WO2006100797A1 - 扁平上皮細胞癌関連抗原の発現の抑制による乾癬、扁平上皮細胞癌及び/又は不全角化の治療のための方法及び医薬組成物 - Google Patents

扁平上皮細胞癌関連抗原の発現の抑制による乾癬、扁平上皮細胞癌及び/又は不全角化の治療のための方法及び医薬組成物 Download PDF

Info

Publication number
WO2006100797A1
WO2006100797A1 PCT/JP2005/018074 JP2005018074W WO2006100797A1 WO 2006100797 A1 WO2006100797 A1 WO 2006100797A1 JP 2005018074 W JP2005018074 W JP 2005018074W WO 2006100797 A1 WO2006100797 A1 WO 2006100797A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
scca
caspase
cells
oligonucleotide
extract
Prior art date
Application number
PCT/JP2005/018074
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Toshihiko Hibino
Jotaro Nakanishi
Chika Katagiri
Original Assignee
Shiseido Company, Ltd.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shiseido Company, Ltd. filed Critical Shiseido Company, Ltd.
Priority to CN2005800491695A priority Critical patent/CN101141982B/zh
Priority to EP05787935A priority patent/EP1859806A4/en
Priority to US11/886,475 priority patent/US7829547B2/en
Publication of WO2006100797A1 publication Critical patent/WO2006100797A1/ja
Priority to US12/907,412 priority patent/US20110305783A1/en

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C12Q1/37—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving peptidase or proteinase
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
    • A61K36/42—Cucurbitaceae (Cucumber family)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
    • A61K36/72—Rhamnaceae (Buckthorn family), e.g. buckthorn, chewstick or umbrella-tree
    • A61K36/725—Ziziphus, e.g. jujube
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
    • A61K36/81—Solanaceae (Potato family), e.g. tobacco, nightshade, tomato, belladonna, capsicum or jimsonweed
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
    • A61K36/87—Vitaceae or Ampelidaceae (Vine or Grape family), e.g. wine grapes, muscadine or peppervine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/88—Liliopsida (monocotyledons)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/04—Screening involving studying the effect of compounds C directly on molecule A (e.g. C are potential ligands for a receptor A, or potential substrates for an enzyme A)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/20—Dermatological disorders
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/20—Dermatological disorders
    • G01N2800/205—Scaling palpular diseases, e.g. psoriasis, pytiriasis

