KR20070112208A - 편평상피세포암 관련 항원 발현의 억제에 의한 건선,편평상피세포암 및/또는 부전각화의 치료를 위한 방법 및의약 조성물 - Google Patents

Abstract

제1의 관점에 있어서, 본 발명은, 세포의 편평상피세포암 관련 항원(SCCA)의 발현을 억제함으로써, 건선 및 편평상피세포암으로 이루어지는 군에서 선택되는 질환을 치료 및/또는 예방하는 방법을 제공한다. 다른 관점에 있어서, 본 발명은, 표피 부전각화를 억제하는 물질의 스크리닝 방법으로서, 편평상피세포암 관련 항원-1(SCCA-1)이 보유하는 시스테인　프로테아제 저해 활성을 억제하는 후보 물질의 활성을 지표로 하는 것을 특징으로 하는 방법도 제공한다.

Description

편평상피세포암 관련 항원 발현의 억제에 의한 건선, 편평상피세포암 및/또는 부전각화의 치료를 위한 방법 및 의약 조성물{METHOD AND PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR TREATING PSORIASIS, SQUAMOUS CELL CARCINOMA AND/OR PARAKERATOSIS BY INHIBITING EXPRESSION OF SQUAMOUS CELL CARCINOMA-RELATED ANTIGEN}

본 발명은, 세포의 편평상피세포암 관련 항원(Squamous Cell Carcinoma Antigen, 이하 「SCCA」라고 부름)의 발현을 억제함으로써, 건선 및 편평상피세포암으로 이루어지는 군에서 선택되는 질환을 치료 및/또는 예방하는 방법, 의약 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한, 편평상피세포암 관련 항원-1(SCCA-1)이 보유하는 시스테인 프로테아제 저해 활성을 억제하는 후보 물질의 활성을 지표로 하는, 표피 부전각화를 억제하는 물질의 스크리닝 방법, 그와 같은 방법에 의해 스크리닝된 표피 부전각화를 억제하는 물질, 그리고 나아가서는 표피 세포 중의 SCCA-1의 카스파아제-14 저해 활성을 억제함으로써, 표피 세포 각화의 정상화를 도모하여, 표피 부전각화를 억제하는 방법을 제공한다.

SCCA는 편평상피암 세포로부터 추출되는 항원이며, 자궁경부, 폐, 식도, 피부의 편평상피세포암에서 높은 혈중 농도를 보여, 편평상피세포암의 진단에 자주 이용되고 있다(H. Kato et al. Cancer 40 : 1621-1628(1977) ; N. Mino et al., Cancer 62 : 730-734(1988)). 특히, SCCA의 혈중 레벨은 편평상피세포암의 진행 단계, 악성도, 종양의 크기 등에 양호하게 상관하기 때문에, 암의 조기 발견뿐만 아니라, 암 치료 효과의 평가나 재발 우려의 진단 등에 있어서 특히 유효한 암 마커이다.

SCCA는 또한, 건선 표피의 상층에 있어서 발현의 항진이 인정되는 것으로도 알려졌다(Takeda A. 등, J. Invest. Dermatol. (2002) 118(1), 147-154). 건선은 피부병의 하나이며, 표피 세포의 증식ㆍ분화 이상과 염증 세포 침윤을 특징으로 하는 만성, 재발성의 염증성 부전각화증인 건선이 있다. 건선은 유전적 소인에 여러 가지 환경 인자가 가해져 발증된다고 생각된다(Hopso-Havu et al .British Journal of Dermatology(1983) 109, 77-85).

SCCA는 염색체 18q21.3 상에 탠덤하게 나란히 늘어서 있는 2개의 유전자 SCCA-1 및 SCCA-2 유전자에 의해 코드된다. 이들에 의해 코드되는 단백질, SCCA-1 및 SCCA-2는 함께 분자량 약 45,000의 단백질이며, 매우 상동성이 높지만, 반응 부위의 아미노산 배열이 달라, 다른 기능을 갖고 있다고 생각되고 있다(Schick et al. J. Biol. Chem. (1997) 27213, 1849-55). 편평포피세포암이나 건선 등의 질환에 있어서 SCCA-1 및 SCCA-2가 고발현하는 것은 알고 있었지만, 이들이 질환 세포에 있어서 어떠한 기능을 하고 있는지는 분명하지 않았다.

한편, 케라티노사이트는 종말 분화함으로써, 유해한 환경에 대한 「각화층」이라 불리는 보호 장벽을 형성하는 기능을 갖는 것으로 알려졌다. 종말 분화의 프 로세스는, 분화 프로그램을 기초로 정확하게 제어되며, 증식형 기저 세포에서부터 시작하여, 유극 세포, 과립 세포, 그리고 마지막으로 각질 세포에 이른다. 과립 세포에서 각화 세포에의 과도기에는, 케라티노사이트의 내측 및 외측에 극적인 변화가 생긴다. 케라티노사이트는 핵, 세포 소기관을 잃고, 한편 주위의 지질층, 각화외피라 불리는 강화된 세포막 및 케라틴 패턴을 획득한다. 케라틴 패턴은 내부 구조가 유연하고, 게다가 긴장한 상태를 유지한다. 과거의 보고에 따르면, 분화중인 케라티노사이트는 DNA 단편화 및 TUNEL 양성 세포의 존재 등, 아폽토시스의 특징을 보인다(Haake A. R., J. Invest. Dermatol. 101, 107-12(1993)). 인간 각화 세포 추출물 중에는 카스파아제양 활성이 검출되고, 그리고 인간 케라티노사이트 중에는 몇 개인가의 카스파아제가 발현되고 있다. 그러나, 다른 보고에 따르면, 전형적인 프로 아폽토시스 카스파아제, 예컨대 카스파아제-3, -6 및 -7은 종말 분화할 때에 활성화되지 않는다는 것이다. 분화의 이상은 종종 「부전각화」라고 불리는 각화층 속의 핵의 항구적인 존재를 초래한다. 부전각화는 피부의 배리어 기능의 심각한 파괴를 가져온다. 그러나, 어떠한 인자가 탈핵 프로세스에 관여하고 있는지, 또 이 프로세스가 케라티노사이트 분화 중에 어떻게 하여 조절되는지는 오늘까지 충분히 해명되지 못하고 있었다.

카스파아제는 잘 알려진 아폽토시스 세포사 실행 인자이며, 이들은 기질을 아스파라긴산 잔기의 후방에서 절단하는, 진화의 과정에서 보존된 시스테인 프로테아제이다. 포유동물의 카스파아제는 그 구조 및 기능에 따라서 3개의 서브군, 즉 개시 카스파아제, 실행 카스파아제 및 염증성 카스파아제로 나뉜다. 실행 카스파아 제의 중요한 역할은, CAD(카스파아제 활성화형 DN아제)의 인히비터 ICAD를 분해하는 것으로, 결과적으로 CAD를 활성 뉴클레아제로서 유리시키는 점에 있다(Enari M. et al., Nature 391, 43-50(1998)). 카스파아제 활성은 여러 가지 분자로 조절된다. 특히, 몇 개인가의 카스파아제와 직접적으로 연계하는 저해적 단백질군이 3가지 있다. 바큐로바이러스 항아폽토시스성 단백질 p35는 세린 및 그 밖의 시스테인 프로테이나제 12에 작용하지 않고, 카스파아제-1, -3, -6, -7, -8 및 -10을 저해한다(Zhou Q. et al., Biochemistry 37, 10757-65(1998)). 바큐로바이러스는 또한 다른 항아폽토시스성 단백질, 아폽토시스성 단백질 인히비터(IAP)를 합성한다. IAP의 상동체는 포유동물에게 있어서도 발견되고 있다(Verhagen A. M. et al., Genome Biol. 2, REVIEWS 3009(2001)). 포유동물 IAP는 카스파아제-14를 저해함으로써, 또는 프로 아폽토시스 촉진 인자, 예컨대 DIABLO/Smac로 길항함으로써, 아폽토시스를 블록한다(Wu G. Nature 408, 1008-12(2000)). 시토킨 응답 수식 인자 A(Crm A)는 우두바이러스의 유전자 생성물이며, 아폽토시스성 카스파아제 및 염증성 카스파아제를 저해할 수 있다(Garcia-Calvo Metal. J. Biol. Chem. 273, 32608-13(1998)). 흥미롭게도, Crm A는 세르핀 초과(superfamily)에 속하고, 세르핀의 일부, 예컨대 PI-9 및 PAI-1이 카스파아제-1 및 카스파아제-3의 각각과의 상호작용에 의해서 아폽토시스를 억제할 수 있음이 시사되고 있다(Annand R. R. et al., Biochem. J. 342Pt3, 655-65(1999)). 케라티노사이트의 종말 분화가 아폽토시스 현상의 일부인지의 여부, 또, 이 프로세스에 있어서 임의의 조절 단백질이 관여하는 것인지의 여부를 아는 것은 흥미롭다.

카스파아제-14는 카스파아제 패밀리의 최신 멤버이며, 오로지 분화의 케라티노사이트에 있어서 발현된다. 카스파아제-14는 카스파아제 패밀리 멤버 사이에서 상동인 EST로서 확인되었다. 최근의 연구가 보인 바에 따르면, 각화 세포 속의 카스파아제-14는 프로세싱되어 헤테로다이머로 되고, 그리고 카스파아제-1에 대응하는 합성 기질 Trp-Glu-His-Asp-AFC에 대하여 효소 활성을 보인다는 것이다(Mikolajczyk J. et al., Biochemistry 43, 10560-9(2004)). 이 가수분해 활성은 단백질 분해 절단 및 코스모트로픽염의 존재를 필요로 한다. 카스파아제-14의 일차 구조는 염증성 카스파아제, 예컨대 카스파아제-1, -4 및 -5와 매우 가깝지만, 분화된 케라티노사이트에 한정되는 카스파아제-14의 발현은 케라티노사이트 종말 분화에 있어서의 다른 형태에서의 관여를 시사한다(Lippens S. et al., Cell Death Differ. 7, 1218-24(2000)). 그러나, 카스파아제-14의 활성화 메카니즘, 천연 기질 또는 조절 인자는 아직 해명되고 있지 못하다.

본 발명자는 SCCA가 관여하는 표피의 생리학적 메카니즘의 해명을 목적으로 하는 연구를 하고 있었던 바, SCCA가 세포의 아폽토시스를 억제하는 작용을 갖는 항아폽토시스 인자임을 놀랍게도 발견했다.

간단히 설명하면, 본 발명자는 피부 UV 방어 메카니즘을 검토하여, 인간 피부에의 UV 조사에 의해 유극층 및 과립층에 있어서 SCCA의 발현이 강력하게 항진하고 있음을 밝혔다. 그래서, SCCA 발현이 인정되지 않는 3T3 세포에 인간 SCCA-1 및 SCAA-2 유전자를 도입하여 안정 발현계를 확립하고, SCCA 안정 발현계 세포의 UV 조사에 의한 아폽토시스를 조사한 바, 어느 SCCA 안정 발현계에 있어서도 UV 조사에 의한 아폽토시스가 의미 있게 감소하는 것이 분명하게 되었다.

또한, SCCA를 고발현하는 HaCat 세포에 pSilencer 벡터로 항상적으로 siRNA를 발현시키는 RNA 간섭법에 의해 SCCA-1 및 SCCA-2의 녹다운(siSCCA)세포주를 수립하여, 그 세포주에 UV 조사를 한 결과, 컨트롤주와 비교하여, SCCA 녹다운 세포의 아폽토시스율이 의미 있게 높음을 보였다. 이상으로부터, 본 발명자는 SCCA가 아폽토시스를 억제하는 작용을 갖는 단백질이라고 결론지을 수 있었다.

암이나 건선 등, 세포의 증식ㆍ분화 이상을 동반하는 질환에 있어서는, 암 세포 등은 아폽토시스의 억제에 의해 세포사로부터 벗어나, 이상 증식을 계속하는 것으로 생각된다. 따라서, SCCA의 고발현성을 보이는 세포에 있어서는, 항아폽토시스 작용을 갖는 SCCA가 그 세포사를 억제하여, 결과적으로 그 세포의 이상 증식으로 이어지는 것이 분명하다. 따라서, 아폽토시스 억제 작용을 갖는 SCCA의 발현을 억제하면, 편평상피세포암이나 건선 등, 세포의 증식 이상 등을 동반하는 질환을 치료ㆍ예방할 수 있음이 분명하다.

본 발명은, 상기한 견지에 비추어, SCCA 고발현 세포의 증식 이상을 동반하는 질환, 예컨대 암, 특히 편평상피세포암, 나아가서는 건선 등의 치료ㆍ예방을 위한 방법, 의약 조성물의 제공을 과제로 한다.

또한, 본 발명은, 표피의 부전각화의 메카니즘을 해명함으로써, 종래 기술과는 다른 완전히 신규의 어프로치로 표피 부전각화의 억제ㆍ치료 수단을 개발하는 것도 과제로 한다. 부전각화를 동반하는 아토피성 피부염, 건선과 같은 피부병에 대한 특효약이 없다는 것을 고려하면, 피부 과학, 화장품학 분야에 있어서의 본 발명이 미치는 영향은 크다.

제1 관점에 있어서, 본 발명은 세포의 편평상피세포암 관련 항원(SCCA)의 발현을 억제함으로써, 건선 및 편평상피세포암으로 이루어지는 군에서 선택되는 질환을 치료 및/또는 예방하는 방법을 제공한다. 바람직하게는, 세포의 SCCA 발현의 억제는, SCCA를 코드하는 유전자의 RNA 간섭에 의해 실시한다. 보다 적합한 형태에 있어서, RNA 간섭에는, 서열번호 1의 올리고뉴클레오티드 또는 그 이변체를 포함하는 센스 올리고뉴클레오티드쇄 및 서열번호 3의 올리고뉴클레오티드 또는 그 이변체를 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오티드쇄를 포함하여 이루어지는 이중쇄 RNA를 이용한다. 여기서, 상기 서열번호 1의 올리고뉴클레오티드의 이변체는 SCCA를 코드하는 유전자의 뉴클레오티드 번호 46∼66위치에 대하여 매우 엄격한 조건 하에서 하이브리드화하는 배열을 지니고, 그리고 상기 서열번호 3의 올리고뉴클레오티드의 이변체는 SCCA를 코드하는 유전자의 뉴클레오티드 번호46∼66위치의 상보쇄에 대하여 높은 엄격한 조건 하에서 하이브리드화하는 배열을 갖는다.

