KR101500755B1

KR101500755B1 - Ｌｏｘ 단백질과 ｎｒａｇｅ 단백질 사이의 정상적인동시발현 및 상호작용을 복구시키기 위한 물질

Info

Publication number: KR101500755B1
Application number: KR1020087012657A
Authority: KR
Inventors: 샤르벨 보에; 클로딘 즐레잘; 이자벨 오를리; 발레리 앙드르; 파스칼 소메; 코린 레메르몌; 오딜 다무르; 에리크 페례
Original assignee: 바스프 뷰티 케어 솔루션즈 프랑스 에스에이에스; 상뜨로 나쇼날 드 라 러쉐르쉐 샹띠피크; 위니베르시테 끌로드 베르나르 리옹 Ⅰ
Priority date: 2005-10-28
Filing date: 2006-10-26
Publication date: 2015-03-17
Also published as: US20160095815A1; EP1948128A2; JP2009521401A; US20120225141A1; CN101365421B; JP6058249B2; BRPI0617938A2; ES2622114T3; EP2345405A1; JP2015028036A; US9308161B2; KR101609487B1; WO2007048985A3; EP1948128B1; US20110223264A1; CN101365421A; KR20140083999A; KR20080100333A; WO2007048985A2; FR2892635A1

Abstract

본 발명은 LOX 단백질과 NRAGE 단백질 사이의 정상적인 동시발현 및 상호작용을 복구시키기 위한 물질에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 특히 LOX 단백질과 NRAGE 단백질 사이의 상호작용이 없거나 변경된 경우에 세포 증식, 분화 및 세포자멸의 현상들 사이의 균형을 조절하기 위해서 LOX 단백질과 NRAGE 단백질 사이의 상호작용을 조정하는 조성물을 제조하는데 있어서, 서열 1의 서열을 갖는 LOX의 발현 및/또는 활성을 조정하고/하거나 서열 2의 서열을 갖는 NRAGE의 발현 및/또는 활성을 조정하는 유효량의 1종 이상의 물질의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 특히 피부 노화, 편평 태선, 이식편-대-숙주 반응 (GVH), 습진, 건선 및 기저세포형 또는 유극세포형의 암, 특히 상피 암, 더욱 특히 피부 상피 암을 치료하고/하거나 저해할 수 있게 한다.

LOX 단백질, NRAGE 단백질, 증식, 분화, 세포자멸, 균형, 피부 노화, 편평 태선, 이식편-대-숙주 반응 (GVH), 습진, 건선 및 기저세포형의 암, 유극세포형의 암, 상피 암, 피부 상피 암

Description

ＬＯＸ 단백질과 ＮＲＡＧＥ 단백질 사이의 정상적인 동시발현 및 상호작용을 복구시키기 위한 물질 {SUBSTANCE FOR RESTORING NORMAL CO-EXPRESSION AND INTERACTION BETWEEN LOX AND NRAGE PROTEINS}

본 발명은 LOX 단백질과 NRAGE 단백질 사이의 정상적인 동시발현 및 상호작용을 복구시키기 위한 물질의 용도에 관한 것이다.

1) 배경기술

다세포 유기체에서는 세포 증식, 규정된 기능으로의 세포 분화, 및 프로그래밍되거나 프로그래밍되지 않은 세포 사멸 사이의 균형에 의해 항상성이 유지된다.

예를 들어, 피부는 유기체를 외부 공격으로부터 보호하는 것이 특정 기능 중 하나인 장기라고 여겨질 수 있다. 외부에 대한 불투과성은, 사멸한 세포로 구성된 고도로 각질화된 각막층에 의해 확실해진다. 따라서, 표피 세포 또는 각질세포의 수명 리듬은, 각질화되고 사멸한 세포로의 이러한 분화를 유도하는 연속적인 변화에 의해 좌우된다: (1) 개시자 세포 (표피 기저 세포층의 "줄기" 세포)의 유지, (2) 비대칭적 분열 (각 줄기 세포가 2개의 딸 세포가 됨), (3) 분화 ("개시자 딸" 세포 중 하나로부터의 표피 기저상부(suprabasal) 세포층의 형성), (4) 세포자멸성(apoptotic) 세포 사멸에 대한 내성 획득, (5) 각질화 세포로의 변화, 및 (6) 표피 상부 세포층의 프로그래밍된 세포 사멸. 이러한 균형에 있어서의 임의의 변형 은 병리적일 수 있다.

당업자는 증식, 분화 및 세포자멸의 세포내 현상에 관한 특정 측면을 고려한 여러가지 생물학적 메카니즘 및 분자를 알고 있다. 그러나, 어떠한 한가지 메카니즘에 대하여도 이러한 3가지 현상을 연관짓고 따라서 제어 및 조절의 측면에서 작용하는 표적을 구성하는 실질적인 정보를 제공하는 데이타는 전혀 없다.

2) LOX (단백질)

LOX는, 구리에 의존적인 아민 옥시다제인 리실 옥시다제 (LO)과에 속한다. 현재까지, LOX, LOXL, LOXL2, LOXL3 및 LOXL4의 5종 LO 유전자가 특징규명되어 있다. LOX는 콜라겐의 생체외 및 생체내 가교에 있어서의 역할이 알려져 있고, LOXL은 탄성 섬유의 항상성과 명확한 관련이 있다. 다른 이소형의 생체내 역할은 알려져 있지 않다.

LO는 섬유아세포, 평활근 세포, 내피 세포 및 각질세포와 같은 다양한 세포에 의해 합성된다. 따라서, 상기 효소는 수많은 조직, 예컨대 피부, 간, 신장, 비장 및 대동맥에 세포외 및 세포내 수준 둘다로 존재한다.

2.1) 세포외 매트릭스의 안정화 - 세포외 역할

LOX의 세포외 역할은 현재 널리 알려져 있는데, 그 역할은 결합 조직의 세포외 매트릭스 (ECM)를 안정화하는데 있다. LOX의 실제 기능은 원섬유 콜라겐 및 엘라스틴을 가교하는 것이다. 이러기 위해서, 이것은 원섬유 프로콜라겐 분자 및 트로포엘라스틴의 리실 및 히드록시리실 잔기의 산화적 탈아미노화를 촉매하며, 이때의 반응은 암모니아 및 과산화수소의 방출을 수반한다. 이후, 형성된 알데히드 잔 기는 인접한 알데히드기 또는 아민기와 자발적으로 축합하여 분자내 및 분자간 결합을 형성한다. 이러한 축합 반응은 콜라겐 및 엘라스틴 섬유에서 발견되는 브릿징(bridging)을 일으킨다. 따라서, LOX 및 LO는 ECM에서의 변화 (노화, 섬유증, 암, 치유, 골관절 및 심혈관 질환, 혈관형성(angiogenesis))를 포함하는 생체의학 분야에서 연구된다.

유기 니트릴이 비가역적인 LOX 억제제임이 시험관내 입증된 바 있다. 따라서, β-아미노프로피오니트릴 (β-APN)은 알킬아민 기질과의 경쟁시에 LOX의 활성 부위에 결합한다. LO는 β-APN을 기질로서 사용하기 때문에 쉬프(Schiff) 염기를 형성하지만 알데히드 생성물을 방출하지는 않으며, 이것은 합성에 대한 영향 없이 활성 부위를 공유결합으로 차단한다. 이를 기초로, 본 발명자들은 특정 유형의 세포 (연골세포 등) 배양시에 전반적으로 일어나는 이들 세포의 탈분화를 피하기 위해서 β-APN을 비롯한 여러가지 리실 옥시다제 억제제를 사용하는 것에 대하여 기재한 바 있다. [프랑스 특허 01.10443 (Farjanel et al.), CNRS, Use of lysyl oxidase inhibitors for cell culture and tissue engineering. 2001년 8월 3일자 출원. 공개 번호: 2 828 206]. 그러나, 상기 문헌은 리실 옥시다제를 전체적으로 다루고 있으며, LOX 이소형에 관하여는 구체적으로 다루고 있지 않다. 추가로, 상기 문헌은 오로지 시험관내 배양된 세포의 탈분화 억제만을 다루고 있으며, 증식, 분화 및 세포자멸 사이의 균형 유지에 있어서 리실 옥시다제 또는 더욱 유력하게는 LOX의 역할에 대하여 아무런 교시를 제공하지 않으며, 또한 리실 옥시다제 또는 LOX의 새로운 파트너 또는 기질에 대하여도 아무런 교시를 제공하지 않는다.

2.2) 세포내 역할

LOX 및 LO의 세포내 역할은 일반적으로 널리 알려져 있지 않다. 따라서, LOX가 세포 발생, 분화, 이동 또는 노화의 조절에 관여한다는 것이 알려져 있긴 하지만 [Csiszar, Lysyl oxidases: A novel multifunctional amine oxidase family, Nucleic Acid Research and Molecular Biology, 2001, 70, 2-28], 이것의 기초가 되는 분자 메카니즘은 밝혀져 있지 않다.

2.2.1) LOX 및 세포내 항상성

세포내 항상성의 조절 (증식, 분화 및 세포자멸 사이의 생리적 균형 유지)에 LOX가 관여한다는 가능성이 통상적으로 수용되고 있지만 [Jeay et al., Lysyl oxidase inhibits Ras-mediated transformation by preventing activation of NF-ΚB, Mol. Cell. Biol., 2003, 23, 2251-2263], 아직은 이것의 기초가 되는 메카니즘이 당업자에게 알려져 있지 않다.

따라서, 현재로는 당업자가 한편으로는 LOX와 분화 사이의 가능한 관계, 다른 한편으로는 LOX와 세포 증식/형질전환 사이의 가능한 관계를 나타내는 몇개의 데이타는 보유하고 있다. 그러나, 선행 기술에는 LOX와 세포자멸 사이의 가능한 관계가 언급되어 있지 않다.

2.2.2) LOX 및 표피 분화

LOX는 표피에 위치해 있고, 이것의 발현은 각질세포의 분화 수준에 대한 함수로서 조절된다 [Noblesse et al., Lysyl oxidase-like and lysyl oxidase are present in the dermis and epidermis of a skin equivalent and in human skin and are associated to elastic fibers, J. Invest. Dermatol., 2004, 122, 621-630]. 그러나, 지금까지 행해진 연구로는 각질세포에서의 LOX의 역할을 규명하거나 콜라겐 또는 엘라스틴을 거의 만들지 않거나 전혀 만들지 않는 상기 세포에서 LOX의 파트너를 조사할 수 없었다.

2.2.3) LOX 및 세포 형질전환

LOX 유전자는 세포의 비-종양 표현형 유지와 명확한 관련이 있다.

LOX의 이러한 역할을 설명하기 위해서 2가지 가설이 제기된 바 있다. 첫번째 가설은 ECM의 가교가 비-종양 상태의 유지를 선호하는 3차원 환경을 유도한다는 것을 시사한다. 이러한 가설은 암이 침윤성이 되면 LOX 및 LOXL은 더이상 발현되지 않지만 이것들이 암에 계내(in situ) 존재한다는 사실에 의해 뒷받침된다 [Peyrol et al., Lysyl oxidase gene expression in the stromal reaction to in situ and invasive ductal breast carcinoma, Am. J. Pathol. Feb., 150(2), 497-507, 1997]. 다른 가설은 당업자가 이미 발견한 기질에 대한 LO의 세포내 역할에 관한 것이다 [Li et al., Localization and activity of lysyl oxidase within nuclei of fibrogenic cells, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1997, Nov. 25, 94(24), 12817-22].

LOX 효소가 ras 종양유전자의 저해자이고 유전자의 체세포 돌연변이가 각종 암과 관련이 있다는 사실이 밝혀진 바 있다 ([Contente et al., Expression of gene rrg is associated with reversion of NIH 3T3 transformed by LTR-c-H-ras, Science, 1990, 249, 796-798], [Csiszar et al., Somatic mutations of the lysyl oxidase gene on chromosome 5q23.1 in colorectal tumors, Int. J. Cancer, 2002, 97, 636-642]). 최근의 연구는 ras로 형질전환된 섬유아세포에서 LOX가 낮은 수준으로 발현되는 것이 FGF-2 자가분비 성장 인자의 활성으로 인한 것이고, 항-종양 약물 수라민이 상기 효소의 발현 재유도를 가능하게 한다는 것을 보여주었다 [Palamakumbura et al., Autocrine growth factor regulation of lysyl oxidase expression in transformed fibroblasts, J. Biol. Chem., 2003, Aug. 15, 278(33), 30781-7; Epub 2003 Jun. 4]. 다른 경우에는 이들 섬유아세포에서의 LOX 재발현이 AKT 단백질의 위치 조절을 통해 NF-κB 신호전달 경로에 작용함으로써 상기 세포가 연질 한천 중에서 성장하는 것이 억제된다고 나타난 바 있다 [Jeay et al., Lysyl oxidase inhibits Ras-mediated transformation by preventing activation of NF-B, Mol. Cell. Biol., 23, 2251-2263, 2003].

다른 종양 저해자의 경우에서와 같이, LOX는 이것의 세포내 기질 및 파트너의 이용가능성 및 조절에 따라 작용하는 것 같지만, 이러한 기질 및 파트너는 여전히 당업자에게 알려져 있지 않다.

2.2.4) 세포자멸

용어 세포자멸은 세포 사멸의 형태적 특징이 괴사의 경우와는 상이한, 특별한 형태의 세포 사멸을 나타내는데 사용된다.

세포자멸은 카스파제를 필요로 하는 프로그래밍된 세포 사멸 과정이다. 이러한 과정 동안, 세포에서는 특히 현저한 형태적 특징, 예컨대 염색질의 축합 및 핵의 단편화가 일어나게 되어 인접한 세포에는 손상을 주지 않으면서 자가-파괴되 고 조직으로부터 제거된다.

세포자멸은 세포의 발생 과정 동안 또는 항상성 동안의 세포 자연사에 상응한다.

선행 기술은 세포자멸 및 분화의 세포내 과정을 통해 세포 주기 조절에 관여하는 수많은 작용제 및 메카니즘에 대한 정보를 제공한다.

3) NRAGE (단백질)

따라서, 본 발명자들은 세포 주기, 분화 및 세포자멸의 조절에 관여하는 단백질 과에 특히 관심이 있다. 이것은 MAGE (Melanoma Associated antiGEn, 흑색종-관련 항원) 단백질 과에 속하는데, 이것의 구성원 중 하나이며 "뉴로트로핀-수용체-상호작용 MAGE 상동체(Neurotrophin-Receptor-interacting MAGE homolog)"라고도 불리는 NRAGE 단백질이 신경영양성 인자 NGF를 통한 전-세포자멸(pro-apoptotic) 역할에 관하여 특히 알려져 있다.

NRAGE 단백질은 778개 아미노산을 포함한다. 중앙 영역에는 MAGE 단백질에 특징적인 제1 도메인인 MAGE 상동성 도메인 (MHD-1)이 있고, N-말단 영역에는 오직 특정 이소형에만 존재하는 제2의 도메인 MHD-2가 있다. 이들 2개의 도메인은 리실 잔기가 풍부한 영역을 갖는다. 이들 2개의 도메인 사이에는, 현재 알려져 있는 다른 어떠한 단백질에도 존재하지 않는 IRD (Interspersed Repeat Domain, 산재된 반복 도메인)라 불리는 영역이 있다.

NRAGE 단백질은 여러가지 경로를 통해 세포자멸의 제어에 관여한다.

● NRAGE는 호중구성 인자 (NGF) 또는 TNF의 "낮은 친화도" 수용체인 p75NTR 과 상호작용하여 세포 주기의 진행을 차단할 수 있기 때문에, 카스파제 경로를 통한 전-세포자멸 활성을 갖는다.

● NRAGE는 또한 세포자멸 단백질, IAP의 세포질 억제제와 상호작용하여 전-세포자멸 활성을 갖는다.

● NRAGE는 또한 조직의 형태발생 조절에 참여하는 핵의 호메오(homeo) 인자, 예컨대 인자 Msx 및 Dlx의 활성에 직접 작용할 수도 있다.

NRAGE의 발현은 편재해 있지만, 선행 기술로는 이것이 피부에 존재한다고 할 수 없고, 또한 선행기술은 LOX와 세포자멸 사이의 가능한 관계 또는 LOX 단백질과 NRAGE 단백질 사이의 관련성에 관한 정보를 제공하는 어떠한 데이타도 제공하지 못한다.

4) 선행 기술에 대한 결론

선행 기술은 LOX에 대한 신규한 파트너 또는 기질이 무엇인지, 특히 증식, 분화 및 세포자멸 사이의 세포내 균형 유지에 참여하는 것들이 무엇인지를 밝혀내지 못하며, 또한 선행 기술은 상피 세포 (특히 각질세포) 또는 임의의 다른 세포 유형에서도 이들 신규한 파트너 또는 기질이 무엇인지를 밝혀내지 못한다.

선행 기술은 연령의 함수로서, 또는 UV 또는 다른 유형의 공격에 대한 노출 여부의 함수로서, 또는 피부를 공격하는 질환 (건선, 이식편-대-숙주 반응, 암 등)의 사례에 있어서 표피에서 LOX가 발현되는 것 (특히 각질세포에 의해 발현되는 LOX)에 있어서의 가능한 변화에 대한 정보를 제공하지 못한다.

선행 기술은 세포자멸에 LOX가 관여하는 것에 대하여 설명하지 못한다.