Definitions

  • compositions for the treatment of psoriasis, squamous cell carcinoma and / or keratinization by inhibiting the expression of squamous cell carcinoma associated antigens
  • the present invention relates to a squamous cell carcinoma associated antigen of cells (Squamous Cell Care
  • SCCA inoma Antigen
  • the present invention also provides a method for screening a substance that suppresses epidermal aberration keratinization, using as an index the activity of a candidate substance that suppresses cysteteaase inhibitory activity possessed by squamous cell carcinoma associated antigen 1 (SCCA-1), Substances that suppress epidermal keratinization screened by such a method, and also normalize keratinization of epidermal cells by suppressing the caspase_14 inhibitory activity of SCCA-1 in epidermal cells To provide a method for suppressing keratinization of epidermal failure.
  • SCCA-1 squamous cell carcinoma associated antigen 1
  • SCCA is an antigen extracted from squamous cell carcinoma cells, and shows high blood concentration in squamous cell carcinoma of the uterus, lung, esophagus, and skin, and is often used for diagnosis of squamous cell carcinoma ( H. Kato et al. Cancer 40: 1621-1628 (1977); ⁇ Mino et al. Cancer 62: 730-734 (1988)).
  • blood levels of SCCA correlate well with the progression stage, malignancy, tumor size, etc. of squamous cell carcinoma. It is a cancer marker that is particularly effective in diagnosis.
  • SCCA is also known to be upregulated in the upper layers of the psoriatic epidermis (Takeda A. et al., L Invest.
  • Psoriasis is a skin disease, and there is psoriasis, a chronic, recurrent inflammatory akeratosis characterized by abnormal proliferation and differentiation of epidermal cells and inflammatory cell infiltration. Psoriasis is thought to develop by adding various environmental factors to a genetic predisposition (Hopso-Havu et al. British Journal of Dermatology (1983) 109, 77-85).
  • S C C A is encoded by two genes, S C C A-1 and S C C A-2, arranged in tandem on chromosome 18 q 21.3.
  • the proteins encoded by them, SGCA-1 and SCCA-2, are both proteins with a molecular weight of about 45,000 and are highly homologous, but have different amino acid sequences at the reaction site and different functions. (Schick et al. J. Biol. Chem. (1997) 27213, 184 9-55).
  • S C C A-1 and S C C A-2 were known to be highly expressed in diseases such as squamous cell carcinoma and psoriasis, it was unclear what function they performed in the diseased cells.
  • keratinocytes are known to have a function of forming a protective barrier called “keratinized layer” against harmful environments by terminal differentiation.
  • the process of terminal differentiation is precisely controlled under the differentiation program, starting from proliferating basal cells, to spiny cells, granule cells, and finally to keratinocytes.
  • keratinocytes lose their nuclei, organelles, while acquiring a surrounding lipid layer, an enhanced cell membrane called keratinized envelope, and a keratin pattern.
  • the keratin pattern maintains a flexible and tensioned internal structure.
  • Caspases are well-known apoptotic cell death executors, which are cysteine proteases conserved during evolution that cleave substrates behind aspartic acid residues. Mammalian caspases are divided into three subgroups according to their structure and function: initiating caspases, executive caspases and inflammatory caspases. Implementation An important role of caspases is to degrade the CAD AD (Caspase-Activated DNase) inhibitor, resulting in the release of CAD as an active nuclease (Enari M et al., Nature 391, 43-50 (1998)). Caspase activity is regulated by various molecules. In particular, there are three inhibitory proteins that work directly with several caspases.
  • CAD AD Caspase-Activated DNase
  • Baculovirus anti-apoptotic cisprotein p35 inhibits caspase 1, — 3, 1, 6, 7, 8, and -10 without acting on serine and other cysteine proteinases 12 (Zhou Q. et al., Biochemistry 37, 10757-6 5 (1998)). Baculovirus also synthesizes another anti-apoptotic protein, the apoptotic protein inhibitor (IAP) . A homologue of I'A P has also been found in mammals (Verhag en AM et al., Genome Biol. 2, REVIEWS 3009 (2001)).
  • Mammalian IAP blocks apoptosis by inhibiting caspase 14 or by antagonizing a blower apoptosis promoting factor such as DIABLO / Smac (Wu G. Nature 408, 1008-12 (2000)).
  • Cytokine response modifier A (Crni A) is a cowpox virus gene product that can inhibit apoptotic and inflammatory caspases (Garcia- Calvo M et al. J. Biol. Chem. 273). , 32608-13 (1998)).
  • Crm A belongs to the serpin superfamily, suggesting that some serpins, such as PI-9 and PAI-1, can suppress apoptosis by interacting with caspase 1-1 and caspase-3 respectively.
  • Caspase-14 is one of the latest members of the caspase family and is expressed exclusively in differentiated keratinocytes. Caspase 14 was identified as a homologous EST among the force-spurse family members. Recent studies have shown that caspase 14 in keratinocytes is processed into heterodimer and has enzymatic activity against the synthetic substrate Trp_Glu-His-Asp-AFC corresponding to caspase 1-1. (Mikolajczyk J. et al., Biochemistry 43, 10560-9 (2004)). This hydrolytic activity requires proteolytic cleavage and the presence of cosmotropic salts.
  • caspase-14 The primary structure of caspase-14 is a caspase that is very close to inflammatory caspases, such as caspase 1, 4 and 1, but limited to differentiated keratinocytes.
  • the expression of See 14 suggests a different mode of involvement in keratinocyte terminal differentiation (Lippens S. et al., Cell Death Differ. 7, 1218-24 (2000)).
  • the caspase 14 activation mechanism, natural substrate or regulator has not been elucidated yet. Disclosure of the invention
  • the present inventor conducted research aimed at elucidating the physiological mechanism of the epidermis in which SCCA is involved, and surprisingly found that SCCA is an anti-apoptotic factor that has the effect of suppressing cellular apoptosis. I found it.
  • the present inventor examined the skin UV protection mechanism, and revealed that UV irradiation on human skin strongly enhanced the expression of SCA in the spinous layer and granule layer.
  • we established a stable expression system by introducing the human SCCA-1 and SCAA-1 genes into 3 T 3 cells in which SCCA expression was not observed, and examined the apoptosis of SCCA stable expression cells by UV irradiation. It was revealed that apoptosis by UV irradiation was significantly reduced in any SCCA stable expression system.
  • SCCA-1 and SCCA-2 knockdown (si SCCA) cell lines were obtained by RNA interference, in which siRNA was constitutively expressed in pS ilencer vector in HA Cat cells that highly express SCCA.
  • siRNA was constitutively expressed in pS ilencer vector in HA Cat cells that highly express SCCA.
  • UV irradiation of the cell line it was shown that the apoptosis rate of SCCA knockdown cells was significantly higher than that of the control line. From the above, the present inventor was able to conclude that S C CA is a protein having an action of suppressing apoptosis.
  • the present invention aims to provide a method and a pharmaceutical composition for the treatment and prevention of diseases associated with abnormal growth of SCCA high-expressing cells, such as cancer, particularly squamous cell carcinoma, and psoriasis. And
  • Another object of the present invention is to develop a mechanism for suppressing and treating epidermal keratinization by a completely new approach that is different from the prior art by elucidating the mechanism of keratinization of the epidermis.
  • the impact of the present invention in the fields of dermatology and cosmetics is significant.
  • the present invention provides a method for treating and / or preventing a disease selected from the group consisting of psoriasis and squamous cell carcinoma by suppressing the expression of squamous cell carcinoma associated antigen (SCCA) in cells.
  • SCCA squamous cell carcinoma associated antigen
  • the suppression of SCCA expression in cells is performed by RNA interference of a gene encoding SCCA.
  • the RNA interference comprises a sense oligonucleotide strand comprising the oligonucleotide of SEQ ID NO: 1 or a variant thereof and an antisense oligonucleotide strand comprising the oligonucleotide of SEQ ID NO: 3 or a variant thereof.
  • the oligonucleotide variant of SEQ ID NO: 1 has a high stringency condition with respect to nucleotide numbers 46 to 66 of the gene encoding SCCA.
  • the oligonucleotide variants of SEQ ID NO: 3 are hybridized under conditions of high stringency to the complementary strands at nucleotide positions 4-6 to 6 of the gene encoding SCCA. Has an array.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for treating and / or preventing a disease selected from the group consisting of psoriasis and squamous cell carcinoma by suppressing the expression of SCCA in cells.
  • the pharmaceutical composition contains a double-stranded RNA that provides a short RNA that interferes with the RNA encoding the gene encoding SCCA.
  • the pharmaceutical composition comprises a sense oligonucleotide chain comprising the oligonucleotide of SEQ ID NO: 1 or a variant thereof and an antisense oligonucleotide strand comprising the oligonucleotide of SEQ ID NO: 3 or a variant thereof.
  • the oligonucleotide variant of SEQ ID NO: 1 has a sequence that hybridizes under high stringency conditions to nucleotide numbers 46 to 66 of the gene encoding SCCA
  • the variant of the oligonucleotide of column number 3 has a sequence that is highly hybridized under highly stringent conditions with respect to the complementary strands of nucleotide numbers 46 to 66 of the gene encoding SCCA.
  • the double-stranded RNA is in a form contained in a vector, such as a pS i 1 nc cer vector.
  • the present invention further provides a method for preparing cells with suppressed expression of SCCA.
  • suppression of SCCA expression is performed by RNA interference of a gene encoding SCCA.
  • the RNA interference includes a sense oligonucleotide chain comprising an oligonucleotide of SEQ ID NO: 1 or a variant thereof and an antisense oligonucleotide comprising an oligonucleotide of SEQ ID NO: 3 or a variant thereof. Utilizes double-stranded RNA comprising a nucleotide chain.
  • the above-mentioned oligonucleotide variant of SEQ ID NO: 1 has a sequence that is hybridized under highly stringent conditions with respect to nucleotide numbers 46 to 66 of the gene encoding SCCA
  • the oligonucleotide variant 3 has a sequence that hybridizes under high stringency conditions to the complementary strands of nucleotide numbers 46 to 66 of the gene encoding SCCA.
  • the present invention further provides a cell in which the expression of SCCA is suppressed by the above method and a mammal containing such a cell.
  • a method and a pharmaceutical composition for the treatment and prevention of a disease selected from the group consisting of squamous cell carcinoma and psoriasis are provided.
  • the present application also includes the following aspects of the invention: Do
  • a screening method for substances that suppress keratinization of the epidermis including the activity of a candidate substance that suppresses the cystine protease inhibitory activity possessed by Squamous Cell Carcinoma Associated Antigen 1 (SCCA-1).
  • SCCA-1 Squamous Cell Carcinoma Associated Antigen 1
  • Epidermal keratinization characterized by containing as an active ingredient one or several herbal medicines selected from the group consisting of Higamama extract, Budu extract, strawberry extract, Kiuri extract, Kiwi extract and Taiso extract Composition for preventing skin, especially cosmetic cosmetic skin Adult.
  • composition according to [7] or [8], wherein the epidermal keratinization is caused by psoriasis is caused by psoriasis.
  • [1 1] A method for suppressing keratinization of epidermal insufficiency by normalizing keratinization of epidermal cells by suppressing the caspase-14 inhibitory activity of S C C A-1 in epidermal cells.
  • [1 2] Applying an external composition containing 1 or several kinds of herbal medicines as active ingredients selected from the group consisting of Himakuma extract, budu extract, tomato extract, cucumber extract, kiwi extract and taiso extract. [11] The method according to [11], which suppresses caspase 14 inhibitory activity of SCCA-1 in epidermal cells.
  • An external skin composition that suppresses skin keratinization especially a cosmetic or cosmetic external skin composition for the production of Himakuma extract, Budu extract, tomato extract, cucumber extract, kiwi extract and evening Use as an active ingredient of one or several herbal medicines selected from the group consisting of isotope extracts.
  • Figure 1 shows the expression of S C CA in the epidermis of exposed and unexposed areas.
  • Figure 2 shows the variation of SCA expression in the epidermis due to UV irradiation.
  • Figure 3 shows the effect of UV irradiation on SSCA expression in cultured human keratinocytes.
  • Fig. 4 shows a comparison of the apocytosis rate induced by UV irradiation between S C C A high-expressing cells and S C C A non-expressing cells.
  • FIG. 5 shows the establishment of the S S CA knockdown cell line.
  • FIG. 6 shows a comparison of the apoptosis rate induced by UV irradiation between S C CA knockdown cells and control cells.
  • Figure 7 shows a Western plot analysis of skin extracts.
  • the presence of zymogen and active caspase-14 was analyzed by immunoblotting by using H-99 antibody and M4D 146 antibody.
  • the whole skin extract, skin equivalent extract and keratinocyte extract of lO ⁇ g (lanes 1, 2 and 4) and l ⁇ g (lane 3) were applied.
  • Figure 8 shows the analysis of purified caspase-14.
  • A After SDS polyacrylamide gel electrophoresis, fraction No. 25 obtained from Superdex 75 mouthmatography was transferred to a membrane and stained with Coomassie Brilliant Blue. Two protein bands, 17 KDa and UKDa, were shown.
  • B Western blot analysis using H-99, M4D 146 and C20 antibodies. Positive for both 17 KDa band mosquito SH99 antibody and hl4D l16 antibody, also shown to be recognized by llKDa band strength 20 antibody '
  • Figure 9 shows the effect of various synthetic inhibitors on purified caspase-14.
  • Incubate caspase-14 with peptide inhibitors for caspases (YVAD, VDV AD, DEVD, VEID, IETD, LEHD, MLD) and class specific inhibitors for cysteine proteinase (IAA) and serine proteinase (AEBSF) did.
  • Residual enzyme activity was measured using WEHD-MCA as a substrate in the presence of 1.3 M sodium citrate and 5 mM DTT. The enzyme concentrations tested were 5, 2.5 and 1. respectively. The value represents the average value of the duplicate assembly.
  • FIG. 10 shows (A) cleavage activity of purified caspase-14 against I CAD.
  • B Western plot analysis using FL311 antibody. Cleavage products of 33 KDa and 27 KDa were shown. Pre-incubation with IO M S C C A-1 completely suppressed I C AD cleavage. ICAD degradation was observed only in the presence of cosmotrophic salts. Western blot analysis using antibodies specific for the amino terminal showed the disappearance of intact ICAD molecules during the extended incubation with caspase-14. When S C C A— 1 was added to the mixture, I C AD degradation was no longer detected and remained unaffected after 16 hours of incubation (B).
  • C The results of investigating the hydrolytic activity of synthetic caspase substrates in the presence of cosmotropic salts are shown.
  • Figure 11 shows the localization of active caspase-14 and TUN EL positive cells. Thin sections of skin of normal human H- 99 antibody (A), stained with HHD 1 46 antibody (B) and T UN EL (C). Texas-Red was used for fluorescence detection (B). Use FITC for TUN EL and Texas Red for immune staining for TUNEL and caspases Double staining was performed.
  • Figure 12 shows the co-localization of I CAD and keratinocytes. Thin sections of normal human skin were stained with the anti-I CAD antibody FL331. Most nuclei in the lower epidermis were positive for this antibody.
  • I CAD was stained with an antibody on the superficial layer of keratinocytes derived from AD patient skin, positive sites of various sizes were shown (B). Nuclei staining was often observed with fluorinated propime (PI) indicating nuclear clusters (C). The bright field at the same site showed an overlapping scale on the surface (D). The superimposed image revealed that ICAD exists only at the keratosis site (E). A superimposed image of nuclear staining in bright field is also shown (F).
  • PI fluorinated propime
  • FIG. 13 shows the co-localization of S C C A-1 and keratonuclei.
  • S C C A—1 was hardly detectable in normal skin sections.
  • S C C A-1 positive sites were shown (H). Nuclear clusters were found only on these sites (I).
  • the bright field is shown in (J).
  • the superimposed image shows that the S C C A-1 positive site preferably overlaps the site where undigested nuclei are present (K).
  • Another superimposed image corresponding to S C C A-1 staining and bright field is also shown (L).
  • SCCA is a protein having an action of suppressing apoptosis. Therefore, it is clear that by suppressing the expression of SCCA, it is possible to treat and prevent diseases associated with abnormal proliferation / differentiation of cells expressing squamous cell carcinoma antigen such as cancer and psoriasis.
  • squamous cell carcinoma include cervical, lung, esophagus, and upper Squamous cell carcinoma in organs such as the jaw and 'skin.
  • SCCA is a protein with a molecular weight of approximately 45,000 that is present in squamous cell carcinoma cells and psoriatic epidermis.
  • the amino acid sequences of S C CA-1 and S C C A-2 and the nucleic acid sequences encoding them are described in Takeda Aeta. J. Invest. Dermatol. 118, 147-154 (2002) (supra).
  • RNA interferometry antisense RNA NA DNA analysis, peptide and RNA • DNA polymerase, site-specific deletion, homologous recombination It can be achieved by various techniques such as dominant negative alleles, intrabodies, etc., but RNA interferometry is particularly preferred.
  • RNA interferometry is a method that uses a strand containing a sense oligonucleotide of about 21 to 23 base pairs complementary to a part of mRNA that codes a part of a target gene and a part of the above mRNA. This is a method for suppressing the expression of a target gene by introducing a double-stranded RNA composed of a homologous chain containing an antisense oligonucleotide of about 21 to 23 base pairs into a cell.
  • This method is based on the interference characteristics of double-stranded RNA derived from the coding region of the gene, and has been proven to have excellent utility in nematode genetic studies (Fire et al., Nature (1998) 391: 80 6-811) and can be used to produce a function-deficient phenotype in Drosophila and mammals.
  • a sequence (sense oligonucleotide) complementary to an appropriate target region of the SCCA gene preferably about 18 to 23 nucleotides in length, and a nucleotide length complementary to the sense sequence
  • dsRNA double-stranded RNA
  • the double stranded RNA is nucleotide number 46-6 of the SCCA gene.
  • a sense oligonucleotide containing a sequence complementary to the sequence at position 6 (ACATGAACTT GGTGTTGGCT T: SEQ ID NO: 1) and a sequence homologous to the sequence at nucleotide positions 46-6 (above AAGCCAACAC CAAGTTCATGT; SEQ ID NO: 3)
  • the total length of the sense and antisense oligonucleotides is not particularly limited.
  • the length is 25 nucleotides or more and 100 nucleotides or less, preferably 40 nucleotides or more and 80 nucleotides or less, more preferably 50 nucleotides. More than 70 nucleotides or less. '
  • the sense oligonucleotide may be an oligonucleotide comprising a variant of the oligonucleotide of SEQ ID NO: 1.
  • This mutant preferably has a sequence that hybridizes under conditions of high stringency to nucleotide positions 46 to 66 of the gene encoding SCA.
  • the antisense oligonucleotide may be an oligonucleotide containing a variant of the oligonucleotide of SEQ ID NO: 3.
  • This mutant preferably has a sequence that is hybridized under highly stringent conditions with respect to the complementary strand at nucleotide positions 46 to 66 of the gene encoding SCA.
  • the high stringency high-precipitation conditions are, for example, a sodium concentration of about 10 to 40 mM, preferably about 20 mM, and a temperature of about 50 to 70 ° C, preferably Conditions including about 60 to 65.
  • the resulting double-stranded RNA can be introduced directly into the target cell or d s
  • RNA may be preliminarily linked to a vector having elements necessary for transcription such as a promoter and terminator, and then introduced into a target cell.
  • Double strand R above By introducing a vector containing NA into a cell, the sense strand of SEQ ID NO: 1 (or a variant thereof) and the antisense strand of SEQ ID NO: 3 (or a variant thereof) and the sense strand thereof are transcribed in the cell.
  • a short hairpin R NA (shRNA) is generated that connects the DNA and the antisense strand.
  • sh RNA is then cleaved into short RNA (short interfering RNA) of about 21 to 23 base pairs by intracellular nuclease and dicer, forming a complex RISC and cleaving the SC CA mRNA.
  • short RNA short interfering RNA
  • a gene that suppresses the expression of SCCA for example, the above double-stranded RNA or another gene that suppresses the expression of SCCA, such as antisense DNA or RNA, Absorber RNA or DNA, etc. , Simply called “SCCA expression-suppressing gene”), which suppresses the expression of SCCA, and as a result is used as an active ingredient in a pharmaceutical composition for the prevention and treatment of psoriasis and squamous cell carcinoma.
  • the SCC A expression-suppressing gene may be directly administered by injection, or may be administered to the affected area by a method of administering a vector or plasmid in which the gene is incorporated.
  • Examples of the above vectors include adenovirus vectors, adeno-associated virus vectors, herpes virus vectors, vaccinia virus vectors, retrovirus vectors, etc. SC virus expression can be efficiently performed using these virus vectors.
  • a suppressor gene can be administered. It is also possible to adopt a method in which an SCCA expression-suppressing gene is introduced into a phospholipid vesicle such as liposome and the ribosome is administered. Since ribosomes are closed vesicles containing biodegradable materials, mixing the ribosome and gene causes the aqueous layer and lipid bilayer inside the liposome to hold the gene (liposome Mu-gene complex). Next, when the complex is cultured with cells, the gene in the complex is taken into the cells (lipofection method). Then, the obtained cells may be administered by the following administration method.
  • the administration form of the pharmaceutical composition in addition to systemic administration such as normal intravenous and intraarterial administration, local administration can be performed to each tissue where tumor or psoriasis is present. In addition, administration forms combined with catheter technology, surgery, etc. can be employed.
  • the dosage of the pharmaceutical composition of the present invention varies depending on age, sex, symptom, administration route, administration frequency, dosage form, and will be determined appropriately by a doctor or the like.
  • plasmid DNA When plasmid DNA is administered directly intravenously, it is difficult to express the gene because DNA is immediately degraded by DNase in the blood. Therefore, when using plasmid DNA, it is preferable to adopt the direct injection method of plasmid. This method is easier to purify the vector than the method using viral vectors, so it can be prepared in large quantities in a short time, and there is no restriction on the size of the transgene and the concentration at the time of injection. Etc. (Verma IM et al., Nature 389: 239-242, 1997).
  • the direct injection method purified plasmid DNA is dissolved in physiological saline and injected directly into the muscle. As a result, the plasmid DNA is taken into cells around the injection site, the expression of the gene incorporated into the eukaryotic expression unit on the plasmid occurs, and the gene product is produced.
  • the direct injection method for DNA is currently intramuscular, but intratumor (Yang JP et al., Gene. The r. 3: 542-548, 1996) and intradermal (Hengge UR et al. , J. Clin. In vest. 97: 2911-2916, 1996; Coate KA et al., Hum. Gene. Ther. 8: 1659-1665, 1997). Is possible.
  • plasmid DNA for example, 1 g to lmg, preferably 25 ⁇ g to 100; g of DNA is dissolved in 1 physiological saline and injected. This gives the highest expression after 4-7 days.
  • Confirmation of suppression of the expression of S C C A can be performed, for example, by directly measuring the amount of S C C A in the cell.
  • it is determined by extracting RNA from the cell and measuring the amount of mRNA encoding SCC A. Extraction of mRNA and measurement of the amount thereof are well known in the art.
  • quantification of RNA is performed by quantitative polymerase chain reaction (PCR).
  • SCCA measurement uses antibodies specific to SCCA, and methods well known in the art, such as immunostaining methods using fluorescent substances, dyes, enzymes, etc., Western plot methods, immunoassay methods such as It can be performed by various methods such as ELISA and RIA.
  • the expression level of S C C A can also be measured by measuring the known biological activity of S C C A.
  • the expression of SCA can be determined through in situ hybridization and measurement of its biological activity.
  • the cells in which the expression of S C CA is suppressed according to the present invention may preferably be epidermal cells such as granule cells, spinous cells and the like.
  • mammals having such cells include mice, rabbits, hamsters, guinea pigs, usagis, inu, cats, horses, sushi, hedges, bushes, and goats. It may be a non-human mammal such as a monkey.
  • the animals and cells according to the present invention should be used as model animals and cells used for screening, for example, elucidation of the UV protection mechanism of the epidermis, and research and development of drugs that prevent or suppress UV-induced skin damage. You can.
  • Psoriasis is a skin disease and is a chronic, recurrent inflammatory keratokeratosis characterized by abnormal proliferation / differentiation of epidermal cells and inflammatory cell infiltration. Psoriasis is thought to develop by adding various environmental factors to the genetic predisposition (
  • S C C A is encoded by two genes, S C C A-1 and S C C A-2, which are arranged in tandem on chromosome 18Q 21.3.
  • CA-12 is a protein with a molecular mass of approximately 45,000, which is highly homologous, but has a different amino acid sequence at the reaction site and is thought to have different functions (Schick et al J. Biol. Chem. (1997) 27
  • the screening method for a substance that suppresses epidermal keratinization uses the activity of a candidate substance that suppresses the cysteine proteinase inhibitory activity possessed by SCCA-1 as an index.
  • a cysteine protease ideally caspase 14 is most preferred, but other caspase families, or any other known cysteine protease, such as papine, given availability Cathebsins, such as cathebsin B, cathebsin L, bromelain, and ficin, can be substituted.
  • the screening method comprises a system that assesses the activity of a cysteine protease (1), a system that assesses the activity of a cysteine protease in the presence of only a candidate substance (2), and a candidate substance and SCCA-1 Is composed of a system (3) for preincubating and assessing the activity of cysteine protease in the presence of the incubation mixture.
  • a system that assesses the activity of a cysteine protease in the presence of only a candidate substance (2) and a candidate substance and SCCA-1 Is composed of a system (3) for preincubating and assessing the activity of cysteine protease in the presence of the incubation mixture.
  • the Atsy system (2) it is possible to know the influence of the candidate substance itself on the cysteine protease.
  • Atssey (1), (2), (3) There are no particular restrictions on the order in which they are performed, and if the conditions are the same, the sessions may be performed on the same day or in different ways
  • cysteine protease The enzyme activity of cysteine protease is measured using a conventional cysteine protease substrate such as N ⁇ -benzoyl-L-arginine 4-12 troanilide hydrochloride (L 1 ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ). It can implement by the method of.
  • a conventional cysteine protease substrate such as N ⁇ -benzoyl-L-arginine 4-12 troanilide hydrochloride (L 1 ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ). It can implement by the method of.
  • the screening method can be carried out as follows.
  • cysteine protease Incubate the cysteine protease for a specified time in a suitable buffer solution such as HEPES buffer. Next, a substrate for cysteine protease, such as L-B A P NA, is added, incubated at a predetermined temperature for a predetermined time, developed, and the enzyme activity [X] of cysteine protease is measured.
  • a substrate for cysteine protease such as L-B A P NA
  • cysteine protease After incubation of the above-mentioned buffer for the assay and the candidate substance for a predetermined time, cysteine protease is added, and the activity [y] of the systemic protease is measured under the same conditions as in (1). The% ⁇ [y] / [x] X100 ⁇ of the cysteine protease enzyme activity [y] to the above [X] is determined.
  • the value of ⁇ [y] / [X] X100 ⁇ is a measure of the cysteine protease inhibitory activity of the test substance as described above. That is, the closer the value is to 100, the more the cysteine protease inhibitory activity of the test substance. Means low. Further, a value ⁇ 100 ⁇ [y] / [x] X100 ⁇ obtained by subtracting the value of ⁇ [y] / [x] X100 ⁇ from 100 is also obtained. In this case, the closer the value is to 0, the more cysteine prosthesis the test substance has. It means that thease inhibitory activity is low.
  • ⁇ [z] / [X] X100 ⁇ is a measure of the sum of the cysteine protease inhibitory activity of SCCA-1 and the cysteine protease inhibitory activity of the test substance itself, that is, its value is close to 100. It means that the total inhibitory activity is low.
  • Substances screened by the above method are presumed to have an inhibitory effect on cysteine protease inhibitory activity possessed by SCC A_1, and thus have a function to suppress keratinization, and may be useful as a keratinization inhibitor. High nature.