상기 관점에서의 다른 형태에 있어서, 본 발명은 세포의 SCCA의 발현을 억제함으로써, 건선 및 편평상피세포암으로 이루어지는 군에서 선택되는 질환을 치료 및/또는 예방하기 위한 의약 조성물을 제공한다. 바람직하게는, 의약 조성물은, SCCA를 코드하는 유전자에 대하여 RNA 간섭하는 단쇄 RNA를 사용하게 하는 이중쇄 RNA를 함유한다. 보다 적합한 형태에 있어서, 상기 의약 조성물은, 서열번호 1의 올리고뉴클레오티드 또는 그 이변체를 포함하는 센스 올리고뉴클레오티드쇄 및 서열번호 3의 올리고뉴클레오티드 또는 그 이변체를 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오티드쇄를 포함하여 이루어지는 이중쇄 RNA를 함유한다. 여기서, 상기 서열번호 1의 올리고뉴클레오티드의 이변체는 SCCA를 코드하는 유전자의 뉴클레오티드 번호 46∼66위치에 대하여 매우 엄격한 조건 하에서 하이브리드화하는 배열을 지니고, 그리고 상기 서열번호 3의 올리고뉴클레오티드의 이변체는 SCCA를 코드하는 유전자의 뉴클레오티드 번호 46∼66위치의 상보쇄에 대하여 매우 엄격한 조건 하에서 하이브리드화하는 배열을 갖는다.

적합한 형태에 있어서, 상기 이중쇄 RNA는 벡터, 예컨대 pSilencer 벡터 속에 함유된 형태에 있다.

본 발명은 또한, SCCA의 발현이 억제된 세포를 조제하기 위한 방법을 제공한다. 바람직하게는, SCCA 발현의 억제는 SCCA를 코드하는 유전자의 RNA 간섭에 의해 이루어진다. 보다 적합한 형태에 있어서, RNA 간섭에는, 서열번호 1의 올리고뉴클레오티드 또는 그 이변체를 포함하는 센스 올리고뉴클레오티드쇄 및 서열번호 3의 올리고뉴클레오티드 또는 그 이변체를 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오티드쇄를 포함하여 이루어지는 이중쇄 RNA를 이용한다. 여기서, 상기 서열번호 1의 올리고뉴클레오티드의 이변체는 SCCA를 코드하는 유전자의 뉴클레오티드 번호 46∼66위치에 대하여 매우 엄격한 조건 하에서 하이브리드화하는 배열을 지니고, 그리고 상기 서열번호 3의 올리고뉴클레오티드의 이변체는 SCCA를 코드하는 유전자의 뉴클레오티드 번호 46∼66위치의 상보쇄에 대하여 매우 엄격한 조건 하에서 하이브리드화하는 배열을 갖는다. 본 발명은 또한, 상기 방법에 의해 SCCA의 발현의 억제된 세포 및 그와 같은 세포를 함유하는 포유동물도 제공한다.

따라서, 본 발명에 의해, 편평상피세포암 및 건선으로 이루어지는 군에서 선택되는 질환의 치료ㆍ예방을 위한 방법, 의약 조성물이 제공된다.

또 다른 관점에 있어서, 본원은 이하 발명의 형태도 포함한다.

[1] 표피 부전각화를 억제하는 물질의 스크리닝 방법으로서, 편평상피세포암 관련 항원-1(SCCA-1)이 보유하는 시스테인 프로테아제 저해 활성을 억제하는 후보 물질의 활성을 지표로 하는 것을 특징으로 하는 방법.

[2] 이하의 분석계 (1), (2), (3) :

(1) 시스테인 프로테아제의 활성을 측정하여, 그 측정치[x]를 얻는다 ;

(2) i) 후보 물질을 상기 (1)에 규정된 시스테인 프로테아제의 효소 활성적으로 동등량과 혼합하여, 인큐베이션한다 ; 그리고 ii) 상기 (2) i)의 인큐베이션 혼합물의 시스테인 프로테아제 활성을 상기 (1)과 동일 조건 하에서 측정하여, 그 측정치[y]를 얻는다 ; 및

(3) i) SCCA-1과, (2) i)에서 사용한 것과 동량의 상기 후보 물질을 혼합하여, 인큐베이션한다; ii) 상기 (3) i)의 인큐베이션 혼합물을 상기 (1)에 규정된 시스테인 프로테아제의 효소 활성적으로 동등량과 혼합하여, 상기 (2) i)과 동일 조건 하에서 인큐베이션한다; 그리고 iii) 상기 (3) ii)의 인큐베이션 혼합물의 시스테인 프로테아제 활성을 상기 (1)과 동일 조건 하에서 측정하여, 그 측정치[z]를 얻는다;

를 포함하여 이루어지며, 여기서 이하의 조건

{[z]/[x]×100}-{100-[y]/[x]×100}>0

을 만족하면, 상기 후보 물질은, SCCA-1이 보유하는 시스테인 프로테아제 저해 활성을 억제하는 활성을 갖는 것으로 결정되어, 표피 부전각화를 억제하는 물질로서 선정되는, [1]의 방법.

[3] {[z]/[x]×100}-{100-[y]/[x]×100}>3을 만족하는 것을 조건으로 하는, [3]의 방법

[4 {[z]/[x]×100}>{100-[y]/[x]×100}>16을 만족하는 것을 조건으로 하는, [3]의 방법

[5] 상기 시스테인 프로테아제가 카스파아제-14인 [1]∼[4] 중 어느 방법.

[6] 상기 시스테인 프로타아제가 파파인인 [1]∼[4] 중 어느 방법.

[7] 애기부들 엑기스, 포도 엑기스, 토마토 엑기스, 오이 엑기스, 키위 엑기스 및 대추 엑기스로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 또는 여러 종류의 생약을 활성 성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하는, 표피 부전각화를 억제하는 피부 외용 조성물, 특히 미용학적 피부 외용 조성물.

[8] 수촉 엑기스를 함유하는 것을 특징으로 하는 [7]의 피부 외용 조성물.

[9] 상기 표피 부전각화가 건선을 원인으로 하는 [7] 또는 [8]의 조성물.

[10] 상기 표피 부전각화가 아토피성 피부염을 원인으로 하는 [7] 또는 [8]의 조성물.

[11] 표피 세포 중의 SCCA-1의 카스파아제-14 저해 활성을 억제함으로써, 표피 세포 각화의 정상화를 도모하여, 표피 부전각화를 억제하는 방법.

[12] 표피에 애기부들 엑기스, 포도 엑기스, 토마토 엑기스, 오이 엑기스, 키위 엑기스 및 대추 엑기스로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 또는 여러 종류의 생약을 활성 성분으로서 함유하는 피부 외용 조성물을 도포함으로써, 표피 세포 중의 SCCA-1의 카스파아제-14 저해 활성을 억제하는 [11]의 방법.

[13] 상기 피부 외용 조성물이 애기부들 엑기스를 함유하는 것을 특징으로 하는 [12]의 방법.

따라서, 본 발명에 의해, 종래 기술과는 다른 완전히 신규의 어프로치로 표피 부전각화의 억제ㆍ치료 수단의 제공도 가능하게 된다.

[14] 표피 부전각화를 억제하는 피부 외용 조성물, 특히 미용학적 또는 화장학적 피부 외용 조성물을 제조하기 위한, 애기부들 엑기스, 포도 엑기스, 토마토 엑기스, 오이 엑기스, 키위 엑기스 및 대추 엑기스로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 또는 여러 종류의 생약의 활성 성분으로서의 사용.

[15] 상기 생약이 애기부들 엑기스인 [7]의 사용.

[16] 상기 표피 부전각화가 건선을 원인으로 하는 [14] 또는 [15]의 사용.

[17] 상기 표피 부전각화가 아토피성 피부염을 원인으로 하는 [14] 또는 [15]의 사용.

도 1은 노광 및 비노광 부위의 표피에 있어서의 SCCA의 발현을 도시한다.

도 2는 UV 조사에 의한 표피에 있어서의 SCCA의 발현의 변동을 도시한다.

도 3은 배양 인간 각화 세포에 있어서의 SSCA 발현에 대한 UV 조사의 영향을 도시한다.

도 4는 SCCA 고발현 세포와 SCCA 비발현 세포와의, UV 조사에 의해 유도되는 아폽토시스율의 비교를 도시한다.

도 5는 SSCA 녹다운 세포주의 수립을 도시한다.

도 6은 SCCA 녹다운 세포와 컨트롤 세포와의, UV 조사에 의해 유도되는 아폽토시스율의 비교를 도시한다.

도 7은 피부 추출물의 웨스턴 블롯 분석을 도시한다. H-99 항체 및 h14D¹⁴⁶ 항체를 사용함으로써, 티모겐 및 활성 카스파아제-14의 존재를 면역 블롯법으로 분석했다. 10 μg(레인 1, 2 및 4) 및 1 μg(레인 3)의 전체 피부 추출물, 피부 등가 추출물 및 각화 세포 추출물을 적용했다.

도 8은 정제 카스파아제-14의 분석을 도시한다. (A) SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 후, Superdex 75 크로마토그래피로부터 얻어진 획분 No. 25를 PVDF막으로 옮기고, 그리고 쿠마지 브릴리언트 블루로 염색했다. 17 KDa 및 11 KDa의 2개의 단백질 밴드가 나타났다. (B) H-99, h14D¹⁴⁶ 및 C20 항체를 사용한 웨스턴 블롯 분석. 17 KDa 밴드가 H99 항체 및 h14D¹⁴⁶ 항체의 쌍방에 대하여 양성을 보이고, 또한 11 KDa 밴드가 C20 항체로 인식되는 것을 나타냈다.

도 9는 정제 카스파아제-14에 대한 여러 가지 합성 인히비터의 효과를 나타낸다. 카스파아제에 대한 펩티드 인히비터(YVAD, VDVAD, DEVD, VEID, IETD, LEHD, DNLD) 및 시스테인 프로테이나제(IAA) 및 세린 프로테이나제(AEBSF)에 대한 클래스 특이적 인히비터와 함께, 카스파아제-14를 인큐베이트했다. 1.3 M 시트르산나트륨 및 5 mM DTT의 존재에 있어서 WEHD-MCA를 기질로서 사용하여, 잔류 효소 활성을 측정했다. 시험한 효소 농도는 각각 5, 2.5 및 1.25 μM으로 했다. 값은 중복 분석의 평균치를 나타낸다.

도 10은 (A) ICAD에 대한 정제 카스파아제-14의 절단 활성을 도시한다. (B) FL331 항체를 사용한 웨스턴 블롯 분석을 도시한다. 33 KDa 및 27 KDa의 절단 생성물이 나타내어졌다. 10 μM SCCA-1을 이용한 앞의 인큐베이션에 의해서, ICAD 절단은 완전히 억제되었다. 코스모트로픽염의 존재에 있어서만, ICAD 분해가 관찰되었다. 아미노 말단에 특이적인 항체를 사용한 웨스턴 블롯 분석은 카스파아제-14와의 연장된 인큐베이션 중에 인택트한 ICAD 분자의 소실을 보였다. 혼합물에 SCCA-1을 첨가하면, ICAD 분해는 이제는 검출되지 않고, 16시간의 인큐베이션 후, 영향을 받지 않는 채 그대로였다(B). (C) 합성 카스파아제 기질에 대한 가수분해 활성을, 코스모트로픽염의 존재에 있어서 조사한 결과를 도시한다.

도 11은 활성 카스파아제-14 및 TUNEL 포지티브 세포의 국재를 도시한다. 정상적인 인간 피부의 얇은 절편을 H-99 항체(A), h14D¹⁴⁶ 항체(B) 및 TUNEL(C)로 염색했다. Texas-Red를 형광 검출(B)을 위해 사용했다. TUNEL에는 FITC를 이용하고, 그리고 면역 염색에는 Texas Red를 이용하여, TUNEL 및 카스파아제를 위한 이중 염색을 실시했다.

도 12는 ICAD 및 부전각화 핵의 공국재(共局在)를 도시한다. 정상적인 인간 피부의 얇은 절편을 항ICAD 항체 FL331로 염색했다. 아래 표피의 대부분의 핵은 이 항체에 대하여 양성을 보였다. AD 환자 피부에서 유래되는 각화 세포의 표면에 나타나는 층상의 ICAD를 항체로 염색했을 때에는, 여러 가지 사이즈의 양성 부위가 보였다(B). 핵 클러스터를 나타내는 요오드화프로피듐(PI)에 의한 핵 염색이 종종 인정되었다(C). 동일한 부위의 밝은 시야는 표면상의 오버랩된 스케일을 나타냈다(D). 중첩 화상은 부전각화 부위에 있어서만 ICAD가 존재하는 것을 분명히 했다(E). 밝은 시야에 있어서의 핵 염색의 중첩 화상도 나타내고 있다(F).

도 13은 SCCA-1 및 부전각화 핵의 공국재를 도시한다. SCCA-1은 정상적인 피부 절편 내에서는 거의 검출할 수 없었다. AD 환자 피부의 표면에 나타나는 층에 있어서, SCCA-1 양성 부위는 보였다(H). 이들 부위 상에서만, 핵 클러스터가 인정되었다(I). 밝은 시야를 (J)에 나타낸다. 중첩 화상은 SCCA-1 양성 부위가, 바람직하게는 미소화 핵이 존재하는 부위와 겹치는 것을 나타낸다(K). SCCA-1 염색 및 밝은 시야에 대응하는 다른 중첩 화상도 나타낸다(L).

건선 및/또는 편평상피세포암의 치료를 위한 방법 및 의약 조성물

본 발명자는, SCCA가 아폽토시스를 억제하는 작용을 갖는 단백질임을 해명했다. 따라서, SCCA의 발현을 억제함으로써, 암이나 건선 등, 편평상피세포암 항원을 발현하는 세포의 증식ㆍ분화 이상을 동반하는 질환을 치료ㆍ예방할 수 있음이 분명하다. 편평상피세포암으로서는, 예컨대 자궁경, 폐, 식도, 상악, 피부 등의 기관에 있어서의 편평상피세포암을 들 수 있다.

SCCA는 전술한 바와 같이 편평상피암 세포나 건선 표피에 존재하는 분자량 약 45,000의 단백질이다. SCCA-1 및 SCCA-2의 아미노산 배열 및 이들을 코드하는 핵산 배열은 Takeda A et al. J. Invest. Dermatol. 118, 147-154(2002)(상기함)에 기재되어 있다.

세포의 SCCA의 발현 억제는, 여러 가지 유전학적 기술, 예컨대 RNA 간섭법, 안티센스 RNAㆍDNA법, 펩티드 및 RNAㆍDNA 압타머, 부위 특이적 흠실(欠失), 상동 재결합, 도미넌트 네가티브 대립 유전자, 인트라 보디 등, 여러 가지 기술에 의해 달성할 수 있지만, RNA 간섭법에 의한 것이 특히 바람직하다.

RNA 간섭법은, 표적 유전자의 일부를 코드하는 mRNA의 일부에 대하여 상보성인 21∼23 염기쌍 정도의 센스 올리고뉴클레오티드를 포함하는 쇄와 상기 mRNA의 일부에 대하여 상동인 21∼23 염기쌍 정도의 안티센스 올리고뉴클레오티드를 포함하는 쇄로 구성되는 이중쇄 RNA를 세포에 도입함으로써 표적 유전자의 발현을 억제하는 방법이다. 이 방법은, 유전자의 코드 영역에서 유래하는 이중쇄 RNA의 간섭 특성에 기초한 것으로, 선충의 유전학적 연구에 있어서 우수한 유용성을 지님이 증명되고 있으며(Fire 등, Nature (1998)391 : 806-811), 노랑초파리나 포유동물에게 있어서도 기능 결손 표현형을 산출하기 위해서 이용할 수 있다.