선행 기술은 건강한 피부, 노화 또는 UV에 의해 변질되거나 다른 유형의 공격을 받은 피부 또는 질환에 걸린 피부이건 간에 피부 중에 NRAGE가 존재할 가능성에 대한 정보를 제공하지 못한다.

선행 기술은 상피 기원의 세포 또는 표피에서의 NRAGE를 연구하기 위한 공지된 모델을 제공하지 못한다.

선행 기술은 조직과는 상관없이 LOX 단백질과 NRAGE 단백질 사이에서 일어나는 임의의 종류의 상호작용에 대한 정보를 제공하지 못한다.

선행 기술은 각질세포에서 LOX 및/또는 NRAGE의 발현을 조정할 수 있는 활성 성분을 밝혀내기 위한 모델을 제공하지 못한다.

추가로, 특정 용도의 동물 실험은 현재 유럽에서 금지되어 있고, 인간 실험은 윤리적 논쟁 거리이다. 따라서, 발명자들이 동물 또는 인간을 사용한 스크리닝 방법을 수행하는 것은 허용되지 않는다.

3차원 모델 MIMESKIN^® (프랑스 소재의 콜레티카(Coletica))에서, LOX는 표피에서 발현되고, 이것의 발현은 각질세포의 분화 수준에 대한 함수로서 조절된다 [Noblesse et al., 2004]. 이러한 연구는 NRAGE의 발현 또는 LOX와 세포자멸 사이의 가능한 관계 여부에 대한 조사는 포함하지 않았기 때문에, 증식, 분화 및 세포자멸 사이의 균형이 파괴된 경우 (노화, 스트레스, 질환)에 당업자가 세포내 항상성을 조절하기 위해서 상기한 균형을 기초로 하여 LOX 및/또는 NRAGE의 발현을 조정하는데 관심을 갖지는 않을 것이 명확하고, 이것은 새로운 기술적 문제가 된다.

따라서, 선행 기술은 세포 조절에 작용하기 위한 목적으로 LOX의 발현을 조정하는 것과 관련이 있을 수도 있고 관련이 없을 수도 있는, LOX의 세포내 파트너 (예컨대 NRAGE)의 발현을 조정할 수 있는 활성 성분을 제공하지 못한다. 이러한 맥락에서, 이들 활성 성분의 효과를 판단하기 위한 객관적인 기준을 얻기도 매우 어렵다.

발명의 목적

본 발명의 주된 목적은 상기 언급한 기술적 문제, 특히 LOX 단백질과 NRAGE 단백질 사이의 상호작용이 없거나 변경된 경우에 LOX 단백질과 NRAGE 단백질 사이의 상호작용을 개선시키기 위한 활성 성분을 동정하는 방법을 제공하는 것과 관련된 기술적 문제를 해결하는 것이다.

특히, 본 발명의 목적은 노화 또는 UV에 의해 변질되거나 다른 유형의 공격을 받은 피부의 사례, 및/또는 건선, 습진, 이식편-대-숙주 반응, 편평 태선 및/또는 암성 질환과 같은 병리 상태의 사례에서와 같이 증식, 분화 및 세포자멸 사이의 세포내 균형이 파괴된 경우에 이러한 균형을 조절하기 위한 것이다.

추가로, 본 발명은 노화 또는 UV에 의해 변질되거나 다른 유형의 공격을 받은 피부의 사례, 및/또는 건선, 습진, 이식편-대-숙주 반응, 및 암성 반흔 및/또는 질환과 같은 병리 상태의 사례에서와 같이 특히 증식, 분화 및 세포자멸 사이의 세포내 균형이 파괴된 경우에 이러한 균형을 조절하는데 있어서, LOX 및/또는 NRAGE의 발현을 조정하는 활성 성분의 용도에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 LOX 단백질과 NRAGE 단백질 사이의 상호작용이 없거나 변경된 경우에 LOX 단백질과 NRAGE 단백질 사이의 상호작용을 개선시키기 위한 활성 성분에 관한 것이다.

본 발명은 특히 피부 세포 모델에서 NRAGE의 발현 및 이러한 발현 후의 위치를 확인하는 방법을 제공하는 것에 대한 기술적 문제를 해결할 수 있게 한다. 본 발명은 LOX 단백질과 NRAGE 단백질 사이의 상호작용의 불량한 조절과 관련된 상태를 진단하는 방법을 제공하는 기술적 문제를 해결할 수 있게 한다.

발명의 설명

이하, 본 명세서 전반에서 사용된 용어의 의미를 기재하며, 이는 본 발명자들이 이해하고 있는 바와 같다:

"LOX": 특히 서열 1의 아미노산 서열로 정의된 바와 같은 인간 단백질 리실 옥시다제, LOX의 이소형.

"NRAGE": 특히 서열 2의 아미노산 서열로 정의된 바와 같은 인간 단백질 NRAGE.

"LOX의 발현 조정": LOX를 코딩하는 유전자의 조정. 특히, LOX를 코딩하는 메신저 RNA의 발현 조정. 이러한 메신저 RNA로부터의 LOX 합성을 조정하는 것 뿐만이 아니라 LOX의 활성까지도 조정함.

"NRAGE의 발현 조정": NRAGE를 코딩하는 유전자의 조정. 특히, NRAGE를 코딩하는 메신저 RNA의 발현 조정. 이러한 메신저 RNA로부터의 NRAGE 합성을 조정하는 것 뿐만이 아니라 NRAGE의 생물학적 효과까지도 조정함.

이러한 조정은 증식, 분화 및 세포자멸 사이의 균형이 파괴된 상황에서 이러한 균형 상태를 재유도할 수 있게 해야 한다.

LOX에 효과적이라고 여겨지는 활성 성분은, LOX 발현 및/또는 활성을 나타내는 1종 이상의 세포 유형을 포함하는 모델에서 이들 활성 성분과의 접촉시에 대조군 모델 (일반적으로, 상기 활성 성분과 접촉시키지 않음)에서의 LOX 발현 및/또는 활성 수준에 비해 LOX의 mRNA 발현에 있어서는 약 ±50％의 차이를 제공하고/하거나 LOX의 발현 및/또는 LOX의 활성에 있어서는 약 ±15％의 차이를 제공하는 것들이 바람직하다.

NRAGE에 효과적이라고 여겨지는 활성 성분은 NRAGE 발현 및/또는 활성을 나타내는 1종 이상의 세포 유형을 포함하는 모델에서 이들 활성 성분과의 접촉시에 대조군 모델 (일반적으로, 상기 활성 성분과 접촉시키지 않음)에서의 NRAGE 발현 및/또는 활성 수준에 비해 NRAGE의 mRNA의 발현에 있어서는 약 ±50％의 차이를 제공하고/하거나 NRAGE의 발현 및/또는 NRAGE의 생물학적 효과에 있어서는 약 ±15％의 차이를 제공하는 것들이 바람직하다.

따라서, 첫번째 특징에 따라, 본 발명은 특히 증식, 분화 및 세포자멸 사이의 세포내 균형이 파괴된 경우, 특히 LOX 단백질과 NRAGE 단백질 사이의 상호작용이 없거나 변경된 경우에 이러한 현상들 사이의 균형을 조절하기 위해서 LOX 단백질과 NRAGE 단백질 사이의 상호작용을 조정하는 조성물을 제조하는데 있어서, 적어도 서열 1의 LOX 단백질의 발현 및/또는 활성을 조정하고/하거나 적어도 서열 2의 NRAGE 단백질의 발현 및/또는 활성을 조정하는 유효량의 1종 이상의 물질의 용도에 관한 것이다.

본 발명은 LOX 단백질과 NRAGE 단백질 사이의 상호작용이 없거나 변경된 경 우에 LOX 단백질과 NRAGE 단백질 사이의 상호작용을 개선시키기 위한 조성물을 제조하는데 있어서, 서열 1의 LOX의 발현 및/또는 활성을 조정하고/하거나 서열 2의 NRAGE의 발현 및/또는 활성을 조정하는 유효량의 1종 이상의 물질의 용도에 관한 것이다.

추가로, 본 발명은 증식, 분화 및 세포자멸 사이의 세포내 균형이 없거나 변경된 하나 이상의 상태를 예방하거나 치료하기 위한 조성물을 제조하는데 있어서, 적어도 서열 2의 NRAGE 단백질의 발현 및/또는 활성을 조정하고 서열 1의 LOX 단백질의 발현 및/또는 활성을 임의로 조정하는 유효량의 1종 이상의 물질의 용도에 관한 것이다.

유리하게는, LOX 및/또는 NRAGE의 발현은 상피 세포, 특히 각질세포에서 조정된다.

유리하게는, 상기 물질의 목적은 LOX 단백질과 NRAGE 단백질 사이의 상호작용, 특히 NRAGE 단백질의 IRD 도메인에서 일어나는 상호작용을 조정하는 것이다.

유리하게는, LOX 단백질과 NRAGE 단백질 사이의 상호작용은 LOX-유도된 효소적 촉매 작용에 의한 NRAGE의 중합, 특히 NRAGE의 이량체화를 포함한다.

유리하게는, LOX 단백질과 NRAGE 단백질 사이의 상호작용은 LOX의 촉매 활성으로 인한 H₂O₂의 생성을 수반하며, H₂O₂는 이후에 다른 분자, 예를 들어 중성 스핑고마이엘리나제 또는 NF-κB를 활성화시킨다.

유리하게는, LOX 단백질과 NRAGE 단백질 사이의 상호작용은 LOX의 비-효소 활성, 특히 LOX의 전-영역(pro-region) (A22 내지 D169)에 의해 발휘되는 활성을 포함한다.

유리하게는, 상기 물질의 목적은 스트레스에 대한 세포 노출, 특히 열에 대한 세포 노출, 또는 조사(radiation), 특히 태양광 조사에 대한 세포 노출, 또는 독성제, 예를 들어 화학적 또는 미생물학적 작용제에 대한 세포 노출, 피부 노화, 편평 태선, 이식편-대-숙주 반응 (GVH), 습진, 건선 및 암, 특히 상피 암으로 구성된 군에서 선택된 상태를 치료하고/하거나 예방하는 것이다.

유리하게는, 상기 물질의 목적은 과증식(hyperproliferation), 특히 기저세포형 또는 유극세포형의 암, 더욱 특히 상피 암, 가장 특히 피부 상피 암, 건선 또는 습진의 사례에서 세포 증식을 감소시키는 것이다.

유리하게는, 상기 물질의 목적은 특히 피부 노화, 스트레스에 대한 피부 노출, 특히 열에 대한 노출, 또는 조사, 특히 태양광 조사에 대한 피부 노출, 또는 독성제, 예를 들어 화학적 또는 미생물학적 작용제에 대한 피부 노출, 또는 이식편-대-숙주 반응 (GVH) 동안 발생하는 실질적인 세포자멸의 사례에서 표피의 세포자멸을 감소시키는 것이다.

유리하게는, 상기 물질의 목적은 특히 노화, 열에 대한 피부 노출, 조사, 특히 태양광 조사에 대한 피부 노출 또는 이식편-대-숙주 반응 (GVH) 동안 발생하는 표피에서의 세포 저증식(hypoproliferation)의 사례에서 세포 증식을 증가시키는 것이다.

유리하게는, 상기 물질의 목적은 피부 노화, 스트레스에 대한 피부 노출, 특 히 열에 대한 노출, 또는 조사, 특히 태양광 조사에 대한 피부 노출, 또는 독성제, 예를 들어 화학적 또는 미생물학적 작용제에 대한 피부 노출, 또는 이식편-대-숙주 반응 (GVH) 동안에 LOX의 발현을 자극하고 NRAGE의 발현을 임의로 억제하는 것이다.

유리하게는, 상기 물질의 목적은 건선 또는 습진을 예방하거나 치료하기 위해서 표피에서 NRAGE의 발현 및/또는 활성을 자극하고 LOX의 발현 및/또는 활성을 임의로 억제하는 것이다.

유리하게는, 상기 물질의 목적은 기저세포형 또는 유극세포형의 암, 특히 상피 암, 더욱 특히 피부 상피 암, 또는 편평 태선을 예방하거나 치료하기 위해서 LOX 및 NRAGE의 발현을 자극하는 것이다.

유리하게는, 상기 조성물은 미용 조성물, 영양학적 조성물, 피부제약 조성물 또는 제약 조성물이다.

유리하게는, 증식, 분화 및 세포자멸 사이의 세포내 균형은 각질세포의 증식, 분화 및 세포자멸 사이의 균형이다.

유리하게는, 활성 성분 제조에 사용되는 출발 물질이 식물 (바람직하게는 뿌리, 줄기, 껍질, 꽃, 열매, 종자, 배아, 검, 삼출물, 잎, 또는 온전한 식물) 또는 단백질인 경우, 이것은 바람직하게는 5 kGy 용량의 조사, 예를 들어 베타 또는 감마 조사로 멸균될 수도 있고 멸균되지 않을 수도 있으며, 이후에는 필요에 따라 예를 들어 실온에서 분쇄하여 분말로 크기를 줄인다. 이후, 분말을 예를 들어 극성 용매, 예를 들어 물, 알콜, 글리콜, 예컨대 부틸렌 글리콜, 또는 폴리올, 및/또는 극성 용매들의 혼합물, 유리하게는 물과 알콜, 글리콜 또는 폴리올 (예컨대 에탄올, 글리세롤, 부틸렌 글리콜 및 다른 글리콜, 크실리톨 등)의 다양한 비율의 혼합물, 바람직하게는 75/25 또는 50/50의 물/부틸렌 글리콜 혼합물 중에서, 또는 비극성 용매, 예를 들어 알칸, 또는 비극성 용매들의 혼합물, 또는 극성 용매와 비극성 용매의 혼합물 중에서 분말의 2 내지 5％ (중량/중량), 바람직하게는 5％의 비율로 분산시킨다. 바람직하게는 2시간 이상 동안 교반, 예를 들어 자성 교반하고 임의로는 용매를 가열한 후에, 샘플을 바람직하게는 경사분리 또는 원심분리로 청징화한 후에 바람직하게는 0.45 ㎛ 또는 0.22 ㎛ 필터에서 여과한다.

유리하게는, 활성 성분 제조에 사용되는 출발 물질이 특징규명된 분자 (예컨대 합성 또는 반-합성으로 수득된 분자, 정제로 수득된 생물학적 분자)인 경우, 이것은 용매, 바람직하게는 물 또는 디메틸 술폭시드 중에 희석 (분자에 따라, 바람직하게는 10^-6 M 내지 10^-2 M, 특히 바람직하게는 10^-4 M, 또는 바람직하게는 1％ 중량/중량 내지 5％ 중량/중량의 농도)시킨다. 이어서, 수득된 용액을 바람직하게는 0.45 ㎛ 또는 0.22 ㎛ 필터에서 임의로 여과한다.

유리하게는, 상기한 방법 중 하나로 수득된 활성 성분을 바람직하게는 0.01 ％ 부피/부피 (v/v) 및 10％ (v/v), 특히 바람직하게는 0.1％ 내지 1％ (v/v)의 최종 농도로 사용한다.

유리하게는, 상기 물질은 대두 추출물, 에페드라(ephedra) 추출물, 홉 추출물 및 계피 추출물로 구성된 군에서 선택된다.

두번째 특징에 따라, 본 발명은

- 상기 활성 성분을 LOX 단백질 (서열 1) 및/또는 NRAGE 단백질 (서열 2)을 발현할 수 있는 1종 이상의 유형의 살아있는 세포와 접촉시키는 단계, 및

- LOX 및/또는 NRAGE의 발현을 분석하여, 증식, 분화 및 세포자멸 사이의 세포내 균형을 개선시키기 위해서 특히 LOX 및/또는 NRAGE의 발현 및/또는 활성을 조정하는 활성 성분을 동정하는 단계

를 포함하는 것을 특징으로 하는, 특히 증식, 분화 및 세포자멸 사이의 세포내 균형이 없거나 변경된 하나 이상의 상태를 예방하거나 치료하기 위해서 LOX 단백질과 NRAGE 단백질 사이의 상호작용을 조정하려는 목적으로 상기한 1종 이상의 활성 성분을 동정하는 방법에 관한 것이다.

추가로, 본 발명은

- LOX 및/또는 NRAGE의 발현을 분석하여, 특히 LOX 단백질과 NRAGE 단백질 사이의 상호작용이 없거나 변경된 경우에 LOX 단백질과 NRAGE 단백질 사이의 상호작용을 개선시키기 위해서 LOX 및/또는 NRAGE의 발현 및/또는 활성을 조정하는 활성 성분을 동정하는 단계

를 포함하는 것을 특징으로 하는, LOX 단백질과 NRAGE 단백질 사이의 상호작용이 없거나 변경된 경우에 LOX 단백질과 NRAGE 단백질 사이의 상호작용을 개선시키기 위해서 LOX 단백질과 NRAGE 단백질 사이의 상호작용을 조정하기 위한 1종 이 상의 활성 성분을 동정하는 방법에 관한 것이다.

유리하게는, LOX 단백질 및/또는 NRAGE 단백질을 발현할 수 있는 상기 살아있는 세포의 증식, 분화 및 세포자멸 사이의 균형, 또는 LOX 단백질과 NRAGE 단백질 사이의 상호작용은, 이것들이 활성 성분과 접촉하기 전에 없거나 변경되어 있다.

유리하게는, 살아있는 세포는 상피 세포, 특히 각질세포이다.