  • the screening method according to the present invention is extremely useful as a primary screening method for countless candidate substances, for example, substances that suppress epikeratosis keratinization from herbal medicines.
  • Symptoms of keratosis include skin diseases such as psoriasis, atopic dermatitis, sweat keratosis, actinic keratosis, seborrheic keratosis, squamous scabies, etc.
  • Substances selected by the screening method according to the invention can be useful for the treatment and prevention of these skin diseases.
  • the present inventor examined the effect of inhibiting the cystine protease inhibitory activity possessed by SCCA-1 of various herbal medicines by the above screening method. As a result, the followings were found: Himakuma extract, budu extract, cocoon extract, cucumber extract, kiwi extract and evening isou extract It has been found that it has such a suppression effect. Accordingly, in another aspect, the present invention is characterized by containing, as an active ingredient, one or several herbal medicines selected from the group consisting of a castor extract, a budu extract, a tomato cake extract, a cucumber extract, a kiwi extract, and an evening extract. An external composition for skin that suppresses keratinization of epidermal failure is provided.
  • Extracts from these plants can be obtained by drying plant raw materials as necessary, further chopping or grinding as necessary, and then extracting with an aqueous extractant or an organic solvent.
  • an aqueous extractant for example, cold water, hot water, or hot water having a boiling point or lower than that can be used.
  • the organic solvent methanol, ethanol, 1,3-butanediol, ether, etc. It can be used in or heated.
  • One or more of the above-mentioned extracts in the composition for external use according to the present invention can be arbitrarily selected and used.
  • the content of the extract is preferably 0.001 to 20.0 mass%, more preferably 0.001 to 10.0 mass%, based on the total amount of the external composition. In particular, 0.1 to 5.0% by mass is preferable. If the content is less than 0.001% by mass, the effects of the present invention may not be fully exhibited. In some cases, it is not preferable.
  • composition for external use of the present invention may be produced according to a conventional method, and can be prepared by the above extract alone, but in addition to the above extract, components usually used in skin external preparations such as cosmetics and pharmaceuticals, such as oil, Surfactant, powder, coloring material, water, humectant, thickener, alcohols, various skin nutrients, antioxidants, UV absorbers, fragrances, preservatives, etc. may be added as necessary. it can.
  • cosmetics and pharmaceuticals such as oil, Surfactant, powder, coloring material, water, humectant, thickener, alcohols, various skin nutrients, antioxidants, UV absorbers, fragrances, preservatives, etc.
  • metal sequestering agents such as disodium edetate, trisodium edetate, sodium citrate, sodium polyphosphate, sodium metaphosphate, gluconic acid, caffeine, tannin, verapamil, and derivatives thereof, licorice extract, Grab lysine, hot water extract of fire spine fruit, various herbal medicines, tocopherol acetate, glycyrrhizic acid and its derivatives or salts thereof, vitamin C, magnesium ascorbate phosphate, darcoside ascorbate, arbutin, kojic acid, etc.
  • Whitening agents glucose, fructose, mannose, sucrose, saccharides such as trehalose, vitamin A such as retinol, retinoic acid, retinoic acetate, retinol palmitate, and the like can also be added as appropriate.
  • composition for external use of the present invention can be used as a cosmetic, a quasi-drug, etc., particularly preferably as a cosmetic, applied to the outer skin, and its dosage form is also an aqueous system, a solubilization system, an emulsification system.
  • dosage forms such as powder system, oil liquid system, gel system, ointment system, aerosol system, water-oil 2 layer system, water-oil 1 powder 3 layer system, etc.
  • it is a basic cosmetic, it can be widely applied in the above-mentioned various dosage forms in the form of face wash, lotion, milky lotion, cream, jewel, essence (beauty serum), pack, mask and the like.
  • makeup cosmetics can be widely applied in the form of body soap, soap, etc.
  • quasi-drugs can be widely applied to various ointment forms.
  • the form which the composition for external use of this invention can take is not limited to these dosage forms and forms.
  • the present invention also provides a method for suppressing keratinization of epidermal cells by suppressing keratinization of epidermal cells by suppressing the caspase 14 inhibitory activity of SCC A-1 in epidermal cells.
  • Symptoms with aberrant keratinization include skin diseases such as psoriasis, atopic dermatitis, sweat keratosis, sunlight keratosis, seborrheic keratosis, squamous scab as described above. It is done.
  • the composition is applied by applying the skin external composition according to the present invention to the skin, but its usage and dosage are not particularly limited, and the dosage form of the skin external composition and the skin to be treated are not particularly limited.
  • the present invention will be described more specifically with specific examples. In addition, this invention is not limited by this. Example
  • Epidermal biopsies were fixed in cold acetone and embedded in paraffin according to the AM e X procedure (Sato Y. et al. Am. J. Pathol., 125, 431-435 (1986)). Sections were deparaffinized with xylene, washed with acetone and then PBS. Next, the non-specific binding site of the section was blocked with 10% normal rabbit serum (Histofine, Tokyo, Japan).
  • the epidermis section was anti-SCCA-1 monoclonal antibody (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA) ( 1: diluted to 500), anti-one SCCA-2 Monoclonal antibody (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA) (diluted 1:50) or anti-SCCA polyclonal antibody (described in Takeda A. et al. J. Invest. Dermatol. 118, 147-154 (2002)) Incubated with each of the following methods. After washing with PBS, the sections were counterstained with hematoxylin and observed with DAKO Envision System (DAKO Corp., CA, USA).
  • DAKO Envision System DAKO Corp., CA, USA
  • Figure 1 shows the epidermis from the upper arm (24-year-old human), the buttocks (46-year-old human), and the thigh (75-year-old human), which are non-exposed areas.
  • the epidermis derived from the human body (20 years old, 76 years old) and the eyelid (82 years old) is collected using an anti-SCCA polyclonal antibody that binds to both SCCA-1 and SCCA-2. This is the result of observation. From Fig. 1, it can be seen that S C C A is significantly enhanced in the upper epidermis of the exposed part compared to the non-exposed part. However, no increase in the expression of SCA was observed in the basal layer even at the exposed site.
  • Fig. 2 shows UV epithelial specimens of UV epithelial (transluminous evening T0 REXFL 2 0 5-E-3 0 / DMR (Toshiba Medical Supply)) and the non-irradiated control epidermis.
  • Fig. 2 shows the results of microscopic observation of the expression of SCCA-1 and SCCA-2, respectively, using anti-SCCA-1 monoclonal antibody and anti-SCCA-2 monoclonal antibody, respectively.
  • Both SC-1 and SCCA-2 were found to be upregulated by UV irradiation of the human epidermis, and the increased expression was prominent in the spinous and granular layers of the skin.
  • the expression levels of SCCA-1 and SCCA-2 were determined by quantitative real-time polymerase chain reaction (PCR). Briefly, total RNA was converted to cDNA using Supers cript II (Invitrogen, Carlsbad, CA). The sample was amplified using AB IPR ISM 7900 HTS Se que nc De te ct i sSon stem (Applied Biosystems, Foster City, Calif.) By performing 40 steps of 2-step PCR. As an internal standard, GAPDH (Daricel Aldehyde 1-3_Phosphate Dehydrogenase) was used.
  • the primers used are as follows.
  • a reporter dye (6—force loxy-fluorescein) was attached to the 5 ′ end of the Taq Man probe sequence, and a Quenchia monochroma (6_carboxy-tetramethyl-rhodamine) was incorporated at its 3 ′ end.
  • Figure 3 shows the results of the effects of U V B irradiation on the expression of S C CA in cultured human keratinocytes. It was revealed that the expression of both S C C A-1 and S C C A-2 was enhanced by UV irradiation. Therefore, it was revealed that the expression of S C C A-1 and S C C A 12 was enhanced at the gene level in the epidermal cells by UV irradiation.
  • T 3 T 3 cells are cells derived from mouse embryos that do not express SCC A-1 and 2. A gene encoding S C C A-1 or 2 was introduced into these cells as follows.
  • SCCA-1 and SCCA-2 cDNA (Takeda A et al. J. Invest. Dermatol. 118, 147-154 (2002)) were double digested with BamHI and KpnI. They were subcloned into the pTarget vector and then introduced into 3T3 cells using L i ⁇ ofectamine Plus (GIBC 0, Invitrogen Corp.). Briefly, 20 g of cD NA in serum-free DME M medium (Invitrogen Corp.) 6 75/1 is mixed with 75 1 Plus reagent and left in 25 5 for 15 minutes did.
  • Lipofectamine (1 00 ⁇ 1) was added to 6500 1 serum-free DME M medium, which was then added to the above cDNA-P 1 us mixture and left at 25 ° C for 15 minutes .
  • This c D NA mixture was added to serum-free DMEM medium 1 0 ml, its to 3 T 3 4 hours the cells therein at 3 7 ° C, it was incubated with C 0 under 2 atmosphere of 5%.
  • the medium was replaced with DMEM medium containing 10% FCS (Invitrogen Corp.) and incubated overnight.
  • G 4 18 (Calbiochem) was added to a final concentration of 500 g / m 1.
  • G 4 18 was kept at this concentration throughout the culture period. The medium was changed every 2-3 days. After 4 weeks in culture, several G 4 18 resistant colonies could be isolated and SCCA-1 and SCCA-2 expressing cell lines were established.
  • SCCA-1 transfected cells express SCCA-1 specifically and stably, and thus, it was confirmed that the cells into which cDNA encoding SCCA-2 was introduced (SCCA-12-introduced cells) specifically and stably express SCCA-2.
  • SCCA-12-introduced cells specifically and stably express SCCA-2.
  • 3T3 cells (control cells) into which nonspecific sequences were introduced by the same procedure did not express either SCCA-1 or SCCA-2.
  • S CCA-1 introduced cells
  • S CCA-2 introduced cells
  • control cells the roles of S C C A-1 and S C C A-2 when uv irradiation was applied to epidermal cells were examined. Specifically, we examined the role of S C CA-1 and S C CA -2 in UV-induced apoptosis in epidermal cells.
  • the various cells were cultured in a DMEM medium containing 10% FCS at 37 ° C. in an atmosphere of high humidity and 5% CO 2 .
  • Cells at 60-70% confluence were irradiated with UVB for 0-48 hours.
  • a transluminator TOR EX FL 2 0 5—E— 3 0 / DM R (Toshiba Medical Supply) was used at an intensity of 50 m JZ cm 2 .
  • Apoptosis evaluation for these cells was performed using FAC SC OULTER (EPIX XL-MCL, Becjman Coulter), and annexin V-FITC and propidimyodain (PI) double staining (Annexiii V-FITC kit, Immunotech) The analysis was performed by FACS (fluorescence-activated cell saw) analysis using as an index.
  • SC SC-1 and SC A CA-2 knockdown cell line was established by RNA interference, and the role of SCCA-1 and SCCA-2 in the epidermal cells during UV irradiation was further investigated.
  • HaCat cells H. Hans, et al. Experimental Cell Research 239, 399-410 (1998) are human keratinocytes that highly express SCA. According to the RNA interference method, this cell is constitutively expressed with pS i 1 en-cer vector (Ambion) and siRNA (short interference RNA) is expressed. Established.
  • the siRNA was constructed using the pS i len c er vector according to the attached instructions. Specifically, nucleotide numbers 46 to 6 of SCCA-encoding gene 65-mer sense oligonucleotides (SEQ ID NO: 1), including 21-mer oligonucleotides complementary to positions 6 (ACATGAACTT GGTGTTGGCT T: SEQ ID NO: 1) 2) and 65-mer antisense oligonucleotides (SEQ ID NO: 13), including 21-mer oligonucleotides (AAGCCA ACAC CAAGTTCATGT; SEQ ID NO: 3) homologous to nucleotide positions 46-6-6.
  • SEQ ID NO: 1 65-mer sense oligonucleotides
  • SEQ ID NO: 13 65-mer antisense oligonucleotides
  • AAGCCA ACAC CAAGTTCATGT 21-mer oligonucleotides
  • the resulting double-stranded oligonucleotide was cloned into the Hind III and Bam HI sites of the pS i 1 encer vector.
  • the transfer to Ha C at cells was performed using Lipofectinium 200 (In vitrogen) according to the attached instructions.
  • the control cell uses a double-stranded oligonucleotide consisting of two oligonucleotides that do not have significant homology or complementarity to the mammalian gene sequence.
  • a stable cell line was obtained by culturing transfection cells in hygromycin-B selective medium for 4-6 weeks and selecting. To confirm that the expression of SCCA is suppressed Therefore, the expression of SC CA-1 and SCC A_2 was measured by real-time PCR as described above.
  • Sense oligonucleotide (SEQ ID NO: 1 2)
  • Antisense oligonucleotide (SEQ ID NO: 1 3)
  • the various cells were cultured in keratinocyte SFM medium (GIBCO, Invitrogen) at 37 ° C. in the presence of L-glutamine and epidermal growth factor in a high humidity, 5% CO 2 atmosphere. Cells with a confluence of 60-70% were irradiated with UVB. UVB irradiation was performed using transluminescence Yuichi TOREX FL 2 0 5-E-30 / DMR (Toshiba Medical Supply) at an intensity of 50 mJ / cm 2 .
  • FAC SC OUL TER Fluorescence activated cell chromatography
  • PI propidium dydin
  • Ac-WEHD_MCA, Ac- YVAD- MCA, Ac-VDVAD-MCA, Ac_DEVD- MCA, Ac-VE ID-MCA, Ac-IETD_MCA, Ac_LEHD- MCA are purchased from Pept ide Institute, Inc. (Japan, Osaka) did.
  • Benzyloxycarbonyl (Z) -YVAD-FMK, Z-VDVSD-FMK, Z-DEVD-FMK, Z-VEID-FMK, Z-IETD-FMK, Z-LEHD-FMK and Z-VAD-FMK are BioV Purchased from ision (Mountain View, CA). Recombinant caspase-1-10 ttBIOMOL Research Labs, Inc. (Plymouth Meeting, PA). The H-99 antibody (Santa Cruz Biotechnology, Inc) was used for detection of the proform and large subunit of caspase-14.
  • the H-99 antibody is an antibody raised against a peptide corresponding to amino acids 24-122 of human caspase-14, and therefore the caspase-14 proenzyme and its processed form, ie its large subunit. React with. C-20 antibody (Santa Cruz) was used to detect caspase-14 small subunits.
  • a cleavage site-specific antibody (hl4D M 6 ) was prepared by immunizing a rabbit with a synthetic pentapeptide TVGGD corresponding to the putative processing site of hitosparse- 14 . (2-ii) Measurement of WEHD-MCA hydrolysis activity
  • the reaction was stopped with 150 l of 0.1M monochloroacetic acid and measured using a Fluoroskan Ascent FL (The ⁇ Electron Co., Wolsam, Mass.) With an excitation wavelength of 355 nm and an emission wavelength of 460 nm.
  • Fluoroskan Ascent FL The ⁇ Electron Co., Wolsam, Mass.
  • caspase 14 and peptide inhibitors were incubated in the assay buffer for 15 minutes at room temperature, and the assay was initiated by adding 5 l of IOO M WEHD-MCA.
  • the column was equilibrated with 20 mM acetate buffer (pH 4.5) and eluted with a 0-1 M NaCl gradient.
  • the positive fraction was concentrated and loaded onto a chromatofocusing Mono P column equilibrated with 25 mM ethanolamine (pH 8.3). Elution was performed using 46 ml of Polybuffer (pH 5.0) while forming a pH gradient from pH 8 to 5.
  • Caspase 14 was finally purified using Superdex 75 gel chromatography. Protein concentration was determined with the BioRad Protein Assay Kit (BioRad Lab, Hercules, CA).
  • CDNA encoding Caspase-14 was isolated and amplified from PCR by PCR using forward primer: AAGGATCC AATCCGCGGTCTTTGGAAGAGGAG (SEQ ID NO: 14) and reverse primer: TTTCTGCAGGTTGCAGATACAGCCGTTTCCGGAGGGTGC (SEQ ID NO: 15) .
  • the PCR product was cloned into the pQE-100 DoubleTag vector (Qiagen, Valencia, Calif.) And expressed in E. coli JM109.
  • SSCA1 cDNA was isolated from the psoriasis cMA library (Takeda A et al., J. Inve st. Dermatol., 118, 147-54 (2002)) and cloned into pQE30 Quiagen .
  • the recombinant protein was purified by Ni-NTA Agarose (Quiagen) and Mono Q chromatography.
  • TUN EL positive cells and active caspases For double immunodetection of TUN EL positive cells and active caspases, Texas Red® dye-conjugated anti-rabbit IgG (donkey) was used as the secondary antibody.
  • the TUN EL reaction was performed using a fluorescein in situ cell death detection kit (Roche Diagnostics) according to the manufacturer's instructions.
  • the sample was infiltrated with 0.1% Triton X-100, and the sample was immunostained overnight at 4 ° C. with anti-ICAD or anti-SCCA antibody.
  • Alexa Fluor 400-conjugated anti-rabbit (ICAD) or anti-mouse IgG (SCCA-1) was used as a secondary antibody for 1 hour at room temperature.
  • ICAD Alexa Fluor 400-conjugated anti-rabbit
  • SCCA-1 anti-mouse IgG
  • Caspase 14 in keratinocytes is processed by Asp 1 "
  • the H-99 antibody detected only a 17 KDa band in the keratinocyte extract (Figure 8). This result is inconsistent with the results for extracts from whole skin or skin equivalent models, including the unprocessed 30 KDa form.
  • This 17 KDa band is also recognized by the M4D 146 antibody (Fig. 8B), and is presumed to be a large subunit of active caspase 14 (Pl7). This suggests that caspase 14 maturation is achieved by cleavage at Asp 146 during the final stages of terminal differentiation.
  • a 30 KDa band was also recognized by the H-99 and hl4D 146 antibodies in the skin equivalent model, suggesting cleavage at Asp 146 .
  • caspase 14 in keratinocytes is presumed to exist in a processed and hence active form (Eckhart L. et al., J. Invest. Dermatol. 115, 1148- 51 (2000); Lippens S. et al., Cell Death Differ. 7, 1218-24 (2000); Mikolajczyk, J. et al., Biochemistry 43, 10560-9 (2004)). It is considered an excellent source of purification.
  • human keratinocytes are also known to contain caspase-1-like enzymes ( Takahash i T., J. Invest. De rma tol. Ill, 367-72 (1998)).
  • Caspase-1 substrates can be hydrolyzed by both caspase-1 and caspase-14.
  • the inventor first tested 1. WEHD-MCA hydrolysis by caspase-1 in the presence or absence of 1. 3M sodium citrate and 5 mM dithiothreitol. Even though WEHD-MCA is an excellent substrate for caspase-1 in standard caspase assembly buffer, it was confirmed that caspase-1 cannot hydrolyze this substrate in the presence of kosmotropic ions. (De won't be shown). Therefore, each fraction was evaluated in three ways, including hydrolytic activity on WEHD-MCA, reactivity with H-99, and hl 4D 14 6 antibody. Table 1 shows the results of continuous chromatography.
  • caspase 14 has been purified as a heterodimer consisting of a large subunit (17 KDa) and a small subunit (ulkda).
  • Superdex 75 gel chromatography showed that, unlike other caspases, caspase 14 in human keratinocytes exists as a monomer, like the dalanzyme B activated form.
  • Table 1 summarizes caspase 14 purification rates. Starting from about 10 mg of soluble protein extract, 11.8 g of purified protein was obtained. The specific activity increased 764 times and the yield was 9.1%.
  • caspase-14 The enzyme properties of purified caspase-14 were examined (Figs. 9-10).
  • Caspersee 14 has various caspase cracks such as YVAD-FMK (Caspase-1 inhibitor), VDVAD-FMK (Caspase-2 inhibitor), DEVD-FMK (Caspase-3 inhibitor), It was sensitive to IETD—FMK (caspase-8 inhibitor), LEHD-FMK (caspase-9 inhibitor) and VAD—FMK (pan—caspase inhibitor) (FIG. 9).
  • IETD—FMK caspase-8 inhibitor
  • LEHD-FMK caspase-9 inhibitor
  • VAD—FMK pan—caspase inhibitor
  • pan-caspase cracker VAD-FMK inhibited caspase 14 activity to the same extent as VAD-FMK.
  • the class specific inhibitor for cysteine proteinase, odoacetic acid (IAA), or the class specific inhibitor for serine proteinase, 4- (2-aminoethyl) benzensulfonyl fluoride (AEB SF) was used in this study. There was no significant inhibitory effect at the test concentrations.
  • caspase 14 During the search for caspase 14 natural substrate, the inventors tested the effect of caspase 14 on ICAD. This is because nuclear loss is one of the most important events for terminal differentiation. Incubation of purified caspase-14 with recombinant ICAD protein in normal caspase atsey buffer indicated that purified caspase 14 was not hydrolyzed to ICAD according to Western blot analysis using anti-ICAD IgG. It did not show degradation activity (Fig. 10A). However, in the presence of kosmotropic salts, there is a decrease in the ICAD protein content and an increase in the two major degradation products. Purified caspase 14 showed limited degradation to IC AD
  • SCCA-1 belongs to the serpin superfamily, but inhibits cysteine proteinases such as papain and cathebsin L (Takeda A. et al., Biol. Chem. 383, 1231-6 (2002)). This indicates that it is a unique cross-class inhibitor such as SCCA-1 force s Crm-A 32 . Therefore, the present inventors tested whether SCC A_1 can inhibit caspase members. In the case of Kaspersee 14, the cosmotropic conditions were used. Incubation of recombinant active caspase with SCCA-1 did not affect any of the caspase members (1-10) for enzyme activity. In contrast, SCCA-1 inhibited the activity of caspase-14 against WEHD-MCA in a dose-dependent manner (Fig. 10C). SCCA-1 also inhibited IC AD degradation by caspase-14. Prolonged incubation did not show any recovery of enzyme activity. This suggests a strong binding between caspase-14 and SCCA-1 (Fig. 10 B).
  • caspase 14 including proform and active form was localized from spinous cells to keratinocytes in normal human epidermis. This is consistent with previous findings (Lippens et al., (2000), supra). Active caspase-14 detected with the hl4D 146 antibody was limited to keratinocytes and a part of granule cells (FIG. 11B). Most keratinocytes were ubiquitously stained. TUNEL positive cells were observed just below the cornified layer, but many of these positive cells were significantly restricted ( Figure 1). 1 C) o Interestingly, TUNEL positive cells were localized exclusively with hl4D U 6 positive cells. This suggests that MA fragmentation has occurred in these cells and that active caspase-14 is involved in this process.
  • caspase 14 is expressed in the epidermis and rarely in other tissues (Van de Craen, M et al., Cell Death Differ. 5, 836-46 (1998)).
  • Previous reports show that terminal differentiation of keratinocytes is linked to caspase 14 processing, suggesting activation of caspase family proteinases (Lippens, S et al. , Cell Death Differ 7, 1218-24 (2000); Eckhart 1. Biochem. Biophys. Res. Commun. 277, 655-9 (2000); Hu SJ Biol. Chem 273, 29648-53 (1988)).
  • the final preparation consisted of two protein bands: a 17 KDa protein band recognized by the hl4D 146 antibody and an llKDa protein band recognized by the C20 antibody. These protein bands are the large and small subunits of active caspase-14. During the purification process, an H-99 positive 17 KDa band was recognized along with the M4D 146 antibody. This suggests that the large subunit ends with Asp 146 at its carboxyl terminus. The amino subunit region of the small subunit was identified as Lys 153 -Asp-Ser-Pro-Gin, suggesting that processing occurs between lie 152 and Lys 153 . This site is a strange cleavage site for caspase members.
  • caspase 14 has significantly different properties. The inventor has first elucidated that SCCA-1 is an endogenous inhibitor for caspase 14.
  • SCCA-1 The most specific property of SCCA-1 is its remarkable specificity for force spurse 14. Caspase Other members of 1-10 are not affected by SCCA-1 SCCA-1 does not inhibit Caspa-See 3 activity using synthetic substrate DEVD-MCA or natural substrate IC AD This is in contrast to Crm A. Crm A also belongs to the Serpin superfamily and is known to be able to suppress a number of caspases including caspase 1 and caspase 8 (Gagliardini V.
  • IC AD also called DNA fragmentation factor “DFF 45”
  • C AD caspase-activated DNase
  • IC ADZ CAD system plays a major role in the degradation of chromosomal DNA during apoptotic cell death.
  • IC AD bound to CAD exists as an inactive complex. Caspase - 3, evening with limited relative IC AD indicates proteolytic, cut at two sites Asp 1 17 and Asp 224.
  • caspase 14 can be a perfect replacement for caspase-3. While caspase 14 can degrade ICAD, it is clearly different from pro-apoptotic caspase 3 for the following reasons. First, caspase 14 overexpression does not induce apoptotic cell death (Van de Craen. Cell Death Differ. 5, 838-46 (1 998)). This is in contrast to caspase 3. Secondly, force spurse 14 is not activated by various apoptotic stimuli (Lippens et al. (2000), supra). The initiating caspase or other caspase member was unable to process pro-caspase-14. This is consistent with previous findings (Lippens et al. (2000), supra).
  • caspase-14 Activation occurs only during terminal differentiation (E ckhart L. et al., (2000), supra).
  • caspase-14 synthesis is limited to differentiating keratinocytes in adult tissues (Eckhart L. Biochem. Biophys. Res. Commun. 277, 655-9 (2000)).
  • caspase-14's ability to cut ICAD is regulated in a significantly different manner than caspase-3.
  • IC AD degradation by caspase-14 requires unusually high concentrations of kosmotropic ions. At such ion concentrations, other caspases were hardly active.
  • caspase 14 seems to be in a special position among the caspase members because the keratinocyte fractionation program regulates its activation.
  • SCCA-1 is hardly expressed.
  • strong expression has been reported in the psoriatic epidermis, mucosa and esophagus (Takeda A. et al., J. Invest. Dermatol. 118, 147-54 (2002)).
  • these tissues are associated with keratinization.
  • the present inventor has revealed that intense staining of SCCA-1 is also found at the keratinization site.
  • SC CA-1 and I CAD were always colocalized at the same site where the nuclear assembly was present.
  • the overall activation mechanism of caspase 14 in the skin is not well understood. Activation is only observed in skin or skin equivalent models, not in cell culture systems (Eckhar t L. et al. (2000), supra). In fact, the present inventors tried various conditions. These conditions include the addition of serum, the extension of the culture period to 14 days in the presence or absence of calcium and in the presence or absence of calcium, treatment with calcium ionophore A2 3 187, or many differentiations Includes 30 minutes of air exposure sufficient to uplift the marker. These differentiation stimuli induced significant caspase-1 1 ⁇ 2MA expression, but there was no effective stimulus to induce caspase 14 activity (data not shown). The activation process is tightly controlled and strongly inhibited in monolayer culture.
  • caspase 14 activation is not controlled by the apoptotic program, but through the control of the differentiation program.
  • many proteinases are also activated, including serine, cysteine and aspartate proteinases. Trypsin-like and chymotrypsin-like serum proteinases have been suggested to play a role in detaching the outermost keratinocytes.
  • Some cysteine proteinases, such as cathebsins B and L, are upregulated in differentiated keratinocytes.
  • Cathebsin D, aspartate proteinase has also been suggested to play a role in keratinocyte shedding. These enzymes may be involved in other differentiation mechanisms, such as caspase-14 activation.
  • C A-1 Abnormal expression of C A-1 directly affects the differentiation program, resulting in keratinization and disruption of barrier function.
  • Atsy buffer 50 mM HEPES (pH 7.5) 5 mM DTT 2.5 mM EDTA 0.1% C HA PS) 80 1 and 1 g / ml papine (Sigma) 20 1 are mixed and brought to room temperature. Incubated for 15 minutes. Next, 2.5 mM of substrate N ⁇ -benzoyl L-arginine 4-nitroanilide hydrochloride (L-BAP NA) 20 1 was added and incubated at 37 ° C for 15 minutes. To this was added 25% acetic acid solution 30 1 in ethanol and 0.2% p-dimethylaminocinnamaldehyde 30 1 was added for color development, and the absorbance at 545 ⁇ was measured. This absorbance is defined as the enzyme activity [X] of cysteine protease.
  • the above-mentioned buffer 60 1 and candidate 20 ⁇ 1 were incubated at room temperature for 30 minutes. To this was added 1 g / ml of papain 201 and incubated at room temperature for 15 minutes. Then 2.5 mM L 1 B A P N A20 1 was added and incubated at 37 ° C. for 15 min. To this, 25% acetic acid solution 30 ⁇ 1 in ethanol and 0.2% ⁇ -dimethylaminocinnamaldehyde 30/1 were added for color development, and the absorbance at 545 nm was measured. The absorbance is defined as the enzyme activity [y] of the cysteine protease, and the% of the tested substance with respect to the above [X] is shown in the column of [Sample Only] in Table 2 below.
  • sample Only is a measure of the cysteine protease inhibitory activity of the test crude drug itself, that is, the closer the value is to 100, the greater the cystine protease inhibitory activity of the test crude drug.
  • Table 2 below also shows the value [100-[Sample Only]] that is obtained by subtracting the value of [Sample Only] from 100. In this case, the closer the value is to 0, the lower the cystine protease inhibitory activity of the test crude drug.
  • the above assembly buffer 40 1 and recombinant SCCA-1 20 1 were mixed, and the candidate crude drug substance 20 1 was added thereto, followed by incubation at room temperature for 30 minutes. To this was added 1 ⁇ g / ml papain 201 and incubated at room temperature for 15 minutes. Then 2.5 mM L-BAPN A2 0 1 was added and incubated at 37 ° C for 15 minutes. Eta A 25% acetic acid solution 30 1 in diol and 0.2% ⁇ -dimethylaminocinnamaldehyde 30 1 were added for color development, and the absorbance at 545 nm was measured. The absorbance is defined as the enzyme activity [z] of cysteine protease, and the% of the tested substance with respect to the above [X] is shown in the column of [SCCA-1 +] in Table 2 below.
  • the value of [SCCA-1 +] is a measure of the sum of the cysteine protease inhibitory activity of SCCA-1 and the cysteine protease inhibitory activity of the test crude drug itself, that is, the closer the value is to 100, the more It means that inhibitory activity is low.
  • the [Difference] column in the table shows the value obtained by subtracting [100-[Sample only]] from [SCCA-1 +].
  • a method and a pharmaceutical composition for preventing or treating a disease selected from the group consisting of squamous cell carcinoma and psoriasis are provided. Further, according to the present invention, it is possible to provide a means for suppressing / treating epidermal keratinization by a completely new approach different from the prior art.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Alternative & Traditional Medicine (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)

