ES2484696T3 - Método de identificación de inhibidores de paraqueratosis epidérmica - Google Patents

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Abstract

Procedimiento in vitro para la identificación de sustancias que inhiben la paraqueratosis epidérmica, en donde se utiliza de indicador la actividad de una sustancia candidata que inhibe la actividad cisteína proteasa inhibidora que posee el antígeno 1 del carcinoma epidermoide (SCCA-1, por su nombre en inglés), en donde la cisteína proteasa es la caspasa 14.

Description

E11173296
23-07-2014
DESCRIPCIÓN
Método de identificación de inhibidores de paraqueratosis epidérmica
Campo de la técnica
La presente invención da a conocer un procedimiento para la identificación de sustancias que inhiben la 5 paraqueratosis epidérmica basándose en la actividad de sustancias candidatas que inhiben la actividad cisteína proteasa que posee el antígeno 1 del carcinoma epidermoide (SCCA-1).
Antecedentes de la técnica
El SSCA es un antígeno que se extrae de las células del epitelio pavimentoso que se encuentra en alta concentración en la sangre obtenida de los pacientes que padecen el carcinoma epidermoide del cuello uterino, de 10 los pulmones, del esófago y de la piel, y se utiliza con frecuencia para diagnosticar el carcinoma epidermoide (H. Kato et al., Cancer, 40: 1621-1628 (1977); N. Mino et al., Cancer, 62. 730-734 (1988)). Ya que la concentración de SCCA en la sangre muestra una correlación favorable con factores tales como la progresión del estadio del carcinoma epidermoide, el grado de neoplasia maligna y el tamaño del tumor en concreto, es un marcador particularmente eficaz no sólo para la detección precoz del cáncer, sino también para la evaluación de los efectos
15 del tratamiento contra el cáncer y el diagnóstico del riesgo de recidiva.
Además, también se sabe que se incrementa la expresión de SCCA en la capa superior de la epidermis psoriásica (Takeda et al., J. Invest. Dermatol. (2002) 118(1), 147-154). La psoriasis es un tipo de enfermedad de la piel en forma de paraqueratosis inflamatoria crónica y recurrente que se caracteriza por la proliferación y la diferenciación anormales de las células epidérmicas, y la infiltración de células inflamatorias. Se cree que la psoriasis se produce
20 debido a factores genéticos además de diferentes factores medioambientales (Hopso-Havu et al., British Journal of Dermatology (1983) 109, 77-85).
El SCCA está codificado por dos genes, SCCA-1 y SCCA-2, dispuestos en tándem en el cromosoma 18q21.3. Las proteínas SCCA-1 y SCCA-2 codificadas por estos genes tienen una masa molecular de unos 45.000 Da y, aunque son muy homólogas entre sí, se cree que tienen funciones diferentes debido a que difieren en la secuencia de
25 aminoácidos del sitio de reacción (Schick et al., J. Biol. Chem. (1997) 27231, 1849-55). Aunque se sabe que SCCA1 y SCCA-2 se expresan mucho en enfermedades tales como el carcinoma epidermoide y la psoriasis, está poco claro qué funciones desempeñan en las células enfermas.
Por otra parte, se sabe que los queratinocitos tienen la función de formar una barrera protectora denominada la «capa queratinizada» contra entornos perjudiciales como resultado de la diferenciación terminal. El proceso de la 30 diferenciación terminal está controlado de forma exacta por un programa de diferenciación y comienza con las células basales proliferativas, va a través de las etapas de células espinosas, células granulares y, finalmente, termina con la diferenciación en queratinocitos. Se producen cambios considerables dentro y fuera de los queratinocitos durante el periodo de transición de células granulares a queratinocitos. Los queratinocitos pierden el núcleo y los orgánulos celulares, mientras que adquieren una capa de lípidos periférica, una membrana celular 35 reforzada que se denomina tegumento córneo y un patrón de queratina. El patrón de queratina mantiene una estructura interna flexible y hermética. De acuerdo con resultados anteriores, los queratinocitos que están en diferenciación muestran características apoptósicas tales como células con fragmentación del ADN y células positivas con TUNEL (Haake A. R., J. Invest. Dermatol. 101, 107-12 (1993)). Se ha detectado actividad de tipo caspasa en los extractos de queratinocitos humanos, y se expresan diferentes tipos de caspasas en los 40 queratinocitos humanos. Sin embargo, otros resultados han indicado que las caspasas proapoptósicas típicas tales como caspasa 3, caspasa 6 y caspasa 7 no están activadas en el momento de la diferenciación terminal. Las anomalías de la diferenciación conducen con frecuencia a la presencia permanente de núcleos en la capa queratinizada, lo que se denomina «paraqueratosis». La paraqueratosis ocasiona un daño grave a la función de barrera que tiene la piel. Sin embargo, aún está por determinar qué factores intervienen en el procedimiento de
45 desnucleación y la manera en la que este proceso está regulado durante la diferenciación de los queratinocitos.
Wrench y Didierjean («Antibodies to orthokeratotic keratinocytes in monitoring the drug induced inhibition of parakeratotic differentiation in adult and infant mice» ARCHIVES OF DERMATOLOGICAL RESEARCH, vol. 227. n.º 3, 1 de febrero de 1985, páginas 201-208) estudiaron dos modelos experimentales de inhibición inducida por fármacos para la paraqueratosis (PQ): (1) la supresión del desarrollo normal de la PQ en la cola del ratón lactante y
50 (2) la conversión de la PQ en ortoqueratosis. Encontraron que los fenoles del alquitrán de alta ebullición ocasionan una inhibición más potente de la PQ que el valerato de betametasona.
En la patente europea EP1550459 A1 se describen inhibidores de la paraqueratosis ocasionada por los componentes estimulantes que hay en el sebo en torno a los poros prominentes. Estos agentes comprenden un antagonista de un receptor de las células excitatorias, por ejemplo, un receptor de glutamato tal como el receptor del
55 ácido N-metil-D-aspártico o un receptor de ATP tal como el receptor P2X, o un agonista de un receptor inhibidor de la célula tal como el receptor del γ-aminobutirato tal como el receptor sensible a la bicuculina que tiene un canal de Cl, o un receptor de glicina.
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Las caspasas son factores de ejecución de la muerte celular apoptósica que se conocen bien y son cisteína proteasas conservadas en el proceso evolutivo que escinden los sustratos tras un resto de ácido aspártico. Las caspasas de los mamíferos se dividen en tres subgrupos de acuerdo con su estructura y función, a saber, caspasas iniciadoras, caspasas efectoras y caspasas inflamatorias. Las caspasas efectoras cumplen la importante función de 5 degradar el ICAD, el inhibidor de la CAD (ADNasa activada por caspasa), lo que da lugar a que la CAD se disocie como una nucleasa activa (Enari M. et al., Nature, 391, 43-50 (1998)). La actividad de las caspasas está regulada por distintas moléculas. En particular, hay tres grupos de proteínas inhibidoras en colaboración directa con varias caspasas. La proteína antiapoptósica p35 de baculovirus inhibe las caspasas 1, 3, 6, 7, 8 y 10 sin actuar sobre las serina proteinasas ni sobre otras cisteína proteinasas (Zhou Q. et al., Biochemistry, 37, 10757-65 (1998)). El baculovirus también sintetiza otras proteínas antiapoptósicas e inhibidores de las proteínas apoptósicas (IPA). En los mamíferos también se encuentran homólogos de los IPA (Verhagen A. M. et al., Genome Biol., 2, Reviews 3009 (2001)). El IPA de los mamíferos bloquea la apoptosis mediante la inhibición de la caspasa 14 o al antagonizar con los factores proapoptósicos, tales como DIABLO/Smac (Wu G., Nature, 408, 1008-12 (2000)). El modificador A de la respuesta de citocinas (Crm A) es un producto genético del virus de la viruela vacuna que es capaz de inhibir las
15 caspasas apoptósicas y las caspasas inflamatorias (García-Calvo M. et al., J. Biol. Chem., 273, 32608-13 (1998)). Es muy interesante que el Crm A se haya sugerido que pertenezca a una superfamilia de inhibidores de serina proteinasas, y que algunos inhibidores de serina proteinasas, tales como PI-9 y PAI-1, sean capaces de inhibir la apoptosis al interaccionar con la caspasa 1 y la caspasa 3, respectivamente (Annand R. R. et al., Biochem. J., 342Pt3, 655-65 (1999)). Por lo tanto, será interesante determinar si la diferenciación terminal de los queratinocitos constituye o no una porción de los fenómenos de la apoptosis y la manera en que las proteínas reguladoras arbitrarias intervienen en este proceso.
La caspasa 14 es el miembro más nuevo de la familia de las caspasas y se expresa casi exclusivamente en los queratinocitos en diferenciación. La caspasa 14 se identificó mediante un homólogo de EST entre los miembros de la familia de las caspasas. De acuerdo con los hallazgos de la investigación reciente, la caspasa 14 presente en los
25 queratinocitos es un heterodímero procesado que muestra actividad enzimática con respecto al sustrato sintético Trp-Glu-His-Asp-AFC que corresponde a la caspasa 1 (Mikolajczyk J. et al., Biochemistry, 43, 10560-9 (2004)). Esta actividad hidrolítica requiere la degradación y la escisión de la proteína, así como la presencia de una sal cosmótropa. Aunque la estructura primaria de la caspasa 14 es muy similar a la de las caspasas inflamatorias, tales como las caspasas 1, 4 y 5, se ha sugerido que, al expresarse la caspasa 14 únicamente en los queratinocitos diferenciados, está implicada en la diferenciación terminal de los queratinocitos de un modo diferente (Lippens S. et al., Cell Death Differ., 7, 1218-24 (2001)). Sin embargo, todavía no se han esclarecidon el mecanismo de activación de la caspasa 14 así como su sustrato natural o los factores reguladores.
Descripción de la invención
Como resultado de llevar a cabo la investigación con el propósito de esclarecer el mecanismo fisiológico de la piel en
35 el que interviene el SCCA, los inventores de la presente invención hallaron con sorpresa que el SCCA es un factor antiapoptósico que tiene la acción de inhibir la apoptosis celular.
Sencillamente, los inventores de la presente invención llevaron a cabo estudios del mecanismo de defensa de la piel ante los UV y mostraron con claridad que la expresión del SCCA en la capa espinosa y en la capa granular se incrementaba de manera considerable debido a la irradiación UV de la piel humana. Por lo tanto, cuando se estableció un sistema de expresión estable mediante la introducción los genes SCCA-1 y SCCA-2 humanos en las células 3T3 en las que no se había observado que expresaran el SSCA, y se estudió la apoptosis inducida por la radiación UV en las células que tienen un sistema de expresión estable del SCCA, se demostró con claridad que la apoptosis inducida por la radiación UV disminuía significativamente en cada uno de los sistemas de expresión estable de SCCA.
