틴 17 (Z19574); 아넥신 A1/리포코르틴 (X05908); 및 콜라겐, 타입 VI, 알파 3 (COL6A3)(NM_004369)로 구성된 군으로부터 선택된 접착 단백질 폴리펩티드 또는 핵산의 발현이 상향조절됨을 검출하는 것을 포함하는 방법.
  25. 제16항 내지 제24항중 어느 한 항에 있어서, 하기 한 것으로 구성된 군으로부터 선택된 접착 단백질 폴리펩티드 또는 핵산의 발현이 하향조절됨을 검출하는 것을 포함하는 방법:
    S/코르네오데스모신(AF030130); 데소플라킨 (XM_004463); 플라코글로빈 (NM_002230); (NM_021991); 데스모글레인 1 (XM_008810); 데스모콜린 1 (MX_008687); 엔보플라킨 (XM_008135;U72543); 플렉틴 1 (NM000445); S100A2 (AI539439; M87068); S100A8 (AI126134); S100A7 (AA586894); S100A9); GB: W72424); SPRR2A); GB:M21302); SPRR1B (M19888); SPRK (AI923984); HCR (BAA81890); SEEK1 (BAA88130); SPR1 (BAB63315); STG(BAA88132); 인보루크린 (NM_005547); 트리코히알린 (NM_005547); 및 로리크린 (XM_048902).
  26. 제16항 내지 제25항중 어느 한 항에 있어서, 하기 한 것으로 구성된 군으로부터 선택된 프로테아제 폴리펩티드 또는 핵산의 발현이 상향조절됨을 검출하는 것을 포함하는 방법:
    세포소멸 관련 시스테인 프로테아제 (CASP14) mRNA (NM_012114); TGM5 (XM_007529); 포스포리파제 A(2)(BC013384); CD47 항원 (X69398); 칼리크레인 8 (AB008390); AD024 단백질 (XM_002642); SCCE (XM_009002); 데펜신 베타2 (AF0711216); 인터페론 유도성 단백질 27 (X67325); 지방산 결합 단백질 FABP5 (M94856); SCTE (XM_009000); 칼리크레인 1, 직장/췌장/침선 (KLK1) (XM_047300); 호모 사피엔스 칼리크레인 2, 프로스타틱 (KLK2) (XM_031757); 칼리크레인 3, (프로스테이트 특이 항원) (KLK3) (XM_031768); 칼리크레인 6 (뉴로신, 자임)(KLK6)(XM_055658); 칼리크레인 4 (프로스타제, 에나멜 매트릭스, 프로스테이트)(KLK4) (XM_008997); 막-형 세린 프로테아제 1 (AF133086); 인간 피부 콜라게나제 (M13509); 콜라게나제 MMP-1 (LOC116389); 콜라게나제 MMP-12 (U78045); 콜라게나제 MMP-9 (NM_004994); 콜라게나제 MMP-3 (U78045); 콜라게나제 MMP-28 (AF219624); 카스파제 7 (BC015799); 카스파제 5 (NM_004347); 카스파제-14 (NM_012114); 유비퀴틴 특이적 프로테아제 USP-5 (NM_003481); 유비퀴틴 특이적 프로테아제 USP-11 (NM_004651); 유비퀴틴 특이 프로테아제 USP 6 (NM_004505); TPS1 (NM_003293); TPSB1 (XM_016204); TPSG1 (XM_008123); 프로테아제 넥신-II (XM_047793); 넥신 전구체로부터 유도된 글리아 (P07093); 26S 프로테아제 조절 서브유닛 S10B(Q92524); 및 PCOLN3 (XM_047524).
  27. 제16항 내지 제26항중 어느 한 항에 있어서, 하기 한 것으로 구성된 군으로부터 선택된 프로테아제 폴리펩티드 또는 핵산의 발현이 하향조절됨을 검출하는 것을 포함하는 방법:
    트랜스글루타미나제 1 (TGM1) (M98447); TGM2 (XM_009482); TGM4 (XM_056203); TGM7 (NM_052955); TGM3 (L10386); 유비퀴틴 특이적 프로테아제 USP 26(NM_031907); 유비퀴틴 특이적 프로테아제 (USP 28)(NM_020886); 26S 프로테아제 서브유닛 4(L02426); LILRB1 (AF004230); 전사 1의 시그널 변환제 및 활성화제, 91 kDa (STAT1)(977935); 및 프로테아좀(프로좀, 마크로파인) 서브유닛 6 (PSMA6) (X59417).
  28. 제16항 내지 제27항중 어느 한 항에 있어서, 하기 한 것으로 구성된 군으로부터 선택된 프로테아제 억제제 폴리펩티드 또는 핵산의 발현이 하향조절됨을 검출하는 것을 포함하는 방법:
    hbc750 인간 췌도(pancreatic islet) (T11141; T10920); TIMP-4 (NM_003256); TIM9a (AF150100); 플라스미노겐 활성화제 억제제 타입 2 (L19066); 다가 프로테아제 억제제 WFIKKN (AF422194); 에핀-1 (EPPIN) (AF286368); 에핀-2 (EPPIN) (AF286369); 에핀-3 (EPPIN) (AF286370); 스파르크/오스테오넥틴, cwcv 및 카잘-유사 도메인 프로테오글리칸 (테스티칸) (SPOCK) (NM_004598); PI12 (AH009756); HIV-1 프로테아제에 대한 인간 면역결핍 바이러스 타입 1 유전자 (AB020923); 분비된 포스포단백질 2, 24 kD (SPP2) (NM_006944); 및 시클린-의존적 키나제 억제제 2B (p15, CDK4를 억제함)(CDKN2B) (NM_004936).