Abstract

第一の観点において、本発明は、細胞の扁平上皮細胞癌関連抗原（ＳＣＣＡ）の発現を抑制することで、乾癬及び扁平上皮細胞癌から成る群から選ばれる疾患を治療及び／又は予防する方法を提供する。別の観点において、本発明は、表皮不全角化を抑制する物質のスクリーニング方法であって、扁平上皮細胞癌関連抗原−１（ＳＣＣＡ−１）が保有するシステインプロテアーゼ阻害活性を抑制する候補物質の活性を指標とすることを特徴とする方法も提供する。

Description

扁平上皮細胞癌関連抗原の発現の抑制による乾癬、 扁平上皮細胞癌 及び 又は不全角化の治療のための方法及び医薬組成物
技術分野
本発明は、 細胞の扁平上皮細胞癌関連抗原 （Squamous Cell Care 明
inoma Antigen. 以下 「 S C C A」 と称す）の発現を抑制することで 、 乾癬及び扁平上皮細胞癌から成田る群から選ばれる疾患を治療及び ノ又は予防する方法、 医薬組成物を提書供する。 本発明はまた、 扁平 上皮細胞癌関連抗原一 1 ( S C C A— 1 ) が保有するシスティンプ 口テアーゼ阻害活性を抑制する候補物質の活性を指標とする、 表皮 不全角化を抑制する物質のスクリーニング方法、 そのような方法に よりスクリーニングされた表皮不全角化を抑制する物質、 そしてさ らには表皮細胞中の S C C A— 1のカスパーゼ _ 14阻害活性を抑制 することで、 表皮細胞の角化の正常化を図り、 表皮不全角化を抑制 する方法を提供する。
背景技術
S C C Aは扁平上皮癌細胞から抽出される抗原であり、 子宮類部 、 肺、 食道、 皮膚の扁平上皮細胞癌で高い血中濃度を示し、 扁平上 皮細胞癌の診断によく利用されている （H. Kato et al. Cancer 40 ： 1621-1628 (1977)； Ν· Mino et al. Cancer 62: 730-734 (1988) ) 。 特に、 S C C Aの血中レベルは扁平上皮細胞癌の進行段階、 悪 性度、 腫瘍の大きさなどに良好に相関するため、 癌の早期発見のみ ならず、 癌治療効果の評価や再発のおそれの診断などにおいて特に 有効な癌マーカ一である。 S C C Aはまた、 乾癬表皮の上層において発現の亢進が認められ ることでも知られる （Takeda A. ら、 L Invest. Dermatol. (2002 ) 118 (1), 147-154) 。 乾癬は皮膚病の一つであり、 表皮細胞の増 殖 · 分化異常と炎症細胞浸潤を特徴とする慢性'、 再発性の炎症性不 全角化症である乾癬がある。 乾癬は遺伝的素因に種々の環境因子が 加わって発症すると考えられる （Hopso- Havu et al. British Jour nal of Dermatology (1983) 109, 77-85) 。
S C C Aは染色体 18 q 21.3上にタンデムに並んでいる二つの遺伝 子 S C C A— 1及び S C C A— 2遺伝子によりコードされる。 それ らによりコードされるタンパク質、 S G C A— 1及び S C C A— 2 は共に分子量約 45， 000のタンパク質であり、 非常に相同性が高いが 、 反応部位のアミノ酸配列が異なり、 異なる機能を有していると考 えられている （Schick et al. J. Biol. Chem. (1997) 27213, 184 9-55) 。 扁平包皮細胞癌や乾癬などの疾患において S C C A— 1及 び S C C A— 2が高発現することはわかっていたが、 それらが疾患 細胞においてどのような機能を果たしているかは不明であった。
一方、 ケラチノサイ トは終末分化することで、 有害な環境に対す る 「角化層」 と称される保護バリアーを形成する機能を有すること で知られる。 終末分化のプロセスは、 分化プログラムのもとで正確 に制御され、 増殖型基底細胞から始まり、 有棘細胞、 顆粒細胞、 そ して最後に角質細胞に至る。 顆粒細胞から角化細胞への過渡期には 、 ケラチノサイ トの内側及び外側に劇的な変化が生じる。 ケラチノ サイ トは、 核、 細胞小器官を失い、 一方で周囲の脂質層、 角化外皮 と称される強化された細胞膜及びケラチンパターンを獲得する。 ケ ラチンパターンは内部構造の柔軟な、 なおかつ緊張した状態を維持 する。 過去の報告によれば、 分化中のケラチノサイ トは、 D NA断 片化及び TUN E L陽性細胞の存在など、 アポトーシスの特徴を示 す （Haake A. R. , J. Invest. Dermatol. 101, 107-12 (1993) ) 。 ヒ ト角化細胞抽出物中にはカスパーゼ様活性が検出され、 そしてヒ ト ケラチノサイ ト中にはいくつかのカスパーゼが発現されている。 し かし、 他の報告によれば、 典型的なプロアポトーシスカスパーゼ、 例えばカスパーゼ— 3、 一 6及び一 7、 終末分化の際に活性化され ないとのことである。 分化の異常はしばしば、 「不全角化」 と称さ れる角化層中の核の恒久的な存在を招く。 不全角化は皮膚のバリア 一機能の深刻な破壊をもたらす。 しかしながら、 どのような因子が 脱核プロセスに関与しているか、 また、 このプロセスがケラチノサ イ ト分化中にどのようにして調節されるかは、 今日まで十分に解明 されていなかった。
カスパーゼはよく知られたアポト一シス細胞死実行因子であり、 これらは基質をァスパラギン酸残基の後方で切断する、 進化の過程 で保存されたシスティンプロテア一ゼである。 哺乳動物のカスパー ゼは、 その構造及び機能に従って 3つのサブ群、 すなわち開始カス パーゼ、 実行カスパーゼ及び炎症性カスパーゼに分けられる。 実行 カスパーゼの重要な役割は、 C AD (カスパーゼ活性化型 D Nァ一 ゼ） のインヒビ夕一 I C ADを分解することであり、 結果として、 C ADを活性ヌクレアーゼとして遊離させる点にある （Enari M. e t al. , Nature 391, 43-50 (1998) ) 。 カスパーゼ活性は様々な分 子で調節される。 とりわけ、 いくつかのカスパーゼと直接的に連携 する阻害的タンパク質群が 3つある。 バキュロウィルス抗アポ卜一 シス性夕ンパク質 p35は、 セリン及びその他のシスティンプロティ ナ一ゼ 12に作用することなく、 カスパーゼー 1 , — 3， 一 6 ,— 7， 一 8及び- 10を阻害する （Zhou Q. et al. , Biochemistry 37, 10757-6 5 (1998) )。 バキュロウィルスはまた別の抗アポトーシス性タンパク 質、 アポト一シス性タンパク質インヒビ夕一 （ I A P ) を合成する 。 I'A Pの相同体は哺乳動物においても見いだされている （Verhag en A. M. et al. , Genome Biol. 2, REVIEWS 3009 (2001) ) 。 哺乳 動物 I A Pは、 カスパーゼー 14を阻害することにより、 又はブロア ポトーシス促進因子、 例えば DIABLO/Smacと拮抗することにより、 アポトーシスをブロックする （Wu G. Nature 408, 1008-12 (2000) ) 。 サイ トカイン応答修飾因子 A(Crni A)は、 牛痘ウイルスの遺伝子生 成物であり、 アポトーシス性カスパーゼ及び炎症性カスパーゼを阻 害することができる （Garcia- Calvo M et al. J. Biol. Chem. 273 ， 32608-13 (1998) ) 。 興味深いことに、 Crm Aはセルピン超科に属 し、 セルピンの一部、 例えば P I — 9及び P A I — 1がカスパーゼ 一 1及びカスパーゼー 3のそれぞれとの相互作用によってアポトー シスを抑制できることが示唆されている （ Ann and R. R. et al. , B iochem. J. 342Pt 3, 655-65 (1999) ) 。 ケラチノサイ トの終末分化 がアポトーシス現象の一部であるかどう力、、 また、 このプロセスに おいて任意の調節タンパク質が関与するのかどうかを知ることは興 味深い。
カスパーゼ— 14はカスパーゼファミ リーの最新メンバ一であり、 専ら分化のケラチノサイ トおいて発現される。 カスパーゼー 14は力 スパーゼファミ リーメンバ一間で相同な E S Tとして同定された。 最近の研究が示したところによれば、 角化細胞中のカスパーゼー 14 はプロセッシングされてヘテロダイマ一になり、 そしてカスパ一ゼ 一 1 に対応する合成基質 Trp_Glu- His- Asp- AFCに対し酵素活性を示 す、 とのことである （Mikolajczyk J. et al. , Biochemistry 43, 10560-9 (2004)) 。 この加水分解活性はタンパク質分解切断及びコ スモトロピック塩の存在を必要とする。 カスパーゼ— 14の一次構造 は、 炎症性カスパーゼ、 例えばカスパーゼー 1、 一 4及び一 5 と極 めて近いものの、 分化されたケラチノサイ 卜に限定されるカスパー ゼー 14の発現は、 ケラチノサイ ト終末分化における別の態様での関 与を示唆する （Lippens S. et al.， Cell Death Differ. 7, 1218-2 4(2000))。 しかしながら、 カスパーゼー 14の活性化メカニズム、 天 然の基質又は調節因子はまだ解明されていない。 発明の開示
本発明者は S C C Aが関与する表皮の生理学的メカニズムの解明 を目的とする研究を行っていたところ、 S C C Aが細胞のアポト一 シスを抑制する作用を有する抗アポトーシス因子であることを驚く べきことに見出した。
簡単に説明すると、 本発明者は皮膚 UV防御メカニズムの検討を 行い、 ヒ ト皮膚への U V照射により有棘層及び顆粒層において S C C Aの発現が強力に亢進することを明らかにした。 そこで、 S C C A発現の認められない 3 T 3細胞にヒ 卜 S C C A— 1及び S C AA 一 2遺伝子を導入して安定発現系を確立し、 S C C A安定発現系細 胞の UV照射によるアポトーシスを調べたところ、 いずれの S C C A安定発現系においても UV照射によるアポトーシスが有意に減少 することが明らかになった。
さらに、 S C C Aを高発現する H a C a t細胞に p S i l e n c e rベクタ一で恒常的に s i R NAを発現させる RNA干渉法によ り S C C A— 1及び S C C A— 2のノ ックダウン （ s i S C C A) 細胞株を樹立し、 その細胞株に UV照射をした結果、 コントロール 株と比べ、 S C C Aノックダウン細胞のアポトーシス率が有意に高 いことが示された。 以上から、 本発明者は S C C Aがアポトーシス を抑制する作用を有するタンパク質であると結論づけることができ た。
癌や乾癬など、 細胞の増殖 ， 分化異常を伴う疾患においては、 癌 細胞などはアポ卜一シスの抑制により細胞死から免れ、 異常増殖し 続けるものと考えられる。 従って、 S C C Aの高発現性を示す細胞 においては、 抗アポトーシス作用を有する S C C Aがその細胞死を 抑え、 結果としてその細胞の異常増殖につながることが明らかであ る。 よって、 アポトーシス抑制作用を有する S C C Aの発現を抑え れば、 扁平上皮細胞癌や乾癬など、 細胞の増殖異常等を伴う疾患を 治療 · 予防できることが明らかである。
本発明は、 上記見地に鑑み、 S C C A高発現細胞の増殖異常を伴 う疾患、 例えば癌、 特に扁平上皮細胞癌、 さらには乾癬などの治療 • 予防のための方法、 医薬組成物の提供を課題とする。
さらに、 本発明は、 表皮の不全角化のメカニズムを解明すること で、 従来技術とは異なる全く新規なアプローチで表皮不全角化の抑 制 · 治療手段を開発することも課題とする。 不全角化を伴うア トピ 一性皮膚炎、 乾癬といつた皮膚病に対する特効薬がないことを考慮 すると、 皮膚科学、 化粧品学分野における本発明が与える影響は大 さい。
第一の観点において、 本発明は細胞の扁平上皮細胞癌関連抗原 （ S C C A ) の発現を抑制することで、 乾癬及び扁平上皮細胞癌から 成る群から選ばれる疾患を治療及び 又は予防する方法を提供する 。 好ましくは、 細胞の S C C Aの発現の抑制は、 S C C Aをコード する遺伝子の R N A干渉により実施する。 より好適な態様において 、 R N A干渉には、 配列番号 1のオリゴヌクレオチド又はその変異 体を含むセンスォリゴヌクレオチド鎖及び配列番号 3のオリゴヌク レオチド又はその変異体を含むアンチセンスオリゴヌクレオチド鎖 を含んで成る二本鎖 R N Aを利用する。 ここで、 上記配列番号 1 の オリゴヌクレオチドの変異体は S C C Aをコードする遺伝子のヌク レオチド番号 4 6〜 6 6位に対し高ス トリンジェントな条件下でハ ィブリダイズする配列を有し、 そして上記配列番号 3のオリゴヌク レオチドの変異体は S C C Aをコードする遺伝子のヌクレオチド番 号 4 6〜 6 6位の相補鎖に対し高ス トリンジェン卜な条件下でハイ プリダイズする配列を有する。
上記観点における別の態様において、 本発明は細胞の S C C Aの 発現を抑制することで、 乾癬及び扁平上皮細胞癌から成る群から選 ばれる疾患を治療及び Z又は予防するための医薬組成物を提供する 。 好ましくは、 医薬組成物は、 S C C Aをコードする遺伝子に対し て R NA干渉する短鎖 R NAを供する二本鎖 R NA含有する。 より 好適な態様において、 上記医薬組成物は、 配列番号 1のオリゴヌク レオチド又はその変異体を含むセンスオリゴヌクレオチド鎖及び配 列番号 3のオリゴヌクレオチド又はその変異体を含むアンチセンス オリゴヌクレオチド鎖を含んで成る二本鎖 R NAを含有する。 ここ で、 上記配列番号 1のオリゴヌクレオチドの変異体は S C C Aをコ 一ドする遺伝子のヌクレオチド番号 4 6〜 6 6位に対し高ス トリン ジェントな条件下でハイブリダィズする配列を有し、 そして上記配 列番号 3のオリゴヌクレオチドの変異体は S C C Aをコードする遺 伝子のヌクレオチド番号 4 6〜 6 6位の相補鎖に対し高ス トリンジ ェン卜な条件下でハイプリダイズする配列を有する。
好適な態様において、 上記二本鎖 R NAはベクター、 例えば p S i 1 e n c e rベクターの中に含有された形態にある。
本発明はさらに、 S C C Aの発現の抑制された細胞を調製するた めの方法を提供する。 好ましくは、 S C C Aの発現の抑制は、 S C C Aをコードする遺伝子の RNA干渉により行われる。 より好適な 態様において、 R NA干渉には、 配列番号 1のオリゴヌクレオチド 又はその変異体を含むセンスオリゴヌクレオチド鎖及び配列番号 3 のオリゴヌクレオチド又はその変異体を含むアンチセンスォリゴヌ クレオチド鎖を含んで成る二本鎖 R NAを利用する。 ここで、 上記 配列番号 1のオリゴヌクレオチドの変異体は S C C Aをコードする 遺伝子のヌクレオチド番号 4 6〜 6 6位に対し高ス トリンジェント な条件下でハイプリダイズする配列を有し、 そして上記配列番号 3 のオリゴヌクレオチドの変異体は S C C Aをコードする遺伝子のヌ クレオチド番号 4 6〜 6 6位の相補鎖に対し高ス トリンジエンドな 条件下でハイブリダィズする配列を有する。 本発明はさらに、 上記 方法により S C C Aの発現の抑制された細胞及びそのような細胞を 含有する哺乳動物も提供する。
よって、 本発明により、 扁平上皮細胞癌及び乾癬から成る群から 選ばれる疾患の治療 · 予防のための方法、 医薬組成物が提供される さらなる別の観点において、 本願は以下の発明の態様も包含する
[ 1 ] 表皮不全角化を抑制する物質のスクリ一二ング方法であつ て、 扁平上皮細胞癌関連抗原一 1 ( S C C A— 1 ) が保有するシス ティンプロテアーゼ阻害活性を抑制する候補物質の活性を指標とす ることを特徴とする方法。
[ 2 ] 以下のアツセィ系（1), (2), (3) ：
(1)システィンプロテア一ゼの活性を測定し、 その測定値 [ X ] を得る ；
(2) i)候補物質を前記（1)に規定のシスティンプロテア一ゼの酵素 活性的に同等量と混合し、 インキュベーションする ； そして
ii)当該（2) i)のインキュベーショ ン混合物のシスティンプロ テアーゼ活性を前記（1)と同一条件下で測定し、 その測定値 [y] を得る ； 並びに
(3) i) S C C A— 1 と、 （2) i)で使用したのと同量の前記候補物 質とを混合し、 インキュベーションする ；
ii)当該（3) i)のインキュベーショ ン混合物を前記（1)に規定 のシスティンプロテアーゼの酵素活性的に同等量と混合し、 前記（2 ) i)と同一条件下でインキュベーショ ンする ； そして
i i i)上記（3) i i)のインキュベーション混合物のシスティンプ 口テアーゼ活性を前記（1)と同一条件下で測定し、 その測定値 [ z ] を得る ；
を含んで成り、 ここで以下の条件
{ [ z ] / [ X ] X 100} 一 { 100- [ y ] / [ x ] X 100} > 0 が満たされれば、 前記候補物質は、 S C C A— 1が保有するシス ティンプロテアーゼ阻害活性を抑制する活性を有するものと決定さ れ、 表皮不全角化を抑制する物質として選定される、 [ 1 ] の方法
[ 3 ] { [ z ] / [ X ] X 100} - { 100- [ y ] / [ x ] X 100 } > 3
が満たされることを条件とする [ 2 ] の方法。
[4 ] { [ z ] / [ X ] X 100} - { 100- [ y ] / [ x ] X 100 } >16
が満たされることを条件とする [ 3 ] の方法。
[ 5 ] 前記システィンプロテア ゼがカスパ一ゼ一 14である、 [ 1 ] 〜 [4 ] のいずれかの方法。
[ 6 ] 前記システィンプロテアーゼがパパインである、 [ 1 ] 〜 [ 4 ] のいずれかの方法。
[ 7 ] ヒメガマエキス、 ブドゥエキス、 卜マ卜エキス、 キユウリ エキス、 キウイエキス及びタイソゥエキスから成る群から選択され る 1又は数種の生薬を活性成分として含有することを特徴とする、 表皮不全角化を抑制する皮膚外用組成物、 特に美容学的皮膚外用組 成物。
[ 8 ] ヒメガマエキスを含有することを特徴とする、 [ 7 ] の皮 膚外用組成物。
[ 9 ] 前記表皮不全角化が乾癬を原因とする、 [ 7 ] 又は [ 8 ] の組成物。
[ 1 0 ] 前記表皮不全角化がアトピー性皮膚炎を原因とする、 [ 7 ] 又は [ 8 ] の組成物。
[ 1 1 ] 表皮細胞中の S C C A— 1のカスパーゼ— 14阻害活性を 抑制することで、 表皮細胞の角化の正常化を図り、 表皮不全角化を 抑制する方法。
[ 1 2 ] 表皮にヒメガマエキス、 ブドゥエキス、 トマトエキス、 キユウリエキス、 キウイエキス及びタイソゥエキスから成る群から 選択される 1又は数種の生薬を活性成分として含有する皮膚外用組 成物を塗布することにより、 表皮細胞中の S C C A— 1のカスパー ゼー 14阻害活性を抑制する、 [ 1 1 ] の方法。
[ 1 3 ] 前記皮膚外用組成物がヒメガマエキスを含有することを 特徴とする、 [ 1 2 ] の方法。
よって、 本発明により、 従来技術とは異なる全く新規なアブロー チで表皮不全角化の抑制 · 治療手段の提供も可能となる。
[ 1 4 ] 表皮不全角化を抑制する皮膚外用組成物、 特に美容学的 又は化粧学的皮膚外用組成物を製造するための、 ヒメガマエキス、 ブドゥエキス、 トマトエキス、 キユウリエキス、 キウイエキス及び 夕イソゥエキスから成る群から選択される 1又は数種の生薬の活性 成分としての使用。
[ 1 5 ] 前記生薬がヒメガマエキスである、 [ 7 ] の使用。
[ 1 6 ] 前記表皮不全角化が乾癬を原因とする、 [ 1 4 ] 又は [ 1 5 ] の使用。 [ 1 7 ] 前記表皮不全角化がアトピー性皮膚炎を原因とする、 [ 1 4 ] 又は [ 1 5 ] の使用。 図面の簡単な説明
図 1は、 露光及び非露光部位の表皮における S C C Aの発現を示 す。
図 2は、 UV照射による表皮における S C C Aの発現の変動を示 す。
図 3は、 培養ヒ ト角化細胞における S S C A発現に対する UV照 射の影響を示す。
図 4は、 S C C A高発現細胞と S C C A非発現細胞との、 UV照 射により誘導されるアポ卜一シス率の比較を示す。
図 5は、 S S C Aノックダウン細胞株の樹立を示す。
図 6は、 S C C Aノックダウン細胞とコントロール細胞との、 U V照射により誘導されるアポトーシス率の比較を示す。
図 7は、 皮膚抽出物のウェスタンプロッ ト分析を示す。 H- 99抗体 及び M4D146抗体を使用することにより、 チモーゲン及び活性カス パーゼ- 14の存在を免疫プロッ ト法で分析した。 lO^ g (レーン 1 , 2及び 4 ) 及び l ^g (レーン 3 ) の全皮膚抽出物、 皮膚等価抽出 物及び角化細胞抽出物を適用した。
図 8は、 精製カスパーゼ- 14の分析を示す。 （A) SDSポリアクリ ルアミ ドゲル電気泳動後、 Superdex 75ク口マトグラフィ一から得 られた画分 No.25を 膜に移し、 そしてクーマジ一ブリ リアント ブルーで染色した。 17KDa及び UKDaの 2つのタンパク質バンドが示 された。 （B) H- 99、 M4D146及び C20抗体を使用したウエスタンブ 口ッ ト分析。 17KDaバンドカ SH99抗体及び hl4Dl i16抗体の双方に対し て陽性を示し、 また llKDaバンド力 20抗体で認識されることが示さ れた'。
図 9は、 精製カスパーゼ- 14に対する種々の合成インヒビ夕一の 効果を示す。 カスパーゼに対するペプチドインヒビター（YVAD, VDV AD, DEVD, VEID, IETD, LEHD, MLD)、 並びにシスティンプロティ ナーゼ（IAA)及びセリンプロティナーゼ（AEBSF)に対するクラス特異 的インヒビ夕一と一緒に、 カスパーゼ- 14をインキュベートした。 1 .3M クェン酸ナトリゥム及び 5mM DTTの存在において WEHD- MCAを基 質として使用して、 残留酵素活性を測定した。 試験した酵素濃度は それぞれ、 5, 2.5及び 1. とした。 値は重複アツセィの平均値 を表す。
図 1 0は、 （A) I C ADに対する精製カスパーゼ- 14の切断活 性を示す。 （B) F L 3 3 1抗体を使用したウエスタンプロッ ト分 析を示す。 33KDa及び 27KDaの切断生成物が示された。 IO M S C C A - 1 を用いた前インキュベーションによって、 I C AD切断は完 全に抑制された。 コスモトロフィ ック塩の存在においてのみ、 I C A D分解が観察された。 ァミノ末端に特異的な抗体を使用したゥェ スタンブロッ ト分析は、 カスパーゼ— 14との延長されたインキュべ ーシヨン中にインタク トな ICAD分子の消失を示した。 混合物に S C C A— 1 を添加すると、 I C AD分解はもはや検出されず、 16時間 のインキュベーショ ン後、 影響を受けないままであった （B) 。 （ C) 合成カスパーゼ基質に対する加水分解活性を、 コスモトロピッ ク塩の存在において調査した結果を示す。
図 1 1は、 活性カスパーゼ- 14及び TUN E Lポジティブ細胞の 局在を示す。 正常なヒ トの皮膚の薄い切片を H— 99抗体（A)、 hHD1 46抗体（B)及び T UN E L (C)で染色した。 Texas- Redを蛍光検出（ B)のために使用した。 TUN E Lには F I T Cを用い、 そして免 疫染色には Texas Redを用いて、 T U N E L及びカスパーゼのため の二重染色を実施した。
図 1 2は、 I C AD及ぴ不全角化核の共局在を示す。 正常なヒ ト の皮膚の薄い切片を抗 I C AD抗体 F L 3 3 1で染色した。 下表皮 のほとんどの核はこの抗体に対して陽性を示した。 A D患者皮膚に 由来する角化細胞の表在層上の I C ADを抗体で染色したときには 、 種々のサイズの陽性部位が示された（B)。 核クラスターを示すョ ゥ化プロビジゥム （PI)による核染色がしばしば認められた（C)。 同 じ部位の明視野は、 表面上のオーバーラップされたスケールを示し た（D)。 重畳画像は、 不全角化部位においてのみ ICADが存在するこ とを明らかにした（E)。 明視野における核染色の重畳画像も示され ている （F)。
図 1 3は、 S C C A— 1及び不全角化核の共局在を示す。 S C C A— 1は、 正常な皮膚切片内ではほとんど検出することができなか つた。 AD患者皮膚の表在層において、 S C C A— 1 陽性部位は示さ れた （H )。 これらの部位上でのみ、 核クラスターが認められた（ I ) 。 明視野を（J )に示す。 重畳画像は、 S C C A— 1 陽性部位が、 好 ましくは未消化核が存在する部位と重なることを示す（K)。 S C C A - 1染色及び明視野に対応する別の重畳画像も示す（L)。
発明を実施するための最良の形態
乾癬及び 又は扁平上皮細胞癌の治療のための方法及び医薬組成物 本発明者は、 S C C Aがアポトーシスを抑制する作用を有する夕 ンパク質であることを解明した。 従って、 S C C Aの発現を抑制す ることで、 癌や乾癬など、 扁平上皮細胞癌抗原を発現する細胞の増 殖 · 分化異常を伴う疾患を治療 ' 予防することができることが明ら かである。 扁平上皮細胞癌としては、 例えば子宮頸、 肺、 食道、 上 顎、 '皮膚などの器官における扁平上皮細胞癌が挙げられる。
