KR20160073937A - 변형 인자 x 폴리펩티드 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

변형된 치료 단백질이 제공된다. 특히 변형 인자 X 폴리펩티드, 인자 X 지모겐, 인자 Xa 및 인자 X의 다른 형태 및 이들의 용도가 제공된다.

Description

변형 인자 X 폴리펩티드 및 이의 용도{Modified factor X polypeptides and uses thereof}
변형 치료 단백질이 제공된다. 특히 변형 인자 X 폴리펩티드, 상기 인자 X 지모겐, 인자 Xa 및 인자 X의 다른 형태, 및 이들의 용도가 제공된다.
지혈은 출혈을 정지시키는 복잡한 생리 과정이다. 혈소판, 혈장 단백질, 및 혈관 및 내피세포는 조직 상처에 즉시 뒤따르는 반응들에서 각각 중요한 역할을 하는 상기 과정의 세 가지 요소이고, 정상 환경 하에서는, 응괴(clot)의 신속한 형성을 야기한다. 이에 대한 핵심은 특정 혈장 단백질(또는 응고 인자)이 이전에 활성화된 다른 응고 인자들에 의하여 "캐스캐이드(cascade)"로 순차적으로 활성화되어 트롬빈을 신속하게 생성시키는 일련의 단백질 분해 사건인, 응고 캐스캐이드(cascade)이다. 이러한 캐스캐이드에서 생성된 다량의 트롬빈은 피브리노겐을 응괴 형성을 위해 요구되는 피브린 펩티드로 절단하는 기능을 수행한다. 인자 X (FX)는 출혈 질병을 치료하기 위한 치료제로 제안되어 왔고, 응고 과정에서 그의 중추적인 역할 때문에 다른 응고 인자 치료제 보다 유리하다. 현재 FX를 이용한 치료는 더 안전한 접근이라고 여겨지기 때문에, 비-활성화된 지모겐의 치료적 용도에 기반을 두고 있다. 개선된 또는 대안의 FX 치료제에 대한 요구(need)가 있다.
관련 출원
우선권의 이익은 2012년 7월 25일에 출원된 "변형된 인자 X 폴리펩티드 및 이의 용도"를 명칭으로 하는 미국 가출원번호 제61/741,806호에 대하여 주장된다.
본 출원은 미국 가출원번호 제61/741,806호를 우선권으로 주장하는 "변형된 인자 X 폴리펩티드 및 이의 용도"를 명칭으로 하는 동일자 출원된 미국특허출원 제13/815,768호에 관련된다.
상기 언급된 출원들 각각의 내용은 그 전체가 참조로써 본원에 포함된다.
전자적으로 제공된 서열목록의 참조 포함
서열목록의 전자 버전이 본원과 함께 제출되며, 그 내용은 전체가 참조로써 본원에 포함된다. 전자파일은 1.68 메가바이트 크기이며, 제목은 4941SEQPC1.txt이다.
요약
본 발명은 비변형 FX 폴리펩티드와 비교하여 증가된 보조인자(FVa) 의존성, 증가된 반감기, 저해제에 대한 증가된 저항성(예를 들어, 항트롬빈 Ⅲ) 및/또는 변경된 글리코실화와 같은 변경된 물성 또는 활성을 나타내는 변형 또는 변이체(variant) 인자 X (FX) 폴리펩티드를 제공된다. 본원에서 제공하는 변형 FX 폴리펩티드는 상기 물성 또는 활성의 전부 또는 일부를 나타낼 수 있다. 변형 FX 폴리펩티드는 성숙된 형태(mature), 지모겐, 이의 활성 또는 활성화된 또는 촉매적 활성형일 수 있다.
예를 들어, 본 발명은 변형 FX 폴리펩티드의 활성 FX (FXa)형이 변형 FX 폴리펩티드와 동일하지만 아미노산 치환(들)을 함유하지 않는 FXa 폴리펩티드와 비교하여 적어도 2배, 10배, 20배, 30배, 40배, 및 일반적으로 적어도 50배의 증가된 FVa 보조인자 의존성을 나타내도록 비변형 FX 폴리펩티드에서 아미노산 치환을 함유하는 변형 FX 폴리펩티드를 제공한다. 비변형 FX 폴리펩티드는 서열번호 134에 기재된 아미노산 서열을 가지거나, 또는 지모겐, 이의 활성형 또는 촉매적 활성형이거나, 또는 서열번호 134, 또는 지모겐, 이의 활성형 또는 촉매적 활성형에 대하여 적어도 75%의 서열 상동성을 가지는 아미노산 서열을 가진다.
하나의 예에서, 비변형 FX 폴리펩티드는 서열번호 134의 잔기 1-139에 기재된 아미노산 서열을 함유하는 경쇄 및 서열번호 134의 잔기 143-448에 기재된 아미노산 서열을 함유하는 중쇄를 가지는 지모겐 FX 폴리펩티드, 또는 서열번호 134의 잔기 1-139에 기재된 아미노산 서열을 함유하는 경쇄 및 서열번호 134의 잔기 143-448에 기재된 아미노산 서열을 함유하는 중쇄를 가지는 지모겐 FX 폴리펩티드에 대하여 적어도 75%의 서열 상동성을 나타내는 아미노산 서열일 수 있다. 다른 예에서, 비변형 FX 폴리펩티드는 서열번호 134의 잔기 1-139에 기재된 아미노산 서열을 함유하는 경쇄 및 서열번호 134의 잔기 195-448에 기재된 아미노산 서열을 함유하는 중쇄를 가지는 활성 FX (FXa) 폴리펩티드, 또는 서열번호 134의 잔기 1-139에 기재된 아미노산 서열을 함유하는 경쇄 및 서열번호 134의 잔기 195-448에 기재된 아미노산 서열을 함유하는 중쇄를 가지는 FXa에 대하여 적어도 75%의 서열 상동성을 나타내는 아미노산 서열이다. 추가 예에서, 비변형 FXa 폴리펩티드는 상술한 활성 FXa에 대하여 촉매적 활성이다. 임의의 비변형 FX 폴리펩티드는 서열번호 134, 지모겐 또는 이의 활성, 촉매적 활성형에 대하여 적어도 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 상동성을 가질 수 있다.
상기 및 본원에서 제공하는 변형 FX 폴리펩티드의 특정 예에서, 변형 FX 폴리펩티드의 성숙(mature) 또는 지모겐 형태는 다른 세린 프로테아제로부터의 비상동 활성화 펩티드를 함유하지 않는다. 다른 예에서, 본원의 변형 FX 폴리펩티드의 성숙 또는 지모겐 형태는 변형 활성화 펩티드를 함유하지 않는다. 본원의 추가 예에서, 변형 FX 폴리펩티드의 FXa형, 또는 이의 촉매적 활성 부분(portion)은 다른 세린 프로테아제로부터의 비상동 활성화 펩티드를 함유하는 지모겐 FX 폴리펩티드또는 변형 활성화 펩티드로부터 생산되지 않는다. 변형 FX 폴리펩티드는 단리되거나 실질적으로 정제되거나, 정제될 수 있다.
또한 본 발명은 비변형 FX 폴리펩티드에서 아미노산 치환을 함유하는 단리된 변형 활성 인자 X (FXa) 폴리펩티드를 제공하는데, 여기서 상기 변형 FX 폴리펩티드의 활성 FX (FXa)형은 변형 FX 폴리펩티드와 동일하지만 아미노산 치환(들)을 함유하지 않는 FXa 폴리펩티드와 비교하여 적어도 2배, 3배, 4배, 5배, 10배, 20배, 30배, 40배, 및 일반적으로 적어도 50배의 증가된 FVa 보조인자 의존성과 같은, 증가된 보조인자 의존성을 나타낸다. 변형 FXa는 일반적으로 활성화 펩티드를 함유하지 않는다. 비변형 FX 폴리펩티드는 서열번호 134의 잔기 1-139에 기재된 아미노산 서열을 가지는 경쇄 및 서열번호 134의 잔기 195-448에 기재된 아미노산 서열을 가지는 중쇄를 가지는 FXa에 대하여 적어도 75%의 서열 상동성을 나타내는 아미노산 서열을 함유하는 활성 FX (FXa) 폴리펩티드일 수 있고, 또는 이의 촉매적 활성형이다.
증가된 보조인자 의존성을 나타내는 본원에 제공되는 변형 FX 폴리펩티드 또는 단리된 변형 FX 폴리펩티드의 모든 예에서, 보조인자 의존성은 비변형 폴리펩티드와 비교하여 적어도 75배, 100배, 125배, 150배, 200배, 250배, 300배, 350배, 400배, 450배, 500배, 600배, 700배, 800배, 900배, 1000배, 2000배 또는 그 이상으로 증가될 수 있다.
서열번호 134에 기재된 아미노산 위치를 참고로 위치 196에서 천연 아미노산 잔기 또는 비변형 FX 폴리펩티드에서 아미노산 잔기 196에 상응하는 잔기가 중성의 극성 아미노산 잔기로 치환된 폴리펩티드들이 본원이 제공하는 상기 변형 FX 폴리펩티드 또는 단리된 변형 FX 폴리펩티드 중에 포함된다. 예를 들어, 중성의 극성 아미노산은 아스파라긴(N), 글루타민(Q), 세린(S), 트레오닌(T), 트립토판(W), 시스테인(C) 및 티로신(Y) 중에서 선택되고, 일반적으로 세린(S) 또는 트레오닌(T)이다. 상응하는 아미노산 잔기(즉, 서열번호 4에 기재된 것과 다른 FX 폴리펩티드에서 위치 196에 상응하는 아미노산 잔기)는 비변형 FX 폴리펩티드과 서열번호 134의 폴리펩티드의 정렬에 의해서 확인된다. 이는 도 3에서 예시된다. 예를 들어, 본 발명은 서열번호 134에 기재된 아미노산 위치를 참고로 위치 196에 상응하는 위치에 S로의 아미노산 치환 또는 위치 196에 상응하는 위치에 T로의 아미노산 치환, 또는 196에 상응하는 위치에 S 또는 T를 포함하지 않는 비변형 FX 폴리펩티드에서 상응하는 아미노산 잔기에 동일한 아미노산 치환을 함유하는 변형 FX 폴리펩티드를 제공한다. 특정 예에서, 변형 FX 폴리펩티드는 서열번호 134에 기재된 아미노산 위치를 참고로 위치 196에 상응하는 위치에 S로의 아미노산 치환, 또는 196에 상응하는 위치에 S를 포함하지 않는 비변형 FX 폴리펩티드에서 상응하는 아미노산 잔기에 동일한 치환을 함유한다.
전술된 또는 본원에서 제공하는 변형 FX 폴리펩티드 또는 단리된 FX 폴리펩티드의 임의의 예에서, 폴리펩티드는 경쇄 또는 중쇄의 프로테아제 도메인에 추가적인 아미노산 치환(들)을 함유할 수 있다. 다른 예에서, 위치 196에서의 전술한 아미노산 치환이 상기 폴리펩티드에서 유일한 변형이다. 그러므로, 본원이 제공하는 변형 FX 폴리펩티드 또는 단리된 변형 FX 폴리펩티드는 동일한 형태의 비변형 폴리펩티드, 예를 들어, 서열번호 134 또는 지모겐, 이의 활성, 촉매적 활성형에 기재된 아미노산 서열을 가지는 비변형 폴리펩티드와 비교하여 단지 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9. 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개의 아미노산 치환(들)을 함유할 수 있다.
본원의 임의의 예에서, 추가적인 아미노산 치환(들)은 서열번호 134에 기재된 아미노산 위치를 참고로 위치 195 또는 197에 상응하는 위치에 이소류신(I), 알라닌(A), 발라닌(V), 세린(S) 또는 트레오닌(T)으로의 치환, 또는 비변형 FX 폴리펩티드에서 상응하는 아미노산 잔기에 동일한 치환에 해당하지 않는다. 추가적인 아미노산 치환(들)은 변경된 글리코실화, 저해제에 대한 증가된 저항성 및/또는 증가된 촉매 활성을 야기하거나 부여할 수 있다. 예를 들어, 저해제에 대한 증가된 저항성은 항-트롬빈 Ⅲ (ATⅢ)에 대한 증가된 저항성일 수 있다.
본원의 특정 예에서, 상술한 또는 본원의 임의의 변형 FX 폴리펩티드 또는 단리된 변형 FX 폴리펩티드는 서열번호 134에 기재된 아미노산 위치를 참고로, 211, 214, 216, 218, 219, 273, 276, 306, 326, 332, 338, 420 및 424 중에서 선택되는 위치에 상응하는 아미노산 위치에 아미노산 치환(들)을 가지고, 여기서 상응하는 아미노산 위치는 비변형 FX 폴리펩티드와 서열번호 134에 기재된 폴리펩티드의 정렬에 의해서 확인된다. 예를 들어, 아미노산 치환(들)은 서열번호 134에 기재된 아미노산 위치를 참고로 위치 211에 상응하는 위치에서 S; 위치 214에 상응하는 위치에서 D; 위치 214에 상응하는 위치에서 A; 위치 214에 상응하는 위치에서 S; 위치 216에 상응하는 위치에서 R; 위치 216에 상응하는 위치에서 K; 위치 216에 상응하는 위치에서 A; 위치 216에 상응하는 위치에서 S; 위치 218에 상응하는 위치에서 R; 위치 218에 상응하는 위치에서 K; 위치 218에 상응하는 위치에서 A; 위치 219에 상응하는 위치에서 H; 위치 273에 상응하는 위치에서 A; 위치 273에 상응하는 위치에서 E; 위치 276에 상응하는 위치에서 A; 위치 276에 상응하는 위치에서 E; 위치 306에 상응하는 위치에서 E; 위치 326에 상응하는 위치에서 S; 위치 326에 상응하는 위치에서 T; 위치 326에 상응하는 위치에서 V; 위치 326에 상응하는 위치에서 Q; 위치 326에 상응하는 위치에서 N; 위치 326에 상응하는 위치에서 M; 위치 326에 상응하는 위치에서 K; 위치 326에 상응하는 위치에서 Y; 위치 326에 상응하는 위치에서 E; 위치 326에 상응하는 위치에서 D; 위치 332에 상응하는 위치에서 A; 위치 332에 상응하는 위치에서 D; 위치 332에 상응하는 위치에서 E; 위치 332에 상응하는 위치에서 S; 위치 332에 상응하는 위치에서 G; 위치 338에 상응하는 위치에서 A; 위치 338에 상응하는 위치에서 S; 위치 338에 상응하는 위치에서 N; 위치 338에 상응하는 위치에서 R; 위치 338에 상응하는 위치에서 V; 위치 338에 상응하는 위치에서 Y; 위치 338에 상응하는 위치에서 M; 위치 420에 상응하는 위치에서 A; 위치 420에 상응하는 위치에서 E; 위치 424에 상응하는 위치에서 A; 또는 위치 424에 상응하는 위치에서 E로의 아미노산 치환(들) 또는 비변형 FX 폴리펩티드에서 상응하는 아미노산 잔기에 동일한 치환(들)일 수 있다.
예를 들어, 서열번호 134에 기재된 아미노산 위치를 참고로, 위치 196에 상응하는 위치에 S, 및 위치 214에 상응하는 위치에 D; 위치 196에 상응하는 위치에 S, 및 위치 214에 상응하는 위치에 A; 위치 196에 상응하는 위치에 S, 및 위치 214에 상응하는 위치에 S; 위치 196에 상응하는 위치에 S, 및 위치 216에 상응하는 위치에 R; 위치 196에 상응하는 위치에 S, 및 위치 216에 상응하는 위치에 K; 위치 196에 상응하는 위치에 S, 및 위치 216에 상응하는 위치에 A; 위치 196에 상응하는 위치에 S, 및 위치 216에 상응하는 위치에 S; 위치 196에 상응하는 위치에 S, 및 위치 218에 상응하는 위치에 R; 위치 196에 상응하는 위치에 S, 및 위치 218에 상응하는 위치에 K; 위치 196에 상응하는 위치에 S, 및 위치 218에 상응하는 위치에 A; 위치 196에 상응하는 위치에 S, 및 위치 273에 상응하는 위치에 E; 위치 196에 상응하는 위치에 S, 및 위치 273에 상응하는 위치에 A; 위치 196에 상응하는 위치에 S, 및 위치 276에 상응하는 위치에 A; 위치 196에 상응하는 위치에 S, 및 위치 276에 상응하는 위치에 E; 위치 196에 상응하는 위치에 S, 및 위치 306에 상응하는 위치에 E; 위치 196에 상응하는 위치에 S, 및 위치 326에 상응하는 위치에 E; 위치 196에 상응하는 위치에 S, 및 위치 326에 상응하는 위치에 D; 위치 196에 상응하는 위치에 S, 및 위치 326에 상응하는 위치에 M; 위치 196에 상응하는 위치에 S, 및 위치 326에 상응하는 위치에 N; 위치 196에 상응하는 위치에 S, 및 위치 326에 상응하는 위치에 Q; 위치 196에 상응하는 위치에 S, 및 위치 332에 상응하는 위치에 A; 위치 196에 상응하는 위치에 S, 및 위치 332에 상응하는 위치에 D; 위치 196에 상응하는 위치에 S, 및 위치 332에 상응하는 위치에 E; 위치 196에 상응하는 위치에 S, 및 위치 332에 상응하는 위치에 S; 위치 196에 상응하는 위치에 S, 및 위치 332에 상응하는 위치에 G; 위치 196에 상응하는 위치에 S, 및 위치 338에 상응하는 위치에 A; 위치 196에 상응하는 위치에 S, 및 위치 338에 상응하는 위치에 S; 위치 196에 상응하는 위치에 S, 및 위치 420에 상응하는 위치에 A; 위치 196에 상응하는 위치에 S, 및 위치 420에 상응하는 위치에 E; 위치 196에 상응하는 위치에 S, 및 위치 424에 상응하는 위치에 A; 위치 196에 상응하는 위치에 S, 및 위치 424에 상응하는 위치에 E; 또는 위치 196에 상응하는 위치에 S, 위치 420에 상응하는 위치에 E 및 위치 424에 상응하는 위치에 E로의 아미노산 치환(들), 또는 비변형 FX 폴리펩티드에서 상응하는 아미노산 잔기에 동일한 아미노산 치환(들)을 함유하는 FX 폴리펩티드는 전술한 임의의 폴리펩티드를 포함하여, 본원에서 제공하는 변형 FX 폴리펩티드 또는 단리된 변형 FX 폴리펩티드 중 하나이다.
전술한 임의의 폴리펩티드를 포함하여, 본원에서 제공하는 임의의 변형 FX 폴리펩티드 또는 단리된 변형 FX 폴리펩티드에서, 변형 FX 폴리펩티드는 비-천연 글리코실화 부위의 도입에 의하여 글리코실화를 변경하는 아미노산 치환(들)을 함유할 수 있다. 예를 들어, 비-천연 글리코실화 부위는 서열번호 134에 기재된 아미노산 위치를 참고로, 위치 51에 상응하는 위치에 N; 위치 56에 상응하는 위치에 N 및 위치 58에 상응하는 위치에 S; 위치 62에 상응하는 위치에 N 및 위치 64에 상응하는 위치에 S; 위치 65에 상응하는 위치에 N 및 위치 67에 상응하는 위치에 S; 위치 67에 상응하는 위치에 N; 위치 73에 상응하는 위치에 N 및 위치 75에 상응하는 위치에 S; 위치 75에 상응하는 위치에 N 및 위치 77에 상응하는 위치에 S; 위치 77에 상응하는 위치에 N 및 위치 79에 상응하는 위치에 S; 위치 78에 상응하는 위치에 N 및 위치 80에 상응하는 위치에 S; 위치 82에 상응하는 위치에 S; 위치 83에 상응하는 위치에 N; 위치 82에 상응하는 위치에 N 및 위치 84에 상응하는 위치에 S; 위치 85에 상응하는 위치에 N 및 위치 87에 상응하는 위치에 S; 위치 86에 상응하는 위치에 N 및 위치 88에 상응하는 위치에 S; 위치 95에 상응하는 위치에 N 및 위치 97에 상응하는 위치에 S; 위치 114에 상응하는 위치에 N; 위치 119에 상응하는 위치에 N 및 위치 121에 상응하는 위치에 S; 위치 122에 상응하는 위치에 S; 위치 215에 상응하는 위치에 N 및 위치 217에 상응하는 위치에 S; 위치 243에 상응하는 위치에 N 및 위치 245에 상응하는 위치에 S; 위치 264에 상응하는 위치에 N 및 위치 266에 상응하는 위치에 S; 위치 293에 상응하는 위치에 N 및 위치 295에 상응하는 위치에 S; 위치 388에 상응하는 위치에 N; 위치 389에 상응하는 위치에 N 및 위치 391에 상응하는 위치에 S; 위치 428에 상응하는 위치에 N 및 위치 430에 상응하는 위치에 S; 또는 위치 429에 상응하는 위치에 N 및 위치 431에 상응하는 위치에 S로의 아미노산 치환(들), 또는 비변형 FX 폴리펩티드에서 상응하는 아미노산 잔기에 동일한 치환(들)에 의해 도입될 수 있다.
예를 들어, 서열번호 134에 기재된 아미노산 위치를 참고로, 위치 196에 상응하는 위치에 S 및 위치 51에 상응하는 위치에 N; 위치 196에 상응하는 위치에 S, 위치 56에 상응하는 위치에 N 및 위치 58에 상응하는 위치에 S; 위치 196에 상응하는 위치에 S, 위치 58에 상응하는 위치에 N 및 위치 60에 상응하는 위치에 S; 위치 196에 상응하는 위치에 S, 위치 62에 상응하는 위치에 N 및 위치 64에 상응하는 위치에 S; 위치 196에 상응하는 위치에 S, 위치 65에 상응하는 위치에 N 및 위치 67에 상응하는 위치에 S; 위치 196에 상응하는 위치에 S 및 위치 67에 상응하는 위치에 N; 위치 196에 상응하는 위치에 S, 위치 73에 상응하는 위치에 N 및 위치 75에 상응하는 위치에 S; 위치 196에 상응하는 위치에 S, 위치 75에 상응하는 위치에 N 및 위치 77에 상응하는 위치에 S; 위치 196에 상응하는 위치에 S, 위치 77에 상응하는 위치에 N 및 위치 79에 상응하는 위치에 S; 위치 196에 상응하는 위치에 S, 위치 78에 상응하는 위치에 N 및 위치 80에 상응하는 위치에 S; 위치 196에 상응하는 위치에 S 및 위치 82에 상응하는 위치에 S; 위치 196에 상응하는 위치에 S 및 위치 83에 상응하는 위치에 N; 위치 196에 상응하는 위치에 S, 위치 82에 상응하는 위치에 N 및 위치 84에 상응하는 위치에 S; 위치 196에 상응하는 위치에 S, 위치 85에 상응하는 위치에 N 및 위치 87에 상응하는 위치에 S; 위치 196에 상응하는 위치에 S, 위치 86에 상응하는 위치에 N 및 위치 88에 상응하는 위치에 S; 위치 196에 상응하는 위치에 S, 위치 95에 상응하는 위치에 N 및 위치 97에 상응하는 위치에 S; 위치 196에 상응하는 위치에 S 및 위치 114에 상응하는 위치에 N; 위치 196에 상응하는 위치에 S, 위치 114에 상응하는 위치에 N, 위치 211에 상응하는 위치에 S 및 위치 219에 상응하는 위치에 H; 위치 196에 상응하는 위치에 S, 위치 119에 상응하는 위치에 N 및 위치 121에 상응하는 위치에 S; 위치 196에 상응하는 위치에 S, 위치 114에 상응하는 위치에 N, 위치 119에 상응하는 위치에 N 및 위치 121에 상응하는 위치에 S; 위치 196에 상응하는 위치에 S, 위치 114에 상응하는 위치에 N, 위치 119에 상응하는 위치에 N, 위치 121에 상응하는 위치에 S, 위치 211에 상응하는 위치에 S 및 위치 219에 상응하는 위치에 H; 위치 196에 상응하는 위치에 S; 위치 119에 상응하는 위치에 N, 위치 121에 상응하는 위치에 S, 위치 211에 상응하는 위치에 S 및 위치 219에 상응하는 위치에 H; 위치 196에 상응하는 위치에 S 및 위치 122에 상응하는 위치에 S; 위치 196에 상응하는 위치에 S, 위치 215에 상응하는 위치에 N 및 위치 217에 상응하는 위치에 S; 위치 196에 상응하는 위치에 S, 위치 243에 상응하는 위치에 N 및 위치 245에 상응하는 위치에 S; 위치 196에 상응하는 위치에 S, 위치 264에 상응하는 위치에 N 및 위치 266에 상응하는 위치에 S; 위치 196에 상응하는 위치에 S, 위치 119에 상응하는 위치에 N, 위치 121에 상응하는 위치에 S, 위치 264에 상응하는 위치에 N 및 위치 266에 상응하는 위치에 S; 위치 196에 상응하는 위치에 S, 위치 211에 상응하는 위치에 S , 위치 219에 상응하는 위치에 H, 위치 264에 상응하는 위치에 N 및 위치 266에 상응하는 위치에 S; 위치 196에 상응하는 위치에 S, 위치 119에 상응하는 위치에 N, 위치 121에 상응하는 위치에 S, 위치 211에 상응하는 위치에 S, 위치 219에 상응하는 위치에 H, 위치 264에 상응하는 위치에 N 및 위치 266에 상응하는 위치에 S; 위치 196에 상응하는 위치에 S, 위치 114에 상응하는 위치에 N, 위치 264에 상응하는 위치에 N 및 위치 266에 상응하는 위치에 S; 위치 196에 상응하는 위치에 S, 위치 114에 상응하는 위치에 N, 위치 211에 상응하는 위치에 S, 위치 219에 상응하는 위치에 H, 위치 264에 상응하는 위치에 N 및 위치 266에 상응하는 위치에 S; 위치 196에 상응하는 위치에 S, 위치 264에 상응하는 위치에 N, 위치 266에 상응하는 위치에 S 및 위치 388에 상응하는 위치에 N; 위치 196에 상응하는 위치에 S, 위치 293에 상응하는 위치에 N 및 위치 295에 상응하는 위치에 S; 위치 196에 상응하는 위치에 S 및 위치 388에 상응하는 위치에 N; 위치 196에 상응하는 위치에 S, 위치 119에 상응하는 위치에 N, 위치 121에 상응하는 위치에 S 및 위치 388에 상응하는 위치에 N; 위치 196에 상응하는 위치에 S, 위치 114에 상응하는 위치에 N, 위치 211에 상응하는 위치에 S, 위치 219에 상응하는 위치에 H 및 위치 388에 상응하는 위치에 N; 위치 196에 상응하는 위치에 S, 위치 211에 상응하는 위치에 S, 위치 219에 상응하는 위치에 H, 위치 264에 상응하는 위치에 N, 위치 266에 상응하는 위치에 S 및 위치 388에 상응하는 위치에 N; 위치 196에 상응하는 위치에 S, 위치 119에 상응하는 위치에 N, 위치 121에 상응하는 위치에 S, 위치 211에 상응하는 위치에 S, 위치 219에 상응하는 위치에 H 및 위치 388에 상응하는 위치에 N; 위치 196에 상응하는 위치에 S, 위치 389에 상응하는 위치에 N 및 위치 391에 상응하는 위치에 S; 위치 196에 상응하는 위치에 S, 위치 428에 상응하는 위치에 N 및 위치 430에 상응하는 위치에 S; 또는 위치 196에 상응하는 위치에 S, 위치 429에 상응하는 위치에 N 및 위치 431에 상응하는 위치에 S로의 아미노산 치환(들), 또는 비변형 FX 폴리펩티드에서 상응하는 아미노산 잔기에 동일한 치환(들)을 함유하는 변형 FX 폴리펩티드는 전술한 임의의 폴리펩티드를 포함하여, 본원에서 제공하는 변형 FX 폴리펩티드 또는 단리된 변형 FX 폴리펩티드 중 하나이다.
하나의 예에서, 서열번호 137-157, 169, 205-208, 214-243 및 246-265 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열, 또는 서열번호 137-157, 169, 205-208, 214-243 및 246-265 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열 중 어느 하나에 대하여 적어도 75%의 서열 상동성을 나타내고 아미노산 치환(들)을 함유하는 아미노산 서열을 함유하는 변형 FX 폴리펩티드 또는 단리된 변형 FX 폴리펩티드가 본원에 제공된다. 다른 예에서, 서열번호 137-157, 169, 205-208, 214-243 및 246-265 중 어느 하나의 잔기 1-139에 기재된 아미노산 서열을 가지는 경쇄 및 잔기 143-448에 기재된 아미노산 서열을 가지는 중쇄를 함유하는 아미노산 서열, 또는 서열번호 137-157, 169, 205-208, 214-243 및 246-265 중 어느 하나의 잔기 1-139에 기재된 아미노산 서열을 가지는 경쇄 및 잔기 143-448에 기재된 아미노산 서열을 가지는 중쇄를 함유하는 아미노산 서열 중 어느 하나에 대하여 적어도 75%의 서열 상동성을 나타내고 아미노산 치환(들)을 함유하는 아미노산 서열을 함유하는 변형 FX 폴리펩티드 또는 단리된 변형 FX 폴리펩티드가 본원에 제공된다. 추가 예에서, 서열번호 137-157, 169, 205-208, 214-243 및 246-265 중 어느 하나의 잔기 1-139에 기재된 아미노산 서열을 가지는 경쇄 및 잔기 195-448에 기재된 아미노산 서열을 가지는 중쇄를 함유하는 아미노산 서열, 또는 서열번호 137-157, 169, 205-208, 214-243 및 246-265 중 어느 하나의 잔기 1-139에 기재된 아미노산 서열을 가지는 경쇄 및 잔기 195-448에 기재된 아미노산 서열을 가지는 중쇄를 함유하는 아미노산 서열 중 어느 하나에 대하여 적어도 75%의 서열 상동성을 나타내고 아미노산 치환(들)을 함유하는 아미노산 서열을 함유하는 변형 FX 폴리펩티드 또는 단리된 변형 FX 폴리펩티드가 본원에 제공된다. 추가 예에서, 변형(들)을 포함하고 촉매 활성을 나타내는 상기 형태들 중 어느 하나의 촉매적 활성형을 함유하는 변형 FX 폴리펩티드 또는 단리된 변형 FX 폴리펩티드가 본원에 제공된다.
서열번호 134에 기재된 아미노산 위치를 참고로 비변형 FX 폴리펩티드의 198, 202, 211, 214, 217, 219, 327 및/또는 338의 천연 아미노산 잔기 또는 198, 202, 211, 214, 217, 219, 327 및/또는 338의 아미노산 잔기에 상응하는 잔기에 아미노산 치환을 함유함으로써, 변형 FX 폴리펩티드가 FVa-의존적 촉매 활성을 나타내는 변형 인자 X (FX) 폴리펩티드가 본원에 제공된다. 이러한 예에서, 상응하는 아미노산 잔기는 비변형 FX 폴리펩티드와 서열번호 134의 폴리펩티드의 정렬에 의해서 확인되고, 예를 들어, 도 3에 예시되어 있다. 비변형 FX 폴리펩티드는 서열번호 134에 기재된 아미노산 서열을 갖거나, 또는 지모겐, 이의 활성형 또는 촉매적 활성형이거나, 또는 서열번호 134, 지모겐, 이의 활성형 또는 촉매적 활성형에 대하여 적어도 75%의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 가진다. 하나의 예에서, 비변형 FX 폴리펩티드는 서열번호 134의 잔기 1-139에 기재된 아미노산 서열을 함유하는 경쇄 및 서열번호 134의 잔기 143-448에 기재된 아미노산 서열을 함유하는 중쇄를 가지는 지모겐 FX 폴리펩티드, 또는 서열번호 134의 잔기 1-139에 기재된 아미노산 서열을 함유하는 경쇄 및 서열번호 134의 잔기 143-448에 기재된 아미노산 서열을 함유하는 중쇄를 가지는 지모겐 FX 폴리펩티드에 대하여 적어도 75%의 서열 상동성을 나타내는 아미노산 서열일 수 있다. 다른 예에서, 비변형 FX 폴리펩티드는 서열번호 134의 잔기 1-139에 기재된 아미노산 서열을 함유하는 경쇄 및 서열번호 134의 잔기 195-448에 기재된 아미노산 서열을 함유하는 중쇄를 가지는 활성 FX (FXa) 폴리펩티드, 또는 서열번호 134의 잔기 1-139에 기재된 아미노산 서열을 함유하는 경쇄 및 서열번호 134의 잔기 195-448에 기재된 아미노산 서열을 함유하는 중쇄를 가지는 FXa에 대하여 적어도 75%의 서열 상동성을 나타내는 아미노산 서열이다. 추가 예에서, 비변형 FXa 폴리펩티드는 전술한 활성 FXa의 촉매 활성형이다. 임의의 비변형 FX 폴리펩티드는 서열번호 134 또는 지모겐, 이의 활성형 또는 촉매 활성형에 대하여 적어도 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 상동성을 가질 수 있다. 이러한 변형 FX 폴리펩티드는 단리되거나 또는 실질적으로 정제될 수 있다.
예를 들어, 본원에서 제공하는 변형 FX 폴리펩티드는 서열번호 134에 기재된 아미노산 위치를 참고로, 위치 202에 상응하는 위치에 S; 위치 211에 상응하는 위치에 S; 위치 214에 상응하는 위치에 D; 위치 214에 상응하는 위치에 A; 위치 214에 상응하는 위치에 S; 위치 217에 상응하는 위치에 S; 위치 219에 상응하는 위치에 H; 위치 327에 상응하는 위치에 A; 위치 327에 상응하는 위치에 L; 위치 338에 상응하는 위치에 A; 위치 338에 상응하는 위치에 S; 위치 338에 상응하는 위치에 N; 위치 338에 상응하는 위치에 R; 위치 338에 상응하는 위치에 V; 위치 338에 상응하는 위치에 Y; 및 위치 338에 상응하는 위치에 M으로의 아미노산 치환(들), 또는 비변형 FX 폴리펩티드에서 상응하는 아미노산 잔기에 동일한 치환(들)을 함유한다.
본원에서 제공하는 변형 FX 폴리펩티드의 특정 예에서, 변형 FX 폴리펩티드는 서열번호 134에 기재된 아미노산 위치를 참고로, 위치 211에 상응하는 위치에 S 및 위치 219에 상응하는 위치에 H로의 아미노산 치환들 또는 비변형 FX 폴리펩티드에서 상응하는 아미노산 잔기에 동일한 치환들을 함유한다. 예를 들어, 본원에서 제공하는 변형 FX 폴리펩티드는 서열번호 134에 기재된 아미노산 위치를 참고로 위치 196에 상응하는 위치에 S, 위치 211에 상응하는 위치에 S 및 위치 219에 상응하는 위치에 H; 위치 197에 상응하는 위치에 A, 위치 214에 상응하는 위치에 S 및 위치 219에 상응하는 위치에 H; 또는 위치 195에 상응하는 위치에 L, 위치 211에 상응하는 위치에 S 및 위치 219에 상응하는 위치에 H로의 아미노산 치환(들) 또는 비변형 FX 폴리펩티드에서 상응하는 아미노산 잔기에 동일한 치환들을 함유하는 것들을 포함한다.
본원에서 제공하는 변형 FX 폴리펩티드의 다른 예에서, 변형 FX 폴리펩티드는 서열번호 134에 기재된 아미노산 위치를 참고로 각각 위치 327에 상응하는 위치에 A 및 위치 338에 상응하는 위치에 A로의 아미노산 치환(들); 또는 위치 327에 상응하는 위치에 L 및 위치 338에 상응하는 위치에 M으로의 아미노산 치환(들), 또는 비변형 FX 폴리펩티드에서 상응하는 아미노산 잔기에 동일한 치환들을 함유한다. 예를 들어, 서열번호 200에 상응하는 위치에 V, 위치 327에 상응하는 위치에 L 및 위치 338에 상응하는 위치에 M으로의 아미노산 치환(들); 또는 위치 200에 상응하는 위치에 V, 위치 327에 상응하는 위치에 L, 위치 334에 상응하는 위치에 A 및 위치 338에 상응하는 위치에 M으로의 아미노산 치환(들)을 함유하는 변형 FX 폴리펩티드가 본원에 제공된다.
비변형 FX 폴리펩티드에서 서열번호 134에 기재된 아미노산 위치를 참고로 각각, 위치 197에 상응하는 위치에 S; 위치 200에 상응하는 위치에 A; 위치 200에 상응하는 위치에 V; 위치 326에 상응하는 위치에 S; 위치 326에 상응하는 위치에 T; 위치 326에 상응하는 위치에 V; 위치 326에 상응하는 위치에 N; 위치 326에 상응하는 위치에 M; 위치 326에 상응하는 위치에 K; 위치 326에 상응하는 위치에 Y; 위치 327에 상응하는 위치에 A; 위치 327에 상응하는 위치에 L; 위치 334에 상응하는 위치에 A; 위치 334에 상응하는 위치에 T; 위치 334에 상응하는 위치에 N; 위치 336에 상응하는 위치에 E; 위치 338에 상응하는 위치에 A; 위치 338에 상응하는 위치에 S; 위치 338에 상응하는 위치에 N; 위치 338에 상응하는 위치에 R; 위치 338에 상응하는 위치에 V; 위치 338에 상응하는 위치에 Y; 및/또는 위치 338에 상응하는 위치에 M인 아미노산 치환 또는 비변형 FX 폴리펩티드에서 상응하는 아미노산 잔기에 동일한 치환들을 함유하는 변형 인자 X (FX) 폴리펩티드가 본원에 제공되는데, 이에 의하여 변형 FX 폴리펩티드는 FVa-의존적 촉매 활성을 나타낸다. 이러한 예에서, 상응하는 아미노산 잔기는 예를 들어, 도 3에 예시된 바와 같이, 비변형 FX 폴리펩티드와 서열번호 134의 폴리펩티드의 정렬에 의하여 확인된다. 비변형 FX 폴리펩티드는 서열번호 134에 기재된 아미노산 서열을 가지거나, 지모겐, 이의 활성형 또는 촉매 활성형이거나, 또는 서열번호 134 또는 지모겐, 이의 활성형 또는 촉매 활성형에 대하여 적어도 75%의 서열 상동성을 가지는 아미노산 서열을 가진다. 하나의 예에서, 비변형 FX 폴리펩티드는 서열번호 134의 잔기 1-139에 기재된 아미노산 서열을 함유하는 경쇄 및 서열번호 134의 잔기 143-448에 기재된 아미노산 서열을 함유하는 중쇄를 가지는 지모겐 FX 폴리펩티드, 또는 서열번호 134의 잔기 1-139에 기재된 아미노산 서열을 함유하는 경쇄 및 서열번호 134의 잔기 143-448에 기재된 아미노산 서열을 함유하는 중쇄를 가지는 지모겐 FX 폴리펩티드에 대하여 적어도 75%의 서열 상동성을 나타내는 아미노산 서열일 수 있다. 다른 예에서, 비변형 FX 폴리펩티드는 서열번호 134의 잔기 1-139에 기재된 아미노산 서열을 함유하는 경쇄 및 서열번호 134의 잔기 195-448에 기재된 아미노산 서열을 함유하는 중쇄를 가지는 활성 FX (FXa) 폴리펩티드, 또는 서열번호 134의 잔기 1-139에 기재된 아미노산 서열을 함유하는 경쇄 및 서열번호 134의 잔기 195-448에 기재된 아미노산 서열을 함유하는 중쇄를 가지는 FXa 폴리펩티드에 대하여 적어도 75%의 서열 상동성을 나타내는 아미노산 서열이다. 추가 예에서, 비변형 FXa 폴리펩티드는 전술한 활성 FXa의 촉매 활성형이다. 임의의 비변형 FX 폴리펩티드는 서열번호 134 또는 지모겐, 이의 활성형 또는 촉매 활성형에 대하여 적어도 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 상동성을 가질 수 있다. 이러한 변형 FX 폴리펩티드는 단리되거나 또는 실질적으로 정제될 수 있다.
본원에서 제공하는 변형 FX 폴리펩티드의 이러한 예에서, 변형 FX 폴리펩티드는 위치 196에 상응하는 위치에 S, 위치 196에 상응하는 위치에 I; 위치 196에 상응하는 위치에 L; 위치 196에 상응하는 위치에 T; 위치 326에 상응하는 위치에 A 및/또는 위치 326에 상응하는 위치에 Q로의 아미노산 치환(들)도 함유할 수 있다.
FVa-의존적 촉매 활성을 나타내는 임의의 것을 포함하여, 본원에서 제공하는 변형 FX 폴리펩티드는 비-천연 글리코실화 부위의 도입에 의해서 글리코실화를 변경하는 아미노산 치환(들)을 함유할 수 있다. 예를 들어, 비-천연 글리코실화 부위는 서열번호 134에 기재된 아미노산 위치를 참고로, 위치 51에 상응하는 위치에 N; 위치 56에 상응하는 위치에 N 및 위치 58에 상응하는 위치에 S; 위치 62에 상응하는 위치에 N 및 위치 64에 상응하는 위치에 S; 위치 65에 상응하는 위치에 N 및 위치 67에 상응하는 위치에 S; 위치 67에 상응하는 위치에 N; 위치 73에 상응하는 위치에 N 및 위치 75에 상응하는 위치에 S; 위치 75에 상응하는 위치에 N 및 위치 77에 상응하는 위치에 S; 위치 77에 상응하는 위치에 N 및 위치 79에 상응하는 위치에 S; 위치 78에 상응하는 위치에 N 및 위치 80에 상응하는 위치에 S; 위치 82에 상응하는 위치에 S; 위치 83에 상응하는 위치에 N; 위치 82에 상응하는 위치에 N 및 위치 84에 상응하는 위치에 S; 위치 85에 상응하는 위치에 N 및 위치 87에 상응하는 위치에 S; 위치 86에 상응하는 위치에 N 및 위치 88에 상응하는 위치에 S; 위치 95에 상응하는 위치에 N 및 위치 97에 상응하는 위치에 S; 위치 114에 상응하는 위치에 N; 위치 119에 상응하는 위치에 N 및 위치 121에 상응하는 위치에 S; 위치 122에 상응하는 위치에 S; 위치 215에 상응하는 위치에 N 및 위치 217에 상응하는 위치에 S; 위치 243에 상응하는 위치에 N 및 위치 245에 상응하는 위치에 S; 위치 264에 상응하는 위치에 N 및 위치 266에 상응하는 위치에 S; 위치 293에 상응하는 위치에 N 및 위치 295에 상응하는 위치에 S; 위치 388에 상응하는 위치에 N; 위치 389에 상응하는 위치에 N 및 위치 391에 상응하는 위치에 S; 위치 428에 상응하는 위치에 N 및 위치 430에 상응하는 위치에 S; 또는 위치 429에 상응하는 위치에 N 및 위치 431에 상응하는 위치에 S로의 아미노산 치환(들), 또는 비변형 FX 폴리펩티드에서 상응하는 아미노산 잔기에 동일한 치환(들)에 의해 도입될 수 있다.
예를 들어, 위치 119에 상응하는 위치에 N, 위치 121에 상응하는 위치에 S, 위치 196에 상응하는 위치에 S, 위치 211에 상응하는 위치에 S 및 위치 219에 상응하는 위치에 H; 위치 114에 상응하는 위치에 N, 위치 196에 상응하는 위치에 S, 위치 211에 상응하는 위치에 S 및 위치 219에 상응하는 위치에 H; 위치 114에 상응하는 위치에 N, 위치 119에 상응하는 위치에 N, 위치 121에 상응하는 위치에 S, 위치 196에 상응하는 위치에 S, 위치 211에 상응하는 위치에 S 및 위치 219에 상응하는 위치에 H; 위치 196에 상응하는 위치에 S, 위치 211에 상응하는 위치에 S, 위치 219에 상응하는 위치에 H, 위치 264에 상응하는 위치에 N 및 위치 266에 상응하는 위치에 S; 위치 119에 상응하는 위치에 N, 위치 121에 상응하는 위치에 S, 위치 196에 상응하는 위치에 S, 위치 211에 상응하는 위치에 S, 위치 219에 상응하는 위치에 H, 위치 264에 상응하는 위치에 N 및 위치 266에 상응하는 위치에 S; 위치 114에 상응하는 위치에 N, 위치 196에 상응하는 위치에 S, 위치 211에 상응하는 위치에 S, 위치 219에 상응하는 위치에 H, 위치 264에 상응하는 위치에 N 및 위치 266에 상응하는 위치에 S; 위치 119에 상응하는 위치에 N, 위치 121에 상응하는 위치에 S, 위치 196에 상응하는 위치에 S, 위치 211에 상응하는 위치에 S, 위치 219에 상응하는 위치에 H 및 위치 388에 상응하는 위치에 N; 위치 114에 상응하는 위치에 N, 위치 196에 상응하는 위치에 S, 위치 211에 상응하는 위치에 S, 위치 219에 상응하는 위치에 H 및 위치 388에 상응하는 위치에 N; 또는 위치 196에 상응하는 위치에 S, 위치 211에 상응하는 위치에 S, 위치 219에 상응하는 위치에 H, 위치 264에 상응하는 위치에 N, 위치 266에 상응하는 위치에 S 및 위치 388에 상응하는 위치에 N으로의 아미노산 치환(들)을 함유하는 변형 FX 폴리펩티드가 본원에 제공된다.
FVa-의존적 촉매 활성을 유지하거나 나타내면서, 비-천연 글리코실화 부위의 도입에 의하여 글리코실화를 변경하는 아미노산 치환(들)을 함유하는 변형 FX 폴리펩티드가 본원에 제공된다. 예를 들어, 서열번호 134에 기재된 아미노산 위치를 참고로, 위치 51에 상응하는 위치에 N; 위치 56에 상응하는 위치에 N 및 위치 58에 상응하는 위치에 S; 위치 62에 상응하는 위치에 N 및 위치 64에 상응하는 위치에 S; 위치 65에 상응하는 위치에 N 및 위치 67에 상응하는 위치에 S; 위치 67에 상응하는 위치에 N; 위치 73에 상응하는 위치에 N 및 위치 75에 상응하는 위치에 S; 위치 75에 상응하는 위치에 N 및 위치 77에 상응하는 위치에 S; 위치 77에 상응하는 위치에 N 및 위치 79에 상응하는 위치에 S; 위치 78에 상응하는 위치에 N 및 위치 80에 상응하는 위치에 S; 위치 82에 상응하는 위치에 S; 위치 83에 상응하는 위치에 N; 위치 82에 상응하는 위치에 N 및 위치 84에 상응하는 위치에 S; 위치 85에 상응하는 위치에 N 및 위치 87에 상응하는 위치에 S; 위치 86에 상응하는 위치에 N 및 위치 88에 상응하는 위치에 S; 위치 95에 상응하는 위치에 N 및 위치 97에 상응하는 위치에 S; 위치 114에 상응하는 위치에 N; 위치 119에 상응하는 위치에 N 및 위치 121에 상응하는 위치에 S; 위치 122에 상응하는 위치에 S; 위치 215에 상응하는 위치에 N 및 위치 217에 상응하는 위치에 S; 위치 243에 상응하는 위치에 N 및 위치 245에 상응하는 위치에 S; 위치 264에 상응하는 위치에 N 및 위치 266에 상응하는 위치에 S; 위치 293에 상응하는 위치에 N 및 위치 295에 상응하는 위치에 S; 위치 388에 상응하는 위치에 N; 위치 389에 상응하는 위치에 N 및 위치 391에 상응하는 위치에 S; 위치 428에 상응하는 위치에 N 및 위치 430에 상응하는 위치에 S; 또는 위치 429에 상응하는 위치에 N 및 위치 431에 상응하는 위치에 S로의 아미노산 치환(들), 또는 비변형 FX 폴리펩티드에서 상응하는 아미노산 잔기에 동일한 치환(들)에 의해 도입되는 비-천연 글리코실화 부위를 함유하는 변형 FX 폴리펩티드가 본원에 제공된다.
임의의 단리되거나 실질적으로 정제된 형태를 포함하여, 변형 FX 폴리펩티드 중에, 본원에 제공되는 것은 단지 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 아미노산 치환(들)을 함유하는 것을 포함한다. 하나의 예에서, 서열번호 164, 173, 174, 176, 177, 179-181, 183-190, 192-203, 205-209, 213, 259-261 및 263-265 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열 또는 서열번호 164, 173, 174, 176, 177, 179-181, 183-190, 192-203, 205-209, 213, 259-261 및 263-265 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열 중 어느 하나에 대하여 적어도 75%의 서열 상동성을 나타내고 아미노산 치환(들)을 함유하는 아미노산 서열을 가지는 변형 FX 폴리펩티드가 본원에서 제공된다. 다른 예에서, 서열번호 164, 173, 174, 176, 177, 179-181, 183-190, 192-203, 205-209, 213, 259-261 및 263-265 중 어느 하나의 잔기 1-139에 기재된 아미노산 서열을 가지는 경쇄 및 잔기 143-448에 기재된 아미노산 서열을 가지는 중쇄를 함유하는 아미노산 서열, 또는 서열번호 164, 173, 174, 176, 177, 179-181, 183-190, 192-203, 205-209, 213, 259-261 및 263-265 중 어느 하나의 잔기 1-139에 기재된 아미노산 서열을 가지는 경쇄 및 잔기 143-448에 기재된 아미노산 서열을 가지는 중쇄를 함유하는 아미노산 서열 중 어느 하나에 대하여 적어도 75%의 서열 상동성을 나타내고 아미노산 치환(들)을 함유하는 아미노산 서열을 갖는 변형 FX 폴리펩티드가 본원에서 제공된다. 추가 예에서, 서열번호 164, 173, 174, 176, 177, 179-181, 183-190, 192-203, 205-209, 213, 259-261 및 263-265 중 어느 하나의 잔기 1-139에 기재된 아미노산 서열을 가지는 경쇄 및 잔기 195-448에 기재된 아미노산 서열을 가지는 중쇄를 함유하는 아미노산 서열, 또는 서열번호 164, 173, 174, 176, 177, 179-181, 183-190, 192-203, 205-209, 213, 259-261 및 263-265 중 어느 하나의 잔기 1-139에 기재된 아미노산 서열을 가지는 경쇄 및 잔기 195-448에 기재된 아미노산 서열을 가지는 중쇄를 함유하는 아미노산 서열 중 어느 하나에 대하여 적어도 75%의 서열 상동성을 나타내고 아미노산 치환(들)을 함유하는 아미노산 서열을 갖는 변형 FX 폴리펩티드가 본원에서 제공된다. 추가 예에서, 아미노산 치환(들)을 포함하고 촉매 활성을 나타내는 상기 임의의 폴리펩티드의 촉매 활성형인 변형 FX 폴리펩티드가 본원에서 제공된다.