45 Además, como resultado de establecer una línea de células que tienen atenuados los genes SSCA-1 y SCCA-2 (siSCCA) mediante interferencia por ARN, en la que el siRNA se expresó de manera constitutiva con un vector pSilencer en las células HaCat que expresaban gran cantidad de SSCA, y a continuación se irradió esa línea celular con luz UV, la velocidad de la apoptosis en las células con atenuación de SCCA se demostró que era significativamente más alta que en una línea de células de control. Basándose en estos hallazgos, los inventores de la presente invención concluyeron que el SCCA es una proteína que tiene la acción de inhibir la apoptosis.
En las enfermedades tales como la psoriasis y el cáncer asociado a la proliferación y la diferenciación celulares anormales se cree que las células cancerosas se escapan de la muerte celular y continúan proliferando de manera anormal mediante la inhibición de la apoptosis. Así pues, está claro que en células que expresan gran cantidad de SCCA, el SCCA inhibe la muerte celular debido a su acción antiapoptósica, lo que conduce a una proliferación
55 anormal de las células. En consecuencia, está claro que sería posible tratar y prevenir las enfermedades, tales como el carcinoma epidermoide y la psoriasis asociada a la proliferación anormal de las células y similares, si fuera posible inhibir la expresión del SCCA que tiene la acción inhibidora de la apoptosis.
Al tener en cuenta estos hallazgos, un objeto de la presente invención es dar a conocer un procedimiento y una composición farmacéutica para tratar y prevenir las enfermedades asociadas a la proliferación anormal de células que expresan el SCCA en gran cantidad y en particular el carcinoma epidermoide y la psoriasis.
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Además, un objeto de la presente invención es desarrollar medios para inhibir y tratar la paraqueratosis epidérmica mediante una estrategia completamente nueva que difiere de la técnica anterior mediante el esclarecimiento del mecanismo de la paraqueratosis epidérmica. Cuando se considera que no hay fármacos eficaces para las enfermedades de la piel tales como la dermatitis atópica y la psoriasis asociada a la paraqueratosis, la presente invención se espera que tenga un efecto considerable en los campos de la dermatología y de la cosmética.
La presente invención incluye los aspectos de la invención que se describen a continuación.
[1] Un procedimiento para la identificación de sustancias que inhiben la paraqueratosis epidérmica, en donde se utiliza como indicador la actividad de una sustancia candidata que inhibe la actividad inhibidora de cisteína proteasas que posee el antígeno 1 del carcinoma epidermoide (SCCA-1).
[2] El procedimiento del punto [1] anterior, que comprende los siguientes sistemas de ensayo (1), (2) y (3):
(1)
medir la actividad cisteína proteasa y obtener el valor medido [x];
(2)
i) mezclar un compuesto candidato con una cantidad igual de cisteína proteasa que se define en el punto (1) anterior en términos de actividad enzimática seguido de la incubación; y
ii) medir la actividad cisteína proteasa de la mezcla incubada del punto (2) i) anterior en las mismas condiciones que en el punto (1) anterior y obtener el valor medido [y]; y,
(3)
i) mezclar el candidato deseado en una cantidad igual a la utilizada en el punto (2) i) con el SCCA-1 seguido de la incubación;
ii) mezclar la mezcla incubada del punto (3) i) con una cantidad igual de cisteína proteasa que se define
en el punto (1) anterior en términos de actividad enzimática, e incubar en las mismas condiciones que
en el punto (2) i) anterior; y
iii) medir la actividad cisteína proteasa de la mezcla incubada del punto (3) ii) anterior en las mismas condiciones que en el punto (1) anterior y obtener el valor medido [z]; en donde,
el compuesto candidato se determina que tiene una actividad que inhibe la actividad inhibidora de cisteína proteasas que posee SCCA-1 y se selecciona como una sustancia que inhibe la paraqueratosis epidérmica si satisface la condición siguiente:
([z ]/[x] x 100} – {100 – [y]/[x] x 100 } > 0.
[3] El método del punto [2] anterior, en donde la condición a satisfacer es {[z]/[x] x 100} – {100 – [y]/[x] x 100} > 3.
[4] El método del punto [3] anterior, en donde la condición a satisfacer es {[z]/[x] x 100} – {100 – [y]/[x] x 100} > 16.
[5] El método según cualquiera de los puntos [1] a [4] anteriores, en donde la cisteína proteasa es la caspasa 14.
[6] El método según cualquiera de los puntos [1] a [4] anteriores, en donde la cisteína proteasa es la papaína.
De acuerdo con esto, la presente invención es capaz de dar a conocer medios para inhibir y tratar la paraqueratosis epidérmica mediante el uso de una estrategia completamente nueva que difiere de la técnica anterior.
Breve descripción de los dibujos
En la figura 1 se muestra la expresión de SCCA en la epidermis en los sitios expuestos y en los sitios sin exponer.
En la figura 2 se muestran las fluctuaciones de la expresión de SCCA en la epidermis debido a la irradiación UV.
En la figura 3 se muestran los efectos de la irradiación UV sobre la expresión del SCCA en los queratinocitos humanos cultivados.
En la figura 4 se muestra una comparación de la apoptosis inducida por irradiación UV entre las células que expresan gran cantidad de SCCA y las células que no expresan el SCCA.
En la figura 5 se muestra el establecimiento de una línea de células con atenuación de SSCA.
En la figura 6 se muestra una comparación de la velocidad de la apoptosis inducida por la irradiación UV entre las células con atenuación de SCCA y las células de control.
En la figura 7 se muestra un análisis de transferencia Western de un extracto de piel. La presencia de zimógeno y caspasa 14 activa mediante inmunotransferencia con el anticuerpo H-99 y con el anticuerpo h14D146. Se aplicaron 10 μg (carriles 1, 2 y 4) y 1 μg (carril 3) de extracto de piel completo, de extracto de piel equivalente y de extracto de queratinocitos.
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En la figura 8 se muestra un análisis de la caspasa 14 purificada. (A) La fracción n.º 25 obtenida por cromatografía en Superdex 75 después de la electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS se transfirió a una membrana de PVDF y se tiñó con azul brillante de Coomassie. Se observaron dos bandas de proteína, una a 17 kDa y otra a 11 kDa. (B) Análisis de transferencia Western con los anticuerpos H-99, h14D146 y C20. La banda de 17 kDa se observó
5 que era positiva tanto para el anticuerpo H99 como para el h14D146, mientras que la banda de 11 kDa fue reconocida por el anticuerpo C20.
En la figura 9 se muestran los resultados de diferentes inhibidores sobre la caspasa 14 purificada. La caspasa 14 se incubó con los inhibidores peptídicos de la caspasa (que consisten en YVAD, VDVAD, DEVD, VEID, IETD, LEHD y DNLD) y los inhibidores específicos de clase de las cisteína proteinasas (IAA) y de las serina proteinasas (AEBSF).
10 Se midió la actividad enzimática residual con WEHD-MCA como sustrato en presencia de citrato de sodio a 1,3 M y DTT a 5 mM. Las enzimas se analizaron en concentraciones de 5, 2,5 y 1,25 μM, respectivamente. Los valores se muestran como los valores medios de ensayos por duplicado.
En la figura 10 (A) se muestra la actividad cortadora de ICAD que tiene la caspasa 14 purificada. (B) muestra un análisis de transferencia Western con el anticuerpo FL331. Se observaron los productos de la escisión a 33 y 27 15 kDa. La escisión por ICAD se inhibió completamente mediante preincubación con 10 μM de SCCA-1. La descomposición de ICAD sólo se observó en presencia de una sal cosmótropa. El análisis de transferencia Western que utiliza un anticuerpo específico contra el extremo amino mostró la pérdida de moléculas de ICAD intactas durante la incubación extendida con la caspasa 14. Cuando se añadió el SCCA-1 a la mezcla, la degradación de ICAD resultó virtualmente indetectable, y seguía sin haber efectos tras la incubación durante 16 horas (B). (C) Se
20 muestran los resultados de investigar la actividad hidrolítica sobre los sustratos sintéticos de caspasa en presencia de una sal cosmótropa.
En la figura 11 se muestra la localización de la caspasa 14 activa y las células positivas con TUNEL. Los cortes delgados de piel humana normal se tiñeron con el anticuerpo H-99 (A), con el anticuerpo h14D146 (B) y con TUNEL (C). Se utilizó Texas-Red para la detección fluorescente (B). Se utilizó FITC para TUNEL, se utilizó Texas-Red para
25 la inmunotinción y se realizó la tinción doble con TUNEL y la caspasa 14.
En la figura 12 se muestra la colocalización del ICAD y los núcleos paraqueratósicos. Los cortes delgados de piel humana normal se tiñeron con el anticuerpo anti-ICAD FL331. Casi todos los núcleos subepidérmicos daban positivo con este anticuerpo. Cuando se tiñó con el anticuerpo el ICAD de la capa superficial de los queratinocitos de la piel de pacientes con DA se observaron sitios positivos de distintos tamaños (B). La tinción nuclear con yoduro de
30 propidio (PI) mostró que se observaban con frecuencia aglomeraciones nucleares (C). Las observaciones en campo brillante de los mismos sitios indicaron escalas solapantes sobre la superficie (D). La superposición de imágenes demostró con claridad la presencia de ICAD sólo en los sitios de paraqueratosis (E). La superposición de imágenes de tinción nuclear también se indicó en las observaciones de campo brillante (F).
En la figura 13 se muestra la colocalización de SCCA-1 y de los núcleos paraqueratósicos. Apenas se pudo detectar
35 nada de SCCA-1 en los cortes de piel normal. Los sitios positivos para SCCA-1 se observaron en la capa superficial de la piel de pacientes con DA (H). Las aglomeraciones nucleares se observaron solamente en estos sitios (I). La imagen de campo brillante se muestra en (J). La superposición de imágenes indicó que los sitios positivos para SCCA-1 se superponen preferiblemente con los sitios donde están presentes los núcleos sin digerir (K). También se muestran la tinción de SCCA-1 y una superposición de imágenes diferente que corresponde a la observación de
40 campo brillante (L).
Mejor modo de realizar la invención
Procedimiento para identificar sustancias que inhiben la paraqueratosis, las sustancias identificadas con este procedimiento y el procedimiento para inhibir la paraqueratosis
La psoriasis es un tipo de enfermedad de la piel en forma de paraqueratosis inflamatoria recurrente y crónica que se
45 caracteriza por la proliferación y diferenciación anormales de las células epidérmicas y la infiltración de células inflamatorias. Se cree que la psoriasis se produce debido a factores genéticos además de diferentes factores medioambientales (Hopso-Havu et al., British Journal of Dermatology (1983) 109, 77-85). El SCCA está codificado por dos genes, SCCA-1 y SCCA-2, dispuestos en tándem en el cromosoma 18q21.3. Las proteínas SCCA-1 y SCCA-2 codificadas por estos genes tienen una masa molecular de unos 45.000 Da, y aunque son muy homólogas
50 entre sí, se cree que tienen diferentes funciones debido a que tienen diferente secuencia de aminoácidos en el sitio de reacción (Schick et al., J. Biol. Chem. (1997) 27231, 1849-55).