S C C Aは上述のとおり扁平上皮癌細胞や乾癬表皮に存在する分 子量約 45， 000のタンパク質である。 S C CA— 1及び S C C A— 2 のアミノ酸配列並びにそれらをコードする核酸配列は Takeda A e t al. J. Invest. Dermatol. 118, 147-154 (2002) (前掲） に記載さ れている。
細胞の S C C Aの発現の抑制は、 様々な遺伝学的技術、 例えば R NA干渉法、 アンチセンス R NA ' D NA法、 ペプチド及び R N A • D NAアブ夕マー、 部位特異的欠失、 相同組換え、 ドミナントネ ガティブ対立遺伝子、 イントラボディーなど、 様々な技術により達 成できるが、 R NA干渉法によるのが特に好ましい。
R NA干渉法は、 標的遺伝子の一部をコ一ドする mR NAの一部 に対し相補性な 2 1〜 2 3塩基対程度のセンスオリゴヌクレオチド を含む鎖と上記 mR N Aの一部に対し相同な 2 1〜 2 3塩基対程度 のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む鎖とから構成される二本 鎖 R NAを細胞へ導入することで標的遺伝子の発現を抑制する方法 である。 この方法は、 遺伝子のコード領域に由来する二本鎖 R NA の干渉特性に基づく もので、 線虫の遺伝学的研究において優れた有 用性を持つことが証明されており （Fire等， Nature (1998) 391:80 6-811) 、 ショウジヨウバエや哺乳動物においても機能欠損表現型 を産出するために利用することができる。
本方法では、 S C C A遺伝子の適当な標的領域、 好ましくはヌク レオチド長さが約 1 8〜 2 3個の領域に相補的な配列 （センスオリ. ゴヌクレオチド） と該センス配列に相補性のヌクレオチド長さ約 1 8〜 2 3個の配列 （アンチセンスオリゴヌクレオチド） とから構成 される二本鎖 R NA ( d s R NA) をインビトロ合成する。 好まし くは、 二本鎖 RNAは S C C A遺伝子のヌクレオチド番号 4 6〜 6 6位の配列に相補性の配列 （ACATGAACTT GGTGTTGGCT T： 配列番号 1 ) を含むセンスオリゴヌクレオチドと、 上記ヌクレオチド番号 4 6〜 6 6位の配列と相同の配列 （AAGCCAACAC CAAGTTCATG T； 配列 番号 3 ) を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドとから構成される 。 センス及びアンチセンスオリゴヌクレオチド全体の長さは特に限 定されるものではないが、 例えば 2 5ヌクレオチド以上 1 0 0ヌク レオチド以下、 好ましくは 4 0ヌクレオチド以上 8 0ヌクレオチド 以下、 より好ましくは 5 0ヌクレオチド以上 7 0ヌクレオチド以下 程度である。 '
センスオリゴヌクレオチドは、 配列番号 1 のオリゴヌクレオチド の変異体を含むオリゴヌクレオチドであってもよい。 この変異体は S C C Aをコードする遺伝子のヌクレオチド番号 4 6〜 6 6位に対 し高ス トリンジェン卜な条件下でハイブリダィズする配列を有する ものが好ましい。 また、 アンチセンスオリゴヌクレオチドは、 配列 番号 3のオリゴヌクレオチドの変異体を含むオリゴヌクレオチドで あってもよい。 この変異体は S C C Aをコードする遺伝子のヌクレ ォチド番号 4 6〜 6 6位の相補鎖に対し高ス トリ ンジェントな条件 下でハイプリダイズする配列を有するものが好ましい。 ここで高ス トリンジェントなハイプリダイゼーショ ン条件とは、 例えばナトリ ゥム濃度が約 1 0〜 4 0 mM、 好ましくは約 2 0 mM、 温度が約 5 0〜 7 0 °C、 好ましくは約 6 0〜 6 5でであることを含む条件をい 。
得られた二本鎖 R NAは、 標的細胞の直接導入するか、 又は d s
RNAをプロモーター、 ターミネータ一などの転写に必要な要素を もつベクターに予め連結してから標的細胞に導入してよい。 ベクタ
—としては、 当業者周知の様々なものを使用することができるが、 p S i l e n c e rベクタ一 （Ambion) が好ましい。 上記二本鎖 R NAを含有するベクターを細胞に導入することで、 細胞内での転写 により、 配列番号 1 (又はその変異体） のセンス鎖と配列番号 3 ( 又はその変異体） のアンチセンス鎖及びそのセンス鎖とアンチセン ス鎖とをつなぐショートヘアピン R N.A ( s h R N A ) が生成され る。 s h R N Aは次に細胞内のヌクレア一ゼ、 ダイサ一により 2 1 〜 2 3塩基対程度の短鎖 R N A (short interfering RNA) へと切断 され、 複合体 R I S Cを形成して S C CAの mRNAを切断する R N A干渉を起こし、 結果として導入細胞による S C C Aの発現が抑 制される。
好適には、 本発明において、 S C C Aの発現を抑制する遺伝子、 例えば上記二本鎖 R N Aやその他の S C C Aの発現を抑制する遺伝 子、 例えばアンチセンス DNA又は RNA、 アブ夕マー RNA又は DNAなど （以下、 単に 「 S C C A発現抑制遺伝子」 と称す） を、 S C C Aの発現を抑制し、 その結果乾癬や扁平上皮細胞癌の予防 · 治療のための医薬組成物の活性成分として使用される。 上記 S C C A発現抑制遺伝子は注射により直接投与するか、 該遺伝子が組込ま れたべクタ一又はプラスミ ドを投与する方法により、 患部に投与し てよい。
上記ベクターとしては、 アデノウイルスベクター、 アデノ関連ゥ ィルスべクタ一、 ヘルぺスウィルスベクタ一、 ワクシニアウィルス ベクター、 レトロウイルスベクター等が挙げられ、 これらのウィル スベクターを用いることにより効率よく S C CA発現抑制遺伝子を 投与することができる。 また、 S C C A発現抑制遺伝子をリポソ一 ムなどのリン脂質小胞に導入し、 そのリボソームを投与する方法を 採用することもできる。 リボソームは、 生分解性材料を含む閉鎖小 胞であるため、 リボソームと遺伝子とを混合することにより、 リポ ゾーム内部の水層や脂質二分子層に遺伝子を保持させる （リポソ一 ム-遺伝子複合体） 。 次に、 該複合体を細胞とともに培養すると複 合体中の遺伝子が細胞内に取り込まれる （リポフエクシヨン法） 。 そして、 得られる細胞を以下の投与方法で投与してよい。
上記医薬組成物の投与形態としては、 通常の静脈内、 動脈内等の 全身投与のほか、 腫瘍や乾癬が存在する各組織に局所投与を行う こ とができる。 さらに、 カテーテル技術、 外科的手術等と組み合わせ た投与形態を採用することもできる。 本発明の医薬組成物の投与量 は、 年齢、 性別、 症状、 投与経路、 投与回数、 剤型によって異なり 、 医師などにより適宜決定されるであろう。
プラスミ ド D NAを直接静脈内に投与すると、 D NAが血中の D N a s eなどによって即座に分解されてしまうため、 遺伝子を発現 させることは困難である。 そこで、 プラスミ ド D NAを用いる場合 は、 プラスミ ドの直接注射法を採用することが好ましい。 この方法 は、 ウィルス性ベクターを用いた方法に比ベ、 ベクターの精製が簡 単であるため、 短時間で大量に調製することができ、 導入遺伝子の 大きさおよび注入時の濃度に制限がないなど、 さまざまなメリ ッ ト を有する （Verma I M et al. , Nature 389: 239-242, 1997) 。
D NA直接注射方法は、 精製したプラスミ ド D NAを生理食塩水 などに溶解し、 それを直接筋肉内に注射するだけでよい。 その結果 、 注射部位周辺の細胞にプラスミ ド D NAが取り込まれ、 プラスミ ド上の真核生物の発現ュニッ トに組み込まれた遺伝子の発現が起こ り、 その遺伝子産物が作られる。 D NA直接注射法は、 現在筋肉内 注射が主流となっているが、 腫瘍内 （Yang J P et al. , Gene. The r. 3: 542-548, 1996 ) 、 皮内 （Hengge U R et al. , J. Clin. In vest. 97: 2911-2916, 1996; C oate K A et al. , Hum. Gene. The r. 8: 1659-1665, 1997) などへのプラスミ ド D N A直接注射をする ことが可能である。 筋肉内注射するプラスミ ド D N Aは、 例えば 1 g〜 lmg、 好まし くは 25^ g〜100; gの D NAを 1の生理食塩水に溶解し、 注射す る。 これにより、 4〜7日後に発現の最高値を得ることができる。
S C C Aの発現の抑制の確認は、 例えば細胞中の S C C Aの量を 直接測定することにより行うことができる。 好ましくは、 細胞から RNAを抽出し、 S C C Aをコードする mR NAの量を測定するこ とにより決定する。 mR NAの抽出、 その量の測定も当業界におい て周知であり、 例えば R N Aの定量は定量ポリメラーゼ連鎖反応法 (P C R) により行われる。 他に、 S C C Aの測定は S C C Aに特 異的な抗体を利用し、 当業界において周知の方法、 例えば蛍光物質 、 色素、 酵素などを利用する免疫染色法、 ウェスタンプロッ ト法、 免疫測定方法、 例えば E L I S A法、 R I A法など、 様々な方法に より実施できる。 以上の他、 S C C Aの既知の生物活性を測定する ことにより S C C Aの発現量を測定することもできる。 他に、 S C C Aの発現は in situハイプリダイゼ一ショ ン法やその生物活性の 測定を通じて決定することができる。
本発明により S C C Aの発現の抑制される細胞は好ましくは表皮 細胞、 例えば顆粒細胞、 有棘細胞などであってよい。 また、 そのよ うな細胞を有する哺乳動物としては、 ヒ ト以外に、 マウス、 ラッ 卜 、 ハムスター、 モルモッ ト、 ゥサギ、 ィヌ、 ネコ、 ゥマ、 ゥシ、 ヒ ッジ、 ブ夕、 ャギ、 サルなどの非ヒ ト哺乳動物であってよい。 本発 明に係る動物及び細胞は、 例えば表皮の UV防御機構の解明や、 U Vによる皮膚傷害を予防又は抑制する薬剤の研究 · 開発ゃスクリー ニングに利用されるモデル動物や細胞としても使用することができ る。
不全角化を抑制する物質のスクリーニング方法、 同方法によりスク リーニングされた物質及び不全角化を抑制する方法 乾癬は皮膚病の一つであり、 表皮細胞の増殖 · 分化異常と炎症細 胞浸潤を特徴とする慢性、 再発性の炎症性不全角化症である。 乾癬 は遺伝的素因に種々の環境因子が加わって発症すると考えられる （
Hopso-Havu e t al. British Journal of Dermatology (1983) 109,
77- 85) 。 S C C Aは染色体 18Q 21.3上にタンデムに並んでいる二 つの遺伝子 S C C A ― 1及び S C C A— 2遺伝子によりコードされ
•α。 それらによりコ ―ドされるタンパク質 、 S C C A - 1及び S C
C A一 2は共に分子 約 45, 000の夕ンパク質であり、 非常に相同性 が髙いが、 反応部位のアミノ酸配列が異なり、 異なる機能を有して いると考えられている (Schick et al. J. Biol. Chem. (1997) 27
213, 1849- 55) 。
本発明に係る表皮不全角化を抑制する物質のスクリ一二ング方法 は、 S C C A— 1が保有するシスティンプロテア一ゼ阻害活性を抑 制する候補物質の活性を指標とする。 システィンプロテア一ゼとし ては、 理想的にはカスパーゼー 14を使用するのが最も好ましいが、 その他のカスパーゼファミリー、 あるいは入手容易性を考慮すると 、 周知のあらゆるその他のシスティンプロテア一ゼ、 例えばパパイ ン、 カテブシン、 例えばカテブシン B、 カテブシン L、 ブロメライ ン、 フイ シン、 などで代用することができる。
好適な態様において、 上記スクリーニング方法は、 システィンプ 口テアーゼの活性をアツセィする系（1)、 候補物質のみの存在下で システィンプロテアーゼの活性をアツセィする系（2)、 及び候補物 質及び S C C A— 1 を予めインキュベーショ ンしておき、 当該イン キュベーシヨン混合物の存在下でシスティンプロテアーゼの活性を アツセィする系（3)、 から構成される。 アツセィ系（2)を含ませるこ とで、 候補物質自体が及ぼし得るシスティンプロテアーゼに対する 影響を知ることができる。 なお、 アツセィ系（1) 、 （2)、 （3)を実施 する順序は特に制限されることはなく、 アツセィ条件が同じである なら、 アツセィは同日でも異なる曰で行ってもよい。
システィンプロテアーゼの酵素活性の測定は、 システィンプロテ ァーゼの基質として慣用のもの、 例えば N α—ベンゾィル— L—ァ ルギニン 4一二トロアニリ ド塩酸塩 （L一 Β Α Ρ ΝΑ) を用い、 当 業者周知の方法により実施することができる。
特に好適な態様において、 当該スクリーニング方法は以下のとお りに実施できる。
( 1 ) システィンプロテア一ゼの活性をアツセィする系
適当なアツセィ用緩衝液、 例えば H E P E Sバッファ一中でシス ティンプロテアーゼを所定時間インキュベーションする。 次いで、 システィンプロテア一ゼの基質、 例えば L— B A P NAを添加し、 所定温度にて所定時間インキュベーション後、 発色させ、 システィ ンプロテアーゼの酵素活性 [ X ] を測定する。
( 2 ) 候補物質のみの存在下でシスティンプロテアーゼの活性をァ ッセィする系
上記アツセィ用緩衝液と候補物質を所定時間ィンキュベーシヨ ン 後、 システィンプロテア一ゼを添加し、 （ 1 ) と同条件下でシステ インプロテアーゼの活性 [ y ] を測定する。 このシスティンプロテ ァーゼ酵素活性 [ y ] の、 上記 [ X ] に対する％ { [ y ] / [ x ] X 100} を求める。
{ [ y ] / [ X ] X100} の値は、 上記のとおり試験物質が有す るシスティンプロテアーゼ阻害活性の目安となり、 即ちその値が 10 0に近いほど、 試験物質が有するシスティンプロテアーゼ阻害活性 が低いことを意味する。 また、 100から上記 { [y ] / [x ] X 100 } の値を差し引いた値 { 100— [ y ] / [ x ] X100} も求める。 こ の場合、 その値が 0に近いほど、 試験物質が有するシスティンプロ テアーゼ阻害活性が低いことを意味する。
( 3 ) S C C A— 1、 候補物質及びシスティンプロテア一ゼを含有 する系の酵素活性の測定
上記アツセィ用緩衝液と S C C A— .1 を混合し、 それに候補物質 加え、 所定時間インキュベーションする。 （ 1 ) 又は （ 2 ) と同条 件でシスティンプロテアーゼの活性 [ z ] を測定する。 このシステ インプロテアーゼ酵素活性 [ z ] の、 上記 [ X ] に対する％ { [ z ] / [ X ] X 100} を求める。
{ [ z ] / [ X ] X 100} の値は、 S C C A— 1が有するシステ ィンプロテアーゼ阻害活性と試験物質自体が有するシスティンプロ テアーゼ阻害活性の総計の目安となり、 即ちその値が 100に近いほ ど、 その総阻害活性が低いことを意味する。
最後に、 { [ z ] / [x] X100} から { 100— [y ] / [x] X 100} を差し引いた値を求める。 この差が大きいほど、 S C C A— 1、 候補物質及びシスティンプロテアーゼを含有する系における S C C A - 1が有するシスティンプロテアーゼ阻害活性が低いことの 目安となり、 即ち、 候補物質による S C C A— 1 のシスティンプロ テアーゼ阻害活性の抑制が顕著であることを示唆する。
上記方法によりスクリーニングされた物質は S C C A_ 1が保有 するシスティンプロテアーゼ阻害活性抑制効果を有するものと推定 され、 延いては不全角化抑制機能を有し、 不全角化抑制剤として有 用である可能性が高い。
このような物質の不全角化抑制機能の確認は、 不全角化を起こし た皮膚、 例えばモデル動物の皮膚に適用し、 治癒効果をみることで 簡単に行うことができる。 従って、 本発明に係るスクリーニング方 法は、 無数に存在する候補物質、 例えば生薬の中から表皮不全角化 を抑制する物質を一次スクリーニングするための方法として極めて 有用である。 不全角化の認められる症状には、 例えば乾癬、 アトピ 一性皮膚炎、 汗腔角化症、 日光角化症、 脂漏性角化症、 扁平鱗癬、 などの皮膚疾患があり、 よって本発明に係るスクリーニング方法に より選択された物質は、 これらの皮膚疾患の治療 ' 予防に有用であ り得る。
本発明者は、 上記スクリーニング方法により、 各種生薬の S C C A— 1が保有するシスティンプロテアーゼ阻害活性抑制効果を検討 したところ、 ヒメガマエキス、 ブドゥエキス、 卜マ卜エキス、 キュ ゥリエキス、 キウイエキス及び夕イソウエキスがそのような抑制効 果を有すること見出した。 従って、 別の観点において、 本発明はヒ メガマエキス、 ブドゥエキス、 トマ卜エキス、 キユウリエキス、 キ ウイエキス及び夕イソゥエキスから成る群から選択される 1又は数 種の生薬を活性成分として含有することを特徴とする、 表皮不全角 化を抑制する皮膚外用組成物を提供する。
これらの植物からのエキスは、 植物原材料を必要に応じて乾燥さ せ、 さらに必要に応じて細断又は粉砕した後、 水性抽出剤又は有機 溶剤により抽出することにより得られる。 水性抽出剤としては、 例 えば、 冷水、 温水、 又は沸点もしくはそれより低温の熱水を用いる ことができ、 また有機溶剤としては、 メタノール、 エタノール、 1 ， 3—ブタンジオール、 エーテル等を、 常温で又は加熱して用いる ことができる。
本発明に係る外用組成物における上記エキスは、 1種又は 2種以 上が任意に選択され用いることができる。 上記エキスの含有量は、 前記外用組成物全量中 0. 00 1〜20. 0質量％が好ましく、 さらに好ま しくは 0. 0 1〜1 0. 0質量％である。 特に、 0. 1〜5. 0質量％が好ましい 。 含有量が 0. 00 1質量％未満であると、 本発明の効果が充分に発揮 されない場合があり、 一方 20. 0質量％を越えると製剤化が難しいの であまり好ましくない場合がある。
本発明の外用組成物は、 常法に従って製造すればよく、 また上記 エキス単独でも調製可能であるが、 上記エキス以外に、 通常化粧品 や医薬品等の皮膚外用剤に用いられる成分、 例えば、 油分、 界面活 性剤、 粉末、 色材、 水、 保湿剤、 増粘剤、 アルコール類、 各種皮膚 栄養剤、 酸化防止剤、 紫外線吸収剤、 香料、 防腐剤等を必要に応じ て適宜配合することができる。
その他、 ェデト酸ニナトリウム、 ェデト酸三ナトリウム、 クェン 酸ナトリウム、 ポリ リン酸ナトリウム、 メタリン酸ナトリウム、 グ ルコン酸等の金属封鎖剤、 カフェイン、 タンニン、 ベラパミル、 お よびその誘導体、 甘草抽出物、 グラブリジン、 火棘の果実の熱水抽 出物、 各種生薬、 酢酸トコフエロール、 グリチルリチン酸およびそ の誘導体またはその塩等の薬剤、 ビタミン C、 ァスコルピン酸リン 酸マグネシウム、 ァスコルビン酸ダルコシド、 アルブチン、 コウジ 酸等の美白剤、 グルコース、 フルク トース、 マンノース、 ショ糖、 トレハロース等の糖類、 レチノール、 レチノイン酸、 酢酸レチノー ル、 パルミチン酸レチノールなどのビタミン A類なども適宜配合す ることができる。
本発明の外用組成物は、 外皮に適用される化粧料、 医薬部外品等 、 特に好適には化粧料として活用することが可能であり、 その剤型 も水溶液系、 可溶化系、 乳化系、 粉末系、 油液系、 ゲル系、 軟膏系 、 エアゾール系、 水一油 2層系、 水一油一粉末 3層系等、 幅広い剤 型を採り得る。 すなわち、 基礎化粧品であれば、 洗顔料， 化粧水， 乳液， クリーム， ジエル， エッセンス （美容液） ， パック， マスク 等の形態に、 上記の多様な剤型において広く適用可能である。 また 、 メーキャップ化粧品であれば、 ファンデーショ ン等、 トイレタリ 一製品としてはボディソープ， 石けん等の形態に広く適用可能であ る。 さらに、 医薬部外品であれば、 各種の軟膏剤等の形態に広く適 用が可能である。 そして、 これらの剤型及び形態に、 本発明の外用 組成物の採り得る形態が限定されるものではない。
本発明はまた、 表皮細胞中の S C C A— 1のカスパーゼー 14阻害 活性を抑制することで、 表皮細胞の角化の正常化を図り、 表皮不全 角化を抑制する方法を提供する。 不全角化の認められる症状には、 上述のとおり、 例えば乾癬、 アトピー性皮膚炎、 汗腔角化症、 日光 角化症、 脂漏性角化症、 扁平鱗癬、 などの皮膚疾患が挙げられる。 好ましくは、 本発明に係る皮膚外用組成物を肌に適用することで実 施されるが、 その用法、 用量は特に限定されるものではく、 皮膚外 用組成物の剤型や処置する肌の角化不全状態により適宜決定される 以下、 具体例を挙げて、 本発明を更に具体的に説明する。 なお、 本発明はこれにより限定されるものではない。 実施例
( 1 ) 乾癬及び Z又は扁平上皮細胞癌の治療のための方法及び医薬 組成物
(l-i)免疫組織化学的検査
表皮生検を AM e X手順 （Sato Y. et al. Am. J. Pathol. , 125 , 431-435 (1986)) に従い、 冷却アセトンで固定してからパラフィ ンの中に包埋した。 切片をキシレンで脱パラフィ ン処理し、 ァセト ン、 次いで P B Sで洗浄した。 次にその切片の非特異的結合部位を 1 0 %正常ゥサギ血清（Histof ine, Tokyo, Japan)でブロックした 表皮切片を抗— S C C A— 1モノクローナル抗体 （Santa Cruz B iotec nology, CA, USA) ( 1 : 500に希釈） 、 抗一 S C C A— 2モ ノクロ一ナル抗体 （Santa Cruz Biotechnology, CA， USA) (1 : 50 0に希釈） 又は抗ー S C C Aポリクローナル抗体 （Takeda A. et al . J. Invest. Dermatol. 118, 147-154 (2002)に記載のとおりにし て精製） のそれぞれとインキュベーショ ンした。 P B Sで洗浄後、 切片をへマトキシリンでカウンター染色し、 DAKO E n V i s i o n S y s t e m (DAKO Corp. , CA， USA)で観察を行った。
図 1 は、 表皮検体として、 非露光部位である上腕部 （ヒ ト 24歳） 、 臀部 （ヒ ト 46歳） 、 太腿部 （ヒ ト 75歳） 由来の表皮、 及び露光部 位である頰部 （ヒ ト 20歳、 76歳） 、 目瞼 （ヒ ト 82歳） 由来の表皮を 採取し、 抗体として S C C A— 1及び S C C A— 2の両者に結合す る抗ー S C C Aポリクローナル抗体を用い、 顕微鏡観察した結果で ある。 図 1から、 非露光部位と比べ、 露光.部位の表皮上層で S C C Aが顕著に亢進していることがわかる。 しかしながら、 露光部位で も、 基底層では S C C Aの発現の亢進は認められなかつた。
図 2は、 表皮検体として、 UV照射 （トランスルミネー夕一T〇 R E X F L 2 0 5 - E - 3 0 /DMR (Toshiba Medical Supply )を施したヒ ト表皮及び照射を施していないコントロール表皮にお ける S C C A— 1及ぴ S C CA— 2のそれぞれの発現の顕微鏡観察 結果である。 抗体として、 抗ー S C C A— 1モノクローナル抗体及 び抗ー S C C A— 2モノクローナル抗体それぞれを使用した。 図 2 から、 S C C A— 1及び S C C A— 2共に、 ヒ ト表皮に UVを照射 することで発現が亢進されることが明らかとなった。 また、 発現の 亢進は皮膚有棘層及び顆粒層において顕著であった。
以上により、 表皮に UVが照射されると、 表皮、 特にその有棘層 及び顆粒層において S C C A— 1及び S C C A— 2の発現が亢進さ れることが明らかとなった。
(1 - ii)定量 P C R実験 次に、 表皮における S C CA— 1及び S C CA— 2の発現が UV 照射により亢進されることを遺伝子レベルで確認する実験を行った ヒ ト角化細胞をケラチノサイ ト— S.FM培地 （GIBCO, Invitroge n)中、 L一グルタミン及び上皮細胞成長因子の存在下で高湿、 C O 25 %の雰囲気において、 3 7 °Cにて培養した。 集密度 6 0〜 7 0 %の細胞に U V Bを 0〜 4 8時間にわたり、 照射した。 UVB照射 はトランスルミネーター TOR EX F L 2 0 5 - E - 3 0 /DM R (Toshiba Medical Supply)を用い、 5 0 m J Z c m2の強度で行 つた。 コントロール細胞には U V B照射を施さなかった。
上記培養細胞から総 R N Aを、 I s o g e n (Nippon Gene)を用 い、 添付の説明書に従い、 単離精製した。 S C CA— 1及び S C C A - 2それぞれの発現レベルを定量リアルタイム · ポリメラ一ゼ連 鎖反応法 （P CR) により決定した。 簡単には、 総 RNAを Supers cript II (Invitrogen, Carlsbad, CA) を用い、 c DNAへと変換 させた。 その試料を AB I P R I SM 7 9 0 0 H T S e q u e n c e D e t e c t i o n S y s t em (Applied B iosys tem s, Foster City, CA)を用い、 2—ステップ P C Rを 4 0サイクル 行い、 増幅させた。 内部標準として GAPDH (ダリセルアルデヒ ド一 3 _ホスフェートデヒ ドロゲナ一ゼ） を用いた。