  29. 제16항 내지 제28항중 어느 한 항에 있어서, 하기 한 것으로 구성된 군으로부터 선택된 프로테아제 억제제 폴리펩티드 또는 핵산의 발현이 상향조절됨을 검출하는 것을 포함하는 방법:
    SLPI(X04502); SKALP (SM_009524; L10343); CSTA (NM_005213; AA570193); SCCA(S66296); SCCA2 (U19557); 플라스미노겐 활성화제 억제제 타입 1 (X04729; X04731); PAI2 (AF071400); SERPINA5 (NM_000624); TIMP (D11139); TIMP-1 (NM_003254); TIMP-2 (NM_003255); TIMP-3 (E13880); TIM 96 (AF 150105); 시스타틴 A (AA570193); 시스타틴 M/E (NM_001323); C1 억제제(SERPING1) (XM_046218); 프로테아제 억제제, 쿠니츠 타입, 2 (SPINT2) (XM_032280); 세린 프로테아제 억제제, 카찰 타입 4 (SPINK 4) (XM_005539); 프로테아제 억제제, 클래드 B (오브알부민), 멤버 9 (XM_053642); 세린 (또는 시스테인) 프로테이나제 억제제, 클래드 B (오브알부민), 멤버 6(XM_047984); 세린 프로테아제 억제제-유사, 쿠니츠 및 WAP 도메인 1(eppin) (SPINLW1) (NM_020398); 프로테아제 억제제 쿠니츠 타입 1 (SPINT1) (XM_056836); HIV-1 프로테아제에 대한 인간 면역결핍 바이러스 타입 1 유전자 (AB020924); 조직 인자 경로 억제제 2(TFPI2) (NM_006528); 카텝신 F(CTSF) (NM_003793); 세린(또는 시스테인) 프로테아제 억제제, 클래드 A (알파-1 안티프로테이나제, 안티트립신), 멤버 6(SERPINA6) (NM_001756); 세린(또는 시스테인) 프로테이나제 억제제, 클래드 B (오브알부민), 멤버 3 (SERPINB3) (NM_006919); 세린 (또는 시스테인) 프로테이나제 억제제, 클래드 A (알파-1 안티프로테이나제, 안티트립신), 멤버 3(SERPINA3) (NM_001085); 호모 사피엔스 세린(또는 시스테인) 프로테이나제 억제제, 클래드 B (오브알부민), 멤버 13 (XM_008743); 세린 (또는 시스테인)프로테이나제 억제제, 클래드 B(오브알부민), 멤버 5(SERPINB5 (XM_008742); RelA-보조된 억제제 (XM_057693); DNA 결합 1의 억제제, 우세한 음성 헬릭스-루프-헬릭스 단백질 (ID1) (XM_046179); 세린 (또는 시스테인) 프로테이나제 억제제, 클래드 E (넥신, 플라스미노겐 활성화제 억제제 타입 1), 멤버 (SERPINE1) (XM_054850); 시클린-의존적 키나제 억제제 2B 유사체 (p15, CDK4 억제함) (BC014469); 세린 (또는 시스테인) 프로테이나제 억제제, 클래드 B (오브알부민),멤버 7 (SERPINB7 (XM_008745); 활성화된 STAT 단백질 PIASy 의 단백질 억제제 (PIASY) (NM_016149); 활성화된 STAT 단백질 PIASy 의 단백질 억제제 유사체 (LOC95830) (XM_016864); PKC-강화된 PP1 억제성 단백질 (PPP1R14A) (AY050668); DNA 결합 3의 억제제, 우세한 음성 헬릭스-루프-헬릭스 단백질 (ID3)(NM_002167); 클래드 A(알파-1 안티프로테이나제, 안티트립신) 세린 (또는 시스테인) 프로테이나제 억제제, 클래드 H (열충격 단백질 47), 멤버 1 (SERPINH1) (NM_004353); 허핀(hurpin)에 대한 PI13 유전자(세린 프로테아제 억제제) (AJ278717); 프로테아제 억제제 5 (마스핀) (PI5) (XM_008742); 및 PAI-2 (A32415).
  30. 세포간 접착에 관여하는 접착 단백질의 발현 및/또는 활성을 상향조절하거나, 또는 접착 단백질의 단백질분해를 하향조절하는 것을 포함하는 그룹 I 질병의 치료 또는 예방방법.
  31. 제30항에 있어서, 접착 단백질의 발현 및/또는 활성이 전사 또는 번역 수준, 또는 그 모두에서 상향조절되는 방법.
  32. 제30항 또는 제31항에 있어서, 접착 단백질의 단백질분해에 관여하는 프로테아제의 발현, 활성 및/또는 분해가 하향조절되는 방법.
  33. 제30항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 접착 단백질의 단백질분해에관여된 프로테아제의 활성을 억제하는 프로테아제 억제제의 발현 및/또는 활성은 상향조절되고, 및/또는 프로테아제 억제제의 분해가 하향조절되는 방법.
  34. 제33항에 있어서, 접착단백질의 단백질분해는 프로테아제 억제제 또는 그의 단편의 투여; 프로테아제 또는 그의 단편의 길항물질의 투여; 프로테아제 억제제의 작용물질의 투여; 프로테아제의 발현감소; 프로테아제의 활성감소; 프로테아제 억제제의 발현감소; 프로테아제 억제제의 활성증가중의 하나 또는 그 이상에 의해 감소되는 방법.
  35. 질병에 관련되지 않은 형태의 접착 단백질, 프로테아제 또는 프로테아제 억제제 또는 그의 단편 치료 유효량을, 그룹 I 질병에 걸린 환자 또는 그러한 질병에 걸릴 가능성이 있는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 그룹 I 질병의 치료 또는 예방방법.
  36. 제35항에 있어서, 프로테아제 활성을 억제시킬 수 있는 프로테아제 억제제 또는 그의 단편을 투여하는 것을 포함하는 방법.
  37. 제36항에 있어서, SLPI의 단편, 바람직하게는 CGKS (SB7a) 및 CGKS CVSPVKA (SB7b); KIIDGA; GDKIIDGA; GDKIID; KII; KIID; KIIDG; KIIDGA; LDPVD (651); KRDLK (652); LDPVDTPNP (653); LDPVDTPNPTRRKPG (654); CGKSCVSPVKA (644);CVSPVKA (643), 가장 바람직하게는 펩티드 643, 펩티드 651 또는 펩티드 653으로 구성된 군으로부터 선택된 펩티드를 투여하는 것을 포함하는 방법.
  38. 제35항 내지 37항중 어느 한 항에 있어서, TNF-α 및/또는 IL-β를 투여하는 것을 포함하는 방법.
  39. 제35항 내지 38항중 어느 한 항에 있어서, 그룹 I 질병은 습진, 바람직하게는 아토피성 습진이거나, 또는 피부염, 바람직하게는 허피스상 피부염인 방법.