본원에서 제공된 임의의 예에서, 변형 FX 폴리펩티드는, FXa형이거나 이의 촉매 활성 조각(fragment)일 때, 아미노산 치환(들)을 함유하지 않은 동일한 FXa 폴리펩티드와 비교하여 증가된 FVa 보조인자 의존성을 나타내는 것들을 포함한다. 예를 들어, 보조인자 의존성은 적어도 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 20배, 30배, 40배, 50배, 100배, 200배, 300배, 400배, 500배, 600배, 700배, 800배, 900배, 1000배, 1200배 또는 1500배 증가된다.
본원에서 제공된 임의의 예에서, 변형 FX 폴리펩티드는, 변형 FX 폴리펩티드는 활성 FXa형이거나 이의 촉매 활성 조각(fragment)일 때, 아미노산 치환(들)을 함유하지 않은 동일한 FXa 폴리펩티드와 비교하여 항트롬빈 III (ATIII) 또는 TFPI와 같은 저해제게 대하여 증가된 저항성을 나타내는 것들을 포함한다. 증가된 저항성은 적어도 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 20배, 30배, 40배, 50배, 60배, 70배, 80배, 90배, 100배, 200배, 300배, 400배, 500배, 600배, 700배, 800배, 900배, 1000배, 1500배, 2000배, 2500배, 3000배, 3500배, 4000배, 4500배, 4500배, 5000배, 5500배 또는 6000배 증가된다.
본원에서 제공된 임의의 예에서, 변형 FX 폴리펩티드는, 활성 FXa형이거나 이의 촉매 활성 조각(fragment)일 때, 아미노산 치환(들)을 함유하지 않은 동일한 FXa 폴리펩티드의 촉매 활성에 대하여 적어도 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 또는 그 이상의 촉매활성을 나타내는 것을 포함한다. 하나의 예에서, 촉매 활성은 FVa의 존재 하에 있다. 다른 예에서, 촉매 활성은 FVa의 부재 하에 있다.
본원에서 제공되는 변형 FX 폴리펩티드 또는 단리된 변형 FX 폴리펩티드의 임의의 예에서, 변형 FX 폴리펩티드는 서열번호 134에 기재된 아미노산 위치를 참고로 위치 195에 상응하는 위치에 류신(L)으로의 아미노산 치환, 또는 비변형 FX 폴리펩티드에서 상응하는 아미노산 잔기에 동일한 치환(들)을 추가 함유할 수 있다.
본원에서 제공되는 변형 FX 폴리펩티드 또는 단리된 변형 FX 폴리펩티드의 임의의 예에서, 변형 폴리펩티드는 인간 폴리펩티드일 수 있고, 또는 비-인간 폴리펩티드일 수 있다. 일부 예에서, 변형 FX 폴리펩티드는 지모겐 폴리펩티드이다. 다른 예에서, 변형 FX 폴리펩티드는 활성이거나 활성화되고, 예를 들어, 변형 FX 폴리펩티드는 중쇄에 활성화 펩티드를 함유하지 않거나 결실되어 있다. 이러한 예에서, 활성화는 TF/FVIIa 또는 FVIIIa/FIXa 테나제 복합체 또는 Russell's Viper Venom FX Activator에 의한 단백질 분해성 절단에 의해 영향받을 수 있다. 일부 예에서, 변형 FX 폴리펩티드는 두-사슬 폴리펩티드이다. 다른 예에서, 변형 FX 폴리펩티드는 단일-사슬 폴리펩티드이다.
본원에서 제공되는 변형 FX 폴리펩티드 또는 단리된 변형 FX 폴리펩티드의 예들에서, 일차 서열만이 변형된다. 본원에서 제공되는 임의의 변형 FX 폴리펩티드 또는 단리된 변형 FX 폴리펩티드의 다른 예에서, 폴리펩티드는 화학적 변형 또는 번역후 변형을 추가 함유할 수 있다. 예를 들어, 변형 FX 폴리펩티는 글리코실화, 카복실화, 히드록실화, 황산화, 인산화, 알부민화, 또는 폴리에틸렌글리콜(PEG) 모이어티에 컨쥬게이트화된다. 본원에서 제공되는 변형 FX 폴리펩티드 또는 단리된 변형 FX 폴리펩티드의 추가 예에서, 폴리펩티드는 키메라 또는 융합 단백질이다.
상술하거나, 다른 곳에서 기술된 것을 포함하여, 본원에서 제공되는 임의의 변형 FX 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 핵산 분자가 본원에서 제공된다. 또한, 이러한 핵산 분자를 함유하는 벡터가 본원에서 제공된다. 벡터는 원핵생물 벡터, 바이러스 벡터, 또는 진핵생물 벡터일 수 있다. 벡터는 포유동물 벡터일 수 있다. 벡터가 바이러스 벡터인 예들에서, 바이러스는 아데노바이러스, 아데노-연관-바이러스, 레트로바이러스, 헤르페스 바이러스, 렌티바이러스, 폭스바이러스, 또는 사이토메갈로바이러스일 수 있다.
또한, 임의의 상기 핵산 분자 또는 벡터를 함유하는 단리된 세포가 본원에서 제공된다. 세포는 진핵생물 세포일 수 있고, 예를 들어, 포유동물 세포일 수 있다. 포유동물 세포는 새끼 햄스터 신장 세포(BHK-21) 또는 293 세포 또는 CHO 세포일 수 있다. 세포는 변형 FX 폴리펩티드를 발현할 수 있다. 그러므로, 본원에서 제공되는 세포들에 의해 생산된 변형 FX 폴리펩티드가 또한 본원에서 제공된다.
약학적으로 허용가능한 비히클 중에 본원에서 제공되는 변형 FX 폴리펩티드, 본원에서 제공되는 핵산, 또는 본원에서 제공되는 벡터의 어느 것이든 함유하는 약학적 조성물이 본원에서 제공된다. 약학적 조성물은 국부(local), 전신 또는 국소(topical) 투여용으로 제형화될 수 있다. 예를 들어, 제형은 경구, 비강, 폐, 구강, 경피, 피하, 십이지장내, 장, 비경구, 정맥, 또는 근육내 투여용으로 제형화된다. 일부 예에서, 약학적 조성물은 제어-방출용으로 제형화된 조성물일 수 있다. 다른 예에서, 약학적 조성물은 단일-용량 투여용으로 제형화된다. 본원에서 제공되는 조성물들은 변형 FX 폴리펩티드가 아미노산 치환(들)을 함유하고, 활성화 폴리펩티드를 포함하지 않는 임의의 활성인 FXa를 포함한다.
a) 서열번호 134에 기재된 아미노산 1-139의 서열, 또는 서열번호 134의 아미노산 1-139 서열에 대하여 적어도 75%의 서열 상동성을 나타내고 아미노산 치환(들)을 함유하는 아미노산 서열을 갖는 경쇄; 및 서열번호 136-265 중 어느 하나의 아미노산 143-448 서열, 또는 서열번호 136-265 중 어느 하나의 아미노산 143-448 서열에 대하여 적어도 75%의 서열 상동성을 나타내고 비변형 FX 폴리펩티드와 비교하여 아미노산 치환(들)을 함유하는 아미노산 서열을 갖는 중쇄;를 포함하는 변형 FX 지모겐을 포함하는 조성물을 제공하고; 및 b) 상기 지모겐의 활성화 절단에 의하여 폴리펩티드로부터 활성화 펩티드를 제거하고, 이로써 변형 FXa 폴리펩티드를 생산하는 것을 포함하는 변형 활성 인자 X (FXa) 폴리펩티드를 생산하는 방법이 본원에서 제공된다. 상기 방법에 사용된 FX 지모겐은 서열번호 4-133 또는 136-265 및 417-546 중 어느 하나에 기재된 폴리펩티드를 암호화하는 핵산, 또는 서열번호 4-133, 또는 136-265 및 417-546 중 어느 하나에 대하여 적어도 75%의 서열 상동성을 갖고 비변형 FX 폴리펩티드와 비교하여 아미노산 치환(들)을 함유하는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산의 발현에 의하여 생산되는 변형 FX 지모겐을 포함한다. 본원에서 제공되는 방법에서, 활성화 펩티드의 제거에 의한 활성화 절단은 생체내(in vivo) 또는 시험관내(in vitro)에서 영향을 받을 수 있다. 예를 들어, 활성화 절단은 TF/TVIIa 또는 FVIIIa/FIXa 테나제 복합체 또는 러셀 살모사 독 FX 활성화제(Russeell's Viper Venom FX Activator) 중에서 선택되는 활성제에 의해 영향을 받을 수 있다. 본원에서 제공되는 방법은 조성물로부터 활성제를 제거하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 본원의 방법은 또한 조성물로부터 활성화 펩티드를 제거하는 단계를 포함할 수 있다.
본원에서 제공되는 임의의 변형 FX 폴리펩티드 또는 본원에서 제공되는 임의의 약학적 조성물을 개체에게 투여함으로써 출혈 질병인 질환 또는 상태를 치료하는 방법이 본원에서 제공된다. 방법에 사용된 변형 FX 폴리펩티드는 아미노산 치환(들)을 함유하는 지모겐, FXa 또는 이의 촉매 활성 부분(portion)일 수 있다. 본원의 방법에서, 폴리펩티드 또는 약학적 조성물로의 치료는 질환 또는 상태와 연관된 증상을 개선하거나 완화한다. 본원에서 제공된 방법은 또한 출혈 질병에 연관된 증상의 변화에 대하여 개체를 모니터링하는 것을 포함한다.
출혈 질병을 치료하는 본원에 제공된 임의의 방법에서, 출혈 질병은 선천적 출혈 질병 또는 후천적 출혈 질병이다. 예를 들어, 출혈 질병은 응고 인자 결핍에 의한 질병, 응고인자에 대한 후천적 저해제의 존재에 의한 질병, 혈액 질병, 출혈 질병, 폰 빌레브란트 질병(Von Willebrand's disease), 비타민-K 길항제를 이용한 항응고제 치료로 야기된 질병, 유전성 혈소판 질병, 비타민 K 에폭시드 리덕테이즈 C1 결핍, 감마-카복실레이즈 결핍, 외상과 연관된 출혈, 부상, 혈전증, 혈소판감소증, 뇌졸중, 응고장애, 파종성 혈관내 응고(DIC), 베르나르-술리에 증후군(Bernard Soulier syndrome), 혈소판무력증(Glanzman thromblastemia) 또는 저장 풀 결핍(storage pool deficiency)일 수 있다. 출혈 질병이 응고 인자의 결핍에 의한 것이거나, 응고 인자에 대한 후천적 저해제의 존재에 의한 것인 예에서, 상기 응고 인자는 인자 Ⅶ, 인자 Ⅸ, 인자 Ⅹ, 인자 XI, 인자 V, 인자 XII, 인자 Ⅱ 또는 폰 빌레브란트 인자(von Willebrand factor)이다. 출혈 질병이 응고 인자의 결핍에 의한 것인 예에서, 상기 응고 인자는 인자 Ⅶ, 인자 Ⅷ, 인자 Ⅸ 또는 인자 XI이다. 예를 들어, 출혈 질병은 혈우병 A, 혈우병 B 또는 혈우병 C이다.
출혈 질병이 응고 인자의 결핍에 의한 것인 본원의 방법의 예에서, 상기 질병은 가족성 다중 응고 인자 결핍(familial multiple coagulation factor deficiency, FMFD)이다. 출혈 질병이 응고 인자에 대한 후천적 저해제의 존재에 의한 것인 본원의 예에서, 상기 응고 인자는 인자 Ⅶ, 인자 Ⅷ, 인자 Ⅸ, 인자 Ⅹ, 인자 XI, 및 인자 XII이다. 이러한 예에서, 후천적 저해제는 자가항체이다. 예를 들어, 출혈 질병은 후천적 혈우병이다. 출혈 질병이 유전성 혈소판 질병인 본원의 방법의 예에서, 출혈 질병은 체디아크 히가시 증후군(Chediak-Higashi syndrome), 헤르만스키-푸드락 증후군(Hermansky-Pudlak syndrome), 트롬복산 A2 기능장애, 혈소판무력증(Glanzmann's thrombasthenia) 및 베르나르-술리에 증후군(Bernard Soulier syndrome)일 수 있다. 질병이 비타민-K 길항제를 이용한 항응고제 치료로 야기된 본원의 다른 예에서, 상기 비타민-K 길항제는 헤파린, 오당류, 와파린, 소분자 항혈전제(small molecular antithrombotics) 및 FXa 저해제일 수 있다.
본원의 방법의 다른 예에서, 질병은 혈전증, 혈소판감소증, 뇌졸중 및 응고장애이다. 본원의 방법의 추가 예에서, 출혈 질병은 외상, 수술 또는 상처로 야기된다. 이러한 예에서, 예를 들어, 출혈은 급성 혈관절증(acute haemarthroses), 만성 혈우병성 관절증(chronic haemophilic arthropathy), 혈종, 혈뇨, 중추신경계 출혈, 위장 출혈, 또는 뇌 출혈로서 나타난다. 다른 예에서, 출혈은 발치(dental extraction)에 의한 것이다. 출혈 질병이 수술에 의한 것인 본원의 다른 예에서, 수술은 심장 수술, 혈관성형술, 폐 수술, 복부 수술, 척추 수술, 뇌 수술, 혈관 수술, 치아 수술, 또는 장기 이식 수술이다. 예를 들면, 수술은 골수, 심장, 폐, 이자 또는 간의 이식에 의한 이식 수술이다.
출혈 질병을 치료하기 위한 방법의 본원의 임의의 예에서, 변형 FX 폴리펩티드가 비변형 FX 폴리펩티드와 비교하여 증가된 반감기를 나타낼 수 있다. 예를 들어, 증가된 반감기는 AT-Ⅲ에 대한 증가된 저항성 또는 도입된 비-천연 글리코실화 부위의 글리코실화에 의한 과글리코실화(hyperglycosylation)에 의해 영향을 받는다.
출혈 질병을 치료하기 위한 방법의 본원의 임의의 예에서, 상기 방법은 또한 하나 이상의 추가적인 응고 인자를 투여하는 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 추가 응고 인자는 혈장 정제 또는 재조합 응고 인자, 비타민 K, 비타민 K 유도체 및 단백질 C 저해제와 같은 응혈원, 혈장, 혈소판, 적혈구 또는 코르티코스테로이드일 수 있다.
본원에서 제공되는 임의의 변형 FX 폴리펩티드의 의학적 용도가 또한 본원에서 제공된다. 하나의 예에서, 출혈 질병을 치료하는데 사용되기 위하여 본원에서 제공되는 임의의 변형 FX 폴리펩티드가 본원에서 제공된다. 다른 예에서, 출혈 질병의 치료를 위한 약제의 제조에 본원에서 제공되는 임의의 변형 FX 폴리펩티드를 함유하는 약학적 조성물의 사용이 본원에 제공된다. 본원에서 제공되는 의학적 용도에서, 변형 FX 폴리펩티드는 아미노산 치환(들)을 함유하는 지모겐, FXa 또는 이의 촉매 활성형이다.
출혈 질병을 치료하기 위하여 본원에서 제공되는 용도를 위한 폴리펩티드 또는 용도에서, 출혈 질병은 선천적 출혈 질병 또는 후천적 출혈 질병이다. 예를 들어, 출혈 질병은 응고 인자의 결핍에 의한 질병, 응고 인자에 대한 후천적 저해제의 존재에 의한 질병, 혈액 질병, 출혈 질병, 폰 빌레브란트 질병(Von Willebrand's disease), 비타민-K 길항제를 이용한 항응고제 치료로 야기된 질병, 유전성 혈소판 질병, 비타민 K 에폭시드 리덕테이즈 C1 결핍, 감마-카복실레이즈 결핍, 외상과 연관된 출혈, 부상, 혈전증, 혈소판감소증, 뇌졸중, 응고장애, 파종성 혈관내 응고(DIC), 베르나르-술리에 증후군(Bernard Soulier syndrome), 혈소판무력증(Glanzman thromblastemia) 또는 저장 풀 결핍(storage pool deficiency)이다. 출혈 질병이 응고 인자의 결핍에 의한 것이거나, 응고 인자에 대한 후천적 저해제의 존재에 의한 것인 예에서, 상기 응고 인자는 인자 Ⅶ, 인자 Ⅸ, 인자 Ⅹ, 인자 XI, 인자 V, 인자 XII, 인자 Ⅱ 또는 폰 빌레브란트 인자(von Willebrand factor)이다. 출혈 질병이 응고 인자의 결핍에 의한 것인 예에서, 상기 응고 인자는 인자 Ⅶ, 인자 Ⅷ, 인자 Ⅸ 또는 인자 XI일 수 있다. 예를 들어, 출혈 질병은 혈우병 A, 혈우병 B 또는 혈우병 C이다.
출혈 질병이 응고 인자의 결핍에 의한 것인 출혈 질병을 치료하기 위한 본원에서 제공되는 용도를 위한 폴리펩티드 또는 용도의 예에서, 상기 질병은 가족성 다중 응고 인자 결핍(familial multiple coagulation factor deficiency, FMFD)이다. 출혈 질병이 응고 인자에 대한 후천적 저해제의 존재에 의한 것인 본원의 예에서, 상기 응고 인자는 인자 Ⅶ, 인자 Ⅷ, 인자 Ⅸ, 인자 Ⅹ, 인자 XI 및 인자 XII이다. 이러한 예에서, 후천적 저해제는 자가항체이다. 예를 들어, 출혈 질병은 후천적 혈우병이다. 출혈 질병이 유전성 혈소판 질병인 본원에서 제공되는 용도를 위한 폴리펩티드 또는 용도의 예에서, 출혈 질병은 체디아크 히가시 증후군(Chediak-Higashi syndrome), 헤르만스키-푸드락 증후군(Hermansky-Pudlak syndrome), 트롬복산 A2 기능장애, 혈소판무력증(Glanxmann's thrombasthenia) 및 베르나르-술리에 증후군(Bernard-Soulier syndrome)일 수 있다. 질병이 비타민-K 길항제를 이용한 항응고제 치료로 야기된 것인 본원의 다른 예에서, 상기 비타민-K 길항제는 헤파린, 오당류, 와파린, 소분자 항혈전제(small molecular antithrombotics) 및 FXa 저해제일 수 있다.
출혈 질병을 치료하기 위하여 본원에서 제공되는 용도를 위한 폴리펩티드 또는 용도의 다른 예에서, 질병은 혈전증, 혈소판감소증, 뇌졸중 및 응고장애이다. 추가 예에서, 출혈 질병은 외상, 수술 또는 상처로 야기된다. 이러한 예에서, 예를 들어, 출혈은 급성 혈관절증(acute haemarthroses), 만성 혈우병성 관절증(chronic haemophilic arthropathy), 혈종, 혈뇨, 중추신경계 출혈, 위장 출혈, 또는 뇌 출혈로서 나타난다. 다른 예에서, 출혈은 발치(dental extraction)에 의한 것이다. 출혈 질병이 수술에 의한 것인 본원의 다른 예에서, 수술은 심장 수술, 혈관성형술, 폐 수술, 복부 수술, 척추 수술, 뇌 수술, 혈관 수술, 치아 수술, 또는 장기 이식 수술이다. 예를 들어, 수술은 골수, 심장, 폐, 이자 또는 간의 이식에 의한 이식 수술이다.
출혈 질병을 치료하기 위하여 본원에서 제공되는 사용을 위한 폴리펩티드 또는 용도의 본원의 임의의 예에서, 변형 FX 폴리펩티드는 비변형 FX 폴리펩티드와 비교하여 증가된 반감기를 나타낼 수 있다. 예를 들어, 증가된 반감기는 AT-Ⅲ에 대한 증가된 저항성 또는 도입된 비-천연 글리코실화 부위의 글리코실화에 의한 과글리코실화(hyperglycosylation)에 의해 영향을 받는다.
포장 재료 및 포장 재료 안에 함유된 본원에서 제공되는 임의의 FX 폴리펩티드를 함유하는 임의의 약학적 조성물을 함유하는 제조품이 본원에서 제공된다. 본원에서 제공되는 제조품의 예에서, 포장 재료는 변형 FX 폴리펩티드가 출혈 질병의 치료용으로 사용됨을 지시하는 라벨을 포함한다. 또한, 본원의 임의의 약학적 조성물, 상기 조성물의 투여용 장치 및 선택적으로, 투여를 위한 지침을 포함하는 키트가 또한 본원에서 제공된다.
발명의 상세한 설명
개요
A. 정의
B. 지혈 및 인자 X 기능
1. 응고 경로
a. 조직 인자 (외인성) 응고 경로
b. 내인성 응고 경로
c. 공통 경로
2. 인자 V-독립적 활성
a. 트롬빈 활성화
b. 염증 및 세포 증식
i. 이펙터 세포 프로테아제 수용체-1(Effector Cell Protease Receptor-1, EPR-1)
ii. 프로테아제 활성화 수용체(Protease Activated Receptors, PARs)
3. 인자 X 저해제
C. 인자 X 구조 및 활성화
1. 가공 및 구조
2. 활성화
3. 생물약제로서의 인자 X 및 Xa
D. 변형 인자 X 폴리펩티드
E. 인자 X 폴리펩티드의 생산
1. 벡터 및 세포
2. 발현 시스템
a. 원핵세포 발현
b. 효모
c. 곤충 및 곤충 세포
d. 포유류 세포
e. 식물
2. 정제
3. 융합 단백질
4. 폴리펩티드 변형
5. 뉴클레오티드 서열
F. 변형 인자 X 활성의 평가
1. 시험관내 검정
2. 비-인간 동물 모델
3. 임상 검정
G. 제형 및 투여
1. 제형
a. 용량
b. 투여형태
2. 변형 FVX 폴리펩티드의 투여
3. 변형 FVX 폴리펩티드를 암호화하는 핵산의 투여 (유전자 치료)
H. 치료적 용도
I. 병용 요법
J. 제조품 및 키트
K. 실시예
A. 정의
다른 언급이 없는 한, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 당업계의 숙련된 자가 일반적으로 이해하고 있는 바와 같은 의미이다. 모든 특허, 특허출원, 공개공보 및 간행물, 진뱅크(Genbank) 서열, 데이터데이스, 웹사이트 및 본 명세서를 통해 언급된 기타 공개 자료는 다른 언급이 없는 한, 전문이 참고인용되었다. 본원에서 용어들에 대한 정의가 여러 개인 경우에는, 본 섹션의 정의가 우세하다. URL 또는 이러한 다른 식별자 또는 주소를 참고로 하는 경우에, 이러한 식별자는 변경될 수 있고 인터넷에서의 특정 정보는 등록 및 삭제될 수 있지만, 인터넷을 조사하면 동등한 정보를 찾을 수 있다는 것이 이해된다. 이에 대한 언급은 이러한 정보의 이용가능성 및 대중 보급성을 입증한다.
본원에 사용된 응고 경로(coagulation pathway) 또는 응고 캐스캐이드(coagulation cascade)는 불용성 피브린 응괴의 형성을 야기하는 일련의 활성화 사건을 의미한다. 응고 캐스캐이드 또는 경로에서 세린 프로테아제의 불활성 단백질(지모겐(zymogen)이라고도 불림)은 하나 이상의 펩티드 결합의 절단에 의해 활성 프로테아제로 전환되고, 이어서 캐스캐이드 중의 다음 지모겐 분자에 대한 활성화 프로테아제로 작용한다. 캐스캐이드의 최종 단백질 분해 단계에서 피브리노겐은 트롬빈에 의해 피브린으로 단백분해적으로 절단되고, 이 피브린은 상해 부위에서 가교결합하여 응괴를 형성한다.
본원에 사용된 "지혈(hemostasis)"은 기관이나 신체 부위에서의 출혈 또는 혈류의 정지를 의미한다. 지혈이란 용어는 혈관 상해 후 혈액 소실을 방지하는 응괴화부터 조직 수복 후 응괴의 후속 용해까지의 전 과정을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 "응고(clotting)" 또는 "응고(coagulation)"는 불용성 피브린 응괴의 형성 또는 혈액의 응고인자가 응고 캐스캐이드에서 상호작용하여, 결국 불용성 피브린 응괴를 형성시키는 과정을 의미한다.
본원에 사용된 "프로테아제(protease)"는 공유 펩티드 결합의 가수분해를 촉매하는 효소이다. 이 명칭은 지모겐 형 및 이의 활성화된 단일쇄, 이중쇄 및 다중쇄 형을 포함한다. 분명히 말하면, 프로테아제에 대한 언급은 모든 형태를 의미한다. 프로테아제는 활성 부위의 촉매적 활성 및 표적 기질의 펩티드 결합을 절단하는 기전에 따라서, 예컨대 세린 프로테아제, 시스테인 프로테아제, 아스파르트산 프로테아제, 트레오닌 및 메탈로-프로테아제를 포함한다.
본원에 사용된 세린 프로테아제(serine proteases) 또는 세린 엔도펩티다제(serine endopeptidases)는 이 효소의 활성 부위에 세린 잔기의 존재를 특징으로 하는 펩티다제 유형을 의미한다. 세린 프로테아제는 체내의 광범위한 기능, 예컨대 혈액 응고 및 염증에 관여할 뿐만 아니라, 원핵생물 및 진핵생물에서 소화 효소로서 기능한다. 세린 프로테아제에 의한 절단 기전은 세린에 의한 표적화된 펩티드 결합의 친핵성 공격을 기본으로 한다. 아스파테이트 또는 금속과 연합한 시스테인, 트레오닌 또는 물 분자 역시 이 역할을 할 수 있다. 세린, 히스티딘 및 아스파테이트의 정렬된 측쇄는 대부분의 세린 프로테아제에 공통적인 촉매적 트라이어드(triad)를 형성한다. 세린 프로테아제의 활성 부위는 폴리펩티드 기질이 결합하는 틈(cleft)에 형성되어 있다.
본원에서 사용된, 인자 X(Factor X, FX) 또는 FX 폴리펩티드(FX polypeptide)는 활성형일 때 프로트롬빈에 대하여 촉매적 활성(즉, 프로트롬보제닉 활성(prothrombogeninc activity))을 나타내는 세린 프로테아제 폴리펩티드를 의미한다. FX는 응고 경로의 일부인 세린 프로테아제이고, 특히 공통 응고 경로에서 첫번째 세린 프로테아제이다. FX는 전구체 폴리펩티드(예컨대 서열번호 2로 기재되는)로부터 세포에서 가공되어 프로펩티드 영역을 함유하는 폴리펩티드를 생산하고, 상기 폴리펩티드는 궁극적으로 절단되어 신호 서열 및 프로펩티드를 결여하는 성숙 폴리펩티드(예컨대 서열번호 134로 기재되는)를 생성한다. 분비된 FX 폴리펩티드는 이중쇄(two-chain) 폴리펩티드이다. FX 폴리펩티드는 불활성의 지모겐 또는 활성의 인자 X(FXa)를 포함한다. 활성 FXa는 활성화 펩티드를 결여한다. FXa는 촉매적 활성을 나타내는 FX의 형태인데, 촉매적 활성은 그것의 보조인자인 인자 Va(Factor Va)에 대한 활성 FX(FXa)의 결합에 있어서 크게 증가한다. FXa 활성은 또한 Ca++ 및 인지질의 포함에 의해 향상된다. 본원에서 제공되는 바와 같이, 지모겐-유사 형태로 FXa의 형성의 구조적 변화를 야기하는 돌연변이가 도입될 수 있는데, FVa 보조인자의 존재에서 완전 활성형에서, 프로트롬빈에 대한 촉매적 활성을 나타낸다. 따라서, 본원에서 FX 또는 FX 폴리펩티드에 대한 언급은 전구체, 이의 단일 단일-쇄 및 이중쇄 형을 포함하고, 성숙 형태, 지모겐 형태, FXa 형을 포함하고, 지모겐-유사 형태, 또는 이의 촉매적 활성 부분을 포함하는, 모든 형태를 포함한다.
FXa에 대한 언급은 서열번호 2로 기재되는 전구체 폴리펩티드를 포함하는 인간 FX 폴리펩티드를 포함하며, 이의 단일-쇄 및 이중쇄 형태, 성숙 형 및 지모겐 형태, FXa 형을 포함하고, 지모겐 형태, 지모겐-유사 형태, 또는 이의 촉매적 활성형을 포함한다. 예를 들어, 신호 서열 및 프로펩티드 영역을 결여하는 성숙 FX는 서열번호 134로 기재된다. 이의 지모겐 형태는 130 아미노산 경쇄(서열번호 134의 잔기 1-139에 상응하는) 및 306 아미노산 중쇄(서열번호 134로 기재되는 잔기 143-448에 상응하는)를 함유하는 이중쇄 형태이다. 이의 FXa 형은 130 아미노산 중쇄(서열번호 134의 잔기 1-139에 상응하는) 및 중쇄(서열번호 134의 아미노산 잔기 194-448에 상응하는)를 함유하는 이중쇄 형태, 또는 이의 촉매적 활성형이다. 언급한 바와 같이, FX는 또한 보조인자 FVa의 부재에서 지모겐-유사인 FXa를 포함하는 이의 변형된 형태를 포함한다.
FX에 대한 언급은 이의 변이체, 예컨대 대립유전자 변이체 및 종 변이체, 스플라이스 변이체에 의해 암호화되는 변이체, 및 서열번호 2로 기재되는 전구체 폴리펩티드에 대해 적어도 40%, 45%, 50%, 55%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 상동성을 갖거나 이의 성숙형, 지모겐형 또는 FXa 형을 포함하는 기타 변이체를 포함한다. 이러한 변이체는 이의 FXa 형 또는 이의 촉매적 부분을 포함하는 임의의 부분에서, FVa 결합, 촉매적 활성, 프로트롬빈 결합, 프로트롬빈분해효소 활성 및.또는 응고 활성을 포함하나 이에 제한되지 않는 1 이상의 FX 활성을 나타내는 임의의 것을 포함한다. 상기 활성은 천연 또는 야생형 인자 X와 비교하여 감소되거나 증가될 수 있다. 예를 들어, FX 폴리펩티드는 이의 FXa 형, 또는 촉매적 활성 부분이 천연 또는 야생형 FXa 폴리펩티드의 적어도 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 90%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 200% 또는 그 이상의 활성을 나타내는 폴리펩티드를 포함한다. 예시적인 변이체는 인간(서열번호 2로 기재되고 서열번호 1에 의해 암호화되는 전구체 프리프로펩티드 및 서열번호 134로 기재되는 성숙형), 북부 흰뺨 긴팔원숭이(서열번호 393으로 기재되는 전구체 프리프로펩티드; 및 서열번호 404로 기재되는 성숙형), 올리브 개코원숭이(서열번호 394로 기재되는 전구체 프리프로펩티드 및 서열번호 405로 기재되는 성숙형), 레서스 원숭이(서열번호 395로 기재되는 전구체 프리프로펩티드 및 서열번호 406으로 기재되는 성숙형), 더스키 티티 원숭이(서열번호 396으로 기재되는 전구체 프리프로펩티드 및 서열번호 407로 기재되는 성숙형), 아프리카 코끼리(서열번호 397로 기재되는 전구체 프리프로펩티드 및 서열번호 408로 기재되는 성숙형), 마우스(서열번호 398로 기재되는 전구체 프리프로펩티드 및 서열번호 409로 기재되는 성숙형), 토끼(서열번호 399로 기재되는 전구체 프리프로펩티드 및 서열번호 410으로 기재되는 성숙형), 랫트(서열번호 400으로 기재되는 전구체 프리프로펩티드 및 서열번호 411로 기재되는 성숙형), 개(서열번호 401로 기재되는 전구체 프리프로펩티드 및 서열번호 412로 기재되는 성숙형), 돼지(서열번호 402로 기재되는 전구체 프리프로펩티드 및 서열번호 413으로 기재되는 성숙형), 및 소(서열번호 403으로 기재되는 전구체 프리프로펩티드 및 서열번호 414로 기재되는 성숙형)을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 예시적인 변이체는 또한 서열번호 547-552로 기재되는 변이체(Cargill et al.(1999) Nat. Gen., 22:231-238)를 포함하나 이에 제한되지 않는 인간 FX의 대립유전자 변이체를 포함한다.
본원에서 사용된, 전구체 FX 폴리펩티드(precursor FX polypeptide)는 분비를 위한 단백질 및 프로펩티드를 표적으로 하는 N-말단 신호 펩티드를 함유하는 FX 폴리펩티드의 비-분비형을 의미한다. 신호 펩티드는 소포체(endoplasmic reticulum)에서 절단된다. FX 전구체 폴리펩티드의 예는 서열번호 2로 기재되는 폴리펩티드, 또는 이의 대립유전자 또는 종 변이체 또는 기타 변이체, 예컨대 서열번호 393-403 또는 547-552로 기재되는 임의의 변이체이다.
본원에 사용된 "전구영역(proregion)", "프로펩티드(propeptide)" 또는 "전구서열(pro sequence)"은 절단되어 성숙 단백질을 생산하는 영역 또는 분절을 의미한다. 전구영역은 성숙한 생물학적 활성 폴리펩티드의 아미노 말단에 위치한 아미노산의 서열이며 몇 개의 아미노산만큼 작을 수 있거나 또는 다중도메인(multidomain) 구조일 수 있다. FX 폴리펩티드에 대해, 프로펩티드 영역은 일반적으로 약 9개의 아미노산이나, 종에 따라 다양할 수 있다(예컨대 더 길거나 더 짧거나). FX에 대하여, 프로펩티드 서열은 단백질의 번역후 변형에서 가능하고 세포로부터 단백질의 분비 전에 절단된다. FX에 대하여, 프로펩티드 서열은 소포체 내에서 비타민 K-의존적 카복실라제에 의해 γ-카복실화를 위한 인식 요소이다. 상기 반응은 γ-카복시글루탐산(Gla)에 대한 Gla 도메인에서 글루탐산 잔기에 의한 전환에 의해 일어난다. 이 변형은 혈액 내에서 지모겐의 최적의 Ca2+ -매개 활성화를 위해 요구된다. 예를 들어, gla 잔기는 인자 X/Xa가 칼슘 의존적 방식으로 인지질(즉, 세포 표면)에 결합하는 것을 허용하는데, 이는 프로트롬빈분해효소 복합체의 조립에 요구된다. 예시적인 프로펩티드 또는 전구영역은 서열번호 2의 아미노산 32-40에 상응한다.
본원에서 사용된, FX의 프로펩티드 형태(propeptide form of FX)는 신호 서열을 결여하나 프로펩티드를 유지하는 단백질이다. 예를 들어, 서열번호 2로 기재되는 인간 FX에 대한 예시에서, 상기 프로펩티드는 서열번호 2로 기재되는 아미노산 32-40에 상응하는 9개의 아미노산 프로펩티드이다. 따라서, FX의 예시적인 프로펩티드 형태는 서열번호 2의 아미노산 32-488로 기재되는 인간 FX이거나, 대립유전자 및 종 변이체를 포함하는 이의 변이체이다.
본원에서 사용된, "성숙 FX 폴리펩티드(mature FX polypeptide)"는 신호 서열 및 프로펩티드 서열을 결여하는 폴리펩티드 서열을 의미한다. 상기 폴리펩티드는 폴리펩티드의 분비 전에 트랜스-골지체에서 단백분해적 절단에 의해 제거된다. 예시적인 성숙 FX 폴리펩티드는 서열번호 134로 기재되며, 또한 종 및 대립유전자 변이체와 같은 이의 변이체를 포함한다. 예를 들어, 상기 변이체의 예는 서열번호 404-414 중 임의의 서열로 기재되는 변이체이다. 성숙 FX 폴리펩티드는 일반적으로 이중쇄 폴리펩티드를 생성하는 쇄간 단백분해 전에 FX의 단일쇄 형태를 의미한다.
본원에서 사용된, 지모겐(zymogen)은 혈장내에 정상적으로 존재하는 FX 폴리펩티드의 이중쇄 불활성형을 지칭한다. 상기 이중쇄 형은 중쇄 및 경쇄 간의 잔기 Arg 140-Arg142(서열번호 134로 기재되는 잔기에 상응하는)를 제거하여, 경쇄가 중쇄로부터 절단되는 쇄간 절단에 의해 생성된다. 이는 순환 내로 분비 동안에 또는 그 후에 일어난다. 지모겐은 중쇄의 N-말단에서 활성화 펩티드의 존재로 인해 활성형보다 더 크다. FX에 대해서, 지모겐은 γ-카복시글루탐산(GLA)-풍부 도메인을 함유하는 경쇄, 및 2개의 상피 성장 인자(EGF)-유사 도메인을 포함하는 경쇄를 함유한다. 중쇄는 아미노산(예컨대 서열번호 134의 Cys132 및 Cys302) 간의 이황화 결합에 의해 경쇄에 연결된다. 중쇄는 그것의 N-말단에 52 아미노산 잔기 활성화 펩티드(예컨대 서열번호 134에서 아미노산 잔기 Ser143 내지 Arg194)를 함유한다. 상기 중쇄는 또한 세린 프로테아제 도메인(예컨대 서열번호 134의 잔기 Ile195 내지 Lys448)을 함유하는데, 이는 촉매 트라이어드(예컨대 서열번호 134의 His236, Asp282, 및 Ser379, 및 키모트립신 넘버링에 의해 His57, Asp102, 및 Ser195에 상응하는)을 갖는 세린 프로테아제 도메인을 함유한다. 지모겐 형태는 일반적으로 불활성이고 활성화 펩티드 분절을 제거하는 촉매적 절단에 의해 활성 폴리펩티드로 전환될 수 있다. 지모겐은, 따라서, 활성화제(activator)의 작용에 의해 단백분해 효소로 전환되는 효소적 불활성 단백질이다.
본원에서 사용된, 활성화 펩티드(activation peptide)는 촉매적 기구를 차폐함으로써 단백분해 활성을 억압하는 기능을 하여 촉매적 중간산물의 형성을 방지하는(즉, 기질 결합 부위를 구조적으로 폐쇄함으로써) FX 중쇄의 N-말단에 존재하는 분절을 의미한다. FX 활성화 펩티드의 예는 서열번호 134에서 아미노산 잔기 Ser143 내지 Arg194에 상응하는 성숙 FX 폴리펩티드의 중쇄의 N-말단에서 52 아미노산 잔기 활성화 펩티드이다.
본원에서 사용된, 변형된 활성화 펩티드(modified activation peptide)는 예를 들어 비변형 인자 X 폴리펩티드 또는 천연 인자 X 폴리펩티드의 활성화 펩티드와 비교하여 1 이상의 아미노산 차이의 존재로 인해, FX 폴리펩티드에 천연의 것이 아닌 활성화 펩티드를 의미한다. 1 이상의 아미노산 차이는 1 이상의 아미노산 치환(대체), 삽입 또는 결실과 같은 아미노산 돌연변이일 수 있거나, 삽입 또는 결실, 및 이의 임의의 조합일 수 있다. 예를 들어, 변형된 활성화 펩티드는 비변형 또는 천연 FX 폴리펩티드의 활성화 펩티드와 비교하여(예컨대 서열번호 134에서 Ser143 내지 Arg194로 기재되는 아미노산의 서열과 비교하여) 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50 또는 그 이상의 아미노산 차이를 가질 수 있는 것이다. 아미노산 변형의 예는 비변형 또는 천연(예컨대 야생형) FX 폴리펩티드에 존재하지 않는 프로테아제 가공 부위를 야기하는 변형이다. 예를 들어, 변형은 다른 프로테아제로부터 이종성 활성화 펩티드와 천연 또는 야생형 FX 폴리펩티드의 치환을 포함한다.
본원에서 사용된, 변형 활성화 펩티드를 함유하지 않는 변형 FX 폴리펩티드에 대한 언급은 상기 폴리펩티드의 활성화 펩티드가 비변형 인자 X 폴리펩티드 또는 천연 인자 X 폴리펩티드의 활성화 펩티드와 비교하여 상이하지 않음을 의미한다. 예를 들어, 변형 FX 폴리펩티드가 활성화 펩티드를 포함하는 구현예에서, 변형 FX 폴리펩티드는 천연 또는 야생형 활성화 펩티드를 함유한다. 따라서, 본원에서 변형 활성화 펩티드를 함유하지 않는 변형 FX 폴리펩티드에 대한 언급은 거기에서 변형(예컨대 아미노산 치환)이 경쇄에 있거나 중쇄의 프로테아제 도메인에만 있고, 전형적으로 중쇄의 프로테아제 도메인에만 있음을 의미한다.
본원에서 사용된, 활성 FX(active FX)(FXa) 또는 활성화 FX(activated FX)는 중쇄가 N-말단 활성화 펩티드를 함유하지 않는 FX 폴리펩티드의 이중쇄 형을 의미한다. FXa는 활성화 펩티드를 제거하는 중쇄의 절단에 의해 활성화된다. 따라서, FXa는 이황화 결합에 의해 결합된 2개 쇄로 구성된 이형이량체이다. 인간 FX에 있어서, 경쇄는 약 16,000 달톤의 분자량을 갖고 서열번호 134의 아미노산 1-139의 서열로 구성되고, 중쇄는 약 38,000 달톤의 분자량을 갖고 세린 프로테아제 도메인을 구성하는 아미노산 잔기 Ile195 내지 Lys448로 구성된다. FX의 활성화는 활성화 펩티드를 방출하는 Arg194-Ile195 결합의 절단에 의해 일어난다. 활성화는 외인성 인자 X 효소 복합체(Factor Xase complex)(인자 Ⅶa/TF 복합체) 또는 외인성 인자 X 효소 복합체(FIXa/FⅧa 복합체)에 의해 달성된다. 활성화는 일반적으로 인지질 및 칼슘 이온의 존재를 요구한다. 활성화는 또한 러셀 살모사 독(Russel's viper venom, RVV-X)에 의해 달성될 수 있다. FXa는 촉매적 활성, FVa 결합, 헤파린 결합, 프로트롬빈 결합, 프로트롬빈분해효소 활성 및/또는 응고 활성을 나타낸다. 본원의 목적을 위해, FXa의 언급은 활성화 펩티드를 결여하는 임의의 FX 이중쇄 형으로서 촉매적 활성, FVa 결합, 헤파린 결합, 프로트롬빈 결합, 프로트롬빈분해효소 활성 및/또는 응고 활성과 같은 FXa 활성을 나타낼 수 있는 임의의 FX 이중쇄 형을 의미한다. 따라서, FXa에 대한 언급은 FVa의 포화 농도의 존재에서 FXa 활성을 나타내는 지모겐-유사 FXa 폴리펩티드를 포함한다.
본원에서 사용된, FXa 폴리펩티드의 "촉매적 활성 부분(catalytically active portion)"은 촉매적 트라이어드 잔기(예컨대 서열번호 134의 His236, Asp282, 및 Ser379, 및 키모트립신 넘버링에 의해 His57, Asp102, 및 Ser195에 상응하는)를 포함하는 중쇄의 아미노산의 인접한 부분을 함유하나, 서열번호 134의 아미노산 잔기 Ile195 내지 Lys448에 상응하는 중쇄의 전체-서열을 포함하지 않는 활성 FXa 폴리펩티드를 의미한다. 촉매적 활성 부분은 FXa의 경쇄의 전부 또는 일부를 함유할 수 있다. FXa 폴리펩티드의 촉매적 활성 부분은 전장 FXa와 비교하여 활성의 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 이상, 예컨대 활성의 적어도 120%, 130%, 140%, 150%, 200%, 300%, 400%, 500% 또는 그 이상을 나타낸다. 변형 FXa 또는 이의 촉매적 활성 부분에 대한 언급은 촉매적 활성 부분이 변형(들)(예컨대 아미노산 치환(들))을 함유함을 의미한다는 것이 이해된다.
본원에서 사용된, 러셀 살모사 독(Russell's viper venom)(RVV-X)은 인자 X를 특이적으로 활성화시키는 Vipera russelli(러셀 살모사)의 독 메탈로프로테아제(metalloprotease)를 의미한다(Takeya et al. (1992) J Biol Chem., 267:14109-14117. RVV-X는 약 79,000 달톤의 분자량을 갖고 이황화 결합된 중쇄 및 경쇄를 함유한다. RVV-X는 인자 X 활성화를 위해 인지질을 요구하지 않으나, 향상된 활성화를 위해 외인성 Ca2+ 및 아미노 말단 Gla 도메인의 존재를 요구한다. RVV-X의 활성은 EDTA의 존재에서 저해된다. 뱀 독의 정제된 제조는 알려져 있고 이용가능하며(예컨대 카탈로그 번호 RVVX-2010, Haematologic Technologies, Inc.; 카탈로그 번호 ab62233; Abcam, Cambridge, MA), 그 서열이 알려져 있다(예컨대 Takeya et al. (1992) J Biol. Chem., 267:14109-14117 및 Uniprot No. Q7LZ61, Q4PRD1 및 Q4PRD2 참조).
본원에 사용된 "지모겐-유사(zymogen-like)" 단백질 또는 폴리펩티드는 단백분해 절단에 의해 활성화되지만, 보조인자의 부재에서는 지모겐과 관련된 성질, 예컨대 낮은 활성 또는 무활성, 또는 이 단백질의 지모겐 형태의 구조 또는 야기되는 활성을 닮은 구조 또는 야기되는 활성을 여전히 나타내는 단백질을 의미한다. 예를 들어, 본원에서 제공되는 변형 FXa 폴리펩티드에 있어서, FVa 공동-인자에 결합되어 있지 않을 때, FXa의 이중쇄 활성화 형태는 지모겐-유사 단백질이고; 이는 매우 낮은 활성을 나타낸다. FVa에 결합시, FXa의 이중쇄 활성화 형태는 구조적 변화 또는 "구조적 평형(conformational equilibrium)"으로의 이동을 거치며 응고 인자로서 완전한 활성을 획득한다.
본원에 사용된, FX에 관한 "야생형(wild-type)" 또는 "천연(native)"은 자연계에서 인간 및 기타 동물을 포함하는 유기체 내에 존재하는 대립유전자 변이체를 포함하는, 천연 또는 천연적으로 발생하는 FX 유전자에 의해 암호화되는 FX 폴리펩티드를 의미한다. 야생형 또는 천연 FXa 폴리펩티드에 대해 언급되는 경우, 이는 FXa 폴리펩티드의 활성 또는 촉매적 활성 부분으로 이해된다. 종에 대한 언급 없이 야생형 인자 X에 대한 언급은 모든 종의 야생형 인자 X를 포함시키고자 의도된다. 야생형 FX 폴리펩티드 중에는 암호화된 전구체 폴리펩티드, 이의 단편, 및 이의 가공된 형태, 예컨대 신호 펩티드가 없는 성숙 형태뿐만 아니라 이의 임의의 번역 전 또는 번역 후 가공된 또는 변형된 형태가 포함된다. 또한, 천연 FX 폴리펩티드 중에는 글리코실화, 카복실화 및 히드록실화에 의한 변형을 포함하나, 이에 제한되지 않는 변형에 의해 번역후 변형된 형태가 포함된다. 천연 FX 폴리펩티드는 또한 지모겐 및 활성형 뿐 아니라 이의 임의의 가공된 형태 또는 동형 단백질을 포함하는, 이중쇄 분비형을 포함한다. 예를 들어, 인간은 천연 FX를 발현한다. 야생형 인간 FX의 아미노산 서열은 서열번호 2로 기재되며, 본원에서 기술된 바와 같이 이의 성숙, 지모겐, 활성 및 촉매적 활성형, 및 서열번호 547-552로 기재되는 종 변이체 및 이의 성숙, 지모겐, 활성 및 촉매적 활성형을 포함한다. 북부 흰뺨 긴팔원숭이(서열번호 393으로 기재되는 전구체 프리프로펩티드 및 서열번호 404로 기재되는 성숙형), 올리브 개코원숭이(서열번호 394로 기재되는 전구체 프리프로펩티드 및 서열번호 405로 기재되는 성숙형), 레서스 원숭이(서열번호 395로 기재되는 전구체 프리프로펩티드 및 서열번호 406으로 기재되는 성숙형), 더스키 티티 원숭이(서열번호 396으로 기재되는 전구체 프리프로펩티드 및 서열번호 407로 기재되는 성숙형), 아프리카 코끼리(서열번호 397로 기재되는 전구체 프리프로펩티드 및 서열번호 408로 기재되는 성숙형), 마우스(서열번호 398로 기재되는 전구체 프리프로펩티드 및 서열번호 409로 기재되는 성숙형), 토끼(서열번호 399로 기재되는 전구체 프리프로펩티드 및 서열번호 410으로 기재되는 성숙형), 랫트(서열번호 400으로 기재되는 전구체 프리프로펩티드 및 서열번호 411로 기재되는 성숙형), 개(서열번호 401로 기재되는 전구체 프리프로펩티드 및 서열번호 412로 기재되는 성숙형), 돼지(서열번호 402로 기재되는 전구체 프리프로펩티드 및 서열번호 413으로 기재되는 성숙형), 및 소(서열번호 403으로 기재되는 전구체 프리프로펩티드 및 서열번호 414로 기재되는 성숙형).