使用したプライマーは下記のとおりである。
S C C A— 1 ：
順方向プライマー
5' -GTGCTATCTGGAGTCCT-3' (配列番号 3 )
逆方向プライマー
5' -CTGTTGTTGCCAGCAA-3' (配列番号 4 )
TaQ Man プローブ 5' -CATCACCTACTTCAACT-3' (配列番号 5 )
S C C A - 2 ：
順方向プライマー
5' -CTCTGCTTCCTCTAGGAACACAG-3' (配列番号 6 )
逆方向プライマ一
5' -TGTTGGCGATCTTCAGCTCA-3' (配列番号 7 )
Taa Man プローブ
5' -AGTTCCAGATCACATCGAGTT-3' (配列番号 8 )
G A P D H ：
順方向プライマー
5' -GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3' (配列番号 9 )
逆方向プライマー
5' -GAAGATGGTGATGGGATTTC-3' (配列番号 1 0 )
Tad Man プローブ
5' -AGGCTGAGAACGGGAAGCTTGT-3' (配列番号 1 1 )
リポーター色素 （ 6—力ルポキシ—フルォレセイン） を T a q M a nプローブ配列の 5 ' 末端に結合させ、 そしてクェンチヤ一色 素 （ 6 _カルボキシーテトラメチル—ローダミン） をその 3 ' 末端 に組み込ませた。
図 3に培養ヒ ト角化細胞における S C C Aの発現についての U V B照射の影響の結果を示す。 S C C A— 1、 S C C A— 2、 共に U V照射により発現が亢進されることが明らかとなった。 従って、 表 皮細胞は UV照射により、 遺伝子レベルで S C C A— 1、 S C C A 一 2の発現が亢進されることが明らかとなった。
U V照射における S C C Aの役割の検討
以上により、 表皮細胞では、 UV照射を受けることで S C C A— 1及び S C C A— 2の発現が亢進することが解明された。 次に、 S C C A - 1及び S C C A ^ 2が U V照射を受けた表皮細胞において どのような役割を担っているかを検討した。
(1-iii) S C C A - 1及び 2高発現細胞の樹立
3 T 3細胞 （A T C Cより入手） は S C C A— 1及び 2を発現し ないマウス胎児由来の細胞である。 この細胞に、 下記のとおりにし て S C C A— 1又は 2をコードする遺伝子を導入した。
S C C A— 1及び S C C A— 2の c D NA (Takeda A et al. J. Invest. Dermatol. 118, 147-154 (2002) ) を Bam HI及び Kpn Iで 二重消化した。 それらを p T a r g e t ベクターの中にサブクロ 一二ングし、 次いで L i ρ o f e c t a m i n e P l u s (GIBC 0, Invitrogen Corp. ) を用い、 3 T 3細胞に導入した。 簡単に述 ベると、 無血清 DME M培地 （Invitrogen Corp. ) 6 7 5 / 1 中の c D NA 2 0 gを 7 5 1 の P l u s試薬と混合し、 2 5 に て 1 5分放置した。 L i p o f e c t a m i n e ( 1 0 0 ^ 1 ) を 6 5 0 1 の無血清 DME M培地に添加し、 次いでそれを上記 c D N A - P 1 u s混合物に加え、 そして 2 5 °Cにて 1 5分放置した。 この c D NA混合物を 1 0 m l の無血清 D M E M培地に添加し、 そ して 3 T 3細胞をその中で 3 7 °Cにて 4時間、 5 %の C 02雰囲気 下でインキュベーションした。 その培地を 1 0 %の F C S (Invitr ogen Corp. ) 含有の D M E M培地と交換し、 そして一晩インキュべ —シヨンした。 翌日、 G 4 1 8 (Calbiochem) を最終濃度 5 0 0 g /m 1 となるように添加した。 G 4 1 8は培養期間中この濃度に 保っておいた。 培地は 2〜 3 日ごとに交換した。 培養 4週間後、 い くつかの G 4 1 8耐性コロニーを単することができ、 S C C A— 1 及び S C C A— 2発現細胞系が樹立された。
S C C A— 1 をコードする c D N Aが導入された細胞 （ S C C A 一 1導入細胞） は S C C A— 1 を特異的且つ安定的に発現し、 そし て S C CA— 2をコードする c D N Aが導入された細胞 （ S C C A 一 2導入細胞） は S C CA— 2を特異的且つ安定的に発現すること が確認された。 また、 同様の操作で非特異的な配列の導入された 3 T 3細胞 （コントロール細胞） は S C CA— 1、 S C CA— 2のい ずれも発現しなかった。
上記 S C CA— 1導入細胞、 S C CA— 2導入細胞及びコント口 ール細胞を用い、 表皮細胞に U V照射を与えたときの S C C A— 1 、 S C C A— 2が果たす役割について検討した。 詳しくは、 表皮細 胞における UV誘導アポ卜一シスに対する S C CA— 1、 S C CA ― 2の役割について検討した。
上記各種細胞を 1 0 % F C Sを含む DMEM培地中で高湿、 C O 25 %の雰囲気において、 3 7 °Cにて培養した。 集密度 6 0〜 7 0 %の細胞に U V Bを 0〜 4 8時間にわたり、 照射した。 U V B照射 はトランスルミネーター TOR EX F L 2 0 5— E— 3 0/DM R (Toshiba Medical Supply)を用レ 5 0 m J Z c m2の強度で行 つた。
これらの細胞についてのアポトーシス評価は FAC S C OUL TE R (EPIX XL-MCL, Becjman Coulter) を用い、 ァネキシン V— F I T C及びプロピジゥムィオダイン （P I ) 二重染色法（Annexiii V-FITC kit, Immunotech) を指標とする FAC S (蛍光活性化セ ルソー夕） 解析により行った。
その結果を図 4に示す。 図 4から明らかなとおり、 S C CA— 1 及び S C CA— 2導入細胞のいずれも UV照射によるアポトーシス が有意に減少することが認められた。 従って、 S C C A— 1及び S C CA— 2共に、 UVによる誘導されるアポトーシスを抑制できる ものと推定された。
このことを確認するため、 本発明者は次に S C CA— 1及び S C C A— 2ノ ックダウン細胞株を RNA干渉法により樹立し、 UV照 射における表皮細胞内での S C C A— 1及び S C C A— 2の役割に ついてさらに検討した。
(1- iv) S C C Aノックダウン細胞の樹立
H a C a t細胞 (H. Hans, et al. Experimental Cell Research 239, 399-410 (1998) ) は S C C Aを高発現するヒ ト角化細胞であ る。 この細胞に、 R N A干渉法に従い、 p S i 1 e n— c e rベクタ 一 (Ambion) で恒常的に s i RNA (short interference RNA) を 発現させることにより、 S C CA— 1及び 2のノックダウン細胞株 を樹立した。
s i RNAは p S i l e n c e rベクタ一を用い、 添付の説明書 に従い、 構築した。 詳しくは、 S C C Aをコードする遺伝子のヌク レオチド番号 46〜 6 6位に相補性な 2 1 m e rのオリゴヌクレオ チド （ACATGAACTT GGTGTTGGCT T： 配列番号 1 ) を含む 6 5 m e r のセンスオリゴヌクレオチド （配列番号 1 2) と、 ヌクレオチド番 号 4 6〜 6 6位に相同な 2 1 m e rのオリゴヌクレオチド （ AAGCCA ACAC CAAGTTCATG T； 配列番号 3 ) を含む 6 5 m e rのアンチセン スオリゴヌクレオチド （配列番号 1 3) とから成る二本鎖オリゴヌ クレオチドを p S i 1 e n c e rベクタ一の H i n d I I I部位 及び B a m H I部位にクローニングした。 H a C a t細胞へのト ランスフエクシヨ ンは L i p o f e c t am i n e 2 0 0 0 (In vitrogen)を用い、 添付の説明書に従って行った。 コントロール細 胞は、 哺乳動物の遺伝子配列と有意な相同性、 相補性をもたない二 本のオリゴヌクレオチドから成る二本鎖オリゴヌクレオチドを用い
、 作製した。 安定な細胞系はトランスフエクシヨン細胞をハイグロ マイシン一 B選択培地の中で 4〜 6週間培養して選択を行うことに より獲得した。 S C C Aの発現が抑制されていることを確認するた め、 上述のとおりにして、 リアルタイム P C Rにより S C CA— 1 及び S C C A_ 2の発現を測定した。
センスオリゴヌクレオチド （配列番号 1 2 )
GATCCCGGCCAACACCAAGTTCATGTTTCAAGAGA ACATGAACTTGGTGTTGGCTT TTTTGGAAA
(下線部が相同領域）
アンチセンスオリゴヌクレオチド (配列番号 1 3 )
AGCTTTTCCAAAA AAGCCAACACCAAGTTCATGT TCTCTTGAAACATGAACTTGGT GTTGGCCGG
(下線部が相補性領域）
その結果を図 5に示す。 上記 s i R N A'の導入された細胞では、 コントロールに比べ、 S C CA— 1及び 2ともには発現が 9 0 %以 上抑制 （ノックダウン） されていることが確認された。
上記ノックダウン細胞及びコントロール細胞を用い、 表皮細胞に おける U V誘導アポト一シスに対する S C C A— 1、 2の役割につ いて検討した。
上記各種細胞をケラチノサイ ト一 S FM培地 （GIBCO, Invitroge n)中、 L一グルタミン及び上皮細胞成長因子の存在下で高湿、 C O 25 %の雰囲気において、 3 7 °Cにて培養した。 集密度 6 0〜 7 0 %の細胞に U V Bを照射した。 U V B照射はトランスルミネー夕一 TOREX F L 2 0 5— E— 3 0 /DMR (Toshiba Medical Su pply)を用い、 5 0 m J / c m2の強度で行った。
これらの細胞についてのアポトーシス評価を FAC S C OUL TE Rを用い、 ァネキシン V— F I TC及びプロピジゥムィォダイ ン （P I ) 二重染色法を指標とする FAC S (蛍光活性化セルソ一 夕） 解析により行った。
その結果を図 6に示す。 ノックダウン細胞に UV照射を行った結 果、 コントロール細胞では 3 8 %の細胞がアポトーシスを生じるの に対し、 ノックダウン細胞では約 8 0 %もの細胞がアポトーシスを 引き起こすことが明らかになった。 従って、 S C C Aは U V照射に より誘導される表皮細胞のアポトーシスを有意に抑制することがわ かった。 よって、 S C C Aは表皮細胞の U V防御機構を担い、 また アポトーシスを抑制する作用を有するタンパク質であることが明ら かとなつた。
( 2 ) 不全角化を抑制する物質のスクリーニング方法、 同方法によ りスクリーニングされた物質及び不全角化を抑制する方法
(2 - i)材料及び方法
材料
Ac - WEHD_MCA、 Ac- YVAD- MCA、 Ac-VDVAD-MCA, Ac_DEVD- MCA、 Ac-VE ID - MCA、 Ac - IETD_MCA、 Ac_LEHD- MCAは Pept ide Institute, Inc. (日 本、 大阪府）から購入した。
ベンジルォキシカルポニル（Z)- YVAD- FMK、 Z-VDVSD-FMK, Z-DEVD- FMK、 Z-VEID-FMK, Z- IETD- FMK、 Z- LEHD- FMK及び Z- VAD-FMKは、 BioV ision (Mountain View, CA)から購入した。 組換えカスパーゼ- 1〜 10 ttBIOMOL Research Labs, Inc. (Plymouth Meeting, PA)から得た。 カスパーゼー 14のプロ形及び大サブュニッ トの検出のために、 H - 99抗体（Santa Cruz Biotechnology, Inc)を使用した。 H- 99抗体は ヒ トカスパーゼ— 14のアミノ酸 24-122に対応するペプチドに対し生 起された抗体であり、 従ってカスパーゼ一 14のプロ酵素及びそのプ ロセッシングされた形態、 即ち、 その大サブユニッ トと反応する。 カスパーゼ— 14の小サブュニッ 卜の検出のためには、 C- 20抗体（S anta Cruz)を使用した。 開裂部位特異的抗体（hl4DM 6)は、 ヒ トカ スパーゼ— 14の推定プロセッシング部位に相当する合成ペンタぺプ チド TVGGDを用い、 ゥサギを免疫化することにより作成した。 (2-ii) WEHD- MCA加水分解活性の測定
Mikolajczyk J. et al. , Biochemistry 43, 10560-9 (2004)に記 載の方法に多少の変更を加え、 Ac- WEHD- MCAを基質として、 カスパ ーゼ— 14活性を測定した。 簡単には、 アツセィ混合物を、 45 zLの 0 .1M HEPES緩衝液（pH 7.5)、 0.06M NaCK 0.01¾ CHAPS, 5mM DTT、 1 .3M クェン酸ナトリウム及び IO M WEHD - MCAから作製した（全て、 最終濃度で表示）。 この混合物に酵素試料 1)を添加し、 これを 1 0〜 30分間にわたってィンキュベ一トした。 反応を 150 lの 0.1Mの モノクロ口酢酸により停止させ、 そして Fluoroskan Ascent FL (The ΓΠΙΟ Electron Co. , Wolsam, MA)を用い、 355nmの励起波長及び 460n mの発光波長により測定を行った。 インヒビ夕一アツセィの場合、 カスパーゼー 14及びべプチドインヒビターを室温で 15分間、 アツセ ィ緩衝液中でインキュベートし、 そして 5 lの IOO M WEHD - MCAを 添加することによりアツセィを開始した。
(2-iii)カスパーゼ— 14の精製
健常人の踵からこすり取ったヒ ト角化細胞（約 14g)を、 ガラスホ モジナイザーを使用して、 0.14M NaClを含有する 0.1M Tris-HCl (pH
8.0)で抽出した。 60分間にわたって 15, 000gで遠心分離した後、 上 澄みを得た。 Amicon Ultra (Millipore, MA)で濃縮し、 Fast Desalt ing カラム HR10/10 (Amersham Biosciences)で脱塩した後、 粗生成 物を HiPrep 16/10 Q XLカラムに塗布した。 カラムを 20mM Tris-HCl
(pH 8.0)で洗浄し、 そして 0〜 1 Mの線形 NaCl勾配で溶離させた。 画分は抗カスパーゼ一 14抗体（H- 99) (Santa Cruz Biotechnology, C A)及び h D146抗体を使用するウェス夕ンブロッ 卜により追跡した 。 また、 各画分について Ac- Tyr_Glu-His- Asp-メチル -クマリ ンアミ ド （WEHD- MCA) (Peptide Institute, In 日本国大阪）に対する加水 分解活性を測定した。 陽性を示した画分を同緩衝液で平衡させた M 0 no Q カラムに載せ、 これを最大 1 Mの NaCl勾配で溶離させた。 力 スパ一ゼ一 14画分をさらに Mono S陽イオン交換クロマトグラフィー により分離した。 カラムを 20mM酢酸緩衝液（pH4.5)で平衡にし、 そ して 0〜 1 Mの NaCl勾配で溶離させた。 陽性を示した画分を濃縮し 、 そしてこれを 25mMエタノールァミン（pH 8.3)で平衡にしたクロマ トフオーカシング Mono Pカラムに載せた。 Polybuffer (pH 5.0) 46ml を使用し、 pH8から 5に至る pH勾配を形成させながら、 溶離を行つ た。 カスパーゼー 14は Superdex 75 ゲルクロマトグラフィーを用い 最終的に精製した。 タンパク質濃度は BioRad Protein Assay Kit ( BioRad Lab, Hercules, CA)で決定した。
(2_iv)組換えカスパーゼ— 14及び S C C A— 1の調製
カスパ一ゼ— 14をコ一ドする cDNAを順方向プライマー ： AAGGATCC AATCCGCGGTCTTTGGAAGAGGAG (配列番号 1 4) 及び逆方向プライマー ： TTTCTGCAGGTTGCAGATACAGCCGTTTCCGGAGGGTGC (配列番号 1 5 ) を 使用する PCRによってケラチノサイ ト cDNAから単離 ' 増幅した。 PCR 生成物を pQE-100 DoubleTag ベクタ一（Qiagen, Valencia, CA)中に クローニングし、 そして E.coli JM109中で発現させた。
SSCA1 cDNAを乾癬 cMAライブラリー （Takeda A et al. , J. Inve st. Dermatol. , 118， 147- 54 (2002) )から分離し、 そして pQE30べク 夕一（Quiagen)中にクロ一ニングした。 組換え夕ンパク質を Ni- NTA Agarose (Quiagen)及び Mono Qクロマトグラフィーで精製した。
(2 - v)免疫組織化学
ヒ ト頭皮試験片を患者の同意のもと、 形成外科手術により得た。 組織をリ ン酸緩衝液（pH7.4)中の 4 %パラホルムアルヒ ド （PFA)で固 定し、 パラフィ ン中に包埋した。 薄切片を調製し、 そして 4でで一 晩にわたって適切な抗体と一緒にインキュベートした。 ペルォキシ ダーゼ接合ャギ抗ゥサギ IgG (ニチレイ社製）を二次抗体として使用 し、 発色試薬としての D A Bと反応させた。
TUN E L陽性細胞及び活性カスパーゼの二重免疫検出の場合、 Texas Red (登録商標） 色素接合抗ゥサギ IgG (ロバ）を二次抗体とし て使用した。 TUN E L反応はフルォレセイン in situ 細胞死検出 キッ ト （Roche Diagnostics)を使用し、 その製造者の指示書に従つ て実施した。
I C ADのウエスタンブロッ ト及び免疫組織化学分析の場合、 抗 ICAD IgG (FL331, Santa Cruz Biotechnology)及び DFF45/ICAD Ab-2 (NeoMarkers, Fremont, CA)を使用した。
活性アトピー性皮膚炎 （AD) 患者の皮膚内には、 クラスター化 した不全角化が往々にして観察されることが報告されている （Saku rai K. et al. , J. Dermatol. Sci. 30, 37-42 (2002)； Piloto Val des, L. et al. , Allergol. Immunopathol. (Madr) 18, 321-4 (199 0)) 。 本実験においては、 非侵襲的方法を用い、 不全角化性皮膚に おける I C AD及び S C C A— 1 の局在を調べた。 AD又は健常有 志の皮膚から表在性角化層を採取し、 そして医療用接着剤 Aron Alp ha A(Sankyo Co.， Tokyo)を使用してスライ ドガラス上に付着させ た。 3 %パラホルムアルデヒ ドで固定したあと、 試料に 0.1% Trito n X- 100を浸透させ、 そしてこの試料を抗 I C AD又は抗 S C C A 一 1抗体で一晩にかけて 4 °Cで免疫染色した。 Alexa Fluor 400接 合型抗ラビッ ト （ I C AD) 又は抗マウス IgG ( S C C A— 1 ) を それぞれ二次抗体として、 1時間にわたって室温で使用した。 核の 視覚化のために、 試料を 0.1 ヨウ化ピリジゥム溶液中に 5分間浸漬 し、 そして P B Sで 3回洗浄した。 蛍光観察のために、 Leica DMLA 顕微鏡を使用した。
(2-vi)ウエスタンブロッ ト分析
SDSポリアクリルアミ ドゲル電気泳動法により、 5〜 20%勾配のゲ ルでタンパク質を分離した。 電気泳動後、 タンパク質をポリ ビニリ ジンジフルオライ ド膜（Immobilon - P、 Millipore, Bedford, MA)上 に転写し、 そして H- 99， 4D146又は C20を含む抗カスパーゼー 14抗 体と一緒にインキュベートした。 ペルォキシダーゼ標識抗ゥサギ Ig G (Sigma)又は抗ャギ IgGを二次抗体として使用し、 そして免疫反応 性タンパク質を ECL-プラス （Amersham)を用い化学発光法で視覚化さ せた。
(2-vii)結果
角化細胞中のカスパーゼー 14は Asp1 "でプロセッシングされる
ウエスタンブロッ ト分析によると、 H-99抗体は角化細胞抽出物中 の 17KDaのバンドしか検出しなかった （図 8 ) 。 この結果は、. プロ セッシングされていない 30KDaの形態を含む、 全皮膚又は皮膚等価 モデル由来の抽出物についての結果とは一致しない。 この 17KDaバ ンドは M4D146抗体 （図 8 B) でも認識され、 活性カスパーゼー 14( Pl7)の大サブユニッ トであると推定される。 このことは、 カスパー ゼー 14の成熟が、 終末分化の最終段階中に Asp146での開裂によつて 達成されることを示唆する。 さらに、 30KDaのバンドが、 皮膚等価 モデルにおいて、 H-99及び hl4D146抗体によっても認識され、 この ことは、 Asp146における切断を示唆する。
(2 - viii)角化細胞抽出物からのカスパーゼ— 14の調製
角化細胞中のカスパ一ゼ一 14の大部分はプロセッシングされた形 態、 それ故、 活性型で存在すると推定されるので （Eckhart L. et al. , J. Invest. Dermatol. 115, 1148-51 (2000)； Lippens S. et al. , Cell Death Differ. 7, 1218-24 (2000)； Mikolajczyk, J. e t al. , Biochemistry 43, 10560-9 (2004)) 、 ヒ ト角化細胞は優れ たカスパ一ゼ一 14精製源であると考えられる。 しかしながら、 ヒ ト 角化細胞がカスパーゼー 1様酵素を含有することも知られている （ Takahash i T. , J. Inve s t. De rma t o l . I l l, 367-72 ( 1998) ) 。 カス パ一ゼ— 1の基質、 例えば WEHD-基質は、 カスパーゼ一 1及びカス パーゼー 14の両者によって加水分解することができる。 本発明者は 先ず、 1. 3M クェン酸ナトリウム及び 5 mM ジチオスレィ トールの有 無で、 カスパーゼ— 1 による WEHD- MCA加水分解を試験した。 WEHD- M CAは標準のカスパーゼアツセィ緩衝液中でカスパーゼ— 1 の優れた 基質であるにもかかわらず、 コスモトロピックイオンの存在下では 、 カスパーゼ— 1はこの基質を加水分解できないことが確認された (デ一夕一は示さない）。 従って、 それぞれの画分を、 WEHD- MCAに対 する加水分解活性、 H-99に対する反応性、 及び h l 4D1 4 6抗体といつ た 3通りの方法で評価した。 表 1は、 連続クロマトグラフィーの結 果を示す。 H iPrep Q カラムを使用した最初の陰イオン交換クロマ トグラフィ一の後、 収率は 170%の上昇を示し、 比活性は約 10倍上昇 した。 この上昇はおそらく、 内在性のインヒビ夕一からのカスパー ゼー 14の隔離によるものと考えられる。 ウエスタンプロッ ト分析に よれば、 画分 No. 16〜20は分子量 17 KDaの H- 99陽性且つ 14DM 6陽性 バンドを含有することが示された。 これらの画分は、 WEHD- MCA加水 分解活性も認められた。 続く Mono Q 陰イオン交換ク口マトグラフ ィ一において、 画分 No. 25〜No. 29は、 17 aの H-99陽性且つ M 4D1 4 6陽性バンドの存在による判定に従い、 プロセッシングされた形態 のカスパーゼ— 14を含有する。 これらの画分だけが WEHD- MC A加水分 解活性を示した。 Mono S陽イオンクロマトグラフィ及び Mono Pクロ マトフォーカシングは主だった夾雑タンパク質を除去するのに有効 であり、 そして比活性はそれぞれにより 3. 5倍及び 7倍上昇させた。 ここでもまた、 H - 99陽性且つ h 14D 1 4 6陽性画分だけが WEHD- MC A加水 分解活性を示した。 Supe rdex 75クロマトグラフィーによる最終段 階は分子量 30 KDaのピークを分離し、 このピークは WEHD- MCA加水分 解活性ピークと一致した。 SDSポリアクリルアミ ドゲル電気泳動法 は、 この調製物が 17KDa及び llKDaの断片を含むことを示した。 前者 は H-99抗体及び 4D146抗体の両者に対して陽性を示し、 後者は C20 抗体で認識された。 このことは、 ヒ トカスパーゼー 14が大サブュニ ッ ト （17KDa)及び小サブュニッ ト UlKDa)から成るヘテロダイマーと して精製されたことを示唆する。 また、 Superdex 75ゲルクロマド グラフィ一は、 他のカスパーゼとは異なり、 ヒ ト角化細胞中のカス パーゼー 14はダランザィム B活性化型のようにモノマーとして存在 することを示した。 表 1はカスパーゼー 14の精製率をまとめている 。 約 lOOmgの可溶性タンパク質抽出物から出発して、 精製タンパク 質 11.8 gを得た。 比活性は 764倍上昇し、 収率は 9.1%であった。