  40. 접착 단백질, 프로테아제 또는 프로테아제 억제제 폴리펩티드, 또는 이를 암호화하는 핵산에서 다형성의 존재 또는 부재를 검출하는 것을 포함하며,
    상기 다형성은 그룹 II 질병과 관련된 것을 특징으로 하는,
    개인에서 그룹 II 질병을 진단하거나 또는 그룹 II 질병에 대한 감수성을 진단하는 방법.
  41. 제40항에 있어서,
    상기 질병은 그룹 II 질병을 포함하고, 또
    상기 방법은 코르네오데스모신 핵산 또는 폴리펩티드의 관련 부분에서 하기 뉴클레오티드 하나 이상 또는 하기 아미노산 하나 이상을 검출하는 것을 포함하는 방법:
    표에서, "잔기 위치 (1)"은 수탁번호 L20815에 따른 서열의 번호를 지칭하는 것이고, 또 "잔기 위치(2)"는 수탁번호 AF030130에 따른 서열의 번호를 지칭함.
  42. 제40항 또는 제41항에 있어서,
    상기 질병은 그룹 II 질병을 포함하고, 또
    상기 방법은, Jenisch 등(1999), Tissue Antigens, 54: 439-449에 기재된 바와 같이, 개인에서 CD2 코르네오데스모신 대립유전자를 검출하는 것을 포함하는 방법.
  43. 제40항 내지 제42항중 어느 한 항에 있어서,
    상기 질병은 그룹 II 질병을 포함하고, 또
    상기 방법은 개인에서 (a) 코르네오데스모신 핵산의 위치 180에서 C의 존재; (b) 수탁번호 L20815를 갖는 코르네오데스모신 폴리펩티드의 위치 40에서 L의 존재; (c) 수탁번호 AF030130을 갖는 코르네오데스모신 폴리펩티드의 위치 56에서 L의 존재; 및 (d) 상기 (b) 또는 (c)를 초래하는 코르네오데스모신 핵산에서의 돌연변이중의 하나 또는 그 이상을 검출하는 것을 포함하는 방법.
  44. 제40항 내지 제43항중 어느 한 항에 있어서,
    상기 질병은 그룹 II 질병을 포함하고, 또
    상기 방법은 개인에서 (a) 코르네오데스모신 핵산의 위치 619에서 C의 존재; (b) 코르네오데스모신 폴리펩티드의 위치 186에서 S의 존재; (c) 상기 (b)를 초래하는 코르네오데스모신 핵산에서의 돌연변이중의 하나 또는 그 이상을 검출하는 것을 포함하는 방법.
  45. 제40항 내지 제44항중 어느 한 항에 있어서,
    상기 질병은 그룹 II 질병을 포함하고, 또
    상기 방법은 개인의 SCCE 핵산에서, 바람직하게는 SCCE 게놈 서열(GB: AF166330)중의 위치 7634-7637에 대응하는 위치에서 AACCAACC 서열의 존재를 검출하는 것을 포함하는 방법.
  46. 제40항 내지 제45항중 어느 한 항에 있어서,
    상기 질병은 개인에서 그룹 II 질병, 바람직하게는 여드름을 포함하고, 또 상기 방법은 SLPI의 위치 1300에서 G 잔기의 존재 또는 SLPI의 위치 1418에서 C 잔기의 존재, 또는 이들 모두를 검출하는 것을 포함하는 방법.
  47. 제40항 내지 제46항중 어느 한 항에 있어서,
    상기 질병은 그룹 II 질병을 포함하고, 또
    상기 방법은 (a) SLPI핵산의 위치 291에서 G 잔기의 존재; (b) SLPI 핵산의 위치 292/293에서 G잔기의 부재; (c) SLPI 핵산의 위치 1325에서 G 잔기의 존재; (d) SLPI 핵산의 위치 1418에서 C 잔기의 존재; 및 (d) 상기 내용에 상응하는 SLPI 폴리펩티드에서 다형성으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 다형성의 존재를 검출하는 것을 포함하는 방법.
  48. 제40항 내지 제47항중 어느 한 항에 있어서,
    상기 질병은 개인에서 그룹 II 질병, 바람직하게는 여드름을 포함하고, 또 상기 방법은 위치 110 1에서 G 잔기의 존재, 시스타틴 A 핵산의 위치 96에서 C 잔기의 존재, 시스타틴 A의 위치 71에서 A 잔기의 존재, 시스타틴 A 핵산의 위치 20에서 G 잔기의 존재, 시스타틴 A 핵산의 위치 17에서 T 잔기의 존재, 시스타틴 A 핵산의 위치 13에서 C 잔기의 핵산, 시스타틴 A 핵산의 위치 10에서 T 잔기듸 존재, 시스타틴 A 핵산의 위치 8에서 T 잔기의 존재, 시스타틴 A 핵산의 위치 73에서 G 잔기의 부재, 시스타틴 A 핵산의 위치 76 및 77에서 TG의 부재, 및 시스타틴 A 핵산의 위치 6에서 C 잔기의 부재로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 다형성의 존재를 검출하는 것을 포함하며,
    상기 위치 번호는 시스타틴 A 서열 CystA.1를 참조하여 매긴 것임을 특징으로 하는 방법.
  49. 제40항 내지 제48항중 어느 한 항에 있어서,
    상기 질병은 개인에서 그룹 II 질병, 바람직하게는 건선을 포함하고, 또
    상기 방법은 CystA.1의 위치 270에서 G 잔기의 부재, CystA.1의 위치 73에서 G 잔기의 존재, CystA.1의 위치 15에서 C 잔기의 부재, CystA.1의 위치 6에서 C 잔기의 부재, CystA.1의 위치 4에서 G잔기의 부재, 및 CystA.1의 위치 7에서 G 잔기의 부재로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 다형성의 존재를 검출하는 것을 특징으로 하는 방법.
  50. 제40항 내지 제49항중 어느 한 항에 있어서, 상기 그룹 II 질병은 여드름, 바람직하게는 심상성좌창 또는 건선, 바람직하게는 심상성 건선인 방법.