본원에 사용된, 종 변이체(species variants)는 마우스 및 인간과 같이 다른 포유류 종을 포함하는 다른 종들 중의 폴리펩티드 변이체를 의미한다.
본원에 사용된, 대립유전자 변이체(allelic variants)는 동일 종의 구성원들 간에 단백질 변형을 의미한다.
본원에 사용된, 스플라이스 변이체(splice variant)는 1종이 넘는 mRNA를 야기하는 게놈 DNA의 1차 전사체의 차등 가공에 의해 생성된 변이체를 의미한다.
본원에서 사용된, 상응하는 잔기들(corresponding residues)은 정렬된 위치에서 발생하는 잔기들을 의미한다. 관련된 또는 변이체 폴리펩티드는 당업자에게 알려진 임의의 방법에 의해 정렬된다. 이러한 방법은 전형적으로 매치(match)를 극대화하며, 수동적 정렬을 사용하는 방법 및 이용가능한 다수의 정렬 프로그램(예를 들어, BLASTP)을 사용하는 방법 및 기타 당업자에게 알려진 방법을 포함한다. FX 폴리펩티드의 서열을 정렬함으로써, 당업자는 가이드로서 보존되고 동일한 아미노산 잔기를 사용하여 상응하는 잔기를 확인할 수 있다. 일반적으로, 폴리펩티드의 아미노산이 공개된 서열에서의 아미노산에 상응한다는 설명은 표준 정렬 알고리즘, 예컨대 GAP 알고리즘을 사용하여 상동적 또는 상동성(보존된 아미노산이 정렬된 경우에)을 최대화하는 공개된 서열과 상기 폴리펩티드의 정렬에 있어서 확인된 아미노산을 의미한다. 예를 들어, 도 3에 나타난 정렬에 대하여, 서열번호 134로 기재되는 성숙 인간 FX의 경쇄에서 아미노산 잔기 His8은 서열번호 404로 기재되는 흰뺨 개코원숭이에서 Asn8에 상응한다. 다른 예에서, 서열번호 134로 기재되는 성숙 인간 FX의 중쇄에서 Asp164는 서열번호 411로 기재되는 랫트 FX에서 Asp161에 상응한다.
본원에 사용된, 도메인(domain)(전형적으로 3개 이상, 일반적으로 5개 또는 7개 또는 그 이상의 아미노산의 서열)은 분자의 다른 부분과 구조적 및/또는 기능적으로 구별되고 식별할 수 있는, 단백질 또는 암호화 핵산과 같은 분자의 일부를 의미한다. 예를 들어, 도메인은 하나 이상의 구조적 모티프로 구성된 단백질 내에서 독립적으로 주름진 구조를 형성할 수 있고/있거나 단백분해 활성과 같은 기능적 활성에 의거하여 인식되는 폴리펩티드의 부분을 포함한다. 단백질은 하나 또는 하나보다 많은 구별되는 도메인을 보유할 수 있다. 예를 들어, 도메인은 이 안의 서열과 관련 패밀리 구성원과의 상동성, 예컨대 프로테아제 도메인 또는 gla 도메인을 정의하는 모티프와의 상동성을 통해 확인하거나, 정의하거나 또는 구별할 수 있다. 다른 예에 따르면, 도메인은 기능에 따라, 예컨대 단백분해 활성, 또는 생체분자와의 상호작용 능력, 예컨대 DNA 결합, 리간드 결합 및 이량체화 등에 따라 구별될 수 있다. 도메인은 독립적으로 생물학적 기능이나 활성을 나타낼 수 있어, 이 도메인 단독으로 또는 다른 분자와 융합되어 단백분해 활성 또는 리간드 결합 등과 같은 활성을 수행할 수 있다. 도메인은 아미노산의 선형 서열 또는 아미노산의 비선형 서열일 수 있다. 많은 폴리펩티드는 복수의 도메인을 함유한다. 이러한 도메인은 공지되어 있고 당업자에 의해 확인될 수 있다. 본 발명의 예증을 위해, 정의들이 제공되지만, 명칭으로 특정 도메인을 인식하는 것은 당해 기술분야에 공지된 것임을 잘 알고 있을 것이다. 필요하면, 도메인의 확인을 위해 적당한 소프트웨어를 이용할 수 있다.
본원에 사용된, 프로테아제 도메인(protease domain) 또는 촉매적 활성 도메인(protease domain or a catalytically active domain)은 촉매적 활성을 부여하는 도메인이다. 프로테아제의 프로테아제 도메인에 대한 언급은 임의의 이 단백질들의 단일쇄, 이중쇄 및 다중쇄 형태를 포함한다. 단백질의 프로테아제 도메인은 단백분해 활성에 필요한 상기 단백질의 모든 필수 성질, 예컨대 촉매 중심을 함유한다. FX와 관련하여, 프로테아제 도메인은 키모트립신/트립신 패밀리 프로테아제 도메인들과 상동성 및 구조적 특징, 예컨대 촉매 트라이어드를 공유한다. 예를 들어, 서열번호 134로 기재되는 FX 폴리펩티드에서, 서열번호 134의 아미노산 위치 Ile195 내지 Lys448로 기재되는 아미노산 위치에 상응하는 프로테아제 도메인은 촉매 트라이어드 잔기(예컨대 서열번호 134의 His236, Asp282, 및 Ser379, 및 키모트립신 넘버링에 의해 His57, Asp102, 및 Ser195에 상응하는)을 포함한다.
본원에 사용된, 감마-카복시글루타메이트(gamma-carboxyglutamate)(Gla) 도메인은 비타민 K 의존적 단백질과 같은 단백질의 부분을 의미하는 것으로서, 이 부분은 모든 글루타메이트 잔기가 그런 것은 아니지만, 일반적으로 대부분의 글루타메이트 잔기가 비타민 K 의존적 카복실화에 의해 Gla를 형성하는 글루타메이트 잔기의 번역후 변형을 함유한다. Gla 도메인은 칼슘 이온의 고친화도 결합 및 음하전성 인지질에 대한 결합을 담당한다. 전형적으로, Gla 도메인은 비타민 K 의존적 단백질의 성숙 형태의 N-말단 끝에서 시작해서 보존된 방향족 잔기로 끝난다. 이중쇄의 절단시, Gla 도메인은 경쇄 내에 있다. 성숙 FX 폴리펩티드에서 Gla 도메인은 서열번호 134로 기재되는 예시적 폴리펩티드의 아미노산 위치 1 내지 39에 상응한다. Gla 도메인은 잘 알려져 있고, 이들의 유전자좌는 특정 폴리펩티드에서 확인할 수 있다. 다양한 비타민 K 의존적 단백질의 Gla 도메인은 서열, 구조적 및 기능성 상동성을 공유하는데, 그 예로는 세포 표면 막에 존재하는 음하전성 인지질과 상호작용을 매개하는 소수성 패치로의 N-말단 소수성 잔기의 클러스터링이 있다. 다른 Gla 함유 폴리펩티드의 예로는 FⅦ, FX, 프로트롬빈, 단백질 C, 단백질 S, 오스테오칼신, 기질 Gla 단백질, 성장-정지-특이적 단백질 6(Gas6) 및 단백질 Z를 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원에 사용된, 상피성장인자(epidermal growth factor)(EGF) 도메인(EGF-1 또는 EGF-2)은 상피성장인자(EGF) 서열의 특정 30 내지 40 아미노산 부분과 서열 상동성을 공유하는 단백질의 부분을 의미한다. EGF 도메인은 이황화 결합에 관여하는 것으로 밝혀진(EGF에서) 6개의 시스테인 잔기를 포함한다. EGF 도메인의 주요 구조는 이본쇄 베타 시트와 그 다음 C-말단 짧은 이본쇄 시트까지의 루프이다. FX는 2개의 EGF 도메인: EGF-1 및 EGF-2를 함유한다. 이 도메인들은 서열번호 134로 기재되는 성숙 FX 폴리펩티드의 아미노산 위치 46-84, 및 85-128에 각각 상응한다. 이중쇄로 절단될 때, EGF 도메인은 경쇄에 있다.
본원에 사용된, "비변형 폴리펩티드(unmodified polypeptide)" 또는 "비변형 FX(unmodified FX)" 및 이의 문법적 변형어들은 본원에 제공된 변형을 위해 선택된 출발 폴리펩티드를 의미한다. 출발 폴리펩티드는 폴리펩티드의 천연 발생의, 야생형일 수 있다. 예시적인 비변형 FX 폴리펩티드는 서열번호 134로 기재되는 인간 FX, 및 이의 지모겐 또는 FXa 이중쇄 형이다. 또한, 출발 폴리펩티드는 천연 야생형 동형단백질과 상이하게 변경 또는 변이될 수 있지만, 그럼에도 불구하고 본원에서 생산되는 후속 변형된 폴리펩티드에 상대적으로 출발 비변형 폴리펩티드라고 지칭된다. 따라서, 비변형 참조 단백질에 비해 특정 활성이나 성질의 희망되는 증가 또는 감소를 갖도록 변형된 당업계에 공지된 기존 단백질들은 출발 비변형 폴리펩티드로 선택되어 사용될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 단일 아미노산 변화에 의해 천연 형태로부터 변형되어, 글리코실화의 변경을 위한 아미노산 잔기 또는 잔기들의 변화와 같이 목적 성질의 증가 또는 감소를 갖고 있는 단백질은 동일한 성질 또는 다른 성질을 추가 변형시키기 위한, 본원에서 비변형으로 불리기도 하는 표적 단백질일 수 있다.
본원에 사용된, "변형 인자 X 폴리펩티드(modified factor X polypeptides)" 및 "변형 인자 X(modified factor X)"는 비변형 인자 X 폴리펩티드와 비교했을 때 하나 이상의 아미노산 차이를 보유하는 FX 폴리펩티드를 의미한다. 하나 이상의 아미노산 차이는 하나 이상의 아미노산치환(대체), 삽입 또는 결실과 같은 아미노산 돌연변이이거나, 또는 전체 도메인의 삽입 또는 결실일 수 있고, 이의 임의의 조합일 수 있다. 전형적으로, 변형 FX 폴리펩티드는 비변형 FX 폴리펩티드와 비교하여 1차 서열에 하나 이상의 변형을 갖는다. 예를 들어, 본원에 제공된 변형 FX 폴리펩티드는 비변형 FX 폴리펩티드와 비교했을 때 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50개 이상의 아미노산 차이를 가질 수 있다. 임의의 변형은 야기되는 폴리펩티드가 천연 FX 폴리펩티드와 관련된 적어도 하나의 FX 활성, 예컨대 촉매적 활성, 단백분해 활성, 프로트롬보틱 활성(prothrombotic activity) 또는 응고 활성을 나타내는 한 고려된다.
본원에서 사용된, FX 폴리펩티드의 "성질(property)"은 물리적 또는 구조적 성질, 예컨대 삼차원 구조, pI, 반감기, 구조 및 기타 이러한 물리적 특성을 의미한다.
본원에 사용된, FX 폴리펩티드의 "활성(activity)" 또는 "FX 활성" 또는 "FXa 활성"은 활성 인자 Xa 형태에 의해 나타나는 임의의 활성을 의미한다. 이러한 활성은 시험관내 및/또는 생체내에서 시험될 수 있고, 응고 또는 응고 활성, 응고촉진 활성, 단백분해 또는 촉매적 활성, 예컨대 인자 X(FX) 활성화 또는 제IX 인자(FIX) 활성화의 실시를 위한 활성; 항원성(항-FX 항체에 결합하는 능력 또는 항-FX 항체에 결합하기 위해 폴리펩티드와 경쟁하는 능력); FVa에 결합하는 능력, 프로트롬빈, 헤파린 및/또는 인지질에 결합하는 능력을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 활성은 공인된 검정을 사용해서 시험관내 또는 생체내에서 평가할 수 있으며, 그 예로는 시험관내 또는 생체내에서의 응고 측정이 있다. 이러한 검정의 결과는 폴리펩티드가 생체내 폴리펩티드의 활성과 상관성이 있을 수 있는 활성을 나타낸다는 것을 시사하며, 여기서 생체내 활성은 생물학적 활성으로 언급될 수도 있다. FX의 변형 형태의 기능성 또는 활성을 측정하는 검정은 당업자에게 공지되어 있다. FX 폴리펩티드의 활성을 평가하는 검정의 예로는 응고 활성을 평가하는 프로트롬보플라스틴 시간(PT) 검정 또는 활성화된 부분 트롬보플라스틴 시간(aPTT) 검정, 또는 합성 기질을 사용하는 발색원성 검정이 포함된다.
본원에 사용된, "적어도 하나의 활성을 나타낸다(exhibits at least one activity)" 또는 "적어도 하나의 활성을 유지한다(retains at least one activity)"는 동일한 조건 하에 동일한 형태의 비변형 FX 폴리펩티드와 비교했을 때 변형 FX 폴리펩티드가 나타내는 FX 활성을 의미한다. 일반적으로, 활성은 폴리펩티드의 FXa 형, 또는 이의 촉매적 활성 부분의 활성이다. 예를 들어, 이중쇄 형태의 변형 FXa 폴리펩티드는 이중쇄 형태의 비변형 FXa 폴리펩티드와 동일한 조건 하에 비교되고, 여기서 두 폴리펩티드 간에 유일한 차이는 연구 중인 변형이다. 전형적으로, 동일한 형태의 비변형 FX 폴리펩티드의 적어도 하나의 활성을 유지하거나 나타내는 변형 FX 폴리펩티드는, 변형 FX 폴리펩티드가 생체내 투여되었을 때 응고촉진 치료제로서 치료적으로 효과적일 정도로 충분한 양의 활성을 유지한다. 변형 FX 폴리펩티드는 동일한 형태의 비변형 FX 폴리펩티드와 비교하여 증가 또는 감소된 활성을 나타낼 수 있다. 일반적으로, 변형 FX 폴리펩티드가, 유지되는 활성의 양이, 응혈원으로서 치료 효능을 나타내는 동일한 형태의 비변형 FX 폴리펩티드의 활성의 적어도 약 0.5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% 이상을 나타내는 경우, 활성을 나타낸다. 응혈원으로서 치료 효능을 유지하는데 필요한 활성의 양은 필요하다면 실험적으로 측정될 수 있다. 전형적으로 활성의 0.5% 내지 20%, 0.5% 내지 10%, 0.5% 내지 5%의 유지는 생체내 응혈원으로서 치료 효능을 유지하는데 충분하다. 유지되어야 할 특정 수준은 폴리펩티드의 의도된 용도의 함수이며 경험적으로 결정될 수 있다. 활성은 예를 들어 본원 또는 하기 실시예에서 기술된 것과 같은 시험관내 또는 생체내 검정을 사용하여 측정될 수 있다.
본원에 사용된, FX에 관한 "촉매적 활성(catalytic activity)" 또는 "단백분해 활성(proteolytic activity)"은 기질의 단백분해 절단을 촉매하는 FXa 형, 또는 이의 촉매적 활성 부분의 능력을 의미한다. 이러한 활성을 평가하기 위한 검정들이 당업계에 알려져 있다. 기질과 안정한 아실-효소 중간체를 모니터링 또는 평가하는 검정을 포함하는 검정, 촉매적 활성과 상관관계가 있는 FXa의 저해제에 대한 결합을 평가하는 검정 및 FXa 기질(예컨대 프로트롬빈) 또는 합성 기질의 절단을 직접적으로 평가하는 검정을 포함한다. 예를 들어, FX의 단백분해 활성은 형광-모노-p'-구아니디노벤조에이트(fluorescein-mono-p '-guanidinobenzoate, FMGB) 또는 Spectrozyme FXa(메톡시카보닐-D-사이클로헥실-글리실-아르기닌-파라-니트로아닐라이드 아세테이트(Methoxycarbonyl-D-cyclohexyl-glycyl-arginine-para-nitroanilide acetate))와 같은 발색성 또는 형광 기질을 사용하여, 또는 에코틴(ecotin)과 같은 밀접-결합 가역적 억제제 또는 FXa 기질 프로트롬빈을 사용하여 측정할 수 있다. 촉매적 활성의 평가는 직접적 또는 간접적일 수 있다. 예를 들어, 촉매적 활성은 본원의 실시예 4에서 예시된 바와 같이 FXa 기질의 하류 활성의 절단을 모니터링함으로써 평가될 수 있고 이로써 활성화 트롬빈의 그것의 합성 기질인 Pefafluor TH(H-D-CHA-Ala-Arg-AMC)에 대한 활성이 모니터링된다. 예시적인 검정은 실시예에서 기술된다. 촉매적 활성을 평가하기 위한 검정은 FVa의 존재 또는 부재 및 또한 인지질 또는 Ca2+의 존재 또는 부재에서 수행될 수 있다. 촉매적 활성은 촉매적 효능 또는 kcat/km으로서 표현될 수 있는데, 이는 프로테아제가 기질을 절단하는 효능의 척도이고 당업계에 잘 알려진 바와 같이 정상 상태(steady state) 하에서 측정된다.
본원에서 사용된, "응고 활성(coagulation activity)" 또는 "응고 활성(coagulant activity)" 또는 "응혈원 활성(procoagulant activity)"은 응고를 달성하는 폴리펩티드의 능력을 의미한다. 응고 활성을 평가하는 검정은 당업자에게 공지되어 있고, 프로트롬보플라스틴 시간(PT) 검정 또는 활성화된 부분 트롬보플라스틴 시간(aPTT) 검정을 포함한다.
본원에서 사용된, 프로트롬빈분해효소 활성(prothrombinase activity)은 기질 프로트롬빈에 대한 특이적 촉매적 활성을 의미하고 프로트롬빈(인자 Ⅱ)를 트롬빈(인자 Ⅱa)로 전환하는 활성이다. 상기 활성은 직접적으로, 예를 들어 SDS-PAGE로 검출된 절단 반응의 산물의 단백질 분석에 의해 평가될 수 있다. 활성은 또한 합성 기질을 사용하여 평가되어 발색원성 또는 형광원적-방출된 모이어티가 절단시 모니터링된다. 활성은 또한 그것의 기질 또는 합성 기질(예컨대 Pefafluor TH(H-D-CHA-Ala-Arg-AMC)에 대한 트롬빈의 활성을 모니터링함으로써 간접적으로 평가될 수 있다. 프로트롬빈분해효소 활성을 평가하기 위한 검정은 FVa의 존재 또는 부재에서 그리고 또한 인지질 또는 Ca2+의 존재 또는 부재에서 수행될 수 있다.
본원에 사용된 "응고 저해제(inhibitors of coagulation)"는 응고 또는 응괴 형성을 저해하거나 방지하는 작용을 하는 단백질 또는 분자를 의미한다. 응고의 저해 또는 방지는 생체내 또는 시험관내에서 관찰될 수 있고, 프로트롬보플라스틴 시간(PT) 검정 또는 활성화된 부분 트롬보플라스틴 시간(aPTT) 검정을 포함한, 이에 제한되지 않는 당업계에 공지된 모든 방법에 의해 분석될 수 있다.
본원에 사용된, "항트롬빈 Ⅲ(antithrombin Ⅲ)AT 또는 AT-Ⅲ)"는 세린 프로테아제 저해제(서핀(serpin))이다. AT-Ⅲ은 464개 아미노산 잔기를 함유하는 전구체 단백질(서열번호 553)로서 합성되고 분비되는 동안 절단되어 432 아미노산의 성숙 항트롬빈(서열번호 554)을 방출한다.
본원에서 사용된, "AT-Ⅲ의 저해 효과(inhibitory effect of AT-Ⅲ)" 또는 "AT-Ⅲ에 의한 저해(inhibition by AT-Ⅲ)"는 FX 폴리펩티드의 FXa 형, 또는 이의 촉매적 활성 또는 지모겐-유사 형의 촉매 또는 응고 활성을 저해하는 항트롬빈 Ⅲ(AT 또는 AT-Ⅲ)의 능력을 의미한다. AT-Ⅲ에 의한 저해는 FX 폴리펩티드 또는 변형 FX 폴리펩티드의 저해제에 대한 결합을 평가함으로써 검정될 수 있다. 폴리펩티드의 저해제에 대한 결합을 결정하는 검정은 당업계에 알려져 있다. 또한, 예를 들어 BIAcore 바이오센서 장치와 같은 표면 플라스몬 공명이 또한 AT-Ⅲ 또는 기타 저해제에 대한 FX 폴리펩티드의 결합을 측정하는 데 사용될 수 있다. 그러나, AT-Ⅲ와 같은 공유적 저해제에 대해, 온-속도(on-rate)만이 BIAcore를 사용하여 측정될 수 있다. 공유적 저해제, 예컨대 예를 들어 AT-Ⅲ에 대해, 온-속도만이 BIAcore를 사용하여 측정될 수 있다. 저해 활성은 또한 AT-Ⅲ의 존재에서 FXa의 촉매적 활성 또는 응고 활성을 평가함으로써 평가될 수 있다. 공유적 저해제, 예컨대 예를 들어 AT-Ⅲ에 대해서, 저해에 대한 2차속도 상수가 또한 측정될 수 있다. 예를 들어, AT-Ⅲ에 의한 저해는 또한 FXa의 저해에 대한 2차 속도 상수(K app)를 결정함으로써 평가될 수 있다. 저해 반응은 일반적으로 헤파린의 존재에서 수행되는데, 헤파린은 AT-Ⅲ의 완전한 활성을 위해 요구된다. 예를 들어, 일반적으로 AT-Ⅲ는 그것의 K0.5(즉, FXa의 촉매적 활성의 50% 저해를 위해 요구되는 AT-Ⅲ의 몰농도)가 80 nM 미만, 일반적으로 70 nM, 60 nM, 50 nM, 40 nM, 30 nM, 20 nM, 10 nM, 9 nM, 8 nM, 7 nM, 6 nM, 5 nM, 4 nM, 3 nM, 2 nM 또는 그 미만인 경우 저해 효과를 나타낸다. 예를 들어, AT-Ⅲ는 혈장 FXa 및 야생형 FXa가 나타내는 것에 대하여 약 2 nM의 K0.5를 나타낸다. 다른 예에서, AT-Ⅲ는 K app(M-1s-1 )이 1.0 x 106 초과, 일반적으로 2.0 x 106, 3.0 x 106, 4.0 x 106, 5.0 x 106, 6.0 x 106, 7.0 x 106, 8.0 x 106, 9.0 x 106, 1.0 x 107, 2.0 x 107, 또는 그 이상을 초과하는 경우 저해 효과를 나타낸다. 예를 들어, AT-Ⅲ는 혈장 FXa 및 야생헝 FXa 각각에 대해 약 1.4 x 107 및 9.7 X 106의 K app를 나타낸다.
본원에 사용된, 저해제에 대한 내성 증가, 예컨대 "AT-Ⅲ에 대한 내성 증가(increased resistance to AT-Ⅲ)" 또는 "TFPI에 대한 내성 증가(increased resistance to TFPI)"는 비변형 FX 폴리펩티드와 같은 참조 폴리펩티드에 비해 AT-Ⅲ, TFPI 또는 기타 저해제의 저해 효과에 대한 폴리펩티드의 감소된 감수성의 임의의 양을 의미한다. 저해제, 예컨대 AT-Ⅲ, TFPI의 변형 FX 폴리펩티드에 대한 저해 효과를 결정하기 위한 검정은 저해제(예컨대 AT-Ⅲ 또는 TFPI)의 존재에서 수행될 수 있으며 동일한 저해제(예컨대 AT-Ⅲ 또는 TFPI)의 참조 또는 비변형 FX 폴리펩티드에 대한 저해 효과와 비교될 수 있다. 예를 들어, AT-Ⅲ의 존재 또는 부재에서 그것의 기질인 프로트롬빈을 절단하는 변형 FX 폴리펩티드의 능력이 측정될 수 있으며, AT-Ⅲ가 반응을 억제하는 정도가 결정될 수 있다. 이는 AT-Ⅲ의 존재 또는 부재에서 프로트롬빈을 절단하는 비변형 FX 폴리펩티드의 능력과 비교될 수 있다. 유사한 검정이 TFPI로 수행될 수 있다. 저해제에 대해 증가된 내성을 나타내는 변형 폴리펩티드는, 예를 들어, 비변형 폴리펩티드와 비교하여 저해제의 효과에 대해 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%,40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, 또는 그 이상의 내성의 증가를 나타낸다. 저해에 대한 내성은 변형 FX의 비변형 FX 폴리펩티드에 대한 저해 활성의 비율로서 결정될 수 있다. 예를 들어, K0.5가 결정되고 야생형 FXa와 비교하여 변형 FX 폴리펩티드의 저해제 내성(예컨대 AT-Ⅲ 또는 TFPI 내성)의 정도의 표현이 그들의 K0.5값(K0.5변이체/K0.5야생형)의 비율로서 표현된다. 1.0을 초과하는 비율은 변형 FX 폴리펩티드가 저해제(예컨대 AT-Ⅲ 또는 TFPI)에 대해 증가된 내성을 나타냄을 의미한다. 다른 예에서, K app가 결정될 수 있고 야생형 FXa와 비교하여 변형 FX 폴리펩티드의 저해제 내성(예컨대 AT-Ⅲ 또는 TFPI 내성)의 정도의 표현이 그들의 K app값(K app 야생형/K app 변이체)의 비율로서 표현된다. 1.0 초과의 비율은 변형 FX 폴리펩티드가 저해제, 예컨대 AT-Ⅲ 및/또는 TFPI에 대해 증가된 내성을 나타냄을 의미한다.
본원에서 사용된, 보조인자(cofactor)는 다른 특정 단백질 또는 분자에 결합하여 활성 복합체를 형성하는 단백질 또는 분자를 의미한다. 일부 예에서, 보조인자에 대한 결합은 최적 단백분해 활성을 위해 요구된다. 예를 들어, 인자 Va(FVa)는 FXa의 보조인자이다. FXa 또는 FXa의 지모겐-유사 형태의 FVa에 대한 결합은 FXa의 그것의 기질에 대한 증가된 단백분해 활성을 야기하는 구조적 변화를 유도한다.
본원에서 사용된, 인자 Va(FVa)는 FXa의 보조인자로서 기능하는 비효소적 활성 응고인자를 의미한다. 인자 V는 활성화 혈소판의 표면상의 트롬빈에 의해 활성화되어, 칼슘에 의해 비공유적으로 각각에 결합된 이중쇄 폴리펩티드인 FVa를 생산하는 단일쇄 폴리펩티드이다. FVa는 FXa에 결합하여 프로트롬빈분해효소 복합체를 형성하는데, 이 복합체는 인지질 및 Ca2+의 존재에서 프로트롬빈을 트롬빈으로 전환한다. 생체내에서, 이는 일반적으로 세포 표면상에서 일어난다. FVa는 FVa의 존재에서 트롬빈을 활성화하는 FXa의 활성이 크게 증가하기 때문에 FXa의 보조인자이다.
본원에서 사용된, "FVa-독립적 활성(FVa-independent activity)"은 FVa의 부재에서 FXa의 활성을 의미한다.
본원에서 사용된, "FVa-의존적 활성(FVa-dependent activity)"은 FVa의 존재에서 FXa의 활성을 의미한다.
본원에서 사용된, "보조인자 의존성(cofactor dependence)" 또는 "상대적 보조인자 의존성(relative cofactor dependence)"은 FVa의 부재와 비교하여 FVa의 존재에서 일어나는 FXa의 활성이 더 큰 것을 의미하며, FVa-독립적 활성에 대한 FVa-의존적 활성의 비율로서 표현될 수 있다. 일반적으로, FXa는 보조인자의 부재에서보다 보조인자의 존재에서 훨씬 더 큰 활성을 나타내므로, FXa의 완전한 활성은 보조인자의 존재에 의존적이다. 예를 들어, 활성 FXa와 그것의 활성화 보조인자인 FVa의 연합은 보조인자 부재와 비교하여 활성(예컨대, 촉매적 활성)의 2,000 배 초과 증가를 야기한다.
본원에서 사용된, 증가된 보조인자 의존성은 참조 폴리펩티드, 예컨대 비변형 FX 폴리펩티드와 비교하여 변형 FX 폴리펩티드의 증가된 보조인자 의존성의 임의의 양을 의미한다. 증가된 보조인자 의존성을 나타내는 변형 폴리펩티드는, 예를 들어 비변형 폴리펩티드와 비교하여 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% 또는 그 이상 증가된 보조인자에 대한 의존성을 나타낸다. 증가된 보조인자 의존성은 변형 FX 폴리펩티드의 참조 또는 변형(들)을 함유하지 않는 비변형 FX 폴리펩티드에 대한 비율로서 결정될 수 있다. 예를 들어, 변형 FX 폴리펩티드는 비변형 FX 폴리펩티드와 비교하여 적어도 1.5 배, 2 배, 3 배, 4 배, 5 배, 10 배, 20 배, 30 배, 40 배, 50 배, 60 배, 70 배, 80 배, 90 배, 100 배, 200 배, 300 배, 400 배, 500 배, 600 배, 700 배, 800 배, 900 배, 1000 배 또는 그 이상 증가된 보조인자 의존성을 나타내는 경우 증가된 보조인자 의존성을 나타낸다.
본원에서 사용된, 글리코실화 부위(glycosylation site)는 탄수화물 모이어티가 부착될 수 있는 폴리펩티드의 아미노산 부위를 의미한다. 전형적으로, 글리코실화 단백질은 탄수화물 모이어티의 부착을 위한, 1 이상의 아미노산 잔기, 예컨대 아스파라긴 또는 세린을 함유한다.
본원에 사용된, 천연 글리코실화 부위(native glycosylation site)는 야생형 폴리펩티드에서 탄수화물 잔기가 부착되는 아미노산의 위치를 의미한다. FX에는 4개의 천연 글리코실화 부위가 있다; 서열번호 134를 참고로 잔기 Thr159, Thr171, Asn181 및 Asn191에 상응하는 2개의 O-연결 및 2개의 N-연결 글리코실화 부위가 있다.
본원에 사용된, 비-천연 글리코실화 부위(non-native glycosylation site)는 야생형 폴리펩티드에는 없는 변형 폴리펩티드에서 탄수화물 모이어티가 부착되는 아미노산 위치를 의미한다. 비-천연 글리코실화 부위는 FX 폴리펩티드에 아미노산 치환에 의하여 도입될 수 있다. O-글리코실화 부위는 예를 들어, 세린 또는 트레오닌의 천연 잔기의 아미노산 치환에 의하여 만들어질 수 있다. N-글리코실화 부위는 예를 들어, Xaa가 프롤린이 아닌, Asn-Xaa-Ser/Thr/Cys 모티프 확립에 의하여 생성될 수 있다. 아미노산 변형에 의한 이러한 공통 서열의 생성은, 예를 들어, 천연 아미노산 잔기의 아스파라긴과 단일 아미노산 치환, 천연 아미노산 잔기의 세린, 트레오닌 또는 시스테인과 단일 아미노산 치환, 또는 천연 잔기의 아스파라긴과 제1 아미노산 치환 및 천연 잔기의 세린, 트레오닌 또는 시스테인과 제2 아미노산 치환과 관련된 이중 아미노산 치환이 관여될 수 있다.
본원에서 사용된, "글리코실화의 수준(level of glycosylation)"은, 예를 들어 글리코실화가 가능한 숙주 세포 내에서 발현에 있어서, 글리칸(glycan)에 의해 차지될 수 있는 다수의 글리코실화 부위를 의미한다.
본원에서 사용된, 글리코실화의 수준에 대한 증가는 비변형 또는 야생형 FX 폴리펩티드에 대하여 글리칸에 의해 차지될 수 있는 글리코실화 부위의 수가 더 큰 것을 의미한다. 비변형 또는 야생형 FX 폴리펩티드와 비교하여 글리칸에 의해 차지되는 글리코실화 부위의 수가 더 클때 증가된 수준의 글리코실화를 나타내는 변형 폴리펩티드는 과글리코실화된다.
본원에 사용된 "생물학적 활성(biological activity)"은 화합물, 조성물 또는 다른 혼합물의 생체내 투여 시에 야기되는 생리학적 반응 또는 화합물의 생체내 활성을 의미한다. 따라서, 생물학적 활성은 상기 화합물, 조성물 및 혼합물의 치료 효과 및 약학적 활성을 포함한다. 생물학적 활성은 이러한 활성을 시험하거나 사용하도록 설계된 시험관내 시스템에서 관찰할 수 있다. 따라서, 본 발명의 목적에서, FX 폴리펩티드의 생물학적 활성은 응고 활성을 포함한다.
본원에 사용된 "평가하는(assess)"이란 용어 및 이의 문법적 변형어는 폴리펩티드의 활성의 절대값을 수득한다는 점에서, 또한 활성의 수준을 시사하는 지수, 비율, 백분율, 시각적 또는 다른 값을 수득한다는 점에서 정량적 및 정성적 결정을 포함하는 것으로 의도된다. 평가는 직접적 또는 간접적 평가일 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드에 의한 기질의 절단 검출은 산물을 직접 측정하여 수행할 수도 있고, 또는 절단된 기질의 최종 활성을 결정하여 간접적으로 측정할 수도 있다.
본원에서 사용된, "성숙 넘버링(mature numbering)" 또는 "표준 넘버링(standard numbering)"은 성숙 FX 폴리펩티드에 기초한 순서로 잔기를 넘버링한 것을 의미한다. 본원의 목적을 위해, 성숙 넘버링은 서열번호 134로 기재되는 성숙 FX의 잔기의 넘버링에 기초한다.
본원에 사용된 "키모트립신 넘버링(chymotrypsin numbering)"은 서열번호 556의 성숙 키모트립신 폴리펩티드의 넘버링에 기초한 아미노산 잔기의 넘버링을 의미한다. 다른 세린 프로테아제의 프로테아제 도메인, 예를 들어 인자 X의 프로테아제 도메인의 정렬은 공통 세린 프로테아제의 구조의 3차원 모델링 및 겹침으로부터 유래된 서열 매칭 패턴에 기초한 키모트립신으로 수행된다(예컨대 Greer, J., Proteins Struct. Funct.Genet. 7 (1990) 317-334 참조). 이러한 예에서, 키모트립신의 아미노산에 상응하는 인자 X의 아미노산은 키모트립신 아미노산의 넘버링이 주어진다. 서열번호 134로 기재되는 FX 폴리펩티드의 중쇄의 프로테아제 도메인에 상응하는 아미노산 위치 195-448에 상응하는 키모트립신 넘버는 표 1에 제공된다. 서열번호 134로 기재되는 서열과 관련된 아미노산 위치는 정상 글자체로, 그러한 위치의 아미노산 잔기는 볼드체로, 그리고 상응하는 키모트립신 넘버는 이탤릭체로 기재된다. 예를 들어, 성숙 키모트립신(서열번호 556)과 성숙 인자 FX(서열번호 134)의 정렬에 있어서, 인자 X에서 아미노산 위치 195의 이소류신(I)은 I16의 키모트립신 넘버가 주어진다. 이어지는 아미노산은 그에 따라 넘버링된다. 어느 잔기가 프로테아제 내에 존재하나 키모트립신 내에는 존재하지 않는 경우, 그 아미노산 잔기는 문자 표시가 주어진다(예컨대 성숙 넘버링에 의한 잔기 330은 키모트립신 넘버링에 의해 잔기 146A이다).
표 1. 인자 X의 키모트립신 넘버링
195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209
I V G G Q E C K D G E C P W Q
16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30
210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224
A L L I N E E N E G F C G G T
31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45
225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239
I L S E F Y I L T A A H C L Y
46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60
240 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254
Q A K R F K V R V G D R N T E
61 61A 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 73A
255 256 257 258 259 260 261 262 263 264 265 266 267 268 269
Q E E G G E A V H E V E V V I
74 75 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89
270 271 272 273 274 275 276 277 278 279 280 281 282 283 284
K H N R F T K E T Y D F D I A
90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104
285 286 287 288 289 290 291 292 293 294 295 296 297 298 299
V L R L K T P I T F R M N V A
105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119
300 301 302 303 304 305 306 307 308 309 310 311 312 313 314
P A C L P E R D W A E S T L M
120 121 122 123 124 124A 125 126 127 128 129 129A 130 131 132
315 316 317 318 319 320 321 322 323 324 325 326 327 328 329
T Q K T G I V S G F G R T H E
133 133A 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146
330 331 332 333 334 335 336 337 338 339 340 341 342 343 344
K G R Q S T R L K M L E V P Y
146A 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162
345 346 347 348 349 350 351 352 353 354 355 356 357 358 359
V D R N S C K L S S S F I I T
163 164 165 166 167 168 169 170 172 173 174 175 176 177 178
360 361 362 363 364 365 366 367 368 369 370 371 372 373 374
Q N M F C A G Y D T K Q E D A
178A 179 180 181 182 183 184 185 185A 185B 186 187 188 189 190
375 376 377 378 379 380 381 382 383 384 385 386 387 388 389
C Q G D S G G P H V T R F K D
191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205
390 391 392 393 394 395 396 397 398 399 400 401 402 403 404
T Y F V T G I V S W G E G C A
206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 220 221
405 406 407 408 409 410 411 412 413 414 415 416 417 418 419
R K G K Y G I Y T K V T A F L
222 223 223A 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235
420 421 422 423 424 425 426 427 428 429 430 431 432 433 434
K W I D R S M K T R G L P K A
236 237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250
435 436 437 438 439 440 441 442 443 444 445 446 447 448
K S H A P E V I T S S P L K
251 252 253 254 255 256 257 258 259 260 261 262 263 264
본원에 사용된, 핵산(nucleic acids)은 DNA, RNA 및 이의 유사체, 예컨대 펩티드 핵산(PNA) 및 이의 혼합물을 포함한다. 핵산은 일본쇄 또는 이본쇄일 수 있다. 프로브 또는 프라이머에 관한 것일 때에는 일본쇄 분자로, 형광 또는 방사능표지와 같은 검출가능한 표지 등으로 경우에 따라 표지된다. 이러한 분자들의 길이는 전형적으로 이들의 표적이 라이브러리의 탐침 또는 프라이밍을 위한 통계적으로 고유한 수 또는 낮은 카피수(전형적으로 5 미만, 일반적으로 3 미만)일 정도의 길이이다. 일반적으로, 프로브 또는 프라이머는 당해의 유전자와 동일하거나 상보성인 서열의 적어도 14개, 16개 또는 30개의 인접한 뉴클레오티드를 함유한다. 프로브 및 프라이머는 10, 20, 30, 50, 100 또는 그 이상의 핵산 길이일 수 있다.
본원에 사용된, 펩티드(peptide)는 2 내지 40개 아미노산 길이인 폴리펩티드를 의미한다.
본원에 사용된, 여기에 제시된 다양한 아미노산 서열에서 나타나는 아미노산은 이들의 공지된 3문자 또는 1문자 약어(표 2)에 따라 확인된다. 다양한 핵산 단편에서 나타나는 뉴클레오티드는 당업계에 통상적으로 사용되는 표준 1문자 명칭으로 나타낸다.
본원에 사용된 "아미노산(amino acid)"은 아미노기와 카복시산기를 함유하는 유기 화합물이다. 폴리펩티드는 2개 이상의 아미노산을 함유한다. 본 발명의 목적에 있어서, 아미노산은 20개의 천연발생의 아미노산, 비천연 아미노산 및 아미노산 유사체(즉, α-탄소가 측쇄를 보유하는 아미노산)를 포함한다.
문헌[J.Biol.Chem., 243: 3557-3559(1968)]에 기술되고 37 C.F.R§§1.821-1.822에 채택된 표준 폴리펩티드 명명법을 준수하여, 아미노산 잔기의 약어는 표 2에 제시한 바와 같다:
기호
1문자 3문자 아미노산
Y Tyr 티로신
G Gly 글리신
F Phe 페닐알라닌
M Met 메티오닌
A Ala 알라닌
S Ser 세린
I Ile 이소류신
L Leu 류신
T Thr 트레오닌
V Val 발린
P Pro 프롤린
K Lys 라이신
H His 히스티딘
Q Gln 글루타민
E Glu 글루탐산
Z Glx Glu 및/또는 Gln
W Trp 트립토판
R Arg 아르기닌
D Asp 아스파르트산
N Asn 아스파라긴
B Asx Asn 및/또는 Asp
C Cys 시스테인
X Xaa 미지 또는 기타
본원에 상투적인 문구로 나타낸 아미노산 잔기의 모든 서열은 왼쪽에서 오른쪽 배향으로 통상적인 아미노-말단에서 카복시-말단 방향을 나타낸다. 또한, "아미노산 잔기(amino acid residue)"란 어구는 대응표(표 2)에 열거된 아미노산 및 본 발명에 참고인용된 37 C.F.R.§§1.821-1.822에 언급된 바와 같은 변형된 및 특이적 아미노산을 포함하는 것으로 광범위하게 정의된다. 더욱이, 아미노산 잔기 서열 중 시작이나 말단에 줄표(dash)는 하나 이상의 아미노산 잔기의 추가 서열에 대한 펩티드 결합 또는 NH2와 같은 아미노 말단 기 또는 COOH와 같은 카복시 말단 기에 대한 펩티드 결합을 나타낸다는 것을 유의해야 한다.
본원에 사용된 "소수성 아미노산(hydrophobic amino acid)"은 아이젠버그 소수성 컨센서스 스케일을 사용하여 소수성인 것으로 결정된 아미노산 중 어느 하나를 포함한다. 그 예로는 천연 발생의 소수성 아미노산, 예컨대 이소류신, 페닐알라닌, 발린, 류신, 트립토판, 메티오닌, 알라닌, 글리신, 시스테인 및 티로신(Eisenberg et al.,(1982) Faraday Symp. Chem. Soc. 17: 109-120)이 있다. 비-천연 발생의 소수성 아미노산도 포함된다.
본원에 사용된 "산성 아미노산(acidic amino acid)"은 천연 발생의 아미노산 중에서 아스파르트산 및 글루탐산 잔기를 포함한다. 비천연 발생의 산성 아미노산도 포함된다.
본원에서 사용된, "극성 아미노산(polar amino acid)"은 그 측쇄가 수성(즉, 물) 환경에 있기를 선호하는, 친수성인 아미노산을 의미한다. 이러한 아미노산은 일반적으로 단백질의 표면상에 위치한다. 이러한 아미노산은 일반적으로 물과의 수소 결합에 참여할 수 있는 산소 또는 질소를 포함하는 산, 아미드, 알코올 및 아민과 같은 작용기를 갖는 극성 측쇄를 갖는 것들을 포함하는 경우 분류된다. 이러한 아미노산의 예는 Arg (R), Asn (N), Asp (D), Glu (E), Gln (Q), His (H), Lys (K), Ser (S), Thr (T), 및 Tyr (Y)이다. Cys (C) 및 Trp (W)가 또한 약한 극성으로 고려된다.
본원에서 사용된 극성 및 중성 아미노산(polar and neutral amino acid)은 중성 측쇄를 포함하는 극성 아미노산이다. 치환을 위한 이러한 아미노산 잔기의 예는 Asn (N), Gln (Q), Ser (S), Thr (T), Cys (C) 또는 Tyr (Y)이다.
본원에서 사용된, "천연 발생 아미노산(naturally occurring amino acids)"은 폴리펩티드에서 발생하는 20 L-아미노산을 의미한다.
본원에서 사용된, "비-천연 아미노산(non-natural amino acid)"은 표 2에 기재된 천연 발생 아미노산 중 하나가 아닌 아미노기 및 카복실기를 함유하는 유기 화합물을 의미한다. 따라서 비-천연 발생 아미노산은, 예를 들어 20가지 천연-발생 아미노산 외의 아미노산 또는 아미노산의 유사체를 포함하며, 아미노산의 D-입체이성질체(D-isostereomer)를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 예시적인 비-천연 아미노산은 당업자에게 알려져 있으며 변형 제Ⅶ 인자 폴리펩티드 내에 포함될 수 있다.
본원에서 사용된, 아미노산의 적합한 보존적 치환은 당업자에게 알려져 있으며 야기되는 분자의 생물학적 활성을 변경하지 않고 일반적으로 이루어질 수 있다. 당업자는 일반적으로 폴리펩티드의 비-필수적 영역에서의 단일 아미노산 치환은 생물학적 활성을 실질적으로 변경하지 않음을 인식하고 있다(예컨대, Watson et al. Molecular Biology of the Gene, 4th Edition, 1987, The Benjamin/Cummings Pub. co., p.224 참조). 이러한 치환은 하기 표 3에 기재된 바에 따라 이루어질 수 있다:
원래 잔기 예시적인 보존적 치환
Ala (A) Gly; Ser
Arg (R) Lys
Asn (N) Gln; His
Cys (C) Ser
Gln (Q) Asn
Glu (E) Asp
Gly (G) Ala; Pro
His (H) Asn; Gln
Ile (I) Leu; Val
Leu (L) Ile; Val
Lys (K) Arg; Gln; Glu
Met (M) Leu; Tyr; Ile
Phe (F) Met; Leu; Tyr
Ser (S) Thr
Thr (T) Ser
Trp (W) Tyr
Tyr (Y) Trp; Phe
Val (V) Ile; Leu
기타 치환 역시 경험적으로 결정될 수 있거나 공지의 보존적 치환에 따라 허용가능하다.
본원에 사용된 DNA 작제물(DNA construct)은 일본쇄 또는 이본쇄인 선형 또는 원형의 DNA 분자로서, 자연에서 발견되지 않는 방식으로 조합 및 병치된 DNA 분절을 함유한다. DNA 작제물은 인간 조작의 결과로서 존재하고 조작된 분자의 클론 및 다른 카피를 포함한다.
본원에 사용된 DNA 분절(DNA segment)은 특정 속성을 보유하는 큰 DNA 분자의 부분이다. 예를 들어, 특정 폴리펩티드를 암호화하는 DNA 분절은 5'에서 3' 방향으로 판독할 때 특정 폴리펩티드의 아미노산 서열을 암호화하는 플라스미드 또는 플라스미드 단편과 같은 더 긴 DNA 분자의 부분이다.
본원에 사용된 폴리뉴클레오티드(polynucleotide)란 용어는 5'에서 3' 말단으로 판독되는 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 염기의 일본쇄 또는 이본쇄 중합체를 의미한다. 폴리뉴클레오티드는 RNA 및 DNA를 포함하고 천연 급원에서 단리하거나, 시험관내에서 합성하거나 또는 천연 및 합성 분자의 조합으로부터 제조할 수 있다. 폴리뉴클레오티드 분자의 길이는 뉴클레오티드(약어 "nt") 또는 염기쌍(약어 "bp")으로 제시된다. 뉴클레오티드란 용어는 상황에 따라 일본쇄 분자 및 이본쇄 분자에 사용된다. 이 용어가 이본쇄 분자에 적용될 때 총 길이를 나타내는데 사용되고 염기쌍이란 용어와 동등한 것으로 이해되어야 할 것이다. 당업자라면 잘 알고 있듯이, 이본쇄 폴리뉴클레오티드의 2 가닥은 길이가 약간 다를 수 있어 그 말단들이 어긋날 수 있다; 따라서 이본쇄 폴리뉴클레오티드 분자 내의 모든 뉴클레오티드가 쌍을 이룰 수는 없다. 이러한 짝이 없는 말단은 일반적으로 길이가 20개 뉴클레오티드를 초과하지 않을 것이다.
본원에 사용된, "1차 서열(primary sequence)"은 폴리펩티드의 아미노산 잔기의 서열을 의미한다.
본원에 사용된, 두 단백질 또는 핵산 간의 "유사성(similarity)"은 단백질의 아미노산 서열 또는 핵산의 뉴클레오티드 서열 간의 관련도를 의미한다. 유사성은 잔기의 서열과 이 안에 함유된 잔기의 상동성 및/또는 상동적의 정도를 기초로 할 수 있다. 단백질 또는 핵산 간에 유사성 정도를 평가하는 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 서열 유사성을 평가하는 한 방법에서, 두 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열은 서열 간에 상동성의 최대 수준을 산출하는 방식으로 정렬된다. "동일한(identical)"은 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열이 변하지 않은 정도를 의미한다. 또한, 아미노산 서열의 정렬, 및 어느 정도까지는 뉴클레오티드 서열의 정렬은 아미노산(또는 뉴클레오티드)의 보존적 차이 및/또는 빈번한 치환을 감안할 수 있다. 보존적 차이는 관련된 잔기의 이화학적 성질을 보존하는 것이다. 정렬은 전체적(서열의 전 길이에 걸쳐 모든 잔기를 포함하는 비교된 서열의 정렬) 또는 국소적(가장 유사한 영역 또는 영역들만을 포함하는 서열 일부의 정렬)일 수 있다.
본원에 사용된 "상동적(homology)" 및 "상동성(identity)"이란 용어는 상호교환적으로 사용되지만, 단백질의 상동적은 보존적 아미노산 변화를 포함할 수 있다. 일반적으로, 상응하는 위치를 확인하기 위해, 아미노산 서열은 최고 수준의 정합이 수득되도록 정렬된다(예컨대, Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; and Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991; Carillo 등 (1988) SIAM J Applied Math 48:1073 참조).