본 방법에서는, SCCA 유전자의 적당한 표적 영역, 바람직하게는 뉴클레오티드 길이가 약 18∼23개인 영역에 상보적인 배열(센스 올리고뉴클레오티드)과 이 센스 배열에 상보성의 뉴클레오티드 길이 약 18∼23개인 배열(안티센스 올리고뉴클레오티드)로 구성되는 이중쇄 RNA(dsRNA)를 in vitro 합성한다. 바람직하게는, 이중 쇄 RNA는 SCCA 유전자의 뉴클레오티드 번호 46∼66위치의 배열에 상보성의 배열(ACATGAACTT GGTGTTGGCT T : 서열번호 1)을 포함하는 센스 올리고뉴클레오티드와, 상기 뉴클레오티드 번호 46∼66위치의 배열과 상동의 배열(AAGCCAACAC CAAGTTCATG T ; 서열번호 3)을 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오티드로 구성된다. 센스 및 안티센스 올리고뉴클레오티드 전체의 길이는 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예컨대 25 뉴클레오티드 이상 100 뉴클레오티드 이하, 바람직하게는 40 뉴클레오티드 이상 80 뉴클레오티드 이하, 보다 바람직하게는 50 뉴클레오티드 이상 70 뉴클레오티드 이하 정도이다.

센스 올리고뉴클레오티드는 서열번호 1의 올리고뉴클레오티드의 이변체를 포함하는 올리고뉴클레오티드라도 좋다. 이 이변체는 SCCA를 코드하는 유전자의 뉴클레오티드 번호 46∼66위치에 대하여 매우 엄격한 조건 하에서 하이브리드화하는 배열을 갖는 것이 바람직하다. 또한, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 서열번호 3의 올리고뉴클레오티드의 이변체를 포함하는 올리고뉴클레오티드라도 좋다. 이 이변체는 SCCA를 코드하는 유전자의 뉴클레오티드 번호 46∼66위치의 상보쇄에 대하여 매우 엄격한 조건 하에서 하이브리드화하는 배열을 갖는 것이 바람직하다. 여기서 높은 가혹한 하이브리다이제이션 조건이란, 예컨대 나트륨 농도가 약 10∼40 mM, 바람직하게는 약 20 mM, 온도가 약 50∼70℃, 바람직하게는 약 60∼65℃인 것을 포함하는 조건을 말한다.

얻어진 이중쇄 RNA는, 표적 세포의 직접 도입을 하거나, 또는 dsRNA를 프로모터, 타미네이터 등의 전사에 필요한 요소를 갖는 벡터에 미리 연결하고 나서 표 적 세포에 도입하더라도 좋다. 벡터로서는, 당업자에게 주지된 여러 가지 것을 사용할 수 있는데, pSilencer 벡터(Ambion)가 바람직하다. 상기 이중쇄 RNA를 함유하는 벡터를 세포에 도입함으로써, 세포 내에서의 전사에 의해, 서열번호 1(또는 그 이변체)의 센스쇄와 서열번호 3(또는 그 이변체)의 안티센스쇄 및 그 센스쇄와 안티센스쇄를 잇는 쇼트 헤어핀 RNA(shRNA)이 생성된다. shRNA는 이어서 세포 내의 뉴클레아제, 다이서에 의해 21∼23 염기쌍 정도의 단쇄 RNA(short interfering RNA)로 절단되어, 복합체 RISC를 형성하여 SCCA의 mRNA를 절단하는 RNA 간섭을 일으켜, 결과적으로 도입 세포에 의한 SCCA의 발현이 억제된다.

적합하게는, 본 발명에 있어서, SCCA의 발현을 억제하는 유전자, 예컨대 상기 이중쇄 RNA나 그 밖의 SCCA의 발현을 억제하는 유전자, 예컨대 안티센스 DNA 또는 RNA, 압타머 RNA 또는 DNA 등(이하, 단순히 「SCCA 발현 억제 유전자」라고 부름)을, SCCA의 발현을 억제하여, 그 결과 건선이나 편평상피세포암의 예방ㆍ치료를 위한 의약 조성물의 활성 성분으로서 사용된다. 상기 SCCA 발현 억제 유전자는 주사에 의해 직접 투여하거나, 그 유전자가 들어간 벡터 또는 플라스미드를 투여하는 방법에 의해 환부에 투여하더라도 좋다.

상기 벡터로서는, 아데노바이러스 벡터, 아데노 관련 바이러스 벡터, 헤르페스 바이러스 벡터, 왁시니아 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 등을 들 수 있으며, 이들 바이러스 벡터를 이용함으로써 효율적으로 SCCA 발현 억제 유전자를 투여할 수 있다. 또한, SCCA 발현 억제 유전자를 리포좀 등의 인지질 소포(小胞)에 도입하여, 그 리포좀을 투여하는 방법을 채용할 수도 있다. 리포좀은, 생분해성 재료 를 함유하는 폐쇄 소포이기 때문에, 리보솜과 유전자를 혼합함으로써, 리포좀 내부의 수층이나 지질 2분자층에 유전자를 유지시킨다(리포좀-유전자 복합체). 이어서, 상기 복합체를 세포와 함께 배양하면 복합체 중의 유전자가 세포 내에 받아들여진다(리포펙션법). 그리고, 얻어지는 세포를 이하의 투여 방법으로 투여하여도 좋다.

상기 의약 조성물의 투여 형태로서는, 통상의 정맥내, 동맥내 등의 전신 투여 외에, 종양이나 건선이 존재하는 각 조직에 국소 투여를 할 수 있다. 또한, 카테테르 기술, 외과적 수술 등과 조합한 투여 형태를 채용할 수도 있다. 본 발명의 의약 조성물의 투여량은 연령, 성별, 증상, 투여 경로, 투여 횟수, 제형에 따라 다르며, 의사 등에 의해 적절하게 결정될 것이다.

플라스미드 DNA를 직접 정맥 내에 투여하면, DNA가 혈중의 DNase 등에 의해서 바로 분해되어 버리기 때문에, 유전자를 발현시키는 것은 곤란하다. 그래서, 플라스미드 DNA를 이용하는 경우는, 플라스미드의 직접 주사법을 채용하는 것이 바람직하다. 이 방법은, 바이러스성 벡터를 이용한 방법에 비하여 벡터의 정제가 간단하기 때문에, 단시간에 대량으로 조제할 수 있어, 도입 유전자의 크기 및 주입시의 농도에 제한이 없는 등, 여러 가지 메리트를 갖는다(Verma I M et al., Nature 389 : 239-242, 1997).

DNA 직접 주사 방법은, 정제한 플라스미드 DNA를 생리식염수 등에 용해하여, 그것을 직접 근육 내에 주사하기만 하면 된다. 그 결과, 주사 부위 주변의 세포에 플라스미드 DNA가 받아들여져, 플라스미드 상의 진핵생물의 발현 유닛에 삽입된 유전자의 발현이 발생하여, 그 유전자 산물이 만들어진다. DNA 직접 주사법은, 현재 근육내 주사가 주류로 되어 있지만, 종양내(Yang J P et al., Gene. Ther. 3 : 542-548, 1996), 피내(Hengge U R et al., J. Clin. Invest. 97 : 2911-2916, 1996 ; Choate K A et al., Hum. Gene. Ther. 8 : 1659-1665, 1997) 등에의 플라스미드 DNA 직접 주사를 하는 것이 가능하다.

근육내 주사하는 플라스미드 DNA는, 예컨대 1 μg∼1 mg, 바람직하게는 25 μg∼100 μg의 DNA를 50 μl의 생리식염수에 용해하여 주사한다. 이에 따라, 4∼7일 후에 발현의 최고가를 얻을 수 있다.

SCCA의 발현 억제의 확인은, 예컨대 세포 중의 SCCA의 양을 직접 측정함으로써 행할 수 있다. 바람직하게는, 세포로부터 RNA를 추출하여, SCCA를 코드하는 mRNA의 양을 측정함으로써 결정한다. mRNA의 추출, 그 양의 측정도 당업계에 있어서 주지이며, 예컨대 RNA의 정량은 정량 폴리메라아제 연쇄 반응법(PCR)에 의해 이루어진다. 그 외에, SCCA의 측정은 SCCA에 특이적인 항체를 이용하여, 당업계에 있어서 주지의 방법, 예컨대 형광 물질, 색소, 효소 등을 이용하는 면역 염색법, 웨스턴 블롯법, 면역 측정 방법, 예컨대 ELISA법, RIA법 등, 다양한 방법에 의해서 실시할 수 있다. 이들 외에, SCCA의 기지의 생물 활성을 측정함으로써 SCCA의 발현량을 측정할 수도 있다. 그 밖에, SCCA의 발현은 in situ 하이브리다이제이션법이나 그 생물 활성의 측정을 통하여 결정할 수 있다.

본 발명에 의해 SCCA의 발현이 억제되는 세포는 바람직하게는 표피 세포, 예컨대 과립 세포, 유극 세포 등이라도 좋다. 또한, 그와 같은 세포를 갖는 포유동물로서는, 인간 이외에, 마우스, 래트, 햄스터, 모르모트, 토끼, 개, 고양이, 말, 소, 양, 돼지, 염소, 원숭이 등의 비인간 포유동물이라도 좋다. 본 발명에 관련된 동물 및 세포는, 예컨대 표피의 UV 방어 기구의 해명이나, UV에 의한 피부 상해를 예방 또는 억제하는 약제의 연구ㆍ개발이나 스크리닝에 이용되는 모델 동물이나 세포로서도 사용할 수 있다.

부전각화를 억제하는 물질의 스크리닝 방법, 이 방법에 의해 스크리닝된 물질 및 부전각화를 억제하는 방법

건선은 피부병의 하나이며, 표피 세포의 증식ㆍ분화 이상과 염증 세포 침윤을 특징으로 하는 만성, 재발성의 염증성 부전각화증이다. 건선은 유전적 소인에 여러 가지 환경 인자가 가해져 발증한다고 생각된다(Hopso-Havu et al., British Journal of Dermatology (1983) 109, 77-85). SCCA는 염색체 18q21.3 상에 탠덤하게 나란히 늘어서 있는 2개의 유전자 SCCA-1 및 SCCA-2 유전자에 의해 코드된다. 이들에 의해 코드되는 단백질, SCCA-1 및 SCCA-2는 모두 분자량 약 45,000의 단백질이며, 매우 상동성이 높지만, 반응 부위의 아미노산 배열이 달라, 다른 기능을 갖고 있다고 생각되고 있다(Schick et al. J. Biol. Chem. (1997) 27213, 1849-55).

본 발명에 따른 표피 부전각화를 억제하는 물질의 스크리닝 방법은, SCCA-1이 보유하는 시스테인 프로테아제 저해 활성을 억제하는 후보 물질의 활성을 지표로 한다. 시스테인 프로테아제로서는, 이상적으로는 카스파아제-14를 사용하는 것이 가장 바람직하지만, 그 밖의 카스파아제 패밀리, 혹은 입수 용이성을 고려하면, 주지된 모든 그 밖의 시스테인 프로테아제, 예컨대 파파인, 카테프신, 예컨대 카텝 신 B, 카텝신 L, 브로멜라인, 피신 등으로 대용할 수 있다.

적합한 형태에 있어서, 상기 스크리닝 방법은, 시스테인 프로테아제의 활성을 분석하는 계(1), 후보 물질만의 존재 하에서 시스테인 프로테아제의 활성을 분석하는 계(2), 및 후보 물질 및 SCCA-1을 미리 인큐베이션해 두고서, 그 인큐베이션 혼합물의 존재 하에서 시스테인 프로테아제의 활성을 분석하는 계(3)로 구성된다. 분석계(2)를 포함하게 함으로써, 후보 물질 자체가 미칠 수 있는 시스테인 프로테아제에 대한 영향을 알 수 있다. 한편, 분석계 (1), (2), (3)을 실시하는 순서는 특별히 제한되지 않으며, 분석 조건이 같다면, 분석은 같은 날에 하더라도 다른 날에 하더라도 좋다.

시스테인 프로테아제의 효소 활성의 측정은, 시스테인 프로테아제의 기질로서 관용의 것, 예컨대 Nα-벤조일-L-아르기닌4-니트로아닐리드염산염(L-BAPNA)을 이용하여, 당업자에게 주지된 방법에 의해 실시할 수 있다.

특히 적합한 형태에 있어서, 상기 스크리닝 방법은 다음과 같이 실시할 수 있다.

(1) 시스테인 프로테아제의 활성을 분석하는 계

적당한 분석용 완충액, 예컨대 HEPES 버퍼 속에서 시스테인 프로테아제를 소정 시간 인큐베이션한다. 이어서, 시스테인 프로테아제의 기질, 예컨대 L-BAPNA를 첨가하여, 소정 온도에서 소정 시간 인큐베이션한 후, 발색시켜, 시스테인 프로테아제의 효소 활성[x]을 측정한다.

(2) 후보 물질만의 존재 하에서 시스테인 프로테아제의 활성을 분석하는 계

상기 분석용 완충액과 후보 물질을 소정 시간 인큐베이션한 후, 시스테인 프로테아제를 첨가하여, (1)과 동일 조건 하에서 시스테인 프로테아제의 활성[y]을 측정한다. 이 시스테인 프로테아제 효소 활성[y]의, 상기 [x]에 대한 %{[y]/[x]×100}를 구한다.

{[y]/[x]×100}의 값은, 상기한 바와 같이 시험 물질이 갖는 시스테인 프로테아제 저해 활성의 기준이 되며, 즉 그 값이 100에 가까울수록 시험 물질이 갖는 시스테인 프로테아제 저해 활성이 낮음을 의미한다. 또한, 100에서 상기 {[y]/[X]×100}의 값을 뺀 값{100-[y]/[x]×100}도 구한다. 이 경우, 그 값이 0에 가까울수록 시험 물질이 갖는 시스테인 프로테아제 저해 활성이 낮음을 의미한다.

(3) SCCA-1, 후보 물질 및 시스테인 프로테아제를 함유하는 계의 효소 활성의 측정

상기 분석용 완충액과 SCCA-1을 혼합하고, 그것에 후보 물질을 가하여, 소정 시간 인큐베이션한다. (1) 또는 (2)와 동일 조건으로 시스테인 프로테아제의 활성[z]을 측정한다. 이 시스테인 프로테아제 효소 활성[z]의, 상기 [x]에 대한 %{[z]/[x]×100}를 구한다.