  51. 개인에서 접착 단백질, 프로테아제 또는 프로테아제 억제제, 또는 그의 단편의 존재, 부재 또는 조절된 수준을 검출하는 것을 포함하는, 개인에서 그룹 II 질병 또는 그룹 II 질병에 대한 감수성을 진단하는 방법.
  52. 제51항에 있어서, 상기 방법은 개인에서 (a) 36 kDa, 46-43 kDa 및 52-56 kDa 코르네오데스모신 폴리펩티드의 상대적 풍푸함; (b) 52-56 kDa 코르네오데스모신 폴리펩티드의 증가된 수준; 및 (c) 36 kDa 및 46-43 kDa 코르네오데스모신 폴리펩티드의 하나 또는 모두의 감소된 수준중의 하나 또는 그 이상을 검출하는 것을 포함하는, 개인에서 그룹 II 질병 또는 그룹 II 질병에 대한 감수성을 진단하는 방법.
  53. 제51항 또는 제52항에 있어서, 상기 방법은 (a) 80 kDa, 95 kDa 및 160 kDa 데스모글레인 I 폴리펩티드의 상대적 풍부함; (b) 160 kDa 데스모글레인 I 폴리펩티드의 존재 또는 감소된 수준; (c) 95 및 80 kDa 데스모글레인 I 폴리펩티드의 하나 또는 모두의 감소된 수준 또는 부재; 및 (d) 160 kDa 데스모글레인 I 폴리펩티드의 단백질분해의 부재중의 하나 또는 그 이상을 검출하는 것을 포함하는, 개인에서 그룹 II 질병 또는 그룹 II 질병에 대한 감수성을 진단하는 방법.
  54. 제51항 내지 제53항중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 개인에서 55 kDa 데스모글레인 3 폴리펩티드, 80 kDa 데스모글레인 3 폴리펩티드 및 100 kDa 데스모글레인 3 폴리펩티드중 하나 또는 그 이상의 부재 또는 감소된 수준을 검출하는 것을 포함하는, 개인에서 그룹 II 질병 또는 그룹 II 질병에 대한 감수성을 진단하는 방법.
  55. 제51항 내지 제54항중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 개인에서 (a) 85 kDa, 75 kDa 및 70 kDa 플라코글로빈 폴리펩티드의 상대적 풍부함; (b) 70 kDa 플라코글로빈 폴리펩티드의 존재 또는 증가된 수준; 및 (c) 75 kDa 플라코글로빈 폴리펩티드의 부재 또는 감소된 수준중의 하나 또는 그 이상을 검출하는 것을 포함하는, 개인에서 그룹 II 질병 또는 그룹 II 질병에 대한 감수성을 진단하는 방법.
  56. 제51항 내지 제55항중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 개인에서 (a) 75-80 kDa, 190-250 및/또는 120-180 데스모플라킨 폴리펩티드의 상대적 풍부; (b) 190-250 kDa 및 120-180 kDa 데스모플라킨 폴리펩티드의 하나 또는 모두의 부재 또는 감소된 수준; 및 (c) 85 kDa 데스모플라킨 폴리펩티드의 단백질분해의 부족중의 하나 또는 그 이상을 검출하는 것을 포함하는, 개인에서 그룹 II 질병 또는 그룹 II 질병에 대한 감수성을 진단하는 방법.
  57. 제51항 내지 제56항중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 개인에서 (a) 70-80 kDa, 60-70 kDa 및 50-60 kDa 데스모콜린 1 폴리펩티드의 상대적 풍부; 및 (b) 50-60 kDa 데스모콜린 1 폴리펩티드의 부재 또는 감소된 수준중의 하나 또는 그 이상을 검출하는 것을 포함하는, 개인에서 그룹 II 질병 또는 그룹 II 질병에 대한 감수성을 진단하는 방법:
  58. 제51항 내지 제57항중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 개인에서 (a) 124-209 kDa, 100-120 kDa, 60-80 kDa 및 50-55 kDa 엔보플라킨 폴리펩티드의 상대적 풍부; (b) 60-80 및/또는 50-55 kDa 엔보플라킨 폴리펩티드의 존재 또는 증가된 수준; 및 (c) 124-209 kDa 및/또는 100-120 kDa 엔보플라킨 폴리펩티드의 부재 또는감소된 수준중의 하나 또는 그 이상을 검출하는 것을 포함하는, 개인에서 그룹 II 질병 또는 그룹 II 질병에 대한 감수성을 진단하는 방법.
  59. 제51항 내지 제58항중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 개인에서 (a) 80-90 kDa 및 70-75 kDa 폴리펩티드의 상대적 풍부; (b) 124-209 kDa SCCE 폴리펩티드의 존재 또는 증가된 수준; (c) 80-90 kDa SCCE 폴리펩티드의 부재 또는 감소된 수준중의 하나 또는 그 이상을 검출하는 것을 포함하는, 개인에서 그룹 II 질병 또는 그룹 II 질병에 대한 감수성을 진단하는 방법.
  60. 제51항 내지 제59항중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 개인에서 (a) 90-100 kDa 및 20 kDa 폴리펩티드의 상대적 풍부; (b) 90-100 kDa SLPI 폴리펩티드의 존재 또는 증가된 수준; 및 (c) 20 kDa SLPI 폴리펩티드의 부재 또는 감소된 수준중의 하나 또는 그 이상을 검출하는 것을 포함하는, 개인에서 그룹 II 질병 또는 그룹 II 질병에 대한 감수성을 진단하는 방법.
  61. 제51항 내지 제60항중 어느 한 항에 있어서, 하기 한 것으로 구성된 군으로부터 선택된 접착 단백질 폴리펩티드 또는 핵산의 발현이 상향조절됨을 검출하는 것을 포함하는, 개인에서 그룹 II 질병 또는 그룹 II 질병에 대한 감수성을 진단하는 방법:
    S/코르네오데스모신(AF030130); 데소플라킨 (XM_004463); 플라코글로빈(NM_002230); GB; (NM_021991); 데스모글레인 1 (XM_008810); 데스모콜린 1 (MX_008687); 엔보플라킨 (XM_008135;U72543); 플렉틴 1 (NM000445); S100A2 (AI539439; M87068); 케라틴 6A (L42611); 케라틴 17(Z19574); S100A8 (AI126134); S100A7 (AA586894); S100A9); GB: W72424); SPRR2A); GB:M21302); SPRR1B (M19888); SPRK (AI923984); HCR (BAA81890); SEEK1 (BAA88130); SPR1 (BAB63315); STG(BAA88132); 인보루크린 (NM_005547); 아넥신 A1 /리포코르틴 (X05908); 콜라겐, 타입 VI, 알파3 (COL6A3) (NL_004369); 트리코히알린 (NM_005547); 및 로리크린 (XM_048902).