유리하게는, 상기 방법은 LOX 및/또는 NRAGE의 메신저 RNA 발현 분석을 포함한다.

유리하게는, 상기 방법은 특히 하기 프라이머를 사용한 정량적 RT-PCR을 이용하는 것을 포함한다:

- LOX 유전자의 경우:

- NRAGE 유전자의 경우:

유리하게는, 상기 방법은 예를 들어 정량적 RT-PCR에 의한 메신저 RNA의 발현에 관한 역학 분석을 포함한다.

추가로, 본 발명은 LOX 및/또는 NRAGE의 발현을 조정하는 물질을 사용하거나 투여하여 LOX 단백질과 NRAGE 단백질 사이의 상호작용을 개선시키는 것을 포함하는, 1종 이상의 세포 유형에서 증식, 분화 및 세포자멸의 세포내 현상 사이의 균형 이 파괴된 대상체를 미용상 관리하거나 치유적 치료하는 방법에 관한 것이다.

추가로, 본 발명은 서열 1의 LOX의 발현 및/또는 활성을 조정하고/하거나 서열 2의 NRAGE의 발현 및/또는 활성을 조정하는 물질을 사용하거나 또는 투여하는 것을 포함하는, LOX 단백질과 NRAGE 단백질 사이의 상호작용이 없거나 변경된 대상체를 미용상 관리하거나 치유적 치료하는 방법에 관한 것이다.

추가로, 본 발명은 NRAGE의 발현 및/또는 활성을 조정하고 LOX의 발현 및/또는 활성을 임의로 조정하는 물질을 사용하거나 또는 투여하는 것을 포함하는, 증식, 분화 및 세포자멸 사이의 세포내 균형이 없거나 변경된 상태의 대상체를 미용상 관리하거나 치유적 치료하는 방법에 관한 것이다.

세번째 특징에 따라, 본 발명은

- 앞서 정의한 동정 방법을 이용하여, 증식, 분화 및 세포자멸 사이의 세포내 균형을 개선시키기 위해서 LOX 및/또는 NRAGE의 발현 및/또는 활성을 조정하는 활성 성분을 동정하는 단계, 및

- 상기 활성 성분을 1종 이상의 부형제와 혼합하여, 증식, 분화 및 세포자멸 사이의 세포내 균형이 없거나 변경된 하나 이상의 상태를 예방하거나 치료하기 위한 미용 조성물, 영양학적 조성물, 피부제약 조성물 또는 제약 조성물을 생성하는 단계

를 포함하는, 조성물의 제조 방법에 관한 것이다.

추가로, 본 발명은

- 앞서 정의한 동정 방법을 이용하여, LOX 단백질과 NRAGE 단백질 사이의 상 호작용을 개선시키기 위해서 LOX 및/또는 NRAGE의 발현 및/또는 활성을 조정하는 활성 성분을 동정하는 단계, 및

- 상기 활성 성분을 1종 이상의 부형제와 혼합하여, LOX 단백질과 NRAGE 단백질 사이의 상호작용이 없거나 변경된 경우에 LOX 단백질과 NRAGE 단백질 사이의 상호작용을 개선시키기 위한 미용 조성물, 영양학적 조성물, 피부제약 조성물 또는 제약 조성물을 생성하는 단계

를 포함하는, 조성물의 제조 방법에 관한 것이다.

네번째 특징에 따라, 본 발명은 특히 적어도 각질세포를 포함하는 재구성된 피부 모델, 또는 피부 절편, 바람직하게는 증식, 분화 및 세포자멸 사이의 세포내 균형이 없거나 변경된 상태를 나타내는 표피를 갖는 사람에서 유래된 피부 절편에서 1종 이상의 항-NRAGE 항체를 사용하여 NRAGE의 존재를 검출하고 위치를 확인하는 것을 포함하는, NRAGE의 위치를 확인하는 방법에 관한 것이다.

다섯번째 특징에 따라, 본 발명은 특히 상피 세포, 바람직하게는 각질세포에서 세포내 수준에서의 NRAGE의 발현 조정을 검출하기 위한 조성물을 제조하는데 있어서 항-NRAGE 항체의 용도에 관한 것이다.

유리하게는, 상기 조성물의 목적은 특히 표피에서 증식, 분화 및 세포자멸 사이의 세포내 균형, 또는 LOX 단백질과 NRAGE 단백질 사이의 상호작용이 없거나 변경된 상태를 검출하는 것이고, 이때 상기 상태는 스트레스에 대한 세포 노출, 특히 열에 대한 세포 노출, 또는 조사, 특히 태양광 조사에 대한 세포 노출, 또는 독성제, 예를 들어 화학적 또는 미생물학적 작용제에 대한 세포 노출, 피부 노화, 편 평 태선, 이식편-대-숙주 반응 (GVH), 습진, 건선 및 기저세포형 또는 유극세포형의 암, 특히 상피 암, 더욱 특히 피부 상피 암으로 구성된 군에서 선택된다.

유리하게는, 상기 조성물은 또한 특히 상피 세포, 바람직하게는 각질세포에서 세포내 수준에서의 LOX의 발현 조정을 검출하기 위한 항-LOX 항체를 포함한다.

유리하게는, 상기 조성물은 또한 각질세포에서 LOX의 발현 조정을 검출하기 위한 항-LOX 항체를 포함한다.

유리하게는, 상기 각질세포는 인간 각질세포이다.

예상치 못하게도, 본 발명자들은 LOX와 NRAGE 단백질 사이의 상호작용을 발견하였다. 이러한 발견은 본 발명의 기초이면서 출발점이다. 실제로, LOX는 증식, 분화 및 세포자멸 경로의 교차점에 존재하며 세포내 항상성을 제어할 수 있는 단백질인 것으로 나타났다.

본 발명자들은 또한 NRAGE 단백질이 특히 표피에 존재하고 특히 각질세포에 의해 발현된다는 것도 발견하였다. 이러한 발견 역시 LOX 단백질과 NRAGE 단백질 사이의 상호작용을 세포내 항상성이 파괴된 상황에서 세포내 항상성을 복구시키기 위한 미용상 관리 또는 치료의 작용 표적이 되도록 할 수 있다.

1) LOX / NRAGE 상호작용의 시험관내 발견 및 특징규명

표피 중 LOX의 존재는 이미 발견된 바 있는데 [Noblesse et al., Lysyl oxidase-like and lysyl oxidase are present in the dermis and epidermis of a skin equivalent and in human skin and are associated to elastic fibers, J. Invest. Dermatol., 122, 621-630, 2004], 본 발명자들은 LOX가 위치하는 수준에서는 콜라겐 또는 엘라스틴을 거의 또는 전혀 만들지 못하는 이들 세포에서는 LOX가 이 수준에서 행할 수 있는 역할(들)이 LOX의 현재 알려진 주된 역할 (콜라겐 및 엘라스틴의 가교)과는 다소 다를 것임을 알고, 이러한 역할(들)을 결정하기 위해 노력하였다.

이러한 목적을 염두에 두고, 본 발명자들은 효모 2-하이브리드 기술을 이용하여 LOX의 단백질 파트너를 조사하고 정상적인 인간 피부 각질세포 cDNA의 라이브러리를 특히 루어(lure) GAL4 BD-hLOXmat로 스크리닝하였으며, 이로 인해 NRAGE를 LOX의 잠재적인 파트너로 동정할 수 있었다 (실시예 1 참고).

Hela 세포에서 2-하이브리드 기술을 이용하여, 본 발명자들은 이러한 잠재적인 협력이 포유동물 세포에서도 관찰된다는 것을 입증하였다 (실시예 2 참고).

다음 단계는 LOX 단백질과 NRAGE 단백질 사이의 이러한 잠재적인 협력의 확인이 이들 2종의 단백질 사이의 직접적인 물리적 상호작용에 상응할 수 있는지의 여부를 결정하는 것이었다. 이것은 특히 LOX 단백질 및 NRAGE 단백질의 유전자로 Cos7 세포를 형질감염시킨 후에 생성된 LOX 단백질 및 NRAGE 단백질의 동시-면역침전을 수반하는 기술로 수행되었다. 얻어진 결과는, 한편으로는 LOX 단백질과 NRAGE 단백질 사이의 물리적 상호작용을 확인시켜 주었고, 다른 한편으로는 LOX가 MAGE 단백질 과에서 NRAGE에 특이적인 영역인 IRD (산재된 반복 도메인)라고 불리는 NRAGE의 특별한 영역과 상호작용한다는 것을 밝혀내는 것을 가능하게 했다 (실시예 3 참고).

이러한 맥락에서, 여기서는 한편으로는 NRAGE 단백질이 LOX의 촉매 작용하에서 이량체화되기에 유리한 부위일 수 있는 리실 잔기가 풍부한 2개의 도메인을 함유하고, 다른 한편으로는 이것이 정확하게 이량체 형태로 존재하여 NRAGE의 기능이 그 자체로 명확해 보인다는 것을 함께 고려한다면, LOX 단백질과 NRAGE 단백질 사이의 상호작용의 발견이 매우 특별하게 흥미를 끈다는 것이 지적되어야 한다.

NRAGE의 IRD 영역에서 LOX 단백질과 NRAGE 단백질 사이에 직접적인 물리적 상호작용이 존재함을 시험관내 밝혀낸 본 발명자들은, 이러한 상호작용이 생체내에서도 일어날 것인지의 여부에 의문을 가졌다. 여기서, LOX와는 달리 피부 중 NRAGE의 존재가 이전에는 보고된 바 없다는 것이 주목되어야 한다.

2) 정상적인 인간 피부 및 재구성된 정상적인 인간 피부 중 NRAGE 의 존재의 확인

본 발명자들은 피부의 진피와 표피 둘다에서 NRAGE가 발현되는 것을 확인하였다 (실시예 4 및 실시예 5 참고).

본 발명의 범위 내에서, 본 발명자들은 피부에서 NRAGE의 발현 위치를 확인하는 방법을 이용하였다.

표피에서, 본 발명자들은 예상치 못하게도 (일반적으로 편재해 존재하는 것으로 기재되는 단백질에서 예상되는 바와 같이) NRAGE가 균일하게 발현되는 것이 아니라 발현 구배를 갖는 형태로 발현된다는 것을 입증하였다.

표피 구조에 대한 검토:

표피는 진피에 고정된 기저막 위에 있는 층상 상피이다. 이것의 두께는 평균 60 ㎛ 내지 100 ㎛이고, 가장 안쪽에서부터 표면까지 각질세포의 점진적 분화로 인해 생성된 하기 4개의 연속층으로 이루어져 있다:

- 기저 세포층 (1개의 세포열)

- 유극 세포층 (5개 내지 6개의 단일세포층)

- 과립층 (1개 내지 3개의 단일세포층)

- 각질층 (5개 내지 10개의 단일세포층).

따라서, NRAGE는 기저 세포층에는 존재하지 않으며, 분화된 각질세포의 제1 층에서 나타나고 표지는 각질층에서 증가된다. 표피의 제1 기저상부 세포층에서의 표지는 LOX에 대하여 관찰되는 것에 상응하는데, 기저 세포층에서부터 위쪽으로 나타난다. 다른 한편, LOX의 표지는 NRAGE가 존재하는 표피의 상부 층에서 감소되고, 다음과 같은 3개 대역 사이가 구별된다:

- 기저 세포층 및 제1 증식성 기저상부 세포층을 포함하며, 오직 LOX만이 발현되는 표피의 하부 대역,

- 제1 비-증식성 기저상부 세포층에서부터 제1 단일세포 각질층으로 연장되며, LOX와 NRAGE가 동시-발현되는 중간 대역, 및

- 오직 NRAGE만이 발현되는 표피의 상부 대역.

세포내 수준에서의 관찰은 LOX와 NRAGE가 세포의 주변부, 특히 아막성(submembranous) 영역에 존재하고, NRAGE는 세포질에도 존재한다는 것을 보여준다 (실시예 4 및 실시예 5 참고).

따라서, 본 발명자들은 피부 중 진피와 표피 둘다에서 NRAGE의 존재를 최초로 확인하였다. 본 발명자들은 또한 표피가 LOX 단백질과 NRAGE 단백질이 둘다 발현되고 특히 각질세포에서 세포내 수준에서 아막성 말초 대역인 동일 위치를 공유하는 부분을 포함한다는 것을 보여주었다 (NRAGE는 세포질에도 존재함).

따라서, 본 발명자들은 LOX와 NRAGE가 둘다 위치하는 대역의 표피에서 일어날 수 있는 직접적인 상호작용에 대한 조건의 달성을 시험관내 확인하여 입증하였다.

3) 노화된 표피 및 특정 병리 상태의 표피 중 LOX 및/또는 NRAGE 의 발현 파괴의 확인

본 발명자들은 또한 예상치 못하게도 피부 노화 및 수많은 병리 상태가 표피에서의 LOX 및/또는 NRAGE의 발현 파괴에 수반된다는 것을 입증하였다.

3.1) 표피 중 LOX 및 NRAGE 의 상태

3.1.1) 노인의 피부

노인의 피부는 매우 얇고 (몇개의 세포 층으로 감소됨) 과각질화된 저증식성 표피를 특징으로 한다.

본 발명자들은 노화된 피부에 LOX (사용된 기술로 검출가능함)가 전혀 없다는 것을 확인하였다. 다른 한편, NRAGE는 강력하게 발현되어 세포질에 위치하고, 발현 구배 없이 제1 기저상부 세포층에서부터 위쪽으로 나타난다.

따라서, 본 발명은 NRAGE의 발현 (및/또는 활성)을 억제하거나 억제하지 않으면서 LOX의 발현 (및/또는 활성)을 자극하여, 특히 LOX 및 NRAGE 동시발현 대역을 복구시킴으로써 조절되는 분화 대역 및/또는 세포자멸 대역을 재유도하는 것을 가능하게 한다. 또한, 이것은 피부, 특히 표피가 두꺼워지게 한다.

따라서, 본 발명의 목적은 특히 피부에 대한 노화의 영향을 보정하거나 저해하는 것이다.

3.1.2) 이식편 -대-숙주 반응 ( GVH )

GVH는 조혈 줄기 세포의 동종이식 후에 발생할 수 있는 질환이다. 이것은, 환자의 정상적인 장기 (특히, 피부, 간 및 소화관)의 이식편에 함유된 면역 세포 (림프구)의 영향과 관련이 있다. 피부에서, 이것은 그 자체가 반점구진성, 소양성 및 염증성 발진 형태로 나타난다.

상기 질환을 앓고 있는 환자는 고도의 세포자멸 표피를 갖는 매우 얇은 피부를 갖는다.

본 발명자들이 수행한 조직학적 연구는 LOX의 부재, 및 세포질에 위치하고 제1 기저상부 세포층에서부터 위쪽으로 나타나는 매우 현저한 NRAGE의 존재를 확인하였다.

따라서, 본 발명은 NRAGE의 발현 (및/또는 활성)을 억제하거나 억제하지 않으면서 LOX의 발현 (및/또는 활성)을 자극하여, LOX 및 NRAGE의 동시발현 대역을 재유도함으로써 이것들이 상호작용하여 특히 피부, 특히 표피가 두꺼워지는 것을 수반하면서 GVH의 피부 증세가 감소될 수 있게 한다.

따라서, 본 발명은 GVH를 앓고 있는 환자에서 상기 질환의 피부 증세가 감소될 수 있게 한다.

3.1.3) 편평 태선

태선은 수 밀리미터 직경의 보라색의 평평하고 고형이고 건조하며 매우 소양성인 구진이 존재하는 것을 특징으로 하는, 원인이 알려지지 않은 피부 질환이다.

본 발명자들은 LOX의 발현이 매우 크게 감소하거나 심지어는 전부 사라지고, NRAGE가 매우 불규칙하게 발현되는 것을 확인하였다. 이러한 관찰 결과는 연구된 상기 2종의 단백질 사이에 상호작용이 없거나 또는 매우 약한 수준임을 분명히 반영하는 것이다.

따라서, 본 발명은 NRAGE의 발현 (및/또는 활성)을 조정하거나 조정하지 않으면서 LOX의 발현 (및/또는 활성)을 자극하여, LOX 및 NRAGE 동시발현 대역을 재유도함으로써 LOX 및 NRAGE가 상호작용할 수 있게 하고 정상적인 표피 상태로 복귀되도록 한다.

따라서, 본 발명은 편평 태선을 앓고 있는 환자에서 상기 질환이 치료되거나 감소되거나 예방되도록 할 수 있다.

3.1.4) 건선

건선은 홍반성-편평 병변을 특징으로 하는 만성 피부 질환이다. 상기 질환의 기본적인 특징은, 표피가 보다 신속하게 재생되고 두꺼워지게 하는 것을 담당하는 각질세포의 증식률 증가이다.

조직학적으로, 마지막 분화의 제1 단계, 즉 마지막 불완전 분화에 관여하는 세포의 과증식이 관찰되며, 이것은 세포자멸이 없거나 매우 약하게 존재하는 것과 관련이 있다.

본 발명자들은 LOX의 매우 강력한 발현 및 NRAGE의 중간 수준의 존재를 검출하였고, 해당 대역은 더 균일하거나 덜 균일한 표지를 가지며 발현 구배는 나타내지 않았다. 표준치에서 벗어난 발현 강도의 이러한 특징들은 해당 단백질의 위치에 영향을 주는 훨씬 더 영향력 있는 비정상과 관련이 있다. 따라서, 건선 피부에서 LOX는 표피의 하위부에서 필수적으로 발현되고, NRAGE는 오직 그의 상위부에서만 발현되기 때문에, 이들 단백질의 발현은 건강한 피부에서 정상적으로 관찰되는 중첩 대역 없이 전이된 것이다. 세포내 수준에서는 NRAGE가 세포질에서만 관찰되고 아막성 말초 대역에서는 관찰되지 않는다.