{[z]/[x]×100}의 값은 SCCA-1이 갖는 시스테인 프로테아제 저해 활성과 시험 물질 자체가 갖는 시스테인 프로테아제 저해 활성의 총계의 기준이 되어, 즉 그 값이 100에 가까울수록 그 총 저해 활성이 낮음을 의미한다.

마지막으로, {[z]/[x]×100}에서 {100-[y]/[x]×100}를 뺀 값을 구한다. 이 차가 클수록 SCCA-1, 후보 물질 및 시스테인 프로테아제를 함유하는 계에 있어서의 SCCA-1이 갖는 시스테인 프로테아제 저해 활성이 낮음의 기준이 되며, 즉, 후보 물질에 의한 SCCA-1의 시스테인 프로테아제 저해 활성의 억제가 현저함을 시사한다.

상기 방법에 의해 스크리닝된 물질은 SCCA-1이 보유하는 시스테인 프로테아제 저해 활성 억제 효과를 갖는 것으로 추정되고, 나아가서는 부전각화 억제 기능을 지녀, 부전각화 억제제로서 유용할 가능성이 높다.

이러한 물질의 부전각화 억제 기능의 확인은, 부전각화를 일으킨 피부, 예컨대 모델 동물의 피부에 적용하여, 치유 효과를 봄으로써 간단히 행할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 스크리닝 방법은, 무수히 존재하는 후보 물질, 예컨대 생약 속에서 표피 부전각화를 억제하는 물질을 일차 스크리닝하기 위한 방법으로서 매우 유용하다. 부전각화가 인정되는 증상에는, 예컨대 건선, 아토피성 피부염, 한공각화증, 일광각화증, 지루성각화증, 편평인선 등의 피부 질환이 있으며, 따라서 본 발명에 관련된 스크리닝 방법에 의해 선택된 물질은 이들 피부 질환의 치료ㆍ예방에 유용할 수 있다.

본 발명자는, 상기 스크리닝 방법에 의해 각종 생약의 SCCA-1이 보유하는 시스테인 프로테아제 저해 활성 억제 효과를 검토한 바, 애기부들 엑기스, 포도 엑기스, 토마토 엑기스, 오이엑기스, 키위 엑기스 및 대추 엑기스가 그와 같은 억제 효과를 갖는 것을 발견했다. 따라서, 다른 관점에 있어서, 본 발명은 애기부들 엑기스, 포도 엑기스, 토마토 엑기스, 오이 엑기스, 키위 엑기스 및 대추 엑기스로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 또는 여러 종류의 생약을 활성 성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하는, 표피 부전각화를 억제하는 피부 외용 조성물을 제공한 다.

이들 식물로부터의 엑기스는, 식물 원재료를 필요에 따라서 건조시키고, 또 필요에 따라서 세단 또는 분쇄한 후, 수성 추출제 또는 유기 용제에 의해 추출함으로써 얻어진다. 수성 추출제로서는, 예컨대 냉수, 온수 또는 비점 혹은 그것보다 저온의 열수를 이용할 수 있으며, 또한 유기 용제로서는, 메탄올, 에탄올, 1,3-부탄디올, 에테르 등을 상온에서 또는 가열하여 이용할 수 있다.

본 발명에 따른 외용 조성물에 있어서의 상기 엑기스는, 1종 또는 2종 이상이 임의로 선택되어 이용할 수 있다. 상기 엑기스의 함유량은 상기 외용 조성물 전량 중 0.001∼20.0 질량%가 바람직하고, 더욱 바람직하게는 0.01∼10.0 질량%이다. 특히, 0.1∼5.0 질량%가 바람직하다. 함유량이 0.001 질량% 미만이면, 본 발명의 효과가 충분히 발휘되지 않는 경우가 있으며, 한편 20.0 질량%를 넘으면 제제화가 어렵기 때문에 그다지 바람직하지 못한 경우가 있다.

본 발명의 외용 조성물은, 통상의 방법에 따라서 제조하면 되며, 또한 상기 엑기스 단독으로도 조제가 가능하지만, 상기 엑기스 이외에, 통상 화장품이나 의약품 등의 피부 외용제에 이용되는 성분, 예컨대 유분, 계면활성제, 분말, 색재, 물, 보습제, 증점제, 알코올류, 각종 피부 영양제, 산화방지제, 자외선흡수제, 향료, 방부제 등을 필요에 따라서 적절하게 배합할 수 있다.

그 밖에, 에데트산이나트륨, 에데트산삼나트륨, 시트르산나트륨, 폴리인산나트륨, 메타인산나트륨, 글루콘산 등의 금속 봉쇄제, 카페인, 탄닌, 베라파밀 및 그 유도체, 감초 추출물, 글라블리딘, 귤(火棘) 과실의 열수 추출물, 각종 생약, 초산 토코페롤, 글리틸리틴산 및 그 유도체 또는 그 염 등의 약제, 비타민 C, 아스코르빈산인산마그네슘, 아스코르빈산글루코시드, 알부틴, 코직산 등의 미백제, 글루코오스, 프럭토스, 만노스, 자당, 토레할로스 등의 당류, 레티놀, 레티노인산, 초산레티놀, 팔미틴산레티놀 등의 비타민 A류 등도 적절하게 배합할 수 있다.

본 발명의 외용 조성물은, 외피에 적용되는 화장료, 의약 부외품 등, 특히 적합하게는 화장료로서 활용하는 것이 가능하며, 그 제형도 수용액계, 가용화계, 유화계, 분말계, 유액계, 겔계, 연고계, 에어졸계, 물-오일 2층계, 물-오일-분말 3층계 등, 폭넓은 제형을 채용할 수 있다. 즉, 기초 화장품이라면, 세안료, 화장수, 유액, 크림, 젤, 엣센스(미용액), 팩, 마스크 등의 형태로, 상기한 다양한 제형에 있어서 널리 적용이 가능하다. 또한, 메이크업 화장품이라면, 파운데이션 등, 욕실 제품으로서는 바디소프, 비누 등의 형태로 널리 적용 가능하다. 또한, 의약부외품이라면, 각종 연고제 등의 형태로 널리 적용이 가능하다. 그리고, 이들 제형 및 형태에, 본 발명의 외용 조성물의 채용할 수 있는 형태가 한정되는 것은 아니다.

본 발명은 또한, 표피 세포 중의 SCCA-1의 카스파아제-14 저해 활성을 억제함으로써, 표피 세포 각화의 정상화를 도모하여, 표피 부전각화를 억제하는 방법을 제공한다. 부전각화가 인정되는 증상에는, 전술한 바와 같이, 예컨대 건선, 아토피성 피부염, 한공각화증, 일광각화증, 지루성각화증, 편평인선 등의 피부 질환을 들 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 피부 외용 조성물을 피부에 적용함으로 실시되지만, 그 용법, 용량은 특별히 한정되는 것은 아니며, 피부 외용 조성물의 제형이나 처치하는 피부의 각화부전 상태에 따라 적절하게 결정된다.

이하, 구체적인 예를 들어 본 발명을 더욱 구체적으로 설명한다. 한편, 본 발명은 이에 따라 한정되는 것은 아니다.

실시예

(1) 건선 및/또는 편평상피세포암의 치료를 위한 방법 및 의약 조성물

(1-i) 면역 조직 화학적 검사

표피 생검을 AMeX 순서(Sato Y. et al. Am. J. Pathol., 125, 431-435(1986))에 따라서, 냉각아세톤으로 고정하고 나서 파라핀 속에 포매했다. 절편을 크실렌으로 탈파라핀 처리하여, 아세톤, 이어서 PBS로 세정했다. 이어서 그 절편의 비특이적 결합 부위를 10% 정상 토끼 혈청(Histofine, Tokyo, Japan)으로 블록했다.

표피 절편을 항-SCCA-1 모노클로널 항체(Santa Cruz Biotechnology, CA, USA)(1:500로 희석), 항-SCCA-2 모노클로널항체(Santa Cruz Biotechnology, CA, USA)(1:500로 희석) 또는 항-SCCA 폴리클로널 항체(Takeda A. et al. J. Invest. Dermatol. 118, 147-154(2002)에 기재한 것과 같이 하여 정제)의 각각과 인큐베이션했다. PBS로 세정한 후, 절편을 헤마톡실린으로 카운터 염색하여, DAKO Envision System(DAKO Corp., CA, USA)로 관찰을 했다.

도 1은 표피 검체로서, 비노광 부위인 상완부(인간 24세), 둔부(인간 46세), 대퇴부(인간 75세) 유래의 표피 및 노광 부위인 볼(인간 20세, 76세), 눈꺼풀(인간 82세) 유래의 표피를 채취하여, 항체로서 SCCA-1 및 SCCA-2의 양자에게 결합하는 항-SCCA 폴리클로널 항체를 이용하여, 현미경 관찰한 결과이다. 도 1로부터, 비노 광 부위와 비교하여, 노광 부위의 표피 상층에서 SCCA가 현저히 항진하고 있는 것을 알 수 있다. 그러나, 노광 부위에서도, 기저층에서는 SCCA 발현의 항진은 인정되지 않았다.

도 2는 표피 검체로서, UV 조사(트랜스루미네이터 TOREX FL205-E-30/DMR(Toshiba Medical Supply)를 한 인간 표피 및 조사를 하고 있지 않은 컨트롤 표피에 있어서의 SCCA-1 및 SCCA-2의 각각의 발현의 현미경 관찰 결과이다. 항체로서, 항-SCCA-1 모노클로널 항체 및 항-SCCA-2 모노클로널 항체 각각을 사용했다. 도 2로부터, SCCA-1 및 SCCA-2 모두 인간 표피에 UV를 조사함으로써 발현이 항진되는 것이 분명하게 되었다. 또한, 발현의 항진은 피부 유극층 및 과립층에 있어서 현저했다.

이상에 의해, 표피에 UV가 조사되면, 표피, 특히 그 유극층 및 과립층에 있어서 SCCA-1 및 SCCA-2의 발현이 항진되는 것이 분명하게 되었다.

(1-ii) 정량 PCR 실험

이어서, 표피에 있어서의 SCCA-1 및 SCCA-2의 발현이 UV 조사에 의해 항진되는 것을 유전자 레벨로 확인하는 실험을 했다.

인간 각화 세포를 케라티노사이트 SFM 배지(GIBCO, Invitrogen) 중, L-글루타민 및 상피 세포 성장 인자의 존재 하에서 고습, CO₂ 5%의 분위기에 있어서, 37℃에서 배양했다. 집밀도 60∼70%의 세포에 UVB를 0∼48시간에 걸쳐 조사했다. UVB 조사는 트랜스루미네이터 TOREX FL205-E-30/DMR(Toshiba Medical Supply)를 이용하 여, 50 mJ/cm²의 강도로 행했다. 컨트롤 세포에는 UVB 조사를 하지 않았다.

상기 배양 세포로부터 총 RNA를, Isogen(Nippon Gene)을 이용하여, 첨부한 설명서에 따라서 단리 정제했다. SCCA-1 및 SCCA-2 각각의 발현 레벨을 정량 리얼타임ㆍ폴리메라제 연쇄 반응법(PCR)에 의해 결정했다. 간단하게 말하면, 총 RNA를 SuperscriptII(Invitrogen, Carlshad, CA)를 이용하여, cDNA로 변환시켰다. 그 시료를 ABI PRISM 7900HT Sequence Detection System(Applied Biosystems, Foster City, CA)를 이용하여, 2-스텝 PCR를 40 사이클 행하여, 증폭시켰다. 내부표준으로서 GAPDH(글리셀알데히드-3-포스페이트데히드로게나아제)를 이용했다.

사용한 프라이머는 아래와 같다.

SCCA-1 :

순방향 프라이머

5'-GTGCTATCTGGAGTCCT-3'(서열번호 3)

역방향 프라이머

5'-CTGTTGTTGCCAGCAA-3'(서열번호 4)

Taq Man 프로브

5'-CATCACCTACTTCAACT-3'(서열번호 5)

SCCA-2 :

순방향 프라이머

5'-CTCTGCTTCCTCTAGGAACACAG-3'(서열번호 6)

역방향 프라이머

5'-TGTTGGCGATCTTCAGCTCA-3'(서열번호 7)

Taq Man 프로브

5'-AGTTCCAGATCACATCGAGTT-3'(서열번호 8)

GAPDH :

순방향 프라이머

5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3'(서열번호 9)

역방향 프라이머

5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3'(서열번호 10)

Taq Man 프로브

5'-AGGCTGAGAACGGGAAGCTTGT-3'(서열번호 11)

리포터 색소(6-카르복시-플루오레세인)를 Taq Man 프로브 배열의 5' 말단에 결합시키고, 그리고 억제제 색소(6-카르복시-테트라메틸-로다민)를 그 3' 말단에 넣었다.

도 3에 배양 인간 각화 세포에 있어서의 SCCA의 발현에 관한 UVB 조사 영향의 결과를 도시한다. SCCA-1, SCCA-2, 모두 UV 조사에 의해 발현이 항진되는 것이 분명하게 되었다. 따라서, 표피 세포는 UV 조사에 의해, 유전자 레벨로 SCCA-1, SCCA-2의 발현이 항진되는 것이 분명하게 되었다.

UV 조사에 있어서의 SCCA의 역할의 검토

이상에 의해, 표피 세포에서는, UV 조사를 받음으로써 SCCA-1 및 SCCA-2의 발현이 항진되는 것이 해명되었다. 이어서, SCCA-1 및 SCCA-2가 UV 조사를 받은 표피 세포에 있어서 어떠한 역할을 담당하고 있는지를 검토했다.

(1-iii) SCCA-1 및 2 고발현 세포의 수립

3T3 세포(ATCC로부터 입수)는 SCCA-1 및 2를 발현하지 않는 마우스 태아 유래의 세포이다. 이 세포에, 아래와 같이 하여 SCCA-1 또는 2를 코드하는 유전자를 도입했다.

SCCA-1 및 SCCA-2의 cDNA(Takeda A et al. J. Invest. Dermatol. 118, 147-154(2002))를 Bam HI 및 Kpn I에서 이중 소화했다. 이들을 pTarget 벡터 속에 서브클로닝하고, 이어서 Lipofectamine Plus(GIBCO, Invitrogen Corp.)를 이용하여, 3T3 세포에 도입했다. 간단하게 말하면, 무혈청 DMEM 배지(Invitrogen Corp.) 675 μl 중의 cDNA 20 μg을 75 μl의 Plus 시약과 혼합하여, 25℃에 15분 방치했다. Lipofectamine(100 μl)를 650 μl의 무혈청 DMEM 배지에 첨가하고, 이어서 그것을 상기 cDNA-Plus 혼합물에 가하고, 그리고 25℃에서 15분 방치했다. 이 cDNA 혼합물을 10 ml의 무혈청 DMEM 배지에 첨가하고, 그리고 3T3 세포를 그 속에서 37℃에서 4시간, 5%의 CO₂ 분위기 하에서 인큐베이션했다. 그 배지를 10%의 FCS(Invitrogen Corp.) 함유의 DMEM 배지와 교환하고, 그리고 밤새 인큐베이션했다. 다음날, G418(Calbiochem)을 최종 농도 500 μg/ml이 되도록 첨가했다. G418은 배양 기간 동안 이 농도로 유지해 두었다. 배지는 2∼3일마다 교환했다. 배양 4주 후, 몇 개의 G418 내성 콜로니를 단할 수 있어, SCCA-1 및 SCCA-2 발현 세포계가 수립되었 다.