El procedimiento de identificación de las sustancias que inhiben la paraqueratosis tal y como se reivindica en la presente invención utiliza, a modo de indicador, la actividad de una sustancia candidata que inhibe la actividad inhibidora de cisteína proteasas que posee SCCA-1. Aunque idealmente es mucho más preferible utilizar la caspasa
55 14 como cisteína proteasa, se pueden utilizar como un sustitutos otros miembros de la familia de las caspasas o, en función de lo fácil que resulte comprarlos, cualquier otro tipo conocido de cisteína proteasa, tal como papaína, catepsinas tal como la catepsina B o la catepsina L, bromelaína o ficina.
En un aspecto preferible del mismo, el procedimiento de identificación antes mencionado está compuesto por (1) un
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sistema para ensayar la actividad cisteína proteasa, (2) un sistema para ensayar la actividad cisteína proteasa en presencia solo de una sustancia candidata, y (3) un sistema para preincubar una sustancia candidata y SCCA-1, y ensayar la actividad cisteína proteasa en presencia de la mezcla incubada. El sistema de ensayo (2) hace posible determinar los efectos de la sustancia candidata sobre la cisteína proteasa. Además, no hay limitaciones concretas
5 en el orden en el cual se llevan a cabo los sistemas de ensayo (1), (2) y (3), y los ensayos se pueden llevar a cabo el mismo día o días diferentes siempre y cuando las condiciones de ensayo sean las mismas.
La medición de la actividad enzimática cisteína proteasa se puede llevar a cabo mediante un método conocido entre personas expertas en la técnica mediante el uso de un sustrato de cisteína proteasa utilizado corrientemente tal como hidrocloruro de Nα-benzoíl-L-arginina-4-nitroanilido (L-BAPNA).
10 En un aspecto particularmente preferible del mismo, este procedimiento de identificación se puede llevar a cabo de la misma manera que se describe a continuación.
(1) Sistema para ensayar la actividad cisteína proteasa
Se incuba la cisteína proteasa durante una cantidad de tiempo determinada con anterioridad en un tampón de ensayo adecuado, tal como tampón HEPES. A continuación se le añade un sustrato de cisteína proteasa tal como L
15 BAPNA y, tras incubarlo durante una cantidad de tiempo determinada con anterioridad a una temperatura determinada con anterioridad, se desarrolla el color y luego se mide la actividad enzimática [x] de la cisteína proteasa.
(2) Sistema para ensayar la actividad cisteína proteasa en presencia de una única sustancia candidata
Después de incubar el tampón de ensayo arriba mencionado y la sustancia candidata durante una cantidad de
20 tiempo determinada con anterioridad, se añade la cisteína proteasa y luego se mide la actividad cisteína proteasa en las mismas condiciones que en (1). El porcentaje (%) de esta actividad enzimática cisteína proteasa [y] dividido por la [x] arriba mencionada se determina mediante {[y]/[x] x 100}.
El valor de {[y]/[x] x 100} es un indicador de la actividad inhibidora de cisteína proteasas que posee una sustancia problema según se describe más arriba, o, en otras palabras, cuanto más próximo de 100 esté ese valor, menos
25 actividad inhibidora de cisteína proteasas tendrá la sustancia problema. Además, también se determina el valor obtenido al sustraer el valor {[y]/[x] x 100} de 100, a saber {100 – [y]/[x] x 100}. En este caso, cuando más cerca de 0 esté este valor, menos actividad inhibidora de cisteína proteasas tendrá la sustancia problema.
(3) Medición de la actividad enzimática en un sistema que contiene SCCA-1, la sustancia candidata y la cisteína proteasa
30 Se mezclan el tampón de ensayo arriba mencionado y SCCA-1, y luego se les añade una sustancia candidata y se incuba durante una cantidad de tiempo determinada con anterioridad. A continuación, la actividad cisteína proteasa
[z] se mide en las condiciones de (1) o (2). El porcentaje (%) de esta actividad enzimática cisteína proteasa [z] con respecto a la [x] arriba mencionada se determina mediante {[z]/[x] x 100}.
Este valor de {[z]/[x] x 100} es un indicador del total de la actividad inhibidora de cisteína proteasas que tiene SCCA
35 1 y de la actividad inhibidora de cisteína proteasas que tiene la propia sustancia problema o, en otras palabras, cuanto más próximo de 100 esté este valor, más baja será la actividad inhibidora total.
Finalmente, se determina el valor que se obtiene al sustraer el valor de {100 – [y]/[x] x 100} del valor de {[z]/[x] x 100}. Cuanto mayor sea esta diferencia, menor será la actividad inhibidora de cisteína proteasas de SCCA-1 en el sistema que contiene SCCA-1, la sustancia candidata y la cisteína proteasa, lo que sugiere la sustancia candidata
40 suprime notablemente la actividad inhibidora de cisteína proteasas que tiene SCCA-1.
Una sustancia identificada de acuerdo con el procedimiento descrito anteriormente se supone que es una sustancia que tiene un efecto inhibidor sobre la actividad inhibidora de cisteína proteasas que tiene SCCA-1 y, además, tiene muchas posibilidades de tener una función inhibidora de la paraqueratosis y de ser útil como inhibidora de la paraqueratosis.
45 La confirmación de la función inhibidora de la paraqueratosis de tal sustancia se puede llevar a cabo fácilmente al aplicarla a la piel en la cual aparece la paraqueratosis, tal como la piel de un animal modelo y, a continuación, observando si hay efecto curativo. Así pues, un procedimiento de identificación tal y como se reivindica en la presente invención es muy útil como procedimiento para la identificación inicial de sustancias que inhiben la paraqueratosis entre un número infinito de sustancias candidatas, tal como productos fitofarmacéuticos. Los
50 ejemplos de afecciones en las que se observa la paraqueratosis incluyen la psoriasis, la dermatitis atópica, la paraqueratosis, la queratosis solar, la queratosis seborreica y el liquen plano. Por consiguiente, una sustancia seleccionada de acuerdo con el procedimiento de identificación que se reivindica en la presente invención es útil para el tratamiento y la prevención de estas enfermedades de la piel.
Cuando los inventores de la presente invención estudiaron los efectos inhibidores de distintos productos
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fitofarmacéuticos sobre la actividad inhibidora de cisteína proteasas que tiene SCCA-1, se encontró que poseen tales efectos inhibidores el extracto de anea, el extracto de uva, el extracto de tomate, el extracto de pepino, el extracto de kiwi y el extracto de azufaifo.
Lo que viene a continuación da a conocer una explicación más detallada de la presente invención a través de 5 ejemplos específicos de la misma. Además, la presente invención no está limitada por estos ejemplos.
El ejemplo (2-xiv) se presenta como una realización de la invención. El ejemplo (1) y el ejemplo (2-i)-(2-xiii) se presentan para que sean útiles para la comprensión de la invención.
Ejemplos
(1) Procedimiento y composición farmacéutica para el tratamiento de la psoriasis y/o del carcinoma epidermoide
10 (1-i) Exploración inmunohistoquímica
Una biopsia de epidermis se fijó con acetona fría y luego se embebió en parafina de acuerdo con el procedimiento de AMeX (Sato, Y. et al., Am. J. Pathol., 125, 431-435 (1986)). Se retiraron cortes delgados de la parafina con xileno, y se lavaron con acetona y después con PBS. A continuación, los sitios de fijación inespecíficos de los cortes delgados se bloquearon con suero de conejo normal al 10 % (Histofine, Tokio, Japón).
15 Los cortes delgados de la epidermis se incubaron respectivamente con el anticuerpo monoclonal anti-SCCA-1 (Santa Cruz Biotechnology, CA, EE.UU.) (diluido 1:500), con el anticuerpo monoclonal anti-SCCA-2 (Santa Cruz Biotechnology, CA, EE.UU.) (diluido 1:500) o con anticuerpo policlonal anti-SCCA (purificado como se describió en Takeda, A. et al, J. Invest. Dermatol., 118, 147-154 (2002)). Después de lavar con PBS, los cortes delgados se contratiñeron con hematoxilina y se observaron con el Dako Envision System (Dako Corp., CA, EE.UU.).
20 En la figura 1 se muestran los resultados de las observaciones al microscopio con especímenes epidérmicos de la epidermis de sitios sin exponer que consisten en la extremidad superior (humano, 24 años de edad), glúteos (humano, 46 años de edad) y muslo (humano, 75 años de edad), y de la epidermis de sitios expuestos que consisten en la mejilla (humanos, 20 años de edad, 76 años de edad) y el párpado (humano, 82 años de edad), y con el uso del anticuerpo policlonal anti-SCCA que se fija tanto a SCCA-1 como a SCCA-2. A partir de la figura 1 se puede
25 entender que la cantidad de SCCA es considerablemente más alta en la capa superior de la epidermis de los sitios expuestos que de los sitios sin exponer. Sin embargo, no se observó ningún incremento de expresión de SCCA en la capa basal, incluso en los sitios expuestos.
En la figura 2 se muestran los resultados de las observaciones al microscopio de la expresión de SCCA-1 y SCCA-2 en especímenes de epidermis que consisten en piel humana sometida a radiación UV (transiluminador Torex FL205
30 E-30/DMR (Toshiba Medical Supply)) y epidermis de control no sometida a la radiación UV, respectivamente. Los anticuerpos utilizados para ambos especímenes consistían en el anticuerpo monoclonal anti-SCCA-1 y el anticuerpo monoclonal anti-SCCA-2. A partir de la figura 2 queda claro que se incrementa tanto la expresión de SCCA-1 como la de SCCA-2 como resultado de irradiar la epidermis humana con luz UV. Además, ese incremento de la expresión era manifiesto en la capa espinosa y en la capa granular de la piel.
35 Sobre la base de estos hallazgos, se demostró con claridad que se incrementa la expresión de SCCA-1 y de SCCA2 en la epidermis, y en particular en la capa espinosa y en la capa granular, cuando la epidermis se irradia con luz UV.
(1-ii) Experimento de PCR cuantitativa
A continuación se llevó a cabo un experimento para confirmar que la expresión de SCCA-1 y de SCCA-2 en la 40 epidermis se incrementa a nivel génico por la radiación UV.