본원에 사용된, "서열 상동성(sequence identity)"은 시험 및 참조 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 간에 비교 시에 동일한 아미노산(또는 뉴클레오티드 염기)의 수를 의미한다. 상동적인 폴리펩티드는 미리 결정된 수의 동일한 또는 상동적인 아미노산 잔기를 의미한다. 상동적은 동일한 잔기뿐만 아니라 보존적 아미노산 치환을 포함한다. 서열 상동성은 각 공급업체에서 확립된 디폴트 갭 패널티(default gap penalty)가 사용된 표준 정렬 알고리즘 프로그램으로 측정할 수 있다. 상동적인 핵산 분자는 미리 결정된 수의 동일한 또는 상동적인 뉴클레오티드를 의미한다. 상동적은 동일한 잔기 뿐 아니라 암호화된 아미노산을 변화시키지 않는 치환(즉, "침묵 치환")을 포함한다. 실질적으로 상동적인 핵산 분자는 전형적으로 중간 엄중도 또는 높은 엄중도에서 당해의 전체 길이의 핵산 분자의 적어도 약 70%, 80% 또는 90%를 따라 혼성화하거나 또는 핵산의 길이를 따라 전체가 혼성화한다. 또한, 혼성화하는 핵산 분자 중의 코돈 대신에 축퇴성 코돈을 함유하는 핵산 분자도 고려된다. (단백질의 상동적을 측정하기 위해, 동일한 아미노산 뿐 아니라 보존적 아미노산이 정렬될 수 있다; 이러한 경우에 상동성 %와 상동적 %는 다르다). 임의의 두 핵산 분자가 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% "상동성"인 뉴클레오티드 서열(또는 임의의 두 폴리펩티드가 아미노산 서열을 가짐)을 보유하는지는 Pearson et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444 (1988)에서와 같은 디폴트 파라미터를 사용하는 "FAST A" 프로그램과 같은 공지된 컴퓨터 알고리즘을 이용해서 측정할 수 있다(다른 프로그램은 GCG 프로그램 패키지(Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research 12(I): 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA(Atschul, S.F., et al., J. Molec. Biol. 215:403 (1990); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, ed., Academic Press, San Diego (1994), 및 Carillo et al. SIAM J Applied Math 48: 1073 (1988)를 포함한다). 예를 들어, 국립 생명공학정보센터(NCBI) 데이터베이스의 BLAST 기능은 상동성을 측정하는데 사용할 수 있다. 다른 상업적인 또는 대중이 이용가능한 프로그램으로는 DNAStar "MegAlign" 프로그램 (Madison, WI) 및 위스콘신 대학 유전학 컴퓨터 그룹(University of Wisconsin Genetics Computer Group) (UWG) "Gap" 프로그램 (Madison WI))을 포함한다. 단백질 및/또는 핵산 분자의 상동적 또는 상동성 백분율은 예컨대 GAP 컴퓨터 프로그램(예, Needleman et al. J. Mol. Biol. 48: 443 (1970), Smith와 Waterman (Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981)]에 의해 개정됨)을 사용하여 서열 정보를 비교하여 측정할 수 있다. 간략히 설명하면, GAP 프로그램은 유사한 정렬 기호(즉, 뉴클레오티드 또는 아미노산)의 수를 두 서열 중 더 짧은 서열의 기호의 총 수로 나누어 유사성을 정의한다. GAP 프로그램의 디폴트 파라미터는 (1) 1진법 비교 행렬(동일물에 대해서는 1의 값, 비동일물에 대해서는 0의 값을 포함함) 및 그리브스코브 등(Gribskov et al. Nucl. Acids Res. 14: 6745 (1986))의 가중 비교 행렬 [Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979)에 기술되어 있음]; (2) 각 갭에 대해 3.0의 벌점 및 각 갭의 각 기호에 대해 추가 0.10 벌점; 및 (3) 말단 갭에 대해서는 무벌점을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 "상동성(identity)"이란 용어는 시험 및 참조 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 간의 비교를 나타낸다. 한 가지 비제한적 예에서, "~에 적어도 90% 동일한(at least 90% identical to)"은 참조 폴리펩티드에 대해 90 내지 100%의 상동성 %를 의미한다. 90% 수준 또는 그 이상의 상동성은 예시적 목적으로 가정해보면 100 아미노산 길이의 시험 및 참조 폴리뉴클레오티드 길이를 비교할 때, 시험 폴리펩티드의 아미노산 중 10%(즉, 100개 중 10개) 이하가 참조 폴리펩티드의 아미노산과 상이하다는 사실을 나타낸다. 이와 유사하게 시험 및 참조 폴리뉴클레오티드 간에도 비교할 수 있다. 이러한 차이는 아미노산 서열의 전 길이를 따라 무작위로 분포된 점 돌연변이로서 나타날 수도 있고, 또는 허용될 수 있는 최대 수까지, 예컨대 10/100 아미노산 차이(약 90% 상동성)까지 다양한 길이로 하나 이상의 위치에서 응집되어 있을 수 있다. 차이는 핵산 또는 아미노산 치환, 삽입 또는 결실로서 정의된다. 상동적 또는 상동성 수준이 약 85 내지 90% 이상일 때는, 이 결과는 프로그램 및 갭 파라미터 세트와 무관해야 하고; 이러한 높은 수준의 상동성은 종종 소프트웨어에 의존하지 않고 쉽게 평가될 수 있다.
본원에 사용된, "실질적으로 동일한(substantially identical)" 또는 "유사한(similar)"이란 용어는 관련 기술분야의 숙련된 자가 이해하는 바와 같이 상황에 따라 달라지지만, 당업자라면 쉽게 평가할 수 있는 것임은 물론이다.
본원에 사용된, 정렬된 서열(aligned sequence)은 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열의 상응하는 위치를 정렬시키기 위한 상동적(유사성 및/또는 상동성)의 사용을 의미한다. 전형적으로, 50% 또는 그 이상의 상동성으로 관련이 있는 2 이상의 서열이 정렬된다. 정렬된 서열 세트는 상응하는 위치에 정렬된 2 이상의 서열을 의미하고 게놈 DNA 서열과 정렬된, EST 및 다른 cDNA와 같은, RNA 유래의 정렬 서열을 포함할 수 있다.
본원에 사용된, "특이적으로 혼성화한다(specifically hybridizes)"는 표적 핵산 분자에 대한 핵산 분자(예, 올리고뉴클레오티드)의 상보성 염기쌍 형성에 의한 어닐링을 의미한다. 당업자는 특이적 혼성화에 영향을 미치는 시험관 내 및 생체 내 파라미터, 예컨대 특정 분자의 길이 및 조성 등에 익숙하다. 시험관내 혼성화와 특히 관련이 있는 파라미터로는 또한 어닐링 및 세척 온도, 완충액 조성물 및 염 농도를 포함한다. 높은 엄중도에서 비특이적으로 결합된 핵산 분자를 제거하기 위한 세척 조건의 예는 0.1 x SSPE, 0.1% SDS, 65℃이고, 중간 엄중도에서는 0.2 x SSPE, 0.1% SDS, 50℃이다. 등가의 엄중도 조건은 당업계에 공지되어 있다. 당업자는 특정 적용에 적당한 표적 핵산 분자에 대한 핵산 분자의 특이적 혼성화를 달성하기 위해 상기 파라미터를 쉽게 조정할 수 있다.
본원에 사용된, 단리 또는 정제된(isolated or purified) 폴리펩티드 또는 단백질 또는 이의 촉매적 활성 단백질은 실질적으로 세포성 물질 또는 단백질이 유래된 세포 또는 조직의 기타 오염성 단백질이 실질적으로 없는, 또는 화학적으로 합성되었을 때 화학적 전구체 또는 기타 화학물질이 실질적으로 없는 것이다. 제제는 이러한 순도를 평가하기 위해 당업자가 사용하는 표준 분석방법, 예컨대 박층크로마토그래피(TLC), 겔전기영동 및 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 등으로 측정했을 때 쉽게 검출할 수 있는 불순물이 없는 것으로 보이면 실질적으로 제거된 것으로 결정될 수 있고, 또는 추가 정제에 의해 물질의 단백분해 및 생물학적 활성과 같은 이화학적 성질의 검출가능한 변화가 없을 정도로 충분히 순수한 것으로 결정될 수 있다. 실질적으로 순수한 폴리펩티드를 생산하는 단백질의 정제 방법은 당업자에게 공지되어 있다.
세포성 물질이 실질적으로 없는(substantially free of cellular material) 이란 용어는 세포성 성분이 단리된 세포의 세포성 성분으로부터 단백질이 단리되거나, 또는 단백질이 재조합적으로 생산된, 단백질 제조물을 포함한다. 일 구현예에 따르면, 세포성 물질이 실질적으로 없는 이란 용어는 비-프로테아제 단백질(불순 단백질이라 불리기도 함)이 약 30%(건조중량 기준) 미만인, 일반적으로 비-프로테아제 단백질이 약 20% 미만 또는 비-프로테아제 단백질이 10% 또는 비-프로테아제 단백질이 약 5% 미만인, 프로테아제 단백질 제제를 포함한다. 프로테아제 단백질 또는 이의 활성 부분이 재조합적으로 생산된 경우에는, 배양 배지가 실질적으로 없어야 하고, 즉 배양 배지가 프로테아제 단백질 제제 부피의 약 20%, 10% 또는 5% 이하여야 한다.
본원에 사용된, 화학적 전구체 또는 다른 화학물질이 실질적으로 없는(substantially free of chemical precursors or other chemicals)이란 용어는 단백질의 합성에 관여하는 화학적 전구체 또는 기타 화학물질로부터 단백질이 단리된, 프로테아제 단백질의 제제를 포함한다. 이 용어는 화학적 전구체 또는 프로테아제외 화학물질 또는 성분이 약 30%(건조중량 기준), 20%, 10%, 5% 또는 그 이하인 프로테아제 단백질의 제제를 포함한다.
본원에 사용된, 재조합 DNA 방법을 사용하는 재조합 방법에 의한 생산(production by recombinant methods by using recombinant DNA methods)은 클로닝된 DNA에 의해 암호화된 단백질을 발현시키기 위한 분자생물학의 공지된 방법의 사용을 의미한다.
본원에 사용된, 벡터(vector)(또는 플라스미드(plasmid))는 이종성 핵산을 이의 발현 또는 복제를 위해 세포 내로 도입시키는데 사용되는 독립된 구성요소를 의미한다. 벡터는 전형적으로 에피솜성을 유지하지만, 게놈의 염색체 내로 유전자 또는 이의 일부를 통합시키도록 설계될 수 있다. 또한, 인공 염색체, 예컨대 세균 인공 염색체, 효모 인공 염색체 및 포유류 인공 염색체인 벡터도 고려한다. 이러한 비히클의 선택 및 사용은 당업자에게 공지되어 있다.
본원에 사용된, 발현(expression)은 핵산이 mRNA로 전사되어 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질로 번역되는 과정을 의미한다. 핵산이 게놈 DNA에서 유래된다면, 발현은, 적당한 진핵생물 숙주 세포 또는 유기체가 선택된다면 가공, 예컨대 mRNA의 스플라이싱을 포함할 수 있다.
본원에 사용된, 발현 벡터(expression vector)는 DNA 단편을 발현시킬 수 있는 프로모터 영역과 같은 조절 서열과 작동가능하게 결합된 DNA를 발현시킬 수 있는 벡터를 포함한다. 이러한 추가의 분절로는 프로모터 및 터미네이터 서열을 포함할 수 있고, 선택적으로 하나 이상의 복제 기점, 하나 이상의 선별 마커, 인핸서, 폴리아데닐화 신호 등을 포함할 수 있다. 발현 벡터는 일반적으로 플라스미드 또는 바이러스 DNA에서 유래되거나, 이 둘 모두의 구성요소를 함유할 수 있다. 따라서, 발현 벡터는 적당한 숙주 세포에 도입 시에 클로닝된 DNA를 발현시키는 재조합 DNA 또는 RNA 작제물, 예컨대 플라스미드, 파지, 재조합 바이러스 또는 기타 벡터를 의미한다. 적당한 발현 벡터는 당업자에게 공지되어 있고, 진핵생물 세포 및/또는 원핵생물 세포에서 복제할 수 있고 에피솜성을 유지하거나 숙주 세포 게놈 내로 통합되는 것을 포함한다.
본원에 사용된, 벡터는 또한 "바이러스 벡터(virus vectors)" 또는 "바이러스성 벡터(viral vectors)"를 포함한다. 바이러스 벡터는 외인성 유전자를 세포내로 전이시키기 위해 외인성 유전자에 작동가능하게 연결된 조작된 바이러스(비히클 또는 셔틀로서)이다.
본원에 사용된, 아데노바이러스(adenovirus)는 인간에서 상기도 감염 및 결막염을 유발하는 DNA 함유 바이러스 그룹의 임의의 바이러스를 의미한다.
본원에 사용된, 나출형 DNA(naked DNA)는 백신 및 유전자 치료에 사용될 수 있는 히스톤이 없는 DNA를 의미한다. 나출형 DNA는 형질전환 또는 형질감염이라는 처리가 된 유전자 전이 동안 세포에서 세포로 전달되는 유전자 물질이다. 형질전환 또는 형질감염에서, 수용체 세포에 의해 흡수되는 정제된 또는 나출형 DNA는 수용체 세포에게 새로운 특징 또는 표현형을 제공할 것이다.
본원에 사용된, DNA 분절에 관한 것일 때, 작동적으로 또는 작동가능하게 연결된(operably or operatively linked)이란 분절들이 의도된 목적을 위해 협력하여 기능하도록 분절들이 배열되어 있음을 의미하며, 예컨대 전사는 프로모터에서 시작하여 암호화 분절을 통해 터미네이터로 진행된다.
본원에서 사용된, 단백질의 활성 또는 유전자 또는 핵산의 발현을 조절하는 제제(an agent that modulates the activity of a protein or expression of a gene or nucleic acid)는 그 단백질의 활성을 감소 또는 증가 또는 기타 방법으로 변경시키거나, 어떤 방식으로, 세포내에서 핵산의 발현을 상향 또는 하향조절 또는 기타 방법으로 변경시킨다.
본원에 사용된 "키메라 단백질(chimeric protein)" 또는 "융합 단백질(fusion protein)"은 다른 폴리펩티드에 작동가능하게 연결된 폴리펩티드를 의미한다. 본원에 제공된 키메라 또는 융합 단백질은 1 이상의 변형 FX 폴리펩티드, 또는 이의 부분, 및 전사/번역 조절 신호, 신호 서열, 국재화를 위한 태그, 정제를 위한 태그, 면역글로불린 G 도메인의 일부 및/또는 표적화제 중 어느 하나 이상에 대한 하나 이상의 다른 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 또한, 키메라 FX 폴리펩티드는 이 폴리펩티드의 내인성 도메인 또는 영역이 다른 폴리펩티드로 교환된 것을 포함한다. 이러한 키메라 또는 융합 단백질은 재조합 수단에 의해 융합 단백질로 생산된 것, 화학적 수단, 예컨대 설프히드릴 기에 대한 결합(coupling) 등의 화학적 결합에 의해 생산된 것, 및 임의의 다른 방법으로 생산된 것을 포함하며, 이로써 적어도 하나의 폴리펩티드(즉, FX) 또는 이의 부분이 링커(들)를 통해 다른 폴리펩티드에 직접 또는 간접적으로 결합된다.
본원에 사용된, 융합 단백질에 대해 언급할 때의 작동가능하게 결합된(operatively-linked)이란 서로 프레임내 융합된 프로테아제 폴리펩티드와 비-프로테아제 폴리펩티드를 의미한다. 비-프로테아제 폴리펩티드는 프로테아제 폴리펩티드의 N-말단 또는 C-말단에 융합될 수 있다.
본원에 사용된, 표적화제(targeting agent)는 세포 표면 수용체와 같은 세포 표면 분자에 특이적 결합을 제공하고, 몇몇 경우에는 결합된 컨쥬게이트 또는 이의 부분을 내재화시킬 수 있는 단백질 또는 이의 유효 부분과 같은 임의의 모이어티이다. 또한, 표적화제는 컨쥬게이트의 친화도 단리 또는 정제; 표면에 대한 컨쥬게이트의 부착; 또는 컨쥬게이트 또는 컨쥬게이트를 함유하는 복합체의 검출 등을 촉진하거나 용이하게 하는 것일 수 있다.
본원에 사용된, 분자의 유도체(derivative) 또는 유사체(analog)는 분자 유래의 부분 또는 이 분자의 변형 버전을 의미한다.
본원에 사용된, "질환 또는 질병(disease or disorder)"는 감염, 후천적 상태, 유전적 상태를 포함한, 이에 제한되지 않는 원인이나 상태에서 야기되고 식별가능한 증상들을 특징으로 하는 유기체의 병리학적 상태를 의미한다. 본원에서 당해의 질환 및 질병은 응고를 수반하는 것, 예컨대 응고 단백질에 의해 매개되는 것 및 응고 단백질이 병인 또는 병리에 역할을 하는 것이다. 또한, 질환 및 질병은 혈우병에서와 같이 단백질의 부재에 의해 유발되는 것을 포함하고, 특히 본 발명의 대상은 응고 단백질의 결함 결핍으로 인해 응고가 일어나지 않는 질병이다.
본원에 사용된 "응혈원(procoagulant)"은 혈액 응고를 촉진하는 모든 물질을 의미한다.
본 발명에 사용된, "항응고제(anticoagulant)"는 혈액 응고를 저해하는 모든 물질을 의미한다.
본원에 사용된, "혈우병(hemophilia)"은 혈액 응고인자의 결핍으로 인해 유발된 출혈 질병을 의미한다. 혈우병은 예컨대 응고 인자의 부재, 발현 감소 또는 기능 감소 등의 결과일 수 있다. 가장 일반적인 혈우병 유형은 혈우병 A로서, 제 Ⅷ 인자의 결핍으로 인해 나타난다. 두번째로 가장 일반적인 혈우병 유형은 혈우병 B이며, 이는 제 Ⅸ 인자의 결핍으로 인해 나타난다. FXI 결핍증으로도 불리는 혈우병 C는 혈우병의 가볍고 덜 일반적인 형태이다.
본원에 사용된, "선천적 혈우병(congenital hemophilia)"은 유전되는 혈우병 유형을 의미한다. 선천적 혈우병은 응고 인자의 생산이 없거나, 감소되거나, 비기능성인 응고 인자 유전자의 돌연변이, 결실, 삽입 또는 기타 변형으로부터 나타난다. 예를 들어, 제 Ⅷ 인자 및 제 Ⅸ 인자와 같은 응고 인자 유전자의 유전성 돌연변이는 각각 선천적 혈우병, 혈우병 A 및 B를 야기한다.
본원에 사용된 "후천적 혈우병(acquired hemophilia)"은 FⅧ을 불활성화시키는 자가항체의 생산으로부터 성인기에 발생하는 혈우병의 유형을 의미한다.
본원에 사용된 "출혈 질병(bleeding disorder)"은 혈액 응고 불량으로 인해 출혈을 통제하는 능력이 감소된 대상체의 상태를 의미한다. 출혈 질병은 선천적 또는 후천적일 수 있고, 응고 경로의 결함이나 결핍, 혈소판 활성의 결함이나 결핍 또는 혈관 결함 등으로부터 야기될 수 있다.
본원에 사용된 "후천적 출혈 질병(acquired bleeding disorder)"은 간 질환, 비타민 K 결핍증 또는 쿠마딘(와파린) 또는 다른 항응고제 요법과 같은 상태에 의해 유발되는 응고 결핍으로부터 야기되는 출혈 질병을 의미한다.
본원에 사용된, 질환 또는 상태를 보유한 대상체를 "치료하는(treating)"이란 폴리펩티드, 조성물 또는 본원에 제공된 기타 산물이 대상체에 투여되는 것을 의미한다.
본원에 사용된, 치료제(therapeutic agent), 치료 요법(therapeutic regimen,), 방사선보호제(radioprotectant), 또는 화학치료제(chemotherapeutic)는 당업자에게 공지된 백신을 포함한 통상의 약물 및 약물 치료제를 의미한다. 방사능치료제는 당업계에 공지되어 있다.
본원에 사용된 치료(treatment)는 상태, 질병 또는 질환의 증상들이 호전되거나, 다른 방식으로 유리하게 변경되는 모든 방식을 의미한다. 따라서, 치료는 예방, 치료법 및/또는 치유를 포함한다. 또한, 치료는 본 명세서의 조성물의 모든 약학적 사용을 포함한다. 또한, 치료는 본원에 제공된 변형 FX 및 조성물의 임의의 약학적 사용을 포함한다.
본원에 사용된, 약학적 조성물 또는 다른 치료제의 투여와 같은 치료에 의한 특정 질환 또는 질병의 증상들의 호전(amelioration)은, 영구적 또는 일시적, 지속적 또는 일과성 여부에 관계없이, 조성물 또는 치료제의 투여에 기인할 수 있는 또는 그 투여와 관련이 있을 수 있는 증상들의 임의의 완화를 의미한다.
본원에 사용된, 방지(prevention) 또는 예방(prophylaxis)은 질환이나 상태가 발생할 위험을 감소시키는 방법을 의미한다. 예방은 질환이나 상태의 발생 위험의 감소 및/또는 질환의 증상이나 진행의 악화 방지 또는 질환의 증상이나 진행의 악화 위험의 감소를 포함한다.
본원에 사용된 특정 질환을 치료하기 위한 화합물 또는 조성물의 유효량(effective amount)은 그 질환과 관련이 있는 증상을 호전시키거나, 일부 방식에서는 감소시키기에 충분한 양이다. 이러한 양은 단일 용량으로 투여될 수 있고, 또는 요법에 따라 투여될 수 있어, 효과적이다. 이 양은 질환을 치유할 수 있지만, 전형적으로 질환의 증상을 호전시키기 위해 투여한다. 전형적으로, 증상의 희망되는 호전을 달성하기 위해서는 반복 투여가 필요하다.
본원에 사용된, "치료적 유효량(therapeutically effective amount)" 또는 "치료적 유효 용량(therapeutically effective dose)"은 적어도 치료 효과를 나타내기에 충분한, 제제, 화합물, 물질 또는 화합물을 함유하는 조성물을 의미한다. 유효량은 질환이나 질병의 증상을 예방하거나, 치유하거나, 호전시키거나, 정지시키거나 또는 부분적으로 정지시키는데 필요한 치료제의 양이다.
본원에 사용된, 치료되는 "환자(patient)" 또는 "대상체(subject)"는 인간 및/또는 비-인간 동물, 예컨대 포유류를 포함한다. 포유류는 영장류, 예컨대 인간, 침팬지, 고릴라 및 원숭이; 가축 동물, 예컨대 개, 말, 고양이, 돼지, 염소, 소; 및 설치류, 예컨대 마우스, 랫트, 햄스터 및 저빌을 포함한다.
본원에 사용된, 조합(combination)은 두 항목 간에 또는 그 이상의 항목 간에 임의의 연합을 의미한다. 연합은 공간적일 수 있고, 또는 공통 목적을 위한 2 이상의 항목의 사용을 의미하기도 한다.
본원에 사용된, 조성물(composition)은 2 이상의 산물 또는 화합물(예, 제제, 변조인자, 조절인자 등)의 임의의 혼합물을 의미한다. 이는 용액, 현탁액, 액체, 분말, 페이스트, 수성 또는 비수성 제형 또는 이의 임의의 조합일 수 있다.
본원에 사용된 "제조품(article of manufacture)"은 제조되어 판매되는 제품이다. 본 명세서를 통해 사용된 바와 같이, 이 용어는 포장물품에 함유된 변형 프로테아제 폴리펩티드 및 핵산을 포함하도록 의도된 것이다.
본원에 사용된, 유체(fluid)는 흐를 수 있는 모든 조성물을 의미한다. 따라서, 유체는 반고체, 페이스트, 용액, 수성 혼합물, 겔, 로션, 크림의 형태인 조성물 및 이러한 다른 조성물을 포함한다.
본원에 사용된, "키트(kit)"는 포장된 조합물을 의미하며, 선택적으로 조합물의 구성요소를 사용하여 방법을 실행하는 시약 및 다른 산물 및/또는 성분을 포함한다. 예를 들어, 본원에 제공된 변형 프로테아제 폴리펩티드 또는 핵산 분자와 생물학적 활성 또는 성질의 평가, 진단 및 투여를 포함하나, 이에 제한되지 않는 목적을 위한 다른 항목을 함유하는 키트가 제공된다. 키트는 선택적으로 사용 지침서를 포함한다.
본원에 사용된, 동물(animal)은 모든 동물, 예컨대 인간, 고릴라 및 원숭이를 포함하는 영장류; 마우스 및 랫트와 같은 설치류; 닭과 같은 가금류; 염소, 소, 사슴, 양과 같은 반추동물; 양류, 돼지 및 기타 동물을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 비-인간 동물은 고찰되는 동물로서 인간을 제외한다. 본원에 제공된 프로테아제는 임의의 급원, 동물, 식물, 원핵생물 및 진균류 유래의 프로테아제이다.
본원에 사용된 유전자 치료(gene therapy)는 이 요법이 추구하는 질병 또는 상태를 보유한 포유류, 특히 인간의 특정 세포, 표적 세포 내로 DNA와 같은 이종성 핵산의 전이를 수반한다. 본원의 목적에 대해서, 유전자 치료는 본원에서 제공되는 변형 FX 폴리펩티드를 암호화하는 핵산의 전달을 수반한다. DNA와 같은 핵산은 선택된 표적 세포 내로 직접 또는 벡터나 다른 전달 비히클 등을 통해, DNA와 같은 이종성 핵산이 발현되어, 이로 인해 암호화된 치료 산물이 생산되도록 하는 방식으로 도입된다. 대안적으로, DNA와 같은 이종성 핵산은 일부 방식에서는 치료 산물을 암호화하는 DNA의 발현을 매개할 수 있거나, 또는 일부 방식에서는 치료 산물의 발현을 직접 또는 간접적으로 매개하는 펩티드 또는 RNA와 같은 산물을 암호화할 수 있다. 또한, 유전자 치료는 핵산이 도입되는 세포 또는 포유류에 의해 생성되는 유전자 산물을 보충하거나 결함 유전자를 교체하는 유전자 산물을 암호화하는 핵산을 전달하는데 사용될 수 있다. 도입된 핵산은 포유류 숙주에서 정상적으로 생산되지 않거나, 치료적 유효량으로 또는 치료적으로 유용한 시간에 생산되지 않는 프로테아제 또는 변형 프로테아제와 같은 치료 화합물을 암호화할 수 있다. 치료 산물을 암호화하는 DNA와 같은 이종성 핵산은 병에 걸린 숙주의 세포 내로 도입되기 전에 변형되어 그 산물 또는 이의 발현을 향상시키거나 또는 다른 방식으로 변경시킬 수 있다. 또한, 유전적 치료는 유전자 발현의 저해제, 억제제 또는 다른 변조인자(modulator)의 전달을 수반할 수 있다.
본원에 사용된, 유전자 치료의 치료적 유효 산물(therapeutically effective product)은 이종성 핵산, 보통 DNA에 의해 암호화된 산물로서, 숙주에 핵산 도입 시에 질환을 치유하거나, 선천적 또는 후천적 질환의 증상, 징후를 호전시키거나 제거하는 산물이 발현된다. 또한, RNAi 및 안티센스와 같은 생물학적 활성 핵산 분자도 포함된다.
본원에 사용된, 폴리펩티드가 언급된 아미노산 서열로 "본질적으로 이루어진(consists essentially)"이란 언급은 전장의 폴리펩티드 중 언급된 부분, 또는 이의 단편만이 존재한다는 것을 의미한다. 이러한 폴리펩티드는 선택적으로, 일반적으로 다른 급원 유래의 추가의 아미노산을 포함하거나, 또는 다른 폴리펩티드에 삽입될 수 있다.
본원에 사용된, 하나를 뜻하는 어형인 "한(a)", "하나의(an)" 및 "상기(the)"는 문맥상 다른 분명한 언급이 없는 한 복수의 관련물을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "하나의 세포외 도메인"을 포함하는 화합물에 대한 언급은 하나 또는 복수의 세포외 도메인을 보유하는 화합물을 포함한다.
본원에 사용된, 범위 및 양은 "약(about)" 특수값 또는 범위로서 표현될 수 있다. 약은 또한, 정확한 양도 포함된다. 따라서, "약 5개 염기"는 "약 5개 염기"와 "5개 염기"를 의미한다.
본원에 사용된, "선택적(optional)" 또는 "선택적으로(optionally)"는 후술되는 사건 또는 상황이 일어나거나 일어나지 않으며, 이 표현은 그러한 사건이나 상황이 일어나는 경우와 일어나지 않는 경우를 포함한다는 것을 의미한다. 예를 들어, 선택적로 치환된 기는 그 기가 치환되지 않거나 치환된 것임을 의미한다.
본원에 사용된, 임의의 보호 기, 아미노산 및 다른 화합물에 대한 약어는 다른 표시가 없는 한 통용되는 용법, 공식 약어 또는 IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature(Biochem. 11: 1726 (1972) 참조)에 따른다.
B. 지혈과 인자 X
본원에서 변형 활성화 인자 X(FXa) 폴리펩티드 및 이의 촉매적 활성 단편을 포함하는, 변형 인자 X(FX) 폴리펩티드가 제공된다. 혈전 형성의 공통 경로에서 첫번째 효소로서, FX는 응고 캐스케이드에서 독특하고 중요한 위치를 차지한다. FX의 상류의 응고 인자 FⅨ 및 FⅧ 의 결핍은 부적절한 FXa의 생산으로 이어진다. 부적절한 FXa의 결과는 혈우병을 야기하는, 트롬빈 및 응괴-형성 피브린의 감소된 수준이다(Roberts et al. (2006). Hemophilia A and hemophilia B. In MA Lichtman et al., eds., Williams Hematology, 7th ed., pp. 1867-1886. New York: McGraw-Hill). 따라서, FX는 상류 응고 인자의 결핍을 우회하기 위한 매력적인 치료제이며, 기타 혈우병-독립적인, 의학적 적응증, 예컨대 외과적 과정 동안 또는 그 후에 혈액 응고를 촉진하기 위한 경우에도 유용할 수 있다.
FXa가 캐스케이드에서 다른 응고 인자의 결핍을 우회하는 치료적 응혈원으로 작용하는 반면, 완전한 기능성 FX의 치료제로서의 사용은 전신적 응고의 과도한 활성화로 인해 비현실적인 것으로 입증된 바 있다. 프로트롬빈분해효소 복합체를 형성하는 활성 FXa와 그 활성화된 보조인자인 FVa의 연합은 트롬빈 활성화에서 100,000 배 초과 증가를 야기하는 반면, FXa 단독은 낮은 수준의 트롬빈 활성화가 가능하다(Nesheim et al.(1979) J Biol. Chem., 254:10952-10962). 따라서, FXa의 주입은 희망되지 않는 응고의 유도를 야기할 수 있다. 사실, FXa의 투여는 생체내에서 트롬빈 생성을 야기하고 동물 모델에서 파종성 혈관내 응고(DIC)를 야기하는데 사용될 수 있다(Kruithof et al. (1997) Thombosis and Haemostasis 77(2):308-311; Giles et al. (1984) J Clin. Invest. 74(6):2219-2225). 그러므로, FXa의 치료제로서의 사용은 이러한 약학적 제제가 혈전생성적이고(thrombogenic) 파종성 혈관내 응고로 이어질 수 있다는 우려로 인해 제한된다. 따라서, 치료제로서의 FX의 사용에 대한 연구는 불활성 지모겐 FX의 사용에 집중되어 왔다(예컨대 미국 특허번호 제4,501,731호 참조). 본원에서 제공되는 변형 FXa 폴리펩티드를 포함하는 변형 FX 폴리펩티드는 이러한 문제를 극복한다.
치료제로서 사용시 FXa의 또 다른 제한은 항트롬빈(AT) Ⅲ 및 단백질 C와 같은 혈장 프로테아제 저해제에 의한 이의 급속한 불활성화로 인한 순환 FXa의 짧은 반감기에 있다(Gitel et al. (1984) J. Biol. Chem.259(11):6890-6895; Giles et al. (1988) Br. J. Haematol. 69(4):491-497).
FXa의 희망되지 않는 활성은 응고 경로에서의 활성에 제한되지 않는다. FXa는 또한 면역 및 염증 경로 및 체세포분열의 활성화에서 손상에 이르는 반응으로 잘 기록된 역할을 수행한다(Altieri (1993) Blood 81 :569-579; Altieri (1995) FASEB J. 9:860-865; Cirino et al. (1997) J. Clin. Invest. 99(10):2446-2451; Leadley et al. (2001) Curr. Opin. Pharmacol.1(2):169-175). 면역, 염증 및 체세포분열 경로의 FXa-매개 활성화는 부종과 같은 희망되지 않는 효과를 야기할 수 있다(Cirino et al. (1997) J. Clin. Invest. 99(10):2446-2451). FXa의 이러한 활성은 인자 V와 독립적으로 일어나며, 하기에서 보다 구체적으로 논의된다.
중요하게, 인자 X의 지모겐 구조(하기에서 논의됨)는 상기 언급된 경로의 활성화를 할 수 없다(Ambrosini et al. (1997) J. Biol . Chem. 272(13):8340-8345). 따라서, 상기 기술된 FXa를 치료제로서 사용하는 것의 위험을 극복하기 위해서, 본원에서 제공되는 FXa 폴리펩티드는 상기 폴리펩티드의 구조적 능력을 변경시키기 위해 변형되어 상기 폴리펩티드가 지모겐 구조를 모방하고 FVa의 부재에서 낮은 활성 또는 무활성을 나타내도록 한다. 그러나 FVa의 포화 수준의 존재에서, FXa의 돌연변이의 활성은 프로트롬빈분해효소 복합체로의 일단 조립되면 완전히 복구된다. 본원에서 보여지는 바와 같이, 본원에서 제공된 변형 FX의 FXa 형은 FVa의 부재에서와 비교하여 FVa의 존재에서 야생형 FXa에 의해 나타나는 것보다 대략 50배 내지 100배 또는 그 초과인, 150,000 또는 그 이상, 일반적으로 300,000 배 또는 그 이상과 동등하거나 그 초과인, 촉매적 활성의 비율로서 상대적 보조인자 의존성을 나타내는 것들을 포함한다.
돌연변이 I195L(키모트립신 넘버링에 의해 I16L에 상응, lvanciu et al. (2011) Nature Biotechnology, 29:1028-1033 및 Bunce et al.(2011) Blood, 117:290-8 참조)과 같은, 지모겐-유사 활성을 나타내는 것으로 기술되는 당업계의 기존의 FXa 돌연변이는 FVa의 부재에서 여전히 실질적 활성을 유지한다. 이는 특정 지모겐-유사 FXa 돌연변이의 치료적 적응증을 제한할 수 있다. 크게 증가된 보조인자 의존성을 나타내는 변형 FXa 지모겐-유사 폴리펩티드가 혈전증 또는 염증과 관련된 독성을 부여하지 않고 응고를 용이하게 함으로써 치료적 이점을 나타내는 것이 본원에서 발견된다. 따라서, 본원에서 이러한 변형 FXa 폴리펩티드가 제공된다. 또한, 본원에서 제공되는 FXa 폴리펩티드는 또한 ATⅢ와 같은 혈장 프로테아제 저해제에 의한 불활성화에 저항하는 것들, 및 그 외에 증가된 또는 개선된 순환 반감기를 나타내는 것들을 포함한다.
하기 섹션 및 하위섹션은 응고 경로, 구조, FX 형태(예컨대 지모겐 및 FXa 형)의 가공 및 조절, 및 응고 경로에서 FX의 기능을 기술한다. FV-의존적 및 독립적 활성의 구조, 기능, 및 조절이 또한 하기에서 기술된다.
1. 응고 경로
응고는 혈액이 응괴를 형성하는 복잡한 과정이다. 이는 손상된 혈관 벽이 혈소판 및 피브린을 포함하는 응괴로 덮여 출혈을 멈추고 손상된 혈관의 수선을 시작하는, 손상된 혈관으로부터의 혈액 소실을 중단시키는 지혈(hemostasis)의 중요한 부분이다. 응고의 질병은 피흘림(출혈) 또는 폐쇄적 응괴(혈전증)의 위험 증가로 이어질 수 있다. 응고 경로는 매우 보존되어 있으며, 세포적(혈소판) 및 단백질(응고 인자) 성분과 관련된다. 응고의 제1 단계(primary pahse)에서, 혈소판은 활성화되어 상해 부위에서 지혈성 플러그를 형성한다. 혈장 응고 인자들이 관여하는, 2차 지혈이 그 후에 일어나는데, 이는 혈소판 플러그를 강화시키는 피브린 가닥의 형성을 야기하는 단백분해 캐스케이드에서 작용한다.
혈소판 플러그의 강화로 이어지는 단백분해 캐스케이드는 일련의 반응에 의해 일어나는데, 여기에서 순환하는 세린 프로테아제의 지모겐(불활성 효소 전구체) 및 그것의 당단백질 보조인자는 활성화되어 활성 성분이 되고 그 후 캐스케이드에서 다음 반응을 촉매하여, 궁극적으로 가교결합된 피브린을 야기한다. 응고 인자는 일반적으로 로마 숫자(예컨대 인자 X)로 표시된다. 로마 숫자에 부기된 소문자 "a"는 활성형을 나타낸다(예컨대 인자 Xa).
응고 캐스케이드는 전통적으로 3개의 경로로 나뉜다: 외인성(또는 조직 인자) 경로, 내인성 (또는 접촉 활성화) 경로 및 공통 경로(도 2 참조). 내인성 및 외인성 경로는 평행으로 일어나며, 인자 X에서 수렴하여 공통 경로를 형성하는데, 이는 피브린 응괴의 형성을 야기한다(Mann et al. (1990) Blood, 76(1): 1-16).
a. 조직 인자(외인성) 응고 경로
응고는 혈관에 대한 상해가 혈관벽의 내피를 손상시킨 후에 거의 즉시 개시된다. 혈액 응고 개시의 1차적 경로는 조직 인자 경로(Tissue Factor Pathway)이다. 조직 인자(TF)는 세포의 표면상에 발현되고 정상적으로는 흐르는 혈액에 노출되지 않는 막관통 단백질이다. 혈액에 대한 노출시, TF는 순환하는 세린 프로테아제 인자 Ⅶ(FⅦ)와 연합하는데, 이는 막 표면상의 인자Ⅶ의 활성화(FⅦa)로 이어진다. TF/FⅦa 복합체(테나제(tenase)로도 불림)는 그 후 불활성의, 순환하는 인자 X(FX)의 TF-포함 세포의 표면상의 활성 세린 프로테아제(FXa)로의 전환을 촉매한다.
b. 내인성 응고 경로
내인성 응고 경로는 혈장내에 내인적으로 존재하는 효소들이 관여하며 혈관의 완전성이 위태로워진 후에, 노출된 콜라겐 상의 인자 XII를 포함하는 단백질 복합체의 형성으로 시작한다. 다른 사건들 중에서도, FXII는 FXIIa로 활성화되어 프로테아제 캐스케이드를 개시한다. FXIIa는 (인자 XI)FXI를 FXIa로 전환한다. 인자 XIa는 인자 IX(FIX)를 FIXa로 활성화시킨다. FIXa는 그 후 FIXa의 글리코실화 보조인자인 FⅧa와 테나제(tenase) 복합체를 형성하여, 활성화된 혈소판의 표면상에서 FX를 FXa로 활성화시킨다.
c. 공통 경로
외인성 및 내인성 경로는 TF/FⅦa 및 FⅧa/FⅨa 테나제 복합체에 의해 FX의 지모겐 형태의 절단에서 수렴하여, FX가 활성화되어 활성 FX(FXa)를 형성한다(도 2). Ca2+의 존재에서, 1:1 화학양론으로, FXa와 FXa의 활성화 보조인자인 인자 V(FVa)의 상호작용은 막-연합 프로트롬빈분해효소 복합체의 형성으로 이어진다. 프로트롬빈분해효소 복합체는 FXa와 그 FVa 보조인자인 기질 프로트롬빈 및 인지질 표면의 연합에 의해 막 표면에서 형성된다. 프로트롬빈분해효소는 Arg323-Ile324에서 프로트롬빈(FⅡ로도 불림)의 절단에 의해 작용하며, 그 후 Arg274-Thr275에서의 절단이 일어나 활성 세린 프로테아제, 트롬빈(FⅡa로도 불림)이 생산된다(Krishnaswamy et al.(1986) J. Biol. Chem., 261:8977-8984; Krishnaswamy et al. (1987) J. Biol. Chem., 262:3291-3299). 그 후 트롬빈은 피브리노겐을 피브린으로 전환하는데, 이는 활성화 트랜스글루타미나제(transglutaminase) 인자 XIII에 의해 피브린 단백질의 가교결합에 따라 상해 부위에서 응괴로 이어진다.
피브리노겐을 피브린으로 전환하는 것 뿐 아니라, FXa-활성화 트롬빈은 직접적 절단에 의해 내인성 응고 경로를 추가적으로 활성화시키는 피드백에 의해 응고를 증폭하고 확산시키는 것에 관여하여, 내인성 응고 경로의 몇몇 성분을 활성화시킨다(예컨대 인자 XI를 인자 XIa로 전환시키고 인자 Ⅷ을 인자 Ⅷa로 전환시킴). 트롬빈은 또한 공통 경로의 인자 V를 활성화시키고 혈소판을 활성화시킴으로써 응고 및 혈전을 확산시킨다.
프로트롬빈분해효소 복합체로서의 역할에 더하여, FXa는, 트롬빈 뿐 아니라, FV, FⅧ, 및 FⅦ를 포함하는 응고 인자의 활성화에 의해 피드백 활성이 가능하며, 프로테아제 활성화 수용체들(PARs)의 활성화에서 역할을 수행할 수 있다(Foster et al.(1983) J. Biol. Chem., 258(22): 13970-13977; Eaton et al.(1986) Biochemistry, 25(2):505-512; Butenas 및 Mann (1996) Biochemistry, 35(6):1904-1910).
2. 인자 V-독립적 활성
인자 V/Va의 부재에서, FXa는 낮은 수준의 트롬빈 활성화가 가능하며 염증 반응 매개, 유전자 발현, 및 세포 증식을 포함하는 비-지혈성 세포적 사건에서 기능할 수 있다(Camerer et al. (1999) J. Biol. Chem. 274:32225-32233; Cirino et al. (1997) J Clin. Invest. 99(10):2446-2451; Gajdusek et al. (1986) J. Cell Biol. 103:419-428; Gasic et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89:2317-2320; Herbert et al. (1998) J. Clin. Invest. 101:993-1000; Ko et al. (1996) J Clin. Invest. 98:1493-1501; Papapetropoulos et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:4738-4742; Senden et al. (1998) J Immunol 161:4318-4324). 이러한 FV/FVa-독립적 활성은 하기에서 보다 구체적으로 기술된다.
a. 트롬빈 활성화
인자 Va 보조인자의 부재에서, 상당히 감소되었을지라도, FXa는 프로트롬빈 활성화로 이어지는 일부 촉매적 활성을 유지한다(Nesheim et al. (1979) J. Biol. Chem., 254:10952-10962). 프로트롬빈 활성화의 경로는 FXa가 용액내에 있는지 또는 인지질의 표면상에 FVa와 프로트롬빈분해효소 복합체로 통합되었는지 여부에 따라 구별된다. 용액내에서, 프로트롬빈 활성화는 Arg274에서 프로트롬빈의 최초 절단에 의해 진행하여, 프리트롬빈(prethrombin) 및 단편 1.2를 생성하며, 그 후 Arg323에서 프리트롬빈 단편 내에서의 두번째 절단에 의해 이는 이황화-연결된 α-트롬빈의 A 및 B 쇄를 생성한다(Mann et al.(1981) Methods Enzymol., 80:286-302).
대조적으로, 막-결합 프로트롬빈이 막-결합 프로트롬빈분해효소에 의해 활성화될 때, 프로트롬빈 활성화는 먼저 Arg323에서의 절단에 의해 진행하여, 중간 산물로서 마이조트롬빈(Meizothrombin)의 이황화 연결된 쇄를 생성하며, 그 후 Arg274에서 마이조트롬빈의 절단에 의해 α-트롬빈을 생성하고 펩티드 단편 1.2의 활성화가 일어난다(Krishnaswamy et al. (1986) J Biol. Chem. 261 (19) 8977-8984).
마이조트롬빈 중간체는 그 자체로 강력한 혈관수축제로 작용하는 세린 프로테아제 기능이 있고(Thompson et al. (1987) Blood, 70:41Oa. (초록 1494); Thompson et al. (1990) J. Vasc. Med. Biol., 1 :348; Doyle and Mann (1990) J. Biol. Chem., 265(18) 10693-10701) 트롬보모듈린(thrombomodulin)에 결합되었을 때 항응고제 단백질 C(하기에서 기술됨)를 활성화시킴으로써 혈액 응고에서 조절 구성요소로서 작용할 수 있다(Mann et al. (1990) Blood, 76(1):1-16).
b. 염증 및 세포 증식
응고 경로에서의 역할 뿐 아니라, FXa는 염증 및 체세포분열을 포함하는 기타 생리적 기전에 기여한다(Leadley et al. (2001) Curr. Opin. Pharmacol. 1(2):169-175). FXa는 주로 이펙터 세포 프로테아제 수용체(Effector Cell Protease Receptor, EPR-1)에 결합함으로써 또는 프로테아제 활성화 수용체(Protease Activated Receptors, Pars)의 단백분해적 활성화에 의해 다양한 세포에서 이러한 신호 경로를 개시한다.
i. 이펙터 세포 프로테아제 수용체-1(EPR-1)
이펙터 세포 프로테아제 수용체-1(EPR-I)은 단핵구, 백혈구, 혈관 내피세포, 및 평활근 세포의 표면상의 FXa에 대한 수용체로서 확인된 바 있다(Altieri (1995) FASEB J 9:860-865; Nicholson et al. (1996) J Biol. Chem. 271:28407-28413; Bono et al. (1997) J Cell. Physiol. 172:36-43). FXa의 EPR-1에 대한 결합은 백혈구 활성화(Altieri (1995) J Leukocyte Biol. 58:120-127), 트롬빈 형성(Bouchard et al. (1997) J. Biol. Chem. 272:9244-9251; Ambrosini and Altieri (1996) J Biol. Chem. 271:1243-1248), 및 세포 증식(Nicholson et al. (1996) J Biol. Chem. 271:28407-28413)을 야기한다. 백혈구 활성화는 면역반응의 일부로서 혈관확장 및 염증으로 이어지는 사이토카인의 합성 및 접착 분자의 발현을 동반한다.
성숙 FX 서열의 위치 83-88에 위치한, FXa 서열 LFTRKL(서열번호 555)은 EPR-1에 대한 인식 부위이다(Ambrosini et al. (1997) J Biol. Chem. 272 (13): 8340-8345; Cirino et al. (1997) J Clin. Invest. 99(10):2446-2451). FXa 효소 활성은 EPR-1 결합에 요구되지 않는다(Herbert et al.(1998) J Clin. Invest. 101 :993-1000; Ambrosini et al. (1997) J Biol. Chem. 272 (13):8340-8345). 그러나, 인자 X의 지모겐 구조는 ERP-1 결합 모티프에 대한 접근을 방지하기 때문에 FX의 활성화는 ERP-1 결합에 요구된다. FXa의 경쇄에서 구조적 변이는 상호작용 도메인을 드러내어, EPR-1 결합 및 그 후의 신호 전달을 허용한다.
ii. 프로테아제 활성화 수용체(PARs)
FXa는 또한 프로테아제 활성화 수용체(PARs)의 단백분해 활성화를 통한 세포 신호전달의 개시를 가능하게 한다. PARs는 G-단백질-결합 수용체로서, 혈소판, 내피세포, 근세포 및 뉴런에서 높게 발현된다(Macfarlane et al.(2001) Pharmacol. Rev. 53(2):245-282). 특히, FXa는 프로테아제 활성화 수용체-1(PAR-1) 및 프로테아제 활성화 수용체-2(PAR-2)를 절단하여 N-말단 펩티드를 방출하는데, 상기 펩티드는 결과적으로 고정화된 리간드(tethered ligand)로서 작용하여 활성화로 이어진다(McLean et al. (2001) Thrombosis Research 103:281-297). PAR-1 및 PAR-2의 활성화는 G-단백질 결합 신호전달에 의해 매개되는 세포 증식 증가(Macfarlane et al. (2001) Pharmacol. Rev. 53(2):245-282), 전염증성 사이토카인 및 접착 분자의 생산 증가(McLean et al. (2001) Thrombosis Research 103:281-297; Senden et al. (1998) J Immunolo1 161:4318-4324 ; Papapetropoulos et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:4738-4742), 및 프로트롬보틱 조직 인자(TF)의 생산 증가(McLean et al. (2001) Thrombosis Research 103 :281-297)를 야기한다. FXa 효소 활성은 PAR 신호전달을 활성화하는데 요구된다(McLean et al. (2001) Thrombosis Research 103:281-297).
3. 인자 X 저해제
인자 X 활성은 혈액내에서 3가지 주된 항응고제 단백질 시스템에 의해 저해된다: 항트롬빈 Ⅲ(AT-Ⅲ)/헤파린, 단백질 C/단백질 S, 및 조직 인자 경로 저해제(TFPI). 상기 3가지 시스템은 인자 X 활성 저해에 있어서 구별되고 보충적인 역할을 수행하여, 응고 경로를 저해한다.
항트롬빈(AT-Ⅲ)은 인자 X가 AT-Ⅲ에 대한 반응 부위 고리(loop)에서 반응성 결합에 공격을 개시하는 동안 단백분해 과정의 중간 단계에서 인자 Xa를 붙잡아 상기 효소의 세린 프로테아제 활성을 저해한다. 헤파린은 인자 Xa의 활성 부위 내로의 진입을 용이하게 하는 AT-Ⅲ의 반응성 부위 고리 내에서 구조적 변화를 유도하고 안정한, 불활성의 터너리(ternary) 복합체의 형성을 용이하게 하는 인자 Xa의 표면상의 염기성 잔기와 직접적으로 상호작용함으로써 인자 Xa의 저해를 돕는다(Rezaie, AR, (2000) J Biol. Chem., 275(5):3320-3327; Langdown et al. (2004) J Biol. Chem., 279 (45): 47288-47297).