  62. 제51항 내지 제61항중 어느 한 항에 있어서, 하기 한 것으로 구성된 군으로부터 선택된 접착 단백질 폴리펩티드 또는 핵산의 발현이 상향조절됨을 검출하는 것을 포함하는, 개인에서 그룹 II 질병 또는 그룹 II 질병에 대한 감수성을 진단하는 방법:
    트랜스글루타미나제 1 (TGM1)(M98447); TGM2 (XM_009482); TGM4 (XM_056203); TGM5 (XM_007529); TGM7 (NM_052955); TGM3 (L10386); 포스포리파제 A(2)(BC013384); CD47 항원 (X69398); 칼리크레인 8 (AB008390); AD024 단백질 (XM_002642); 데펜신 베타2 (AF0711216); 인터페론 유도성 단백질 27 (X67325); 지방산 결합 단백질 FABP5 (M94856); SCTE (XM_009000); 칼리크레인 1; 직장/췌장/침선 (KLK1) (XM_047300); 호모 사피엔스 칼리크레인 2; 프로스타틱 (KLK2) (XM_031757); 칼리크레인 3; (프로스테이트 특이 항원) (KLK3) (XM_031768); 칼리크레인 6 (뉴로신; 자임); (KLK6)(XM_055658); 칼리크레인 4 (프로스타제; 에나멜 매트릭스; 프로스테이트)(KLK4) (XM_008997); 막-형 세린 프로테아제 1 (AF133086); 콜라게나제 MMP-1 (LOC116389); 콜라게나제 MMP-12 (U78045); 콜라게나제 MMP-9 (NM_004994); 콜라게나제 MMP-3 (U78045); 콜라게나제 MMP-28 (AF219624); 카스파제 7 (BC015799); 카스파제 5 (NM_004347); 카스파제-14 (NM_012114); 유비퀴틴 특이적 프로테아제 USP-5 (NM_003481); 유비퀴틴 특이적 프로테아제 USP-11 (NM_004651); 유비퀴틴 특이 프로테아제 USP 6 (NM_004505); 유비퀴틴 특이적 프로테아제 USP 26 (NM_031907); 유비퀴틴 특이적 프로테아제 (USP 28)(NM_020886); 26S 프로테아제 서브유닛 4; LILRB1 (AF004230); 전사 1의 시그널 변환제 및 활성화제, 91 kDa (STAT1)(977935); 프로테아좀(프로좀, 마크로파인) 서브유닛 6 (PSMA6)(X59417); TPSB1 (XM_016204); 프로테아제 넥신-II (XM_047793); 넥신 전구체로부터 유도된 글리아 (P07093); 및 26S 프로테아제 조절 서브유닛 S10B ; PCOLN3 (XM_047524).
  63. 제51항 내지 제62항중 어느 한 항에 있어서, 세포소멸 관련 시스테인 프로테아제 (CASP14) mRNA (NM_012114), SCCE (XM_009002), 인간 피부 콜라게나제 (M13509); TPS1 (NM_003293); 및 TPSG1 (XM_008123)로 구성된 군으로부터 선택된 접착 단백질 폴리펩티드 또는 핵산의 발현이 하향조절됨을 검출하는 것을 포함하는, 개인에서 그룹 II 질병 또는 그룹 II 질병에 대한 감수성을 진단하는 방법.
  64. 제51항 내지 제63항중 어느 한 항에 있어서, 하기 한 것으로 구성된 군으로부터 선택된 프로테아제 폴리펩티드 또는 핵산의 발현의 상향조절을 검출하는 것을 포함하는, 개인에서 그룹 II 질병 또는 그룹 II 질병에 대한 감수성을 진단하는 방법:
    SLPI(X04502); SKALP (SM_009524; L10343); CSTA (NM_005213; AA570193); SCCA(S66296); SCCA2 (U19557); 플라스미노겐 활성화제 억제제 타입 1 (X04729; X04731); PAI2 (AF071400); SERPINA5 (NM_000624); 플라스미노겐 활성화제 억제제 타입 2 (L19066); TIMP (D11139); TIMP-1 (NM_003254); TIMP-2 (NM_003255); TIMP-3 (E13880); TIMP-4 (NM_003256); TIM9a (AF150100); TIM9b (AF150105); 시스타인 A (AA570193); 시스타틴 M/E (NM_001323); 다가 프로테아제 억제제 WFIKKN (AF422194); C1 억제제(SERPING1) (XM_046218); 프로테아제 억제제, 쿠니츠 타입, 2 (SPINT2)(XM_032280); 세린 프로테아제 억제제, 카찰 타입 4 (SPINK 4)(XM_005539); 프로테아제 억제제, 클래드 B (오브알부민), 멤버 9 (XM_053642); 세린 (또는 시스테인) 프로테이나제 억제제, 클래드 B (오브알부민), 멤버 6(XM_047984); 에핀-1 (EPPIN) (AF286368); 에핀-2 (EPPIN) (AF286369); 에핀-3 (EPPIN) (AF286370); 세린 프로테아제 억제제-유사, 쿠니츠 및 WAP 도메인 1(eppin) (SPINLW1)(NM_020398); 스파크/오스테오넥틴, cwcv 및 카찰-유사 도메인 프로테오글리칸 (테스티칸)(SPOCK) (NM_004598); 프로테아제 억제제 쿠니츠 타입 1 (SPINT1)(XM_056836); PI12 (AH009756); HIV-1 프로테아제에 대한 인간 면역결핍 바이러스 타입 1 유전자 (AB020923); HIV-1 프로테아제에 대한 인간 면역결핍 바이러스 타입 1 유전자 (AB020924); 조직 인자 경로 억제제 2(TFPI2)(NM_006528); 분비된 포스포단백질 2, 24kD (SPP2)(NM_006944); 카텝신 