Se cultivaron queratinocitos humanos en el medio SFM para queratinocitos (Gibco, Invitrogen) en presencia de Lglutamina y del factor de crecimiento de las células epiteliales a 37 ºC en una atmósfera de CO2 al 5% con una elevada humedad. Las células que tenían una densidad de confluencia del 60 al 70 % se irradiaron con UVB durante 0 a 48 horas. Las células se irradiaron con UVB en el transiluminador Torex FL205-E-30/DMR (Toshiba Medical
45 Supply) a una intensidad de 50 mJ/cm2. Las células de control no se irradiaron con UVB.
El ARN total de las células cultivadas se aisló y se purificó con Isogen (Nippon Gene) de acuerdo con las instrucciones proporcionadas. El nivel de expresión de SCCA-1 y de SCCA-2 se determinó mediante sendas reacciones en cadena de la polimerasa (PCR) cuantitativas y en tiempo real. En pocas palabras, el ARN total se convirtió en ADNc con la Supercript II (Invitrogen, Carlsbad, CA). A continuación, esa muestra se amplificó con 40
50 ciclos de PCR de 2 etapas en el sistema de detección de secuencias ABI PRISM 7900HT (Applied Biosystems, Foster City, CA). Se utilizó la GAPDH (gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa) para el estándar interno.
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Los cebadores utilizados eran según se describe a continuación. SCCA-1:
Cebador directo: 5'
-3' (SEQ ID n.º 3)
Cebador inverso: 5'
-3' (SEQ ID n.º 4)
5
Sonda Taq Man: 5' -3' (SEQ ID n.º 5)
SCCA-2:
10 GAPDH:
Cebador directo: 5'- -3' (SEQ ID n.º 9)
Cebador inverso: 5'- -3' (SEQ ID n.º 10)
Sonda Taq Man: 5'- -3-' (SEQ ID n.º 11)
Se conjugó un colorante indicador (6-carboxifluoresceína) al extremo 5' de la secuencia de la sonda Taq Man y se 15 incorporó un colorante extintor (6-carboxitetrametilrodamina) en el extremo en 3' de la misma.
En la figura 3 se muestran los resultados del efecto de la radiación UVB sobre la expresión del SCCA en los queratinocitos humanos cultivados. La expresión de SCCA-1 y de SCCA-2 se incrementó con claridad por la radiación UV. Así pues, queda claro que la expresión de SCCA-1 y de SCCA-2 en las células epidérmicas se incrementa a nivel génico por la radiación UV.
20 Estudio de la función de SCCA en la radiación UV
Tal y como se ha descrito anteriormente, la expresión de SCCA-1 y SCCA-2 en las células epidérmicas se incrementa como resultado de estar sometida a la radiación UV. A continuación se llevó a cabo un estudio sobre la función desempeñada por SCCA-1 y SCCA-2 en las células epidérmicas sometidas a la radiación UV.
(1-iii) Establecimiento de células que expresan SCCA-1 y SCCA-2 en gran cantidad
25 Las células 3T3 (adquiridas a la ATCC) son células procedentes de fetos de ratón que no expresan ni SCCA-1 ni SCCA-2. En estas células se insertó un gen que codifica SCCA-1 o SCCA-2 tal y como se describe a continuación.
El ADNc de SCCA-1 y SCCA-2 (Takeda, A. et al., J. Invest. Dermatol., 118, 147-154 (2002)) se digirió doblemente con BamHI y KpnI. A continuación, éstos se subclonaron en un vector pTarget que luego se introdujo en las células 3T3 mediante el uso de Lipofectamine Plus (Gibco, Invitrogen). Brevemente, 20 µg del ADNc en 675 µl del medio 30 DMEM sin suero (Invitrogen Corp.) se mezclaron con 75 µl del reactivo Plus y se dejó reposar durante 15 minutos a 25 ºC. Se añadió Lipofectamine (100 µl) a 650 µl del medio DMEM sin suero y luego se añadió la misma a la mezcla de cDNA-Plus anteriormente mencionada y se dejó reposar durante 15 minutos a 25 ºC. A continuación, esta mezcla de ADNc se añadió a 10 ml de medio DMEM sin suero, y las células 3T3 se incubaron en éste durante 4 horas a 37 ºC en una atmósfera con CO2 al 5 %. El medio se reemplazó por medio DMEM que contenía STF al 10% (Invitrogen
35 Corp.) y después se incubó durante una noche. Al día siguiente se le añadió G418 (Calbiochem) a una concentración final de 500 µg/ml. El G418 se mantuvo a esta concentración durante el tiempo de cultivo. El medio se reemplazó cada 2 o 3 días. Después del cultivo durante 4 semanas, se pudieron aislar varias colonias resistentes a G418 y se establecieron los sistemas celulares que expresaban SCCA-1 y SCCA-2.
Las células que llevaban insertado el ADNc que codifica SCCA-1 (células con inserción de SCCA-1) se confirmó que
40 expresaban SCCA-1 de manera específica y estable, mientras que las células que llevaban insertado el ADNc que codifica SCCA-2 (células con inserción de SCCA-2) se confirmó que expresaban SCCA-2 de manera específica y estable. Además, las células 3T3 que llevaban insertada una secuencia inespecífica por el mismo procedimiento (células de control) no expresaban ni SCCA-1 ni SCCA-2.
Se llevó a cabo un estudio sobre la función que desempeñan SCCA-1 y SCCA-2 cuando las células epidérmicas se 45 sometieron a la radiación UV utilizando las células con inserción de SCCA-1, las células con inserción de SCCA-2 y
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las células de control mencionadas anteriormente. Más específicamente, en las células epidérmicas se hizo un estudio de la función de SCCA-1 y SCCA-2 con relación a la apoptosis inducida por UV.
Cada una de las células anteriormente mencionadas se cultivó en medio DMEM que contenía STF al 10 % a 37 ºC en una atmósfera con CO2 al 5 % y humedad elevada. Las células que están a una densidad de aglomeración del 60 5 al 70 % se irradiaron con UVB durante 0 a 48 horas. Las células se irradiaron con UVB en el transiluminador Torex FL205-E-30/DMR (Toshiba Medical Supply) a una intensidad de 50 mJ/cm2.
Se evaluó la apoptosis en estas células con el FACS Coulter (EPIX XL-MCL, Beckman Coulter) y se analizaron por FACS (clasificación de células activadas fluorescentes) mediante la doble tinción con anexina V-FITC y yoduro de propidio (PI) (Annexin V-FITC Kit, Immunotech) para el indicador.
10 Esos resultados se muestran en la figura 4. Tal y como queda claro a partir de la figura 4, la apoptosis atribuible a la irradiación UV se observó que disminuía significativamente en las células con inserción de SCCA-1 y las de SCCA
2. Así pues, se supone que SCCA-1 y SCCA-2 fueron capaces de inhibir la apoptosis inducida por la luz UV.
Para confirmar este hallazgo, los inventores de la presente invención establecieron líneas de células con atenuación génica de SCCA-1 y de SCCA-2 mediante interferencia por ARN para explorar más la función de SCCA-1 y SCCA-2
15 en las células epidérmicas sometidas a la radiación UV.
(1-iv) Establecimiento de las células con atenuación génica de SCCA
Las células HaCat (H. Hans et al., Experimental Cell Research, 239, 399-410 (1998)) son queratinocitos humanos que expresan una gran cantidad de SCCA. Se establecieron líneas de células con atenuación génica de SCCA-1 y de SCCA-2 mediante la expresión constitutiva del siRNA (ARN pequeño interferente) con un vector pSilencer
20 (Ambion) de acuerdo con el procedimiento para la interferencia por ARN.
Se construyó el siRNA en el vector pSilencer de acuerdo con las instrucciones proporcionadas. Más
complementario a los nucleótidos de las posiciones 46 a 66 de un gen que codifica el SCCA, y un oligonucleótido 25 antisentido de 65 nucleótidos (SEQ ID n.º 13) que contiene un oligonucleótido de 21 nucleótidos
: SEQ ID n.º 3) homólogo a los nucleótidos de las posiciones 46 a 66, se clonó entre el sitio HindIII y el sitio BamHI del vector pSilencer. La transfección en las células HaCat se llevó a cabo con Lipofectamine 2000 (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones proporcionadas. Las células de control se prepararon con un oligonucleótido bicatenario que consiste en dos oligonucleótidos ni significativamente homólogos
30 ni complementarios a ninguna secuencia génica de mamífero. Se adquirió un sistema de células estables mediante la selección de las células transfectadas en el medio selectivo con higromicina B después de cultivarlas durante 4 a 6 semanas. El procedimiento descrito más arriba se utilizó para confirmar si estaba inhibida la expresión de SCCA, y se midió por PCR en tiempo real la expresión de SCCA-1 y de SCCA-2.
Oligonucleótido sentido (SEQ ID n.º 12)
imagen2
imagen3
imagen4
(el subrayado indica la región homóloga) Oligonucleótido antisentido (SEQ ID n.º 13)
imagen5
(el subrayado indica la región complementaria)
40 Estos resultados se muestran en la figura 5. Se confirmó que la expresión de SCCA-1 y de SCCA-2 estaba inhibida (por atenuación génica) al 90 % o más en las células que llevaban insertado el siRNA como se describió más arriba en comparación con las células de control.
A continuación se llevó a cabo un estudio sobre la función de SCCA-1 y de SCCA-2 con respecto a la apoptosis inducida por UV en las células epidérmicas mediante la utilización de estas células con atenuación génica y las
45 células de control.
Cada una de las células se cultivó en medio SFM para queratinocitos (Gibco, Invitrogen) en presencia de Lglutamina y el factor de crecimiento de las células epiteliales a 37 ºC en una atmósfera con CO2 al 5 % y humedad elevada. Las células que estaban a una densidad de confluencia del 60 al 70 % se irradiaron con UVB. Las células
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se irradiaron con UBV en el transiluminador Torex FL205-E-30/DMR (Toshiba Medical Supply) a una intensidad de 50 mJ/cm2.
Se evaluó la apoptosis de estas células con el FACS Coulter y se analizó por FACS (clasificación de células activadas fluorescentes) mediante la tinción doble con anexina V-FITC y yoduro de propidio (PI) (Annexin V-FITC 5 Kit, Immunotech) para el indicador.
Los resultados se muestran en la figura 6. Como resultado de irradiar con luz UV las células con atenuación génica, a diferencia de las células de control de las que el 38 % entraron en apoptosis, se indujo la apoptosis en casi el 80 % de las células con atenuación génica. Así pues, se determinó que el SCCA inhibe significativamente la apoptosis que se induce por la radiación UV en las células epidérmicas. Por consiguiente, se determinó con claridad que el SCCA
10 es responsable del mecanismo de defensa contra los UV en las células epidérmicas, mientras que también es una proteína que tiene una acción que inhibe la apoptosis.
(2) Procedimiento para la identificación de las sustancias que inhiben la paraqueratosis, las sustancias identificadas mediante este procedimiento y el procedimiento para inhibir la paraqueratosis
(2-i) Materiales y métodos
15 Materiales
Se compraron Ac-WEHD-MCA, Ac-YVAD-MCA, Ac-VDVAD-MCA, Ac-DEVD-MCA, Ac-VEID-MCA, Ac-IETD-MCA y Ac-LEHD-MCA a Peptide Institute, Inc. (Osaka, Japón).