SCCA-1을 코드하는 cDNA가 도입된 세포(SCCA-1 도입 세포)는 SCCA-1을 특이적 또 안정적으로 발현하고, 그리고 SCCA-2를 코드하는 cDNA가 도입된 세포(SCCA-2 도입 세포)는 SCCA-2를 특이적 또 안정적으로 발현하는 것이 확인되었다. 또한, 같은 조작으로 비특이적인 배열이 도입된 3T3 세포(컨트롤 세포)는 SCCA-1, SCCA-2의 어느 것이나 발현하지 않았다.

상기 SCCA-1 도입 세포, SCCA-2 도입 세포 및 컨트롤 세포를 이용하여, 표피 세포에 UV 조사를 부여했을 때의 SCCA-1, SCCA-2가 하는 역할에 관해서 검토했다. 자세하게는, 표피 세포에 있어서의 UV 유도 아폽토시스에 대한 SCCA-1, SCCA-2의 역할에 관해서 검토했다.

상기 각종 세포를 10% FCS를 포함하는 DMEM 배지 속에서 고습, CO₂ 5%의 분위기에서, 37℃에서 배양했다. 집밀도 60∼70%의 세포에 UVB를 0∼48시간에 걸쳐 조사했다. UVB 조사는 트랜스루미네이터 TOREX FL205-E-30/DMR(Toshiba Medical Supply)를 이용하여, 50 mJ/cm²의 강도로 행했다.

이들 세포에 관한 아폽토시스 평가는 FACS COULTER(EPIX XL-MCL, Becjman Coulter)을 이용하여, 아넥신 V-FITC 및 프로피듐 이오다인(PI) 이중 염색법(Annexin V-FITC kit, Immunotech)을 지표로 하는 FACS(형광 활성화 셀 소터) 해석에 의해 행했다.

그 결과를 도 4에 도시한다. 도 4로부터 분명한 바와 같이, SCCA-1 및 SCCA- 2 도입 세포의 어느 것이나 UV 조사에 의한 아폽토시스가 의미 있게 감소하는 것이 인정되었다. 따라서, SCCA-1 및 SCCA-2 함께, UV에 의한 유도되는 아폽토시스를 억제할 수 있는 것으로 추정되었다.

이것을 확인하기 위해서, 본 발명자는 이어서 SCCA-1 및 SCCA-2 녹다운 세포주를 RNA 간섭법에 의해 수립하여, UV 조사에 있어서의 표피 세포 내에서의 SCCA-1 및 SCCA-2의 역할에 관해서 더욱 검토했다.

(1-iv) SCCA 녹다운 세포의 수립

HaCat 세포(H. Hans. et al., Experimental Cell Research 239, 399-410(1998))는 SCCA를 고발현하는 인간 각화 세포이다. 이 세포에, RNA 간섭법에 따라서, pSilencer 벡터(Ambion)로 항상적으로 siRNA(short interference RNA)를 발현시킴으로써, SCCA-1 및 2의 녹다운 세포주를 수립했다.

siRNA는 PSi1encer 벡터를 이용하여, 첨부한 설명서에 따라서 구축했다. 자세하게 말하면, SCCA를 코드하는 유전자의 뉴클레오티드 번호 46∼66위치에 상보성인 21mer의 올리고뉴클레오티드(ACATGAACTT GGTGTTGGCT T : 서열번호 1)를 포함하는 65mer의 센스 올리고뉴클레오티드(서열번호 12)와, 뉴클레오티드 번호 46∼66위치에 상동인 21mer의 올리고뉴클레오티드(AAGCCAACAC CAAGTTCATG T ; 서열번호 3)를 포함하는 65mer의 안티센스 올리고뉴클레오티드(서열번호 13)로 이루어지는 이중쇄 올리고뉴클레오티드를 pSilencer 벡터의 Hind III 부위 및 Bam HI 부위에 클로닝했다. HaCat 세포에의 트랜스펙션은 Lipofectamine 2000(Invitrogen)를 이용하여, 첨부한 설명서에 따라서 행했다. 컨트롤 세포는 포유동물의 유전자 배열과 의 미 있는 상동성, 상보성을 갖지 않는 2 라인의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 이중쇄 올리고뉴클레오티드를 이용하여 제작했다. 안정적인 세포계는 트랜스펙션 세포를 하이글로마이신B 선택 배지 속에서 4∼6주간 배양하여 선택을 함으로써 획득했다. SCCA의 발현이 억제되고 있움을 확인하기 위해서, 전술한 것과 같이 하여 리얼타임 PCR에 의해 SCCA-1 및 SCCA-2의 발현을 측정했다.

센스 올리고뉴클레오티드(서열번호 12)

GATCCCGGCCAACACCAAGTTCATGTTTCAAGAGA ACATGAACTTGGTGTTGGCTT TTTTGGAAA

(밑줄 부분이 상동 영역)

안티센스 올리고뉴클레오티드(서열번호 13)

AGCTTTTCCAAAA AAGCCAACACCAAGTTCATGT TCTCTTGAAACATGAACTTGGTGTTGGCCGG

(밑줄 부분이 상보성 영역)

그 결과를 도 5에 도시한다. 상기 siRNA가 도입된 세포에서는, 컨트롤에 비교해 SCCA-1 및 2 모두는 발현이 90% 이상 억제(녹다운 )되고 있음이 확인되었다.

상기 녹다운 세포 및 컨트롤 세포를 이용하여, 표피 세포에 있어서의 UV 유도 아폽토시스에 대한 SCCA-1, 2의 역할에 관해서 검토했다.

상기 각종 세포를 케라티노사이트 SFM 배지(GIBCO, Invitrogen) 중, L-글루타민 및 상피 세포 성장 인자의 존재 하에서 고습, CO₂ 5%의 분위기에 있어서, 37℃에서 배양했다. 집밀도 60∼70%의 세포에 UVB를 조사했다. UVB 조사는 트랜스루미네이터 TOREX FL205-E-30/DMR(Toshiba Medical Supply)를 이용하여, 50 mJ/cm²의 강 도로 행했다.

이들 세포에 관한 아폽토시스 평가를 FACS COULTER를 이용하여, 아넥신 V-FITC 및 프로피듐 이오다인(PI) 이중 염색법을 지표로 하는 FACS(형광 활성화 셀 소터) 해석에 의해 행했다.

그 결과를 도 6에 도시한다. 녹다운 세포에 UV 조사를 한 결과, 컨트롤 세포에서는 38%의 세포가 아폽토시스를 일이키는 데 대하여, 녹다운 세포에서는 약 80%쯤의 세포가 아폽토시스를 야기하는 것이 분명하게 되었다. 따라서, SCCA는 UV 조사에 의해 유도되는 표피 세포의 아폽토시스를 의미 있게 억제하는 것을 알 수 있었다. 따라서, SCCA는 표피 세포의 UV 방어 기구를 담당하며, 또한 아폽토시스를 억제하는 작용을 갖는 단백질임이 분명하게 되었다.

(2) 부전각화를 억제하는 물질의 스크리닝 방법, 이 방법에 의해 스크리닝된 물질 및 부전각화를 억제하는 방법

(2-i) 재료 및 방법

재료

Ac-WEHD-MCA, Ac-YVAD-MCA, Ac-VDVAD-MCA, Ac-DEVD-MCA, Ac-VEID-MCA, Ac-IETD-MCA, Ac-LEHD-MCA는 Peptide Institute, Inc.(일본 오사카)로부터 구입했다.

벤질옥시카르보닐(Z)-YVAD-FMK, Z-VDVSD-FMK, Z-DEVD-FMK, Z-VEID-FMK, Z-IETD-FMK, Z-LEHD-FMK 및 Z-VAD-FMK는 BioVision(Mountain View, CA)로부터 구입했다. 제조합 카스파아제-1∼10은 BIOMOL Research Labs, Inc.(Plymouth Meeting, PA)로부터 얻었다.

카스파아제-14의 프로형 및 대형 서브유닛의 검출을 위해, H-99 항체(Santa Cruz Biotechnology, Inc)를 사용했다. H-99 항체는 인간 카스파아제-14의 아미노산 24-122에 대응하는 펩티드에 대하여 생긴 항체이며, 따라서 카스파아제-14의 프로 효소 및 그 프로세싱된 형태, 즉, 그 대형 서브유닛과 반응한다.

카스파아제-14의 소형 서브유닛의 검출을 위해서는, C-20 항체(Santa Cruz)를 사용했다. 개열 부위 특이적 항체(h14D¹⁴⁶)는, 인간 카스파아제-14의 추정 프로세싱 부위에 상당하는 합성 펜타펩티드 TVGGD를 이용하여, 토끼를 면역화함으로써 작성했다.

(2-ii) WEHD-MCA 가수분해 활성의 측정

Mikolajczyk J. et al., Biochemistry 43, 10560-9(2004)에 기재된 방법에 다소의 변경을 가하여, Ac-WEHD-MCA를 기질로 하여 카스파아제-14 활성을 측정했다. 간단하게 말하면, 분석 혼합물을, 45 μL의 0.1M HEPES 완충액(pH 7.5), 0.06M NaCl, 0.01% CHAPS, 5mM DTT, 1.3M 시트르산나트륨 및 10 μM WEHD-MCA로부터 제작했다(전부, 최종 농도로 표시). 이 혼합물에 효소 시료(5 μl)를 첨가하여, 이것을 10∼30분간에 걸쳐 인큐베이트했다. 반응을 150 μl의 0.1M의 모노클로로초산에 의해 정지시키고, 그리고 Fluoroskan Ascent FL(Thermo Electron Co., Wolsam, MA)을 이용하여, 355 nm의 여기 파장 및 460 nm의 발광 파장에 의해 측정을 했다. 인히비터 분석의 경우, 카스파아제-14 및 펩티드 인히비터를 실온에서 15분간, 분석 완충액 속에서 인큐베이트하고, 그리고 5 μl의 100 μM WEHD-MCA를 첨가함으로써 분석 을 시작했다.

(2-iii) 카스파아제-14의 정제

건강한 보통 사람의 발꿈치로부터 문질러 취한 인간 각화 세포(약 14 g)를, 유리 호모게나이저를 사용하여, 0.14M NaCl를 함유하는 0.1M Tris-HCl(pH 8.0)로 추출했다. 60분간에 걸쳐서 15,000 g으로 원심 분리한 후, 상청액을 얻었다. Amicon Ultra(Millipore, MA)로 농축하여, Fast Desalting 컬럼 HR10/10(Amersham Biosciences)로 탈염한 후, 거친 생성물을 HiPrep 16/10 Q XL 컬럼에 도포했다. 컬럼을 20mM Tris-HCl(pH 8.0)로 세정하고, 그리고 0∼1M의 선형 NaCl 구배로 용리시켰다. 획분은 항카스파아제-14 항체(H-99)(Santa Cruz Biotechnology, CA) 및 h14D¹⁴⁶ 항체를 사용하는 웨스턴 블롯에 의해 추적했다. 또한, 각 획분에 관해서 Ac-Tyr-Glu-His-Asp-메틸-쿠마린아미드(WEHD-MCA)(Peptide Institute, Inc. 일본 오사카)에 대한 가수분해 활성을 측정했다. 양성을 보인 획분을 동 완충액으로 평형시킨 Mono Q 컬럼에 얹어, 이것을 최대 1 M의 NaCl 구배로 용리시켰다. 카스파아제-14 획분을 또한 Mono S 양이온 교환 크로마토그래피에 의해 분리했다. 컬럼을 20 mM 초산 완충액(pH 4.5)으로 평형으로 하고, 그리고 0∼1 M의 NaCl 구배로 용리시켰다. 양성을 보인 획분을 농축하고, 그리고 이것을 25 mM 에탄올아민(pH 8.3)으로 평형으로 한 크로마토 포커싱 Mono P 컬럼에 실었다. Polybuffer(pH 5.0) 46 ml을 사용하여, pH 8에서부터 5에 이르는 pH 구배를 형성하게 하면서 용리를 행했다. 카스파아제-14는 Superdex 75 겔 크로마토그래피를 이용하여 최종적으로 정제했다. 단백질 농도는 BioRad Protein Assay Kit(BioRad Lab, Hercules, CA)로 결정했다.

(2-iv) 재결합 카스파아제-14 및 SCCA-1의 조제

카스파아제-14를 코드하는 cDNA를 순방향 프라이머 : AAGGATCCAATCCGCGGTCTTTGGAAGAGGAG(서열번호 14) 및 역방향 프라이머 : TTTCTGCAGGTTGCAGATACAGCCGTTTCCGGAGGGTGC(서열번호 15)를 사용하는 PCR에 의해서 케라티노사이트 cDNA로부터 단리ㆍ증폭했다. PCR 생성물을 pQE-100 DoubleTag 벡터(Qiagen, Valencia, CA) 중에 클로닝하고, 그리고 E. coli JM109 속에서 발현시켰다.

SSCAl cDNA를 건선 cDNA 라이브러리(Takeda A et al., J. Invest. Dermatol., 118, 147-54(2002))부터 분리하고, 그리고 pQE30 벡터(Quiagen) 중에 클로닝했다. 재결합 단백질을 Ni-NTAAgarose(Quiagen) 및 Mono Q 크로마토그래피로 정제했다.

(2-v) 면역 조직 화학

인간 두피 시편을 환자의 동의하에, 성형외과 수술에 의해 얻었다. 조직을 인산 완충액(pH 7.4) 속의 4% 파라포름알데히드(PFA)로 고정하여, 파라핀 중에 포매했다. 얇은 절편을 조제하고, 그리고 4℃에서 밤새 적절한 항체와 함께 인큐베이트했다. 페르옥시다아제 접합 염소 항토끼 IgG(니치레이사 제조)를 이차 항체로서 사용하여, 발색 시약으로서의 DAB와 반응시켰다.

TUNEL 양성 세포 및 활성 카스파아제의 이중 면역 검출의 경우, Texas Red(등록상표) 색소 접합 항토끼 IgG(로바)를 이차 항체로서 사용했다. TUNEL 반응 은 플루오레세인 in situ 세포사 검출 키트(Roche Diagnostics)를 사용하여, 그 제조자의 지시서에 따라서 실시했다.

ICAD의 웨스턴 블롯 및 면역 조직 화학 분석의 경우, 抗ICAD IgG(FL331, Santa Cruz Biotechnology) 및 DFF45/ICAD Ab-2(NeoMarkers, Fremont, CA)를 사용했다.