이러한 관찰 결과는, 건선에서 LOX 단백질과 NRAGE 단백질이 둘다 표피에 존재하지만 이것들은 물리적으로 동일한 공간에 존재하지 않기 때문에 서로와 직접적인 상호작용을 할 수 없음을 보여준다. 이와 같이 상호작용이 없기 때문에 표피에서 기능장애가 관찰되는 것이고, 이는 표피의 항상성 유지에 있어서 LOX 단백질과 NRAGE 단백질 사이의 상호작용의 역할을 반영한다.

따라서, LOX의 발현 (및/또는 활성) 억제 및/또는 NRAGE의 발현 (및/또는 활성)의 임의의 자극, 바람직하게는 부분적 자극은 LOX와 NRAGE의 발현이 중첩되는 대역이 생성되게 하여, 각질세포에서의 세포자멸을 촉진시킴으로써 과증식이 감소될 수 있게 하는 조절되는 증식 대역의 재유도가 특히 가능하게 한다.

추가로, NRAGE의 발현 (및/또는 활성)의 자극 및/또는 LOX의 발현 (및/또는 활성)의 억제, 바람직하게는 부분적 억제는 LOX와 NRAGE의 발현이 중첩되는 대역이 생성되게 하여, 각질세포에서의 세포자멸을 촉진시킴으로써 과증식이 감소될 수 있게 하는 조절되는 증식 대역의 재유도가 특히 가능하게 한다.

따라서, 본 발명은 건선을 예방하고/하거나 치료하거나, 이것의 효과를 일부 감소시키는 것을 가능하게 한다.

3.1.5) 습진

습진은 임상적으로 반점, 더 광범위하거나 덜 광범위한 국소화 종창, 및 이후에 가피(scab)를 형성하고 심한 가려움을 동반하는 습윤성 소포를 특징으로 하는 피부 병소(complaint)이다. 만성기에, 습진은 피부가 두꺼워지면서 변형되어 악화된다. 표피에서는 세포자멸이 감소된다.

본 발명자들은 세포 주변부에서 LOX가 매우 강력하게 발현되는 것을 확인하였다. 다른 한편, NRAGE는 약하게 발현되며 오직 세포질에서만 관찰되는데, 이것은 연구된 상기 2종의 단백질 사이의 상호작용이 없거나 또는 매우 약한 수준임을 명확하게 반영하는 것이다.

따라서, NRAGE의 발현 (및/또는 활성)의 자극, 및/또는 LOX의 발현 (및/또는 활성)의 억제, 바람직하게는 부분적 억제는 세포자멸을 증가시켜서 습진의 효과를 일부 감소시키는 것을 가능하게 한다.

따라서, 본 발명은 습진을 예방하고/하거나 치료하고, 특히 이것의 효과를 일부 감소시키는 것을 가능하게 한다.

3.1.6) 상피 피부암

2가지 주요 유형의 상피 피부 암종 사이가 구별된다:

- 기저세포 암종 (사례의 90％)은 본질적으로 국소적이고 서서히 발생하는 종양이며, 거의 전이되지 않는다. 이것은 기저 세포층 각질세포의 증식이 제어되지 않는 것에서 비롯된다.

- 유극세포 암종 (사례의 10％)은 훨씬 더 공격적으로 국소 발생하며, 전이될 수 있다. 이것은 유극 세포층 각질세포의 증식이 제어되지 않는 것에서 비롯된다.

본 발명자들은 연구된 2가지 유형의 암 (기저세포암 및 유극세포암)의 침윤성 세포에 LOX 및 NRAGE가 없고 종양 근처의 표피에서 LOX 및 NRAGE가 점진적으로 손실된다는 것을 확인하였다. 본 발명자들은 또한 LOX가 종양 주위의 간질 반응에서 강력하게 발현되는 반면에 NRAGE는 이 반응에 존재하지 않음을 관찰하였다.

여기서, 이들 2가지 유형의 암의 사례에 있어서 이전에 확인된 바 없었던 LOX의 발현 부재는 예상치 못한 것이며 LOX는 일반적으로 암에 계내 존재한다고 여겨지고 있기 때문에 이것은 아마도 상피 암에 특이적일 것임에 주목할 수 있다.

NRAG의 발현 부재는 전혀 새로운 것이며, 어떠한 암에서도 기재된 바 없다.

따라서, NRAGE의 발현 (및/또는 활성)의 자극 및 LOX의 발현 (및/또는 활성)은 항상성 복구를 가능하게 한다. 이것은, 특히 상피 피부암에서 종양의 표현형이 반전되게 하는 것을 가능하게 한다.

3.2) 병리 조직 연구에 대한 결론

이러한 관찰 결과를 기초로 하여, 본 발명자들은 증식, 분화 및 세포자멸 사이의 균형의 탈조절을 수반하는 상황이 노년 대상체의 표피에서건 또는 특히 표피를 공격하는 여러가지 질환을 앓고 있는 대상체의 표피에서건 간에 LOX와 NRAGE의 상호작용을 변화시키거나 이들의 상호작용을 불가능하게 하는 LOX 및/또는 NRAGE의 발현 결핍을 계통적인 특징으로 한다는 것을 입증할 수 있었다.

이러한 발견은 본 발명자들로 하여금 LOX 또는 NRAGE에 의해 발휘되는 제어를 이용하여, 바람직하게는 LOX-NRAGE 커플을 이용하여 증식, 분화 및 세포자멸 사이의 균형을 복구시키는 수단을 조사하게 했다.

따라서, 이러한 예상치 못한 발견을 기초로, 본 발명자들은 조성물, 특히 미용 조성물 또는 제약 조성물의 제조를 위한 활성 성분을 동정하고자 하는 목적으로 이들 단백질의 상호작용을 통해 발휘되는 제어를 복구하기 위해서 LOX 및/또는 NRAGE의 발현을 조정하는 활성 성분을 동정하는 방법을 제공한다.

이러한 방식으로, 극도로 얇은 표피 및 LOX의 발현 부재를 특징으로 하는 표피 저증식 (노화된 피부, GVH)의 사례에서는 NRAGE의 발현을 억제하거나 억제하지 않으면서 LOX의 발현을 자극하여, LOX 및 NRAGE의 동시발현 조정을 통해 조절되는 분화 및 세포자멸 대역을 재유도함으로써 피부가 두꺼워지도록 한다.

NRAGE가 과소발현되는 표피 과증식 (건선, 습진)의 사례에서는 LOX의 발현을 억제하거나 (약간) 억제하지 않으면서 NRAGE의 발현을 자극하여, 조절된 증식 대역 (LOX/NRAGE 중첩부)을 재유도하고 과증식이 멈출 수 있게 함으로써 세포자멸을 촉진시킨다.

NRAGE가 과다발현되고 표피에서의 세포자멸이 높은 수준으로 일어나는 사례 (노화된 피부, 스트레스에 대한 피부 노출, 특히 열에 대한 노출, 또는 조사, 특히 태양광 조사에 대한 피부 노출, 또는 독성제, 예를 들어 화학적 또는 미생물학적 작용제에 대한 피부 노출, 또는 이식편-대-숙주 반응 (GVH))에서는 LOX의 발현을 억제하거나 억제하지 않으면서 NRAGE의 발현을 억제한다.

4) 세포내 세포자멸에 LOX 가 관여한다는 것에 대한 확인

예상치 못하게도, 본 발명자들은 LOX와 세포자멸 사이에 지금까지는 알려지지 않았던 관련성이 있다는 것을 확인하였다. 따라서, 수득된 데이타는 각질세포에서 LOX가 수행하는 항-세포자멸 역할을 반영하며, 상기 역할은 전-세포자멸 단백질, 특히 NRAGE의 조절을 포함한다.

5) 활성 성분에 대한 조사

활성 성분은 특히 배양된 각질세포, 바람직하게는 인간 각질세포에서 특히 LOX 및 NRAGE의 메신저 RNA의 발현을 분석하여 동정되었다. 활성을 시험할 활성 성분을, 배양된 각질세포와의 접촉이 효과적인 적절한 조건하에서 충분한 시간 동안 상기 배양된 각질세포와 접촉되도록 위치시킨다. 활성 성분을 여러가지 농도에서 시험하여, 농도에 의한 임의의 영향이 검출될 수 있도록 하는 것이 바람직하다.

본 발명에서 스크리닝된 활성 성분은, 특히 화학적 합성과 관련된 문제들을 피하기 위해서는 식물성 기원인 것이 유리하다. 식물성 기원의 활성 성분의 유리한 점은 특히 약학, 피부약학, 영양학 및 미용학 업계의 숙련가에게 널리 알려져 있다.

활성 성분에 대한 조사는 특히 전체 RNA를 추출한 후에 정량적 RT-PCR을 수행하여 실시한다. 특히, 바람직한 프라이머 서열은 실시예 13에서 사용된 것이지만 이에 제한되지 않는다.

각 검정에서의 cDNA 양을 액틴 cDNA의 양에 대하여 플롯팅한다. 이후, 활성 성분의 존재 또는 부재의 효과를 비교한다. NRAGE 및/또는 LOX의 발현 및/또는 활성이 대조군에 대해 조정 (자극 또는 억제)된다면, 그 물질은 활성 성분의 자격을 가질 수 있다. 유리하게는, 활성 성분은 LOX 및/또는 NRAGE의 메신저 RNA의 발현을 50％ 이상 조정하거나 LOX 및/또는 NRAGE의 발현 및/또는 활성을 15％ 이상 조정하는 것을 가능하게 한다.

본 발명에 따른 화합물은 조성물의 형태, 특히 미용 조성물, 피부제약 조성물 또는 제약 조성물의 형태로 제조된다. 따라서, 이러한 조성물을 위한 부형제는 예를 들어 보존제, 연화제, 유화제, 계면활성제, 보습제, 증점제, 컨디셔너, 소광제, 안정화제, 항산화제, 텍스쳐링제(texturizing agent), 브라이트닝제(brightening agent), 필름 형성제, 가용화제, 안료, 착색제, 향료 및 선 필터(sun filter)로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 화합물을 함유한다. 이러한 부형제는 바람직하게는 아미노산 및 이들의 유도체, 폴리글리세롤, 에스테르, 셀룰로스 중합체 및 유도체, 라놀린 유도체, 인지질, 락토페린, 락토퍼옥시다제, 수크로스-기재의 안정화제, 비타민 E 및 그의 유도체, 천연 및 합성 왁스, 식물성유, 트리글리세리드, 비-비누화 물질, 피토스테롤, 식물 에스테르, 실리콘 및 이들의 유도체, 단백질 가수분해물, 호호바유 및 그의 유도체, 지용성/수용성 에스테르, 베타인, 아민 옥시드, 식물 추출물, 수크로스 에스테르, 이산화티탄, 글리신 및 파라벤으로 구성된 군에서 선택되고, 특히 바람직하게는 부틸렌 글리콜, 스테아레트-2, 스테아레트-21, 글리콜-15 스테아릴 에테르, 세테아릴 알콜, 페녹시에탄올, 메틸파라벤, 에틸파라벤, 프로필파라벤, 부틸파라벤, 부틸렌 글리콜, 천연 토코페롤, 글리세롤, 나트륨 디히드록시세틸 포스페이트, 이소프로필 히드록시세틸 에테르, 글리콜 스테아레이트, 트리이소노나노인, 옥틸 코코에이트, 폴리아크릴아미드, 이소파라핀, 라우레트-7, 카르보머(Carbomer), 프로필렌 글리콜, 글리세롤, 비사볼올, 디메티콘, 수산화나트륨, PEG-30 디폴리히드록시스테아레이트, 카프르산/카프릴산 트리글리세리드, 세테아릴 옥타노에이트, 디부틸 아디페이트, 포도씨유, 호호바유, 황산마그네슘, EDTA, 시클로메티콘, 크산탄 검, 시트르산, 나트륨 라우릴술페이트, 광물성 왁스(mineral wax) 및 광유, 이소스테아릴 이소스테아레이트, 프로필렌 글리콜 디페라르고네이트, 프로필렌 글리콜 이소스테아레이트, PEG-8 밀랍, 수소화 팜 커넬 글리세리드, 수소화 팜 글리세리드, 라놀린유, 호마유, 세틸 락테이트, 라놀린 알콜, 피마자유, 이산화티탄, 락토스, 수크로스, 저밀도 폴리에틸렌 및 등장성 염수 용액으로 구성된 군에서 선택된다.

유리하게는, 상기 언급한 조성물을 수성 또는 유성 용액제, 크림제 또는 수성 또는 유성 겔제, 특히 포트 또는 튜브 중의 것, 특히 샤워젤 또는 샴푸; 밀크; 에멀젼제, 마이크로에멀젼제 또는 나노에멀젼제, 특히 수중유, 유중수, 다중 또는 실리콘 에멀젼제; 로션제, 특히 유리병이나 플라스틱병 또는 투여병 중의 것, 또는 에어로졸 형태; 앰플제; 시럽제; 액체 비누; 저알러지성 클린징 바; 연고제; 발포제; 주사가능한 용액제; 무수, 바람직하게는 액체형, 페이스트형 또는 고체형 제품, 예를 들어 스틱 형태, 특히 립스틱 형태; 산제 및 정제로 구성된 군에서 선택된 형태로 제제화한다.

도 1은 NRAGE 단백질의 서열 및 다이아그램을 보여준다.

도 2는 2-하이브리드 상호작용에 관하여 실시예 2에서 얻은 결과의 평균을 보여준다.

도 3은 재구성된 피부 중 LOX 및 NRAGE의 존재를 확인한 것을 보여준다.

도 4는 공초점 현미경으로 인간 피부 절편에서의 LOX 및 NRAGE의 위치를 보여준다.

도 5는 91세 공여자의 인간 피부 절편에서 LOX 및 NRAGE를 검출한 것을 보여준다.

도 6은 이식편-대-숙주 반응을 앓고 있는 사람의 피부 중에서 LOX 및 NRAGE를 검출한 것을 보여준다.

도 7은 기저세포형 또는 유극세포형의 암 환자의 피부에서 LOX 및 NRAGE를 검출한 것을 보여준다.

도 8은 편평 태선을 앓고 있는 환자의 피부 중에서 LOX 및 NRAGE를 검출한 것을 보여준다.

도 9는 건선을 앓고 있는 환자의 피부 중에서 LOX 및 NRAGE의 위치를 확인한 것을 보여준다.

도 10은 습진을 앓고 있는 환자의 피부 중에서 LOX 및 NRAGE의 위치를 확인한 것을 보여준다.

도 11은 재구성된 피부를 에반스 블루(Evans blue)로 전반적으로 표지한 것을 보여준다 (표피층은 적색, 세포는 청색, 피부 기질의 섬유는 적색, 피부-표피 연결부는 점선).

도 12는 재구성된 피부에서 세포각질(cytokeratin) 10의 면역조직화학적 검출을 보여준다 (세포는 적색 표지를 강력하게 발현함, 핵은 청색, 피부-표피 연결부는 점선).

도 13은 재구성된 피부에서 트랜스글루타미나제의 면역조직화학적 검출을 보여준다 (세포는 적색 표지를 강력하게 발현함, 핵은 청색, 피부-표피 연결부는 점선).

본 발명의 다른 목적, 특징 및 이점은 단지 예시하기 위한 것이지 본 발명의 범위를 어떠한 방식으로도 제한하지 않는 실시예를 언급하며 설명하는 기재로부터 당업자에게 매우 명백해질 것이다.

하기 실시예는 본 발명의 필수 부분을 구성하며, 선행기술의 실시예를 비롯한 그의 전문 기재를 기초로 할 때 임의의 선행 기술에 비해 신규하다고 여겨지는 임의의 특징은 그의 작용 및 일반적인 이용가능성 면에서 본 발명의 필수 부분을 구성한다.

따라서, 각 실시예는 일반적인 범위를 갖는다.

추가로, 달리 언급하지 않는다면, 실시예에서의 모든 백분율(％)은 질량에 대한 것이고, 온도는 섭씨 온도(℃)로 나타내었으며, 압력은 대기압이다.

실시예 1: 효모 2- 하이브리드 기술에 의한 NRAGE 의 클로닝

본 발명은 우선 각질세포에서 LOX의 잠재적인 파트너에 대해 조사하였다. 효모 2-하이브리드 기술 (Y2H)을 이용하였다. Y2H 시스템은 "루어" 단백질과 잠재적인 "표적" 파트너 사이의 상호작용을 확인하고 특징규명하는 것을 가능하게 한다. 여기서의 루어는 Gal4 유전자의 DNA 결합 도메인 (BD)에 융합된 LOX의 성숙 영역이었다. 표적(들)은 Gal4 유전자의 활성화 도메인 (AD)에 융합된, 인간 각질세포의 상보적 DNA 라이브러리에 의해 코딩되는 유전자였다. 루어 (LOX) 도메인과 라이브러리 서열에 의해 코딩되는 도메인 사이의 상호작용은 Gal4 프로모터의 결합 및 활성화를 허용하고, 이것은 AH109 효모에 영양요구성을 부여하는 여러가지 유전자를 제어하여, 결핍 배지에서의 성장 및 갈락토시다제 활성의 활성화를 가능케 한다. 따라서, LOX에 대한 후보 파트너인 단백질을 코딩하는 유전자는 상호작용체들의 가능한 선별을 위한 상기 기술로 확인되었다: 세포내 단백질 흑색종 관련 항원 D1 (MAGE-D1) 또는 NRAGE (도 1).