단백질 C 경로에 있어서, 혈장내를 순환하는 또 다른 비타민 K-의존적 세린 프로테아제 지모겐인 단백질 C는, 응고 경로의 결과로서 트롬빈 형성에 이어서 내피 표면에서 트롬빈-트롬보모듈린(thrombomudoulin)-내피 단백질 C 수용체 복합체에 의해 제한된 단백분해에 의해 활성화 단백질 C(APC)로 전환된다(Esmon and Owen (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78:2249-2252). 활성 단백질 C(APC)는 그 후 단백분해적 절단에 의해 인자 Va(FVa)를 불활성화함으로써 인자 Xa 활성을 저해한다. FVa의 APC 소화는 FVa의 단백질 C 절단을 촉매하고 단백질 C의 불활성화를 저해하는 FXa의 결합에 의해 단백질 S에 의해 용이하게 수행된다(Mosnier and Griffin JH (2006) Front. Biosci., 11: 2381-2399).
조직 인자 경로 저해제(Tissue Factor Pathway Inhibitor, TFPI)는, 인자 X 지모겐이나, 활성 부위 근처가 아니라, 인자 Xa에 직접적으로 결합함으로써 인자 Xa를 저해한다(Broze et al. (1988) Blood, 71 (2): 335-343; Broze et al. (1990) Biochemistry, 7539-7546). 상기에서 논의된, AT-Ⅲ과 같이, FXa의 TFPI 저해는 헤파린의 존재에서 가속화된다. FXa-TFPI 복합체는 그 후 FVIIa-조직 인자 테나제(tenase) 복합체의 결합 및 저해에 의해 조직 인자 응고 경로(및 추가적 FX 활성화)를 저해한다.
C. 인자 X 구조 및 활성화
기타 응고 효소와 같이, 인자 X는, 지모겐이라 불리는, 활성화를 위해 단백분해적 절단을 요구하는 불활성 전구체로서 혈액 내를 순환한다. 지모겐은 활성화 후에 생산되는 세린 프로테아제와 비교하여 약 10,000 배 또는 그 미만의 단백분해 활성을 갖는다. 상기에서 논의된 바와 같이, 혈관 손상 부위에서의 응고 개시는, 지모겐이 특이적 단백분해적 절단을 통해 활성 프로테아제로 전환되어 연속적인 반응을 위한 활성 효소를 생성하는 일련의 반응으로 이어진다. FXa는 TF/FⅦa 및 FⅧa/FⅨa 테나제 복합체에 의해 FX 지모겐의 단백분해적 절단에 있어서 생성된다(도 2 참조). 이는 혈구 활성화 및 가용성 피브리노겐의 불용성 피브린으로의 전환을 야기하여 응괴 형성을 일으켰다. 과량의 프로테아제는 "자살" 기질로서 작용하는 순환 프로테아제 저해제 또는 활성 효소를 인식하는 것들과의 반응에 의해 제거된다. 따라서, 응고 지모겐의 단백분해적 활성화는 응고 캐스케이드의 핵심 조절적 특징이다.
인자 X cDNA는 다수의 포유류 종으로부터 클로닝된 바 있다. 예시적인 FX 폴리펩티드는 인간(서열번호 2로 기재되고 서열번호 1에 의해 암호화되는 전구체 프리프로펩티드; 및 서열번호 134로 기재되는 성숙형); 북부 흰뺨 긴팔원숭이(서열번호 393으로 기재되는 전구체 프리프로펩티드 및 서열번호 404로 기재되는 성숙형), 올리브 개코원숭이(서열번호 394로 기재되는 전구체 프리프로펩티드 및 서열번호 405로 기재되는 성숙형), 레서스 원숭이(서열번호 395로 기재되는 전구체 프리프로펩티드 및 서열번호 406으로 기재되는 성숙형), 더스키 티티 원숭이(서열번호 396으로 기재되는 전구체 프리프로펩티드 및 서열번호 407로 기재되는 성숙형), 아프리카 코끼리(서열번호 397로 기재되는 전구체 프리프로펩티드 및 서열번호 408로 기재되는 성숙형), 마우스(서열번호 398로 기재되는 전구체 프리프로펩티드 및 서열번호 409로 기재되는 성숙형), 토끼(서열번호 399로 기재되는 전구체 프리프로펩티드 및 서열번호 410으로 기재되는 성숙형), 랫트(서열번호 400으로 기재되는 전구체 프리프로펩티드 및 서열번호 411로 기재되는 성숙형), 개(서열번호 401로 기재되는 전구체 프리프로펩티드 및 서열번호 412로 기재되는 성숙형), 돼지(서열번호 402로 기재되는 전구체 프리프로펩티드 및 서열번호 413으로 기재되는 성숙형), 및 소(서열번호 403으로 기재되는 전구체 프리프로펩티드 및 서열번호 414로 기재되는 성숙형)을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 인간 FX의 몇몇 대립유전자 변이체도 확인되었다(Cargill et al. (1999) Nat. Gen., 22:231-238; 서열번호:547-552).
기능적 FXa 활성 효소의 생성을 야기하는, 혈류 내로의 분비에 있어서 불활성 FX 지모겐 전구체의 가공을 조절하는 과정 및 구조적 특징은, 인간 FX 성숙, 지모겐 및 FXa 폴리펩티드로의 예시와 함께 하기에 개요가 서술된다. 이러한 기술에 기초하여, 당업자는 이의 대립유전자 또는 종 변이체를 포함하는, 기타 FX 폴리펩티드에서 이의 상응하는 성숙, 지모겐, FXa 및 촉매적 활성형을 알고 있거나 결정할 수 있다. 예를 들어, 지모겐 형이 임의의 상기 단일-쇄 성숙형의 이중쇄 형을 포함하는데, 여기에서 아미노산 잔기가 단일쇄 FX의 쇄간 단백분해에 의해 절제되어 상기 폴리펩티드가 이황화 결합에 의해 연결된 경쇄 및 중쇄를 포함한다는 것이 포함된다. 또한, 종 및 대립유전자 변이체 및 기타 변이체의 FXa는 일반적으로 활성화 펩티드를 추가적으로 결여하는 이의 이중쇄 형으로 존재한다. 인간 FX에 관하여 예시된 본원의 기술 및 종 및 대립유전자 변이체의 당업계의 지식을 고려하여, 당업자는 예시된 대립유전자 및 종 변이체 및 기타 당업계에 알려진 변이체에서 이러한 형태에 상응하는 잔기를 잘 알고 있고 확인할 수 있다.
1. FX 가공, 번역후 변형 및 지모겐 분비
인자 X는 세린 엔도프로테나제(endoproteinase)이고 키모트립신-유사 접힘(fold)을 갖는 프로테아제의 S1 펩티다제 패밀리의 일원이다. 인자 X를 암호화하는 인간 유전자는 13번 염색체의 긴 팔에 위치한다(13q34). 인자 X는 8개의 엑손으로 이루어져 있으며 대략 33 킬로베이스(kilobase) 길이이고, 간에서 주로 발현된다. 인간 FX 전사체는 1560 뉴클레오티드 길이이고, 짧은 5' 비번역 영역, 및 1467 뉴클레오티드의 오픈 리딩 프레임(open reading frame), 및 3' 비번역 영역을 포함한다. 상기 1467 뉴클레오티드 오픈 리딩 프레임(또는 Fx mRNA; 서열번호 1)은 488 아미노산 프리-프로펩티드(Swiss-Prot 접근번호 P00742; 서열번호 2)를 암호화한다.
인자 X는 프리프로펩티드라고 명명된 단일쇄 전구체 단백질로서 간에서 합성된다. 프리프로펩티드 FX는 간세포의 분비 경로를 거쳐 이동하는 동안 가공된다. 인간 FX의 예시와 같이, 프리-프로펩티드는 소포체(endoplasmic reticulum, ER) 내로의 전좌에 의해 간세포 분비 경로 내로 인자 X 폴리펩티드를 인도하는 31 아미노산 N-말단 신호 펩티드(서열번호 2의 아미노산 1-31)을 함유한다. 신호 펩티드는 그 후 신호 펩티다제에 의해 절단되어, 신규한 아미노 말단에서 9 아미노산 프로펩티드를 남겨(서열번호 2의 aa 32-40) FX의 프로펩티드 형태를 생성한다. 폴리펩티드가 ER의 내강에서 그것의 3차 구조로 접히면서, 12개의 이황화 결합이 형성된다. 인간 FX에 대하여, 이러한 결합은 서열번호 134로 기재되는 잔기에 상응하는 위치 17 및 22, 50 및 61, 55 및 70, 72 및 81, 89 및 100, 96 및 109, 1ll 및 124, 132 및 302, 201 및 206, 221 및 237, 350 및 364, 375 및 403 사이에서 형성된다(도 1 참조).
야기되는 폴리펩티드는 그 후 ER 내강에서 번역후 변형된다. N-말단 프로펩티드는 비타민 K-의존적 카복실라제에 의해 몇몇 글루탐산 잔기(서열번호 134로 기재되는 FX 폴리펩티드의 아미노산 6, 7, 14, 16, 19, 20, 25, 26, 29, 32, 및 39에 상응하는)의 γ-카복시글루탐산(Gla)로의 전환으로 이어지는 인식 구성 요소로서 작용한다(Furie and Furie (1988) Cell, 53:505-518). 이 γ-카복실화 단계는 ER과 골지체 간의 FX 전구체의 수송에서 역할을 수행하며(Stanton and Wallin (1992) Biochem. J, 284:25-31), 순환하는 성숙 Fx 지모겐의 최적 Ca2+-매개 활성화와 관련된다. FX 폴리펩티드는 트랜스-골지 구획에서 β-히드록실화 및 글리코실화에 의해 추가적으로 번역후 변형된다. 연구들은 이러한 잔기의 글리코실화가 인자 X 지모겐의 생리적 활성화제에 의한 인자 X의 인식에 중요함을 보인 바 있다(Yang et al. (2009) J Thromb. Haemost., 7(10): 1696-1702). 예를 들어, 인간 FX와 관련하여, 히드록실화는 서열번호 134로 기재되는 FX 폴리펩티드의 위치 63에 상응하는 아스파르트산 잔기에서 일어나며(McMullen et al. (1983) Biochemistry, 22:2875-2884) 글리코실화는 서열번호 134로 기재되는 FX 폴리펩티드의 잔기 159 및 171에 상응하는 위치에서 트레오닌 잔기에서 및 잔기 181 및 191에 상응하는 위치에서 아스파라긴 잔기에서 일어난다(Inoue and Morita (1993) Eur. J Biochem, 218:153-163).
프로펩티드는 트랜스-골지체에서 단백분해적 절단에 의해 제거되어 상기 프로펩티드를 결여하는 성숙형(서열번호 134로 기재)을 생성하는데, 이는 혈류 내로의 지모겐의 분비 전에 일어난다. 또한, 단일쇄 성숙 FX의 쇄간 단백분해도 트랜스-골지 구획에서 일어나는데, 이는 프로펩티드의 절단에 선행하거나 그 후에 일어날 수 있다(Stanton and Wallin (1992) Biochem. J 284:25-31). 이는 서열번호 134로 기재되는 잔기에 상응하는 아미노산 140-142의 제거, 및 이중쇄 폴리펩티드의 생성을 야기한다. 따라서, 야기되는 분비된 FX 지모겐은 이황화 결합에 의해 연결된 경쇄 및 중쇄로서 존재한다. 예를 들어, 서열번호 134로 기재되는 성숙 단일쇄형을 참고로, 경쇄는 130 아미노산(서열번호 134의 잔기 1-139에 상응하는)이고 중쇄는 306 아미노산(서열번호 134의 잔기 143-448에 상응하는)이다. 분비된 지모겐은 서열번호 134의 아미노산 140-142의 절제로 인해 이중쇄형으로서 존재하는데, FX의 경쇄 및 중쇄는 서열번호 134로 기재되는 아미노산 잔기에 대하여 (경쇄의) Cys132 및 (중쇄의) Cys 302 간의 이황화 결합에 의해 연결된 채로 유지된다(Di Scipio et al. (1977) Biochemistry, 16:698-706).
경쇄 및 중쇄를 포함하는, 분비된 이중쇄 지모겐 불활성형은 효소의 활성화를 위해 제거되어야만 하는 중쇄의 N-말단에서 활성화 펩티드를 포함한다(도 2 참조). 서열번호 134로 기재되는 인간 FX를 참고로, 야생형 FXa 지모겐은 서열번호 134의 아미노산 1-139에 상응하는 아미노산의 서열을 갖는 경쇄 및 아미노산 143-448에 상응하는 아미노산 서열을 갖는 중쇄를 가지며, 활성화 펩티드는 상기 중쇄의 아미노 말단에서 52 아미노산 잔기로 구성된다. 활성 FX(FXa)는 활성화 펩티드를 제거하는 단백분해적 절단에 의해 생성되는데, 이는 하기에서 추가적으로 논의된다. FXa의 경쇄 및 중쇄는 서열번호 134로 기재되는 아미노산 잔기를 참고로 (경쇄의) Cys 132 및 (중쇄의) Cys 302 사이의 이황화 결합에 의해 연결된 채로 유지된다.
(하기에서 논의되는) 활성화 펩티드의 절단 이전에, 인자 X의 순환하는 지모겐 형은 4개의 주된 분절들과 관련하여 FXa로부터 구조적으로 구별되는 구조적 입체구조(structural conformation)로 존재한다. 집합적으로 "활성화 도메인"이라고 불리는, 상기 분절들은 중쇄의 N-말단(활성화 펩티드 더하기 서열번호 134의 잔기 195-198)이고, 잔기 325-334, 365-377, 및 400-406(서열번호 134로 기재되는 잔기에 상응하는)이다. 중쇄의 N-말단에서 활성화 펩티드는 FX의 활성화 도메인 분절을 구조적으로 차단한다. 불활성 지모겐에서, 상기 활성화 도메인은 기질 결합 포켓(substrate binding pocket)(S1 부위)의 부분을 덮어, 기질 접근을 제한하고 매우 낮은 촉매적 활성만을 허용한다.
2. 활성화 인자 X(FXa)의 활성화 및 생성
지모겐 형의 활성화 절단, 및 일반적으로 활성화 펩티드의 방출은, 활성 세린 프로테아제를 생성하기 위해 요구된다. 일반적으로, 세린 프로테아제에 대해, 지모겐의 활성 세린 프로테아제로의 전환은, 키모트립신 넘버링에 의해 Arg15(전형적으로 Arg15 및 Ile16)다음의 절단을 요구한다. 이는 활성화 펩티드의 제거를 야기할 수 있고 Ile16로 시작되는 촉매적 도메인에서 신규한 N-말단을 노출할 수 있다. 예를 들어, FX에 대하여, 활성화된 FX(FXa)는 활성화 펩티드의 제거에 의해 FX 지모겐으로부터 생성되는데, 이는 서열번호 134로 기재되는 잔기에 상응하는 아미노산 194-195 사이의 단백분해적 절단 후에 일어난다. FX에 대하여, 단백분해적 절단은 응고 경로의 상류의 활성화 세린 프로테아제, 즉 TF/FⅦa 및 TF/FⅨa 테나제 복합체에 의해 생체내에서 개시된다. 단백분해적 절단에 의한 활성화는 또한, 예를 들어, 본원에서 실시예에서 기술되는 바와 같이 러셀 살모사 독 FX 활성화제를 사용하여, 시험관내에서 유도될 수 있다.
활성화 펩티드의 제거를 위한 단백분해적 가공은, 서열번호 134로 기재되는 성숙 FX에서 소수성 잔기 Ile195-Gly198에 상응하는, 중쇄의 신규한 N-말단을 드러낸다. 야기되는 FXa는, 이황화 결합에 의해 경쇄에 연결된, 촉매적으로 활성인 중쇄를 포함한다. 서열번호 134로 기재되는 아미노산 서열을 참고로, 야생형 FXa는 서열번호 134의 아미노산 1-139에 상응하는 아미노산 잔기의 서열을 갖는 경쇄 및 서열번호 134의 아미노산 잔기 195-448에 상응하는 아미노산 서열을 갖는 중쇄를 갖는다. FXa의 경쇄 및 중쇄는 서열번호 134로 기재되는 아미노산을 참고로 (경쇄의) Cys 132 및 (중쇄의) Cys302 사이의 이황화 결합에 의해 연결된 채로 유지된다.
중쇄의 노출된 신규한 N-말단 서열은 촉매적 도메인 내로 다시 접혀 서열-특이적 방식으로 N-말단 결합 틈새 내로 삽입한다. 상기 N-말단 삽입은 촉매적 도메인 내부에서 키모트립신 넘버링에 의해 Ile16 및 Aps194(서열번호 134로 기재되는 성숙 FX의 넘버링에 의해 Ile195 및 Asp378에 상응하는)의 α-NH2 기 사이의 염다리의 형성으로 이어진다. 염다리 형성은 활성화 도메인의 재정렬, 촉매 작용을 위해 요구되는 산소음이온 구멍의 형성 및 기질 결합 부위의 형성을 포함하는 촉매적 도메인의 다수의 변화와 관련된다. 이러한 변화는 활성 세린 프로테아제의 성숙으로 이어진다. 예를 들어, 소수성 코어에서 새로 노출된 N-말단과 Asp378 사이의 파묻힌 염다리의 형성을 제공하기 위한 3차 구조의 재정렬은 S1 하위부위(subsite)를 정렬하고(order) 활성 프로테아제를 야기하는 활성화 도메인에서의 구조적 변화로 이어진다.
서열번호 134의 중쇄 잔기 195-448은 키모트립신-유사 세린 프로테아제 도메인의 특징을 이룬다. 키모트립신-유사 세린 프로테아제 패밀리의 다른 일원들과 같이, FX의 프로테아제 도메인은 촉매적 활성 부위에서 수렴하는 2개의 격자무늬(Greek key) β-배럴(β-barrel) 하위도메인을 포함한다. 잔기 His236, Asp282, 및 Ser379는 활성 프로테아제의 활성-부위 촉매적 트라이어드를 구성한다. 서열번호 134의 Arg429 다음의 추가적인 FXa의 자가-단백분해는 FXa의 α-형태를 β-형태로 전환한다(Mertens and Bertina, Biochem. J. (1980) 185:647-658). 그러나, FXa의 이러한 2가지 형태는 기능적으로 구별이 되지 않는다(Pryzdial and Kessler, J. Biol. Chem. (1996) 271 :16621-16626).
프로테아제 도메인의 활성 부위는 S1-S4로 번호가 붙여진 4개의 하위 포켓으로 나뉜다. S1 포켓은 3차원 구조에서 촉매적 트라이어드 옆에 위치하며, 기질 특이성 및 결합의 주된 결정 요인이다. S1 포켓은, Cys403-Cys375 이황화 결합에 의해 연결되는, 서열번호 134의 잔기 398-403 및 373-379에 의해 형성되는 고리, 및 서열번호 134의 잔기 409-412에 의해 형성된다. S1 포켓 내에서, Asp373, Gly400, 및 Gly410은 기질 결합 선택성을 위한 핵심 잔기이다. S2 부위는 서열번호 134의 잔기 270-279에 상응하는 고리에 의해 형성되는 작고 얕은 포켓이다(Rai et al., Curr. Med. Chem. (2001) 8(2):101-119). 서열번호 134의 Tyr279에 상응하는 Tyr은 S2 하위부위(subsite)에서의 효소 특이성에 중요하다(Rezaie, J. Biol. Chem. (1996) 271(39):23807-23814). FXa의 S3 영역은 S1 포켓의 가장자리에 위치하며, 용매 노출되어 있고, 낮은 결합 특이성을 부여한다. S4 하위부위는 서열번호 134의 아미노산 270-279 및 350-359를 포함하는 고리 사이에 형성되며 3개의 리간드 결합 도메인을 포함한다: "소수성 박스(hydrophobic box)"(서열번호 134의 잔기 Tyr279, Phe356 및 Trp399에 의해 형성된), "양이온성 구멍(cationic hole)" (서열번호 134의 Glu277의 측쇄 및 K276의 백본(backbone)에 의해 형성된), 및 물 부위(water site) (서열번호 134의 Thr278, Ile357, 및 Thr359에 의해 형성된)(Rai et al., Curr. Med. Chem. (2001) 8(2):101-119).
FXa 및 지모겐 형의 경쇄는 3개의 특징적 구조적 도메인을 갖는데, 각각은 구별되는 기능적 성질을 갖는다(Leytus et al., Biochemistry. (1986) 25:5098-5102; Padmanabhan et al., J. Mol. Biol. (1993) 232:947-966). γ-카복시글루탐산(GLA)-풍부 도메인(서열번호 134의 잔기 1-39)은 상기 언급된 11개의 GLA 잔기를 함유하며, 세포막과의 Ca2+-의존적 FX 연합에서 중요하다: 프로트롬빈분해효소 복합체의 조립을 위한 요구사항(Morita and Jackson, J Biol. Chem. (1986) 261(9):4015-4023). GLA 도메인은 짧은 소수성 스택(stack) (서열번호 134의 잔기 40-45에 상응하는) 및 2개의 상피 성장 인자(EGF)-유사 도메인: EGF1 (서열번호 134의 아미노산 46-84에 상응하는) 및 EGF2 (서열번호 134의 아미노산 85-128에 상응하는) 앞에 존재하는데, 이는 단백질-단백질 상호작용과 관련되며, EGF1의 경우에, 잔기 Gly47, Gly64, Gln49, Asp/Hya63, 및 Asp46과 관련된 Ca2+-결합과 관련된다(Selander-Sunnerhagen et al., J Biol. Chem. (1992) 267(27):19642-19649).
FXa가 완전히 기능적인 활성 부위를 갖고 프로트롬빈의 트롬빈으로의 절단을 위한 촉매적 기구를 포함함에도 불구하고, FX는 일부 활성이 존재함에도 불구하고 이 반응에 대해서는 활성이 떨어지는 촉매이다. 이 보조인자 독립적 활성은 상기 기술된 Fxa의 주입과 관련된 해로운 부작용의 일부를 설명한다. 일반적으로, 생물학적 기질의 효율적인 절단에 의한 완전한 활성은 보조인자로서 인자 Va(FVa)를 요구한다. 혈소판 막에 존재하는 FVa는 FXa에 결합하여, 인지질에 대한 FXa의 증가된 친화성 및 촉매적 활성의 증가를 야기한다(예컨대 Segers et al. (2007) Thromb. Haemost., 98:530-542 참조). 예를 들어, 실시예에서 보여진 바와 같이, 야생형 FXa 는 일반적으로 FVa의 부재에서보다 FVa의 존재에서 그것의 기질에 대한 3000 배 초과 증가된 촉매적 활성을 나타낸다. FXa에서 코어(core) 보조인자 결합 에피토프는 서열번호 134로 기재되는 잔기에 상응하는 Arg347, Lys351 및 Lys414이다(예컨대 Rudolph et al. (2001) J. Biol. Chem., 276:5123-5128 참조).
D. 변형 인자 X 폴리펩티드
본원에서, 변형(들)을 함유하지 않는 FX 폴리펩티드의 상응하는 형태와 비교하여 변경된 또는 개선된 활성 또는 성질을 나타내는, FX 지모겐 프로테아제 및 활성 FX(FXa) 프로테아제 폴리펩티드를 포함하는, 변이체 또는 변형 인자 X(FX) 폴리펩티드가 제공된다. 특히, 이러한 변경된 또는 개선된 활성 또는 성질은 FX 폴리펩티드가 활성화되는 때 또는 FX 폴리펩티드가 변형 FXa 폴리펩티드로서 존재할 때 명백하다. 본원에서 제공되는 변형 FX 폴리펩티드에서 변경된 활성 또는 성질은 증가된 FVa 보조인자 의존성, 증가된 저해제에 대한 내성, 증가된 글리코실화의 수준 또는 정도, 증가된 반감기 및/또는 증가된 촉매적 활성을 포함한다. 예를 들어, 저해제에 대한 증가된 내성은 조직 인자 경로 저해제(TFPI) 또는 항트롬빈 Ⅲ(AT-Ⅲ) 중 하나 또는 둘 다에 대한 증가된 내성을 야기할 수 있다. 본원에서 제공되는 변형 FX 폴리펩티드의 활성형은, FVa의 존재에서를 포함하여, 촉매적 활성을 나타내며, 따라서 응혈원 활성을 나타낸다. 이러한 변형 FX 폴리펩티드는 응고 캐스케이드에서 더 일찍 작용하는 효소, 예컨대 FⅧa 및 FⅨa에 대한 요구를 우회하는 동시에 응고 활성을 제공하기 위해 질환 또는 상태의 치료에서 사용될 수 있다.
특히, 본원에서, 그들의 활성 FXa 형로 존재할 때, 상처 부위에서 개선된 국소적 활성을 유지하거나 나타내지만, 보조인자의 부재시 낮거나 없는 전신적 활성을 나타내는, 인자 X 지모겐 및 FXa 폴리펩티드를 포함하는 변형 FX 폴리펩티드가 제공된다. 이 결과는, 야생형 FXa 또는 당업계에서 임의의 존재하는 FXa와 비교하여 실질적으로 증가된 보조인자 의존성을 야기하는 본원에서 제공되는 변형(들) 때문이다. 그러므로, 활성 FXa 폴리펩티드로서 본원에서 제공되는 변형된 프로테아제는 야생형 FXa와 비교하여 훨씬 더 증가된 효능을 나타내나, 순환하는 자유 형이 상처의 부위에서 FVa 보조인자에 결합된 때에만 강한(즉, 야생형 FXa와 비교하여) 활성을 나타낼 수 있기 때문에 증가된 안전성을 나타낼 수 있다. FX 지모겐 형 및 FXa를 포함하는, 본원에서 제공되는 변형 FX 폴리펩티드는 혈우병(혈우병 A 또는 B)을 갖는 대상체를 치료하기 위한 치료적 적용에서 뿐 아니라, 예를 들어 외과 수술 또는 기타 외상에서 지혈을 조절하기 위한 기타 적용에서 사용될 수 있다.
또한 변형 FX 폴리펩티드 중에, 인자 X 지모겐 및 FXa 형을 포함하여, 증가된 반감기를 나타내는 것들이 포함된다. 인자 X/인자 Xa 지모겐/프로테아제의 혈우병의 치료를 위한 치료제로서의 사용에서의 문제는 그들의 짧은 반감기이다. 예를 들어, 인자 X는 24 내지 40 시간의 반감기를 나타낸다. 응고 경로에서 결함 또는 결핍을 나타내는 혈우병 환자의 장기적 치료를 위해, 불필요하고 희망되지 않는 빈도로 반복적 투여를 회피하기 위해서 더 긴 반감기가 유익하다. 본원에서 제공되는 변형 인자 X/인자 Xa 지모겐/프로테아제는 글리코실화의 변경된 수준 및/또는 유형으로 인해 변경된 반감기를 나타낸다. 글리코실화는 단백질의 안정성, 가용성을 증가시키고, 면역원성을 감소시킴으로써 폴리펩티드의 혈청 반감기를 증가시킬 수 있다. 인자 X 지모겐 및 FXa 형을 포함하여, 본원에서 제공되는 변형 FX 폴리펩티드는 또한 저해제, 예컨대 ATⅢ 및 기타 저해제에 대한 증가된 내성으로 인해 활성형일 때 증가된 반감기를 나타낸다.
FX 폴리펩티드의 변형(들)은, 상기 형태가, 발현되었을 때, 정제되었을 때 및 가공되었을 때(시험관내 또는 생체내에서) 경쇄 및 활성화 펩티드를 결여하는 중쇄를 함유하는 FXa를 야기할 수 있는 한, FX 폴리펩티드의 임의의 형태에 만들어질 수 있다. 본원의 목적을 위해서, 본원의 FX 폴리펩티드에서 아미노산 치환(들)에 대한 언급은 서열번호 134로 기재되는 성숙형에서 잔기를 참고하는데, 이는 경쇄(아미노산 잔기 1-139에 상응하는) 및 중쇄(아미노산 잔기 140-448에 상응하는)를 함유하고, 여기에서 상기 중쇄는 아미노산 잔기 140-142 및 FXa 형에 정상적으로 존재하지 않는 52 아미노산 활성화 펩티드를 함유한다. 따라서, 본원에서 FX의 변형된 성숙형이 제공된다. 아미노산 치환은 서열번호 134로 기재되는 성숙 폴리펩티드와의 정렬에 의해 당업계에 알려진 임의의 FX 형 또는 임의의 변이체 FX의 상응하는 잔기에서 만들어질 수 있다(예컨대 도 1 참조). 따라서, 본원에서 이황화 결합에 의해 연결된 중쇄 및 경쇄를 함유하는, 서열번호 134의 아미노산 잔기 140-142에 상응하는 아미노산 잔기를 결여하는 이중쇄 지모겐 형인, 그리고 서열번호 134로 기재되는 넘버링을 참고로 아미노산 치환(들)을 함유하는, 변형 FX 폴리펩티드가 제공된다. 본원에서 또한 중쇄에서 활성화 펩티드를 결여하고, 이황화 결합에 의해 연결된 중쇄 및 경쇄를 함유하는, 아미노산 잔기 140-142에 상응하는 아미노산 잔기를 결여하는, 서열번호 134로 기재되는 넘버링을 참조로 아미노산 치환(들)을 함유하는, 서열번호 134의 이중쇄 형인 변형 FXa 형이 제공된다. FX의 다른 형태 또는 서열번호 134 외의 다른 FX 폴리펩티드에 상응하는 잔기들은 서열번호 134와의 정렬에 의해 확인될 수 있다.
언급은 또한 키모트립신 넘버링에 대한 적용을 통해 만들어질 수 있는데, 키모트립신 넘버링은 임의의 세린 프로테아제에서 아미노산 잔기를 넘버링하기 위해 사용되는 통상적인 넘버링 제도이다(Greer (1990) Proteins:Structure, Function and Genetics, 7:317-334). 서열번호 134로 기재되는 성숙 서열 및 키모트립신에 기초한 FX 넘버링을 위한 상응하는 넘버링 제도가 본원의 표 1에 제공된다. 따라서, 키모트립신 넘버링을 참고로 본원에서 제공되는 아미노산 치환(들)을 당업계의 임의의 변이체 FX에서 생성하는 것 역시 당업자의 수준 내이다.
그러므로, 본원에서 서열번호 134로 기재되는 성숙 FX에서, 또는 지모겐, 변형(들)을 함유하는 활성 또는 촉매적 활성형에서, 또는 변형을 포함하는 변형 FX 폴리펩티드, 또는 서열번호 134, 또는 지모겐, 이의 변형(들)을 함유하는 활성 또는 촉매적 활성형에 대해 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 상동성을 나타내는 변이체가 제공된다. 예를 들어, 변형은 당업계에 알려진 임의의 대립유전자 또는 종 변이체, 예컨대 서열번호 393-414 또는 547-552 중 임의의 것으로 기재되는 임의의 서열, 또는 당업계에 알려진 임의의 변이체(예컨대 섹션 D.5 참조), 또는 지모겐, 이의 활성 또는 촉매적 활성형에 대하여 만들어질 수 있다.
야기되는 변형 FX 폴리펩티드는 단일쇄 형일 수 있고 또는 2 이상의 쇄를 포함할 수 있다. 전형적으로, 변형 FX 폴리펩티드는 이중쇄 지모겐이거나 이중쇄 활성 FXa이다. 본원에서 제공되는 임의의 변형된 폴리펩티드가 단일쇄 폴리펩티드로서 자가활성화되거나 이중쇄 형태를 생성할 수 있다는 것이 이해된다. 더 나아가, 본원에서 제공되는 활성화 펩티드를 포함하는 지모겐 형의 임의의 변형된 폴리펩티드가, 공지의 활성화제(예컨대 기타 응고 인자 복합체 또는 RVV)에 의해 활성화되어 변형된 FXa 이중쇄 형을 생성할 수 있다. 활성화 단계는 시험관내에서 수행될 수 있고 또는 생체내 적용, 예컨대 지모겐 형태의 생체내 투여에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, 활성화가 시험관내에서 수행될 때, 활성화 펩티드 또는 기타 절단된 펩티드 서열은 최종 FXa 형, 예컨대 당업계에 알려지고 실시예를 포함한 본원의 다른 부분에서 기술되는 형태로부터 정제될 수 있다. 변형 FX 폴리펩티드의 활성은 전형적으로 이중쇄 활성 FXa 형로 나타난다.
예를 들어, 본원에서 제공되는 변형 FX 폴리펩티드는 적어도 하나의 이황화 결합에 의해 연결된 경쇄 및 중쇄를 갖는 이중쇄형을 포함한다. 특히, FX 폴리펩티드에서 변형은 서열번호 134의 아미노산 1-139에 상응하는 아미노산의 서열을 갖는 경쇄 및 아미노산 143-448에 상응하는 아미노산의 서열을 갖는 중쇄를 갖는 지모겐 이중쇄형, 또는 지모겐이고 서열번호 134의 아미노산 1-139에 상응하는 아미노산의 서열을 갖는 경쇄 및 아미노산 143-448에 상응하는 아미노산의 서열을 갖는 중쇄를 갖는 FX에 대해 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 상동성을 나타내는 변이체에서이다. 다른 예에서, FX 폴리펩티드에서의 변형(들)은 활성화 펩티드를 결여하는 이중쇄 FXa 형이다. 예를 들어, FX 폴리펩티드에서의 변형(들)은 서열번호 134의 아미노산 잔기 1-139에 상응하는 아미노산 서열을 갖는 경쇄 및 서열번호 134의 아미노산 195-448에 상응하는 아미노산 서열을 갖는 중쇄를 갖는 FX에서 또는 촉매적 활성을 갖고 서열번호 134의 아미노산 잔기 1-139에 상응하는 아미노산 서열을 갖는 경쇄 및 서열번호 134의 아미노산 195-448에 상응하는 아미노산 서열을 갖는 중쇄를 갖는 FXa, 또는 이의 촉매적 활성 부분에 대해 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 상동성을 나타내는 이의 변이체에 있다.
시작의, 비변형 참조 폴리펩티드의 본원에서 제공되는 변형은 아미노산 치환 또는 대체, 아미노산의 부가 또는 결실, 또는 이의 임의의 조합을 포함한다. 예를 들어, 변형 FX 폴리펩티드는 변형된 위치의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50 또는 그 이상을 갖는 것들을 포함한다. 또한 본원에서 시작 참조 FX 폴리펩티드와 비교하여 2 이상의 변형을 갖는 변형 FX 폴리펩티드가 제공된다. 변형 FX 폴리펩티드는 변형된 위치의 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50 또는 그 이상을 갖는 것들을 포함한다.
본원에서 제공되는 변형(들)은 FX 폴리펩티드의 FXa 형의 활성 또는 성질을 변경하는 1 이상의 임의의 변형, 예를 들어 변형(들)을 함유하지 않는 FXa 형과 비교하여 보조인자 의존성을 증가시키고, 저해제에 대한 내성을 증가시키고, 글리코실화를 변경하고, 및/또는 반감기를 증가시키는 변형(들)을 함유할 수 있다. 예를 들어, 본원에서 제공되는 변형 FX 폴리펩티드는 보조인자 의존성을 증가시키는 변형(들)을 함유할 수 있다. 이러한 예에서, 보조인자 의존성은 FVa의 부재에서의 촉매적 활성(FVa-독립적 촉매적 활성)을 감소시키고/감소시키거나 보조인자 FVa의 부재에서 기질 친화성(예컨대 프로트롬빈에 대한)을 감소시킴으로써 증가될 수 있다. 다른 예에서, 본원에서 제공되는 변형 FX 폴리펩티드는 반감기를 증가시키는 변형(들)을 함유할 수 있다. 이러한 예에서, 증가된 반감기는 저해제, 예컨대 TFPI 또는 AT-Ⅲ에 대한 내성을 증가시키는 1 이상의 변형 덕분에 달성될 수 있다. 다른 예에서, 증가된 반감기는 본원에서 제공되는 변형 FX 폴리펩티드가 글리코실화되거나 과글리코실화되는 신규한 글리코실화 부위의 부가를 야기하는 1 이상의 변형 덕분에 달성될 수 있다. 본원의 특정 예에서, 본원에서 제공되는 변형 FX 폴리펩티드는 변형(들)을 함유하지 않는 FX와 비교하여 보조인자 의존성을 증가시키고 반감기를 증가시키는 변형(들)을 함유할 수 있다. 일부 예에서, 단일 변형, 예컨대 단일 아미노산 대체 또는 치환은, FX 폴리펩티드의 2, 3, 4 또는 그 이상의 성질 또는 활성을 변경시킨다. 본원에서 제공되는, 변형 FX 폴리펩티드, 및 일반적으로 이의 FXa 형은 변형의 효과의 범위를 확인하기 위해 각 성질 및 활성에 대해 검정될 수 있다. 이러한 검정은 당업계에 알려져 있고 하기에서 기술된다.
본원에서 제공되는 야기되는 변형 FX 폴리펩티드는, 변형 FXa로서 활성 이중쇄 형태일 때, FVa-의존적 응고 활성을 나타낸다. 활성형일때, FVa-의존적 활성이 보존되는데, 즉 변형(들)을 함유하지 않는 FXa와 비교하여 유지되거나 증가된다. 예를 들어, 활성은 변형(들)을 함유하지 않는 FXa의 FVa-의존적 활성의 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190% 또는 그 이상이다.
본원에서 제공되는 임의의 변형은 야기되는 변형 FX 폴리펩티드가 각각이 활성 이중쇄 형일때 변형(들)을 함유하지 않는 FX 폴리펩티드와 비교하여 증가된 보조인자 의존성, 증가된 저해제에 대한 내성, 변경된 글리코실화(예컨대 과글리코실화) 및/또는 증가된 반감기를 나타내고 FVa-의존적 응고 활성을 보존하는 한, 당업자에게 알려진 임의의 기타 변형(예컨대 섹션 D.5에 기재된 임의의 변형)과 조합될 수 있다.
폴리펩티드의 1차 서열 내이거나 그렇지 않은 기타 변형이 또한 변형 FX 폴리펩티드 내에 포함될 수 있는데, 이는 탄수화물 모이어티의 부가, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 모이어티의 부가, Fc 도메인의 부가 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 이러한 추가적 변형은 단백질의 안정성 또는 반감기를 증가시키기 위해 만들어질 수 있다. 본원에서 제공되는 변형 FX 폴리펩티드는 또한 세포적 기구에 의해 추가적으로 변형된 FX 폴리펩티드를 포함하고, 예를 들어, 글리코실화된, γ-카복실화된 폴리펩티드 및 β-히드록실화된 폴리펩티드를 포함한다.
또한 본원에서 본원에서 제공되는 임의의 변형 FX 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자가 제공된다. 특정 예에서, 예를 들어, 암호화된 서열의 발현 수준을 증가시키기 위해, 핵산 서열은 코돈 최적화될 수 있다. 특정 코돈 사용은 변형 폴리펩티드가 발현되는 숙주 유기체에 의존적이다. 당업자는 포유류 또는 인간 세포, E. coli 또는 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)를 포함하는 박테리아 또는 효모에서의 발현을 위한 최적 코돈에 대해 잘 알고 있다. 예를 들어, 코돈 사용 정보는 kazusa.or.jp.codon에서 이용가능한 코돈 사용 데이터베이스(Codon Usage Database)로부터 이용가능하다(예컨대 상기 데이터 베이스의 기술에 대한 Richmond (2000) Genome Biology, 1:241 참조). 또한 Forsburg (2004) Yeast, 10:1045-1047; Brown et al. (1991) Nucleic Acids Research, 19:4298; Sharp et al. (1988) Nucleic Acids Res., 12:8207-8211; Sharp et al. (1991) Yeast, 657-78 참조).
일부 예에서, 핵산 분자의 암호화는 또한 폴리펩티드의 가공을 변경하기 위한 이종성 서열을 함유하도록 변형될 수 있다. 예를 들어, 핵산은 폴리펩티드의 분비 또는 생산을 증가시키거나 그 외에 단백질의 기능적 생산을 개선하기 위해 이종성 신호 서열, 프리프로펩티드(신호 서열 및 프로펩티드를 함유하는) 또는 프로펩티드를 암호화하는 핵산을 포함할 수 있다. 특정 예에서, 핵산은 인자 X의 프로펩티드보다 감마-카복실라제에 대한 변경된(예컨대 감소된) 친화성을 나타내는 비타민-K 의존적 단백질의 프리프로펩티드 또는 프로펩티드를 암호화하는 핵산을 포함할 수 있다. 감마-카복실라제는 글루타메이트(glutamate, Glu)의 감마 카복실 글루탐산(Gla)으로의 변형을 촉매하는 효소인데, 인자 X의 활성에 요구된다. 인자 X의 프로펩티드의 친화성은 기타 비타민-K 의존적 폴리펩티드, 예컨대 인자 Ⅶ, 단백질 S, 인자 Ⅸ, 단백질 C 및 프로트롬빈보다 감마-카복실라제에 대해 가장 높은 친화성을 갖는다(Camire et al. (2000) Biochemistry, 39:14322-9). 암호화 핵산이 감마-카복실라제에 대한 감소된 친화성을 나타내는 프리프로펩티드 또는 프로펩티드 형을 또 다른 비타민-K 의존적 폴리펩티드를 함유하도록 변형하는 것은 더 높은 기질 회전율을 허용함으로써 감마-카복실화를 향상시키고, 이는 결과적으로 감마-카복실화된 총 생산된 단백질의 증가된 백분율을 야기하는 단백질 생산을 개선한다. 예를 들어, 본원에서 프로트롬빈 프로펩티드(서열번호 415-546 중 임의의 서열의 아미노산 잔기 1-43으로 기재되는)를 암호화하는 이종성 서열을 함유하는 변형 FX 폴리펩티드를 암호화하는 핵산이 제공된다. 본원의 다른 부분에서 기술된 바와 같이, 암호화 핵산은 또한 카복실화된 인자 X의 분획을 더욱 증가시키기 위해 비타민 K 에폭사이드 리덕타제(vitamin K eppoxide reductase (VKOR))-형질감염 세포에서 생산될 수 있다(예컨대 Sun et al. (2005) Blood, 106:3811-3815 참조).
본원에서 제공되는 변형된 폴리펩티드 및 암호화 핵산 분자는 당업자에게 알려진 표준 재조합 DNA 기술에 의해 생산될 수 있다. 표적 단백질 내에서 임의의 1 이상의 아미노산의 돌연변이를 수행하기 위한 임의의 방법이 사용될 수 있다. 방법들은 암호화 핵산 분자의 표준 위치-지정 또는 무작위적 돌연변이생성, 또는 고체상 폴리펩티드 합성 방법을 포함한다. 특히, 펩티드 라이게이션(ligation) 전에, 펩티드 합성을 포함하는 총 단백질 합성 방법이 사용될 수 있다. FX 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자는 돌연변이생성, 예컨대 암호화 핵산의 무작위적 돌연변이생성, 실수 유발(error-prone) PCR, 위치지정 돌연변이생성(예컨대 키트, 예를 들어 Stratagene으로부터 이용가능한 QuikChange와 같은 키트를 사용하여), 오버랩 PCR(overlap PCR), 유전자 셔플링, 또는 기타 재조합 방법에 의해 돌연변이생성의 대상이 될 수 있다. 폴리펩티드를 암호화하는 핵산은 그 후 이종성으로 발현되기 위해 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 일부 예에서, 변형 FX 폴리펩티드는, 예컨대 총 화학적 합성, 고체상 또는 용액상 펩티드 합성에 의해 합성적으로 생산된다
하기 하위섹션에서, 핵산 분자를 암호화하는 변형 FX 지모겐 또는 FXa 형을 포함하여, 변경된 성질 및 활성을 나타내는 예시적인 본원에서 제공되는 변형 FX 폴리펩티드가 기술된다. 하기 기술은 증가된 보조인자 의존성, 증가된 저해제(예컨대 AT-Ⅲ)에 대한 내성 및 변경된 글리코실화 중에서 1 이상의 성질 또는 활성에 기초하여 구성된다. 이러한 성질 및 활성이 상호 배제적인 것이 아니므로, 본원에서 제공되는 1 이상의 변형된 폴리펩티드가 상기-확인된 성질 또는 활성의 1, 2 또는 전부를 나타낼 수도 있다는 것이 이해된다.
더 나아가, 서열번호 134로 기재되는 위치를 참고로(키모트립신 넘버링에 의해 잔기 16 및 17에 상응하는) 위치 195에서 Val, Ala, Ser 또는 Thr로의 변형 및/또는 위치 196에서 Ile, Ala, Ser 또는 Thr로의 변형을 함유하는 변형 FX 폴리펩티드의 하기 본원의 일부 예에서, 변형 FX 폴리펩티드는 야생형 인자 X에서 존재하지 않는 프로테아제 가공 부위를 야기하는 또 다른 세린 프로테아제로부터 이종성 활성화 펩티드를 함유하지 않는다. 일 예에서, 전구체, 성숙 또는 지모겐 형으로서, 위치 195 및/또는 196에서 아미노산 치환, 예컨대 Ile, Val, Ala, Ser 또는 Thr과의 치환을 포함하는 본원에서 제공되는 변형 인자 X 폴리펩티드는 Arg194(키모트립신 넘버링에 의해 Arg15)를 프로테아제 절단 부위의 일부로서 포함한다. 특정 예에서, 본원에서 제공되는 인자 X 폴리펩티드의 전구체, 성숙 또는 지모겐 형태는 서열번호 134로 기재되는 아미노산 서열의 아미노산 잔기 143-194에 상응하는 FX 활성화 펩티드를 포함한다. 본원의 예에서, 본원에서 제공되는 위치 195 및/또는 196에서 변형(예컨대 Ile, Val, Ala, Ser 또는 Thr과)을 포함하는 활성형의 변형 FXa 폴리펩티드는 서열번호 134로 기재되는 아미노산 서열의 아미노산 잔기 143-194에 상응하는 활성화 펩티드를 포함하는 변형 FX 지모겐의 활성화 절단 및 가공에 의해 활성이 된다.
1. 변경된 글리코실화
본원에서 1 이상의 변형(들)을 FX 폴리펩티드 내에 함유하여 폴리펩티드의 글리코실화가 변경된, 변형 FX 지모겐 및 변형 FXa 폴리펩티드를 포함하는, 변형 FX 폴리펩티드가 제공된다. 상기 변형은 아미노산의 삽입, 결실 또는 치환일 수 있다. 특히, 상기 변형은 아미노산 치환이다. 글리코실화 부위는 폴리펩티드에 글리코시드 연결을 통해 단당류 및 올리고당류의 부착에 대한 부위를 제공하여, 폴리펩티드가 글리코실화가 가능한 진핵세포 내에서 생산될 때, 그 폴리펩티드는 글리코실화된다. 2개의 주된 글리코실화 유형은 당 단위가 아스파라긴 잔기의 아미드 질소를 통해 부착되는 N-연결 글리코실화, 및 당 단위가 세린, 트레오닌, 히드록시라이신 또는 히드록시프롤린 잔기의 히드록실기를 통해 부착되는 O-연결 글리코실화이다. 그 외에 글리코시드 연결의 덜 일반적인 형태는 시스테인의 S-연결 및 트립토판의 C-연결을 포함한다. N-연결 글리코실화는 Xaa가 프롤린이 아닌 공통 서열 -Asn-Xaa-Ser/Thr/Cys에서 아스파라긴에서 일어난다. O-글리코실화는 세린, 트레오닌 및 프롤린 잔기의 비율이 높은 서열에서 일어날 가능성이 높음에도 불구하고, O-글리코실화에 대해서는 알려진 모티프가 없다. 잠재적인 글리코실화 부위의 존재는, 그러나, 그 부위가 ER 내에서 번역후 가공 동안 글리코실화될 것임을 보장한다. 더 나아가, 글리코실화의 수준은 주어진 부위에서 다양할 수 있으며, 한 부위가 다수의 상이한 글리칸 구조를 가질 수 있다.
FX는 일반적으로 폴리펩티드의 활성화 펩티드 부분에 존재하는 2개의 O-연결 및 2개의 N-연결 글리코실화 부위(서열번호 134에 대하여 잔기 Thr159, Thr171, Asn181 및 Asn191에 상응하는)를 갖는 글리코실화된 단백질이다. 이러한 글리코실화 잔기는 생리적 활성화제에 의한 지모겐 활성화에 요구된다(예컨대 Yang et al. (2009) J Thromb. Haemost., 7:1696-1702 참조).
FX 폴리펩티드의 기능 및 활성을 변경시킬 수 있는, 추가적인 글리코실화 부위가 FX 내로 도입될 수 있다는 것이 발견되었다. 일반적으로, 폴리펩티드의 기능 및 활성은 치료적 이점을 제공하는, 추가적 글리코실화 부위의 부가에 의해 개선 또는 증가된다. 예를 들어, 글리코실화는 단백질의 안정성, 가용성을 증가시키고, 단백질의 면역원성을 감소시킴으로써 폴리펩티드의 혈청 반감기를 증가시킬 수 있다. 글리코실화는 단백질의 단백분해를 감소시킴으로써 단백질의 안정성을 증가시킬 수 있고 열 분해, 변성제에의 노출, 산소 자유 라디칼에 의한 손상, 및 pH의 변화로부터 단백질을 보호할 수 있다. 글리코실화는 또한 표적 단백질이 세포 표면 수용체를 포함하는 다른 단백질에 대한 결합과 관련될 수 있는 제거(clearance) 기전을 회피하도록 할 수 있다. 시알산을 함유하는 탄수화물 모이어티는 단백질의 가용성에 영향을 줄 수 있다. 시알산 모이어티는 매우 친수성이고 표적 단백질의 소수성 잔기를 방어할 수 있다. 이는 표적 단백질의 응집 및 침전을 감소시킨다. 감소된 응집은 표적 단백질에 대한 면역 반응의 방지를 돕는다. 더 나아가, 탄수화물은 면역계로부터 면역원성 서열을 방어할 수 있다. 탄수화물 모이어티에 의해 차지된 공간의 부피는 면역계에 의해 조사되는 이용가능한 표면적을 감소시킬 수 있다. 이 성질들은 표적 단백질의 면역원성의 감소로 이어질 수 있다.