Se compraron benciloxicarbonil (Z)-YVAD-FMK, Z-VDVSD-FMK, Z-DEVD-FMK, Z-VEID-FMK, Z-IETD-FMK, ZLEHD-FMK y Z-VAD-FMK a BioVision (Mountain View, CA). Las caspasas recombinantes 1 a 10 se obtuvieron de
20 BIOMOL Research Labs, Inc. (Plymouth Meeting, PA).
El anticuerpo H-99 (Santa Cruz Biotechnology, Inc.) se utilizó para detectar las proformas y las subunidades grandes de la caspasa 14. El anticuerpo H-99 es un anticuerpo que se produce en respuesta a los péptidos que corresponden a los aminoácidos 24 a 122 de la caspasa 14 humana y, por lo tanto, reacciona con las proenzimas de la caspasa 14 y con sus formas procesadas, es decir, su subunidad grande.
25 El anticuerpo C-20 (Santa Cruz Biotechnology) se utilizó para detectar la subunidad pequeña de la caspasa 14. El anticuerpo específico del sitio de escisión (h14D146) se preparó mediante la inmunización de un conejo con un pentapéptido sintético TVGGD equivalente al supuesto sitio de procesamiento de la caspasa 14 humana.
(2-ii) Medición de la actividad hidrolítica de WEHD-MCA
La actividad de la caspasa 14 se midió con Ac-WEHD-MCA como sustrato mediante la adición de cierto grado de
30 variación al procedimiento descrito en Mikolajczyk, J. et al., Biochemistry, 43, 10560-9 (2004). Brevemente, la mezcla del ensayo se preparó a partir de 45 µl de tampón HEPES a 0,1 M (pH 7,5), 0,06 M de NaCl, 0,01 % de CHAPS, 5 mM de DTT, 1,3 M de citrato de sodio y 10 µM de WEHD-MCA (todas las concentraciones indican la concentración final). Se añadió una muestra de enzima (5 µl) a esta mezcla y luego se incubó durante 10 a 30 minutos. Se detuvo la reacción con 150 µl de ácido monocloroacético a 0,1 M, y las mediciones se realizaron a una
35 longitud de onda de excitación de 355 nm y a una longitud de onda de emisión de 460 nm con el Fluoroskan Ascent FL (Thermo Electron Co., Wolsam, MA). En el caso del ensayo de inhibidores, la caspasa 14 y el inhibidor peptídico se incubaron en el tampón de ensayo durante 15 minutos, y se comenzó el ensayo con la adición de 5 µl de WEHD-MCA a 100 µM.
(2-iii) Purificación de la caspasa 14
40 Las células queratinizadas humanas (aproximadamente 14 g) que se rasparon de los talones de individuos sanos se extrajeron con Tris-HCl a 0,1 M (pH 8,0) que contenía 0,14 M de NaCl mediante el uso de un homogeneizador de vidrio. Se obtuvo un sobrenadante después de centrifugar a 15.000 g durante 60 minutos. Después de la concentración con Amicon Ultra (Millipore, MA) y de la desalinización con la columna de desalado rápido HR10/10 (Amersham Biosciences), se aplicó el producto bruto a una columna HiPrep 16/10 QXL. La columna se lavó con
45 Tris-HCl a 20 mM (pH 8,0) y se eluyó con un gradiente lineal de NaCl de 0 a 1 M. Se le siguió la pista en las fracciones mediante transferencia Western con el anticuerpo anti-caspasa 14 (H-99) (Santa Cruz Biotechnology, CA) y el anticuerpo h14D146. Además, en cada fracción se midió la actividad hidrolítica con respecto a Ac-Tyr-Glu-HisAsp-metil-coumarinaamida (WEHD-MCA) (Peptide Institute, Inc., Osaka, Japón). Las fracciones positivas se colocaron en una columna Mono Q equilibrada con el mismo tampón y se eluyó con un gradiente máximo de NaCl
50 de 1 M. La fracción de la caspasa 14 se volvió a separar en una cromatografía de intercambio catiónico en Mono S. La columna se equilibró con tampón acetato a 20 mM (pH 4,5) y se eluyó en un gradiente de NaCl de 0 a 1 M. Las fracciones positivas se concentraron y se colocaron en una columna Mono P de cromatoenfoque equilibrada con 25 mM de etanolamina (pH 8,3). Se eluyó la columna mientras se formaba un gradiente de pH de 8 a 5 con 46 ml del Polybuffer (pH 5,0). La caspasa 14 se purificó finalmente por cromatografía en gel Superdex 75. La concentración de
55 proteínas se determinó con el kit de ensayo de proteínas de BioRad (BioRad Lab, Hércules, CA).
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(2-iv) Preparación de la caspasa 14 y el SCCA-1 recombinantes
El ADNc que codifica la caspasa 14 se aisló y amplificó aq partir del ADNc de queratinocitos por PCR con un
5 Se clonó el producto de la PCR se clonó en el vector pQE-100 DoubleTaq (Qiagen, Valencia, CA) y se expresó en E. coli JM109.
Se aisló el ADNc de SCCA-1 a partir de una genoteca de ADNc (Takeda A. et al., J. Invest. Dermatol. 118, 147-154 (2002)) y se clonó en el vector pQE30 (Qiagen). La proteína recombinante se purificó con agarosa Ni-NTA (Qiagen) y cromatografía en Mono Q.
10 (2-v) Inmunohistoquímica
Se obtuvieron muestras de cuero cabelludo humano mediante cirugía plástica después de obtener el consentimiento del paciente. El tejido se fijó con paraformaldehído (PFA) al 4% en solución tamponada con fosfato (pH 7,4) y, a continuación, se embebió en parafina. A continuación se prepararon cortes delgados y luego se incubaron con el anticuerpo adecuado durante una noche a 4 ºC. Se utilizó IgG anticonejo de cabra conjugada a peroxidasa (Nichirei
15 Corp.) como anticuerpo secundario y se hizo reaccionar con un reactivo de revelado de color en forma de DAB.
En el caso de la detección con tinción doble de las células positivas con TUNEL y la caspasa activa, se utilizó IgG anticonejo conjugada al colorante Texas Red (marca registrada) (Rova) como anticuerpo secundario. La reacción con TUNEL se llevó a cabo con el kit de detección de la muerte celular in situ con fluoresceína (Roche Diagnostics) de acuerdo con las instrucciones proporcionadas por el fabricante.
20 Se utilizaron los anticuerpos IgG ICAD (FL331, Santa Cruz Biotechnology) y DFF45/ICAD Ab-2 (NeoMarkers, Fremont, CA) en el caso de transferencia Western y análisis de inmunohistoquímica de ICAD.
La paraqueratosis desigual se ha descrito que se observa con frecuencia en la piel de pacientes con dermatitis atópica (DA) activa (Sakurai, K. et al. J. Dermatol. Sci., 30, 37-42 (2002); Piloto Valdés L. et al., Allergol. Immunopathol. (Madr), 18, 321-4 (1990)). En este experimento, se investigó la localización de ICAD y SCCA-1 en la 25 piel paraqueratósica con un procedimiento no invasivo. Se recogió una muestra de la capa queratinizada superficial de la piel de un paciente con DA y un voluntario sano, y se adhirió al vidrio de portaobjetos con el adhesivo médico Aron Alpha A (Sankyo Co., Tokyo). Después de fijarlas con formaldehído al 3 %, las muestras se permeabilizaron con Triton X-100 al 0,1 % y luego se inmunotiñeron con el anticuerpo anti-ICAD o anti-SCCA-1 durante una noche a 4 ºC. El anticuerpo anticonejo (en el caso de ICAD) o la IgG antirratón (en el caso de SCCA-1) conjugados a Alexa 30 Fluor 400 se utilizaron, respectivamente, como anticuerpo secundario a temperatura ambiente durante 1 hora. Las muestras se introdujeron durante 5 minutos en yoduro de piridio al 0,1 % para visualizar los núcleos y, a continuación, se lavaron tres veces con PBS. Se utilizó el microscopio Leica DMLA para la microscopia fluorescente.
(2-vi) Análisis por transferencia Western
Se separó la proteína mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS en un gradiente de concentración del
35 5 al 20 %. Después de la electroforesis, la proteína se transfirió a una membrana de difluoruro de polivinilideno (Immobilon-P, Millipore, Bedford, MA) y, a continuación, se incubó con el anticuerpo anticaspasa 14 que contiene H99, h14D146 o C20. La proteína inmunorreactiva se visualizó por quimioluminiscencia al usar el ECL-Plus (Amersham) con la IgG anticonejo o con la IgG anticabra marcada con peroxidasa (Sigma) a modo de anticuerpo secundario.
40 (2-vii) Resultados
Caspasa 14 de queratinocitos procesada con Asp146
De acuerdo con el análisis por transferencia Western, sólo se detectó una banda de 17 kDa en el extracto de queratinocitos para el anticuerpo H-99 (figura 8). Este resultado no concuerda con el resultado para los extractos procedentes de piel completa ni los modelos equivalentes de piel que contienen una forma de 30 kDa sin procesar.
45 Esta banda de 17 kDa también fue reconocida por el anticuerpo h14D146 (figura 8B) y se supone que es una subunidad grande de la caspasa 14 activa (p17). Esto sugiere que la maduración de la caspasa 14 se consigue mediante la escisión por el Asp146 durante la etapa final de la diferenciación terminal. Además, la banda de 30 kDa también fue reconocida por el anticuerpo H-99 y el h14D146 en un modelo equivalente de piel, lo que sugiere que se escinde por el Asp146.