루어 GAL4 BD - hLOXmat (인간 LOX 성숙)를 사용한 효모 2- 하이브리드 기술에 의한, 각질세포 라이브러리의 스크리닝

벡터 pGAD-10 중 정상적인 인간 피부 각질세포의 cDNA 라이브러리를 사용하였다. 본 스크리닝을 위해 선택된 루어는 신호 펩티드 또는 전-영역이 없는 LOX 효소의 인간 cDNA 영역에 의해 코딩되는 LOXmat이었다. 뉴클레오티드 서열을 벡터 pBD-Gal4 Cam에 있는 GAL4 전사 인자의 DNA 결합 도메인 (BD) 뒤쪽에 삽입하였다. 하기하는 프라이머를 사용하여, 삽입될 LOX 단편 +494 내지 +1254를 PCR (폴리머라제 연쇄 반응)로 증폭시키고 벡터 pGal4-BD에 있는 Gal4 결합 도메인 뒤에 삽입하였다.

(BamHI을 도입함)

(보존된 정지 코돈에 SalI을 도입함).

증폭된 단편을 우선 벡터 TOPO에 도입한 후에 pGal4-BD로 삽입하였다. BD-LOXmat 융합 단백질의 발현을 검증하기 위해서, AH109 효모를 루어 플라스미드 pBD-LOXmat로 형질전환시켰다.

형질전환된 효모를 스크리닝하였다: AH109 효모 중 6.88×10⁶ cfu (결핍 배지 중에서의 성장). 아데닌, 히스티딘, 트립토판 및 루이신 결핍 배지에서 성장하는 클론 80개 선별. 이 중 23개가 강력한 성장을 나타내어 이것들을 보관함.

실시예 2: 포유동물 2- 하이브리드 기술 ( M2H )에 의한, LOX 단백질과 NRAGE 단백질 사이의 상호작용의 검증

Hela 세포를 한편으로는 플라스미드 pAct 및 pAct-NRAGE로 형질감염시키고, 다른 한편으로는 리포펙트아민의 존재하에 pBind 및 pBind-LOXmat로 형질감염시켰다. 48시간 후에 루시퍼라제 활성을 시험하고, 결과를 루시퍼라제 활성:대조군 (빈(empty) pBind 벡터)의 비율로 나타내었다. 상기 실험은 3벌로 수행되었고, 수득된 결과의 평균을 도 2에 나타내었다.

효모 2-하이브리드 스크리닝을 위해 실시예 1에서 사용된 hLOX 서열을 포유동물 2-하이브리드 상호작용을 위해 pBind 벡터 (미국 매디슨 소재의 프로메 가(Promega))의 Gal4 결합 도메인 뒤쪽 영역에 삽입하였다.

NRAGE 프레이(prey)를 pAct 벡터 (프로메가) VP16 Gal4 활성화 도메인 뒤에 삽입하였다. 이것은 아미노산 152 (뉴클레오티드 458)에서 출발하였다.

실시예 3: 포유동물 세포 중 LOX 및 NRAGE 의 동시-면역침전

Cos7 세포 (포유동물 신장 상피 세포)를, LOX 유전자 (인간 완전, 인간 성숙 영역 및 뮤린(murine) 성숙 영역)를 위한 구축물 pcLOX32-V5His (LOX), pcLOX36-V5His 또는 pcLOX27-V5His 및 NRAGE 유전자를 위한 pNM3-HA (완전 NRAGE) 또는 pNM7-HA (IRD 영역)로 동시-형질감염시켰다. 형질감염은 직경 100 mm의 페트리 접시에서 리포펙트아민을 사용하여 수행되었다. 48시간 후에, 형질감염된 세포를 용해 완충제 500 ㎕ 중에 용해시켰다. 세포 용해물의 단백질을 항-V5 또는 항-HA와 함께 인큐베이션시켰고, 이때 항-V5 또는 항-HA 모노클로날 항체는 세포 용해물을 진탕시키면서 여기에 1/250의 비율로 1시간 30분에 걸쳐 4℃에서 첨가하였다.

이러한 방식으로 형성된 면역 복합체 (IC)는 단백질 G-세파로스를 사용하여 1시간에 걸쳐 4℃에서 진탕시키면서 침전시켰다. 용해 완충제 중에 10분간 3회 세척하고 SDS-PAGE 완충제 중에 용출시킨 후, 모든 IC로 10％ SDS-PAGE 겔에서의 전기영동을 실시한 후에 웨스턴 블럿팅을 실시하였다. IC를 PVDF (폴리비닐리덴 플루오라이드) 막으로 전달한 후에 발색시켰다:

- NRAGE의 경우, 1/1000으로 희석된 항-HA를 사용한 후에 1/20,000로 희석된 항-마우스-HRP (양고추냉이 퍼옥시다제)를 사용.

- LOX의 경우, 1/5000으로 희석된 항-V5-HRP를 사용.

최종 검출은 HRP의 화학발광으로 확인하였다.

수득된 결과는 완전한 형태의 NRAGE (NM3-HA)가 완전한 형태의 인간 LOX (LOX 32H), 성숙 인간 LOX (LOX 36H) 및 성숙 뮤린 LOX (LOX 27H)와 동시-면역침전된다는 것을 입증하였다. 추가로, IRD 영역에 상응하는 NRAGE (NM7-HA)는 이들 3종의 재조합 단백질과 동일한 방식으로 동시-면역침전되었는데, 이는 상기 영역이 상호작용에 관여함을 보여준다.

실시예 4: 면역조직화학에 의한, 재구성된 피부 모델 중 LOX 및 NRAGE 존재의 확인

확인은, 정상적인 인간 각질세포가 표면에 침착되어 있는 정상적인 인간 섬유아세포가 접종된 피부 기질 (콜라겐/글리코스아미노글리칸/키토산, MIMEDISC^®, 프랑스 소재의 엥겔하드 라이온(Engelhard Lyon))로부터 제조한 재구성된 피부 모델 (MIMESKIN^®, 프랑스 소재의 엥겔하드 라이온)에서 수행되었다.

45일 동안 배양한 후에 공기-액체 계면에서 노출시켜서 각질세포가 분화하게 하였고, 샘플은 보우인(Bouin's) 고정제 또는 포름알데히드 중에서 고정시킨 후에 파라핀에 포매시켰다.

하기하는 항체로 절편을 면역표지하였다.

- 문헌 [Sommer et al., Transient expression of lysyl oxidase by liver myofibroblasts in murine schistosomiasis, Laboratory Investigation, 69, 460-470, 1993]에 기재된 방법으로 수득하고 정제한 항-LOX 항체,

- 항-NRAGE 항체 (염소 폴리클로날 IgG),

- 토끼 항-염소 2차 항체.

면역 복합체는 디아미노벤지딘을 기질로 사용한 퍼옥시다제-접합된 항-토끼 IgG를 사용한 후에 헤마톡실린을 사용한 대조염색을 실시하여 검출하였다.

도 3은 재구성된 피부에서의 LOX 및 NRAGE의 면역조직화학적 검출을 보여준다.

피부-표피 연결부의 위치는 실선으로 표시하였고, 피부 기질의 위치는 화살표로 표시하였으며, 각질세포의 위치는 화살표 머리로 표시하였다.

LOX의 발현은 기저 세포층에서부터 위쪽으로 나타나 기저상부 세포층에서 지속적이고, 분화된 층에서는 점진적으로 사라진다. NRAGE의 발현에는 약간의 변동이 있는데, 그 자체는 비-증식성 기저상부 세포층에서부터 위쪽으로 나타나고, LOX가 더이상 발현되지 않는 과립층과 각질층에서 크게 증가된다.

따라서, 이들 단백질은 재구성된 피부의 MIMESKIN^® 모델 표피의 비-증식성 기저상부 세포층과 관련이 있다. 이러한 공존 위치(co-location)는 정상적인 인간 피부에서의 면역조직학 (IH)으로 확인하였다.

따라서, 본 발명자들은 LOX 단백질과 NRAGE 단백질이 표피에서 발현되며, 유극 세포층에 공존 위치 대역을 갖는다는 것을 입증하였다.

실시예 5: 공초점 현미경에 의한, 정상적인 인간 피부에서 LOX 및 NRAGE 의 공존 위치의 확인

절제 수술 (포피)로 얻은 정상적인 인간 피부 샘플의 동결된 절편을 준비하 였다. LOX 및 NRAGE의 발현 검출에는 실시예 4의 항-LOX 및 항-NRAGE 1차 항체를 사용하였다. 사용한 2차 항체는 다음과 같았다:

- 당나귀 항-토끼 IgG-F1TC, 녹색의 플루오레세인 표지,

- 당나귀 항-염소 IgG-R, 적색의 로다민 표지.

음성 대조군은 1차 항체 없이 준비하였다.

자이스(ZEISS) AXIOPLAN 2 LSM510 직립형 공초점 현미경을 사용하여 이중 표지를 관찰하였고, 자이스 LSM5 이미지 브라우저(Image Browser) 소프트웨어를 사용하여 화상을 획득하였다.

도 4는 정상적인 인간 피부 중의 LOX 및 NRAGE의 면역검출을 수행한 결과를 공초점 현미경을 통해 보여준다.

이러한 관찰 결과는, LOX 및 NRAGE의 발현의 거의 완벽한 근위와 더불어 정상적인 인간 피부 표피의 유극 세포층 중 LOX 및 NRAGE의 공존 위치를 추가로 예시하면서 실시예 4의 결과를 확인시켜준다. 따라서, 세포내 수준에서의 관찰 결과는 LOX 및 NRAGE가 세포 (아막성 말초 대역 중의 세포) 주변부에 존재하며, NRAGE는 세포질에도 존재함을 보여준다.

실시예 6: 상이한 연령의 사람들 피부 중 LOX 및 NRAGE 의 위치 확인

실시예 4에 기재한 프로토콜을 이용하여, 상이한 연령군 (20세 미만, 60세 초과) 중의 2명의 공여자에서 얻은 인간 피부 절편에 대한 면역조직학적 연구를 수행하였다.

도 5는 91세 공여자 피부에서 수행된 표지를 보여준다. 이러한 관찰 결과는 매우 얇고 (몇개의 세포층으로 줄어듦) 과각질화된 저증식성 표피를 보여준다.

본 발명자들은 LOX (사용된 기술로 검출가능함)가 전혀 없다는 것을 확인하였다. 다른 한편, NRAGE는 강력하게 발현되어 세포질에 위치하고, 발현 구배 없이 제1 기저상부 세포층에서부터 위쪽으로 나타난다.

실시예 7: 이식편 -대-숙주 반응 ( GVH )을 앓고 있는 사람의 피부 중 LOX 및 NRAGE 의 검출

실시예 4에 기재한 프로토콜을 이용하여, 이식편-대-숙주 반응 (GVH)을 앓고 있는 환자의 인간 피부 절편에 대한 면역조직학적 연구를 수행하였다. 본 연구에는 5명의 공여자를 포함시켰다.

도 6은 표피에서 LOX가 거의 모두 사라졌으며 (진피에서의 발현에는 변화 없음), 세포질에 위치한 NRAGE의 존재는 매우 현저하며 제1 기저상부 세포층에서부터 위쪽으로 나타난다는 것을 확인시켜 준다.

실시예 8: 기저세포형 또는 유극세포형의 암이 있는 사람의 피부 중 LOX 및 NRAGE의 검출

실시예 4에 기재한 프로토콜을 이용하여, 기저세포암 또는 유극세포암 환자의 피부 샘플에 대한 면역조직학적 연구를 수행하였다.

도 7은 연구된 암의 2가지 유형을 하기와 같이 보여준다:

- 종양 주변부 표피에서 LOX 및 NRAGE의 발현의 점진적 감소,

- 표피 침윤성 세포 중 LOX 및 NRAGE의 부재,

- 종양 주위 피부 간질 반응에서 LOX의 강력한 발현,

- 종양 주위 피부 간질 반응에서 NRAGE의 부재.

실시예 9: 편평 태선을 앓고 있는 환자의 피부 중 LOX 및 NRAGE 의 검출

실시예 4에 기재한 프로토콜을 이용하여, 편평 태선을 앓고 있는 3명의 환자의 피부 절편에 대한 면역조직학적 연구를 수행하였다.

도 8은 표피에서 LOX의 발현이 매우 크게 감소되거나 심지어는 전혀 없음을 보여준다. 이러한 파괴는 표피 중 NRAGE의 발현의 불균일성과 상관관계가 있다.

실시예 10: 건선을 앓고 있는 환자의 피부 중 LOX 및 NRAGE 의 위치 확인

실시예 4에 기재한 프로토콜을 이용하여, 건선을 앓고 있는 5명의 환자의 피부 절편에 대한 면역조직학적 연구를 수행하였다.

도 9는 관찰된 모든 절편을 대표하며, 표피 중 LOX의 매우 강력한 발현 및 NRAGE의 중간 수준의 존재를 보여주며, 해당 대역은 더 균일하거나 덜 균일한 표지를 가지며 발현 구배는 나타내지 않는다. 표준치에서 벗어난 발현 강도의 이러한 특징들은 해당 단백질의 위치에 영향을 주는 훨씬 더 영향력 있는 비정상과 관련이 있다. 따라서, 건선 피부에서 LOX는 표피의 하위부에서 필수적으로 발현되고, NRAGE는 오직 그의 상위부에서만 발현되기 때문에, 이들 단백질의 발현은 건강한 피부에서 정상적으로 관찰되는 중첩 대역이 없도록 변동된 것이다. 세포내 수준에서는 NRAGE가 세포질에서만 관찰되고 아막성 말초 대역에서는 관찰되지 않는다.

실시예 11: 습진을 앓고 있는 환자의 피부 중 LOX 및 NRAGE 의 위치 확인

실시예 4에 기재한 프로토콜을 이용하여, 습진을 앓고 있는 환자의 피부 절편에 대한 면역조직학적 연구를 수행하였다.

도 10은 표피 중 LOX의 매우 강력한 세포주위 발현을 보여준다. 다른 한편, NRAGE는 약하게 발현되며 오직 세포질에서만 관찰되는데, 이는 세포내 수준에서 공존 위치가 상실되었음을 반영한다.

실시예 12: 세포자멸 억제에서의 LOX 관여의 확인

본 연구는 전면성장에 이르른 분화된 인간 각질세포의 단일층 배양물에 대해 수행되었다. 세포자멸에 대한 LOX의 효과는, 정상적인 조건 또는 전-세포자멸 조건 (45℃±0.5℃의 온도에 1시간 30분 동안 노출시켜 야기한 열 충격)하에서 β-APN (0.02％ w/v (중량/부피))의 첨가를 통해 그의 활성을 억제하여 확인하였다.

세포자멸에 의한 세포 사멸이 검출되었고, 세포자멸을 수반하는 DNA 파괴의 표지를 기초로 하는 TUNEL (말단 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라제 매개 dUTP 닉(nick) 말단 표지) 기술을 이용하여 정량하였다.

첫번째 단계는 DNA의 유리 3'-OH 말단에서 플루오레세인-표지된 뉴클레오티드의 중합을 촉매하는 TdT (말단 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라제)를 사용하여 DNA를 표지하는 것이다. 두번째 단계는 기질을 알칼리성 포스파타제-접합된 항-플루오레세인 항체와 인큐베이션시킨 후에 상기 혼입된 플루오레세인을 상기 항체로 검출하는 것이다.

본 실험은, DNase 용액을 이용한 DNA 단편화로 수득된 양성 대조군 및 인산 염 완충제를 사용하여 수득된 음성 대조군으로 검증되었다.

얻어진 결과는 하기 표에 나타내었다:

	열 충격 없음 ( 표지된 세포의 비율(％))	열 충격 실시 ( 표지된 세포의 비율(％))
β- APN 없음	6％	39％
β- APN 존재	56％	81％

얻어진 결과는 다음을 입증한다:

- 열 충격 (45℃±0.5℃, 1시간 30분)은 현저한 세포내 세포자멸을 유도함.

- β-APN에 의해 LOX의 효소 활성이 억제되면 세포자멸이 실질적으로 증가함.

이러한 결과는 LOX 활성의 항-세포자멸 효과를 확인시켜 준다.

실시예 13: 활성을 시험할 활성 성분과 접촉시키거나 접촉시키지 않은 상태의, 칼슘 배지에서의 배양물 중 분화된 각질세포에 의한 LOX 및 NRAGE 메신저 RNA의 발현 분석 (예를 들어 정량적 RT - PCR , 활성 성분의 스크리닝에 의한 분석)

활성 성분을, 어린 대상체 (수집된 정상적인 인간 포피 표피 각질세포 - 클로네틱스(Clonetics))에서 얻은 정상적인 인간 포피의 각질세포에 대해 시험하였다.

각질세포는 예를 들어 항생제가 보충된 K-SFM (각질세포 혈청-무함유 배지) 중에서 37℃에서 5％ CO₂하에 3번째 계대까지 증폭시켰다.