表 1
カスパーゼ一 14の精製のまとめ
Figure imgf000040_0001
(2-v i v)精製カスパーゼー 14の酵素特性
精製カスパーゼ— 14の酵素特性を調べた （図 9〜 1 0 ) 。 カスパ ーゼー 14は様々なカスパーゼィンヒビ夕一、 例えば YVAD- FMK (カス パーゼ— 1インヒビ夕一）、 VDVAD-FMK (カスパーゼー 2インヒビ夕 一） 、 DEVD- FMK (カスパーゼ— 3インヒビ夕一） 、 IETD— FMK (カス パ一ゼ— 8インヒビ夕一） 、 LEHD - FMK (カスパーゼ— 9インヒビ ター） 及び VAD— FMK ( pan—カスパーゼインヒビ夕一）に対する感受 性を有した （図 9 ) 。 なお、 VEID— FMKの効果はほとんどなかった 。 とりわけ YVAD- FMKは、 カスパーゼー 14活性に対して極めて強力な 阻害効果を示した。 このことはおそらく、 カスパーゼ一 1 とカスバ —ゼ一 14との間の構造類似性によるものと考えられる。 pan-カスパ ーゼインヒビ夕ー VAD-FMKは、 VAD- FMKと同程度にカスパーゼー 14活 性を抑制した。 システィンプロティナーゼに対するクラス特異的ィ ンヒビターであるョード酢酸（IAA)、 又はセリンプロティナーゼに 対するクラス特異的インヒビ夕一である 4 -（2-ァミノェチル）ベンゼ ンスルホニルフルオリ ド （AEB SF)は、 この研究における試験濃度で は有意な阻害効果を示さなかった。
(2-x) I C A D分解に対する精製カスパーゼー 14の効果
カスパーゼー 14の天然基質の模索中に、 本発明者は I C A Dに対 するカスパーゼー 14の効果を試験した。 というのも、 核の消失は終 末分化にとつて極めて重要な事象の 1つであるからである。 通常の カスパーゼアツセィ緩衝液中で組換え I C A Dタンパク質と共に精 製カスパーゼ一 14をインキュベートすると、 抗 I CAD I gGを用いたゥ エスタンブロッ ト分析による判定によれば、 精製カスパーゼー 14は I C A Dに対し何ら加水分解活性を示さなかった （図 1 0 A ) 。 し かし、 コスモトロピック塩の存在下では、 イン夕タ トな I C A D夕 ンパク質が減少し、 2つの主要な分解生成物が増加することから、 精製カスパーゼー 14は I C ADに対して限定的な分解作用を示した
(2-xi) S C C A— 1 によりカスパーゼ一 14が阻害される
S C C A - 1はセルピン超科に属するものの、 システィンプロテ イナーゼ、 例えばパパイン及びカテブシン Lを阻害する （Takeda A . et al. , Biol. Chem. 383, 1231-6 (2002) ) 。 このことは、 S C C A— 1力 s Crm- A32のような固有のクロスクラスインヒビターであ ることを示す。 従って、 本発明者は S C C A_ 1がカスパーゼメン バーを阻害できるかどうかを試験した。 カスパーゼー 14の場合、 コ スモトロピック条件を利用した。 組換え活性カスパーゼを S C C A 一 1 と共にインキュベートしても、 カスパーゼメンバー（1〜 10)の いずれも酵素活性について何ら影響を受けなかった。 これとは逆に 、 S C C A - 1 は用量依存式にカスパーゼ一 14の WEHD- MCAに対する 活性を抑制した（図 1 0 C) 。 SCCA— 1はカスパーゼ— 14による I C AD分解も阻害した。 インキュベーショ ンを延長しても、 酵素活性 の回復を示すことはなかった。 このことは、 カスパーゼ一 14と S C C A— 1 との強い結合を示唆する （図 1 0 B) 。
(2-xii)活性カスパーゼー 14及び TUNEL陽性細胞の局在
カスパーゼー 14が脱核プロセスに関与するかどうかを調べるため 、 本発明者は、 活性カスパーゼー 14及び TUNELの二重染色を行った 。 図 1 1 Aに示すとおり、 プロ形及び活性型を含むカスパーゼー 14 は、 正常ヒ ト表皮内の有棘細胞から角化細胞にかけて局在していた 。 このことは過去の所見（Lippens et al. , (2000)、 前掲）と合致す る。 hl4D146抗体で検出された活性カスパーゼ— 14は、 角化細胞及 び顆粒細胞の一部に限定されていた（図 1 1 B)。 角化細胞のほとん どは遍在的に染色された。 TUNEL陽性細胞は、 角化層のすぐ下側に 観察されたが、 これらの陽性細胞の多くは著しく制限された（図 1 1 C) o 興味深いことに、 TUNEL陽性細胞は、 専ら hl4DU 6陽性細胞 と共に局在していた。 このことは、 これらの細胞中で MA断片化が 起きており、 活性カスパーゼ— 14がこのプロセスに関与しているこ とを示唆している。
(2- xiii)不全角化性核における I CAD及び S C CA— 1の共局在 正常なヒ ト上皮の縦断面では、 FL331抗体を使用することで、 基 底細胞及び基底上細胞の核内に I C A Dの局在が主にあることがわ かる。 細胞質は、 基底細胞から顆粒細胞において弱く陽性を示した 。 角化層においては、 I CADに対する免疫反応性は大幅に低減し た。 N末端ペプチド抗体 DFF45/ICAD Ab- 2を使用しても事実上同じ 結果が得られた（デ一夕一は示さず） 。 AD患者の表在性角化層を 抗 ICAD抗体（FL- 331)で染色した場合、 様々なサイズのクラスタ一領 域がこの抗体に対して陽性を示した （図 1 2 B) 。 P I による核染 色は、 不全角化性の核がこれらの斑状の島内に常に見いだされるこ とを示した （図 1 2 C) 。 表在性角化層の明視野は、 凹 ώの多い粗 い表面を示した （図 1 2 D) 。 重畳画像は、 不全角化部位が I C A D陽性部位と一致することを示した （図 1 2 E及び 1 2 F) 。 これ らの結果は、 終末分化において核を排除するのに I C AD分解が必 要とされることを示唆する。
正常な皮膚の場合、 極めて低レベルの S C C A— 1が顆粒層内で 検出された。 活性 ADを有する表在性角化層内でも、 陽性部位の斑 状分布が顕著な強い免疫染色が見いだされた（図 1 3 H)。 同様に、 3 (：〇八ー 1陽性領域は、 P I陽性の核の層、 即ち不全角化部位と 一致した（図 1 3 ·！〜 L)。 これらの結果をまとめると、 I CADZ C AD系が脱核プロセスの主要な役割を果たし、 そして S C C A— 1はサブレッサーとしてこの反応に関与することを示唆する。 考察
カスパーゼー 14は大部分が表皮内で発現され、 その他の組織内で はほとんど発現されない （Van de Craen, M et al. , Cell Death D iffer. 5, 836-46 (1998) ) 。 過去の報告によれば、 ケラチノサイ トの終末分化はカスパーゼー 14のプロセッシングと連携していると のことであり、 このことは、 カスパーゼ科プロティナ一ゼの活性化 を示唆する （Lippens, S et al. , Cell Death Differ 7, 1218-24 (2000)； Eckhart 1. Biochem. Biophys. Res. Commun. 277, 655-9 (2000)； Hu S. J. Biol. Chem 273, 29648-53 (1988) ) 。 最近、 Mik olajaczyk et al. , ( 2004) 前掲） は、 グランザィム B切断カス パーゼー 14がコスモトロピック塩の存在下で酵素的に活性であるこ とを実証した。 この研究において、 本発明者は、 ヒ トカスパーゼー 14がケラチノサイ ト分化の最終段階において活性であるかどうかを 調べるために、 完全に分化されたケラチノサイ 卜からのカスパーゼ _ 14の精製を試みた。 本発明者は、 大サブユニッ ト、 プロ形（H-99) (Asp146 (hl4D146)に推定カスパ一ゼ切断部位を有する） 及び小サ ブュニッ ト （C20)をそれぞれ認識する 3種の抗体を使用した。 最終 調製物は 2つのタンパク質バンド、 すなわち hl4D146抗体によつて 認識された 17KDaの夕ンパク質バンド、 及び C20抗体によつて認識さ れた llKDaのタンパク質バンドから成った。 これらのタンパク質バ ンドは、 活性カスパーゼ— 14の大及び小サブユニッ トである。 精製 工程の間、 H- 99陽性の 17KDaのバンドが、 M4D146抗体と一緒に認識 された。 このことは、 大サブユニッ トがそのカルボキシル末端にお いて Asp146で終わる'ことを示唆している。 小サブユニッ トのァミノ 末端領域は Lys153- Asp - Ser- Pro- Ginとして同定され、 このことは、 プロセッシングが lie152と Lys153との間で生じることを示唆する。 この部位はカスパーゼメンバーとしては奇異な切断部位である。 こ のことは、 包皮抽出物から免疫沈降させたカスパーゼ一 14が同じ部 位で切断を示すという、 011611他の発見（810(：116111. Biop ys. Res. C ommun. 2002 Aug 30； 296 (4)； 91卜 7)と合致する。 従って、 ヒ トカス パーゼー 14は高活性へテロダイマーとして均質に精製されたと結論 付けた。 カスパーゼー 14の成熟には、 2つの部位 Asp14 e及び lie152 におけるプロセッシング、 並びにリンカ一領域 Xxx147及び lie152内 の 6つの残基の除去が関与するものと示唆された。 2つの異なる切 断部位（一方は酸性、 他方は疎水性）の存在はまた、 カスパーゼー 14 の活性化が多数の酵素により多段階的に行われることを示唆する。 精製カスパーゼー 14の酵素学的特性は極めて独自のものであった 。 精製カスパーゼー 14は、 既知のカスパーゼインヒビ夕一に対し比 較的広いインヒビター感受性を示した。 とりわけ、 カスパーゼ 1ィ ンヒビ夕一 YVAD-FMKが最も強い阻害作用を示した。 YVAD- FMKは WEH D - MCA並びに別のカスパーゼ一 1基質である YCAD- MCAに対して最も 高い活性を示した。 このことは、 カスパーゼ- 1とカスパーゼ一 14と の密な関係を示唆する。 しかし、 本発明者が明らかにしたところで は、 カスパーゼー 14は顕著に異なる特性を有している。 本発明者は 、 S C C A— 1がカスパーゼー 14に対する内在性インヒビ夕一であ ることを初めて解明した。 S C C A— 1 の最も特異的な特性は、 力 スパーゼー 14に対する著しい特異性である。 カスパーゼ 1〜 10の他 の構成員が S C C A— 1 による影響を受けることはない。 合成基質 DEVD-MCA又は天然基質 I C ADを使用して、 S C C A— 1がカスパ —ゼー 3活性を阻害することはなかった。 これは Crm Aとは対照的 である。 Crm Aもセルピン超科に属し、 カスパーゼー 1及びカスパ ーゼー 8を含む多数のカスパーゼを抑制することができることで知 られる （Gagliardini V. et al. , Science 263, 826-8 ( 1994) ) 0 XI ΑΡはカスパーゼー 3， —7及び一 9を阻害することで知られる （Sri nivasula S. M. et al. , Nature 410, 112-6 (2001) ) 0 抗アポトー シス性タンパク質 p35はカスパーゼー 1， 一 3 , — 6， - 7 , 一 8 及び一 10を阻害することから、 より広いスペク トルを有すると考え られる。 これらの阻害タンパク質 C A, IAP及び p35の全てがいく つかの開始及び実行カスパーゼの一部を抑制し得るという事実は、 これらの分子が典型的なアポト一シス経路の実行に関与しているこ とを示唆する。 他方、 本発明者の結果が強く示唆しているのは、 S C C A— 1が通常のアポト一シス事象におけるキープレーヤーでは ないが、 カスパーゼ— 14により媒介される脱核プロセスにおける重 要なレギユレ一夕一である、 ということである。
このプロセスの分子メカニズムは解明されていなかった。 本発明 者は、 ヒ トカスパーゼー 14がコスモトロピック塩の存在下において 、 I C ADを分解できることを明らかにした。 I C AD (D NA断 片化因子 「D F F 4 5」 とも称される） は、 カスパーゼ活性化型 D Nァ一ゼ（C AD) (又は D F F 4 0 ) と称されるマグネシウム依 存性エンドヌクレアーゼに対するインヒビ夕一である。 I C ADZ C AD系は、 アポトーシス性細胞死中の染色体 D N Aの分解におい て主要な役割を演じる。 C ADに結合した I C ADは、 不活性複合 体として存在する。 カスパーゼ— 3は、 I C ADに対し限られた夕 ンパク質分解を示し、 2つの部位 Asp1 17及び Asp 224で切断する。 こ の切断は C ADを活性化し、 D NA分解を開始させる （Nagata S. Exp. Cell Res. 256, 12-8 (2000) ) 。 カスパーゼ— 3はアポトー シスの際の大量の細胞タンパク質の切断にとっては必ずしも必要で ないが、 I C ADの切断にとっては必須である （Tang D. et al. , J. Biol. Chem. 273, 28549-52 (1998) ) 。 このことは、 カスパーゼ — 3が D N A断片化に極めて重要であり、 他の実行カスパーゼ、 即 ちカスパーゼ— 6や 7は重要ではないことを示す。 興味深いことに 、 カスパ一ゼ— 14は I C ADから、 12KDa及び 35KDaの似たような切 断断片を生成した。 配列分析は同一の切断部位を示した。 このこと は、 カスパーゼー 14がカスパーゼ— 3の完璧な代替物となり得るこ とを示唆している。 カスパーゼー 14は I C A Dを分解し得るものの 、 下記の理由から、 プロアポトーシスカスパーゼー 3 とは明らかに 異なる。 第 1 に、 カスパーゼー 14の過剰発現はアポト一シス性細胞 死を誘導しない （Van de Craen. Cell Death Differ. 5, 838-46 (1 998) ) 。 このことはカスパーゼー 3 とは対照的である。 第 2に、 力 スパーゼー 14は種々のアポトーシス性刺激では活性化されない （Li ppens et al. (2000)、 前掲） 。 開始カスパ一ゼ又はその他のカス パーゼメンバ一は、 プロ一カスパーゼ一 14をプロセッシングするこ とができなかった。 このことは過去の所見と一致する （Lippens et al. (2000)、 前掲） 。 活性化は終末分化においてのみ発生する （E ckhart L. et al. , (2000)、 前掲） 。 第 3 に、 カスパーゼ— 14の合 成は、 成人組織における分化中のケラチノサイ トに限定される （Ec khart L. Biochem. Biophys. Res. Commun. 277, 655-9 (2000) ) 。 また、 I C A D切断に対するカスパーゼ— 14の能力は、 カスパーゼ 一 3 とは顕著に異なる様式で調節される。 カスパーゼ— 14による I C AD分解は、 異常な高濃度のコスモトロピックイオンを必要とす る。 このようなイオン濃度では、 他のカスパーゼはほとんど活性で はなかった。 総合的に見て、 カスパーゼー 14は、 ケラチノサイ ト分 化プログラムがその活性化を調節することから、 カスパーゼメンバ 一の中では特殊な位置づけにあるように考えられる。
ケラチノサイ ト終末分化における I C AD/C AD系の関与は、 in vivo実験によってさらに裏づけされる。 免疫組織化学的研究は 、 I C ADが基底ケラチノサイ トから有棘ケラチノサイ 卜にかけて 核内に存在し、 顆粒細胞で消失し、 核の消失は終末分化の際に起こ ることが示された。 AD患者の表在性表皮内には、 I CADの強い 免疫染色が斑状部位に示された。 これらの領域は若干粗い表面を有 し、 半透明性が低い。 まさにこれらの領域上に、 P I陽性な、 未消 化の核の集合が共局在していた。 他の領域が抗 I CAD抗体で染色 されることはなかった。 また、 A D患者の皮膚からのテープス トリ ッピング試料はインタク 卜な I CADタンパク質の存在を示したが 、 健常人の抽出物中では検出されることはなかった。 これらの結果 は、 I CADが終末分化の際の脱核プロセスに関与していることを 示唆する。
正常な表皮では S C C A— 1はほとんど発現されない。 他方、 乾 癬表皮、 粘膜及び食道においては、 強い発現が報告されている （Ta keda A. et al.， J. Invest. Dermatol. 118, 147-54 (2002) ) 。 興 味深いことには、 これらの組織には不全角化が伴っている。 本発明 者は、 不全角化部位には S C C A— 1の強い染色も見いだされるこ とを明らかにした。 さらに、 S C CA— 1及び I CADは、 核の集 合が存在する箇所と同じ部位に常に共局在していた。 S C C A— 1 又は I CADが陰性である他の表皮表面部分はなかったので、 不全 角化部位におけるこれらの分子の共局在は、 これらの分子が脱核プ 口セスの抑制に関与することを示唆する。 パン-カスパーゼインヒ ビ夕一 VAD-FMKにより、 皮膚等価モデルにおいて核が消失しなくな ることが報告されている （Weil他、 1999)。 VAD-FMKが最も強力な力 スパ一ゼー 14インヒビ夕一の 1つであるという本発明者の発見は、 カスパーゼ一 14がおそらく この反応における候補であるという可能 性を高める。 カスパーゼー 14は、 乾癬皮膚の不全角化部位内ではダ ゥンレギュレートされ、 また口腔表皮内には存在しない。 口腔表皮 では、 核の消失は何らかの形で損なわれるか、 或いは行われない （ Lippens et al. , (2000)、 前掲） 。 興味深いことには、 S C CA— 1はこれらの組織内でアップレギュレートされる。 おそらく、 これ らの分子の異常発現は、 核の恒久的な存在などを含む、 不完全な分 化を引き起こすものと考えられる。
皮膚内のカスパーゼー 14の活性化メカニズムは全体的によくわか つていない。 皮膚又は皮膚等価モデルにおいてのみ活性化が観察さ れ、 細胞培養系では観察されない （Eckhar t L. e t a l . (2000)、 前 掲） 。 実際に、 本発明者は種々の条件を試した。 これらの条件には 、 血清の添加、 集密になってからカルシウムの存在下もしくは非存 在下での 14日目までの培養期間の延長、 カルシウムィオノフォア A2 3 187による処理、 又は多くの分化マーカ一をアップレギユレ一卜す るのに十分な 30分間にわたる空気暴露を含む。 これらの分化刺激は 顕著なカスパ一ゼ一 1 ½MA発現を誘導するものの、 カスパーゼー 14 活性を引き起こすのに効果的な刺激はなかった （データーは示さな い） 。 活性化プロセスは厳密に制御され、 単層培養中で強く抑制さ れる。 層化及び空気暴露がその活性化に必要と思われる。 カスパー ゼー 14の活性化は、 アポトーシスプログラムによってではなく、 分 化プログラムによる制御を介して行われるのが明らかである。 終末 分化プロセス中には、 セリン、 システィン及びァスパラギン酸プロ ティナーゼを含む多くのプロティナーゼも活性化される。 トリプシ ン様及びキモトリブシン様血清プロティナーゼは、 最も外側の角化 細胞を脱落させる役割を演じることが示唆されている。 システィン プロティナーゼの一部、 例えばカテブシン B及び Lは分化されたケ ラチノサイ ト中でアップレギュレートされる。 カテブシン D、 ァス パラギン酸プロティナーゼもまた、 角化細胞を脱落させる役割を演 じることが示唆されている。 これらの酵素は他の分化メカニズム、 例えばカスパーゼ— 14の活性化に関与することがある。
以上をまとめると、 本発明者は、 ヒ ト角化細胞抽出物からカスパ ーゼ— 14を精製した。 カスパーゼー 14は核の消失を誘導し、 この消 失はアポトーシス様であるが、 しかしケラチノサイ ト分化の最終段 階で I C A D分解を介して生じる区別可能な変化であることが強く 示唆される このプロセスはいくつかのアポトーシス性因子を共有 するものの これは損傷された細胞の排除を招く細胞死プロセスで はな < 、 主要な役割であるバリアー機能のための構造全体を完成す
•ό とを目的とした構成プロセスである。 カスパーゼー 14又は S C
C A ― 1 の異常発現は分化プログラムに直接的に影響を及ぼし、 そ の結果 、 不全角化及びバリァー機能崩壊が生じる。
(2-xiv)スクリ一二ング方法
不全角化を抑制する物質のスクリーニングは以下のとおりにして 実施した。 試験した生薬は以下のとおりである。
ヒメガマエキス （一丸フアルコス）
ブドゥエキス （一丸フアルコス）
トマトエキス (一丸フアルコス）
キユウリエキス （一丸フアルコス）
キウイエキス （一丸フアルコス），
夕イソウエキス （一丸フアルコス）
トルメンチラ （一丸フアルコス）
(a) システィンプロテアーゼの酵素活性の測定
アツセィ用緩衝液 （50mMの H E P E S (pH7.5) 5 mMの D T T 2.5mMの E D TA 0.1%の C HA P S ) 80 1 と 1 g/mlのパパイ ン （Sigma) 20 1 を混合し、 室温にて 15分インキュベーションし た。 次いで、 2.5mMの基質 N α—ベンゾィルー L—アルギニン 4— 二トロアニリ ド塩酸塩 （L— B A P NA) 20 1 を添加し、 37°Cで 15分インキュベーションした。 これにエタノール中の 25%の酢酸溶 液 30 1 及び 0.2%の p—ジメチルアミノシンナムアルデヒ ド 30 1 を添加して発色させ、 545ηπιの吸光度を測定した。 この吸光度を システィンプロテア一ゼの酵素活性 [ X ] とする。
(b) 不全角化を抑制する候補生薬とシスティンプロテア一ゼを含 有する系の酵素活性の測定
上記アツセィ用緩衝液 60 1 と候補物質 20^ 1 を室温にて 30分ィ ンキュベーシヨ ンした。 これに、 1 g/mlのパパイン 20 1 を添加 し、 室温にて 15分インキュベーションした。 次いで、 2.5mMの L一 B A P N A20 1 を添加し、 37°Cで 15分インキュベーションした。 これにエタノール中の 25%の酢酸溶液 30^ 1 及び 0.2%の ρ —ジメ チルァミノシンナムアルデヒ ド 30 / 1 を添加して発色させ、 545nm の吸光度を測定した。 この吸光度をシスティンプロテアーゼの酵素 活性 [ y ] とし、 試験した各物質についての上記 [ X ] に対する％ を以下の表 2中の [サンプルのみ] の列に示す。
[サンプルのみ] の値は、 試験生薬自体が有するシスティンプロ テア一ゼ阻害活性の目安となり、 即ちその値が 100に近いほど、 試 験生薬が有するシスティンプロテアーゼ阻害活性が俾ぃことを意味 する。 また、 下記の表 2に、 100から上記 [サンプルのみ] の値を 差し引いた値 [100— [サンプルのみ] ] も示す。 この場合、 その値 が 0に近いほど、 試験生薬が有するシスティンプロテアーゼ阻害活 性が低いことを意味する。
(c) S C C A— 1、 候補生薬及びシスティンプロテア一ゼを含有 する系の酵素活性の測定
上記アツセィ用緩衝液 40 1 と組換え S C C A— 1 20 1 を混 合し、 それに候補生薬物質 20 1加え、 室温にて 30分インキュベー シヨンした。 これに、 1 ^ g/mlのパパイン 20 1 を添加し、 室温に て 15分インキュベーションした。 次いで、 2.5mMの L— B A P N A2 0 1 を添加し、 37°Cで 15分インキュベーショ ンした。 これにエタ ノール中の 25%の酢酸溶液 30 1及び 0. 2%の ρ—ジメチルァミノ シンナムアルデヒ ド 30 1 を添加して発色させ、 545nmの吸光度を 測定した。 この吸光度をシスティンプロテアーゼの酵素活性 [ z ] とし、 試験した各物質についての上記 [ X ] に対する％を以下の表 2 中の [ S C C A— 1 + ] の列に示す。
[ S C C A— 1 + ] の値は、 S C C A— 1が有するシスティンプ 口テアーゼ阻害活性と試験生薬自体が有するシスティンプロテア一 ゼ阻害活性の総計の目安となり、 即ちその値が 100に近いほど、 そ の総阻害活性が低いことを意味する。
また、 表中の [差] の列は、 [ S C C A— 1 + ] から [100— [サ ンプルのみ] ] を差し引いた値を示す。 この差が大きいほど、 S C C A— 1、 候補生薬及びシスティンプロテアーゼを含有する系にお ける S C C A - 1が有するシスティンプロテアーゼ阻害活性が低い ことの目安となり、 即ち、 候補生薬による S C C A— 1のシスティ ンプロテアーゼ阻害活性の抑制が顕著であることを示唆する。
この結果を以下の表 2 にまとめた。
表 2
Figure imgf000052_0001
その結果、 ヒメガマエキス、 ブドゥエキス、 トマトエキス、 キュ ゥリエキス、 キウイエキス及び夕イソゥエキス、 特にヒメガマェキ スが S C C A— 1のシスティンプロテアーゼ阻害活性を有意に抑制 することがわかった。 従って、 これらのエキスが表皮不全角化を抑 えるのに有効であるものと考えられる。 産業上の利用の可能性
本発明により、 扁平上皮細胞癌及び乾癬から成る群から選ばれる 疾患の治療 ' 予防のための方法、 医薬組成物が提供される。 また、 本発明により、 従来技術とは異なる全く新規なアプローチで表皮不 全角化の抑制 · 治療手段の提供も可能となる。