50 (2-viii) Preparación de la caspasa 14 a partir de extracto de queratinocitos
La mayoría de la caspasa 14 en las células queratinizadas está en una forma procesada y, por esta razón, ya que se supone que está presente en una forma activa (Eckhart, L. et al., J. Invest. Dematol., 115, 1148-51 (2000); Lippens,
S. et al., Cell Death Differ., 7, 1218-24 (2000); Mikolajczyk J. et al, Biochemistry, 43, 10560-9 (2004)), se cree que los queratinocitos humanos son una fuente mejor de caspasa 14 purificada. Sin embargo, también se sabe que los
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queratinocitos humanos contienen la enzima de tipo caspasa 1 (Takahashi T. et al., Invest. Dermatol. 111, 367-72 (1998)). Los sustratos de la caspasa 1, tales como el sustrato WEHD, se pueden hidrolizar mediante la caspasa 1 y la caspasa 14. Los inventores de la presente invención analizaron primero la hidrólisis de WEHD-MCA por la caspasa 1 con citrato de sodio a 1,3 M y en presencia y ausencia de ditioetreitol a 5 M. A pesar de que el WEHD5 MCA es mejor sustrato de la caspasa 1 en el tampón de ensayo estándar de la caspasa, se confirmó que la caspasa 1 era incapaz de hidrolizar este sustrato en presencia de un ion cosmótropo (datos sin mostrar). Así pues, se evaluó cada fracción mediante tres procedimientos que consisten en la actividad de hidrólisis de WEHD-MCA, la reactividad con el anticuerpo H-99 y el h14D146. La tabla 1 muestra los resultados de la cromatografía continua. Tras la cromatografía de intercambio aniónico inicial que utiliza una columna HiPrep Q, el rendimiento mostró un incremento 10 del 170%, mientras que la actividad específica se incrementó más o menos 10 veces. Este incremento probablemente se pueda atribuir a la disociación de la caspasa 14 de un inhibidor intrínseco. De acuerdo con el análisis de transferencia Western, se demostró que las fracciones n.º 16 a 20 contenían bandas de 17 kDa positivas para H-99 y h14D146. También se observó que estas fracciones mostraban actividad hidrolítica de WEHD-MCA. En la posterior cromatografía de intercambio aniónico en Mono Q, las fracciones n.º 25 a 29 contenían una forma 15 procesada de la caspasa 14 de acuerdo con una valoración hecha basándose en la presencia de bandas de 17 kDa positivas para H-99 y h14D146. Se observó que sólo estas fracciones mostraban actividad hidrolítica de WEHD-MCA. La cromatografía catiónica en Mono S y el cromatoenfoque en Mono P eran eficaces para retirar las principales proteínas contaminantes y la actividad específica se incrementó 3,5 veces y 7 veces, respectivamente. Aquí de nuevo sólo las fracciones positivas para H-99 y h14D146 mostraron actividad hidrolítica de WEHD-MCA. En la etapa 20 final y con el uso de la cromatografía Superdex 75, se separó un pico que tenía una masa molecular de 30 kDa, y este pico coincidía con el pico de la actividad hidrolítica de WEHD-MCA. En la electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS, esta preparación se demostró que contenía fragmentos de 17 kDa y 11 kDa. El primero era positivo para el anticuerpo H-99 y el anticuerpo h14D146, mientras que el segundo era reconocido por el anticuerpo C20. Esto sugiere que la caspasa 14 humana se purifica en forma de un heterodímero compuesto por una subunidad grande
25 (17 kDa) y una subunidad pequeña (11 kDa). Además, la cromatografía en Superdex 75 indicaba que, a diferencia de otras caspasas, la caspasa 14 de los queratinocitos humanos está presente en forma de un monómero a la manera de una forma activada por la granzima B. La tabla 1 proporciona un resumen de la tasa de purificación de la caspasa 14. Se obtuvieron 11,8 µg de la proteína purificada a partir de unos 100 mg de extracto de proteína soluble. La actividad específica se incrementó 764 veces y el rendimiento fue del 9,1 %.
30 Tabla 1. Resumen de purificación de la caspasa 14
Concentración de proteína
Volumen Masa total de proteína Actividad enzimática Actividad específica Actividad total Rendimiento
µg/ml
ml µg AFU (mU) (mU/mg de proteína) U (%)
Ext. CC TBS
312,0 320,00 99840,0 3,67 11,8 587,34 100,0
HiPrep Q
1185,0 15,00 17775,0 133,59 112,7 1001,92 170,6
Mono Q
582,0 8,00 4656,0 150,30 258,2 601,19 102,4
Mono S
61,3 8,00 490,4 56,94 928,8 227,75 38,8
Mono P
50,5 1,00 50,5 338,31 6699,2 169,15 28,8
Superdex 75
11,8 1,00 11,8 106,52 9015,1 53,26 9,1
(2-ix) Características enzimáticas de la caspasa 14 purificada
Se estudiaron las características enzimáticas de la caspasa 14 purificada (figuras 9 y 10). La caspasa 14 era sensible a diferentes inhibidores de caspasas, tales como YVAD-FMK (inhibidor de la caspasa 1), VDVAD-FMK 35 (inhibidor de la caspasa 2), DEVD-FMK (inhibidor de la caspasa 3), IETD-FMK (inhibidor de la caspasa 8), LEHD-FMK (inhibidor de la caspasa 9) y VAD-FMK (inhibidor de pancaspásico) (figura 9). Además, VEID-FMK apenas tuvo ningún efecto. YVAD-FMK en particular resultó tener efectos inhibidores muy potentes sobre la actividad de la caspasa 14. Esto probablemente se debe a la similitud estructural entre la caspasa 1 y la caspasa 14. El inhibidor pancaspásico, VAD-FMK, inhibió la actividad caspasa con aproximadamente la misma intensidad que VAD-FMK. El
40 inhibidor específico de la clase de las cisteína proteasas, el ácido yodoacético (IAA, por su nombre en inglés) o el inhibidor específico de la clase de las serina proteasas, el fluoruro de 4-(2-aminoetil)bencenosulfonilo (ABBSF), no mostraron ningún efecto inhibidor significativo a las concentraciones problema utilizadas en este estudio.
(2-x) Efectos de la caspasa 14 purificada sobre la degradación del ICAD
Los inventores de la presente invención analizaron los efectos de la caspasa 14 sobre la ICAD a la vez que se
45 estaban buscando los sustratos naturales de la caspasa 14. Esto se debe a que la desaparición del núcleo es un acontecimiento muy importante para la diferenciación terminal. De acuerdo con una valoración hecha mediante análisis de transferencia Western con IgG anti-ICAD cuando la proteína ICAD recombinante y la caspasa 14
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purificada se incubaron en un tampón corriente de ensayo de caspasa, la caspasa 14 purificada no mostró ninguna actividad hidrolítica sobre la ICAD (figura 10A). Sin embargo, ya que disminuye la cantidad de la proteína ICAD intacta y se incrementan los dos productos de degradación principales en presencia de una sal cosmótropa, la caspasa 14 purificada mostró poca actividad degradadora del ICAD.
5 (2-xi) Inhibición de la caspasa 14 por SCCA-1
Aunque el SCCA-1 es un miembro de la superfamilia de las serpinas, inhibe las cisteína proteasas tales como la papaína y la catepsina L (Takeda, A. et al., Biol. Chem. 383, 1231-6 (2002)). Esto indica que SCCA-1 es un inhibidor único de clase al igual que Crm-A32. Así pues, los inventores de la presente invención llevaron a cabo una prueba para saber si el SCCA-1 es capaz o no de inhibir a los miembros de las caspasas. Se utilizaron condiciones
10 cosmótropas en el caso de la caspasa 14. Ninguno de los miembros de las caspasas (1 a 10) se vieron afectados con respecto a la actividad enzimática cuando la caspasa recombinante se incubó con el SCCA-1 (figura 10C). El SCCA-1 inhibió la degradación de ICAD debida a la caspasa 14. La recuperación de la actividad enzimática no se observó incluso si se incrementaba el tiempo de incubación. Esto sugiere la existencia de una fuerte fijación entre la caspasa 14 y el SCCA-1 (figura 10B).
15 (2-xii) Localización de la caspasa 14 activa y células positivas con TUNEL
Para investigar si la caspasa 14 está implicada en el proceso de desnucleación, los inventores de la presente invención llevaron a cabo la doble tinción con caspasa 14 y TUNEL. Tal y como se muestra en la figura 11A, la caspasa 14 que contiene las proformas y las formas activas estaba localizada en las células que iban desde las células espinosas hasta los queratinocitos de la epidermis humana normal. Esto concuerda con los hallazgos 20 anteriores (Lippens et al. (2000), op. cit.). La caspasa 14 activa detectada con el anticuerpo h14D146 se limitaba a algunos queratinocitos y células granulares (figura 11B). Casi todos los queratinocitos estaban teñidos de manera desigual. Aunque se observaron las células positivas con TUNEL inmediatamente por debajo de la capa queratinizada, la localización de la mayoría de estas células positivas era muy limitada (figura 11C). Resulta interesante observar que las células positivas con TUNEL estaban casi siempre localizadas con células positivas con
25 h14D146. Esto sugiere que la fragmentación del ADN se produce en estas células y que la caspasa 14 activa está implicada en este proceso.
(2-xiii) Colocalización de ICAD y SCCA-1 en los núcleos paraqueratósicos
El uso del anticuerpo FL331 revela que la ICAD se localiza principalmente en el núcleo de las células basales y en las células del epitelio basal en los cortes transversales de la piel humana normal. El citoplasma era débilmente 30 positivo en las células que van desde las células basales hasta las células granulares. En la capa queratinizada, la inmunorreactividad contra la ICAD disminuyó considerablemente. Se obtuvieron esencialmente los mismos resultados incluso cuando se utilizó el anticuerpo contra el péptido del extremo amino, DFF45/ICAD Ab-2 (datos sin mostrar). En el caso de usar el anticuerpo anti-ICAD (FL-331) para la tinción de la capa queratinizada superficial de los pacientes con DA, dieron positivo para este anticuerpo diferentes tamaños de regiones de aglomeración (figura 35 12B). La tinción nuclear con PI indicaba que los núcleos paraqueratósicos se encuentran siempre en estas islas porfiríticas (figura 12C). Las observaciones de la capa queratinizada superficial en campo brillante revelaron una superficie tosca con numerosas irregularidades en la superficie (figura 12D). Las imágenes superpuestas indicaban que los sitios paraqueratósicos coincidían con los sitios positivos para l ICAD (figuras 12E y 12F). Estos resultados sugieren que se necesita la degradación de ICAD para la eliminación de los núcleos durante la diferenciación
40 terminal.
Se detectó una concentración muy baja de SCCA-1 en la capa granular en el caso de piel humana normal. En la capa queratinizada superficial de la DA activa también se observó una fuerte inmunotinción con una distribución porfirítica prominente de sitios positivos (figura 13A). De igual forma, las regiones positivas para SCCA-1 coincidían con la capa de núcleos positivos al PI, es decir los sitios paraqueratósicos (figuras 13J a 13L). En resumen, estos
45 resultados sugieren que el sistema ICAD/CAD desempeña una función importante en el proceso de desnucleación y que el SCCA-1 interviene como supresor en esta reacción.