따라서, 본원에서 제공되는 변경된 글리코실화를 나타내는 FX 폴리펩티드는, 혈액내에서 증가된 반감기를 포함하는 개선된 약동학적 및 약력학적 성질을 나타낸다. 변경된 글리코실화를 나타내는 본원에서 제공되는 변형 FX 폴리펩티드는 또한 증가된 촉매적 활성 및/또는 증가된 저해제에 대한 내성과 같은 다른 변경된 활성 및 성질을 나타낼 수 있다. 특히, 본원에서 제공되는 변형 FX 폴리펩티드 중에는 변경된 글리코실화를 나타내는 것들, 및 증가된 보조인자 의존성(예컨대 섹션 D.2 참조) 또는 증가된 저해제, 예컨대 TFPI 또는 AT-Ⅲ에 대한 내성(예컨대 섹션 D.3 참조) 중 하나 또는 둘 다를 포함하는 것들이 포함된다.
본원에서 제공되는 FX 폴리펩티드 중에는 비변형 FX 폴리펩티드와 비교하여 글리코실화의 수준 및/또는 유형을 변경함으로써 변형된 것들이 포함된다. 글리코실화는 또한 비변형 FX 폴리펩티드와 비교하여 증가되거나 감소될 수 있다. 일부 예에서, 글리코실화의 수준 또는 정도는 증가되어, 과글리코실화된 FX 폴리펩티드를 야기한다. 이는, 예를 들어, 탄수화물이 연결된 비변형 FX 폴리펩티드에서 발견되지 않는 비-천연 글리코실화 부위의 적어도 하나의 통합에 의해 달성될 수 있다. 과글리코실화된 FX 폴리펩티드는 또한 비변형 FX 폴리펩티드에서 발견되나 글리코실화되지 않은 적어도 하나의 천연 글리코실화 부위에 대해 탄수화물 모이어티의 연결에 의해 생성될 수 있다.
본원에서 제공되는 변형 FX 폴리펩티드는 변경된, 예컨대 신규한, O-연결 글리코실화, N-연결 글리코실화 또는 O-연결 및 N-연결 글리코실화를 포함할 수 있다. 일부 예에서, 변형 FX 폴리펩티드는, 각각이 상이한 글리코실화 부위에 연결된, 1, 2, 3, 4, 5 또는 그 이상의 탄수화물 모이어티를 포함한다. 상기 글리코실화 부위(들)은 천연 글리코실화 부위(들) 및/또는 비-천연 글리코실화 부위(들)일 수 있다. 일부 예에서, 변형 FX 폴리펩티드는 1 이상의 비-천연 글리코실화 부위에서 글리코실화된다. 예를 들어, 변형 FX 폴리펩티드는 1, 2, 3, 4, 5 또는 그 이상의 비-천연 글리코실화 부위를 도입하도록 변형될 수 있다.
비-천연 글리코실화 부위는 아미노산 치환에 의해 도입될 수 있다. 예를 들어, 천연 잔기의 세린 또는 트레오닌으로의 아미노산 치환에 의해, O-글리코실화 부위는 창조될 수 있다. N-연결 글리코실화 부위는 Xaa가 프롤린이 아닌, 모티프 Asn-Xaa-Ser/Thr/Cys를 창조함으로써 창조될 수 있다. 아미노산 변형에 의한 공통 서열의 창조는 천연 아미노산 잔기의 아스파라긴과의 치환, 천연 아미노산 잔기의 세린, 트레오닌 또는 시스테인과의 치환, 천연 아미노산 잔기의 아스파라긴과의 치환 및 천연 잔기의 세린, 트레오닌 또는 시스테인과의 아미노산 치환과 관련될 수 있다. 비-천연 글리코실화 부위는 FX 폴리펩티드의 임의의 영역에서 창조될 수 있다. 예를 들어, 1 이상의 글리코실화 부위는 경쇄 및/또는 중쇄 내로 도입될 수 있다. 일부 예에서, 1 이상의 글리코실화 부위는 경쇄의 EGF1 도메인 내 도입된다. 다른 예에서, 비-천연 글리코실화 부위는 중쇄의 프로테아제 도메인 영역 내로 도입된다. 글리코실화의 수준(예컨대 도입된 비-천연 글리코실화 부위의 수)은 비변형 또는 야생형 FX 폴리펩티드의 글리코실화의 수준과 비교하여 적어도 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% 또는 그 이상 증가될 수 있다.
본원에서 제공되는 예시적인 변형(들)은 비변형 FX 폴리펩티드에서 하기와의 아미노산 치환(들)을 포함하나 이에 제한되지 않는 1 이상의 아미노산 치환(들)로의 변형에 의해 비-천연 글리코실화를 도입하는 것을 포함한다: 위치 51에 상응하는 위치에서 N; 위치 56에 상응하는 위치에서 위치 N 및 위치 58에 상응하는 위치에서 S; 위치 62에 상응하는 위치에서 N 및 위치 64에 상응하는 위치에서 S; 위치 65에 상응하는 위치에서 N 및 위치 67에 상응하는 위치에서 S; 위치 67에 상응하는 위치에서 N; 위치 73에 상응하는 위치에서 N 및 위치 75에 상응하는 위치에서 S; 위치 75에 상응하는 위치에서 N 및 위치 77에 상응하는 위치에서 S; 위치 77에 상응하는 위치에서 N 및 위치 79에 상응하는 위치에서 S; 위치 78에 상응하는 위치에서 N 및 위치 80에 상응하는 위치에서 S; 위치 82에 상응하는 위치에서 S; 위치 83에 상응하는 위치에서 N; 위치 82에 상응하는 위치에서 S; 위치 83에 상응하는 위치에서 N; 위치 82에 상응하는 위치에서 N 및 위치 84에 상응하는 위치에서 S; 위치 85에 상응하는 위치에서 N 및 위치 87에 상응하는 위치에서 S; 위치 86에 상응하는 위치에서 N 및 위치 88에 상응하는 위치에서 S; 위치 95에 상응하는 위치에서 N 및 위치 97에 상응하는 위치에서 S; 위치 114에 상응하는 위치에서 N; 위치 119에 상응하는 위치에서 N 및 위치 121에 상응하는 위치에서 S; 위치 122에 상응하는 위치에서 S; 위치 215에 상응하는 위치에서 N 및 위치 217에 상응하는 위치에서 S; 위치 243에 상응하는 위치에서 N 및 위치 245에 상응하는 위치에서 S; 위치 264에 상응하는 위치에서 N 및 위치 266에 상응하는 위치에서 S; 위치 293에 상응하는 위치에서 N 및 위치 295에 상응하는 위치에서 S; 위치 388에 상응하는 위치에서 N; 위치 389에 상응하는 위치에서 N 및 위치 391에 상응하는 위치에서 S; 위치 428에 상응하는 위치에서 N 및 위치 430에 상응하는 위치에서 S 및/또는 위치 429에 상응하는 위치에서 N 및 위치 431에 상응하는 위치에서 S이고, 각각은 서열번호 134로 기재되는 아미노산 위치를 참고한다. 서열번호 134로 기재되는 아미노산 잔기를 참고로, 비-천연 글리코실화를 도입하기 위한 본원에서 제공되는 변형 FX 폴리펩티드는 비-제한적 아미노산 치환(들)은 표 4에 기재된다.
표 4
E51N Q56N/Q58S K62N/G64S L65N/E67S
E67N L73N/G75S G75N/E77S E77N/K79S
G78N/N80S E82S L83N E82N/F84S
T85N/K87S R86N/L88S D95N/D97S G114N
D119N/G121S K122S R243N/K245S E264N/E266S
T293N/R295S K388N D389N/Y391S T428N/G430S
R429N/L431S E215N/N217S
전형적으로, 본원에서 제공되는 변경된 글리코실화를 갖는 변형 FX 폴리펩티드는 FX의 활성의 적어도 하나를 유지한다. 일부 예에서, 비변형 FX 폴리펩티드와 비교하여 변형 FX 폴리펩티드에 존재하는 변경된 글리코실화 수준 또는 글리코실화의 유형에서의 변화는 증가된 촉매적 활성 및/또는 저해제, 예컨대 AT-Ⅲ에 대한 증가된 내성으로서 나타날 수 있다. 증가된 활성은 부가된 글리코실화 덕분이거나, 활성에서의 변화를 달성하기 위해 독립적으로 또는 변경된 글리코실화와 함께 작용하는 2차 아미노산 변형(들) 덕분일 수 있다. 섹션 D.2 및 섹션 D.3은 글리코실화를 변경시키기 위한 본원에서 제공되는 임의의 변형(들)과 조합될 수 있는 예시적인 변형(들)을 기술한다.
예를 들어, 변경된 글리코실화를 갖는 본원에서 제공되는 변형 FX 폴리펩티드는, 활성형일 때, 비변형 FX와 비교하여 증가된 반감기, 증가된 촉매적 활성 및/또는 증가된 응고 활성을 나타낸다. 변경된 글리코실화를 갖는 변형 FX 폴리펩티드의 반감기는 비변형 또는 야생형 FX 폴리펩티드의 반감기와 비교하여 적어도 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, 또는 그 이상 증가될 수 있다. 반감기는 당업계에 알려진 검정에서 측정됨으로서, 예컨대 본원(예컨대 실시예 7)에서 기술된 약동학(PK) 또는 제거(clearance) 연구를 수행함으로서 결정될 수 있다. 변경된 글리코실화를 갖는 변형 FX 폴리펩티드의 촉매적 활성은 생체내 또는 시험관내 검정에서 측정된 대로 비변형 또는 야생형 FX 폴리펩티드의 촉매적 활성과 비교하여 적어도 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, 또는 그 이상 증가될 수 있다. 촉매적 활성에서의 증가는 FVa-의존적 및/또는 FVa-독립적 촉매적 활성일 수 있다. 전형적으로, 본원에서 제공되는 변경된 글리코실화를 갖는 변형 FX 폴리펩티드는 FVa-의존적 촉매적 활성을 유지하거나 증가된 FVa-의존적 촉매적 활성을 나타내어 변형된 폴리펩티드가 증가된 보조인자 의존성을 나타낸다. 이러한 변형 FX 폴리펩티드의 예는 섹션 D.2에 기재된다.
다른 예에서, 본원에서 제공되는 변경된 글리코실화를 갖는 변형 FX 폴리펩티드는, 활성형일 때, 비변형 FX와 비교하여 증가된 저해제에 대한 내성, 예컨대 증가된 AT-Ⅲ에 대한 내성을 나타낸다. 변경된 글리코실화를 갖는 변형 FX 폴리펩티드의 저해제, 예컨대 AT-Ⅲ에 대한 내성은 적어도 2 배, 3 배, 4 배, 5 배, 6 배, 7 배, 8 배, 9 배, 10 배, 20 배, 30 배, 40 배, 50 배, 60 배, 70 배, 80 배, 90 배, 100 배, 200 배, 300 배, 400 배, 500 배, 600 배, 700 배, 800 배, 900 배, 1000 배, 1500 배, 2000 배, 2500 배, 3000 배, 3500 배, 4000 배, 4500 배, 5000 배, 5500 배, 6000 배 또는 그 이상 증가될 수 있다. 따라서, 적절한 시험관내, 생체내, 또는 생체외 검정에서 평가될 때, 변경된 글리코실화를 갖는 변형 FX 폴리펩티드는 비변형 FX 폴리펩티드의 AT-Ⅲ에 대한 내성과 비교하여 AT-Ⅲ에 대해 증가된 내성을 나타낼 수 있다. 이러한 변형 FX 폴리펩티드의 예는 섹션 D.3에 기재된다.
2. 증가된 보조인자 의존성
본원에서 1 이상의 변형(들)을 FX 폴리펩티드 내에 함유하고, 활성 FXa 형일 때, FVa의 부재에서와(FVa-독립적 활성) 비교하여 보조인자 FVa의 존재에서(FVa-의존적 활성) 더 큰 촉매적 활성을 나타내는, 변형 FX 지모겐 및 변형 FXa 폴리펩티드를 포함하는, 변형 FX 폴리펩티드가 제공된다. 변형은 아미노산의 삽입, 결실 또는 치환일 수 있다. 특히 변형은 아미노산 치환이다. 본원에서 제공되는 변형 FX 폴리펩티드는, 활성형일 때, 변형(들)을 함유하지 않는 FXa와 비교하여 FVa의 부재에서의 촉매적 활성보다 FVa의 존재에서 촉매적 활성의 비율로서 증가된 보조인자 의존성을 나타낸다.
FVa가 실질적으로 FXa의 활성을 증가시킴에도 불구하고, 야생형 FXa는 FVa의 부재에서조차 일부 활성을 나타낸다. 예를 들어, 본원의 실시예에서 예시된 바와 같이, 야생형 FXa(예컨대 혈장-유래된 또는 재조합적으로 생산된)의 보조인자 의존성은 대략 3,000이다. 상기에서 논의된 바와 같이, FVa-독립적 활성은 치료제로서 FXa의 사용을 제한하는 원치않는 활성을 야기할 수 있다. FVa-독립적 활성을 제한 또는 감소시키는 것은 FVa-의존적 활성을 유지하면서 달성될 수 있다는 것이 본원에서 밝혀진다. FVa의 존재에서 촉매적 활성의 변화는 증가된 FVa-의존적 응고 활성으로서 나타날 수 있다. 따라서, 치료적 적용을 위해 요구되는 응괴 형성을 달성하기 위해 막 표면에서 프로트롬빈분해효소 활성을 유지하는 동시에, 원치않는 활성이 감소, 최소화 또는 제거될 수 있다. 본원에서 제공되는 변형된 프로테아제는, 활성 FXa 폴리펩티드로서, 야생형 FXa보다 훨씬 증가된 효능을 나타내나, 순환하는 자유형이 상처의 FVa 보조인자에 결합되었을 때에만 활성을 나타낼 수 있기 때문에 훨씬 더 안전할 수 있다.
증가된 보조인자 의존성은 FX 지모겐의 FXa로의 구조적 변환과 관련된 FX의 중쇄의 1 이상의 아미노산 잔기의 변형에 의해 달성된다. 보통, FX는 지모겐에서 활성 프로테아제까지 구조적 형태의 평형으로 존재하는데, 활성화 전에는 지모겐 형을 선호하고 활성화 후에는 FXa 형을 선호한다. 지모겐 형에서, 주된 특이성 포켓(예컨대 S1 결합 부위) 및 산소음이온 구멍이 존재하지 않거나 그들이 "활성 구조"에서 안정화되어, 지모겐 형을 불활성으로 만든다. 또한, 기질 특이성의 연장된 부위(엑소사이트(exosite)) 및 FVa 결합 부위도 적절하게 형성되지 않거나 "활성 구조"로 안정화된다. 변경된 활성 상태로의 전이는 Arg194-Ile195(키모트립신 넘버링에 의해 Arg15-Ile16) 간의 결합의 절단에 있어서 이동될 수 있는데, 이는 Arg378(키모트립신 넘버링에 의해 Asp194)과의 염다리의 형성과 관련된 신규한 N-말단의 창조를 야기할 수 있다. 프로테아제 상태로의 전이는 또한 FXa 형의 상호작용 안정화의 존재에 의해 결합 절단 없이 일어날 수 있다. 예를 들어, FVa 보조인자는 FXa와의 상호작용의 강한 안정화를 제공하고 FXa 형으로 평형으로 이동할 수 있다.
결합 절단에 있어서, 이 지모겐의 활성 효소로의 전이는 또한 활성 효소를 생산하기 위한 프로테아제의 기타 구조적 변화와 관련된다. 예를 들어, 서열번호 134를 참고로 성숙 넘버링에 의해 잔기 195-198, 325-334, 366-377 및 400-406에 상응하는(키모트립신 넘버링에 의해 잔기 16-19, 142-152, 184-193 및 216-223에 상응하는) 활성화 도메인에서의 구조적 변화는, 주된 특이성 포켓 또는 기질 결합 부위와 산소음이온 구멍을 재정렬하고 안정화시킨다(Toso et al. (2008) J Biol. Chem., 283:18627-18635). 더 나아가, 프로트롬빈 결합 및 촉매작용과 관련된, 잔기 213-219 및 249-259(키모트립신 넘버링에 의해 잔기 34-40 및 70-80에 상응하는)를 함유하는 고리(loop)에 의해 형성된 엑소사이트 1은 프로엑소사이트(proexosite) 상태로 존재하고 전이를 동반하는 구조적 변화와 함께 활성 배열로서만 나타난다(Bock et al. (2007) J Thromb. Haemost., 5:81-94). 지모겐의 활성 효소로의 구조적 변화는 또한 코어 보조인자 결합 에피토프를 형성하는 엑소사이트 2 내에 Arg347, Lys351 및 Lys414를 포함하는 FVa 결합 부위의 발현으로 이어진다(또한 Bianchini (2004) J Biol. Chem., 279:3671-3679 참조). 활성 효소 구조는 또한 기질 결합에 있어서 안정화된다.
FX 단백질의 구조적 평형은 지모겐의 활성 효소로의 전이와 관련된 아미노산 잔기의 변형에 의해 이동될 수 있다. 이러한 잔기의 변형은 평형을 지모겐-유사 상태로 이동시킬 수 있다. 지모겐의 활성 효소로의 전이와 관련된 잔기는 신규한 N-말단의 잔기, 예컨대 아미노산 잔기 195-198(키모트립신 넘버링에 의해 잔기 16-19에 상응하는)을 포함한다. 지모겐 전이와 관련된 기타 잔기는 구조적 변화에서 직접적으로 역할을 수행하거나 그렇지 않으면 활동적으로 연관된 활성화 도메인 및 엑소사이트(상기 기재된) 내의 잔기를 포함한다. 이러한 영역에서 잔기의 돌연변이는 전이 과정에서 활성화된 효소의 활성화 도메인 및/또는 엑소사이트의 구조적 동요를 야기할 수 있는데, 이는 기질 결합 및/또는 촉매작용을 변경하여 지모겐-유사 활성을 야기할 수 있다. 예를 들어, 활성화 도메인의 일부는 자가분해 고리(키모트립신 넘버링에 의해 잔기 142-152에 상응하는)인데, 이는 구조적으로 변경된 경우 기질의 감소된 단백분해를 야기할 수 있다. 따라서, 이러한 영역의 돌연변이는 FXa 형을 추가적으로 탈안정화하여, 지모겐-유사 상태에 유리한 평형으로의 이동을 야기할 수 있다. 본원에서 상기 도메인과 관련되거나 가까운 근처에 있는 잔기의 변형 또한 변형될 수 있고 FV-독립적 활성에 영향을 줄 수 있어 실질적으로 증가된 보조인자 의존성을 나타내는 프로테아제를 야기할 수 있다는 것이 발견된다. 촉매적 트라이어드 잔기는 촉매적 활성을 위해 요구되기 때문에 돌연변이생성에 대한 표적이 되지 않는다(예컨대 서열번호 134를 참고로 His236, Asp282 및 Ser379).
특히, 변형은 상기 기술된 지모겐의 활성 효소로의 전이 동안 일어나는 분자간 염다리 또는 기타 "결합된(coupled)" 구조적 변화의 형성을 방해하거나 탈안정화시키기 위해 결합 절단 후의 FXa로의 전이를 개시하는 N-말단 펩티드 분절에서의 잔기에 만들어질 수 있다. 예를 들어, FXa에서 Ile195 및 어느 정도는 Val196도 단백질 모이어티 내에 파묻히는데, 여기에서 Ile195의 α-암모늄 기와 Asp378의 측쇄 카복실레이트(carboxylate) 기는 내부 염다리를 형성한다. 이 염다리는 활성 효소를 안정화시킨다. 예를 들어 위치 195, 196 및/또는 378에서의 아미노산 잔기의 변형에 의해, 염다리의 붕괴는 지모겐-유사 구조를 향한 활성 효소 구조의 변형을 야기하는 것으로 발견된다. 인접한 잔기 197 및 198의 변형은 또한 효소를 지모겐-유사 구조로 변형(trnasform)시키기 위한 변형을 위한 표적이다.
또한, 본원에서 제공되는 변형은 일부 세린 프로테아제에서 지모겐 상태를 안정화시키는 것으로 알려진 지모겐 트라이어드 잔기 내의 변형들을 포함한다. 예를 들어, 키모트립신 및 트립시노겐의 지모겐 구조에서, Asp378(키모트립신 넘버링에 의해 Asp194)에 상응하는 측쇄는 위치 211(키모트립신 넘버링에 의해 His40)에서 파묻힌 히스티딘과의 이온 쌍(ion pair)에 의해 안정화되는데, 이는 또한 위치 219(키모트립신 넘버링에 의해 Ser32)와 수소 결합을 형성한다(Madison et al. (1993) Science, 262:419-421). 이 지모겐 트라이어드(키모트립신 넘버링에 의해, Asp194-His40-Ser32)는 지모겐 형을 안정화시킨다. 류신(L)이 위치 211(키모트립신 넘버링에 의해 위치 32에 상응하는)에 존재하고 글리신(G)이 위치 219(키모트립신 넘버링에 의해 위치 40에 상응하는)에 존재하기 때문에, 상응하는 지모겐 트라이어드는 FX 내에 존재하지 않는다. 그러므로, 본원의 변형은 상응하는 지모겐 트라이어드(키모트립신 넘버링에 의해 Asp194-His40-Ser32)가 FX 내에 형성되는 변형을 포함한다.
FX의 지모겐 형과 같이, 지모겐-유사 구조적 상태의 FXa 폴리펩티드는 낮은 촉매적 활성을 나타낸다. 상기 기술된 바와 같이, 활성은 FVa 보조인자에 의해 조절될 수 있다. FX의 지모겐 형, 및 FXa의 지모겐-유사 형은, 일반적으로 FVa에 대해 감소된 친화성을 나타내는데, 아마도 프로테아제 도메인의 구조적 활성화가 FVa 결합 부위를 노출하는 데 요구되기 때문인 듯 하다. 그럼에도 불구하고, FVa가 강력한 안정화제이기 때문에, 지모겐-유사 구조적 상태로부터 FXa로의 평형은 과량의 FVa 보조인자의 강력한 안정화 존재의 존재에서 구조될 수 있다. 그러므로, 본원의 예에서, 지모겐-유사 변이체는 FVa의 부재에서 낮은 활성을 나타내나, FVa의 존재에서 상당한 활성을 나타낼 수 있다. 활성형일 때, 야기되는 FX 폴리펩티드는, FVa의 부재에서와 비교하여 FVa의 존재에서 변형(들)을 함유하지 않는 FXa와 비교하여 증가된 촉매적 활성의 비율을 나타낸다. 증가된 보조인자 의존성은 FVa의 부재에서 감소된 촉매적 활성 및/또는 FVa의 존재에서 증가된 촉매적 활성 때문일 수 있다.
예를 들어, 본원에서 제공되는 변형 FX 폴리펩티드는, 활성 FXa 형일 때, 5000, 예컨대 10,000; 20,000; 30,000; 40,000; 50,000; 100,000; 200,000; 300,000; 400,000; 500,000; 600,000; 700,000; 800,000; 900,000; 1,000,000; 2,000,000; 3,000,000; 4,000,000; 5,000,000; 6,000,000; 7,000,000; 8,000,000; 9,000,000; 10,000,000, 15,000,000; 20,000,000; 25,000,000; 30,000,000; 35,000,000; 40,000,000; 45,000,000; 50,000,000 또는 그 이상을 초과하는 상대적 보조인자 의존성을 나타낸다. 변형(들)을 함유하지 않는 FXa와 비교하여 상대적 보조인자 의존성은 적어도 2 배, 3 배, 4 배, 5 배, 6 배, 7 배, 8 배, 9 배, 10 배, 20 배, 30 배, 40 배, 50 배, 60 배, 70 배, 80 배, 90 배, 100 배, 200 배, 300 배, 400 배, 500 배, 600 배, 700 배, 800 배, 900 배, 1000 배, 1500 배, 2000 배, 2500 배, 3000 배, 4000 배, 4500 배, 5000 배, 6000 배, 7000 배, 8000 배, 9000 배, 10000 배, 15000 배, 20000 배 또는 그 이상 증가된다. 따라서, 적절한 시험관내, 생체내, 또는 생체외 검정에서 평가될 때, 변형 FX 폴리펩티드는 비변형 FX 폴리펩티드의 보조인자 의존성과 비교하여 증가된 보조인자 의존성을 나타낼 수 있다.
이러한 변형 FX 폴리펩티드 중에는 서열번호 134로 기재되는 위치에 상응하는 FX의 중쇄에서 아미노산 위치(들) 195, 196, 197, 198, 200, 202, 211, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 273, 276, 306, 326, 327, 332, 334, 336, 338, 378, 420 및/또는 424에서 변형(들)을 함유하는 것들이 포함된다. 예를 들어, 본원에서 제공되는 변형 FX 폴리펩티드는 아미노산 위치 198, 202, 211, 214, 217, 219, 327 및/또는 338에서 변형(들)을 함유하는 것들을 포함한다. 일반적으로, 변형은 아미노산 치환이다. 아미노산 치환은 야기되는 변형 FX 폴리펩티드가, 활성형일 때, 아미노산 치환(들)을 함유하지 않는 FXa와 비교하여 증가된 보조인자 의존성을 나타내고 FVa-의존적 촉매적 활성을 유지하는 한 상기 위치에서 그 외 19개 아미노산의 임의의 것이 될 수 있다.
일 예에서, 변형 FX 폴리펩티드는 서열번호 134에서 위치 195, 196, 197, 또는 198, 예컨대 적어도 위치 196에 상응하는 위치(키모트립신 넘버링에 의해 위치 16-19)에서 적어도 하나의 아미노산 치환(들)과 같은, 적어도 하나의 아미노산 변형(들)을 함유한다. 이러한 아미노산 잔기는 FX 지모겐의 활성화 절단에 있어서 노출된 신규한 N-말단에서 소수성 잔기에 상응한다. 본원의 다른 부분에서 논의되는 바와 같이, N-말단에서의 소수성 잔기는 불활성으로부터 활성 상태로의 전이에 필수적인 잔기 Asp378(키모트립신 넘버링에 의해 Asp194)과 염다리를 형성한다. 예를 들어, 서열번호 134로 기재되는 예시적인 FX 폴리펩티드의 넘버링을 참고로 위치 196에서 존재하는 Val 잔기는 소수성이고 이 상호작용에 적합하다. N-말단 아미노산 잔기 195, 196, 197 및/또는 198(키모트립신 넘버링에 의해 잔기 16-19에 상응하는)의 극성 R 기를 포함하는 친수성 중성 아미노산 잔기로의 변형은 특히 염다리 형성을 방해하거나 탈안정화시키도록 작용한다는 것이 본원에서 발견된다. 치환을 위한 이러한 아미노산 잔기의 예는 Asn (N), Gin (Q), Ser (S), Thr (T), Cys (C) 또는 Tyr (Y)이다.
본원에서 제공되는 예시적인 변형은, 비변형 FX 폴리펩티드에서 하기와의 아미노산 치환을 포함하나 이에 제한되지 않는다: 위치 196에 상응하는 위치에서 I; 위치 196에 상응하는 위치에서 S; 위치 196에 상응하는 위치에서 L; 위치 196에 상응하는 위치에서 T; 위치 197에 상응하는 위치에서 S; 위치 197에 상응하는 위치에서 S; 위치 197에 상응하는 위치에서 A; 위치 200에 상응하는 위치에서 A; 위치 200에 상응하는 위치에서 V; 위치 202에 상응하는 위치에서 S; 위치 211에 상응하는 위치에서 S; 위치 214에 상응하는 위치에서 D; 위치 214에 상응하는 위치에서 A; 위치 214에 상응하는 위치에서 S; 위치 215에 상응하는 위치에서 N; 위치 216에 상응하는 위치에서 R; 위치 216에 상응하는 위치에서 K; 위치 216에 상응하는 위치에서 A; 위치 216에 상응하는 위치에서 S; 위치 217에 상응하는 위치에서 S; 위치 218에 상응하는 위치에서 R; 위치 218에 상응하는 위치에서 K; 위치 218에 상응하는 위치에서 A; 위치 219에 상응하는 위치에서 H; 위치 273에 상응하는 위치에서 A; 위치 273에 상응하는 위치에서 E; 위치 276에 상응하는 위치에서 A; 위치 276에 상응하는 위치에서 E; 위치 306에 상응하는 위치에서 E; 위치 326에 상응하는 위치에서 S; 위치 326에 상응하는 위치에서 T; 위치 326에 상응하는 위치에서 V; 위치 326에 상응하는 위치에서 Q; 위치 326에 상응하는 위치에서 N; 위치 326에 상응하는 위치에서 M; 위치 326에 상응하는 위치에서 K; 위치 326에 상응하는 위치에서 Y; 위치 326에 상응하는 위치에서 E; 위치 326에 상응하는 위치에서 D; 위치 327에 상응하는 위치에서 A; 위치 327에 상응하는 위치에서 L; 위치 332에 상응하는 위치에서 A; 위치 332에 상응하는 위치에서 D; 위치 332에 상응하는 위치에서 E; 위치 332에 상응하는 위치에서 S; 위치 332에 상응하는 위치에서 G; 위치 334에 상응하는 위치에서 A; 위치 334에 상응하는 위치에서 T; 위치 334에 상응하는 위치에서 N; 위치 336에 상응하는 위치에서 E; 위치 338에 상응하는 위치에서 A; 위치 338에 상응하는 위치에서 S; 위치 338에 상응하는 위치에서 N; 위치 338에 상응하는 위치에서 R; 위치 338에 상응하는 위치에서 V; 위치 338에 상응하는 위치에서 Y; 위치 338에 상응하는 위치에서 M; 위치 420에 상응하는 위치에서 A; 위치 420에 상응하는 위치에서 E; 위치 424에 상응하는 위치에서 A; 및/또는 위치 424에 상응하는 위치에서 E이고, 각각은 서열번호 134로 기재되는 아미노산 위치를 참고한다. 변형 FX 폴리펩티드는 상기 아미노산 치환(들)의 임의의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10 또는 그 이상을 함유할 수 있는데, 여기에서 각 치환은 야기되는 변형 FX 폴리펩티드가, 활성형일 때, 증가된 보조인자 의존성을 나타내고 FVa-의존적 촉매적 활성을 나타내는 한, 상이한 위치이다. 이러한 변형 FX 폴리펩티드는, 활성형일 때, 변형(들)을 함유하지 않는 비변형 FXa 폴리펩티드와 비교하여, 적어도 2 배 증가된 보조인자 의존성을 나타내는 것들을 포함한다. 서열번호 134로 기재되는 아미노산 잔기를 참고로, 본원에서 제공되는 변형 FX 폴리펩티드에서 이러한 비제한적 아미노산 치환(들)은 표 5 및 6에 기재된다.
표 5
V196I V196S V196L V196T G197S G197A E200A
E200V K202S L211S/G219H N214D N214A N214S E215N
E216R E216K E216A E216S N217S E218R E218K
E218A T327A/K338A R273A R273E K276A K276E R306E
R326S R326T R326V R326Q R326N R326M R326K
R326Y R326E R326D T327A T327L R332A R332D
R332G S334A S334T S334N R336E K338A K338S
K338N K338R K338V K338Y K338M K420A K420E
K424A K424E E200V/T327L/
K338M
E220V/T327L/
S334A/K338M		 V196S/L211S/
G219H		 G197A/L211S/
G219H		 I195L/L211S/
G219H
V196S/E216K V196S/E216A V196S/E216S V196S/E218R V196S/E218K V196S/E218A V196S/R332A
V196S/R332D V196S/R332E V196S/R332S V196S/R332G V196S/R326D V196S/R326M V196S/R326N
V196S/R326Q V196S/R273E V196S/R273A V196S/R424E V196S/K420A V196S/K420E V196S/R306E
V196S/N214D V196S/N214A V196S/N214S V196S/E216R V196S/K276A V196S/K276E V196S/K420E/
R424E
V196S/K338A V196S/K338S T327A/K338A
추가적인 아미노산 치환(들)이 또한 본원에서 제공되는 변형 FX 폴리펩티드 내에 포함될 수 있고, 야기되는 변형 FX 폴리펩티드가, 활성형일 때, 변형(들)을 함유하지 않는 비변형 FXa 폴리펩티드와 비교하여, 적어도 2배 증가된 보조인자 의존성을 갖고 FVa-의존적 촉매적 활성을 유지하는 한, 본원에 기술되거나 당업계에 공지된 임의의 기타 아미노산 치환일 수 있다. 예를 들어, 추가적인 변형은 저해제, 예컨대 AT-Ⅲ에 대한 내성을 증가키시기 위해(예컨대 섹션 D.3) 및/또는 글리코실화를 변경시키기 위해(예컨대 섹션 D.1) 본원에 기술된 임의의 추가적인 변형(들)을 포함한다. 비-천연 글리코실화 부위를 도입하기 위한 예시적인 아미노산 치환(들)은 비변형 FX 폴리펩티드에서 하기와의 아미노산 치환(들)을 포함하나 이에 제한되지 않는다: 위치 51에 상응하는 위치에서 N; 위치 56에 상응하는 위치에서 N 및 위치 58에 상응하는 위치에서 S; 위치 62에 상응하는 위치에서 N 및 위치 64에 상응하는 위치에서 S; 위치 65에 상응하는 위치에서 N 및 위치 67에 상응하는 위치에서 S; 위치 67에 상응하는 위치에서 N; 위치 73에 상응하는 위치에서 N 및 위치 75에 상응하는 위치에서 S; 위치 75에 상응하는 위치에서 N 및 위치 77에 상응하는 위치에서 S; 위치 77에 상응하는 위치에서 N 및 위치 79에 상응하는 위치에서 S; 위치 78에 상응하는 위치에서 N 및 위치 80에 상응하는 위치에서 S; 위치 82에 상응하는 위치에서 S; 위치 83에 상응하는 위치에서 N; 위치 82에 상응하는 위치에서 N 및 위치 84에 상응하는 위치에서 S; 위치 85에 상응하는 위치에서 N 및 위치 87에 상응하는 위치에서 S; 위치 86에 상응하는 위치에서 N 및 위치 88에 상응하는 위치에서 S; 위치 95에 상응하는 위치에서 N 및 위치 97에 상응하는 위치에서 S; 위치 114에 상응하는 위치에서 N; 위치 119에 상응하는 위치에서 N 및 위치 121에 상응하는 위치에서 S; 위치 122에 상응하는 위치에서 S; 위치 215에 상응하는 위치에서 N 및 위치 217에 상응하는 위치에서 S; 위치 243에 상응하는 위치에서 N 및 위치 245에 상응하는 위치에서 S; 위치 264에 상응하는 위치에서 N 및 위치 266에 상응하는 위치에서 S; 위치 293에 상응하는 위치에서 N 및 위치 295에 상응하는 위치에서 S; 위치 388에 상응하는 위치에서 N; 위치 389에 상응하는 위치에서 N 및 위치 391에 상응하는 위치에서 S; 위치 428에 상응하는 위치에서 N 및 위치 430에 상응하는 위치에서 S; 및/또는 위치 429에 상응하는 위치에서 N 및 위치 431에 상응하는 위치에서 S이고, 각각은 서열번호 134로 기재되는 아미노산 위치를 참고한다. 서열번호 134로 기재되는 아미노산 잔기를 참고로, 본원에서 제공되는 변형 FX 폴리펩티드에서 이러한 비-제한적 아미노산 치환(들)은 표 6에 기재된다.
표 6
L73N/G75S/
V196S		 G75N/E77S/
V196S		 R86N/L88S/
V196S		 G114N/V196S D95N/D97S/
V196S		 E82S/V196S
G78N/N80S/
V196S		 E77N/K79S/
V196S		 D119N/G121S/
V196S		 L83N/V196S K122S/V196S E51N/V196S
G114N/D119N/
G121S/V196S		 D119N/G121S/
V196S/L211S/
G219H/K388N		 T85N/K87S/
V196S		 Q56N/Q58S/
V196S
 K62N/G64S/
V196S
 D119N/G121S/
V196S/L211S/
G219H
G114N/D119N/
G121S/V196S/
L211S/G219H		 L65N/E67S
V196S
 E67N/V196S
 V196S/E215N/
N217S		 V196S/E264N/E266S G114N/V196S/
L211S
G219H/K388N
D119N/G121S/
V196S/E264N/
E266S		 G114N/V196S/
E264N/E266S		 V196S/R429N/
L431S		 V196S/R243N/
K245S		 V196S/T293N/R295S V196S/D389N/
Y391S
D119N/G121S/
V196S/K388N		 V196S/T428N/
G430S		 V196S/L211S/
G219H/E264N/
E266S		 D119N/G121S/
V196S/L211S/
G219H/E264N/E266S		 G114N/V196S/L211S/
G219H/
E264N/E266S		 V196S/E264N/
E266S/K388N
E82N/F84S/
V196S		 Q58N/K60S/
V196S		 G114N/V196S/
L211S/G219H		 V196S/L211S/
G219H/E264N/E266S/K388N		 V196S/K388N
특정 예에서, 본원에서 제공되는 변형 FX 폴리펩티드는 비변형 FX 폴리펩티드에서 하기와의 아미노산 치환을 포함하나, 이에 제한되지 않는 적어도 하나의 변형을 포함한다: 위치 196에 상응하는 위치에서 S; 위치 196에 상응하는 위치에서 T; 위치 197에 상응하는 위치에서 S; 위치 197에 상응하는 위치에서 S; 위치 197에 상응하는 위치에서 A; 위치 200에 상응하는 위치에서 A; 위치 200에 상응하는 위치에서 V; 위치 202에 상응하는 위치에서 S; 위치 211에 상응하는 위치에서 S; 위치 214에 상응하는 위치에서 D; 위치 214에 상응하는 위치에서 A; 위치 214에 상응하는 위치에서 S; 위치 215에 상응하는 위치에서 N; 위치 216에 상응하는 위치에서 R; 위치 216에 상응하는 위치에서 A; 위치 216에 상응하는 위치에서 S; 위치 217에 상응하는 위치에서 S; 위치 218에 상응하는 위치에서 R; 위치 218에 상응하는 위치에서 A; 위치 219에 상응하는 위치에서 H; 위치 273에 상응하는 위치에서 E; 위치 276에 상응하는 위치에서 E; 위치 306에 상응하는 위치에서 E; 위치 326에 상응하는 위치에서 S; 위치 326에 상응하는 위치에서 T; 위치 326에 상응하는 위치에서 V; 위치 326에 상응하는 위치에서 N; 위치 326에 상응하는 위치에서 M; 위치 326에 상응하는 위치에서 K; 위치 326에 상응하는 위치에서 Y; 위치 326에 상응하는 위치에서 E; 위치 326에 상응하는 위치에서 D; 위치 327에 상응하는 위치에서 A; 위치 327에 상응하는 위치에서 L; 위치 332에 상응하는 위치에서 D; 위치 332에 상응하는 위치에서 E; 위치 332에 상응하는 위치에서 S; 위치 332에 상응하는 위치에서 G; 위치 334에 상응하는 위치에서 A; 위치 334에 상응하는 위치에서 T; 위치 334에 상응하는 위치에서 N; 위치 336에 상응하는 위치에서 E; 위치 338에 상응하는 위치에서 A; 위치 338에 상응하는 위치에서 N; 위치 338에 상응하는 위치에서 R; 위치 338에 상응하는 위치에서 V; 위치 338에 상응하는 위치에서 Y; 위치 338에 상응하는 위치에서 M; 위치 420에 상응하는 위치에서 E; 및/또는 위치 424에 상응하는 위치에서 E이고, 각각은 서열번호 134로 기재되는 아미노산 위치를 참고한다.
본원의 예에서, 변형 FX 지모겐 또는 FXa를 포함하여, 본원에서 제공되는 변형 FX 폴리펩티드는, 서열번호 134로 기재되는 아미노산 위치를 참고로 위치 211에 상응하는 위치에서 S와 치환인 또는 위치 219에 상응하는 위치에서 H와 치환인 적어도 하나의 아미노산 치환을 비변형 FX 폴리펩티드에서 갖는다. 변형 FX 폴리펩티드는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상의 아미노산 치환(들)을 포함할 수 있는데, 야기되는 변형 FX 폴리펩티드가, 활성형일 때, 증가된 보조인자 의존성을 나타내고 FVa-의존적 촉매적 활성을 유지하는 한, 여기에서 각 치환은 상이한 위치이다. 예를 들어, 변형 FX 지모겐 또는 FXa를 포함하여, 본원에서 제공되는 변형 FX 폴리펩티드는 서열번호 134로 기재되는 아미노산 위치를 참고로 위치 211에 상응하는 위치에서 S와의 치환 및 위치 219에 상응하는 위치에서 H와의 치환인 적어도 2개의 아미노산 치환을 비변형 FX 폴리펩티드에서 가진다. 추가적인 아미노산 치환(들)은 본원에서 기술되거나 당업계에 공지된 임의의 기타 아미노산 치환일 수 있다. 특정 예에서, 추가적인 아미노산 치환은 위치 195, 196, 197 또는 198에서이다. 이러한 추가적인 아미노산 치환(들)의 예는 하기와의 치환을 포함하나 이에 제한되지 않는다: 위치 195에 상응하는 위치에서 L; 위치 195에 상응하는 위치에서 V와 치환; 위치 195에 상응하는 위치에서 S와 치환; 위치 195에 상응하는 위치에서 T와 치환; 위치 195에 상응하는 위치에서 I와 치환; 위치 195에 상응하는 위치에서 A와 치환; 위치 195에 상응하는 위치에서 F와 치환; 위치 195에 상응하는 위치에서 D와 치환; 위치 195에 상응하는 위치에서 G와 치환; 위치 196에 상응하는 위치에서 I와 치환; 위치 196에 상응하는 위치에서 A와 치환; 위치 196에 상응하는 위치에서 S와 치환; 위치 196에 상응하는 위치에서 L과 치환; 위치 196에 상응하는 위치에서 F와 치환; 위치 196에 상응하는 위치에서 I와 치환; 위치 196에 상응하는 위치에서 T와 치환; 위치 196에 상응하는 위치에서 G와 치환; 위치 197에 상응하는 위치에서 S와 치환; 위치 197에 상응하는 위치에서 A와 치환; 위치 197에 상응하는 위치에서 N과 치환; 위치 197에 상응하는 위치에서 H와 치환; 및 위치 197에 상응하는 위치에서 R과 치환. 다른 예에서, 추가적인 변형은 저해제, 예컨대 AT-Ⅲ에 대한 내성을 증가시키기 위해(섹션 D.3) 및/또는 글리코실화를 증가 변형시키기 위해(섹션 D.1) 본원에 기술된 임의의 추가적인 변형(들)을 함유한다. 이러한 변형 FX 폴리펩티드는, 변형(들)을 함유하지 않는 비변형 FXa 폴리펩티드와 비교하여, 활성형일 때, 적어도 2배 증가된 보조인자 의존성을 나타내는 것들을 포함한다. 서열번호 134로 기재된 아미노산 잔기를 참고로, 본원에서 제공되는 변형 FX 폴리펩티드에서 비-제한적 아미노산 치환(들)은 표 7에 기재된다.
표 7
L211S/G219H V196L/L211S/G219H G197A/L211S/G219H I195L/L211S/G219H
D119N/G121S/
V196S/L211S/
G219H		 G114N/V196S/
L211S/G219H		 G114N/D119N/
G121S/V196S/
L211S/G219H		 G114N/V196S/
L211S
G219H/K388N
V196S/L211S/
G219H/E264N/
E266S/K388N		 V196S/L211S/
G219H/E264N/
E266S		 D119N/G121S/
V196S/L211S/
G219H/E264N/E266S		 G114N/V196S/L211S/
G219H/E264N/E266S
D119N/G121S/
V196S/L211S/
G219H/K388N
특히 본원의 예에서, 변형 FX 지모겐 또는 FXa를 포함하여, 본원에서 제공되는 변형 FX 폴리펩티드는, 비변형 FX 폴리펩티드에서 하기 적어도 하나와의 아미노산 치환을 갖는다; 위치 196에 상응하는 위치에서 S와 치환; 위치 196에 상응하는 위치에서 L; 위치 196에 상응하는 위치에서 T; 위치 197에 상응하는 위치에서 S; 위치 197에 상응하는 위치에서 A; 위치 200에 상응하는 위치에서 A; 위치 200에 상응하는 위치에서 V; 위치 202에 상응하는 위치에서 S; 위치 338에 상응하는 위치에서 A; 위치 338에 상응하는 위치에서 S; 또는 위치 338에 상응하는 위치에서 V이며, 각각은 서열번호 134로 기재되는 아미노산 위치를 참고한다. 변형 FX 폴리펩티드는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상의 아미노산 치환(들)을 함유할 수 있는데, 여기에서 각 치환은, 야기되는 변형 FX 폴리펩티드가, 활성형일 때, 증가된 보조인자 의존성을 나타내고 FVa-의존적 촉매적 활성을 나타내는 한, 상이한 위치에 있다. 추가적인 아미노산 치환(들)은 본원에 기술되거나 당업계에 알려진 임의의 기타 아미노산 치환일 수 있다. 예를 들어, 추가적인 변형은 보조인자 의존성을 증가시키는 상기 본원에 기술된 임의의 추가적인 변형(들), 저해제, 예컨대 AT-Ⅲ에 대한 증가된 내성을 나타내는 임의의 것들(섹션 D.3) 및/또는 글리코실화를 변경시키는 임의의 것들(섹션 D.1)을 포함한다. 이러한 변형 FX 폴리펩티드는, 활성형일 때, 변형(들)을 함유하지 않는 비변형 FXa 폴리펩티드와 비교하여 적어도 10배 증가된 보조인자 의존성을 나타내는 것들을 포함한다. 서열번호 134로 기재되는 아미노산 잔기를 참고로, 본원에서 제공되는 변형 FX 폴리펩티드에서 이러한 비-제한적 아미노산 치환(들)은 표 8 및 표 9에 기재된다.
표 8
V196S V196T V196L V196T G197S
K202S K338A K338S K338V T327A/K338A
E200V/T327L/S334A/K338M G197A/L211/G219H
특정 예에서, 변형 FX 지모겐 또는 FXa를 포함하여, 활성형일 때 증가된 보조인자 의존성을 나타내는, 본원에서 제공되는 변형 FX 폴리펩티드는 비변형 FX 폴리펩티드에서 아미노산 위치 196에서 비극성, 중성 또는 친수성 아미노산 잔기로 적어도 하나의 아미노산 치환을 가진다. 따라서, 본원에서 제공되는 변형 FX 폴리펩티드는 적어도 하나의 아미노산 변형, 예컨대 서열번호 134로 기재되는 아미노산의 서열을 참고로 위치 196에 상응하는 위치에서 N, Q, S, T, W, C, 또는 Y와의 치환인, 적어도 하나의 아미노산 치환을 함유한다. 이러한 본원에서 제공되는 변형 FX 폴리펩티드는 변형(들)을 함유하지 않는 비변형 FXa 폴리펩티드와 비교하여, 활성형일 때, 적어도 2 배, 5 배, 10 배, 20 배, 30 배, 40 배, 그리고 일반적으로 적어도 50 배, 예컨대 적어도 100 배 또는 그 이상 증가된 보조인자 의존성을 나타내는 것들을 포함한다. 본원에서 제공되는 이러한 변형 FX 폴리펩티드의 예는, 위치 196에 상응하는 위치에서 S와의 치환인 아미노산 치환을 적어도 하나 포함하는, 변형 FX 지모겐 또는 FXa를 포함하는, FX 폴리펩티드이다. 변형 FX 폴리펩티드는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상의 아미노산 치환(들)을 함유할 수 있는데, 여기에서 각 치환은, 야기되는 변형 FX 폴리펩티드가, 활성형일 때, 적어도 2 배, 5 배, 10 배, 20 배, 30 배, 40 배, 그리고 일반적으로 적어도 50 배, 예컨대 적어도 100 배 또는 그 이상 증가된 보조인자 의존성을 나타내고 FVa-의존적 촉매적 활성을 유지하는 한, 상이한 위치이다. 추가적인 아미노산 치환(들)은 본원에서 기술되거나 당업계에 공지된 임의의 기타 아미노산 치환일 수 있다. 예를 들어, 추가적인 변형은 보조인자 독립성을 증가시키는 상기 기술된 임의의 추가적인 변형(들), 저해제, 예컨대 AT-Ⅲ에 대한 증가된 내성을 나타내는 임의의 것들(섹션 D.3) 및/또는 글리코실화를 변경시키는 임의의 것들(섹션 D.1)을 포함한다. 서열번호 134로 기재되는 아미노산 잔기를 참고로, 본원에서 제공되는 변형 FX 폴리펩티드에서 이러한 비-제한적인 아미노산 치환(들)은 표 9에 기재된다.