세포를 96웰 플레이트에 예를 들어 1 cm² 당 40,000개 세포 비율로 접종하고, 약 80％ 전면성장시까지 배양하였다. 이어서, 세포를 칼슘과잉 배지 (1.7 mM CaCl₂, 37℃, 5％ CO₂) 중에서 배양하여 세포 분화를 유도하였다.

활성 성분 제조에 사용되는 출발 물질이 식물 (바람직하게는 뿌리, 줄기, 껍질, 꽃, 열매, 종자, 배아, 검, 삼출물, 잎, 또는 온전한 식물) 또는 단백질인 경우, 이것은 바람직하게는 5 kGy 용량의 조사, 예를 들어 베타 또는 감마 조사로 멸균될 수도 있고 멸균되지 않을 수도 있으며, 이후에는 필요에 따라 예를 들어 실온에서 분쇄하여 분말로 크기를 줄인다. 이후, 분말을 극성 용매, 예를 들어 물 또는 부틸렌 글리콜, 및/또는 극성 용매들의 혼합물, 유리하게는 물과 알콜, 글리콜 또는 폴리올 (예컨대 에탄올, 글리세롤, 부틸렌 글리콜 및 다른 글리콜, 크실리톨 등)의 다양한 비율의 혼합물, 바람직하게는 75/25 또는 50/50의 물/부틸렌 글리콜 혼합물 중에서, 또는 비극성 용매, 예를 들어 알칸, 또는 비극성 용매들의 혼합물, 또는 극성 용매와 비극성 용매의 혼합물 중에서 분말의 2 내지 5％ (중량/중량), 바람직하게는 5％의 비율로 분산시킨다. 2시간 이상 동안 교반, 예를 들어 자성 교반한 후에, 샘플을 경사분리 또는 원심분리로 청징화한 후에 바람직하게는 0.45 ㎛ 또는 0.22 ㎛ 필터에서 여과한다.

활성 성분 제조에 사용되는 출발 물질이 특징규명된 분자 (예컨대 합성 또는 반-합성으로 수득된 분자, 정제로 수득된 생물학적 분자)인 경우, 이것은 용매, 바람직하게는 물 또는 디메틸 술폭시드 중에 희석 (분자에 따라, 바람직하게는 10^-6 M 내지 10^-2 M, 특히 바람직하게는 10^-4 M, 또는 바람직하게는 1％ 중량/중량 내지 5％ 중량/중량의 농도)시킨다. 이어서, 수득된 용액을 바람직하게는 0.45 ㎛ 또는 0.22 ㎛ 필터에서 임의로 여과한다.

이후, 상기한 방법 중 하나로 수득된 활성 성분을 바람직하게는 0.01 ％ 부피/부피 (v/v) 내지 10％ (v/v), 유리하게는 0.1％ 내지 1％ (v/v), 예를 들어 1％ (v/v)의 최종 농도에서 시험한다.

세포 존재하의 인큐베이션은 24시간 동안 칼슘과잉 K-SFM 중에서 성장 인자 없이 수행되는 것이 유리하다. 세포를 인산염 완충제 (pH 7.4) 중에서 세정한 후에 -80℃에서 동결 건조시켰다.

전체 RNA 의 추출

SV 전체 RNA 단리 시스템(SV Total RNA Isolation System) (프랑스 메일란 소재의 프로메가)을 제조업체의 프로토콜에 따라 96웰 플레이트 조건으로 사용하여 전체 RNA를 추출하였다.

유전자 발현은 실시간 RT-PCR로 변형시켰고, 각 유전자의 발현을 액틴 (하우스킵핑(housekeeping) 유전자)에 대해 측정하고 미처치 음성 대조군의 비율(％)로 표현하였다.

정량적 실시간 RT - PCR (Q- RT - PCR )

5 ng/㎕의 전체 RNA 10 ㎕를 PCR 혼합물 (2× SYBR 그린 완충제 혼합물(SYBR Green Buffer Mix) 25 ㎕, 효소 혼합물 0.5 ㎕, 최종 농도 0.5 μM의 센스 프라이머 및 최종 농도 0.5 μM의 안티센스 프라이머, 및 RNase-무함유 및 DNase-무함유 물 qsp 40 ㎕로 구성됨) 40 ㎕에 첨가하였다.

RT-PCR은 50℃에서 30분간의 역전사, 95℃에서 15분간의 폴리머라제 활성화 및 PCR 주기의 실시 (95℃에서 15초, 60℃에서 30초, 72℃에서 30초)×50회 주기를 포함하는 여러가지 단계로 진행되었다.

용융 곡선의 생성:

90℃, 1분

30℃, 1분

50℃에서 95℃, 10초/℃ (용융 곡선)

자극률(％) 또는 억제율(％)은 미처치 대조군 (시험 물질의 부재)에 대한 값으로 표현하였다.

액틴 유전자: 60℃에서의 혼성화

LOX 유전자: 60℃에서의 혼성화

NRAGE 유전자: 60℃에서의 혼성화

인볼루크린(Involucrin) 유전자: 60℃에서의 혼성화

세포 집단이 존재하는 것을 고려하여, 모든 결과를 하우스킵핑 유전자로 사용한 "액틴" 신호와 비교하였다. 실험에 따라, C(T) (= 주기 역치)의 측정 역치는 0.05 내지 0.01 사이의 T 값에 대해 고정되었고, 이것은 하기 식에 따라 각 유전자에 대하여 계산된 임의의 측정 단위이다:

S_{유전자 ≪x≫} 10⁷×(½)^{C(T)유전자 ≪x≫}

C(T)_{유전자 ≪x≫}는 유전자 ≪x≫의 형광 역치가 0.01 내지 0.05에 도달하는데 필요한 주기의 수를 나타낸다.

하기 비율을 계산하여, 관심 유전자의 값을 "액틴" 신호와 비교하였다:

R = S_{유전자 ≪x≫}/S_액틴

이러한 비율을 처치된 샘플과 미처치 샘플 사이에서 비교하였고, ≪x≫는 액틴, LOX 또는 NRAGE 유전자이다.

활성 성분의 스크리닝

각 검정에서의 cDNA 양을 액틴 cDNA의 양과 비교한 후 음성 대조군 (활성 성분 없음)의 경우와 비교하였다. 결과는, 측정된 효과가 약 2배에 도달한 경우에 유의한 것으로 간주하였다. 120종의 시험한 활성 성분 중 3종이 시험한 농도 및 규정된 조건하에서 이러한 기준에 상응하였다. 이들 활성 성분을 하기 표에 기재하였다:

명칭	NRAGE 대조군에 대한 배수	LOX 대조군에 대한 배수
에페드라	2	2
대두	2.5	1
홉	1	2

에페드라 추출물은 특히 물 또는 물/부틸렌 글리콜 혼합물 (예컨대 75/25 또는 50/50)과 같은 극성 용매, 바람직하게는 물을 사용하여 온전한 식물을 추출하여 얻는 것이 바람직하다.

홉 추출물은 특히 물 또는 물/부틸렌 글리콜 혼합물 (75/25 또는 50/50)과 같은 극성 용매, 바람직하게는 물을 사용하여 콘(cone)을 추출하여 얻는 것이 바람직하다.

대두 추출물은 특히 물 또는 물/부틸렌 글리콜 혼합물 (75/25 또는 50/50)과 같은 극성 용매, 바람직하게는 물을 사용하여 종자를 추출하여 얻는 것이 바람직하다.

결론

고려한 조건하에서 120종의 활성 성분들 중,

- 1종의 활성 성분은 NRAGE 및 LOX를 코딩하는 유전자의 mRNA 합성 속도를 유의하게 활성화시킬 수 있었고,

- 1종의 활성 성분은 LOX를 코딩하는 유전자에는 영향을 미치지 않으면서 NRAGE를 코딩하는 유전자의 mRNA 합성 속도를 유의하게 활성화시킬 수 있었으며,

- 1종의 활성 성분은 NRAGE를 코딩하는 유전자에는 영향을 미치지 않으면서 LOX를 코딩하는 유전자의 mRNA 합성 속도를 유의하게 활성화시킬 수 있었다.

본 연구는, 적어도 각질세포에서는 증식, 분화 및 세포자멸 사이의 균형을 유지할 수 있는 활성 성분의 선별을 가능하게 한다

에페드라 추출물은 예를 들어 암, 바람직하게는 피부 상피 암 (기저세포 또는 유극세포), 또는 편평 태선 등의 질환의 치료, 또는 임의로는 GVH의 특정 피부 증세의 치료, 또는 그밖에 피부에 대한 노화의 영향을 감소시키는데 사용될 수 있다.

대두 추출물은 예를 들어 피부 상피 암 (기저세포 또는 유극세포)과 같은 암, GVH 또는 편평 태선 등의 질환의 치료, 또는 노화를 방지하거나 예방하는데 사용될 수 있다. 대두 추출물은 특히 세포 과증식을 방지하는데 사용될 수 있다.

홉 추출물은 예를 들어 피부 상피 암 (기저세포 또는 유극세포)과 같은 암, 습진 또는 건선 등의 질환의 치료에 사용될 수 있다. 홉 추출물은 특히 세포 저증식을 방지하는데 사용될 수 있다.

대두 추출물 및 홉 추출물은 예를 들어 피부 상피 암 (기저세포 또는 유극세포)과 같은 암 또는 편평 태선 등의 질환의 치료와 관련하여 사용될 수 있다.

대두 추출물 및 에페드라 추출물은 예를 들어 피부 상피 암 (기저세포 또는 유극세포)과 같은 암 또는 편평 태선 등의 질환의 치료와 관련하여 사용될 수 있다.

홉 추출물 및 에페드라 추출물은 예를 들어 피부 상피 암 (기저세포 또는 유극세포)과 같은 암 또는 편평 태선 등의 질환의 치료와 관련하여 사용될 수 있다.

실시예 14: 칼슘 분화 동안 각질세포 중 NRAGE 및 LOX 메신저 RNA 의 발현 역학에 대한 정량적 RT - PCR 분석, 및 발현 역학에 활성 성분이 미치는 영향

80％ 전면성장 세포를 얻기 위해 사용된 실험 조건은 실시예 13에서 기재한 것과 동일하였다. 분화는 칼슘 (1.7 mM CaCl₂) 및 활성 성분의 존재하에 수행되었다. 분석은 2일, 3일 및 4일간의 인큐베이션 후에 Q-RT-PCR (실시예 13에서 기재한 방법)로 수행하였다.

9종의 상이한 물질들을 이러한 방식으로 시험하였다. 이들 중 하나인 계피 추출물은 고려한 실험 조건하에서 LOX 및 NRAGE의 억제를 제공하였다.

명칭	NRAGE 대조군에 대한 배수	LOX 대조군에 대한 배수
계피 2 D 3 D 4 D	0.9 0.7 0.2	0.5 0.7 0.5

(D = 일수)

계피 추출물은 특히 물 또는 물/부틸렌 글리콜 혼합물 (75/25 또는 50/50)과 같은 극성 용매, 바람직하게는 물을 사용하여 껍질을 추출하여 얻는 것이 바람직하다.

결론

계피 추출물은 예를 들어 건선과 같은 질환의 치료에 사용될 수 있다.

계피 추출물 및 대두 추출물 (이것들의 효과는 앞의 실시예에서 검출하였음)은 예를 들어 GVH의 특정 피부 증세, 습진 또는 건선과 같은 질환의 치료, 또는 그밖에 피부에 대한 노화의 영향을 감소시키는 것과 관련하여 사용될 수 있다.

실시예 15: 활성을 시험할 활성 성분과 접촉하거나 접촉하지 않은 상태의, 칼슘 분화 부재시 배양된 각질세포에 의한 LOX 메신저 RNA 의 발현 분석 (예를 들어 정량적 RT - PCR , 활성 성분의 스크리닝에 의한 분석)

절제 수술 후에 수거한 인간 생검의 효소적 추출로 얻은 어린 대상체의 정상적인 인간 각질세포를 항생제가 보충된 K-SFM (보충물을 함유하는 각질세포 혈청-무함유 배지) 규정 배지 중에서 37℃에서 5％ CO₂하에 단일층으로 배양하고 이에 대하여 활성을 시험하였다.

상기 세포를 제2 계대일 때 24웰 플레이트에 예를 들어 1 cm²당 30,000개 세포의 양으로 접종하고, 약 95％ 전면성장시까지 성장시켰다. 세포 카펫을 바람직하게는 칼슘 및 마그네슘을 함유하는 pH 7.4의 인산염 완충제로 세정한 후에 보충물은 없으나 항생제는 함유하도록 제조한 K-SFM 배지 중에 희석한 시험할 활성 성분 또는 기준 양성 대조군과 접촉시켰다.

여러가지 기원 (예를 들어, 식물성, 생물공학적 기원 또는 합성 분자)의 활성 성분을 0.1 ％ 부피/부피 (v/v) 내지 1％ (v/v)에서 시험하였다. 식물성 기원의 활성 성분은 예를 들어 1％ (v/v)에서 시험하였고, 합성 분자는 예를 들어 0.1％ (v/v)에서 시험하였다.

특히, 식물성 기원의 활성 성분은, 식물 (바람직하게는 뿌리, 뿌리줄기, 줄기, 껍질, 꽃, 열매, 종자, 배아 또는 잎)을 용매 또는 용매들의 혼합물, 유리하게는 100:0 내지 0:100 물/(알콜, 글리콜 또는 폴리올) (예컨대 에탄올, 글리세롤, 부틸렌 글리콜 및 다른 글리콜, 크실리톨 등) 혼합물 중에 2％ 내지 5％ (w/w)로 침연시켜서 수득된 추출물이다. 이어서, 수득된 추출물을 여과 또는 증류시켜서 가용성 분획을 회수하고, 이것을 바람직하게는 0.45 ㎛에서 여과한다. 생물공학적 가수분해물은 미생물, 유리하게는 락토바실러스(Lactobacillus) 또는 사카로마이세스(Saccharomyces) 과의 존재하에 식물성 추출물을 발효시켜 수득한다. 이어서, 이러한 가수분해물을 바람직하게는 0.45 ㎛에서 여과한다.

인큐베이션은 24시간 동안 37℃에서 5％ CO₂하에 성장 인자는 함유하지 않지만 항생제는 함유하는 K-SFM 배지 중에서 수행하는 것이 유리하다. 음성 대조군은 배양 배지 그 자체이거나, 또는 시험된 추출물의 추출 방법을 수행하는 동안 사용한 용매를 0.1％ (v/v) 내지 1％ (v/v)로 함유하는 배양 배지이다. 세포 분화 유도에 사용된 기준 양성 대조군은 염화칼슘 용액 (CaCl₂ - 최종 농도 1.7 mM)이다.

미처치 세포 (NT 대조군)은 pH 7.4의 인산염 완충제로 세정한 후에 -80℃에서 동결 건조시켰다. 활성 성분 또는 대조군의 존재하에 24시간 동안 처치한 후, 세포를 pH 7.4의 인산염 완충제로 세정한 후에 -80℃에서 동결 건조시켰다.

전체 RNA 의 추출

SV 전체 RNA 단리 시스템 (프랑스 메일란 소재의 프로메가)을 제조업체의 프로토콜에 따라 24웰 플레이트 조건으로 사용하여 전체 RNA를 추출하였다.

유전자 발현은 실시간 RT-PCR로 변형시켰고, 각 유전자의 발현을 액틴 (하우스킵핑 유전자)에 대해 측정하고 미처치 음성 대조군의 비율(％)로 표현하였다.

정량적 실시간 RT - PCR (Q- RT - PCR )

5 ng/㎕의 전체 RNA 10 ㎕를 PCR 혼합물 (2× SYBR 그린 완충제 혼합물 25 ㎕, 효소 혼합물 0.5 ㎕, 최종 농도 0.5 μM의 센스 프라이머 및 최종 농도 0.5 μM의 안티센스 프라이머, 및 RNase-무함유 및 DNase-무함유 물 qsp 40 ㎕로 구성됨) 40 ㎕에 첨가하였다.

RT-PCR은 50℃에서 30분간의 역전사, 95℃에서 15분간의 폴리머라제 활성화 및 PCR 주기의 실시 (95℃에서 15초, 60℃에서 30초, 72℃에서 63초, 78℃에서 30초)×50회 주기를 포함하는 여러가지 단계로 수행되었다.

용융 곡선의 생성:

90℃, 1분

30℃, 1분

50℃에서 95℃, 10초/℃ (용융 곡선)

사용된 프라이머

액틴 유전자: 60℃에서의 혼성화

LOX 유전자: 60℃에서의 혼성화

S_{유전자 "} _LOX _" 10⁷×(½)^{C(T)유전자 "} ^LOX ^"

C(T)_{유전자 "} _LOX _"는 "LOX" 유전자의 형광 역치가 0.01 내지 0.05에 도달하는데 필요한 주기의 수를 의미한다.

R = S_{유전자 "} _LOX _"/S_액틴

이러한 비율을 처치된 샘플과 미처치 샘플 사이에서 비교하였다.