F(CTSF)(NM_003793); 세린(또는 시스테인) 프로테아제 억제제, 클래드 A (알파-1 안티프로테이나제, 안티트립신), 멤버 6(SERPINA6) (NM_001756); 세린(또는 시스테인) 프로테이나제 억제제, 클래드 B (오브알부민), 멤버 3 (SERPINB3) (NM_006919); 세린 (또는 시스테인) 프로테이나제 억제제, 클래드 A (알파-1 안티프로테이나제, 안티트립신), 멤버 3(SERPINA3) (NM_001085); 호모 사피엔스 세린(또는 시스테인) 프로테이나제 억제제, 클래드 B (오브알부민), 멤버 13 (XM_008743); 세린 (또는 시스테인)프로테이나제 억제제, 클래드 B(오브알부민), 멤버 5(SERPINB5 (XM_008742); RelA-보조된 억제제 (XM_057693); DNA 결합 1의 억제제, 우세한 음성 헬릭스-루프-헬릭스 단백질 (ID1) (XM_046179); 세린 (또는 시스테인) 프로테이나제 억제제, 클래드 E (넥신, 플라스미노겐 활성화제 억제제 타입 1), 멤버 (SERPINE1) (XM_054850); 시클린-의존적 키나제 억제제 2B (p15, CDK4 억제함)(CDKN2B) (NM_004936); 시클린-의존적 키나제 억제제 2B 유사체 (p15, CDK4 억제함)(BC014469); 세린 (또는 시스테인) 프로테이나제 억제제, 클래드 B (오브알부민), 멤버 7 (SERPINB7 (XM_008745); 활성화된 STAT 단백질 PIASy 의 단백질 억제제 (PIASY) (NM_016149); 활성화된 STAT 단백질 PIASy 의 단백질 억제제 유사체 (LOC95830) (XM_016864); PKC-강화된 PP1 억제성 단백질 (PPP1R14A) (AY050668); DNA 결합 3의 억제제, 우세한 음성 헬릭스-루프-헬릭스 단백질 (ID3)(NM_002167); 클래드 A(알파-1 안티프로테이나제, 안티트립신)(XM-028358); 세린 (또는 시스테인) 프로테이나제 억제제,클래드 H (열충격 단백질 47), 멤버 1 (SERPINH1) (NM_004353); 허핀(hurpin)에 대한 PI13 유전자(세린 프로테아제 억제제) (AJ278717); 프로테아제 억제제 5 (마스핀) (PI5) (XM_008742); PAI-2 (A32415).
  65. 제51항 내지 제64항중 어느 한 항에 있어서, hbc 인간 췌도(T1114; T10920) 폴리펩티드 또는 핵산의 발현이 하향조절됨을 검출하는 것을 포함하는, 그룹 II 질병 또는 그룹 II 질병에 대한 감수성을 진단하는 방법.
  66. 제51항 내지 제65항중 어느 한 항에 있어서, 그룹 II 질병이 건선, 비늘선, 심상성좌창 및 모공각화증으로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
  67. 세포간 접착에 관여하는 접착단백질의 발현 및/또는 활성이 전사수준 또는 번역수준 또는 그 모두에서 하향조절되거나, 또는 접착단백질의 단백질 분해가 상향조절되는 것을 특징으로하는, 그룹 II 질병의 치료 또는 예방방법.
  68. 제67항에 있어서, 접착단백질의 발현 및/또는 활성이 전사수준 또는 번역수준 또는 그 모두에서 하향조절되는 것을 특징으로하는 그룹 II 질병의 치료 또는 예방방법.
  69. 제67항 또는 제68항에 있어서, 접착단백질의 단백질분해에 관여된 프로테아제의 발현, 활성 및/또는 분해가 상향조절되는 것을 특징으로하는 그룹 II 질병의 치료 또는 예방방법.
  70. 제67항 내지 제69항중 어느 한 항에 있어서, 접착단백질의 단백질분해에 관여된 프로테아제의 활성을 억제하는 프로테아제 억제제의 발현 및/또는 활성이 하향조절되고, 및/또는 프로테아제 억제제의 분해가 상향조절되는 것을 특징으로하는 그룹 II 질병의 치료 또는 예방방법.
  71. 제67항 내지 제70항중 어느 한 항에 있어서,
    접착단백질의 단백질분해는, 프로테아제 또는 그의 단편의 투여; 프로테아제의 작용물질의 투여; 프로테아제 억제제의 길항물질의 투여; 프로테아제의 발현의 증가; 프로테아제의 활성의 증가; 프로테아제 억제제의 발현의 감소; 프로테아제의 활성의 감소중 어느 하나 또는 그 이상에 의해 증가되는 것을 특징으로 하는 그룹 II 질병의 치료 또는 예방방법.
  72. 그룹 II 질병에 걸린 환자 또는 그러한 질병에 걸린 가능성이 있는 환자에게 질병과 관련되지 않은 형태의 접착 단백질, 프로테아제 또는 프로테아제 억제제 또는 그의 단편 치료 유효량을 투여하는 것을 포함하는 그룹 II 질병의 치료 또는 예방방법.
  73. 제72항에 있어서, 접착단백질 또는 그의 단편을 투여하는 것을 포함하는 그룹 II 질병의 치료 또는 예방방법.
  74. 제72항 또는 제73항에 있어서, 데스모콜린 I의 단편, 바람직하게는 펩티드 641 서열을 포함하는 펩티드, 또는 데스모플라킨의 단편, 바람직하게는 펩티드 642 서열을 포함하는 펩티드를 투여하는 것을 포함하는 그룹 II 질병의 치료 또는 예방방법.
  75. 접착단백질, 프로테아제 또는 프로테아제 억제제, 바람직하게는 접착 단백질, 프로테아제 또는 프로테아제 억제제의 질병 관련 형태와 특이적으로 반응할 수 있는 모노클로날 또는 폴리클로날 항체.
  76. 접착단백질, 프로테아제 또는 프로테아제 억제제 폴리펩티드를 후보 화합물과 접촉시키고 또 후보 화합물이 접착 단백질, 프로테아제 또는 프로테아제 억제제와 결합하는지 여부를 결정하는 것을 포함하는, 접착단백질, 프로테아제 또는 프로테아제 억제제와 결합할 수 있는 분자의 확인방법.