활성 아토피성 피부염(AD) 환자의 피부 내에는, 클러스터화된 부전각화가 왕왕 관찰되는 경우가 보고되고 있다(Sakurai K. et al., J. Dermatol. Sci. 30, 37-42(2002) ; Piloto Valdes, L. et al., Allergol. Immunopathol. (Madr) 18, 321-4(1990)). 본 실험에 있어서는, 비칩습적 방법을 이용하여, 부전각화성 피부에 있어서의 ICAD 및 SCCA-1의 국재를 조사했다. AD 또는 건장함 유지의 피부로부터 표면에 나타나는 각화층을 채취하여, 그리고 의료용 접착제 Aron Alpha A(Sankyo Co., Tokyo)를 사용하여 슬라이드 유리 위에 부착시켰다. 3% 파라포름알데히드로 고정한 후, 시료에 0.1% Triton X-100을 침투시키고, 그리고 이 시료를 항ICAD 또는 항SCCA-1 항체로 밤새 4℃에서 면역 염색했다. Alexa Fluor 400 접합형 항래빗(ICAD) 또는 항마우스 IgG(SCCA-1)를 각각 이차 항체로 하여, 1시간에 걸쳐 실온에서 사용했다. 핵의 시각화를 위해, 시료를 0.1% 요드화피리듐 용액 속에 5분간 침지하고, 그리고 PBS로 3회 세정했다. 형광 관찰을 위해, Leica DMLA 현미경을 사용했다.

(2-vi) 웨스턴 블롯 분석

SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동법에 의해, 5∼20% 구배의 겔로 단백질을 분리했다. 전기영동 후, 단백질을 폴리비닐리딘디플루오라이드막(Immobilon-P, Millipore, Bedford, MA) 상에 전사하고, 그리고 H-99, h14D¹⁴⁶ 또는 C20을 함유하는 항카스파아제-14 항체와 함께 인큐베이트했다. 페르옥시다아제 표식 항토끼 IgG(Sigma) 또는 항염소 IgG를 이차 항체로서 사용하고, 그리고 면역 반응성 단백질을 ECL-플러스(Amersham)를 이용하여 화학 발광법으로 시각화시켰다.

(2-vii) 결과

각화 세포 중의 카스파아제-14는 Asp ¹⁴⁶ 으로 프로세싱된다

웨스턴 블롯 분석에 의하면, H-99 항체는 각화 세포 추출물 중의 17 KDa의 밴드밖에 검출되지 않았다(도 8). 이 결과는, 프로세싱되어 있지 않은 30 KDa의 형태를 포함하는, 전체 피부 또는 피부 등가 모델 유래의 추출물에 관한 결과와는 일치하지 않는다. 이 17 KDa 밴드는 h14D¹⁴⁶ 항체(도 8B)에서도 인식되며, 활성 카스파아제-14(p17)의 대형 서브유닛이라고 추정된다. 이것은, 카스파아제-14의 성숙이, 종말 분화의 최종 단계 중에 Asp¹⁴⁶에서의 개열에 의해서 달성되는 것을 시사한다. 또한, 30 KDa의 밴드가, 피부 등가 모델에 있어서, H-99 및 h14D¹⁴⁶ 항체에 의해서도 인식되며, 이것은 Asp¹⁴⁶에 있어서의 절단을 시사한다.

(2-viii) 각화 세포 추출물로부터의 카스파아제-14의 조제

각화 세포 중의 카스파아제-14의 대부분은 프로세싱된 형태, 그 때문에, 활 성형으로 존재한다고 추정되기 때문에(Eckhart L. et al., J. Invest. Dermatol. 115, 1148-51(2000) ; Lippens S. et al., Cell Death Differ. 7, 1218-24(2000) ; Mikolajczyk, J. et al., Biochemistry 43, 10560-9(2004)), 인간 각화 세포는 우수한 카스파아제-14 정제원이라고 생각된다. 그러나, 인간 각화 세포가 카스파아제-1양 효소를 함유하는 것도 알려져 있다(Takahashi T., J. Invest. Dermatol. 111, 367-72(1998)). 카스파아제-1의 기질, 예컨대 WEHD-기질은 카스파아제-1 및 카스파아제-14의 양자에 의해서 가수분해할 수 있다. 본 발명자는 우선, 1.3M 시트르산나트륨 및 5mM 디티오스레이톨의 유무로, 카스파아제-1에 의한 WEHD-MCA 가수분해를 시험했다. WEHD-MCA는 표준의 카스파아제 분석 완충액 속에서 카스파아제-1이 우수한 기질임에도 불구하고, 코스모트로픽 이온의 존재 하에서는, 카스파아제-1은 이 기질을 가수분해할 수 없음이 확인되었다(데이터는 나타내지 않음). 따라서, 각각의 획분을, WEHD-MCA에 대한 가수분해 활성, H-99에 대한 반응성 및 h14D¹⁴⁶ 항체라는 3가지의 방법으로 평가했다. 표 1은 연속 크로마토그래피의 결과를 나타낸다. HiPrep Q 컬럼을 사용한 최초의 음이온 교환 크로마토그래피 후, 수율은 170%의 상승을 보이고, 비활성은 약 10배 상승했다. 이 상승은 아마도 내재성의 인히비터로부터의 카스파아제-14의 격리에 의한 것이라고 생각된다. 웨스턴 블롯 분석에 따르면, 획분 No. 16∼20은 분자량 17KDa의 H-99 양성 또한 14D¹⁴⁶ 양성 밴드를 함유하는 것이 보였다. 이들 획분은, WEHD-MCA 가수분해 활성도 인정되었다. 계속되는 Mono Q 음이온 교환 크로마토그래피에 있어서, 획분 No. 25∼No. 29는 17KDa의 H- 99 양성 또한 h14D¹⁴⁶ 양성 밴드의 존재에 의한 판정에 따라, 프로세싱된 형태의 카스파아제-14를 함유한다. 이들 획분만이 WEHD-MCA 가수분해 활성을 보였다. Mono S 양이온 크로마토그래피 및 Mono P 크로마토 포커싱은 주된 협잡 단백질을 제거하는 데 유효하고, 그리고 비활성은 각각에 의해 3.5배 및 7배 상승시켰다. 여기서도 또한, H-99 양성 또한 h14D¹⁴⁶ 양성 획분만이 WEHD-MCA 가수분해 활성을 보였다. Superdex 75 크로마토그래피에 의한 최종 단계는 분자량 30 KDa의 피크를 분리하고, 이 피크는 WEHD-MCA 가수분해 활성 피크와 일치했다. SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동법은, 이 조제물이 17 KDa 및 11 KDa의 단편을 포함함을 보였다. 전자는 H-99 항체 및 h14D¹⁴⁶ 항체의 양자에 대하여 양성을 보이고, 후자는 C20 항체에서 인식되었다. 이것은 인간 카스파아제-14가 대형 서브유닛(17 KDa) 및 소형 서브유닛(11 KDa)으로 이루어지는 헤테로다이머로서 정제되었음을 시사한다. 또한, Superdex 75 겔 크로마토그래피는, 다른 카스파아제와는 달리, 인간 각화 세포 중의 카스파아제-14는 그란자임 B 활성화형와 같이 모노머로서 존재함을 보였다. 표 1은 카스파아제-14의 정제율을 정리하여 나타내고 있다. 약 100 mg의 가용성 단백질 추출물로부터 출발하여, 정제 단백질 11.8 μg을 얻었다. 비활성은 764배 상승하고, 수율은 9.1%였다.

[표 1]

카스파아제-14의 정제의 정리

(2-viv) 정제 카스파아제-14의 효소 특성

정제 카스파아제-14의 효소 특성을 조사했다(도 9∼도 10). 카스파아제-14는 여러 가지 카스파아제 인히비터, 예컨대 YVAD-FMK(카스파아제-1 인히비터), VDVAD-FMK(카스파아제-2 인히비터), DEVD-FMK(카스파아제-3 인히비터), IETD-FMK(카스파 아제-8 인히비터), LEHD-FMK(카스파아제-9 인히비터) 및 VAD-FMK(pan-카스파아제 인히비터)에 대한 감수성을 지녔다(도 9). 한편, VEID-FMK의 효과는 거의 없었다. 특히 YVAD-FMK는 카스파아제-14 활성에 대하여 매우 강력한 저해 효과를 보였다. 이것은 아마도 카스파아제-1과 카스파아제-14 사이의 구조 유사성에 의한 것이라고 생각된다. pan-카스파아제 인히비터 VAD-FMK는 VAD-FMK와 같은 정도로 카스파아제-14 활성을 억제했다. 시스테인 프로테이나제에 대한 클래스 특이적 인히비터인 요오드초산(IAA), 또는 세린 프로테이나제에 대한 클래스 특이적인 히비터인 4-(2-아미노에틸)벤젠슬포닐플루오리드(AEBSF)는 이 연구에 있어서의 시험 농도에서는 의미 있는 저해 효과를 보이지 않았다.

(2-x) ICAD 분해에 대한 정제 카스파아제-14의 효과

카스파아제-14의 천연 기질의 모색 중에, 본 발명자는 ICAD에 대한 카스파아제-14의 효과를 시험한 것도, 핵의 소실은 종말 분화에 있어서 매우 중요한 사상의 하나이기 때문이다. 통상의 카스파아제 분석 완충액 속에서 재결합 ICAD 단백질과 함께 정제 카스파아제-14를 인큐베이트하면, 항ICAD IgG을 이용한 웨스턴 블롯 분석에 의한 판정에 따르면, 정제 카스파아제-14는 ICAD에 대하고 아무런 가수분해 활성을 보이지 않았다(도 10A). 그러나, 코스모트로픽염의 존재 하에서는, 인택트한 ICAD 단백질이 감소하여, 2개의 주요한 분해 생성물이 증가함으로써, 정제 카스파아제-14는 ICAD에 대하여 한정적인 분해 작용을 보였다.

(2-xi) SCCA-1에 의해 카스파아제-14가 저해된다

SCCA-1은 세르핀 초과에 속하지만, 시스테인 프로테이나제, 예컨대 파파인 및 카텝신 L을 저해한다(Takeda A et al., Biol. Chem. 383, 1231-6(2002)). 이것은, SCCA-1이 Crm-A³²와 같은 고유의 크로스클래스 인히비터임을 나타낸다. 따라서, 본 발명자는 SCCA-1이 카스파아제 멤버를 저해할 수 있는지 여부를 시험했다. 카스파아제-14의 경우, 코스모트로픽 조건을 이용했다. 재결합 활성 카스파아제를 SCCA-1과 함께 인큐베이트하더라도, 카스파아제 멤버(1∼10)의 어느 것이나 효소 활성에 관해서 아무런 영향을 받지 않았다. 이것과는 반대로, SCCA-1은 용량 의존식으로 카스파아제-14의 WEHD-MCA에 대한 활성을 억제했다(도 10C). SCCA-1은 카스파아제-14에 의한 ICAD 분해도 저해했다. 인큐베이션을 연장하더라도, 효소 활성의 회복을 보이는 일은 없었다. 이것은 카스파아제-14와 SCCA-1과의 강한 결합을 시사한다(도 10B).

(2-xii) 활성 카스파아제-14 및 TUNEL 양성 세포의 국재

카스파아제-14가 탈핵 프로세스에 관여하는지 여부를 조사하기 위해서, 본 발명자는, 활성 카스파아제-14 및 TUNEL의 이중 염색을 했다. 도 11A에 도시하는 바와 같이, 프로형 및 활성형을 포함하는 카스파아제-14는, 정상 인간 표피 내의 유극 세포에서부터 각화 세포에 걸쳐서 국재하고 있었다. 이것은 과거의 소견(Lippens et al., (2000), 전술함)과 합치한다. h14D¹⁴⁶ 항체로 검출된 활성 카스파아제-14는 각화 세포 및 과립 세포의 일부에 한정되고 있었다(도 11B). 각화 세포의 대부분은 편재적으로 염색되었다. TUNEL 양성 세포는 각화층의 바로 아래쪽에 관찰되었지만, 이들 양성 세포의 대부분은 현저히 제한되었다(도 11C). 흥미롭게 도, TUNEL 양성 세포는, 오로지 h14D¹⁴⁶ 양성 세포와 함께 국재하고 있었다. 이것은 이들 세포 속에서 DNA 단편화가 일어나고 있으며, 활성 카스파아제-14가 이 프로세스에 관여하고 있음을 시사하고 있다.

(2-xiii) 부전각화성 핵에 있어서의 ICAD 및 SCCA-1의 공국재

정상적인 인간 상피의 종단면에서는, FL331 항체를 사용함으로써, 기저 세포 및 기저상 세포의 핵 내에 ICAD의 국재가 주로 있음을 알 수 있다. 세포질은, 기저 세포에서부터 과립 세포에 있어서 약하게 양성을 보였다. 각화층에 있어서는, ICAD에 대한 면역 반응성은 대폭 저감했다. N 말단 펩티드 항체 DFF45/ICAD Ab-2를 사용하더라도 사실상 동일한 결과를 얻을 수 있었다(데이터는 나타내지 않음). AD 환자의 표면에 나타나는 각화층을 항ICAD 항체(FL-331)로 염색한 경우, 다양한 사이즈의 클러스터 영역이 이 항체에 대하여 양성을 보였다(도 12B). PI에 의한 핵 염색은, 부전각화성 핵이 이들 얼룩형의 섬 내에 항상 발견됨을 나타냈다(도 12C). 표면에 나타나는 각화층의 밝은 시야는 요철이 많은 거친 표면을 나타냈다(도 12D). 중첩 화상은, 부전각화 부위가 ICAD 양성 부위와 일치함을 보였다(도 12E 및 12F). 이들 결과는 종말 분화에 있어서 핵을 배제하는 데에 ICAD 분해가 필요하게 됨을 시사한다.

정상적인 피부의 경우, 매우 낮은 레벨의 SCCA-1이 과립층 내에서 검출되었다. 활성 AD를 갖는 표면에 나타나는 각화층 내에서도, 양성 부위의 얼룩형 분포가 현저한 강한 면역 염색이 발견되었다(도 13H). 마찬가지로, SCCA-1 양성 영역은 PI 양성의 핵의 층, 즉 부전각화 부위와 일치했다(도 13의 J∼L). 이들 결과를 정리하면, ICAD/CAD계가 탈핵 프로세스의 주요한 역할을 하고, 그리고 SCCA-1은 억제제(suppressor)로서 이 반응에 관여함을 시사한다.