활성 성분의 스크리닝

각 시험에서의 cDNA 양을 액틴 cDNA의 양과 비교한 후 음성 대조군 (NT)의 경우와 비교하였다. 결과는, 측정된 효과가 약 2배 (자극) 또는 0.5배 (억제)만큼 조정된 경우에 유의한 것으로 간주하였다. 60종의 시험한 활성 성분 중 30종이 규정된 조건하에서 이러한 기준에 상응하였다. 이들 활성 성분을 하기 표에 기재하였다:

<표>

결론

고려한 조건하에서 60종의 활성 성분들 중,

- 3종의 활성 성분은 LOX 코딩 유전자의 mRNA 합성 속도를 유의하게 억제할 수 있었고,

- 28종의 활성 성분은 LOX 코딩 유전자의 mRNA 합성 속도를 유의하게 활성화할 수 있었다.

본 연구에 의해, 적어도 각질세포 수준에서 증식, 분화 및 세포자멸 사이의 평형을 조정할 수 있는 활성 성분을 선별하는 것이 가능하였다.

실시예 16: 조직학으로 활성을 시험할 활성 성분과 접촉하거나 접촉하지 않은 상태의, 재구성된 피부 모델에서 표피 분화/증식 항상성의 조절에 관여하는 단백질의 발현 분석 ( 에페드라 추출물의 예)

증식 또는 분화 표지의 입증은, 정상적인 인간 각질세포가 표면에 침착되어 있는 정상적인 인간 섬유아세포가 접종된 피부 기질 (콜라겐/글리코스아미노글리칸/키토산, MIMEDISC^®, 프랑스 소재의 엥겔하드 라이온)로부터 제조한 재구성된 피부 모델 (MIMESKIN^®, 프랑스 소재의 엥겔하드 라이온)에서 수행되었고, 이때 상기 세포는 절제 수술로 얻은 생검을 효소 처치하여 추출한 것이다.

재구성된 피부 모델은 특히 하기 프로토콜에 따라 수득하였다:

- 정상적인 인간 피부의 0.5 내지 1.10⁶개 섬유아세포를 콜라겐/글리코스아미노글리칸/키토산 기재의 매트릭스 기질에 접종한 후에 영양 배지, 예를 들어 10％ 송아지 혈청, 바람직하게는 최종 농도 1 mM의 아스코르브산, 바람직하게는 최종 농도 10 ng/mL의 EGF (표피 성장 인자), 바람직하게는 최종 농도 100 ㎍/mL의 노르모신(Normocin)이 보충된 DMEM-글루타맥스(Glutamax)에서 21일 동안 성장시켰다.

- 정상적인 인간 피부의 0.5 내지 1.10⁶개 섬유아세포를 상기와 동등한 피부에 접종한 후에 영양 배지, 예를 들어 송아지 혈청, 바람직하게는 최종 농도 1 mM의 아스코르브산, 바람직하게는 최종 농도 10 ng/mL의 EGF (표피 성장 인자), 바람직하게는 최종 농도 0.4 ㎍/mL의 하이드로코르티손, 바람직하게는 최종 농도 0.12 IU/mL의 우물린, 바람직하게는 최종 농도 0.4 ㎍/mg의 이수프렐, 바람직하게는 최종 농도 2.10^-9 M의 트리요오도티로닌, 바람직하게는 최종 농도 24.3 ㎍/mL의 아데닌, 바람직하게는 최종 농도 100 ㎍/mL의 노르모신이 보충된 DMEM-글루타맥스/Ham F-12 (3:1 v/v의 비율)에서 성장시켰다. 침지시킨 상태로 7일 동안 계속 배양한다. 이어서, 상기 배양물을 송아지 혈청, 하이드로코르티손, 이수프렐, 트리요오도티로닌 및 우물린을 제외하고는 침지 배양과 동일한 배지에서 공기-액체 계면에서 14일 더 두었다.

활성 성분 (에페드라 추출물)은 상기한 배양 배지 중에 0.5％ 및 1％로 희석하고, 섬유아세포 및 각질세포 각각의 접종 후 3일 동안 사용하는 것이 유리하다 (즉, 제3일 내지 제21일 및 제24일 내지 제42일). 양성 대조군은 재구성된 피부가 나타난 시기(emerged phase) (즉, 제28일 내지 제42일) 동안에 염화칼슘을 최종 농도 1.5 mM로 첨가하여 표피 분화가 자극되도록 하는 것이 바람직하다.

배양 종료시, 샘플을 냉동시켜 감열성 수지에 넣은 후에 5 ㎛로 저온 절단(cryo-cut)하였다.

절단물에 대한 표지는 하기하는 시약을 사용하여 수행하였다:

- 인간 1차 항-트랜스글루타미나제 항체

- 인간 1차 항-세포각질 10 항체

- 알렉사-플루오르(alexa-fluor) 커플링된 2차 항체

- 에반스 블루

- 대피(Dapi).

면역표지의 가시화는 광자 현미경 (Axioskop2plus - 독일 자이스)으로 수행하였고, 트랜스글루타미나제 면역표지의 정량화는 화상 분석 (루시아(Lucia) - 프랑스 닐론(Nilon))으로 수행하였으며, 활성 성분 처치 효과를 평가하였다 (홀름-사이닥(Holm-Sidak) 통계 시험, p < 0.01).

<표>

이러한 결과는 활성 성분이 양성 대조군과 동일 유형의 표피 분화를 투여량-의존적 관계로 유도한다는 것을 보여준다. 사실상, 처치된 피부에는 트랜스글루타미나제를 발현하는 많은 수의 각질세포층이 특히 소위 과립층에 존재하였다. 추가로, 수득된 표지는 표피 부분의 확대도에서 예시되는 것과 같이 보다 강력하고 보다 한정적이었다. 정량화는 특히 1％ 농도의 활성 성분 처치 후에 단백질 형태가 유도되는 것을 명확하게 입증하였다 (2배 유도).

도 11은 재구성된 피부를 에반스 블루로 전반적으로 표지한 것을 보여준다 (표피층은 적색, 세포는 청색, 피부 기질의 섬유는 적색, 피부-표피 연결부는 점선).

이러한 결과는 활성 성분이 양성 대조군과 동일 유형의 표피 분화를 투여량-의존적 관계로 유도한다는 것을 보여준다. 사실상, 처치된 피부에는 많은 수의 각질세포층이 존재하였고, 특히 소위 과립층의 두께 증가가 두드러졌다. 추가로, 에페드라 추출물로 처치된 진피에서 섬유아세포 밀도에 미치는 흥미로운 영향도 알아냈다.

도 12는 재구성된 피부에서 세포각질 10의 면역조직화학적 검출을 보여준다 (세포는 적색 표지를 강력하게 발현함, 핵은 청색, 피부-표피 연결부는 점선).

이러한 결과는 활성 성분이 양성 대조군과 동일 유형의 표피 분화를 투여량-의존적 관계로 유도한다는 것을 보여준다. 사실상, 처치된 피부에는 세포각질 10을 발현하는 많은 수의 각질세포층이 특히 소위 과립층에 존재하였다.

실시예 17: 수중유 에멀젼 유형의 미용 제제 또는 제약 제제 중 본 발명의 생성물의 사용

제제 17a:

A 물 qsp 100

부틸렌 글리콜 2

글리세롤 3

나트륨 디히드록시세틸 포스페이트, 2

이소프로필 히드록시세틸 에테르

B 글리콜 스테아레이트 SE 14

트리이소노나노인 5

옥틸 코코에이트 6

C 부틸렌 글리콜, 메틸파라벤, 2

에틸파라벤, 프로필파라벤

(pH는 5.5로 조정함)

D 본 발명의 생성물 0.01％ 내지 10％

제제 17b:

A 물 qsp 100

부틸렌 글리콜 2

글리세롤 3

폴리아크릴아미드, 이소파라핀, 2.8

라우레트-7

B 부틸렌 글리콜, 메틸파라벤, 2

에틸파라벤, 프로필파라벤

페녹시에탄올, 메틸파라벤, 2

프로필파라벤, 부틸파라벤, 에틸파라벤

부틸렌 글리콜 0.5

D 본 발명의 생성물 0.01％ 내지 10％

제제 17c:

A 카르보머 0.50

프로필렌 글리콜 3

글리세롤 5

물 qsp 100

B 옥틸 코코에이트 5

비사볼올 0.30

디메티콘 0.30

C 수산화나트륨 1.60

D 페녹시에탄올, 메틸파라벤, 0.50

프로필파라벤, 부틸파라벤,

에틸파라벤

E 향료 0.30

F 본 발명의 생성물 0.01％ 내지 10％

본 발명의 실시예 18: 유중수 유형의 제제 중 본 발명의 생성물의 사용

A PEG-30 디폴리히드록시스테아레이트 3

카프르산 트리글리세리드 3

세테아릴 옥타노에이트 4

디부틸 아디페이트 3

포도씨유 1.5

호호바유 1.5

페녹시에탄올, 메틸파라벤, 0.5

프로필파라벤, 부틸파라벤,

에틸파라벤

B 글리세롤 3

부틸렌 글리콜 3

황산마그네슘 0.5

EDTA 0.05

물 qsp 100

C 시클로메티콘 1

디메티콘 1

D 향료 0.3

E 본 발명의 생성물 0.01％ 내지 10％

본 발명의 실시예 19: 샴푸 또는 샤워젤 유형의 제제 중 본 발명의 생성물의 사용

A 크산탄 검 0.8

물 qsp 100

B 부틸렌 글리콜, 메틸파라벤, 0.5

에틸파라벤, 프로필파라벤

페녹시에탄올, 메틸파라벤, 0.5

프로필파라벤, 부틸파라벤,

에틸파라벤

C 시트르산 0.8

D 나트륨 라우레트 술페이트 40.0

E 본 발명의 생성물 0.01％ 내지 10％

본 발명의 실시예 20: 립스틱 유형의 제제 및 다른 무수 제품 중 본 발명의 생성물의 사용

A 광물성 왁스 17.0

이소스테아릴 이소스테아레이트 31.5

프로필렌 글리콜 디페라르고네이트 2.6

프로필렌 글리콜 이소스테아레이트 1.7

PEG-8 밀랍 3.0

수소화 팜 커넬유, 글리세리드, 3.4

수소화 팜 글리세리드

라놀린유 3.4

호마유 1.7

세틸 락테이트 1.7

광유, 라놀린 알콜 3.0

B 피마자유 qsp 100

이산화티탄 3.9

CI 15850:1 0.616

CI 45410:1 0.256

CI 19140:1 0.048

CI 77491 2.048

C 본 발명의 생성물 0.01％ 내지 5％

본 발명의 실시예 21: 수성 겔 제제 (아이 컨투어 겔, 슬리밍 겔 등) 중 본 발명의 생성물의 사용

A 물 qsp 100

카르보머 0.5

부틸렌 글리콜 15

페녹시에탄올, 메틸파라벤, 0.5

프로필파라벤, 부틸파라벤,

에틸파라벤

B 본 발명의 생성물 0.01％ 내지 10％

본 발명의 실시예 22: 3중 에멀젼 유형의 제제 중 본 발명의 생성물의 사용

1차 에멀젼 W1 /O

A PEG-30 디폴리히드록시스테아레이트 4

카프르산 트리글리세리드 7.5

이소헥사데칸 15

PPG-15 스테아릴 에테르 7.5

B 물 65.3

C 페녹시에탄올, 메틸파라벤, 0.7

프로필파라벤, 부틸파라벤,

에틸파라벤

2차 에멀젼 W1 /O/ W2

A 1차 에멀젼 60

B 폴록사머(Poloxamer) 407 2

페녹시에탄올, 메틸파라벤, 0.3

프로필파라벤, 2-브로모-2-

니트로프로판-1,3-디올

물 qsp 100

C 카르보머 15

D 트리에탄올아민 pH 6.0 내지 6.5

본 발명의 실시예 23: 본 발명의 생성물을 함유하는 제약 제제의 제조

제제 23a: 정제의 제조

A 부형제 (정제 1개 당 그램수(g))

락토스 0.359

수크로스 0.240

B 본 발명의 생성물^* 0.001 내지 0.1

^*본 발명의 생성물은 예를 들어 실시예 13에 기재한 추출 공정 후에 건조 단계를 실시하여 수득하였음.

제제 23b: 연고제의 제조

A 부형제

저밀도 폴리에틸렌 5.5

유동 파라핀 qsp 100

B 본 발명의 생성물^* 0.001 내지 0.1

제제 23c: 주사가능한 제제의 제조

A 부형제

등장성 염수 용액 5 mL

B 본 발명의 생성물^* 0.001 내지 0.1 g

실시예 24: 본 발명의 생성물을 함유하는 제제의 미용학적 허용성에 대한 평가

실시예 2에 따라 수득된 화합물을 0.5％ 크산탄 겔 중에 10％ 농도로 혼입하고, 토끼에서의 안구 평가, 래트에서 단일 경구 투여에 의한 비정상적인 독성 여부의 연구, 및 기니아피그에서의 감작력(sensitizing power) 연구를 수행하여 이에 대한 독성학 시험을 실시하였다.

토끼에서 1차 피부 자극의 평가:

"급성 자극원/피부에 대한 부식 효과"의 연구와 관련한 OECD 지침이 권장하는 방법에 따라, 상기한 제제를 희석하지 않은 채로 0.5 mL의 투여량으로 3 마리 토끼 피부에 도포하였다.

상기 생성물을 1982년 2월 21일자 OJRF에 공개된 1982년 2월 1일자 규정으로 정해진 기준에 따라 분류하였다.

이러한 시험의 결과는 본 발명의 생성물이 피부에 대하여 비-자극원으로 분류된다는 결론을 제공하였다.

토끼에서 안구 자극의 평가:

"급성 자극원/피부에 대한 부식 효과"의 연구와 관련한 1987년 2월 24일자 OECD 지침 제405호가 권장하는 방법에 따라, 상기한 제제를 그대로 3 마리 토끼의 눈에 0.1 mL의 단일 투여로 떨어뜨렸다.

이러한 시험의 결과는 본 발명의 제제가 그대로 또는 희석되지 않은 채로 사용되는 경우에 지침 91/326 EEC에 비추어 눈에 대하여 비-자극원으로 간주될 수 있다는 결론을 제공하였다.

래트에서 단일 경구 투여에 의한 비정상적인 독성이 없는지 여부에 대한 연구:

1987년 2월 24일자 OECD 지침 제401호에 기초하고 미용 제품에 맞게 수정된 프로토콜에 따라, 상기한 제제를 5 마리 수컷 래트 및 5 마리 암컷 래트에게 체중 1 kg 당 5 g의 투여량으로 단일 경구 투여로 투여하였다.

LD₀ 및 LD₅₀은 5000 mg/kg을 넘는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 시험한 제제는 섭취하기에 위험한 제제로 분류되지 않았다.

기니아피그에서 피부 감작화 가능성의 평가

OECD 지침 제406호의 프로토콜에 따라, 상기한 제제를 사용하여 마그누쏜(Magnusson) 및 클리그만(Kligmann)이 저술한 최대화 시험을 실시하였다.

상기 제제는 피부와의 접촉에 있어서 비-감작화제로 분류되었다.