  77. 제76항에 따른 방법에 의해 확인되는 화합물.
  78. (a) 접착 단백질을 제공하고; (b) 프로테아제를 제공하며; (c) 후보 분자 존재하에서 접착 단백질을 프로테아제에 노출시키며; 또 (d) 프로테아제에 의한 접착 단백질 분해의 존재 또는 부재를 측정하는 것을 포함하는, 프로테아제의 활성을 조절할 수 있는 분자를 확인하는 방법.
  79. 프로테아제에 의해 접착 분자의 분해를 향상시킬 수 있는 제78항에 따른 방법에 의해 확인된 화합물의 그룹 II 질병을 치료하기 위한 용도.
  80. 프로테아제에 의해 접착분자의 분해를 억제시킬 수 있는 제78항에 따른 방법에 의해 확인된 화합물의 그룹 I 질병을 치료하기 위한 용도.
  81. 이종 접착 단백질, 프로테아제 또는 프로테아제 억제제를 발현하는 비-인간 트랜스제닉 동물.
  82. 접착 단백질, 프로테아제 또는 프로테아제 억제제의 조절된 수준, 바람직하게는 상향조절되거나 또는 하향조절된 정도로 발현하는 비-인간 트랜스제닉 동물.
  83. 접착 단백질, 프로테아제 또는 프로테아제 억제제를 실질적으로 발현하지 않는 비-인간 트랜스제닉 동물.
  84. 피부 질병, 바람직하게는 그룹 I 또는 그룹 II 질병에 대한 모델로서 사용되는 제81항 내지 제83항중 어느 한 항에 따른 트랜스제닉 동물의 용도.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101286833B1 (ko) * 2005-03-18 2013-07-17 가부시키가이샤 시세이도 편평상피세포암 관련 항원을 지표로 하는 피부 성상의 평가방법

Families Citing this family (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7374886B2 (en) 1999-04-09 2008-05-20 Rigshospitalet Tissue inhibitor of matrix metalloproteinases type-1 (TIMP-1) as a cancer marker and postoperative marker for minimal residual disease or recurrent disease in patients with a prior history of cancer
EP1171771B1 (en) 1999-04-09 2005-06-29 Rigshospitalet Tissue inhibitor of matrix metalloproteinases type-1 (timp-1) as a cancer marker
AU1731201A (en) * 1999-12-06 2001-06-18 Hidetoshi Inoko Method of examining vulgar psoriasis
US7019194B2 (en) 2001-02-09 2006-03-28 Lennart Hansson SCCE modified transgenic mammals and their use as models of human disease
EP1367886B1 (en) * 2001-02-09 2011-07-13 Torbjörn Egelrud Scce transgenic mice and their use as models of human disease
AU2004231740A1 (en) * 2003-04-17 2004-11-04 The Trustees Of Columbia University In The City Ofnew York Desmoglein 4 is a novel gene involved in hair growth
EP1716248A1 (en) * 2004-02-03 2006-11-02 Bayer HealthCare AG Diagnostics and therapeutics for diseases associated with kallikrein 7 (klk7)
US8076065B2 (en) * 2005-05-19 2011-12-13 Synergenz Bioscience Limited Methods and compositions for assessment of pulmonary function and disorders
US7933722B2 (en) * 2005-05-20 2011-04-26 Synergenz Bioscience Limited Methods of analysis of polymorphisms and uses thereof
AU2006305550B2 (en) * 2005-10-16 2013-05-02 Yeda Research & Development Co., Ltd Caspase-8 and skin diseases
GB0604370D0 (en) * 2006-03-03 2006-04-12 Univ Dublin Markers for melanoma progression
ES2375662T3 (es) * 2006-03-17 2012-03-05 Shiseido Company, Limited Método para evaluar el nivel de sensibilidad de la piel mediante el uso del ant�?geno relacionado con el carcinoma de células escamosas como indicación.
CN101506378A (zh) * 2006-06-19 2009-08-12 约翰·霍普金斯大学 在油包水乳液中的微粒上的单分子pcr
JP4676448B2 (ja) * 2007-01-22 2011-04-27 株式会社マルハニチロ水産 タンパク質分解酵素阻害因子発現増強剤及びそれを含む皮膚の保水率改善剤
WO2009045508A1 (en) * 2007-10-02 2009-04-09 Research Foundation Of City University Of New York Novel protein transduction domains derived from secretory leukocyte protease inhibitor
JP2010115178A (ja) * 2008-11-14 2010-05-27 Nippon Menaade Keshohin Kk 皮膚の炎症の予測方法及びその用途
FR2940976B1 (fr) * 2009-01-13 2017-11-03 Oreal Utilisation a des fins de criblage d'actifs anti-ages de formes solubles de la proteine de type desmogleine i
US20100318371A1 (en) * 2009-06-11 2010-12-16 Halliburton Energy Services, Inc. Comprehensive hazard evaluation system and method for chemicals and products
EP2504357B1 (en) 2009-11-23 2017-08-02 Research Development Foundation Recombinant filaggrin polypeptides for cell importation
WO2015042229A2 (en) * 2013-09-20 2015-03-26 Landegren Nils A novel autoantigen
GB201509134D0 (en) * 2015-05-28 2015-07-15 Electrophoretics Ltd Biomolecules involved in Alzheimer's disease
JP7140362B2 (ja) * 2018-04-09 2022-09-21 国立大学法人東海国立大学機構 活性型組換えアクロシン
EP4031579A2 (en) * 2019-09-18 2022-07-27 F. Hoffmann-La Roche AG Anti-klk7 antibodies, anti-klk5 antibodies, multispecific anti-klk5/klk7 antibodies, and methods of use

Family Cites Families (44)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NL154600B (nl) 1971-02-10 1977-09-15 Organon Nv Werkwijze voor het aantonen en bepalen van specifiek bindende eiwitten en hun corresponderende bindbare stoffen.
NL154598B (nl) 1970-11-10 1977-09-15 Organon Nv Werkwijze voor het aantonen en bepalen van laagmoleculire verbindingen en van eiwitten die deze verbindingen specifiek kunnen binden, alsmede testverpakking.