고찰

카스파아제-14는 대부분이 표피 내에서 발현되고, 그 밖의 조직 내에서는 거의 발현되지 않는다(Van de Craen, M et al., Cell Death Differ. 5, 836-46(1998)). 과거의 보고에 따르면, 케라티노사이트의 종말 분화는 카스파아제-14의 프로세싱과 연계하고 있는 것이며, 이것은, 카스파아제과 프로테이나제의 활성화를 시사한다(Lippens, S et al., Cell Death Differ 7, 1218-24(2000) ; Eckhart I. Biochem. Biophys. Res. Commun. 277, 655-9(2000) ; Hu S. J. Biol. Chem 273, 29648-53(1988)). 최근, Mikolajaczyk et al.,(2004)(전술함)은, 그란자임B 절단 카스파아제-14가 코스모트로픽염의 존재 하에서 효소적으로 활성임을 실증했다. 이 연구에 있어서, 본 발명자는, 인간 카스파아제-14가 케라티노사이트 분화의 최종 단계에서 활성인지의 여부를 조사하기 위해서, 완전히 분화된 케라티노사이트로부터의 카스파아제-14의 정제를 시도했다. 본 발명자는, 대형 서브유닛, 프로형(H-99)(Asp¹⁴⁶(h14D¹⁴⁶)에 추정 카스파아제 절단 부위를 지님) 및 소형 서브유닛(C20)을 각각 인식하는 3종의 항체를 사용했다. 최종 조제물은 2개의 단백질 밴드, 즉 h14D¹⁴⁶ 항체에 의해서 인식된 17 KDa의 단백질 밴드 및 C20 항체에 의해서 인식된 11 KDa의 단백질 밴드로 이루어졌다. 이들 단백질 밴드는 활성 카스파아제-14의 대 형 및 소형 서브유닛이다. 정제 공정 동안, H-99 양성의 17 KDa의 밴드가, h14D¹⁴⁶ 항체와 함께 인식되었다. 이것은, 대형 서브유닛이 그 카르복실 말단에 있어서 Asp¹⁴⁶로 끝남을 시사하고 있다. 소형 서브유닛의 아미노 말단 영역은 Lys¹⁵³-Asp-Ser-Pro-Gln으로서 확인되고, 이것은, 프로세싱이 Ile¹⁵²와 Lys¹⁵³ 사이에서 생김을 시사한다. 이 부위는 카스파아제 멤버로서는 기이한 절단 부위이다. 이것은, 포피 추출물로부터 면역 침강시킨 카스파아제-14가 동일한 부위에서 절단을 보인다고 하는, Chien 등의 발견(Biochem. Biophys. Res. Commun. 2002 Aug 30 ; 296(4) ; 911-7)과 합치한다. 따라서, 인간 카스파아제-14는 고활성 헤테로다이머로서 균질하게 정제되었다고 결론지었다. 카스파아제-14의 성숙에는 2개의 부위 Asp¹⁴⁶과 Ile¹⁵²에 있어서의 프로세싱 및 링커 영역 Xxx¹⁴⁷과 Ile¹⁵² 내의 6개의 잔기의 제거가 관여하는 것으로 시사되었다. 2개의 다른 절단 부위(한 쪽은 산성, 다른 쪽은 소수성)의 존재는 또한, 카스파아제-14의 활성화가 다수의 효소에 의해 다단층적으로 이루어짐을 시사한다.

정제 카스파아제-14의 효소학적 특성은 매우 독자적인 것이었다. 정제 카스파아제-14는 기지의 카스파아제 인히비터에 대하여 비교적 넓은 인히비터 감수성을 보였다. 특히, 카스파아제-1 인히비터 YVAD-FMK가 가장 강한 저해 작용을 보였다. YVAD-FMK는 WEHD-MCA 및 다른 카스파아제-1 기질인 YCAD-MCA에 대하여 가장 높은 활성을 보였다. 이것은, 카스파아제-1과 카스파아제-14와의 밀접한 관계를 시사한 다. 그러나, 본 발명자가 밝힌 바로는, 카스파아제-14는 현저히 다른 특성을 갖고 있다. 본 발명자는, SCCA-1이 카스파아제-14에 대한 내재성 인히비터임을 처음으로 해명했다. SCCA-1의 가장 특이적인 특성은, 카스파아제-14에 대한 현저한 특이성이다. 카스파아제 1∼10의 다른 구성원이 SCCA-1에 의한 영향을 받는 일은 없다. 합성 기질 DEVD-MCA 또는 천연 기질 ICAD를 사용하여, SCCA-1이 카스파아제-3 활성을 저해하는 일은 없었다. 이것은 Crm A와는 대조적이다. Crm A도 세르핀 초과에 속하며, 카스파아제-1 및 카스파아제-8을 포함하는 다수의 카스파아제를 억제할 수 있어서 알려졌다(Gagliardini V. et al., Science 263, 826-8(1994)). XIAP는 카스파아제-3, -7 및 -9를 저해하여서 알려졌다(Srinivasula S. M. et al., Nature 410, 112-6(2001)). 항아폽토시스성 단백질 p35는 카스파아제-1, -3, -6, -7, -8 및 -10을 저해하므로, 보다 넓은 스펙트럼을 갖는다고 생각된다. 이들 저해 단백질 Crm A, IAP 및 p35 전부가 몇 개인가의 시작 및 실행 카스파아제의 일부를 억제할 수 있다고 하는 사실은 이들 분자가 전형적인 아폽토시스 경로의 실행에 관여하고 있음을 시사한다. 다른 한편, 본 발명자의 결과가 강하게 시사하고 있는 것은, SCCA-1이 통상의 아폽토시스 사상에 있어서의 키플레이어는 아니지만, 카스파아제-14에 의해 매개되는 탈핵 프로세스에 있어서의 중요한 레귤레이터라는 것이다.

이 프로세스의 분자 메카니즘은 해명되지 못했다. 본 발명자는, 인간 카스파아제-14가 코스모트로픽염의 존재 하에 있어서, ICAD를 분해할 수 있음을 분명히 했다. ICAD(DNA 단편화 인자「DFF45」라고도 불림)는, 카스파아제 활성화형 DN아제(CAD)(또는 DFF40)라고도 불리는 마그네슘 의존성 엔드 뉴클레아제에 대한 인히 비터이다. ICAD/CAD계는, 아폽토시스성 세포사 중의 염색체 DNA의 분해에 있어서 주요한 역할을 한다. CAD에 결합한 ICAD는 불활성 복합체로서 존재한다. 카스파아제-3은 ICAD에 대하여 한정된 단백질 분해를 보이며, 2개의 부위 Asp¹¹⁷ 및 Asp²²⁴에서 절단한다. 이 절단은 CAD를 활성화하여, DNA 분해를 시작하게 한다(Nagata S. Exp. Cell Res. 256, 12-8(2000)). 카스파아제-3은 아폽토시스일 때의 대량의 세포 단백질의 절단에 있어서는 반드시 필요하지는 아니지만, ICAD의 절단에 있어서는 필수이다(Tang D. et al., J. Biol. Chem. 273, 28549-52(1998)). 이것은, 카스파아제-3이 DNA 단편화에 매우 중요하고, 다른 실행 카스파아제, 즉 카스파아제-6이나 -7은 중요하지 않음을 나타낸다. 흥미롭게도, 카스파아제-14는 ICAD로부터 12 KDa 및 35 KDa의 비슷한 절단 단편을 생성했다. 배열 분석은 동일한 절단 부위를 나타냈다. 이것은, 카스파아제-14가 카스파아제-3의 완벽한 대체물이 될 수 있음을 시사하고 있다. 카스파아제-14는 ICAD를 분해할 수 있지만, 하기의 이유에서, 프로아폽토시스 카파아제-3과는 분명히 다르다. 첫째로, 카스파아제-14의 과잉 발현은 아폽토시스성 세포사를 유도하지 않는다(Van de Craen. Cell Death Differ. 5, 838-46(1998)). 이것은 카스파아제-3과는 대조적이다. 둘째로, 카스파아제-14는 여러 가지 아폽토시스성 자극에서는 활성화되지 않는다(Lippens et al., (2000), 전술함). 시작 카스파아제 또는 그 밖의 카스파아제 멤버는, 프로-카스파아제-14를 프로세싱할 수 없었다. 이것은 과거의 소견과 일치한다(Lippens et al., (2000), 전술함). 활성화는 종말 분화에 있어서만 발생한다(Eckhart L. et al., (2000), 전 술함). 셋째로, 카스파아제-14의 합성은, 성인 조직에 있어서의 분화 중의 케라티노사이트에 한정된다(Eckhart L. Biochem. Biophys. Res. Commun. 277, 655-9(2000)). 또한, ICAD 절단에 대한 카스파아제-14의 능력은 카스파아제-3과는 현저히 다른 양식으로 조절된다. 카스파아제-14에 의한 ICAD 분해는 이상한 고농도의 코스모트로픽 이온을 필요로 한다. 이러한 이온 농도에서는, 다른 카스파아제는 거의 활성이 아니었다. 종합적으로 보면, 카스파아제-14는 케라티노사이트 분화 프로그램이 그 활성화를 조절함으로써, 카스파아제 멤버 중에서는 특수한 위치를 부여하고 있는 것처럼 생각된다.

케라티노사이트 종말 분화에 있어서의 ICAD/CAD계의 관여는, in vivo 실험에 의해서 더욱 뒷받침된다. 면역 조직 화학적 연구는, ICAD가 기저 케라티노사이트로부터 유극 케라티노사이트에 걸쳐서 핵 내에 존재하고, 과립 세포에서 소실하여, 핵의 소실은 종말 분화할 때에 발생함을 보였다. AD 환자의 표면에 나타나는 표피 내에는, ICAD가 강한 면역 염색이 얼룩형 부위에 나타났다. 이들 영역은 약간거친 표면을 지니고, 반투명성이 낮다. 확실히 이들 영역 상에, PI 양성인, 미소화 핵의 집합이 공국재하고 있었다. 다른 영역이 항ICAD 항체로 염색되는 일은 없었다. 또한, AD 환자의 피부로부터의 테이프 스트리핑 시료는 인택트한 ICAD 단백질의 존재를 나타냈지만, 건강한 보통 사람의 추출물 속에서는 검출되지 않았다. 이들 결과는, ICAD가 종말 분화를 때의 탈핵 프로세스에 관여하고 있음을 시사한다.

정상적인 표피에서는 SCCA-1은 거의 발현되지 않는다. 다른 한편, 건선 표피, 점막 및 식도에서는 강한 발현이 보고되어 있다(Takeda A. et al., J. Invest. Dermatol. 118, 147-54(2002)). 흥미롭게도, 이들 조직에는 부전각화가 동반되고 있다. 본 발명자는, 부전각화 부위에는 SCCA-1의 강한 염색도 발견됨을 밝혔다. 또한, SCCA-1 및 ICAD는 핵의 집합이 존재하는 곳과 동일한 부위에 항상 공국재하고 있었다. SCCA-1 또는 ICAD가 음성인 다른 표피 표면 부분은 없었기 때문에, 부전각화 부위에 있어서의 이들 분자의 공국재는, 이들 분자가 탈핵 프로세스의 억제에 관여한다는 것을 시사한다. 팬-카스파아제 인히비터 VAD-FMK에 의해, 피부 등가 모델에 있어서 핵이 소실되지 않게 됨이 보고되어 있다(Wei1 등, 1999). VAD-FMK가 가장 강력한 카스파아제-14 인히비터의 하나라고 하는 본 발명자의 발견은, 카스파아제-14가 아마도 이 반응에 있어서의 후보라고 할 가능성을 높인다. 카스파아제-14는, 건선 피부의 부전각화 부위 내에서는 다운 조절되고, 또한 구강 표피 내에는 존재하지 않는다. 구강 표피에서는 핵의 소실은 어떠한 형태로 손상되거나, 혹은 이루어지지 않는다(Lippens et al., (2000), 전술함). 흥미롭게도, SCCA-1은 이들 조직 내에서 업 조절된다. 아마도, 이들 분자의 이상 발현은 핵의 항구적인 존재 등을 포함하는 불완전한 분화를 야기하는 것으로 생각된다.

피부 내의 카스파아제-14의 활성화 메카니즘은 전체적으로 잘 알고 있지 못하다. 피부 또는 피부 등가 모델에 있어서만 활성화가 관찰되고, 세포 배양계에서는 관찰되지 않는다(Eckhart L. et al., (2000), 전술함). 실제로, 본 발명자는 다양한 조건을 실시했다. 이들 조건에는, 혈청의 첨가, 집밀이 되고 나서 칼슘의 존재 하 혹은 비존재 하에서의 14일째까지의 배양 기간의 연장, 칼슘 이오노포어 A23187에 의한 처리, 또는 많은 분화 마커를 업 조절하기에 충분한 30분간에 걸친 공기 폭로를 포함한다. 이들 분화 자극은 현저한 카스파아제-14 mRNA 발현을 유도하지만, 카스파아제-14 활성을 야기하는 데에 효과적인 자극은 없었다(데이터는 나타내지 않음). 활성화 프로세스는 엄밀하게 제어되어, 단층 배양 속에서 강하게 억제된다. 층화 및 공기 폭로가 그 활성화에 필요하다고 생각된다. 카스파아제-14의 활성화는, 아폽토시스 프로그램에 의해서가 아니라, 분화 프로그램에 의한 제어를 통해 이루어지는 것이 분명하다. 종말 분화 프로세스 중에는, 세린, 시스테인 및 아스파라긴산 프로테이나제를 포함하는 많은 프로테이나제도 활성화된다. 트립신양 및 키모트립신양 혈청 프로테이나제는, 가장 외측의 각화 세포를 탈락시키는 역할을 한다는 것이 하는 것이 시사되고 있다. 시스테인 프로테이나제의 일부, 예컨대 카텝신 B 및 L은 분화된 케라티노사이트 속에서 업 조절된다. 카텝신 D, 아스파라긴산 프로테이나제도 또한, 각화 세포를 탈락시키는 역할을 하는 것이 시사되어 있다. 이들 효소는 다른 분화 메카니즘, 예컨대 카스파아제-14의 활성화에 관여하는 경우가 있다.

이상을 정리하면, 본 발명자는, 인간 각화 세포 추출물로부터 카스파아제-14를 정제했다. 카스파아제-14는 핵의 소실을 유도하며, 이 소실은 아폽토시스양이지만, 그러나 케라티노사이트 분화의 최종 단계에서 ICAD 분해를 통해 생기는 구별 가능한 변화임이 강하게 시사된다. 이 프로세스는 몇 가지인가의 아폽토시스성 인자를 공유하는데, 이것은 손상된 세포의 배제를 초래하는 세포사 프로세스가 아니라, 주요한 역할인 배리어 기능을 위한 구조 전체를 완성하는 것을 목적으로 한 구성 프로세스이다. 카스파아제-14 또는 SCCA-1의 이상 발현은 분화 프로그램에 직접 적으로 영향을 미치고, 그 결과, 부전각화 및 배리어 기능 붕괴가 생긴다.

(2-xiv) 스크리닝 방법

부전각화를 억제하는 물질의 스크리닝은 다음과 같은 식으로 실시했다. 시험한 생약은 이하와 같다.