SEQUENCE LISTING <110> ENGELHARD LYON CENTRE NATIONAL de la RECHERCHE SCIENTIFIQUE UNIVERSITE CLAUDE BERNARD L'UNIVERSITE CLAUDE BERNARD LYON 1 <120> Substance pour restaurer une co-expression et une interaction normales entre les proteines LOX et NRAGE <130> ENGELHARD LYON cas 61 <160> 4 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 417 <212> PRT <213> human <400> 1 Met Arg Phe Ala Trp Thr Val Leu Leu Leu Gly Pro Leu Gln Leu Cys 1 5 10 15 Ala Leu Val His Cys Ala Pro Pro Ala Ala Gly Gln Gln Gin Pro Pro 20 25 30 Arg Glu Pro Pro Ala Ala Pro Gly Ala Trp Arg Gin Gin Ile Gin Trp 35 40 45 Glu Asn ASh Gly Gin Val Phe Ser Leu Leu Ser Leu Gly Ser Gin Tyr 50 55 60 Gln Pro Gin Arg Arg Arg Asp Pro Gly Ala Ala val Pro Gly Ala Ala 65 70 75 80 Asn Ala Ser Ala Gin Gin Pro Arg Thr Pro Ile Leu Leu Ile Arg Asp 85 90 95 ASh Arg Thr Ala Ala Ala Arg Thr Arg Thr Ala Gly Ser Ser Gly Val 100 105 110 Thr Ala Gly Arg Pro Arg Pro Thr Ala Arg His Trp Phe Gin Ala Gly 115 120 125 Tyr Ser Thr Ser Arg Ala Arg Glu Arg Gly Ala Ser Arg Ala Glu Asn 130 135 140 Gln Thr Ala Pro Gly Glu Val Pro Ala Leu Ser Asn Leu Arg Pro Pro 145 150 155 160 Ser Arg Val Asp Gly Met Val Gly Asp Asp Pro Tyr ASh Pro Tyr Lys 165 170 175 Tyr Ser Asp Asp ASh Pro Tyr Tyr ASh Tyr Tyr Asp Thr Tyr Glu Arg 180 185 190 Pro Arg Pro Gly Gly Arg Tyr Arg Pro Gly Tyr Gly Thr Gly Tyr Phe 195 200 205 Gin Tyr Gly Leu Pro Asp Leu Val Ala Asp Pro Tyr Tyr Ile Gin Ala 210 215 220 Ser Thr Tyr Val Gin Lys Met Ser Met Tyr Asn Leu Arg Cys Ala Ala 225 230 235 240 Glu Glu Asn Cys Leu Ala Ser Thr Ala Tyr Arg Ala Asp Val Arg Asp 245 250 255 Tyr Asp His Arg Val Leu Leu Arg Phe Pro Gin Arg Val Lys Asn Gin 260 265 270 Gly Thr Ser Asp Phe Leu Pro Ser Arg Pro Arg Tyr Ser Trp Glu Trp 275 280 285 His Ser Cys His Gin His Tyr His Ser Met Asp GIu Phe Ser His Tyr 290 295 300 Asp Leu Leu Asp Ala Asn Thr Gln Arg Arg val Ala Glu Gly His Lys 305 310 315 320 Ala Ser Phe Cys Leu Glu Asp Thr Ser Cys Asp Tyr Gly Tyr His Arg 325 330 335 Arg Phe Ala Cys Thr Ala His Thr Gln Gly Leu Ser Pro Gly Cys Tyr 340 345 350 Asp Thr Tyr Gly Ala Asp Ile Asp Cys Gin Trp Ile Asp Ile Thr Asp 355 360 365 Val Lys Pro Gly ASh Tyr Ile Leu Lys val Ser Val ASh Pro Ser Tyr 370 375 380 Leu Val Pro Glu Ser Asp Tyr Thr Asn ASh Val Val Arg Cys Asp Ile 385 390 395 400 Arg Tyr Thr Gly His His Ala Tyr Ala Set Gly Cys Thr Ile Ser Pro 405 410 415 Tyr <210> 2 <211> 778 <212> PRT <213> human <400> 2 Met Ala Gin Lys Met Asp Cys Gly Ala Gly Leu Leu Gly Phe Gin Ala 1 5 10 15 Glu Ala Ser Val 61u Asp Set Ala Leu Leu Met Gin Thr Leu Met Glu 20 25 30 Ala Ile Gin Ile Set Glu Ala Pro Pro Thr Asn Gln Ala Thr Ala Ala 35 40 45 Ala Ser Pro Gln Ser Ser Gin Pro Pro Thr Ala ASh Glu Met Ala Asp 50 55 60 Ile Gln Val Ser Ala Ala Ala Ala Arg Pro Lys Ser Ala Phe Lys Val 65 70 75 80 Gin Asn Ala Thr Thr Lys Gly Pro ASh Gly Val Tyr Asp Phe Ser Gin 85 90 95 Ala His Asn Ala Lys Asp Val Pro Asn Thr Gln Pro Lys Ala Ala Phe 100 105 110 Lys Ser Gln,Asn Ala Thr ser Lys Gly Pro Asn Ala Ala Tyr Asp Phe 115 120 125 Ser Gin Ala Ala Thr Thr Gly 61u Leu Ala Ala Asn Lys Ser Glu Met 130 135 140 Ala Phe Lys Ala Gin Asn Ala Thr Thr Lys Val Gly Pro Asn Ala Thr 145 150 155 160 Tyr Asn Phe Set Gin Ser Leu Asn Ala Asn Asp Leu Ala Asn Ser Arg 165 170 175 Pro Lys Thr Pro Phe Lys Ala Trp ASh Asp Thr Thr Lys Ala Pro Thr 180 185 190 Ala Asp Thr Gln Thr Gin Asn Val Asn Gin Ala Lys Met Ala Thr Ser 195 200 205 Gin Ala Asp Ile Glu Thr Asp Pro Gly Ile Ser Glu Pro Asp Gly Ala 210 215 220 Thr Ala Gin Thr Ser Ala Asp Gly Ser Gin Ala Gln Asn Leu Glu Ser 225 230 235 240 Arg Thr Ile Ile Arg Gly Lys Arg Thr Arg Lys Ile Asn Asn Leu Asn 245 250 255 Val Glu Glu Asn Ser Ser Gly Asp Gln Arg Arg Ala Pro Leu Ala Ala 260 265 270 Gly Thr Trp Arg Ser Ala Pro val Pro Val Thr Thr Gin ASh Pro Pro 275 280 285 Gly Ala Pro Pro Asn Val Leu Trp Gin Thr Pro Leu Ala Trp Gln ASh 290 295 300 Pro Ser Gly Trp Gin Asn Gin Thr Ala Arg Gin Thr Pro Pro Ala Arg 305 310 315 320 Gln Set Pro Pro Ala Arg Gin Thr Pro Pro Ala Trp Gin Asn Pro Val 325 330 335 Ala Trp Gin Asn Pro Val Ile Trp Pro ASh Pro Val Ile Trp Gln ASh 340 345 350 Pro Val Ile Trp Pro Asn Pro Ile val Trp Pro Gly Pro Val Val Trp 355 360 365 Pro ASh Pro Leu Ala Trp Gin Asn Pro Pro Gly Trp Gin Thr Pro Pro 370 375 380 Gly Trp Gin Thr Pro Pro Gly Trp Gin Gly Pro Pro Asp Trp Gin Gly 385 390 395 400 Pro Pro Asp Trp Pro Leu Pro Pro Asp Trp Pro Leu Pro Pro Asp Trp 405 410 415 Pro Leu Pro Thr Asp Trp Pro Leu Pro Pro Asp Trp Ile Pro Ala Asp 420 425 430 Trp Pro Ile Pro Pro Asp Trp Gin ASh Leu Arg Pro Ser Pro Asn Leu 435 440 445 Arg Pro Ser Pro Asn Ser Arg Ala Ser Gln Asn Pro Gly Ala Ala Gin 450 455 460 Pro Arg Asp Val Ala Leu Leu Gin Glu Arg Ala Asn Lys Leu Val Lys 465 470 475 480 Tyr Leu Met Leu Lys Asp Tyr Thr Lys Val Pro Ile Lys Arg Ser Glu 485 490 495 Met Leu Arg Asp Ile Ile Arg Glu Tyr Thr Asp Val Tyr Pro Glu Ile 500 505 510 Ile Glu Arg Ala Cys Phe Val Leu Glu Lys Lys Phe Gly Ile Gin Leu 515 520 525 Lys Glu Ile Asp Lys Glu Glu His Leu Tyr Ile Leu Ile Ser Thr Pro 530 535 540 Glu Ser Leu Ala Gly Ile Leu Gly Thr Thr Lys Asp Thr Pro Lys Leu 545 550 555 560 Gly Leu Leu Leu Val Ile Leu Gly Val Ile Phe Met Asn Gly Asn Arg 565 570 575 Ala Ser GIu Ala Val Leu Trp Glu Ala Leu Arg Lys Met Gly Leu Arg 580 585 590 Pro Gly Val Arg His Pro Leu Leu Gly Asp Leu Arg Lys Leu Leu Thr 595 600 605 Tyr Glu Phe Val Lys Gin Lys Tyr Leu Asp Tyr Arg Arg Val Pro Asn 610 615 620 Ser ASh Pro Pro Glu Tyr Glu Phe Leu Trp Gly Leu Arg Ser Tyr His 625 630 635 640 Glu Thr Ser Lys Met Lys val Leu Arg Phe Ile Ala Glu Val Gin Lys 645 650 655 Arg Asp Pro Arg Asp Trp Thr Ala Gln Phe Met Glu Ala Ala Asp Glu 660 665 670 Ala Leu Asp Ala Leu Asp Ala Ala Ala Ala Glu Ala Glu Ala Arg Ala 675 680 685 Glu Ala Arg Thr Arg Met 61y Ile Gly Asp Glu Ala Val Ser Gly Pro 690 695 700 Trp Ser Trp Asp Asp Ile Glu Phe Glu Leu Leu Thr Trp Asp Glu Glu 705 710 715 720 Gly Asp Phe Gly Asp Pro Trp Ser Arg Ile Pro Phe Thr Phe Trp Ala 725 730 735 Arg Tyr His Gin Asn Ala Arg Ser Arg Phe Pro Gln Thr Phe Ala Gly 740 745 750 Pro Ile Ile Gly Pro Gly Gly Thr Ala Ser Ala Asn Phe Ala Ala Asn 755 760 765 Phe Gly Ala Ile Gly Phe Phe Trp Val GIu 770 775 <210> 3 <211> 1254 <212> DNA <213> human <400> 3 atgcgcttcg cctggaccgt gctcctgctc gggcctttgc agctctgcgc gctagtgcac 60 tgcgcccctc ccgccgccgg ccaacagcag cccccgcgcg agccgccggc ggctccgggc 120 gcctggcgcc agcagatcca atgggagaac aacgggcagg tgttcagctt gctgagcctg 180 ggctcacagt accagcctca gcgccgccgg gacccgggcg ccgccgtccc tggtgcagcc 240 aacgcctccg cccagcagcc ccgcactccg atcctgctga tccgcgacaa ccgcaccgcc 300 gcggcgcgaa cgcggacggc cggctcatct ggagtcaccg ctggccgccc caggcccacc 360 gcccgtcact ggttccaagc tggctactcg acatctagag cccgcgaacg tggcgcctcg 420 cgcgcggaga accagacagc gccgggagaa gttcctgcgc tcagtaacct gcggccgccc 480 agccgcgtgg acggcatggt gggcgacgac ccttacaacc cctacaagta ctctgacgac 540 aacccttatt acaactacta cgatacttat gaaaggccca gacctggggg caggtaccgg 600 cccggatacg gcactggcta cttccagtac ggtctcccag acctggtggc cgacccctac 660 tacatccagg cgtccacgta cgtgcagaag atgtccatgt acaacctgag atgcgcggcg 720 gaggaaaact gtctggccag tacagcatac agggcagatg tcagagatta tgatcacagg 780 gtgctgctca gatttcccca aagagtgaaa aaccaaggga catcagattt cttacccagc 840 cgaccaagat attcctggga atggcacagt tgtcatcaac attaccacag tatggatgag 900 tttagccact atgacctgct tgatgccaac acccagagga gagtggctga aggccacaaa 960 gcaagtttct gtcttgaaga cacatcctgt gactatggct accacaggcg atttgcatgt 1020 actgcacaca cacagggatt gagtcctggc tgttatgata cctatggtgc agacatagac 1080 tgccagtgga ttgatattac agatgtaaaa cctggaaact atatcctaaa ggtcagtgta 1140 aaccccagct acctggttcc tgaatctgac tataccaaca atgttgtgcg ctgtgacatt 1200 cgctacacag gacatcatgc gtatgcctca ggctgcacaa tttcaccgta ttag 1254 <210> 4 <211> 2713 <212> DNA <213> human <400> 4 ggcacgagga gagtgcggct gctgagagcc gagcccagca atcccgatcc tctgagtcgt 60 gaagaaggga ggcagcgagg gggttggggt tggggcctga ggcaagcccc caggctccgc 120 tcttgccaga gggacaggag ccatggctca gaaaatggac tgtggtgcgg gcctcctcgg 180 cttccaggct gaggcctccg tagaagacag cgccttgctt atgcagacct tgatggaggc 240 catccagatc tcagaggctc cacctactaa ccaggccacc gcagctgcta gtccccagag 300 ttcacagccc ccaactgcca atgagatggc tgacattcag gtttcagcag ctgccgctag 360 gcctaagtca gcctttaaag tccagaatgc caccacaaaa ggcccaaatg gtgtctatga 420 tttctctcag gctcataatg ccaaggatgt gcccaacacg cagcccaagg cagcctttaa 480 gtcccaaaat gctacctcca aaggtccaaa tgctgcctat gatttttccc aggcagcaac 540 cactggtgag ttagctgcta acaagtctga gatggccttc aaggcccaga atgccactac 600 taaagtgggc ccaaatgcca cctacaattt ctctcagtct ctcaatgcca atgacctggc 660 caacagcagg cctaagaccc ctttcaaggc ttggaatgat accactaagg ccccaacagc 720 tgatacccag acccagaatg taaatcaggc caaaatggcc acttcccagg ctgacataga 780 gaccgaccca ggtatctctg aacctgacgg tgcaactgca cagacatcag cagatggttc 840 ccaggctcag aatctggagt cccggacaat aattcggggc aagaggaccc gcaagattaa 900 taacttgaat gttgaagaga acagcagtgg ggatcagagg cgggccccac tggctgcagg 960 gacctggagg tctgcaccag ttccagtgac cactcagaac ccacctggcg caccccccaa 1020 tgtgctctgg cagacgccat tggcttggca gaacccctca ggctggcaaa accagacagc 1080 caggcagacc ccaccagcac gtcagagccc tccagctagg cagaccccac cagcctggca 1140 gaacccagtc gcttggcaga acccagtgat ttggccaaac ccagtaatct ggcagaaccc 1200 agtgatctgg ccaaacccca ttgtctggcc cggccctgtt gtctggccga atccactggc 1260 ctggcagaat ccacctggat ggcagactcc acctggatgg cagaccccac cgggctggca 1320 gggtcctcca gactggcaag gtcctcctga ctggccgcta ccacccgact ggccactgcc 1380 acctgattgg ccacttccca ctgactggcc actaccacct gactggatcc ccgctgattg 1440 gccaattcca cctgactggc agaacctgcg cccctcgcct aacctgcgcc cttctcccaa 1500 ctcgcgtgcc tcacagaacc caggtgctgc acagccccga gatgtggccc ttcttcagga 1560 aagagcaaat aagttggtca agtacttgat gcttaaggac tacacaaagg tgcccatcaa 1620 gcgctcagaa atgctgagag atatcatccg tgaatacact gatgtttatc cagaaatcat 1680 tgaacgtgca tgctttgtcc tagagaagaa atttgggatt caactgaaag aaattgacaa 1740 agaagaacac ctgtatattc tcatcagtac ccccgagtcc ctggctggca tactgggaac 1800 gaccaaagac acacccaagc tcggtctcct cttggtgatt ctgggtgtca tcttcatgaa 1860 tggcaaccgt gccagtgagg ctgtcctctg ggaggcacta cgcaagatgg gactgcgtcc 1920 tggggtgaga catcccctcc ttggagatct aaggaaactt ctcacctatg agtttgtaaa 1980 gcagaaatac ctggactaca gacgagtgcc caacagcaac cccccggagt atgagttcct 2040 ctggggcctc cgttcctacc atgagactag caagatgaaa gtgctgagat tcattgcaga 2100 ggttcagaaa agagaccctc gtgactggac tgcacagttc atggaggctg cagatgaggc 2160 cttggatgct ctggatgctg ctgcagctga ggccgaagcc cgggctgaag caagaacccg 2220 catgggaatt ggagatgagg ctgtgtctgg gccctggagc tgggatgaca ttgagtttga 2280 gctgctgacc tgggatgagg aaggagattt tggagatccc tggtccagaa ttccatttac 2340 cttctgggcc agataccacc agaatgcccg ctccagattc cctcagacct ttgccggtcc 2400 cattattggt cctggtggta cagccagtgc caacttcgct gccaactttg gtgccattgg 2460 tttcttctgg gttgagtgag atgttggata ttgctatcaa tcgcagtagt ctttcccctg 2520 tgtgagctga agcctcagat tccttctaaa cacagctatc tagagagcca catcctgttg 2580 actgaaagtg gcatgcaaga taaatttatt tgctgttcct tgtctactgc tttttttccc 2640 cttgtgtgct gtcaagtttt ggtatcagaa ataaacattg aaattgcaaa gtgaaaaaaa 2700 aaaaaaaaaa aaa 2713

Claims

서열 1의 LOX의 발현 또는 서열 1의 LOX의 활성을 자극하는 1종 이상의 물질을 유효량으로 포함하며, 상기 물질은 카씨아 아마라(Cassia Amara) 추출물인, LOX 단백질과 NRAGE 단백질 사이의 상호작용을 증가시키기 위한 미용 조성물.
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제1항에 있어서, 열에 의해 손상된 세포, 조사(radiation)에 의해 손상된 세포, 독성제에 의해 손상된 세포, 및 피부 노화로 구성된 군에서 선택된 상태를 개선하기 위한 미용 조성물.
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제1항에 있어서, 피부 노화 동안 또는 스트레스에 의해 손상된 피부를 위해 표피의 세포자멸을 감소시키거나 표피의 세포 증식을 증가시키기 위한 미용 조성물.
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제1항에 있어서, 피부 노화 동안 또는 스트레스에 의해 손상된 피부를 위해 LOX의 발현을 자극하기 위한 미용 조성물.
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제1항에 있어서, 증식, 분화 및 세포자멸의 세포내 현상들 사이의 균형이 파괴된 경우 또는 LOX 단백질과 NRAGE 단백질 사이의 상호작용이 없거나 변경된 경우에 이러한 현상들 사이의 균형을 조절하기 위한 미용 조성물.
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제1항에 있어서, 표피에 적용되며, 표피 세포의 세포내 증식, 분화 및 세포자멸 사이의 균형을 조정하기 위한 미용 조성물.
제30항에 있어서, 표피 세포가 각질 세포인 미용 조성물.
제1항에 있어서, 유효량의 카씨아 아마라 추출물을 적어도 포함하는, 피부 노화를 개선하기 위한 미용 조성물.
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제32항에 있어서, 카씨아 아마라 추출물이 나무 전체의 추출물인 미용 조성물.
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제1항에 있어서, 서열 1의 LOX의 발현을 자극하는 유효량의 물질을 포함하고, 상기 물질은 카씨아 아마라 추출물인, 표피 저증식(hypoproliferation)을 개선하기 위한 미용 조성물.
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제1항에 있어서, 카씨아 아마라 추출물 및 1종 이상의 미용 또는 제약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는, 표피에서 LOX 단백질과 NRAGE 단백질 사이의 상호작용을 증가시키기 위한 미용 조성물.