NL154599B (nl) 1970-12-28 1977-09-15 Organon Nv Werkwijze voor het aantonen en bepalen van specifiek bindende eiwitten en hun corresponderende bindbare stoffen, alsmede testverpakking.
US3901654A (en) 1971-06-21 1975-08-26 Biological Developments Receptor assays of biologically active compounds employing biologically specific receptors
US3853987A (en) 1971-09-01 1974-12-10 W Dreyer Immunological reagent and radioimmuno assay
US3867517A (en) 1971-12-21 1975-02-18 Abbott Lab Direct radioimmunoassay for antigens and their antibodies
NL171930C (nl) 1972-05-11 1983-06-01 Akzo Nv Werkwijze voor het aantonen en bepalen van haptenen, alsmede testverpakkingen.
US3850578A (en) 1973-03-12 1974-11-26 H Mcconnell Process for assaying for biologically active molecules
US3935074A (en) 1973-12-17 1976-01-27 Syva Company Antibody steric hindrance immunoassay with two antibodies
US3996345A (en) 1974-08-12 1976-12-07 Syva Company Fluorescence quenching with immunological pairs in immunoassays
US4034074A (en) 1974-09-19 1977-07-05 The Board Of Trustees Of Leland Stanford Junior University Universal reagent 2-site immunoradiometric assay using labelled anti (IgG)
US3984533A (en) 1975-11-13 1976-10-05 General Electric Company Electrophoretic method of detecting antigen-antibody reaction
US4098876A (en) 1976-10-26 1978-07-04 Corning Glass Works Reverse sandwich immunoassay
US4879219A (en) 1980-09-19 1989-11-07 General Hospital Corporation Immunoassay utilizing monoclonal high affinity IgM antibodies
WO1984003171A1 (en) 1983-02-10 1984-08-16 Matsushita Electric Ind Co Ltd Composition of porcelain for voltage-dependent, non-linear resistor
US5011771A (en) 1984-04-12 1991-04-30 The General Hospital Corporation Multiepitopic immunometric assay
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
NZ218336A (en) 1985-12-09 1991-08-27 Kirin Amgen Inc Monoclonal antibodies to human pluripotent granulocyte colony stimulating factor (hpg-csf)
US5290762A (en) * 1986-12-24 1994-03-01 John Lezdey Treatment of inflammation
US5190917A (en) * 1986-12-24 1993-03-02 John Lezdey Treatment of psoriasis
CA1339351C (en) 1987-10-15 1997-08-26 Michael S. Urdea Nucleic acid multimers and amplified nucleic acid hybridization assays using same
US5124246A (en) 1987-10-15 1992-06-23 Chiron Corporation Nucleic acid multimers and amplified nucleic acid hybridization assays using same
US5703055A (en) 1989-03-21 1997-12-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery
US5091302A (en) 1989-04-27 1992-02-25 The Blood Center Of Southeastern Wisconsin, Inc. Polymorphism of human platelet membrane glycoprotein iiia and diagnostic and therapeutic applications thereof
US5552285A (en) 1991-02-27 1996-09-03 New York University Immunoassay methods, compositions and kits for antibodies to oxidized DNA bases
WO1993001315A1 (en) 1991-07-01 1993-01-21 The Blood Center Of Southeastern Wisconsin PEN POLYMORPHISM OF HUMAN PLATELET MEMBRANE GLYCOPROTEIN IIIa AND DIAGNOSTIC AND THERAPEUTIC APPLICATION THEREOF
FR2690691B1 (fr) 1992-04-29 1999-02-12 Bio Merieux Procede d'amplification d'arn necessitant une seule etape de manipulation.
US5281521A (en) 1992-07-20 1994-01-25 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Modified avidin-biotin technique
US5681699A (en) * 1994-02-11 1997-10-28 Cedars-Sinai Medical Center Methods of diagnosing ulcerative colitis and Crohn's disease
US5922575A (en) 1994-04-18 1999-07-13 Mayo Foundation For Medical Education & Research Mutations in the katG gene useful for detection of M. tuberculosis
US5633227A (en) * 1994-09-12 1997-05-27 Miles, Inc. Secretory leukocyte protease inhibitor as an inhibitor of tryptase
US5654139A (en) 1994-09-21 1997-08-05 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Allelic variation of the serotonin 5HT2c receptor
US5807678A (en) 1995-03-23 1998-09-15 Regents Of The University Of California Identification of gene mutations associated with congenital lipoid adrenal hyperplasia
US5858661A (en) 1995-05-16 1999-01-12 Ramot-University Authority For Applied Research And Industrial Development Ataxia-telangiectasia gene and its genomic organization
US5869242A (en) 1995-09-18 1999-02-09 Myriad Genetics, Inc. Mass spectrometry to assess DNA sequence polymorphisms
WO1997037043A1 (en) 1996-03-29 1997-10-09 The Regents Of The University Of California Methods for treating bipolar mood disorder associated with markers on chromosome 18q
US5955266A (en) 1996-04-01 1999-09-21 The Johns Hopkins University School Of Medicine Use of platelet polymorphism P1A2 to diagnose risk of thrombotic disease
US5691145A (en) 1996-08-27 1997-11-25 Becton, Dickinson And Company Detection of nucleic acids using G-quartets
US5691153A (en) 1996-09-06 1997-11-25 Creighton University Genetic markers to detect high bone mass
DE19813317A1 (de) 1998-03-26 1999-09-30 Roche Diagnostics Gmbh Verbessertes Verfahren zur Primer Extension Präamplifikations-PCR
CA2312075A1 (en) * 1998-11-05 2001-12-22 Protease Sciences, Incorporated Cosmetic compositions containing human type serine protease inhibitors
GB9906993D0 (en) * 1999-03-26 1999-05-19 Univ Leicester Psoriasis
US6537968B1 (en) * 2000-07-24 2003-03-25 Alphamed Pharmaceuticals Corp Treatment of lupus erythematosus

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101286833B1 (ko) * 2005-03-18 2013-07-17 가부시키가이샤 시세이도 편평상피세포암 관련 항원을 지표로 하는 피부 성상의 평가방법

Also Published As

Publication number Publication date
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