Discusión
La mayor parte de la caspasa 14 se expresa en la epidermis, mientras que apenas se expresa en los otros tejidos (Van de Craen, M. et al., Cell Death Differ., 5, 836-46 (1998)). De acuerdo con resultados anteriores, la 50 diferenciación terminal de los queratinocitos está ligada al procesamiento de la caspasa 14 y esto sugiere la activación de las proteinasas de la familia de las caspasas (Lippens S, et al., Cell Death Differ., 7, 1218-24 (2000); Eckhart, L., Biochem. Biophys. Res. Commun., 277, 655-9 (2000); Hu, S., J. Biol. Chem., 273, 29648-53 (1988)). Más recientemente, Mikolajczyk et al. (2004, op. cit) demostraron que la caspasa 14 que escinde la granzima B es enzimáticamente activa en presencia de sales cosmótropas. En este estudio, los inventores de la presente invención 55 intentaron purificar la caspasa 14 a partir de los queratinocitos completamente diferenciados para investigar si la caspasa 14 humana está o no activa en la etapa final de la diferenciación de los queratinocitos. Los inventores de la presente invención utilizaron tres tipos de anticuerpos que reconocen una proforma de la subunidad grande (H-99, que tiene un supuesto sitio de escisión para caspasas en el Asp146 (h14D146)) y una subunidad pequeña (C20),
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respectivamente. La preparación final se componía de dos bandas, a saber, una banda de 17 kDa reconocida por el anticuerpo h14D146 y una banda de 11 kDa reconocida por el anticuerpo C20. Estas bandas de proteínas son las subunidades grande y pequeña de la caspasa 14 activa. Durante el procedimiento de purificación, una banda de 17 kDa positiva con H99 fue reconocida junto con el anticuerpo h14D146. Esto sugiere que el extremo carboxilo de la
5 subunidad grande termina en Asp146. La región del extremo amino de la subunidad pequeña se identificó como Lys153-Asp-Ser-Pro-Gln y esto sugiere que el procesamiento se produce entre la Ile152 y la Lys153. Este sitio es un sitio de escisión específico para los miembros de la familia de las caspasas. Esto concuerda con el hallazgo de Chien et al., (Biochem. Biophys. Res. Commun., 30 de agosto de 2002: 296 (4): 911-7) de que la caspasa 14 inmunoprecipitada a partir de extracto de prepucio muestra escisión en el mismo sitio. Así pues, se concluyó que la caspasa 14 humana se purifica homogéneamente en forma de un heterodímero muy activo. Se sugirió que el procesamiento en los dos sitios de Asp146 e Ile152 y que la retirada de seis restos dentro de las regiones conectoras Xxx147 e Ile152 están implicados en la maduración de la caspasa 14. La presencia de dos sitios de escisión diferentes (uno que es ácido y el otro hidrófobo) también sugiere que la activación de la caspasa 14 se lleva a cabo en varias etapas mediante muchas enzimas.
15 Las características enzimáticas de la caspasa 14 purificada eran extremadamente únicas. La caspasa 14 purificada mostraba por comparación un intervalo amplio de sensibilidad de inhibición a los inhibidores de caspasas conocidos. En particular, el inhibidor de la caspasa 1, YVAD-FMK, mostró la acción inhibidora más potente. YVAD-FMK también mostró mayor actividad que WEHD-MCA y otro sustrato de la caspasa 1 en forma de YCAD-MCA. Esto sugiere que la caspasa 1 y la caspasa 14 se encuentran en una relación íntima. Sin embargo, los inventores de la presente invención demostraron con claridad que la caspasa 14 tiene características considerablemente diferentes. Los inventores de la presente invención determinaron por primera vez que SCCA-1 es un inhibidor intrínseco de la caspasa 14. La característica más única de SCCA-1 es su notable especificidad por la caspasa 14. Otros miembros desde las caspasas, desde la 1 a la 10, no se ven afectados por SCCA-1. El SCCA-1 no inhibió la actividad de la caspasa 3 cuando se utilizó el sustrato sintético DEVD-MCA o el sustrato natural ICAD. El Crm A pertenece a la
25 superfamilia de las serpinas y se sabe que es capaz de inhibir un gran número de caspasas que incluye la caspasa 1 y la caspasa 8 (Gagliardini V. et al., Science 263, 826-8 (1994)). Se sabe que XIAP inhibe la caspasa 3, la 7 y la 9 (Srinivasula, S. M. et al., Nature 410, 112-6 (2001)). Ya que la proteína p35 antiapoptósica inhibe las caspasas 1, 3, 6, 7, 8, y 10, se considera que tiene un espectro más amplio. El hecho de que todas estas proteínas inhibidoras que consisten en Crm A, IAP y p35 sean capaces de inhibir una porción de varias caspasas efectoras e iniciadoras sugiere que estas moléculas están implicadas en la ejecución de la vía apoptósica típica. Por otra parte, los resultados obtenidos por los inventores de la presente invención también sugieren firmemente que, aunque SCCA-1 no es un factor clave en los fenómenos apoptósicos habituales, es un regulador importante del proceso de desnucleación mediado por la caspasa 14.
El mecanismo molecular de este proceso todavía se tiene que esclarecer. Los inventores de la presente invención
35 demostraron con claridad que la caspasa 14 humana es capaz de descomponer la ICAD en presencia de sal cosmótropa. El ICAD (también denominado factor de fragmentación del ADN DFF45) es un inhibidor de una endonucleasa dependiente de magnesio denominada ADNasa activada por caspasas (CAD, por su nombre en inglés) (o DFF40). El sistema ICAD/CAD desempeña una función importante en la descomposición del ADN cromosómico durante la muerte celular apoptósica. La ICAD unida a CAD está presente en la forma de un complejo inactivo. La caspasa 3 presenta poca descomposición proteica contra ICAD, y la escinde en los dos sitios de Asp117 y Asp224. Esta escisión activa la CAD e inicia la descomposición del ADN (Nagata, S., Exp. Cell Res., 256, 12-8 (2000)). Aunque la caspasa 3 no es estrictamente necesaria para la escisión de un gran número de proteínas celulares durante la apoptosis, es esencial para la escisión de ICAD (Tang, D., et al., J. Biol. Chem., 273, 28549-52 (1998)). Esto indica que la caspasa 3 es muy importante para la fragmentación del ADN, mientras que otras
45 caspasas efectoras, tales como la caspasa 6 y la caspasa 7, no son importantes. Sigue resultando interesante que la caspasa 14 formara fragmentos que se parecen a los de 12 kDa y 35 kDa de ICAD. El análisis de la secuencia indicó que los sitios de escisión eran idénticos. Esto sugiere que la caspasa 14 puede ser un sustituto perfecto de la caspasa 3. Aunque la caspasa 14 es capaz de descomponer la ICAD, es claramente diferente de la caspasa 3 proapoptósica por las razones indicadas a continuación. Primero, el exceso de expresión de la caspasa 14 no induce la muerte celular apoptósica (Van de Craen, Cell Death Differ., 5, 838-46 (1998)). Esta característica contrasta con la de la caspasa 3. Segundo, la caspasa 14 no se activa con diferentes estímulos apoptósicos (Lippens et al., (2000), op. cit.). La caspasa iniciadora y otros miembros de las caspasas fueron incapaces de procesar la procaspasa 14. Este hallazgo concuerda con los hallazgos ya descritos (Lippens et al., (2000), op. cit.). Tercero, la síntesis de la caspasa 14 se limita a los queratinocitos en diferenciación del tejido adulto (Eckhart, L., Biochem. Biophys. Res.
55 Commun. 277, 655-9 (2000)). Además, la capacidad de la caspasa 14 con respecto a la escisión de ICAD está regulada por un mecanismo que es considerablemente diferente del de la caspasa 3. La descomposición de ICAD por la caspasa 14 requiere una concentración anormalmente alta de ion cosmótropo. Otras caspasas no mostraron casi ninguna actividad a esta concentración de iones. En conjunto, ya que la activación de la caspasa 14 está regulada por un programa de diferenciación de queratinocitos, se considera que tiene una posición única entre los miembros de la familia de las caspasas.
La intervención del sistema ICAD/CAD en la diferenciación terminal de los queratinocitos está apoyada adicionalmente por experimentos in vivo. La investigación inmunohistoquímica ha demostrado que la ICAD está presente en el núcleo desde los queratinocitos basales hasta los queratinocitos espinosos, que no está presente en
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las células granulares, y que la desaparición de los núcleos se produce en el momento de la diferenciación terminal. Se ha demostrado que la ICAD se tiñe con fuerza en los sitios profiríticos de la epidermis superficial de los pacientes con DA. Estas áreas tienen una superficie ligeramente tosca y poco translúcida. En estas áreas estaban presentes localmente grupos de núcleos sin digerir y positivos con PI. Otras áreas no se tiñeron con el anticuerpo anti-ICAD.
5 Además, aunque los ensayos de abrasión con esparadrapo realizados sobre la piel de pacientes con DA revelaron la presencia de la proteína ICAD intacta, está no se detectó en los extractos de los sujetos normales. Estos resultados sugieren que la ICAD está implicada en el proceso de desnucleación en el momento de la diferenciación terminal.
El SCCA-1 apenas se expresa en la piel normal. Por otra parte, el SCCA-1 se expresa mucho en la piel psoriásica, en las membranas mucosas y en el esófago (Takeda, A. et al., J. Invest. Dermatol. 118, 147-54 (2002)). Sigue 10 resultando interesante que estos tejidos estén acompañados de paraqueratosis. Los inventores de la presente invención demostraron con claridad que la fuerte tinción de SCCA-1 también se encuentra en los sitios de paraqueratosis. Además, SCCA-1 e ICAD siempre estaban presentes localmente en los mismos sitios en los cuales estaban presentes grupos de núcleos. Ya que no había otras áreas de la superficie de la piel donde SCCA-1 o ICAD den negativo, la colocalización de estas moléculas en los sitios paraqueratósicos sugiere que estas moléculas están 15 implicadas en la inhibición del proceso de desnucleación. Se describió que los núcleos no desaparecen en un modelo equivalente al de la piel por la acción del inhibidor pancaspásico VAD-FMK (Weil et al., 1999). El hallazgo de los inventores de la presente invención de que VAD-FMK es uno de los inhibidores de la caspasa 14 más potentes realza la posibilidad de que la caspasa 14 sea probablemente un candidato para esta reacción. La caspasa 14 disminuye en los sitios paraqueratósicos de la piel psoriásica y no está presente en la epidermis de la cavidad bucal.
20 En la epidermis de la cavidad bucal, o bien la desaparición de los núcleos se pierde de alguna forma, o bien simplemente no se lleva a cabo (Lippens et al., (2000) op. cit.). Sigue resultando interesante que el SCCA-1 esté inducido en estos tejidos. Los más probable es que la expresión anormal de estas moléculas ocasione la diferenciación incompleta, incluida la presencia permanente de los núcleos.
El mecanismo mediante el cual se activa la caspasa 14 en la piel no se conoce del todo. La activación sólo se
25 observa en la piel o en un modelo equivalente a la piel, y no se observa en las células cultivadas (Eckhart L. et al., (2000) op. cit.). Los inventores de la presente invención realmente analizaron esto en diferentes condiciones. Estas condiciones incluían la adición de suero, la prolongación de la duración del cultivo hasta el día 14 en presencia o ausencia de calcio después de que las células se vuelvan densas, el tratamiento con el ionóforo del calcio A23187, y la exposición al aire durante 30 minutos, lo cual es adecuado para inducir numerosos marcadores de diferenciación.