표 9
V196S V196S/L211S/
G219H		 V196S/N214D V196S/N214A V196S/N214S
V196S/E216R V196S/E216K V196S/E216A V196S/E216S V196S/E216S
V196S/E218R V196S/E218K V196S/E218A V196S/R332A V196S/R332D
V196S/R332E V196S/R332S V196S/R332G V196S/R326D V196S/R326M
V196S/R326N V196S/R326Q V196S/R273E V196S/R273A V196S/R424A
V196S/R424E V196S/K420A V196S/K420E V196S/R306E V196S/K276A
V196S/K276E V196S/K338A V196S/K338S E82S/V196S E82N/F84S/
V196S
L73N/G75S/
V196S		 G75N/E77S/
V196S		 R86N/L88S/
V196S		 G114N/V196S D95N/D97S/
V196S
G78N/N80S/
V196S		 E77N/K79S/
V196S		 D119N/G121S/
V196S		 L83N/V196S K122S/V196S
E51N/V196S Q58N/K60S/
V196S		 G114N/D119N/
G121S/V196S		 D119N/G121S/
V196S/L211S/
G219H/K388N		 T85N/K87S/
V196S
Q56N/Q58S/
V196S
 K62N/G64S/
V196S
 D119N/G121S/
V196S/L211S/
G219H		 G114N/V196S/
L211S/G219H		 G114N/D119N/
G121S/V196S/
L211S/G219H
L65N/E67S
V196S
 E67N/V196S
 V196S/E215N/
N217S		 V196S/E264N/
E266S		 G114N/V196S/
L211S
G219H/K388N
V196S/L211S/
G219H/E264N/
E266S/K388N		 D119N/G121S/
V196S/E264N/
E266S		 G114N/V196S/
E264N/E266S		 V196S/R429N/
L431S		 V196S/R243N/
K245S
V196S/T293N/R295S V196S/D389N/
Y391S		 V196S/K388N D119N/G121S/
V196S/K388N		 V196S/T428N/
G430S
V196S/L211S/
G219H/E264N/
E266S		 D119N/G121S/
V196S/L211S/
G219H/E264N/
E266S		 G114N/V196S/
L211S/G219H/
E264N/E266S		 V196S/E264N/
E266S/K388N		 V196S/K420E/R424E
V196S/E215N/N217S
3. 저해제에 대한 증가된 내성
본원에서, FX 폴리펩티드에서 1 이상의 변형(들)을 함유하고, 활성형일 때, FX 저해제에 의한 저해에 대해 증가된 내성을 나타내는, 변형 FX 지모겐 및 변형 FXa 폴리펩티드를 포함하는, 변형 FX 폴리펩티드가 제공된다. FX 저해제는, 예를 들어, 조직 인자 경로 저해제(tissue factor pathway inhibitor, TFPI) 및 항트롬빈 Ⅲ(AT-Ⅲ)를 포함한다. 변형은 아미노산의 삽입, 결실 또는 치환일 수 있다. 특히, 변형은 아미노산 치환이다.
TFPI는 쿠니츠-유형 저해제(Kunitz-type inbibitor)이다. TFPI는 서열번호 557로 기재되는 아미노산의 전구체 서열을 가지며 서열번호 557의 29-304로 기재되는 잔기에 상응하는 성숙 서열을 가진다. TFPI는 3가(trivalent)이며 3개의 쿠니츠-유형 도메인을 함유한다. TFPI는 그것의 두번째 쿠니츠 도메인(서열번호 557로 기재되는 서열에서 잔기 125-175에 상응하는)을 통해 FXa를 직접적으로 저해한다. TFPI는 또한, FXa가 결합된 후에, 첫번째 쿠니츠 도메인(서열번호 557로 기재되는 서열에서 잔기 54-104에 상응하는)을 통하여 인자 Ⅶa/조직(TF) 복합체를 저해할 수 있다. TFPI에 의한 저해는 인지질 및 FVa의 존재에서 더 크다. 하기 ATⅢ와 같이, TFPI의 활성은 FXa와의 활성 부위 결합 상호작용을 통해 매개된다. 지모겐-유사 폴리펩티드인 변형 FX 폴리펩티드와 같이, 본원에서 제공되는 변형 FX 폴리펩티드 중에는, 결합 상호작용이 변경되고/변경되거나 TFPI에 의한 저해에 대해 접근이 가능하지 않기 때문에 TFPI에 대해 증가된 내성을 나타내는 것들이 포함된다.
AT-Ⅲ는 항응고제 서핀(serpin)(세린 프로테아제 저해제)이다. AT-Ⅲ는 464 아미노산 잔기를 포함하는 전구체 단백질로서 합성된다(서열번호 553 참조). 분비 과정에서, 32 잔기 신호 펩티드가 절단되어 432 아미노산 성숙 인간 항트롬빈(서열번호 554)를 생성한다. 58 kDa AT-Ⅲ 당단백질은 혈액 내를 순환하고 세린 프로테아제 저해제(서핀)으로 작용하여 순환계의 다수의 세린 프로테아제를 저해한다. AT-Ⅲ가 FⅨa, FXI, FXIIa 그리고, 더 적은 정도로, FⅦa의 활성에 대해서도 저해를 보이는 것으로 보여진 바 있음에도 불구하고, AT-Ⅲ의 주된 표적은 트롬빈 및 인자 Xa이다(예컨대 도 2 참조).
AT-Ⅲ의 작용은 글리코사미노글리칸, 예컨대 천연적으로 발생하는 헤파란 설페이트(heparan sulphate) 또는 임상 실무에서 항응고제로서 널리 사용되는 다양한 조직-유래 헤파린에 의해 향상된다. AT-Ⅲ는 반응성 중심 고리(reactive center loop, RCL)에서 구조적 변화를 유도하는 헤파린에서의 고유한 오당류(pentasaccaride)에 대해 매우 특이적으로 결합한다. 이러한 구조에서, AT-Ⅲ의 반응성 중심 고리는 세린 프로테아제의 반응성 부위와 보다 효율적으로 상호작용할 수 있고, 저해를 달성할 수 있다. 이 ATⅢ RCL의 "활성화"는 기타 헤파린의 "낮은 분자량" 형태와 마찬가지로 특이적 오당류 자체에 의해 유도될 수 있고 헤파린의 고분자량 형태에 의해서도 유도될 수 있다. AT-Ⅲ 및 FXa 둘 다에 대한 결합 부위를 갖는, 장쇄(long chain) 헤파린(또는 "고분자량" 헤파린)은, 또한 AT-Ⅲ 및 FXa에 대해 주형으로서 작용하여, 그들을 서로 가까운 인근으로 모으고 더 나아가 저해적 상호작용을 용이하게 한다. 헤파린의 부재에서, AT-Ⅲ는 FXa에 대해 상대적으로 불활성인 저해제이다(Quinsey et al. (2002) J. Biol. Chem., 277:15971-15978).
AT-Ⅲ는 FXa와 특이적으로 상호작용하지만 FX 지모겐 형과는 특이적으로 상호작용하지 않는다. Arg194-Ile195 결합(키모트립신 넘버링에 의해 Arg15-Ile16)의 절단시 일어나는 구조 전환은 AT-Ⅲ와 헤파린 상호작용에 요구되는 엑소사이트를 구조적으로 노출한다. AT-Ⅲ와 FXa의 상호작용은 엑소사이트 1에서 연장된 기질 결합 부위 잔기, 및 특히 성숙 넘버링에 의해 글루탐산 잔기 215, 216 및 219(키모트립신 넘버링에 의해 잔기 36, 37 및 39에 상응하는)에 의해 매개되거나 향상된다(예컨대 Quinsey et al. (2002) 및 Bianchini et al. (2004) J Biol. Chem., 279:3671-3679). FXa의 헤파린-결합 부위는 위상적으로 엑소사이트 1의 반대쪽에 위치하며, 서열번호 134로 기재되는 성숙 넘버링에 의해 잔기 Arg273, Lys 276, Arg306, Arg347, Lys351, Lys420 및 Arg424(키모트립신 넘버링에 의해, Arg93, Lys96, Argl25, Arg165, Lys169, Lys236 및 Arg240에 상응하는)를 포함한다(예컨대, Rezaie (2000) J. Biol. Chem., 275:3320-7 참조). 또한, 자가용해 고리 326-336의 염기성 잔기(키모트립신 넘버링에 의해 잔기 143-154에 상응하는)도 FXa에 의한 AT-Ⅲ의 헤파린-활성화 구조의 인식에서 역할을 수행한다(Rezaie et al. (2005) J Biol. Chem., 280:32722-32728; Bianchini et al. (2004)).
TFPI 또는 AT-Ⅲ를 포함하는, 저해제에 대한 증가된 내성은 저해제(예컨대 AT-Ⅲ 또는 TFPI) 상호작용과 관련된 FX 폴리펩티드에서 1 이상의 잔기의 변형에 의해 달성될 수 있다. 또한, 증가된 내성은 헤파린 상호작용과 관련된 1 이상의 잔기를 변형함으로써 달성될 수 있다. 예를 들어, 엑소사이트 1, 자가분해 고리 또는 헤파린-결합 엑소사이트에서 1 이상의 잔기는, 변형될 수 있다. 또한, FXa 폴리펩티드를 보다 지모겐-유사로 만들어, 상기 결합 부위로의 접근을 구조적으로 동요시키는 변형(들)은 또한 저해제에 대해 증가된 내성을 부여할 수 있다. 따라서, 저해제(예컨대 AT-Ⅲ 또는 TFPI)에 대한 증가된 내성에 대한 변형은 서열번호 134를 참고로 성숙 넘버링에 의해 잔기 195-198, 325-334, 366-377 및 400-406(키모트립신 넘버링에 의해 잔기 16-19, 142-152, 184-193 및 216-223에 상응하는) 및/또는 지모겐 트라이어드를 형성하는 잔기 211, 219 또는 378에 상응하는 활성화 도메인의 1 이상의 잔기에서 일어날 수 있다(예컨대 상기 섹션 D.2 참조).
예를 들어, 본원에서 제공되는 변형 FX 폴리펩티드는, 활성 FXa 형일 때, 변형(들)을 함유하지 않는 비변형 FXa와 비교하여 저해제(예컨대 AT-Ⅲ 또는 TFPI)에 대해 적어도 2 배, 예컨대 적어도 3 배, 4 배, 5 배, 6 배, 7 배, 8 배, 9 배, 10 배, 20 배, 30 배, 40 배, 50 배, 60 배, 70 배, 80 배, 90 배, 100 배, 200 배, 300 배, 400 배, 500 배, 600 배, 700 배, 800 배, 900 배, 1000 배, 1500 배, 2000 배, 2500 배, 3000 배, 3500 배, 4000 배, 4500 배, 5000 배, 5500 배, 6000 배 또는 그 이상 증가된 내성을 나타낸다. 따라서, 적절한 시험관내, 생체내, 또는 생체외 검정에서 평가될 때, 변형 FX 폴리펩티드는 비변형 FX 폴리펩티드와 비교하여 저해제(예컨대 AT-Ⅲ 또는 TFPI)에 대한 증가된 내성을 나타낼 수 있다.
이러한 FX 폴리펩티드 중에는 서열번호 134로 기재되는 잔기에 상응하는 FX의 중쇄에서 아미노산 잔기(들) 196, 197, 200, 202, 211, 214, 216, 218, 219, 273, 276, 306, 326, 327, 332, 334, 336, 338, 420 및/또는 424에서의 변형(들)을 함유하는 것들을 포함한다. 일반적으로, 변형은 아미노산 치환이다. 아미노산 치환은 야기되는 변형 FX 폴리펩티드가, 활성형일 때, 아미노산 치환(들)을 포함하지 않는 FXa와 비교하여 저해제(예컨대 AT-Ⅲ 또는 TFPI)에 대한 증가된 내성을 나타내고 FVa-의존적 촉매적 활성을 유지하는 한 그 위치에서 임의의 기타 19개 아미노산이 될 수 있다.
특정 예에서, 저해제에 대한 내성을 달성하기 위한 변형(들)은 FXa 폴리펩티드를 보다 지모겐-유사로 만들어서, 저해제 결합(예컨대 AT-Ⅲ 또는 TFPI 결합)의 비율(rate)을 감소시키는 변형일 수 있다. 예를 들어, 저해제(예컨대 AT-Ⅲ 또는 TFPI)에 대해 증가된 내성을 나타내는 변형 FX 폴리펩티드는 적어도 하나의 아미노산 변형(들), 예컨대 적어도 하나의 아미노산 치환(들)을, 서열번호 134로 기재되는 위치를 참고로 위치 195, 196, 197, 또는 198(키모트립신 넘버링에 의해 위치 16-19)에 상응하는 위치에서 함유할 수 있다. 이러한 아미노산 잔기는 FX 지모겐의 활성화 절단시 창조되는 신규한 N-말단에서 소수성 잔기에 상응한다. 본원의 다른 부분에서 논의되는 바와 같이, "활성화 절단" 후에 N-말단에서 활성화 포켓 내로 소수성 잔기가 삽입되고 Ile195의 신규한 α-암모늄은 잔기 Asp378(키모트립신 넘버링에 의해 Asp194에 상응하는)과 염다리를 형성하는데, 상기 염다리는 불활성 상태에서 활성 상태로의 전이에 필수적이다. 예를 들어, 서열번호 134로 기재되는 예시적인 FX 폴리펩티드 내에 존재하는 Val 잔기는 소수성이고 활성화 포켓 내의 최적 상호작용을 위해 맞추어져 있다. 특정 예에서, N-말단 아미노산 잔기 195, 196, 197 및/또는 198(키모트립신 넘버링에 의해 잔기 16-19에 상응하는)의 극성 R 기를 포함하는 친수성 중성 아미노산 잔기로의 아미노산 치환(들)에 의한 변형은, 활성을 여전히 유지하는 동시에, 이 α 염다리 형성 또는 기타 상기 기술된 "결합된" 구조적 변화를 방해 또는 탈안정화시킨다. 이러한 아미노산 잔기의 예는 Asn (N), Gln (Q), Ser (S), Thr (T), Cys (C) 또는 Tyr (Y)이다.
본원의 예에서, 저해제(예컨대 AT-Ⅲ 또는 TFPI)에 대한 증가된 내성을 부여하는 본원에서 제공되는 변형은, 비변형 FX폴리펩티드에서 하기와의 아미노산 치환을 포함하나 이에 제한되지 않는다: 위치 196에 상응하는 위치에서 I; 위치 196에 상응하는 위치에서 S; 위치 196에 상응하는 위치에서 L; 위치 196에 상응하는 위치에서 T; 위치 197에 상응하는 위치에서 S; 위치 197에 상응하는 위치에서 A; 위치 200에 상응하는 위치에서 A; 위치 200에 상응하는 위치에서 V; 위치 200에 상응하는 위치에서 S; 위치 202에 상응하는 위치에서 S; 위치 211에 상응하는 위치에서 S; 위치 214에 상응하는 위치에서 D; 위치 214에 상응하는 위치에서 A; 위치 214에 상응하는 위치에서 S; 위치 216에 상응하는 위치에서 R; 위치 216에 상응하는 위치에서 K; 위치 216에 상응하는 위치에서 A; 위치 216에 상응하는 위치에서 S; 위치 218에 상응하는 위치에서 R; 위치 218에 상응하는 위치에서 K; 위치 218에 상응하는 위치에서 A; 위치 219에 상응하는 위치에서 H; 위치 273에 상응하는 위치에서 A; 위치 273에 상응하는 위치에서 E; 위치 276에 상응하는 위치에서 A; 위치 276에 상응하는 위치에서 E; 위치 306에 상응하는 위치에서 E; 위치 326에 상응하는 위치에서 A; 위치 326에 상응하는 위치에서 S; 위치 326에 상응하는 위치에서 T; 위치 326에 상응하는 위치에서 V; 위치 326에 상응하는 위치에서 Q; 위치 326에 상응하는 위치에서 N; 위치 326에 상응하는 위치에서 M; 위치 326에 상응하는 위치에서 K; 위치 326에 상응하는 위치에서 Y; 위치 326에 상응하는 위치에서 E; 위치 326에 상응하는 위치에서 D; 위치 327에 상응하는 위치에서 A; 위치 327에 상응하는 위치에서 L; 위치 332에 상응하는 위치에서 A; 위치 332에 상응하는 위치에서 D; 위치 332에 상응하는 위치에서 E; 위치 332에 상응하는 위치에서 S; 위치 332에 상응하는 위치에서 G; 위치 334에 상응하는 위치에서 A; 위치 334에 상응하는 위치에서 T; 위치 334에 상응하는 위치에서 N; 위치 336에 상응하는 위치에서 E; 위치 338에 상응하는 위치에서 A; 위치 338에 상응하는 위치에서 S; 위치 338에 상응하는 위치에서 N; 위치 338에 상응하는 위치에서 R; 위치 338에 상응하는 위치에서 V; 위치 338에 상응하는 위치에서 Y; 위치 338에 상응하는 위치에서 M; 위치 420에 상응하는 위치에서 A; 위치 420에 상응하는 위치에서 E; 위치 424에 상응하는 위치에서 A; 및/또는 위치 24에 상응하는 위치에서 E이고, 각각은 서열번호 134로 기재되는 아미노산 위치를 참고한다. 변형 FX 폴리펩티드는 상기 아미노산 치환(들)의 임의의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상을 포함할 수 있는데, 여기에서 각 치환은, 활성형일 때, 야기되는 변형 FX 폴리펩티드가 증가된 저해제 내성(예컨대 AT-Ⅲ 내성 및/또는 TFPI 내성)을 나타내고 FVa-의존적 촉매적 활성을 유지하는 한, 상이한 위치에서이다. 이러한 변형 FX 폴리펩티드는, 변형(들)을 함유하지 않는 비변형 FXa 폴리펩티드와 비교하여, 활성형일 때, 적어도 2 배 증가된 저해제 내성(예컨대 AT-Ⅲ 내성 및/또는 TFPI 내성)을 나타내는 것들을 포함한다. 서열번호 134로 기재되는 아미노산 잔기를 참고로, 본원에서 제공되는 변형 FX 폴리펩티드에서 이러한 비-제한적 아미노산 치환(들)은 표 10-13에 기재된다.
표 10
V196I V196S V196L V196T G197S E200A E200V
K202S L211S/G219H R326Y R326A R326T R326V R326Q
R326N R326M R326K T327A T327L S334A S334T
S334N R336E K338A K338S K338N K338R K338V
K338Y K338M T327A/K338A T327L/K338M E200V/T327L/
K338M
E220V/T327L/
S334A/K338M		 V196S/L211S/
G219H
G197A/L211S/
G219H		 I195L/L211S/
G219H		 V196S/N214D V196S/N214A V196S/N214S V196S/E216R
V196S/E216K V196S/E216A V196S/E216S V196S/E218R V196S/E218K V196S/E218A V196S/R332A
V196S/R332D V196S/R332E V196S/R332S V196S/R332G V196S/R326D V196S/R326M V196S/R326N
V196S/R326Q V196S/R273E V196S/R273A V196S/R424E V196S/K420A V196S/K420E V196S/R306E
V196S/R424A V196S/K338A V196S/K338S V196S/K276A V196S/K276E V196S/K420E/
R424E
추가적인 변형(들)은 또한 야기되는 변형 FX 폴리펩티드가 활성형일 때, 변형(들)을 함유하지 않는 비변형 FX폴리펩티드와 비교하여 적어도 2배 증가된 저해제 내성(예컨대 AT-Ⅲ 내성 및/또는 TFPI 내성)을 나타내고, FVa-의존적 촉매적 활성을 유지하는 한, 본원에서 제공되는 변형 FX 폴리펩티드 내에 함유될 수 있고 본원에 기술되거나 당업계에 공지된 임의의 기타 아미노산 치환일 수 있다. 예를 들어, 추가적인 변형은 보조인자 의존성을 증가(예컨대 섹션 D.2)시키거나 및/또는 글리코실화를 변경(예컨대 섹션 D.1)시키기 위한 본원에 기술된 임의의 추가적인 변형(들)을 포함한다. 비-천연 글리코실화 부위를 도입하기 위한 예시적인 아미노산 치환(들)은, 비변형 FX 폴리펩티드에서 하기와의 아미노산 치환(들)을 포함하나 이에 제한되지 않는다: 위치 51에 상응하는 위치에서 N; 위치 56에 상응하는 위치에서 N 및 위치 58에 상응하는 위치에서 S; 위치 62에 상응하는 위치에서 N 및 위치 64에 상응하는 위치에서 S; 위치 65에 상응하는 위치에서 N 및 위치 67에 상응하는 위치에서 S; 위치 67에 상응하는 위치에서 N; 위치 73에 상응하는 위치에서 N 및 위치 75에 상응하는 위치에서 S; 위치 75에 상응하는 위치에서 N 및 위치 77에 상응하는 위치에서 S; 위치 77에 상응하는 위치에서 N 및 위치 79에 상응하는 위치에서 S; 위치 78에 상응하는 위치에서 N 및 위치 79에 상응하는 위치에서 S; 위치 78에 상응하는 위치에서 N 및 위치 80에 상응하는 위치에서 S; 위치 82에 상응하는 위치에서 S; 위치 83에 상응하는 위치에서 N; 위치 82에 상응하는 위치에서 N 및 위치 84에 상응하는 위치에서 S; 위치 85에 상응하는 위치에서 N 및 위치 87에 상응하는 위치에서 S; 위치 86에 상응하는 위치에서 N 및 위치 88에 상응하는 위치에서 S; 위치 95에 상응하는 위치에서 N 및 위치 97에 상응하는 위치에서 S; 위치 114에 상응하는 위치에서 N; 위치 119에 상응하는 위치에서 N 및 위치 121에 상응하는 위치에서 S; 위치 122에 상응하는 위치에서 S; 위치 215에 상응하는 위치에서 N 및 위치 217에 상응하는 위치에서 S; 위치 243에 상응하는 위치에서 N 및 위치 245에 상응하는 위치에서 S; 위치 264에 상응하는 위치에서 N 및 위치 266에 상응하는 위치에서 S; 위치 293에 상응하는 위치에서 N 및 위치 295에 상응하는 위치에서 S; 위치 388에 상응하는 위치에서 N; 위치 389에 상응하는 위치에서 N 및 위치 391에 상응하는 위치에서 S; 위치 428에 상응하는 위치에서 N 및 위치 430에 상응하는 위치에서 S 및/또는 위치 429에 상응하는 위치에서 N 및 위치 431에 상응하는 위치에서 S이고, 각각은 서열번호 134로 기재되는 아미노산 위치를 참고한다. 서열번호 134로 기재되는 아미노산 잔기를 참고로, 본원에서 제공되는 변형 FX 폴리펩티드에서 이러한 비-제한적 아미노산 치환(들)은 표 11에 기재된다.
표 11
T85N/K87S/
V196S		 Q56N/Q58S/
V196S		 K62N/G64S/
V196S		 L65N/E67S/
V196S		 E67N/V196S
 L73N/G75S/
V196S
G75N/E77S/
V196S		 R86N/L88S/
V196S		 G114N/V196S D95N/D97S/
V196S		 E82S/V196S E82N/F84S/
V196S
G78N/N80S/
V196S		 E77N/K79S/
V196S		 D119N/G121S/
V196S		 L83N/V196S K122S/V196S E51N/V196S
Q58N/K60S/V196S G114N/D119N/G121S/V196S D119N/G121S/V196S/L211S/
G219H		 G114N/V196S/
L211S/G219H		 G114N/
D119N/G121S/V196S/L211S/G219H		 V196S/E215N/
N217S
V196S/E264N/
E266S		 D119N/G121S/
V196S/E264N/
E266S		 G114N/V196S/
E264N/E266S		 V196S/R429N/
L431S		 V196S/R243N/K245S V196S/T239N/R295S
V196S/D389N/Y391S V196S/K388N D119N/G121S/V196S/K388N V196S/T428N/
G430S		 V196S/L211S/
G219H/E264N/E266S		 D119N/G121S/
V196S/L211S/
G219H/E264N/E266S
G114N/V196S/
L211S/G219H/
E264N/E266S		 V196S/E264N/
E266S/K388N		 D119N/G121S/
V196S/L211S/
G219H/K388N		 G114N/V196S/L211S/G219H/
K388N		 V196S/L211S/
G219H/E264N/E266S/
K388N
특정 예에서, 본원에서 제공되는 변형은, 비변형 FX 폴리펩티드에서 하기와의 아미노산 치환을 포함하나 이에 제한되지 않는다: 위치 196에 상응하는 위치에서 S; 위치 196에 상응하는 위치에서 T; 위치 197에 상응하는 위치에서 S; 위치 197에 상응하는 위치에서 A; 위치 200에 상응하는 위치에서 A; 위치 200에 상응하는 위치에서 V; 위치 200에 상응하는 위치에서 S; 위치 202에 상응하는 위치에서 S; 위치 211에 상응하는 위치에서 S; 위치 214에 상응하는 위치에서 D; 위치 214에 상응하는 위치에서 A; 위치 214에 상응하는 위치에서 S; 위치 216에 상응하는 위치에서 R; 위치 216에 상응하는 위치에서 K; 위치 216에 상응하는 위치에서 A; 위치 216에 상응하는 위치에서 S; 위치 218에 상응하는 위치에서 R; 위치 218에 상응하는 위치에서 A; 위치 219에 상응하는 위치에서 H; 위치 273에 상응하는 위치에서 E; 위치 276에 상응하는 위치에서 E; 위치 306에 상응하는 위치에서 E; 위치 326에 상응하는 위치에서 S; 위치 326에 상응하는 위치에서 T; 위치 326에 상응하는 위치에서 V; 위치 326에 상응하는 위치에서 N; 위치 326에 상응하는 위치에서 M; 위치 326에 상응하는 위치에서 K; 위치 326에 상응하는 위치에서 M; 위치 326에 상응하는 위치에서 Y; 위치 326에 상응하는 위치에서 E; 위치 326에 상응하는 위치에서 D; 위치 327에 상응하는 위치에서 A; 위치 327에 상응하는 위치에서 L; 위치 332에 상응하는 위치에서 D; 위치 332에 상응하는 위치에서 E; 위치 332에 상응하는 위치에서 S; 위치 332에 상응하는 위치에서 G; 위치 334에 상응하는 위치에서 A; 위치 334에 상응하는 위치에서 T; 위치 334에 상응하는 위치에서 N; 위치 336에 상응하는 위치에서 E; 위치 338에 상응하는 위치에서 A; 위치 338에 상응하는 위치에서 S; 위치 338에 상응하는 위치에서 N; 위치 338에 상응하는 위치에서 R; 위치 338에 상응하는 위치에서 V; 위치 338에 상응하는 위치에서 Y; 위치 338에 상응하는 위치에서 M; 위치 420에 상응하는 위치에서 E; 및/또는 위치 424에 상응하는 위치에서 E이고, 각각은 서열번호 134로 기재되는 아미노산 위치를 참고한다.
본원의 예에서, 변형 FX 지모겐 또는 FXa를 포함하여, 본원에서 제공되는 변형 FX 폴리펩티드는 비변형 FX 폴리펩티드에서 서열번호 134로 기재되는 아미노산 위치를 참고로 위치 211에 상응하는 위치에서 S와의 치환 또는 위치 219에 상응하는 위치에서 H와의 치환인 아미노산 치환을 적어도 하나 가진다. 변형 FX 폴리펩티드는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상의 아미노산 치환(들)을 포함할 수 있는데, 여기에서 각 치환은, 야기되는 변형 FX 폴리펩티드가, 활성형일 때, 저해제(예컨대 AT-Ⅲ 또는 TFPI)에 대한 증가된 내성을 나타내고 FVa-의존적 촉매적 활성을 유지하는 한, 상이한 위치에서이다. 예를 들어, 변형 FX 지모겐 또는 FXa를 포함하여, 본원에서 제공되는 변형 FX 폴리펩티드는, 서열번호 134로 기재되는 아미노산 위치를 참고로 위치 211에 상응하는 위치에서 S와의 치환 및 위치 219에 상응하는 위치에서 H와 치환인 비변형 FX 폴리펩티드에서 적어도 2개의 아미노산 치환을 가진다. 추가적인 아미노산 치환(들)은 본원에서 기술되거나 당업계에 공지된 임의의 기타 아미노산 치환일 수 있다. 특정 예에서, 추가적인 아미노산 치환은 위치 195, 196, 197 또는 198에서이다. 이러한 추가적인 아미노산 치환(들)의 예는 하기와의 치환을 포함하나 이에 제한되지 않는다: 위치 195에 상응하는 위치에서 L; 위치 195에 상응하는 위치에서 V와 치환; 위치 195에 상응하는 위치에서 S와 치환; 위치 195에 상응하는 위치에서 T와 치환; 위치 195에 상응하는 위치에서 I와 치환; 위치 195에 상응하는 위치에서 A와 치환; 위치 195에 상응하는 위치에서 F와 치환; 위치 195에 상응하는 위치에서 D와 치환; 위치 195에 상응하는 위치에서 G와 치환; 위치 196에 상응하는 위치에서 I와 치환; 위치 196에 상응하는 위치에서 A와 치환; 위치 196에 상응하는 위치에서 S와 치환; 위치 196에 상응하는 위치에서 L과 치환; 위치 196에 상응하는 위치에서 F와 치환; 위치 196에 상응하는 위치에서 I와 치환; 위치 196에 상응하는 위치에서 T와 치환; 위치 196에 상응하는 위치에서 G와 치환; 위치 197에 상응하는 위치에서 S와 치환; 위치 197에 상응하는 위치에서 A와 치환; 위치 197에 상응하는 위치에서 A와 치환; 위치 197에 상응하는 위치에서 N과 치환; 위치 197에 상응하는 위치에서 H와 치환; 및/또는 위치 197에 상응하는 위치에서 R과 치환. 다른 예에서, 추가적인 변형은 보조인자 의존성을 증가시키기 위한(예컨대 섹션 D.2) 및/또는 글리코실화를 변경시키기 위한(예컨대 섹션 D.1) 본원에 기술된 임의의 추가적인 변형(들)을 포함한다. 이러한 변형 FX 폴리펩티드는, 활성형일 때, 변형(들)을 함유하지 않는 비변형 FXa 폴리펩티드와 비교하여, 저해제에 대해 적어도 2 배 또는 그 이상 증가된 내성 및/또는 증가된 보조인자 의존성을 나타내는 것들을 포함한다. 서열번호 134로 기재되는 아미노산 잔기을 참고하여, 본원에서 제공되는 변형 FX 폴리펩티드에서 이러한 비-제한적 아미노산 치환은 표 12에 기재된다.
표 12
V196S/L211S/
G219H		 G197A/L211S/
G219H		 I195L/L211S/
G219H		 D119N/G121S/V196S/L211S/
G219H		 G114N/V196S/L211S/G219H G114N/
D119N/G121S/V196S/L211S/G219H
V196S/L211S/
G219H/E264N/E266S		 D119N/G121S/
V196S/L211S/
G219H/E264N/E266S		 G114N/V196S/
L211S/G219H/
E264N/E266S		 D119N/G121S/
V196S/L211S/
G219H/K388N		 G114N/V196S/L211S/G219H/
K388N		 V196S/L211S/
G219H/E264N/E266S/
K388N
본원의 특정 예에서, 활성형일 때 증가된 저해제 내성(예컨대 AT-Ⅱ 내성 및/또는 TFPI 내성)을 나타내는, 변형 FX 지모겐 또는 FXa를 포함하는, 변형 FX 폴리펩티드는 비변형 FX 폴리펩티드에서 하기와의 치환인 적어도 하나의 아미노산 치환을 가진다: 위치 196에 상응하는 위치에서 S; 위치 196에 상응하는 위치에서 L; 위치 196에 상응하는 위치에서 T; 위치 197에 상응하는 위치에서 S; 위치 326에 상응하는 위치에서 N; 위치 334에 상응하는 위치에서 A; 위치 334에 상응하는 위치에서 T; 위치 338에 상응하는 위치에서 A; 위치 338에 상응하는 위치에서 S; 또는 위치 338에 상응하는 위치에서 V이고, 각각은 서열번호 134로 기재되는 아미노산 위치를 참고한다. 변형 FX 폴리펩티드는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상의 아미노산 치환(들)을 포함할 수 있고, 여기에서 각 치환은, 야기되는 변형 FX 폴리펩티드가, 활성형일 때, 증가된 저해제 내성(예컨대 AT-Ⅱ 내성 및/또는 TFPI 내성)을 나타내고 FVa-의존적 촉매적 활성을 유지하는 한, 상이한 위치에서이다. 추가적인 아미노산 치환(들)은 본원에 기술되거나 당업계에 공지된 임의의 기타 아미노산 치환일 수 있다. 예를 들어, 추가적인 변형은 보조인자 독립성(섹션 D.2)을 증가시키는 상기 기술된 임의의 추가적인 변형(들) 및/또는 글리코실화를 변경(섹션 D.1)시키는 임의의 것들을 포함한다. 이러한 변형 FX 폴리펩티드는 변형(들)을 함유하지 않는 비변형 FXa 폴리펩티드와 비교하여, 활성형일 때 적어도 5 배 증가된 보조인자 의존성, 예컨대 적어도 10 배, 20 배, 30 배, 40 배, 50 배, 60 배, 70 배, 80 배, 90 배, 100 배 또는 그 이상 증가된 보조인자 의존성을 나타내는 것들을 포함한다.
특정 예에서, 활성형일 때 증가된 저해제 내성(예컨대 AT-Ⅲ 내성 및/또는 TFPI 내성)을 나타내는, 변형 FX 지모겐 또는 FXa를 포함하는, 본원에서 제공되는 변형 FX 폴리펩티드는 비변형 FX 폴리펩티드에서 적어도 2개의 아미노산 치환(들)을 가지는데, 여기에서 한 치환은 아미노산 위치 195, 196, 197 또는 198에서이고 다른 치환은 위치 273, 276, 306, 326, 332, 338, 420 및/또는 424의 1 이상에 상응하는 위치에서이다. 치환은 그 위치에서 임의의 기타 19개 아미노산일 수 있다. 아미노산 위치 195, 196, 197 또는 198에서 예시적인 비-제한적 치환은 비극성, 중성 또는 친수성 아미노산 잔기에 대한 것일 수 있고, 예를 들어 위치 195 또는 196에서 Asn (N), Gln (Q), Ser (S), Thr (T), Cys (C), 또는 Tyr (Y)와 치환, 예를 들어 S 또는 T와 치환이다. 위치 273, 276, 306, 326, 332, 338, 420 및/또는 424의 1 또는 그 이상에 상응하는 위치에서 예시적인 비-제한적 치환은 산성 또는 중성 아미노산 잔기, 예컨대 Asp (D), Glu (E), Ala (A), Gly (G), Ser (S), Cys (C), Asn (N), Gln (Q), Ile (I), Leu(L), Met (M), Phe (F), Pro (P), Thr (T), Trp (W), Tyr (Y) 또는 Val (V)에 대한 것이고, 예를 들어 A 또는 E와의 치환이다. 위치 195, 196, 197 및/또는 198에서 및 위치 273, 276, 306, 326, 332, 338, 420 및/또는 424의 1 이상에서 적어도 2개의 치환을 포함하는 이러한 변형 FX 폴리펩티드는 활성형일 때, 변형(들)을 함유하지 않는 비변형 FXa 폴리펩티드와 비교하여 적어도 2 배, 4 배, 10 배, 50 배, 100 배, 200 배, 300 배, 400 배, 그리고 특히 적어도 500 배 증가된 저해제 내성(예컨대 AT-Ⅱ 내성 및/또는 TFPI 내성)을, 나타내는 것들을 포함한다.
특정 예에서, 변형 FX 지모겐 또는 FXa를 포함하여, 본원에서 제공되는 변형 FX 폴리펩티드는 비변형 FX 폴리펩티드에서 적어도 2개의 아미노산 치환(들)을 가지는데, 여기에서:
1) 하기와 치환에 상응하는 적어도 하나의 아미노산 치환: 위치 195에 상응하는 위치에서 L; 위치 195에 상응하는 위치에서 V와 치환; 위치 195에 상응하는 위치에서 S와 치환; 위치 195에 상응하는 위치에서 T와 치환; 위치 195에 상응하는 위치에서 I와 치환; 위치 195에 상응하는 위치에서 A와 치환; 위치 195에 상응하는 위치에서 F와 치환; 위치 195에 상응하는 위치에서 D와 치환; 위치 195에 상응하는 위치에서 G와 치환; 위치 196에 상응하는 위치에서 I와 치환; 위치 196에 상응하는 위치에서 A와 치환; 위치 196에 상응하는 위치에서 S와 치환; 위치 196에 상응하는 위치에서 L과 치환; 위치 196에 상응하는 위치에서 F와 치환; 위치 196에 상응하는 위치에서 I와 치환; 위치 196에 상응하는 위치에서 T와 치환; 위치 196에 상응하는 위치에서 G와 치환; 위치 197에 상응하는 위치에서 S와 치환; 위치 197에 상응하는 위치에서 A와 치환; 위치 197에 상응하는 위치에서 A와 치환; 위치 197에 상응하는 위치에서 N과 치환; 위치 197에 상응하는 위치에서 H와 치환; 및/또는 위치 197에 상응하는 위치에서 R과 치환; 및
2) 하기와 치환에 상응하는 적어도 하나의 치환: 위치 273에 상응하는 위치에서 A; 위치 273에 상응하는 위치에서 E; 위치 276에 상응하는 위치에서 A; 위치 276에 상응하는 위치에서 E; 위치 306에 상응하는 위치에서 E; 위치 326에 상응하는 위치에서 A; 위치 326에 상응하는 위치에서 S; 위치 326에 상응하는 위치에서 T; 위치 326에 상응하는 위치에서 V; 위치 326에 상응하는 위치에서 Q; 위치 326에 상응하는 위치에서 N; 위치 326에 상응하는 위치에서 M; 위치 326에 상응하는 위치에서 K; 위치 326에 상응하는 위치에서 Y; 위치 326에 상응하는 위치에서 E; 위치 326에 상응하는 위치에서 D; 위치 332에 상응하는 위치에서 A; 위치 332에 상응하는 위치에서 D; 위치 332에 상응하는 위치에서 E; 위치 332에 상응하는 위치에서 S; 위치 332에 상응하는 위치에서 G; 위치 338에 상응하는 위치에서 A; 위치 338에 상응하는 위치에서 S; 위치 338에 상응하는 위치에서 N; 위치 338에 상응하는 위치에서 R; 위치 338에 상응하는 위치에서 V; 위치 338에 상응하는 위치에서 Y; 위치 338에 상응하는 위치에서 M; 위치 420에 상응하는 위치에서 A; 위치 420에 상응하는 위치에서 E; 위치 424에 상응하는 위치에서 A; 및/또는 위치 424에 상응하는 위치에서 E이고, 각각은 서열번호 134로 기재되는 아미노산 위치를 참고한다. 서열번호 134로 기재되는 아미노산 잔기에 대하여, 본원에서 제공되는 변형 FX 폴리펩티드에서 이러한 비-제한적 아미노산 치환(들)은 표 13에 기재된다.
표 13
V196S/R332D V196S/R332E V196S/R332S V196S/R332G V196S/R326D V196S/R326M
V196S/R326Q V196S/R273E V196S/R273A V196S/R424E V196S/K420A V196S/K420E
V196S/R424A V196S/K338A V196S/K338S V196S/K276A V196S/K276E V196S/K420E/
R424E
V196S/R326N V196S/R306E V196S/R332A
4. 예시적인 변형 FX 폴리펩티드
서열번호 2로 기재되는 전구체 FX 폴리펩티드, 또는 이에 대해 적어도 75% 서열 상동성을 나타내는 이의 변이체에서 아미노산 치환(들)을 포함하는 변형 FX 폴리펩티드가 제공된다. 예를 들어, 변형 FX 폴리펩티드는 서열번호 2에 대해 적어도 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 상동성을 나타내는 FX 폴리펩티드에서 아미노산 치환(들)을 함유한다. 이러한 FX 폴리펩티드의 예는 서열번호 4-133의 임의의 서열로 기재되는 아미노산의 서열, 또는 서열번호 4-133의 임의의 서열에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상을 나타내는 아미노산 서열을 갖는 FX 폴리펩티드이다. 특정 예에서, 변형 FX 폴리펩티드는 서열번호 5-25, 32, 37, 41, 42, 44, 45, 47-49, 51-58, 60-71, 73-77, 81-111 및 114-133으로 기재되는 아미노산 서열 또는 서열번호 5-25, 32, 37, 41, 42, 44, 45,47-49,51-58,60-71,73-77,81-111 및 114-133의 임의의 서열에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 상동성을 나타내는 아미노산 서열을 갖는 FX폴리펩티드이다.
본원에서 이종성 신호 서열을 포함하는 전구체 FX 폴리펩티드에서 아미노산 치환(들)을 포함하는 변형 FX 폴리펩티드가 제공된다. 예를 들어, 이종성 신호 서열은 트롬빈(예컨대 서열번호 415의 아미노산 1-43에 상응하는)으로부터이다. 예를 들어, 본원에서 서열번호 415로 기재되는 FX 폴리펩티드, 또는 이에 대해 적어도 75% 서열 상동성을 나타내는 이의 변이체에서 아미노산 치환(들)을 함유하는 변형 FX 폴리펩티드가 제공된다. 예를 들어, 변형 FX 폴리펩티드는 서열번호 415에 대해 적어도 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 상동성을 나타내는 FX 폴리펩티드에서 아미노산 치환(들)을 함유한다. 이러한 변형 FX 폴리펩티드의 예는 서열번호 417-546의 임의의 서열로 기재되는 아미노산의 서열, 또는 서열번호 417-546의 임의의 서열에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 상동성을 나타내는 아미노산 서열을 갖는 FX 폴리펩티드이다. 특정 예에서, 변형 FX 폴리펩티드는 서열번호 418-438, 445, 450, 454, 455, 457, 458, 460-462, 464-471, 473-484, 486-490, 494-524 및 527-546의 임의의 서열로 기재되는 아미노산의 서열 또는 서열번호 418-438, 445, 450, 454, 455, 457, 458, 460-462, 464-471, 473-484, 486-490, 494-524 및 527-546의 임의의 서열에 대하여 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 상동성을 나타내는 아미노산의 서열을 갖는 FX 폴리펩티드이다.
본원에서 서열번호 134로 기재되는 성숙 FX 폴리펩티드, 또는 이에 대해 적어도 75% 서열 상동성을 나타내는 이의 변이체에서 아미노산 치환(들)을 포함하는 변형 FX 폴리펩티드가 제공된다. 예를 들어, 변형 FX 폴리펩티드는 서열번호 134에 대해 적어도 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 상동성을 나타내는 FX 폴리펩티드에서 아미노산 치환(들)을 함유한다. 이러한 변형 FX 폴리펩티드의 예는 서열번호 136-265의 임의의 서열로 기재되는 아미노산 서열, 또는 서열번호 136-265의 임의의 서열에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 상동성을 나타내는 아미노산 서열을 갖는 FX 폴리펩티드이다. 특정 예에서, 변형 FX 폴리펩티드는 서열번호 137-157, 164, 169, 173, 174, 176, 177, 179-181, 183-190, 192-203, 205-209, 213-243 및 246-265의 임의의 서열로 기재되는 아미노산 서열 또는 서열번호 137-157, 164, 169, 173, 174, 176, 177, 179-181, 183-190, 192-203, 205-209, 213-243 및 246-265의 임의의 서열에 대하여 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상 서열 상동성을 나타내는 아미노산 서열을 갖는 FX 폴리펩티드이다.
또한 본원에서 서열번호 136-265, 또는 서열번호 136-265의 임의의 서열에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상을 나타내는 아미노산 서열의 임의의 서열의 지모겐, 활성 또는 촉매적 활성형이 제공된다. 특정 예에서, 서열번호 137-157, 164, 169, 173, 174, 176, 177, 179-181, 183-190, 192-203, 205-209, 213-243 및 246-265의 임의의 서열의 지모겐, 활성 또는 촉매적 활성형이 있다. 이러한 형태의 예는 이황화 결합에 의해 연결된 중쇄 및 경쇄를 갖는 이중쇄 형이다. 아미노산 치환(들)은 중쇄에 있다.
예를 들어, 본원에서 서열번호 134의 아미노산 1-139의 서열을 갖는 경쇄 및 서열번호 134의 아미노산 143-448의 서열을 갖는 중쇄를 포함하는 지모겐 FX 폴리펩티드, 또는 상기 경쇄 또는 중쇄에 대해 적어도 75% 서열 상동성을 나타내는 중쇄를 포함하는 이의 변이체에서 아미노산 치환(들)을 포함하는 FX의 지모겐 형인 변형 FX 폴리펩티드가 제공된다. 예를 들어, 변형 FX 폴리펩티드는 서열번호 134의 아미노산 1-139의 서열을 갖는 지모겐 FX 경쇄 폴리펩티드에 대해 적어도 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 상동성을 나타내는 경쇄 및/또는 서열번호 134의 아미노산 143-448의 서열을 갖는 지모겐 FX 중쇄 폴리펩티드에 대해 적어도 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 상동성을 나타내는 중쇄를 함유하는 지모겐 FX 폴리펩티드에서 아미노산 치환(들)을 함유하는 변형 FX 지모겐이다. 이러한 변형 FX 지모겐 폴리펩티드의 예는 서열번호 134로 기재되는 아미노산 1-139(즉, 서열번호 136-265의 임의의 서열의 아미노산 1-139에 상응하는)의 서열을 갖는 경쇄 또는 서열번호 134의 임의로 기재되는 아미노산 1-139에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 상동성을 나타내는 아미노산 서열을 갖는 경쇄; 및 서열번호 136-265의 임의의 서열의 아미노산 143-448의 서열을 갖는 중쇄를 함유하는 FX 폴리펩티드, 또는 서열번호 136-265의 임의의 서열로 기재되는 아미노산 143-448에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 상동성을 나타내는 아미노산 서열을 갖는 중쇄를 함유하는 폴리펩티드이다. 특정 예에서, 변형 FX 지모겐 폴리펩티드는 서열번호 134에서 아미노산 1-139(즉, 서열번호 136-265의 임의의 서열에서 아미노산 1-139에 상응하는)의 서열을 갖는 경쇄 또는 서열번호 134의 임의에서 아미노산 1-139에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 상동성을 나타내는 아미노산 서열을 갖는 경쇄; 및 서열번호 137-157, 164, 169, 173, 174, 176, 177, 179-181, 183-190, 192-203, 205-209, 213-243 및 246-265의 임의의 서열에서 아미노산 143-448의 서열을 갖는 중쇄를 함유하는 FX 폴리펩티드, 또는 서열번호 137-157, 164, 169, 173, 174, 176, 177, 179-181, 183-190, 192-203, 205-209, 213-243 및 246-265의 임의의 서열에서 아미노산 143-448에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 상동성을 나타내는 아미노산 서열을 갖는 중쇄를 함유하는 폴리펩티드이다.
본원에서 서열번호 134의 아미노산 1-139의 서열을 갖는 경쇄 및 서열번호 134의 아미노산 195-448의 서열을 갖는 중쇄를 포함하는 FXa 폴리펩티드, 또는 상기 경쇄 또는 중쇄에 대해 적어도 75% 서열 상동성을 나타내는 이의 변이체에서 아미노산 치환(들)을 함유하는 FXa 형인 변형 FX 폴리펩티드가 제공된다. 예를 들어, 변형 FX 폴리펩티드는 서열번호 134의 아미노산 1-139의 서열을 갖는 FXa 경쇄 폴리펩티드에 대해 적어도 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 상동성을 나타내는 경쇄 및/또는 서열번호 134의 아미노산 195-448의 서열을 갖는 FXa 중쇄 폴리펩티드에 대해 적어도 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 상동성을 나타내는 중쇄를 포함하는 FXa 폴리펩티드에서 아미노산 치환(들)을 함유하는 변형 FXa이다. 이러한 변형 FXa 폴리펩티드의 예는 서열번호 134의 아미노산 1-139(즉, 서열번호 136-265의 임의의 서열의 아미노산 1-139에 상응하는)의 서열을 갖는 경쇄, 서열번호 134의 임의의 아미노산 1-139에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 상동성을 나타내는 아미노산 서열을 갖는 경쇄; 및 서열번호 136-265의 임의의 서열의 아미노산 195-448의 서열을 갖는 중쇄를 함유하는 FX 폴리펩티드, 또는 서열번호 136-265의 임의의 서열의 아미노산 195-448에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 상동성을 나태는 아미노산 서열을 갖는 중쇄를 함유하는 폴리펩티드이다. 특정 예에서, 변형 FXa 폴리펩티드는 서열번호 134의 아미노산 1-139(즉, 서열번호 136-265의 임의의 서열의 아미노산 1-139에 상응하는)의 서열을 갖는 경쇄, 또는 서열번호 134의 임의에서 아미노산 1-139에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 상동성을 나타내는 아미노산 서열을 갖는 경쇄; 및 서열번호 137-157, 164, 169, 173, 174, 176, 177, 179-181, 183-190, 192-203, 205-209, 213-243 및 246-265의 임의의 서열의 아미노산 195-448의 서열을 갖는 중쇄를 함유하는 FX 폴리펩티드, 또는 서열번호 137-157, 164, 169, 173, 174, 176, 177, 179-181, 183-190, 192-203, 205-209, 213-243 및 246-265의 임의의 서열의 아미노산 195-448에 대해 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 상동성을 나타내는 아미노산 서열을 갖는 중쇄를 함유하는 폴리펩티드이다.
표 14는 본원에서 제공되는 예시적인 변형 FX 폴리펩티드를 요약한다.