Claims

1. 細胞の扁平上皮細胞癌関連抗原 （ S C C A) の発現を抑制す ることで、 乾癬及び扁平上皮細胞痛から成る群から選ばれる疾患を 治療及び/又は予防する方法。
2. 細胞の S C C Aの発現の抑制が、 S C C Aをコードする遺伝 請
子の RNA干渉による、 請求項 1記載の方法。
3. RNA干渉に、 配列番号 1のオリゴヌクレオチド又はその変 異体を含むセンスオリゴヌクレオチド鎖及び配列番号 3のオリゴヌ クレオチド又はその変異体を含むアンチセンスオリゴヌクレオチド 鎖を含んで成る二本鎖 R NAを利用するこ囲とを特徴とし、 ここで前 記配列番号 1のオリゴヌクレオチドの変異体は S C C Aをコードす る遺伝子のヌクレオチド番号 4 6〜 6 6位に対し高ス トリ ンジェン 卜な条件下でハイプリダイズする配列を有し、 そして前記配列番号 3のオリゴヌクレオチドの変異体は S C C Aをコードする遺伝子の ヌクレオチド番号 4 6〜 6 6位の相補鎖に対し高ス トリ ンジェント な条件下でハイブリダィズする配列を有する、 請求項 2記載の方法
4. 細胞の S C C Aの発現を抑制することで、 乾癬及び扁平上皮 細胞癌から成る群から選ばれる疾患を治療及び 又は予防するため の医薬組成物。
5. S C C Aをコードする遺伝子の R N A干渉により細胞の S C C Aの発現を抑制する、 請求項 4記載の医薬組成物。
6. 配列番号 1のオリゴヌクレオチド又はその変異体を含むセン スオリゴヌクレオチド鎖及び配列番号 3のオリゴヌクレオチド又は その変異体を含むアンチセンスオリゴヌクレオチド鎖を含んで成る 二本鎖 R NAを含有することを特徴とし、 ここで前記配列番号 1 の オリゴヌクレオチドの変異体は S C C Aをコードする遺伝子のヌク レオチド番号 4 6〜 6 6位に対し高ス トリ ンジェントな条件下でハ ィプリダイズする配列を有し、 そして前記配列番号 3のオリゴヌク レオチドの変異体は S C C Aをコードする遺伝子のヌクレオチド番 号 4 6〜 6 6位の相補鎖に対し高ス トリンジェン卜な条件下でハイ プリダイズする配列を有する、 請求項 5記載の医薬組成物。
7. S C C Aの発現の抑制された細胞を調製するための方法であ つて、 S C C Aの発現の抑制が S C C Aをコードする遺伝子の RN A干渉により行われ、 R NA干渉に、 配列番号 1 のオリゴヌクレオ チド又はその変異体を含むセンスオリゴヌクレオチド鎖及び配列番 号 3のオリゴヌクレオチド又はその変異体を含むアンチセンスオリ ゴヌクレオチド鎖を含んで成る二本鎖 RNAを利用することを特徴 とし、 ここで前記配列番号 1のオリゴヌクレオチドの変異体は S C C Aをコードする遺伝子のヌクレオチド番号 4 6〜 6 6位に対し高 ス トリンジェントな条件下でハイプリダイズする配列を有し、 そし て前記配列番号 3のオリゴヌクレオチドの変異体は S C C Aをコ一 ドする遺伝子のヌクレオチド番号 4 6〜 6 6位の相補鎖に対し髙ス トリンジェン卜な条件下でハイプリダイズする配列を有する、 方法
8. 請求項 7記載の方法により S C C Aの発現の抑制された細胞
9. 請求項 8記載の細胞を有する、 ヒ トを除く動物。
10. 表皮不全角化を抑制する物質のスクリーニング方法であって 、 扁平上皮細胞癌関連抗原— 1 ( S C C A— 1 ) が保有するシステ ィンプロテア一ゼ阻害活性を抑制する候補物質の活性を指標とする ことを特徴とする方法。
11. 以下のアツセィ系（1)， (2), (3) ： (1)システィンプロテアーゼの活性を測定し、 その測定値 [ X ] を得る ；
(2) i)候補物質を前記（1)に規定のシスティンプロテアーゼの酵素 活性的に同等量と混合し、 インキュベーションする ； そして
i 当該（2) i)のインキュベーショ ン混合物のシスティンプロ テアーゼ活性を前記（1)と同一条件下で測定し、 その測定値 [y] を得る ； 並びに
(3) i) S C C A— 1 と、 （2) i)で使用したのと同量の前記候補物 質とを混合し、 インキュベーションする ；
ii)当該（3) i)のインキュベーション混合物を前記（1)に規定 のシスティンプロテアーゼの酵素活性的に同等量と混合し、 前記（2 ) i)と同一条件下でインキュベーションする ； そして
i i i)上記（3) i i)のインキュベーショ ン混合物のシスティンプ 口テア一ゼ活性を前記（1)と同一条件下で測定し、 その測定値 [ z ] を得る ；
を含んで成り、 ここで以下の条件
{ [ z ] / [ X ] X 100} - { 100- [ y ] / [ x ] X 100} > 0 が満たされれば、 前記候補物質は、 S C C A— 1が保有するシス ティンプロテアーゼ阻害活性を抑制する活性を有するものと決定さ れ、 表皮不全角化を抑制する物質として選定される、 請求項 10記載 の方法。
12. { [ z ] / [x ] X 100} 一 { 100- [y ] / [x] XlOO} > 3
が満たされることを条件とする、 請求項 11記載の方法。
13. { [ z ] / [ X ] X 100} 一 { 100- [y ] / [x] XlOO} >16
が満たされることを条件とする、 請求項 12記載の方法。
14. 前記システィンプロテア一ゼがカスパーゼー 14である、 請求 項 10〜 13のいずれか 1項記載の方法。
15. 前記システィンプロテアーゼがパパインである、 請求項 10〜 13のいずれか 1項記載の方法。
16. ヒメガマエキス、 ブドゥエキス、 トマトエキス、 キユウリエ キス、 キウイエキス及び夕イソゥエキスから成る群から選択される 1又は数種の生薬を活性成分として含有することを特徴とする、 表 皮不全角化を抑制する皮膚外用組成物。
17. ヒメガマエキスを含有することを特徴とする、 請求項 16記載 の皮膚外用組成物。
18. 前記表皮不全角化が乾癬を原因とする、 請求項 16又は 17の記 載の組成物。
19. 前記表皮不全角化がアトピー性皮膚炎を原因とする、 請求項 16又は 17記載の組成物。
20. 表皮細胞中の S C C A- 1のカスパーゼ— 14阻害活性を抑制 することで、 表皮細胞の角化の正常化を図り、 表皮不全角化を抑制 する方法。
21. 表皮にヒメガマエキス、 ブドゥエキス、 トマトエキス、 キュ ゥリエキス、 キウイエキス及び夕イソゥエキスから成る群から選択 される 1又は数種の生薬を活性成分として含有する皮膚外用組成物 を塗布することにより、 表皮細胞中の S C C A— 1のカスパーゼ一 14阻害活性を抑制する、 請求項 20記載の方法。
22. 前記皮膚外用組成物がヒメガマエキスを含有することを特徴 とする、 請求項 21記載の方法。
PCT/JP2005/018074 2005-03-18 2005-09-22 扁平上皮細胞癌関連抗原の発現の抑制による乾癬、扁平上皮細胞癌及び/又は不全角化の治療のための方法及び医薬組成物 WO2006100797A1 (ja)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN2005800491695A CN101141982B (zh) 2005-03-18 2005-09-22 通过抑制鳞状上皮细胞癌抗原的表达而治疗牛皮癣、鳞状上皮细胞癌和/或角化不全的方法和药物组合物
EP05787935A EP1859806A4 (en) 2005-03-18 2005-09-22 METHOD AND PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR THE TREATMENT OF PSORIASIS, PLATED CELL CARCINOMA AND / OR PARACERATOSIS BY INHIBITION OF EXPRESSION OF PLATE CELL CARCINOMA RELEVANT ANTIGEN
US11/886,475 US7829547B2 (en) 2005-03-18 2005-09-22 Method and pharmaceutical composition for treating psoriasis, squamous cell carcinoma and/or parakeratosis by inhibiting expression of squamous cell carcinoma-related antigen
US12/907,412 US20110305783A1 (en) 2005-03-18 2010-10-19 Method and pharmaceutical composition for treating psoriasis, squamous cell carcinoma and/or parakeratosis by inhibiting expression of squamous cell carcinoma-related antigen

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2005-080566 2005-03-18
JP2005080566A JP4585342B2 (ja) 2005-03-18 2005-03-18 不全角化を抑制する物質のスクリーニング方法、同方法によりスクリーニングされた物質及び不全角化を抑制する方法

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
US12/907,412 Division US20110305783A1 (en) 2005-03-18 2010-10-19 Method and pharmaceutical composition for treating psoriasis, squamous cell carcinoma and/or parakeratosis by inhibiting expression of squamous cell carcinoma-related antigen

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2006100797A1 true WO2006100797A1 (ja) 2006-09-28

Family

ID=37023490

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2005/018074 WO2006100797A1 (ja) 2005-03-18 2005-09-22 扁平上皮細胞癌関連抗原の発現の抑制による乾癬、扁平上皮細胞癌及び/又は不全角化の治療のための方法及び医薬組成物

Country Status (7)

Country Link
US (2) US7829547B2 (ja)
EP (2) EP2375250B1 (ja)
JP (1) JP4585342B2 (ja)
KR (1) KR20070112208A (ja)
CN (3) CN102127589B (ja)
ES (1) ES2484696T3 (ja)
WO (1) WO2006100797A1 (ja)

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP5219586B2 (ja) * 2008-03-31 2013-06-26 株式会社 資生堂 不全角化及び表皮増殖異常三次元皮膚モデルの作製方法
JP5561956B2 (ja) * 2009-04-28 2014-07-30 株式会社 資生堂 カルボキシアミド誘導体及び／またはその塩を活性成分とするｓｃｃａ−１産生抑制剤
JP5719504B2 (ja) * 2009-07-30 2015-05-20 株式会社 資生堂 カスパーゼ−１４特異的モノクローナル抗体
KR101218667B1 (ko) * 2010-07-13 2013-01-07 영농조합법인바이오젠코스텍 나노리포좀으로 안정화시킨 대추 추출물을 함유하는 항아토피 조성물
US20120230930A1 (en) * 2011-03-08 2012-09-13 Corstjens Hugo A Methods For Activating Caspase-14 Expression In Human Skin
US8383167B2 (en) 2011-03-08 2013-02-26 Elc Management, Llc Method for cosmetically treating caspase-14 deficiency
JP2015063479A (ja) * 2013-09-25 2015-04-09 一丸ファルコス株式会社 植物抽出物によるカスパーゼ−１４発現誘導剤
JP6424011B2 (ja) * 2014-03-31 2018-11-14 株式会社ナリス化粧品 角栓形成抑制効果を有する素材のスクリーニング方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2005269974A (ja) * 2004-03-24 2005-10-06 Shiseido Co Ltd 乾癬及び扁平上皮細胞癌の治療のための方法及び医薬組成物

Family Cites Families (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0965328B1 (en) * 1997-01-29 2009-03-04 Kao Corporation Cosmetic
JP2000119156A (ja) * 1998-10-14 2000-04-25 Kose Corp 皮膚外用剤
AU4229200A (en) * 1999-04-22 2000-11-10 Howard Murad Methods and compositions for treating dermatological disorders with fruit extracts
US6524626B2 (en) * 1999-04-23 2003-02-25 E Excel International, Inc. Ginseng berry topical products
JP4035258B2 (ja) * 1999-05-10 2008-01-16 花王株式会社 皮膚外用剤
UA74375C2 (uk) * 2000-05-12 2005-12-15 Бенгт Крістер Ольсон Антиоксидантна композиція для догляду за шкірою, що містить екстракти з виноградних кісточок, томатів та хрящів, спосіб лікування (варіанти)
HU230458B1 (hu) * 2000-12-01 2016-07-28 Europäisches Laboratorium für Molekularbiologie (EMBL) Az RNS interferenciát közvetítő kis RNS molekulák
JP2003063942A (ja) * 2001-08-27 2003-03-05 Kose Corp 皮膚外用剤
FR2829694B1 (fr) * 2001-09-14 2003-12-05 Jacques Andhrel Nouvelles compositions cosmetiques comprenant des extraits vegetaux et leur utilisation comme agent antiradicalaire
JP4091824B2 (ja) * 2002-02-05 2008-05-28 株式会社コーセー 皮膚外用剤
JP4473491B2 (ja) * 2002-05-28 2010-06-02 株式会社資生堂 毛穴縮小剤
GB0212303D0 (en) 2002-05-28 2002-07-10 Isis Innovation Molecular targetting of IGF-1 receptor
EP1559429A4 (en) * 2002-06-25 2009-09-09 Shiseido Co Ltd AGAIN AGING AGING
WO2004072284A1 (en) * 2003-02-11 2004-08-26 Antisense Therapeutics Ltd Modulation of insulin like growth factor i receptor expression
US20040223942A1 (en) * 2003-03-06 2004-11-11 Kao Corporation Skin aging-preventing or improving agent
JP4870433B2 (ja) * 2003-11-28 2012-02-08 タカラバイオ株式会社 セラミダーゼ阻害剤
JP2005281140A (ja) * 2004-03-26 2005-10-13 Shiseido Co Ltd Ｓｃｃａによるｊｎｋ−１キナーゼ活性の抑制方法
JP2005281197A (ja) * 2004-03-30 2005-10-13 Shiseido Co Ltd 不全角化抑制剤、毛穴縮小剤及び皮膚外用剤

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2005269974A (ja) * 2004-03-24 2005-10-06 Shiseido Co Ltd 乾癬及び扁平上皮細胞癌の治療のための方法及び医薬組成物

Non-Patent Citations (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
H. KATO ET AL., CANCER, vol. 40, 1977, pages 1621 - 1628
HAMANAKA S.: "Serum level of squamous cell carcinoma antigen as a new indicator of disease activity in patients with with psoriasis", ARCHIVES OF DERMATOLOGY, vol. 133, no. 3, 1997, pages 393 - 395, XP003002002 *
IIZUKA H. ET AL.: "Apoptosis kara Mita Kansen: Kasoku sareta Saiboshi ni Tomonau Chitsujo no Hassei", NITIKAWA KAISHI, vol. 108, no. 12, 1998, pages 1558 - 1561, XP003002005 *
KATO H.: "Henpei Johi Gan no Akuseido no Kaimei to Rinsho Ekigaku", MINISTRY OF EDUCATION, CULTURE, SPORTS, SCIENCE AND TECHNOLOGY TOKUTEI RYOIKI KENKYU 'GAN' KENKYU HOKOKU SHUROKU HEISEI 15 NENDO (2003 NENDO), 2004, pages 126 - 128, XP003001598 *
KOZU T.: "Genome RNA Ikogaku to Hakketsubyo. (Gernome RNA technology and leukemia)", EXPERIMENTAL MEDICINE, vol. 22, no. 17, 2004, pages 173 - 178, XP003002007 *
N. MINO ET AL., CANCER, vol. 62, 1988, pages 730 - 734
NAWATA S. ET AL.: "Shikyu Keibu Henpei Johi Saibo Gan kara no SCC Kogen Bunpitsu", SANFUJINKA NO SEKAI, vol. 52, 2000, pages 589 - 592, XP003002001 *
See also references of EP1859806A4
SIOMI M. AND TSUKOMO H.: "small RNA ga Hikiokosu Idenshi Hatsugen Seigyo Kiko. (Mechanisms of gene silencing by small RNAs)", EXPERIMENTAL MEDICINE, vol. 22, no. 17, 2004, pages 153 - 160, XP003002006 *
SUMINAMI Y. ET AL.: "Suppression of a squamous cell carcinoma (SCC)-related serpin, SCC antigen, inhibits tumor growth with increased intratumor infiltration of natural killer cells", CANCER RESEARCH, vol. 61, no. 5, 2001, pages 1776 - 1780, XP003001599 *
SUMINAMI Y.: "Tumor-associated ov-serpin, SCC Antigen, is involved in apoptosis", BULL. YAMAGUCHI MED. SCH., vol. 48, no. 3-4, 2001, pages 25 - 27, XP003001600 *
TAKEDA A. ET AL.: "Overexpression of serpin squamous cell carcinoma antigens in psoriatic skin", JOURNAL OF INVESTIGATIVE DERMATOLOGY, vol. 118, no. 1, 2002, pages 147 - 154, XP003002003 *
TEI K. ET AL.: "RNAi no Genri to Yuko na siRNA Sekkeiho. (Mechanism of RNA interference and the selection of highly effective siRNA sequences)", EXPERIMENTAL MEDICINE, vol. 23, no. 4, 15 February 2005 (2005-02-15), pages 107 - 111, XP003002008 *
TEI K. ET AL.: "RNAi no Mechanism to siRNA Hairetsu Sekkeiho. (Molecular machanism of RNA interference and the selection of highly effective siRNA sequences)", PROTEIN, NUCLEIC ACID AND ENZYME, vol. 49, no. 17, 2004, pages 2662 - 2670, XP003002009 *
TERAKI Y. ET AL.: "Byotai to Apoptosis Hifu Shikkan", CLINICAL IMMUNOLOGY, vol. 38, no. SUPPL. 20, 2002, pages 335 - 341, XP003002004 *
YOSHINARI K. ET AL.: "siRNA no Bunshi Sekkei", DRUG DELIVERY SYSTEM, vol. 19, no. 4, 2004, pages 348 - 355, XP003002010 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN102127589B (zh) 2013-01-02
EP2375250A3 (en) 2011-11-23
CN101141982A (zh) 2008-03-12
EP2375250B1 (en) 2014-07-16
CN101141982B (zh) 2012-10-17
CN102127589A (zh) 2011-07-20
US20110305783A1 (en) 2011-12-15
EP1859806A4 (en) 2010-05-26
EP1859806A1 (en) 2007-11-28
KR20070112208A (ko) 2007-11-22
US7829547B2 (en) 2010-11-09
JP4585342B2 (ja) 2010-11-24
EP2375250A2 (en) 2011-10-12
US20090123572A1 (en) 2009-05-14
JP2006254875A (ja) 2006-09-28
CN102552564A (zh) 2012-07-11
ES2484696T3 (es) 2014-08-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Descargues et al. Corneodesmosomal cadherins are preferential targets of stratum corneum trypsin-and chymotrypsin-like hyperactivity in Netherton syndrome
EP2244728B1 (en) Use of serine protease inhibitors in the treatment of skin diseases
KR100844914B1 (ko) 탄력섬유형성의 불완전, 결여 혹은 해체로 인한 질병을제어하는 라이실 옥시다제의 동종효소의 활성 촉진
WO2006100797A1 (ja) 扁平上皮細胞癌関連抗原の発現の抑制による乾癬、扁平上皮細胞癌及び/又は不全角化の治療のための方法及び医薬組成物
EP1860437B1 (en) Evaluation method for skin condition utilizing squamous cell carcinoma-related antigen as measure
CA2770185C (en) Fast acting snare-cleaving enzymes
KR20040107418A (ko) 탄력섬유의 형성을 촉진하는 라이실 옥시다제유사(ｌｏｘｌ) 동종효소의 합성 및 활성 촉진
KR20030067696A (ko) 질병의 진단 및 치료
KR101500755B1 (ko) Ｌｏｘ 단백질과 ｎｒａｇｅ 단백질 사이의 정상적인동시발현 및 상호작용을 복구시키기 위한 물질
Yoshida Klk8, a multifunctional protease in the brain and skin: analysis of knockout mice
Zheng et al. PD184352 exerts anti-inflammatory and antioxidant effects by promoting activation of the Nrf2/HO-1 axis
US7595158B2 (en) Bcl2L12 polypeptide activators and inhibitors
Takahashi et al. Ultraviolet B irradiation induces apoptosis of keratinocytes by direct activation of Fas antigen
WO2016063991A1 (ja) 角層剥離の抑制又は亢進に起因する肌状態を改善するための美容方法及び評価方法
JP4527451B2 (ja) 弾性繊維の形成を刺激するための、ｌｏｘｌ（リシルオキシダーゼ類似）アイソフォームの合成及び活性の刺激
JP7474736B2 (ja) 白斑の予防又は改善剤の評価又は選択方法
JP4954450B2 (ja) 弾性繊維形成の不全、欠損又は無秩序による病状に対処するための、リシルオキシダーゼのアイソフォームの活性の誘導
JP2005281140A (ja) Ｓｃｃａによるｊｎｋ−１キナーゼ活性の抑制方法
Hsu green Tea

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 11886475

Country of ref document: US

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 200580049169.5

Country of ref document: CN

Ref document number: 1020077021451

Country of ref document: KR

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2005787935

Country of ref document: EP

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: RU

WWW Wipo information: withdrawn in national office

Ref document number: RU

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 2005787935

Country of ref document: EP