30 Aunque estos estímulos de diferenciación indujeron la expresión prominente del ARNm de la caspasa 14, no eran eficaces a la hora de inducir la actividad de la caspasa 14 (datos sin mostrar). El proceso de activación está controlado estrictamente y está muy inhibido en los cultivos de monocapas. Se cree que para la activación se necesistan la estratificación y la exposición al aire. Está claro que el control de la activación de la caspasa 14 no está mediado por un programa de apoptosis, sino mediado más bien por un programa de diferenciación. Durante el
35 proceso de diferenciación terminal se activan numerosas proteinasas, entre ellas las serina, cisteína y aspartato proteinasas. Se sugiere que las proteinasas del suero de tipo quimotripsina y de tipo tripsina desempeñan la función de exfoliar los queratinocitos más externos. Algunas cisteína proteinasas, tales como las catepsinas B y L, están inducidas en los queratinocitos diferenciados. También se sugiere que la catepsina D y la aspartato proteinasa realizan la función de exfoliar los queratinocitos. Estas enzimas pueden estar implicadas también en otros
40 mecanismos de diferenciación, tales como la activación de la caspasa 14.
Resumiendo lo anterior, los inventores de la presente invención purificaron la caspasa 14 del extracto de queratinocitos humanos. Aunque la caspasa 14 induce la desaparición de los núcleos y su desaparición se parece a la apoptosis, se sugiere con firmeza que es un cambio distinguible que se produce por medio de la degradación de ICAD en la etapa final de la diferenciación de los queratinocitos. Aunque este proceso comparte varios factores
45 apoptósicos, no implica la muerte celular que conduce a la eliminación de las células dañadas, sino que más bien es un proceso general con el propósito de completar la estructura global para demostrar que la función principal está en la formación de una función de barrera. La expresión anormal de la caspasa 14 o del SCCA-1 tiene un efecto directo sobre el programa de diferenciación y, como resultado, conduce a la aparición de la paraqueratosis y a la rotura de la función de barrera.
50 (2-xiv) Procedimiento de identificación
La identificación de sustancias que inhiben la paraqueratosis se llevó a cabo de la manera que se describe a continuación. Se analizaron los productos fitofarmacéuticos indicados a continuación.
Extracto de anea (Ichimaru Pharcos Co., Ltd.)
Extracto de uva (Ichimaru Pharcos Co., Ltd.)
55 Extracto de tomate (Ichimaru Pharcos Co., Ltd)
Extracto de pepino (Ichimaru Pharcos Co., Ltd.)
Extracto de kiwi (Ichimaru Pharcos Co., Ltd.)
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23-07-2014
Extracto de azufaifo (Ichimaru Pharcos Co., Ltd.)
Tormentilla (Ichimaru Pharcos Co., Ltd.)
(a) Medición de la actividad enzimática cisteína proteasa
Se mezclaron 80 µl de tampón de ensayo (50 mM de HEPES (pH 7,5)), 5 mM de DTT, 2,5 mM de EDTA y 0,1 % de
5 CHAPS) y 20 µl de papaína a 1 µg/ml (Sigma) y se incubaron durante 15 minutos a temperatura ambiente. A continuación se le añadieron 20 µl del sustrato hidrocloruro de Nα-benzoíl-L-arginina-4-nitroanilida (L-BAPNA) a 2,5 mM y después se incubó durante 15 minutos a 37 ºC. Se le añadieron 30 μl de una solución de ácido acético al 25% en etanol y 30 μl de p-dimetilaminocinamaldehído al 0,2 % para revelar el color y luego medirlo por absorbancia a 545 nm. Esta absorbancia se definió como la actividad enzimática [x] de la cisteína proteasa.
10 (b) Medición de la actividad enzimática del sistema que contiene el producto fitofarmacéutico candidato para inhibir la paraqueratosis y la cisteína proteasa
Se incubaron 60 μl del tampón de ensayo mencionado anteriormente y 20 μl de la sustancia candidata durante 30 minutos a temperatura ambiente. Se le añadieron 20 μl de papaína a 1 μg/ml y luego se incubó durante 15 minutos a temperatura ambiente. A continuación se le añadieron 20 μl de L-BAPNA a 2,5 nM y luego se incubó durante 15
15 minutos a 37 ºC. Se le añadieron 30 μl de una solución de ácido acético al 25% en etanol y 30 μl de pdimetilaminocinamaldehído al 0,2 % para revelar el color y luego medirlo por absorbancia a 545 nm. Esta absorbancia se definió como la actividad enzimática de la cisteína proteasa [y], el porcentaje (%) de cada compuesto analizado respecto a la [x] mencionada anteriormente se muestra en la columna titulada «Solo muestra» en la tabla 2 que viene a continuación.
20 Los valores mostrados en la columna «Solo muestra» sirven de indicadores de la actividad inhibidora de cisteína proteasas que tienen los productos fitofarmacéuticos analizados por sí mismos o, en otras palabras, cuanto más próximo a 100 esté ese valor, más baja será la actividad inhibidora de cisteína proteasas que presenta el producto fitofarmacéutico analizado. Además, los valores de [100 – [solo muestra]], obtenidos por sustracción del valor de la «solo muestra» de 100, también se muestran en la tabla 2. En este caso, cuanto más cercano de cero esté el valor,
25 más baja será la actividad inhibidora de cisteína proteasas que tiene el producto fitofarmacéutico analizado.
(c) Medición de la actividad enzimática del sistema que contiene SCCA-1, producto fitofarmacéutico candidato y cisteína proteasa
Se mezclaron 40 μl del tampón de ensayo mencionado anteriormente y 20 μl de SCCA-1 recombinante, después se le añadieron 20 μl de un producto fitofarmacéutico candidato y se incubó durante 30 minutos a temperatura 30 ambiente. A continuación se le añadieron 20 μl de papaína a 1 μg/ml y se incubó entonces durante 15 minutos a temperatura ambiente. A continuación se le añadieron 20 μl de L-BAPNA a 2,5 mM y después se incubó durante 15 minutos a 37 ºC. Se le añadieron 30 μl de una solución de ácido acético al 25% en etanol y 30 μl de pdimetilaminocinamaldehído al 0,2 % para revelar el color y medirlo mediante la absorbancia a 545 nm. Esta absorbancia se definió como la actividad enzimática [z] de la cisteína proteasa, y el porcentaje (%) de cada
35 sustancia analizada con respecto a la [x] mencionada anteriormente se muestra en la columna titulada «SCCA-1+» en la tabla 2 que viene a continuación.
El valor de «SCCA-1+» es un indicador de la actividad inhibidora total de cisteína proteasas que tiene SCCA-1 y la actividad inhibidora de cisteína proteasas que tiene el producto fitofarmacéutico analizado por sí mismo o, en otras palabras, cuanto más próximo de 100 esté el valor, más baja será la actividad inhibidora total del mismo.
40 Además, la columna titulada «Diferencia» en la tabla indica el valor obtenido al sustraer el valor de «Solo muestra» del valor de «SCCA-1+». Una diferencia grande indica que es baja la actividad inhibidora de cisteína proteasas que tiene SCCA-1 en el sistema que contiene SCCA-1, producto fitofarmacéutico candidato y cisteína proteasa. Es decir, esto sugiere que el producto fitofarmacéutico candidato suprime notablemente la actividad inhibidora de cisteína proteasas que tiene SCCA-1.
45 Los resultados se resumen en la tabla 2 que viene a continuación.
E11173296
23-07-2014
Tabla 2
Extracto
[SCCA-1+] [Solo muestra] 100 – [solo muestra] [Diferencia]
Kiwi
16,6 88,0 12,0 4,6
Pepino
12,2 92,7 7,3 5,0
Azufaifo
14,2 88,8 11,2 3,1
Tomate
13,3 92,7 7,3 6,0
Anea
49,8 66,5 33,5 16,3
Uva
24,9 83,9 16,1 8,8
Tormentilla
10,3 2,3 97,7 –87,3
Como resultado, se halló que el extracto de anea, el extracto de uva, el extracto de tomate, el extracto de pepino, el extracto de kiwi y en particular el extracto de azufaifo suprimen significativamente la actividad inhibidora de cisteína 5 proteasas que tiene SCCA-1. Así pues, se espera que estos extractos sean eficaces a la hora de inhibir la paraqueratosis epidérmica.
Aplicabilidad industrial
De acuerdo con la presente invención, se dan a conocer un procedimiento y una composición farmacéutica para tratar y/o prevenir una enfermedad seleccionada del grupo que consiste en psoriasis y carcinoma epidermoide.
10 Además, de acuerdo con la presente invención, se puede dar a conocer un medio para inhibir y tratar la paraqueratosis epidérmica que utiliza una estrategia completamente nueva que es diferente a la de la técnica anterior.

Claims (4)

  1. E11173296
    23-07-2014
    REIVINDICACIONES
    1. Procedimiento in vitro para la identificación de sustancias que inhiben la paraqueratosis epidérmica, en donde se utiliza de indicador la actividad de una sustancia candidata que inhibe la actividad cisteína proteasa inhibidora que posee el antígeno 1 del carcinoma epidermoide (SCCA-1, por su nombre en inglés), en donde la cisteína
    5 proteasa es la caspasa 14.
  2. 2. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende los siguientes sistemas de ensayo (1), (2) y (3):
    (1) medir la actividad cisteína proteasa y obtener el valor medido [x];
    (2) i) mezclar un compuesto candidato con una cantidad igual de cisteína proteasa definida en el punto (1) 10 anterior en términos de actividad enzimática seguido de incubación; y
    ii) medir la actividad cisteína proteasa de la mezcla incubada del punto (2) i) anterior en las mismas condiciones que el punto (1) anterior y obtener el valor medido [y]; y,
    (3) i) mezclar el compuesto candidato en una cantidad igual a la utilizada en el punto (2) i) con SCCA-1 seguido de la incubación;
    15 ii) mezclar la mezcla incubada del punto (3) i) con una cantidad igual de cisteína proteasa definida en el punto (1) anterior en términos de actividad enzimática, e incubar en las mismas condiciones que en el punto (2) i) anterior; y
    iii) medir la actividad cisteína proteasa de la mezcla incubada del punto (3) ii) anterior en las mismas condiciones que el punto (1) anterior y obtener el valor medido [z]; en donde,
    20 el compuesto candidato se determina que tiene actividad que inhibe la actividad cisteína proteasa inhibidora que posee SCCA-1 y se selecciona como una sustancia que inhibe la paraqueratosis epidérmica si satisface la condición siguiente:
    {[z]/[x] x 100} – {100 – [y]/[x] x 100} > 0.
  3. 3. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 2, en donde la condición a satisfacer es 25 {[z]/[x] x 100} – {100 – [y]/[x] x 100} > 3.
  4. 4. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 3, en donde la condición a satisfacer es {[z]/[x] x 100} – {100 – [y]/[x] x 100} > 16.
    21
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