애기부들 엑기스(이치마루파르코스)

포도 엑기스(이치마루파르코스)

토마토 엑기스(이치마루파르코스)

오이 엑기스(이치마루파르코스)

키위 엑기스(이치마루파르코스)

대추 엑기스(이치마루파르코스)

토르멘티라(이치마루파르코스)

(a) 시스테인 프로테아제의 효소 활성의 측정

분석용 완충액(50 mM의 HEPES(pH 7.5), 5 mM의 DTT, 2.5 mM의 EDTA, 0.1%의 CHAPS) 80 μl와 1 μg/ml의 파파인(Sigma) 20 μl을 혼합하여, 실온에서 15분 인큐베이션했다. 이어서, 2.5 mM의 기질 Nα-벤조일-L-아르기닌4-니트로아닐리드염산염(L-BAPNA) 20 μl을 첨가하여, 37℃에서 15분 인큐베이션했다. 이것에 에탄올 중의 25%의 초산 용액 30 μl 및 0.2%의 p-디메틸아미노신남알데히드 30 μl를 첨가하여 발색시켜, 545 nm의 흡광도를 측정했다. 이 흡광도를 시스테인 프로테아제의 효소 활성[x]으로 한다.

(b) 부전각화를 억제하는 후보 생약과 시스테인 프로테아제를 함유하는 계의 효소 활성의 측정

상기 분석용 완충액 60 μl과 후보 물질 20 μl을 실온에서 30분 인큐베이션했다. 이것에, 1 μg/ml의 파파인 20 μl를 첨가하여, 실온에서 15분 인큐베이션했다. 계속해서, 2.5 mM의 L-BAPNA 20 μl를 첨가하여, 37℃에서 15분 인큐베이션했다. 이것에 에탄올 중의 25%의 초산 용액 30 μl 및 0.2%의 p-디메틸아미노신남알데히드 30 μl를 첨가하여 발색시켜, 545 nm의 흡광도를 측정했다. 이 흡광도를 시스테인 프로테아제의 효소 활성[y]으로 하여, 시험한 각 물질에 관한 상기 [x]에 대한 %를 이하의 표 2 중의 [샘플만]의 열에 나타낸다.

[샘플만]의 값은 시험 생약 자체가 갖는 시스테인 프로테아제 저해 활성의 기준이 되며, 즉 그 값이 100에 가까울수록 시험 생약이 갖는 시스테인 프로테아제 저해 활성이 낮음을 의미한다. 또한, 하기의 표 2에, 100에서 상기 [샘플만]의 값을 뺀 값[100-[샘플만]]도 나타낸다. 이 경우, 그 값이 0에 가까울수록 시험 생약이 갖는 시스테인 프로테아제 저해 활성이 낮음을 의미한다.

(c) SCCA-1, 후보 생약 및 시스테인 프로테아제를 함유하는 계의 효소 활성의 측정

상기 분석용 완충액 40 μl과 재결합 SCCA-1 20 μl를 혼합하고, 그것에 후보 생약 물질 20 μl를 가하여, 실온에서 30분 인큐베이션했다. 이것에, 1 μg/ml의 파파인 20 μl을 첨가하여, 실온에서 15분 인큐베이션했다. 계속해서, 2.5 mM의 L-BAPNA 20 μl를 첨가하여, 37℃에서 15분 인큐베이션했다. 이것에 에탄올 중의 25%의 초산 용액 30 μl 및 0.2%의 p-디메틸아미노신남알데히드 30 μl를 첨가하여 발색시켜, 545 nm의 흡광도를 측정했다. 이 흡광도를 시스테인 프로테아제의 효소 활성[z]으로 하여, 시험한 각 물질에 관한 상기 [x]에 대한 %를 이하의 표 2 중의 [SCCA-1+]의 열에 나타낸다.

[SCCA-1+]의 값은, SCCA-1이 갖는 시스테인 프로테아제 저해 활성과 시험 생약 자체가 갖는 시스테인 프로테아제 저해 활성의 총계의 기준이 되며, 즉 그 값이 100에 가까울수록 그 총 저해 활성이 낮음을 의미한다.

또한, 표 중의 [차]의 열은, [SCCA-1+]에서 [100-[샘플만]]을 뺀 값을 나타낸다. 이 차가 클수록, SCCA-1, 후보 생약 및 시스테인 프로테아제를 함유하는 계에 있어서의 SCCA-1이 갖는 시스테인 프로테아제 저해 활성이 낮음의 기준이 되어, 즉, 후보 생약에 의한 SCCA-1의 시스테인 프로테아제 저해 활성의 억제가 현저함을 시사한다.

이 결과를 이하의 표 2에 정리했다.

[표 2]

그 결과, 애기부들 엑기스, 포도 엑기스, 토마토 엑기스, 오이 엑기스, 키위 엑기스 및 대추 엑기스, 특히 애기부들 엑기스가 SCCA-1의 시스테인 프로테아제 저해 활성을 의미 있게 억제함을 알 수 있었다. 따라서, 이들 엑기스가 표피 부전각 화를 억제하는 데에 유효한 것으로 생각된다.

본 발명에 의해, 편평상피세포암 및 건선으로 이루어지는 군에서 선택되는 질환의 치료ㆍ예방을 위한 방법, 의약 조성물이 제공된다. 또한, 본 발명에 의해서, 종래 기술과는 다른 완전히 신규의 어프로치로 표피 부전각화의 억제ㆍ치료 수단의 제공도 가능하게 된다.

SEQUENCE LISTING <110> SHISEIDO CO. LTD. <120> Method and Medicament for Preventing and/or Treating Psoriasis, Squamous Epidermal Cell Carcinoma and/or Skin Parakeratosis by Inhibiting Expression of Squamous Epidermal Cell Carcinoma Antigen <130> R846 <150> JP 2004-087300 <151> 2004-03-24 <150> JP 2005-080566 <151> 2005-03-18 <160> 15 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <223> SiRNA Target Sequence <400> 1 acatgaactt ggtgttggct t 21 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <223> SiRNA Target Sequence <400> 2 aagccaacac caagttcatg t 21 <210> 3 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <223> Forward Primer <400> 3 gtgctatctg gagtcct 17 <210> 4 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <223> Reverse Primer <400> 4 ctgttgttgc cagcaa 16 <210> 5 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <223> Taq Man Probe <400> 5 catcacctac ttcaact 17 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <223> Forward Primer <400> 6 ctctgcttcc tctaggaac acag 24 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <223> Reverse Primer <400> 7 tgttggcgat cttcagctca 20 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <223> Taq Man Probe <400> 8 agttccagat cacatcgagt t 21 <210> 9 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <223> Forward Primer <400> 9 gaaggtgaag gtcggagtc 19 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <223> Reverse Primer <400> 10 gaagatggtg atgggatttc 20 <210> 11 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <223> Taq Man Probe <400> 11 aggctgagaa cgggaagctt gt 22 <210> 12 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <223> Sense Oligonucleotide for SiRNA <400> 12 gatcccggcc aacaccaagt tcatgtttca agagaacatg aacttggtgt tggctttttt 60 ggaaa 65 21 <210> 13 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <223> Antisense Oligonucleotide for SiRNA <400> 13 agcttttcca aaaaagccaa caccaagttc atgttctctt gaaacatgaa cttggtgttg 60 gccgg 65 <210> 14 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <223> Forward Primer <400> 14 aaggatccaa tccgcggtct ttggaagagg ag 32 <210> 15 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <223> Reverse Primer <400> 15 tttctgcagg ttgcagatac agccgtttcc ggagggtgc 39

Claims (22)

1. 세포의 편평상피세포암 관련 항원(SCCA)의 발현을 억제함으로써, 건선 및 편평상피세포암으로 이루어지는 군에서 선택되는 질환을 치료 및/또는 예방하는 방법.
2. 제1항에 있어서, 세포의 SCCA의 발현 억제가, SCCA를 코드하는 유전자의 RNA 간섭에 의한 것인 방법.
3. 제2항에 있어서, RNA 간섭에, 서열번호 1의 올리고뉴클레오티드 또는 그 이변체를 포함하는 센스 올리고뉴클레오티드쇄 및 서열번호 3의 올리고뉴클레오티드 또는 그 이변체를 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오티드쇄를 포함하여 이루어지는 이중쇄 RNA를 이용하는 것을 특징으로 하고, 여기서 상기 서열번호 1의 올리고뉴클레오티드의 이변체는 SCCA를 코드하는 유전자의 뉴클레오티드 번호 46∼66위치에 대하여 매우 엄격한 조건 하에서 하이브리드화하는 배열을 지니고, 그리고 상기 서열번호 3의 올리고뉴클레오티드의 이변체는 SCCA를 코드하는 유전자의 뉴클레오티드번호 46∼66위치의 상보쇄에 대하여 매우 엄격한 조건 하에서 하이브리드화하는 배열을 갖는 방법.
4. 세포의 SCCA의 발현을 억제함으로써, 건선 및 편평상피세포암으로 이루어지 는 군에서 선택되는 질환을 치료 및/또는 예방하기 위한 의약 조성물.
5. 제4항에 있어서, SCCA를 코드하는 유전자의 RNA 간섭에 의해 세포의 SCCA의 발현을 억제하는 의약 조성물.
6. 제5항에 있어서, 서열번호 1의 올리고뉴클레오티드 또는 그 이변체를 포함하는 센스 올리고뉴클레오티드쇄 및 서열번호 3의 올리고뉴클레오티드 또는 그 이변체를 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오티드쇄를 포함하여 이루어지는 이중쇄 RNA를 함유하는 것을 특징으로 하고, 여기서 상기 서열번호 1의 올리고뉴클레오티드의 이변체는 SCCA를 코드하는 유전자의 뉴클레오티드 번호 46∼66위치에 대하여 매우 엄격한 조건 하에서 하이브리드화하는 배열을 지니고, 그리고 상기 서열번호 3의 올리고뉴클레오티드의 이변체는 SCCA를 코드하는 유전자의 뉴클레오티드 번호 46∼66위치의 상보쇄에 대하여 매우 엄격한 조건 하에서 하이브리드화하는 배열을 갖는 의약 조성물.
7. SCCA의 발현이 억제된 세포를 조제하기 위한 방법으로서, SCCA의 발현 억제가 SCCA를 코드하는 유전자의 RNA 간섭에 의해 이루어지고, RNA 간섭에, 서열번호 1의 올리고뉴클레오티드 또는 그 이변체를 포함하는 센스 올리고뉴클레오티드쇄 및 서열번호 3의 올리고뉴클레오티드 또는 그 이변체를 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오티드쇄를 포함하여 이루어지는 이중쇄 RNA를 이용하는 것을 특징으로 하고, 여 기서 상기 서열번호 1의 올리고뉴클레오티드의 이변체는 SCCA를 코드하는 유전자의 뉴클레오티드 번호 46∼66위치에 대하여 매우 엄격한 조건 하에서 하이브리드화하는 배열을 지니고, 그리고 상기 서열번호 3의 올리고뉴클레오티드의 이변체는 SCCA를 코드하는 유전자의 뉴클레오티드 번호 46∼66위치의 상보쇄에 대하여 매우 엄격한 조건 하에서 하이브리드화하는 배열을 갖는 방법.
8. 제7항에 기재한 방법에 의해 SCCA의 발현이 억제된 세포.
9. 제8항에 기재한 세포를 갖는 인간을 제외한 동물.
10. 표피 부전각화를 억제하는 물질의 스크리닝 방법으로서, 편평상피세포암 관련 항원-1(SCCA-1)이 보유하는 시스테인 프로테아제 저해 활성을 억제하는 후보 물질의 활성을 지표로 하는 것을 특징으로 하는 방법.
11. 제10항에 있어서, 이하의 분석계 (1), (2), (3)을 포함하여 이루어지며, 여기서, 조건 {[z]/[x]×100}-{100-[y]/[x]×100}>0이 만족되면, 상기 후보 물질은, SCCA-1이 보유하는 시스테인 프로테아제 저해 활성을 억제하는 활성을 갖는 것으로 결정되어, 표피 부전각화를 억제하는 물질로서 선정되는 방법:

    (1) 시스테인 프로테아제의 활성을 측정하여, 그 측정치[x]를 얻는다;

    (2) i) 후보 물질을 상기 (1)에 규정된 시스테인 프로테아제의 효소 활성적 동등량과 혼합하여, 인큐베이션한다; 그리고 ii) 상기 (2) i)의 인큐베이션 혼합물의 시스테인 프로테아제 활성을 상기 (1)과 동일 조건 하에서 측정하여, 그 측정치[y]를 얻는다; 및

    (3) i) SCCA-1과, (2) i)에서 사용한 것과 동량의 상기 후보 물질을 혼합하여, 인큐베이션한다; ii) 상기 (3) i)의 인큐베이션 혼합물을 상기 (1)에 규정한 시스테인 프로테아제의 효소 활성적으로 동등량과 혼합하여, 상기 (2) i)과 동일 조건 하에서 인큐베이션한다; 그리고 iii) 상기 (3)ii)의 인큐베이션 혼합물의 시스테인 프로테아제 활성을 상기 (1)과 동일 조건 하에서 측정하여, 그 측정치[z]를 얻는다.
12. 제11항에 있어서, {[z]/[x]×100}-{100-[y]/[x]×100}>3이 만족되는 것을 조건으로 하는 방법.
13. 제12항에 있어서, {[z]/[x]×100}-{100-[y]/[x]×100}>16이 만족되는 것을 조건으로 하는 방법.
14. 제10항 내지 제13항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 시스테인 프로테아제가 카스파아제-14인 방법.
15. 제10항 내지 제13항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 시스테인 프로테아제가 파파인인 방법.
16. 애기부들 엑기스, 포도 엑기스, 토마토 엑기스, 오이 엑기스, 키위 엑기스 및 대추 엑기스로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 또는 여러 종류의 생약을 활성 성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하는 표피 부전각화를 억제하는 피부 외용 조성물.
17. 제16항에 있어서, 애기부들 엑기스를 함유하는 것을 특징으로 하는 피부 외용 조성물.
18. 제16항 또는 제17항에 있어서, 상기 표피 부전각화가 건선을 원인으로 하는 조성물.
19. 제16항 또는 제17항에 있어서, 상기 표피 부전각화가 아토피성 피부염을 원인으로 하는 조성물.
20. 표피 세포 중의 SCCA-1의 카스파아제-14 저해 활성을 억제함으로써, 표피 세포의 각화의 정상화를 도모하여, 표피 부전각화를 억제하는 방법.
21. 제20항에 있어서, 표피에 애기부들 엑기스, 포도 엑기스, 토마토 엑기스, 오 이 엑기스, 키위 엑기스 및 대추 엑기스로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 또는 여러 종류의 생약을 활성 성분으로서 함유하는 피부 외용 조성물을 도포함으로써, 표피 세포 중의 SCCA-1의 카스파아제-14 저해 활성을 억제하는 방법.
22. 제21항에 있어서, 상기 피부 외용 조성물이 애기부들 엑기스를 함유하는 것을 특징으로 하는 방법.

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