표 14
펩티드 FX
프리프로펩티드
서열번호		 트롬빈-FX 혼성체
서열번호		 성숙 FX
서열번호		 FX 지모겐
서열번호의
LC: aa 1-139;
HC: aa 143-448		 활성화 FX (FXa)
서열번호의
LC: aa 1-139;
HC: aa 195-448
V196I 4 417 136 136 136
V196S 5 418 137 137 137
T85N/K87S/V196S 6 419 138 138 138
Q56N/Q58S/V196S 7 420 139 139 139
K62N/G64S/V196S 8 421 140 140 140
L65N/E67S/V196S 9 422 141 141 141
E67N/V196S 10 423 142 142 142
L73N/G75S/V196S 11 424 143 143 143
G75N/E77S/V196S 12 425 144 144 144
R86N/L88S/V196S 13 426 145 145 145
G114N/V196S 14 427 146 146 146
D95N/D97S/V196S 15 428 147 147 147
E82S/V196S 16 429 148 148 148
E82N/F84S/V196S 17 430 149 149 149
G78N/N80S/V196S 18 431 150 150 150
E77N/K79S/V196S 19 432 151 151 151
D119N/G121S/V196S 20 433 152 152 152
L83N/V196S 21 434 153 153 153
K122S/V196S 22 435 154 154 154
E51N/V196S 23 436 155 155 155
Q58N/K60S/V196S 24 437 156 156 156
G114N/D119N/G121S/V196S 25 438 157 157 157
G198A 26 439 158 158 158
G198V 27 440 159 159 159
G198R 28 441 160 160 160
G198K 29 442 161 161 161
G198P 30 443 162 162 162
G198H 31 444 163 163 163
L211S/G219H 32 445 164 164 164
G197P 33 446 165 165 165
D378N 34 447 166 166 166
D378S 35 448 167 167 167
V196L 36 449 168 168 168
V196T 37 450 169 169 169
V196P 38 451 170 170 170
G197V 39 452 171 171 171
G197T 40 453 172 172 172
G197S 41 454 173 173 173
E200A 42 455 174 174 174
E200S 43 456 175 175 175
E200V 44 457 176 176 176
K202S 45 458 177 177 177
R326A 46 459 178 178 178
R326S 47 460 179 179 179
R326T 48 461 180 180 180
R326V 49 462 181 181 181
R326Q 50 463 182 182 182
R326N 51 464 183 183 183
R326M 52 465 184 184 184
R326K 53 466 185 185 185
R326Y 54 467 186 186 186
T327A 55 468 187 187 187
T327L 56 469 188 188 188
S334A 57 470 189 189 189
S334T 58 471 190 190 190
S334N 59 472 191 191 191
R336E 60 473 192 192 192
K338A 61 474 193 193 193
K338S 62 475 194 194 194
K338N 63 476 195 195 195
K338R 64 477 196 196 196
K338V 65 478 197 197 197
K338Y 66 479 198 198 198
K338M 67 480 199 199 199
T327A/K338A 68 481 200 200 200
T327L/K338M 69 482 201 201 201
E200V/T327L/K338M 70 483 202 202 202
E200V/T327L/S334A/K338M 71 484 203 203 203
V196S/G197A 72 485 204 204 204
V196S/L211S/G219H 73 486 205 205 205
D119N/G121S/V196S/L211S/G219H 74 487 206 206 206
G114N/V196S/L211S/G219H 75 488 207 207 207
G114N/D119N/G121S/V196S/L211S/G219H 76 489 208 208 208
G197A/L211S/G219H 77 490 209 209 209
V196S/G197A/L211S/G219H 78 491 210 210 210
I195L/V196S 79 492 211 211 211
I195L/G197A 80 493 212 212 212
I195L/L211S/G219H 81 494 213 213 213
V196S/N214D 82 495 214 214 214
V196S/N214A 83 496 215 215 215
V196S/N214S 84 497 216 216 216
V196S/E216R 85 498 217 217 217
V196S/E216K 86 499 218 218 218
V196S/E216A 87 500 219 219 219
V196S/E216S 88 501 220 220 220
V196S/E218R 89 502 221 221 221
V196S/E218K 90 503 222 222 222
V196S/E218A 91 504 223 223 223
V196S/R332A 92 505 224 224 224
V196S/R332D 93 506 225 225 225
V196S/R332E 94 507 226 226 226
V196S/R332S 95 508 227 227 227
V196S/R332G 96 509 228 228 228
V196S/R326E 97 510 229 229 229
V196S/R326D 98 511 230 230 230
V196S/R326M 99 512 231 231 231
V196S/R326N 100 513 232 232 232
V196S/R326Q 101 514 233 233 233
V196S/R273E 102 515 234 234 234
V196S/R273A 103 516 235 235 235
V196S/R424A 104 517 236 236 236
V196S/R424E 105 518 237 237 237
V196S/K420A 106 519 238 238 238
V196S/K420E 107 520 239 239 239
V196S/R306E 108 521 240 240 240
V196S/K276A 109 522 241 241 241
V196S/K276E 110 523 242 242 242
V196S/K420E/R424E 111 524 243 243 243
V196S/R273E/K420E/R424E 112 525 244 244 244
V196S/R273E/R306E/K420E/R424E 113 526 245 245 245
V196S/K338A 114 527 246 246 246
V196S/K338S 115 528 247 247 247
V196S/E215N/N217S 116 529 248 248 248
V196S/E264N/E266S 117 530 249 249 249
D119N/G121S/V196S/E264N/E266S 118 531 250 250 250
G114N/V196S/E264N/E266S 119 532 251 251 251
V196S/R429N/L431S 120 533 252 252 252
V196S/R243N/K245S 121 534 253 253 253
V196S/T293N/R295S 122 535 254 254 254
V196S/D389N/Y391S 123 536 255 255 255
V196S/K388N 124 537 256 256 256
D119N/G121S/V196S/K388N 125 538 257 257 257
V196S/T428N/G430S 126 539 258 258 258
V196S/L211S/G219H/E264N/E266S 127 540 259 259 259
D119N/G121S/V196S/L211S/G219H/E264N/E266S 128 541 260 260 260
G114N/V196S/L211S/G219H/E264N/E266S 129 542 261 261 261
V196S/E264N/E266S/K388N 130 543 262 262 262
D119N/G121S/V196S/L211S/G219H/K388N 131 544 263 263 263
G114N/V196S/L211S/G219H/K388N 132 545 264 264 264
V196S/L211S/G219H/E264N/E266S/K388N 133 546 265 265 265
5. 추가적인 변형
추가적인 변형이 본원에서 제공되는 임의의 변형 FX 폴리펩티드에 만들어질 수 있다. 추가적인 변형(들)은 아미노산 삽입, 결실, 치환, 화학적 변형 및/또는 번역후 변형일 수 있다. 예를 들어, 화학적 모이어티(예컨대 폴리머 모이어티)에 대한 부착 부위를 제공하기 위해, 1 이상의 추가적인 비-천연 글리코실화 부위를 도입하기 위해, 및/또는 폴리펩티드의 활성 또는 기타 성질을 개선 또는 변경시키기 위해 변형 FX 폴리펩티드에서 추가적인 아미노산 치환(들)이 만들어질 수 있다. 변경될 수 있는 예시적인 성질 또는 활성은, 가용성, 안정성, 촉매적 활성(예컨대 프로트롬빈분해효소 활성), 보조인자에 대한 결합(예컨대 FVa), 기질 특이성, 기질 선택성, 및/또는 저해제(예컨대 ATⅢ)에 대한 결합을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
이러한 변형(들)은 당업자에게 잘 알려져 있다(예컨대 미국 특허번호 제5,990,079호; 제6,017,882호; 제6,573,071호; 제6,562,598호; 제6,660,492호; 제6,670,147호; 제6;958,322호, 제7,078,508호; 제7,220,569호; 제7,645,602호; 제8,048,990호; 미국 공개번호 US20030207402호; US2006-0148038호; US20090053185호; US20090175828호; US20090175931호; US20100125052호; US20100255000호; US2010-0285568호; 제2011-0015128호; 제2011-0293597호; 국제 공개 PCT 출원 번호 W01998039456호 및 W02005023308호; 및 Uprichard and Perry, Blood Rev 16: 97-110 (2002); Venkateswarlu et al., Biophys J82(3):1190-1206 (2002); Vianello et al., Thromb. Res. 107:51-54 (2002); Vianello et al. Thromb. Res. 104:257-264 (2001); Vianello et al., Blood Coagul. Fibrinolysis 14:401-405 (2003); Wallmark et al., Blood 78(supple1): 60 (1991); Wallmark et al., Thromb Haemost. 65:1263 (1991); Wang et al., Haemophilia. 11(1):31-37 (2005); Wang et al., Haematologica. 90(12): 1659-1664 (2005); Watzke et al., J Biol. Chem. 265:11982-11989 (1990); Watzke et al., J Clin Invest. 88(5):1685-1689 (1991); Watzke et al., Thromb Haemost 69:1452 (1993); Whinna et al., J. Thromb Haemost 2(7): 1127-1134; Yang et al., Biochemistry 47(22):5976-5985 (2008); 및 Zama et al., Br. J Haematol. 106:809-811 (1999) 참조).
예를 들어, 변형 FX 폴리펩티드는 폴리머와의 컨쥬게이션(conjugation)을 허용하는 폴리펩티드가 되도록 변형될 수 있다. 예시적인 폴리머는, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜 및 폴리프로필렌 글리콜, 카복시메틸셀룰로오스, 덱스트란, 폴리비닐 알코올, 폴리비닐피롤리돈 또는 폴리프롤린과의 코폴리머를 포함한다(Abuchowski et al. (1981); Newmark et al. (1982); 및 Katre et al. (1987)). 본원에서 제공되는 변형 FX 폴리펩티드는 1 이상의 폴리에틸렌 글리콜 모이어티로 변형(페길화)될 수 있다. 활성화 PEG 유도체는 FX 폴리펩티드와 직접적으로 상호작용하는 데 사용될 수 있고, 카복실산 또는 카보네이트(carbonate) 유도체의 에스테르, 특히 남아있는 기(leaving group)가 N-히드록시숙신이미드, p-니트로페놀, 이미다졸 또는 1-히드록시-2-니트로벤젠-4-설포네이트인 것들을 포함한다. 말레이미도(maleimido) 또는 할로아세틸(haloacetyl) 기를 포함하는 PEG 유도체는 설프히드릴(sulfhydryl) 기의 변형을 위해 사용될 수 있고, 히드라진 또는 히드라지드 기를 포함하는 PEG 시약은 탄수화물 기의 과요오드산염 산화에 의해 생성된 알데히드를 변형시키는 데 사용될 수 있다.
또한 인산화된(phosphorylated) 아미노산 잔기, 예컨대 포스포티로신, 포스포세린, 또는 포스포트레오닌을 갖는 변형 FX 폴리펩티드 서열이 고려된다. 본원에서 제공되는 폴리펩티드의 추가적인 변형은 아세틸화 또는 카복실화를 포함하나 이에 제한되지 않는 폴리펩티드의 화학적 유도체화를 포함한다. 예를 들어, 혈액 혈장 내로 주사 후에 천천히 탈아세틸화되어 시간에 걸쳐 활성화 인자 X를 생성하는, FX의 아세틸화 불활성 변이체가 생산되었다(Wolf et al. (1995) Blood. 86, pp 4153-4157).
본원에서 제공되는 변형 FX 폴리펩티드의 기타 적합한 추가적인 변형은 단백분해적 분해에 대한 내성을 증가시키기 위해, 가용성 성질을 최적화시키기 위해 및/또는 그들을 치료적 제제로서 더 적합하게 만들기 위해 표준 화학적 기술 및/또는 재조합 핵산 방법을 사용하여 변형된 폴리펩티드이다. 예를 들어, 펩티드의 백본은 안정성을 향상시키기 위해 고리화될 수 있다(예컨대 Friedler et al. (2000) J Biol. Chem. 275:23783-23789 참조). 천연적으로 발생하는 L-아미노산 외의 잔기, 예컨대 D- 아미노산 또는 비-천연적으로 발생하는 합성 아미노산을 포함하는 유사체가 사용될 수 있다.
추가적인 변형은 폴리펩티드의 세포적 가공 및/또는 번역후 변형을 변경, 증가 또는 개선하는 변형을 포함한다. 예를 들어, 추가적인 변형은 세포 배양물 내에서 프로펩티드 가공의 효율을 개선하기 위해 프로펩티드 절단 부위(예컨대 Thr39)의 영역 내에 있는 것들을 포함한다(Rudolph et al. (1997) Prot. Express and Puri., 10: 373-378). 다른 예에서, 및 본원의 다른 부분에서 기술된 바와 같이, 감마 카복실화의 더 높은 수준은 트롬빈의 그것에 의해 인자 X의 프리프로펩티드를 치환함으로써 달성될 수 있다(예컨대 Camire et al. (2000) Biochemistry. 39 pp. 14322-14329 참조).
기타 예시적인 추가적 변형은 폴리펩티드의 성질 또는 활성의 1 이상을 변경하기 위한 아미노산 치환(들)을 포함한다. 예를 들어, 변형은 그것의 합성을 위해 요구되는 비타민 K에 대한 의존성을 변경시키는 것들, 예컨대 서열번호 134로 기재되는 잔기에 상응하는 위치 10, 11, 12, 28, 29, 32, 33, 34 또는 35에서 아미노산 치환을 포함하나 이에 제한되지 않는 Gla 도메인의 잔기의 변형에 의한 것들을 포함한다(예컨대 미국 특허번호 제6,017,882호 및 제8,048,990호 참조). 변형은 또한 활성화될 FX의 능력을 향상시키도록, 예컨대 기타 세린 프로테아제 또는 기타 펩티드 또는 단백질의 이종성 잔기와 활성화 펩티드에서 잔기의 아미노산 치환(들)에 의해, 만들어질 수 있다(예컨대 미국 특허번호 제6,958,322호 및 제6,573,071호; 국제 공개 PCT 출원 번호 WO 98/38317호, WO 03/035861호, WO 2004/005347호; 미국 공개번호 제2006/0148038호; Himmelspach et al. Thromb. Res., 97, 51-67 (2000); Wolf et al. (1991) JBC. 266, no. 21. pp. 13726-13730; Volkel et al(2005), Mol. Biotechnol., 29 (1): 19-30 참조). 추가적인 변형은 활성화 펩티드를 삭제하여 FX 폴리펩티드가 보조인자 독립적 방식에서 자가-활성화되도록 하는 변형을 포함한다(Rudolph et al., (2002) Thromb Haemost., 88:756-62). 추가적인 변형은 활성화 절단 부위를 변경 또는 변형하여 천연적으로 FX를 활성화시키지 않는 기타 프로테아제가 FX를 절단 또는 활성화하는 변형을 포함한다(예컨대 WO 98/38317호; WO 98/38318호; WO 01/10896호 참조).
본원에서 제공되는 변형 FX의 키메라 단백질이 만들어질 수 있다. 예를 들어, 경로에서 응고 인자 복합체, 예컨대 TF/FⅦa 복합체와 생산적으로 상호작용하는 키메라를 생성하기 위해, 경쇄의 부분(예컨대 Gla 도메인 및/또는 EGF 도메인(들))이 다른 응고 프로테아제, 예컨대 FⅨ로부터 상응하는 부분과 치환될 수 있다(Thiec et al. (2003) JBC, 12:10393-1 0399).
E. FX 폴리펩티드의 생산
변형 FX 폴리펩티드를 포함하여, FX 폴리펩티드는 단백질 정제 및 재조합 단백질 발현을 위한 당업계에 잘 알려진 방법에 의해 수득될 수 있다. 희망되는 유전자를 암호화하는 핵산의 확인을 위한 당업자에게 알려진 임의의 방법이 사용될 수 있다. 당업계에 이용가능한 임의의 방법이 FX 폴리펩티드를 암호화하는 전장(즉, 전체 암호화 영역을 포함하는) cDNA 또는 게놈 DNA 클론을, 예컨대 세포 또는 조직 급원, 예컨대 간으로부터의 예로부터 수득하는 데 사용될 수 있다. cDNA는 또한 상업적으로(예컨대 Origene, Rockville, MD) 또는 합성적 방법을 통해 수득될 수 있다. 변형 FX 폴리펩티드는 본원에 기술된 바와 같이, 예컨대 위치지정 돌연변이생성에 의해, 조작될 수 있다.
FX는 핵산 분자를 클로닝하고 단리하기 위한 당업계에 알려진 임의의 이용가능한 방법을 사용하여 클로닝 또는 단리될 수 있다. 이러한 방법은 핵산의 PCR 증폭 및 핵산 혼성화 스크리닝, 항체-기반 스크리닝 및 활성-기반 스크리닝을 포함하는 라이브러리의 스크리닝을 포함한다.
예를 들어 중합효소 연쇄 반응(PCR) 방법을 포함하는, 핵산의 증폭을 위한 방법은 FX 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자를 단리하기 위해 사용될 수 있다. 핵산을 포함하는 물질이 FX-암호화 핵산 분자가 단리될 수 있는 출발 물질로서 사용될 수 있다. 예를 들어, DNA 및 mRNA 제제, 세포 추출물, 조직 추출물(예컨대 간으로부터), 액체 시료(예컨대 혈액, 혈청, 타액), 건강한 및/또는 병든 대상체로부터의 시료가 증폭 방법에서 사용될 수 있다. 핵산 라이브러리도 출발 물질의 급원으로서 사용될 수 있다. 프라이머는 FX-암호화 분자를 증폭하기 위해 설계될 수 있다. 예를 들어, 프라이머는 FX가 생성되는 발현된 서열에 기초하여 설계될 수 있다. 프라이머는 FX 아미노산 잔기의 역-번역에 기초하여 설계될 수 있다. 증폭에 의해 생성되는 핵산 분자가 시퀀싱되고 FX 폴리펩티드를 암호화하는 것으로 확인될 수 있다.
제한 엔도뉴클레아제 부위를 포함하는 링커 서열을 포함하는, 추가적인 뉴클레오티드 서열이 벡터, 예컨대 단백질 발현 벡터 또는 DNA 서열을 암호화하는 코어 단백질의 증폭을 위해 설계된 벡터 내로 합성 유전자를 클로닝하기 위한 목적으로 FX-암호화 핵산 분자에 통합될 수 있다. 더 나아가, 기능적 DNA 구성요소를 특정하는 추가적인 뉴클레오티드 서열이 FX-암호화 핵산 분자에 작동적으로 연결될 수 있다. 이러한 서열의 예는 세포내 단백질 발현을 용이하게 하도록 설계된 프로모터 서열, 및 단백질 분비를 용이하게 하도록 설계된 분비 서열을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 단백질 결합 영역을 특정하는 서열과 같은 추가적인 뉴클레오티드 서열은 FX-암호화 핵산 분자에 연결될 수 있다. 이러한 영역은 특이적인 표적 세포 내로 FX의 흡수를 용이하게 하거나, 그렇지 않으면 합성 유전자의 약동학을 향상시키는 서열을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
확인되고 단리된 핵산은 그 후 적절한 클로닝 벡터 내로 삽입될 수 있다. 당업계에 알려진 다수의 벡터-숙주 시스템이 사용될 수 있다. 잠재적인 벡터는 플라스미드 또는 변형 바이러스를 포함하지만 이에 제한되지 않으나, 벡터 시스템은 사용되는 숙주 세포와 반드시 양립가능해야만 한다. 이러한 벡터는 람다 유도체와 같은 박테리오파지, 또는 pBR322 또는 pUC 플라스미드 유도체와 같은 플라스미드 또는 블루스크립트 벡터(Stratagene, La Jol1a, CA)를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 클로닝 벡터의 삽입은, 예를 들어, DNA 단편을 상보적인 접착성 말단을 갖는 클로닝 벡터 내로 라이게이션함으로써 성취될 수 있다. 삽입은 TOPO 클로닝 벡터(Invitrogen, Carlsbad, CA)를 사용하여 달성될 수 있다. 만약 클로닝 벡터 내에 DNA를 단편화할 상보적 제한 부위가 존재하지 않는다면, DNA 분자의 말단은 효소적으로 변형될 수 있다. 대안적으로, 희망되는 임의의 부위가 뉴클레오티드 서열(링커)을 DNA 말단에 라이게이션함으로써 생산될 수 있다; 이러한 라이게이션된 링커는 제한 엔도뉴클레아제 인식 서열을 암호화하는 특이적인 화학적으로 합성된 올리고뉴클레오티드를 함유할 수 있다. 대안적인 방법에서, 절단된 벡터 및 FX 단백질 유전자는 동중합적 테일링(homopolymeric tailing)에 의해 변형될 수 있다. 재조합 분자는 유전자 서열의 다수 카피가 생성되도록, 숙주 세포 내로, 예를 들어, 형질전환, 형질감염, 감염, 전기천공 및 초음파천공을 통해 도입될 수 있다.
표적 단백질 내에 1 이상의 아미노산의 돌연변이를 달성하기 위한 당업계에 알려진 임의의 방법이 이용될 수 있다. 방법은 암호화 핵산 분자의 표준 위치지정 돌연변이생성, 또는 고체상 폴리펩티드 합성 방법을 포함한다. 예를 들어, FX 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자는 돌연변이생성, 예컨대 암호화 핵산의 무작위적 돌연변이생성, 실수 유발 PCR, 위치지정 돌연변이생성(예컨대 키트, 예컨대 Stratagene로부터 이용가능한 QuikChange와 같은 키트를 사용하여), 오버랩 PCR, 유전자 셔플링, 또는 기타 재조합 방법의 대상이 될 수 있다. 폴리펩티드를 암호화하는 핵산은 그 후 숙주 세포 내로 도입되어 이종성으로 발현될 수 있다. 일부 예에서, 변형 FX 폴리펩티드는, 예컨대 고체상 또는 용액상 펩티드 합성을 사용하여, 합성적으로 생산된다.
특정 구현예에서, 단리된 FX 단백질 유전자, cDNA, 또는 합성된 DNA 서열의을 통합하는 재조합 DNA 분자로 숙주 세포를 형질전환하는 것은 유전자의 복수의 카피의 생성을 가능하게 한다. 따라서, 유전자는 형질전환체를 성장시키고, 재조합 DNA 분자를 형질전환체로부터 단리하고, 필요시, 삽입된 유전자를 단리된 재조합 DNA로부터 회수함으로써, 대량으로 수득될 수 있다.
1. 벡터 및 세포
하나 또는 그 이상의 FX 단백질의 재조합 발현을 위하여, FX 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 전부 또는 일부를 함유하는 핵산이 적절한 발현 벡터, 즉, 삽입되는 단백질 암호화 서열의 전사 및 번역을 위해 필요한 구성요소(element)를 함유하는 벡터 내로 삽입될 수 있다. 이러한 벡터의 예는 임의의 포유류 발현 벡터, 예컨대, 예를 들어, pCMV이다. 필요한 전사 및 번역 신호는 또한 FX 유전자를 위한 천연(native) 프로모터, 및/또는 그들의 인접 영역(flanking region)들에 의해 공급될 수 있다.
또한, FX 또는 변형 FX를 암호화하는 핵산을 함유하는 벡터가 제공된다. 상기 벡터를 함유하는 세포가 또한 제공된다. 상기 세포는 진핵생물 및 원핵생물 세포를 포함하고, 벡터는 본원에 사용되기에 적합한 임의의 벡터이다.
벡터를 함유하는, 내피 세포(endothelial cell)를 포함한 원핵생물 및 진핵생물 세포가 제공된다. 이러한 세포는 세균 세포, 효모 세포, 진균 세포, 고세균(Archea), 식물 세포, 곤충 세포 및 동물 세포를 포함한다. 상기 기술된 세포를, 암호화된 FX 단백질이 상기 세포에 의해 발현되는 조건하에서 성장시키고, 발현된 FX 단백질을 수거함으로써, FX 폴리펩티드 또는 이의 변형 FX 단백질을 생산하는데 사용한다. 본원의 목적을 위해, FX는 배지내로 분비될 수 있다.
일 구현예에서, FX 활성을 갖고, FX 폴리펩티드의 전부 또는 일부를 함유하는 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드의 서열, 또는 이의 다수 카피를 함유하는 벡터가 제공된다. 또한, 상기 벡터는 세포 내에서 FX 폴리펩티드 또는 이의 변형 FX 폴리펩티드를 발현되도록 또는 FX 단백질이 분비 단백질로서 발현되도록 선택될 수 있다. FX가 발현될 때, 핵산은 분비 신호, 예컨대, 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae) α-교배 인자(mating factor) 신호 또는 이의 부분을 암호화하는 핵산, 또는 천연(native) 신호 서열에 연결되어 있다.
다양한 숙주-벡터 시스템이 단백질 암호화 서열을 발현하는데 사용될 수 있다. 이들은 바이러스(예를 들어, 백시니아(vaccinia) 바이러스, 아데노바이러스 및 기타 바이러스)로 감염된 포유류 세포 시스템; 바이러스(예를 들어, 배큘로바이러스(baculovirus))로 감염된 곤충 세포 시스템; 효모 벡터를 함유하는 효모와 같은 미생물; 또는 박테리오파지, DNA, 플라스미드 DNA, 또는 코스미드 DNA로 형질전환된 세균을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 벡터의 발현 구성요소는 그들의 강도 및 특이성에 있어 다양하다. 사용되는 숙주-벡터 시스템에 따라, 다수의 적합한 전사 및 번역 구성요소 중 어느 하나의 것이 사용될 수 있다.
벡터에 DNA 단편을 삽입하기 위한 당업자에게 공지된 임의의 방법은 적절한 전사/번역 조절 신호 및 단백질 암호화 서열을 함유하는 키메라 유전자를 함유하는 발현 벡터의 작제에 사용될 수 있다. 이러한 방법들은 시험관내 재조합 DNA와 합성 기술 및 생체내 재조합체(유전자 재조합)를 포함할 수 있다. FX 폴리펩티드 또는 변형 FX 폴리펩티드, 또는 이의 도메인, 유도체, 단편 또는 동족체(homolog)를 암호화하는 핵산 서열은 상기 유전자 또는 이의 단편들이 재조합 DNA 분자(들)로 형질전환된 숙주에서 발현되도록 제2 핵산 서열에 의해 조절될 수 있다. 예를 들어, 단백질의 발현은 당업계에 공지된 임의의 프로모터/인핸서에 의해 조절될 수 있다. 특정 구현예에서, 프로모터는 FX 단백질의 유전자들에 대해 천연적이지 않다. 사용될 수 있는 프로모터는 SV40 초기 프로모터 (Bernoist and Chambon, Nature 290: 304-310(1981)), 라우스 육종 바이러스의 3' 장쇄 말단 반복체 내에 함유된 프로모터 (Yamamoto et al. Cell 22:787-797 (1980)), 헤르페스 티미딘 키나제 프로모터 (Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1441-1445 (1981)), 메탈로티오네인 유전자의 조절 서열 (Brinster et al., Nature 296:39-42 (1982)); 원핵 발현 벡터, 예컨대, 베타-락타마제 프로모터 (Jay et al., (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:5543) 또는 tac 프로모터 (DeBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:21-25 (1983)); 문헌 Scientific American 242:79-94 (1980)의 "Useful Proteins from Recombinant Bacteria"에 기재된 것들 참조; 노팔린 신타제 프로모터를 함유하는 식물 발현 벡터 (Herrar-Estrella et al., Nature 303:209-213 (1984)) 또는 컬리플라워 모자이크 바이러스 35S RNA 프로모터 (Garder et al., Nucleic Acids Res. 9:2871 (1981)), 및 광합성 효소 리불로스 비스포스페이트 카복실라제의 프로모터 (Herrera-Estrella et al., Nature 310:115-120 (1984)); 효모 및 기타 진균류로부터의 프로모터 구성요소, 예컨대, Gal4 프로모터, 알코올 탈수소효소 프로모터, 포스포글리세롤 키나제 프로모터, 알칼리성 포스파타제 프로모터, 및 조직 특이성을 나타내고 형질전환 동물내에서 사용되어온 하기 동물 전사 조절 영역: 췌장 선포 세포내에서 활성인 엘라스타제 I 유전자 조절 영역 (Swift et al., Cell 38:639-646 (1984); Ornitz et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399-409 (1986); MacDonald, Hepatology 7:425-515 (1987)); 췌장 베타 세포에서 활성인 인슐린 유전자 조절 영역 (Hanahan et al., Nature 315:115-122 (1985)), 림프양세포에서 활성인 면역글로불린 유전자 조절 영역 (Grosschedl et al., Cell 38:647-658 (1984); Adams et al., Nature 318:533-538 (1985); Alexander et al., Mol. Cell Biol. 7:1436-1444 (1987)), 고환, 유방, 림프양세포 및 비만 세포에서 활성인 마우스 유방암 바이러스 조절 영역 (Leder et al., Cell 45:485-495 (1986)), 간에서 활성인 알부민 유전자 조절 영역 (Pinckert et al., Genes and Devel. 1:268-276 (1987)), 간에서 활성인 알파-페토단백질 유전자 조절 영역 (Krumlauf et al., Mol. Cell. Biol. 5:1639-1648 (1985); Hammer et al., Science 235:53-58 1987)), 간에서 활성인 알파-1 항트립신 유전자 조절 영역 (Kelsey et al., Genes and Devel. 1:161-171 (1987)), 골수 세포에서 활성인 베타 글로빈 유전자 조절 영역 (Magram et al., Nature 315:338-340 (1985); Kollias et al., Cell 46:89-94 (1986)), 뇌의 희소돌기아교세포에서 활성인 미엘린 염기성 단백질 유전자 조절 영역 (Readhead et al., Cell 48:703-712 (1987)), 근섬유에서 활성인 미오신 경쇄-2 유전자 조절 영역 (Shani, Nature 314:283-286 (1985)), 및 시상하부의 성선자극세포에서 활성인 성선자극호르몬 방출 호르몬 유전자 조절 영역 (Mason et al., Science 234:1372-1378 (1986))을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
특정 구현예에서, FX 폴리펩티드 또는 변형 FX 폴리펩티드, 또는 이의 도메인, 단편, 유도체 또는 동족체를 암호화하는 핵산에 작동가능하게 연결된 프로모터, 하나 이상의 복제 기점, 및 선택적으로, 하나 이상의 선별 마커(예를 들어, 항생제 내성 유전자)를 함유하는 벡터가 사용된다. FX 폴리펩티드의 발현을 위한 벡터 및 시스템은 널리 공지된 피치아(Pichia) 벡터(예를 들면, Invitrogen, San Diego, CA에서 이용가능), 특히 암호화된 단백질의 분비를 위해 설계된 것들을 포함한다. 포유류 세포에서 발현시키기 위한 예시적 플라스미드 벡터로는 예컨대 pCMV, pFUSE (InvivoGen) 및 당업자에게 잘 알려진 많은 기타 벡터가 포함된다. E. coli 세포의 형질전환을 위한 예시적 플라스미드 벡터로는, 예를 들면, pQE 발현 벡터 (Qiagen, Valencia, CA로부터 이용가능; 당해 시스템을 기술하는 Qiagen 발간된 문헌 참조)를 포함한다. pQE 벡터는, E. coli 내에서 재조합 단백질의 엄격하게 조절된 고수준 발현을 제공하는 파지 T5 프로모터 (E. coli RNA 폴리머라제에 의해 인지됨) 및 이중 lac 오퍼레이터 억제 모듈, 효율적 번역을 위한 합성 리보솜 결합 부위(RBS II), 6XHis 태그 암호화 서열, t0 및 T1 전사 터미네이터, 복제의 ColE1 기점, 및 앰피실린 내성을 부여하기 위한 베타-락타마제 유전자를 갖는다. pQE 벡터는 재조합 단백질의 N- 또는 C- 말단 어느 하나에 6xHis 태그의 배치를 가능케 한다. 이러한 플라스미드에는 pQE 32, pQE 30, 및 pQE 31을 포함하며, 이는 모든 세개의 리딩 프레임에 대한 다중 클로닝 부위를 제공하고 N-말단 6xHis-태그된 단백질의 발현을 위해 제공된다. E. coli 세포의 형질전환을 위한 다른 예시적 플라스미드 벡터에는, 예를 들면, pET 발현 벡터 (미국 특허 제4,952,496호 참조; NOVAGEN, Madison, WI에서 이용가능; 당해 시스템을 기술하는 Novagen 간행 문헌 또한 참조)를 포함한다. 이러한 플라스미드에는, T7lac 프로모터, T7 터미네이터, 유도성 E. coli lac 오퍼레이터, 및 lac 리프레서 유전자를 함유하는 pET 11a; T7 프로모터, T7 터미네이터, 및 E. coli ompT 분비 신호를 함유하는 pET 12a-c; 및 His 컬럼으로 정제하는데 사용하기 위한 His-TagTM 리더 서열, 컬럼 상에서 정제 후 절단시킬 수 있는 트롬빈 절단 부위, T7-lac 프로모터 영역 및 T7 터미네이터를 함유하는, pET15b 및 pET19b (NOVAGEN, Madison, WI)를 포함한다.
2. 발현 시스템
FX 폴리펩티드(변형된 및 비변형된)는 시험관내 및 생체내 방법을 포함한 단백질 생산을 위해 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 생산될 수 있으며, 그 예로는 FX를 암호화하는 핵산 분자의 숙주 세포, 숙주 동물 내로의 도입 및 시험관내 FX를 암호화하는 핵산 분자로부터의 발현이 포함된다. FX 및 변형 FX 폴리펩티드는 투여 및 치료에 필요한 FX 폴리펩티드의 요구되는 함량 및 형태를 생산하는데 적합한 임의의 유기체에서 발현될 수 있다. 발현 숙주는 원핵생물 및 진핵생물 유기체, 예컨대, E. coli, 효모, 식물, 곤충 세포, 인간세포주 및 형질전환 동물(transgenic animal)을 포함하는 포유류 세포를 포함한다. 발현 숙주는 그들의 단백질 생산 수준뿐만 아니라 발현된 단백질에 존재하는 번역후 변형의 유형이 다를 수 있다. 발현 숙주의 선택은 이러한 인자 및 기타 인자들, 예컨대 조절 및 안전성 문제, 생산비용 및 정제의 필요와 방법 등을 기초로 하여 이루어질 수 있다.
진핵생물 숙주에서의 발현은 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae) 및 피치아 파스토리아(Pichia pastoria)와 같은 효모, 드로소필라 세포 및 레피도프테란 세포와 같은 곤충 세포, 담배, 옥수수, 쌀, 조류(algae) 및 렘나(lemna)와 같은 식물 및 식물 세포에서의 발현을 포함할 수 있다. 발현용 진핵생물 세포로는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포 또는 새끼 햄스터 신장(BHK) 세포와 같은 포유류 세포주도 또한 포함한다. 진핵생물 발현 숙주는 또한 형질전환 동물에서의 생산, 예컨대 혈청, 젖 및 난(egg)에서의 생산을 포함한다.
FX의 발현을 위해 당업자에게 공지되어 있고 많은 발현 벡터들이 이용가능하다. 발현 벡터의 선택은 숙주 발현 시스템의 선택에 의해 영향을 받는다. 이러한 선택은 당업자의 기술 수준 안에 있다. 일반적으로, 발현 벡터는 전사 프로모터 및 선택적으로 인핸서, 번역 신호 및 전사 및 번역 종결 신호를 포함할 수 있다. 안정한 형질전환에 사용되는 발현 벡터는 전형적으로 형질전환된 세포의 선택 및 유지를 허용하는 선별 마커를 가진다. 일부 경우에, 복제 기점은 세포에서 벡터의 카피수를 증폭시키는데 사용될 수 있다.
FX 또는 변형 FX 폴리펩티드는 또한 단백질 융합체로서 사용되거나 발현될 수 있다. 예를 들어, 융합은 폴리펩티드에 추가의 기능성을 부가하기 위해 생성될 수 있다. 융합 단백질의 예로는, 신호 서열, 국재화(localization) 등을 위한 태그, 예컨대 his6 태그 또는 myc 태그, 또는 정제용 태그, 예컨대 GST 융합, 및 단백질 분비 및/또는 막 연합의 유도용 서열을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
일 구현예에서, 프로테아제는 불활성, 지모겐 형으로 발현된다. 다른 구현예에서, FX 폴리펩티드 또는 변형 FX 폴리펩티드는 활성형이 되도록 생성될 수 있는데, 여기에서 활성화는 폴리펩티드의 FX 지모겐 형의 발현 분비 및 정제 후에 러셀 살모사 독 FX 활성화제(Hematologic Technologies)와의 반응에 의해 달성될 수 있다. 이러한 예에서, 활성화제는 투석에 의해 또는 활성화제와 양립가능한 친화성 컬럼(예컨대 비오틴-스트렙타비딘)을 사용하여 야기되는 정제된 제제로부터 제거될 수 있다.
일부 예에서, 불활성화 FX 폴리펩티드 형은 제제 내의 활성화 FXa 형으로부터 제거된다. 예를 들어, FXa가 구조적으로 변경되었기 때문에, FXa는 헤파린에 결합하는 능력을 나타낸다. 따라서, FXa는 지모겐 형도 포함하는 제제로부터 헤파린 컬럼을 사용하는 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있다. 이는 본원 실시예 2에 예시된다. 일반적으로, 본원의 예에서, FXa 폴리펩티드는 적어도 70%, 그리고 일반적으로 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 순도를 나타낸다. 일반적으로, FXa 제제는 FX 지모겐 형을 포함하여, 기타 단백질 오염물질이 실질적으로 없다.
a. 원핵세포 발현
원핵생물, 특히 E. coli 는 다량의 FX를 생산하는 시스템을 제공한다(예를 들어, Platis et al.(2003) Protein Exp. Purif. 31(2): 222-30; 및 Khalizzadeh et al. (2004) J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 31(2): 63-69 참조). E. coli의 형질전환은 당업자에게 공지된 간단하고 신속한 기술이다. E. coli를 위한 발현 벡터는 숙주 세포에 일부 독성을 나타내는 단백질의 발현 및 높은 수준의 단백질 발현의 유도에 유용한 유도성 프로모터를 함유할 수 있다. 유도성 프로모터의 예로는 lac 프로모터, trp 프로모터, 혼성체 tac 프로모터, T7 및 SP6 RNA 프로모터 및 온도 조절 λPL 프로모터를 포함한다.
FX는 E. coli의 세포질 환경에서 발현될 수 있다. 세포질은 환원성 환경이고, 이것은 일부 분자에 대해 불용성 봉입체의 형성을 야기할 수 있다. 디티오트레이톨 및 β-머캅토에탄올과 같은 환원제 및 변성제(예를 들어, 예컨대, 구아니딘-HCl 및 우레아)는 단백질의 재용해에 사용될 수 있다. 대안적인 시도는, 산화 환경과 샤페로닌(chaperonin) 유사 및 디설파이드 이소머라제를 제공하여 가용성 단백질의 생산을 야기하는 세균의 주변세포질 공간에서의 FX의 발현이다. 전형적으로, 리더 서열은 단백질을 주변세포질 공간으로 유도하는, 발현될 단백질에 융합된다. 그 다음, 리더는 주변세포질 내의 신호 펩티다제에 의해 제거된다. 주변세포질-표적화 리더 서열의 예로는 펙테이트 리아제 유전자 유래의 pelB 리더 및 알칼리성 포스파타제 유전자 유래의 리더를 포함한다. 일부 경우에, 주변세포질 발현은 발현된 단백질의 배양 배지로의 유출을 허용한다. 단백질의 분비는 배양 상청액으로부터 빠르고 간단히 정제할 수 있게 한다. 분비되지 않은 단백질은 주변세포질로부터 삼투 용해에 의해 수득할 수 있다. 세포질 발현과 유사하게, 일부 경우에 단백질은 불용성이 될 수 있고, 가용화 및 재접힘(refolding)을 촉진하기 위해 변성제와 환원제를 사용할 수 있다. 또한, 유도 및 성장 온도는 발현 수준 및 가용성에 영향을 미칠 수 있다. 전형적으로, 25℃ 내지 37℃ 사이의 온도가 사용된다. 또한, 발현 단백질의 가용성을 증가시키기 위해 돌연변이를 사용할 수도 있다. 전형적으로, 세균은 아글리코실화(비당화) 단백질을 생산한다. 따라서, 단백질이 기능화를 위해 글리코실화를 요구한다면, 글리코실화는 숙주 세포로부터 정제 후에 시험관내에서 부가될 수 있다.
b. 효모
사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae), 쉬조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 야로위아 리포리티카(Yarrowia lipolytica), 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis) 및 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)는 FX를 위한 유용한 발현 숙주이다(예컨대, Skoko et al.(2003) Biotechnol. Appl. Biochem. 38(Pt3): 257-65 참조). 효모는 에피솜 복제 벡터에 의해 또는 상동적 재조합(homologous recombination)을 통한 안정한 염색체 통합에 의해 형질전환될 수 있다. 전형적으로, 유전자 발현을 조절하기 위해 유도성 프로모터가 사용된다. 이러한 프로모터의 예로는 GAL1, GAL7, 및 GAL5 및 CUP1과 같은 메탈로티오네인 프로모터를 포함한다. 발현 벡터는 종종 형질전환된 DNA의 선택과 유지를 위한 선별 마커, 예컨대 LEU2, TRP1, HIS3 및 URA3을 포함한다. 효모에서 발현된 단백질은 종종 가용성이고, Bip 및 단백질 디설파이드 이소머라제와 같은 샤페로닌과의 공동발현은 발현 수준 및 가용성을 개선시킬 수 있다. 또한, 효모에서 발현된 단백질은 사카로마이세스 세레비지에 유래의 효모 교배형 알파-인자 분비 신호과 같은 분비 신호 펩티드 융합체 및 Aga2p 교배 부착 수용체 또는 아르술라 아데노니보란스(Arxula adeninivorans) 글루코아밀라제와 같은 효모 세포 표면 단백질과의 융합체를 사용하여 분비되도록 유도될 수 있다. 프로테아제 절단 부위(예컨대, Kex-2 프로테아제)는 분비 경로를 이탈할 때 폴리펩티드로부터 융합된 서열을 제거하도록 조작될 수 있다. 또한, 효모는 Asn-X-Ser/Thr 모티프에서 글리코실화할 수 있다.
c. 곤충 및 곤충 세포
특히 배큘로바이러스 발현 시스템을 이용하는 곤충 및 곤충 세포는, FX 또는 이의 변형된 형태와 같은 폴리펩티드의 발현에 유용하다(예컨대, Muneta et al.(2003) J.Vet.Med.Sci. 65(2): 219-23 참조). 혈림프절에서의 발현을 포함하여 곤충 세포 및 곤충 유충은 단백질의 높은 수준을 발현하고 고등 진핵생물이 사용하는 번역후 변형의 대부분을 할 수 있다. 배큘로바이러스는 안정성을 개선시키고 진핵생물 발현의 조절 염려를 감소시키는 제한적인 숙주 범위를 가진다. 전형적으로, 발현 벡터는 고도의 발현 수준을 위한 배큘로바이러스의 폴리헤드린 프로모터와 같은 프로모터를 이용한다. 일반적으로 사용되는 배큘로바이러스 시스템은 배큘로바이러스, 예컨대 오토그라파 캘리포니카 핵다면증 바이러스(AcNPV), 및 봄빅스 모리(Bombyx mori) 핵다면증 바이러스(BmNPV) 및 곤충 세포주, 예컨대 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 유래의 Sf9, 슈달레티아 유니펑타(Pseudaletia unipuncta)(A7S) 및 다나우스 플렉시푸스(Danaus plexippus)(DpN1)를 포함한다. 높은 수준의 발현을 위해, 발현될 분자의 뉴클레오티드 서열은 바이러스의 폴리헤드린 개시 코돈의 인접 하류(immediately downstream)에 융합된다. 포유류 분비 신호는 곤충 세포에서 정확하게 가공되고 발현된 단백질을 배양 배지로 분비시키는데 사용될 수 있다. 또한, 세포주 슈달레티아 유니펑타(Pseudaletia unipuncta)(A7S) 및 다나우스 플렉시푸스(Danaus plexippus)(DpN1)는 포유류 세포 시스템과 유사한 글리코실화 패턴을 갖는 단백질을 생산한다.
곤충 세포의 대안적인 발현 시스템은 안정하게 형질전환된 세포의 사용이다. 세포주, 예컨대 슈니더(Schnieder) 2(S2) 및 Kc 세포(드로소필라 멜라노가스터) 및 C7 세포(아에데스 알보픽터스(Aedes albopictus))가 발현을 위해 사용될 수 있다. 드로소필라 메탈로티오네인 프로모터는 카드뮴 또는 구리를 이용한 중금속 유도의 존재 하에 높은 발현 수준을 유도하는데 사용될 수 있다. 발현 벡터는 전형적으로 네오마이신 및 하이그로마이신과 같은 선별 마커의 사용에 의해 유지된다.
d. 포유류 세포
포유류 발현계는 FX 폴리펩티드의 발현에 사용될 수 있다. 발현 작제물은 아데노바이러스와 같은 바이러스 감염에 의해, 또는 리포좀, 인산칼슘, DEAE-덱스트란과 같은 직접 DNA 전이에 의해, 그리고 전기천공 및 미량주사와 같은 물리적 수단에 의해 포유류 세포로 전이될 수 있다.
포유류 세포의 발현 벡터는 일반적으로 mRNA 캡 부위, TATA 박스, 해독 개시 서열(코작 컨센서스 서열) 및 폴리아데닐화 인자를 포함한다. 이러한 벡터들은 종종 높은 발현 수준을 위한 전사 프로모터-인핸서, 예컨대 SV40 프로모터-인핸서, 인간 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터 및 라우스 육종 바이러스(RSV)의 장말단 반복체를 포함한다. 이러한 프로모터-인핸서는 많은 세포 유형에서 활성적이다. 조직 및 세포형 프로모터 및 인핸서 영역도 역시 발현을 위해 사용될 수 있다. 예시적 프로모터/인핸서 영역은 엘라스타제 I, 인슐린, 면역글로불린, 마우스 유방암 바이러스, 알부민, 알파-태아단백, 알파 1-안티트립신, 베타-글로빈, 미엘린 염기성 단백질, 미오신 경쇄-2 및 성선자극 방출 호르몬 유전자 조절과 같은 유전자 유래의 영역을 포함하나, 이에 국한되지 않는다. 선별 마커는 발현 작제물을 보유한 세포를 선택하고 유지시키는데 사용될 수 있다. 선별 마커 유전자의 예로는 하이그로마이신 B 포스포트랜스퍼라제, 아데노신 데아미나제, 잔틴-구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제, 아미노글리코사이드 포스포트랜스퍼라제, 디하이드로폴레이트 리덕타제 및 티미딘 키나제를 포함하나, 이에 국한되지 않는다. 세포 표면 신호전달 분자, 예컨대 TCR-ζ 및 FcεRI-γ와의 융합은 세포 표면에 활성 상태의 단백질을 직접 발현시킬 수 있다.
많은 세포주는 마우스, 랫트, 인간, 원숭이, 및 닭과 햄스터 세포를 포함한 포유류의 발현에 유용하다. 세포주의 예로는 BHK(즉, BHK-21 세포), 293-F, CHO, CHO 발현, Balb/3T3, HeLa, MT2, 마우스 NS0(비분비형) 및 다른 골수종 세포주, 하이브리도마 및 헤테로하이브리도마 세포주, 림프구, 섬유아세포, Sp2/0, COS, NIH3T3, HEK293, 293S, 293T, 2B8, 및 HKB 세포를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 세포주는 세포 배양배지로부터 분비 단백질의 정제를 용이하게 하는 무혈청 배지에 쉽게 적응한다. 이러한 한 예는 무혈청 EBNA-1 세포주(Pham et al.,(2003) Biotechnol. Bioeng. 84: 332-42)이다.
e. 식물
형질전환 식물 세포 및 식물은 FX의 발현에 사용될 수 있다. 발현 작제물은 전형적으로 직접 DNA 전이, 예컨대 및 미세입자투사법(microprojectile bombardment) 및 원형질 내로 PEG 매개 전이, 및 아그로박테리움 매개의 형질전환을 이용하여 식물 내로 전이된다. 발현 벡터는 프로모터 및 인핸서 서열, 전사 종결 구성요소 및 번역 조절 구성요소를 포함할 수 있다. 발현 벡터와 형질전환 기술은 일반적으로 쌍떡잎식물 숙주, 예컨대 아라비돕시스 및 담배와 외떡잎식물숙주, 예컨대 옥수수 및 쌀 간에 나누어진다. 발현에 사용되는 식물 프로모터의 예로는 컬리플라워 모자이크 바이러스 프로모터, 노팔린 신타제 프로모터, 리보스 비스포스페이트 카복실라제 프로모터 및 유비퀴틴 및 UBQ3 프로모터를 포함한다. 하이그로마이신, 포스포만노스 이소머라제 및 네오마이신 포스포트랜스퍼라제와 같은 선별 마커는 종종 형질전환된 세포의 선택 및 유지를 용이하게 하는데 사용된다. 형질전환된 식물 세포는 세포, 결집체(캘러스 조직)로서 배양물에서 유지되거나 또는 완전 식물로 재생될 수 있다. 식물은 포유류 세포보다 다른 글리코실화 패턴을 갖기 때문에, 이는 이들 숙주에서 FX를 생산하기 위한 선택에 영향을 미칠 수 있다. 또한, 형질전환 식물 세포는 단백질을 생산하도록 조작된 조류(algae)를 포함할 수 있다(예컨대, Mayfield et al.(2003) PNAS 100:438-442 참조). 식물은 포유류 세포와 다른 글리코실화 패턴을 가지기 때문에, 이는 이들 숙주에서 FX를 생산하는 선택에 영향을 미칠 수 있다.
2. 정제
숙주 세포로부터 FX 폴리펩티드를 정제하는 방법은 선택된 숙주 세포와 발현 시스템에 의존한다. 분비 분자인 경우, 단백질은 일반적으로 세포를 제거한 후 배양배지로부터 정제된다. 세포내 발현인 경우, 세포는 용해되고 이 추출물로부터 단백질이 정제된다. 형질전환 식물 및 동물과 같은 형질전환 유기체가 발현에 사용될 때에는, 조직 또는 기관을 출발 물질로서 사용하여 용해된 세포 추출물을 제조한다. 또한, 형질전환 동물 생산은 수집될 수 있는 젖이나 난에서의 폴리펩티드의 생산을 포함할 수 있고, 필요하다면 단백질은 더 추출될 수 있고 당업계의 표준 방법을 사용해서 더 정제될 수 있다.
FX는 SDS-PAGE, 크기 분획 및 크기 배제 크로마토그래피, 황산암모늄 침전, 킬레이트 크로마토그래피 및 음이온 교환 크로마토그래피를 포함하나, 이에 제한되지 않는 당업계에 공지된 표준 단백질 정제 기술을 사용하여 정제할 수 있다. 예를 들어, FX 폴리펩티드는 음이온교환 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있다. FX 폴리펩티드를 정제하는 방법의 예는 기능성 Gla 도메인을 보유하는 임의의 폴리펩티드의 결합과 이어서 칼슘의 존재 하에 용출을 허용하는 이온교환 컬럼을 이용하는 방법이다. 또한, 이 제제(preparation)의 효율과 순도를 개선시키기 위해 친화성 정제 기술이 사용될 수 있다. 예를 들어, FX를 결합시키는 항체, 수용체 및 다른 분자는 친화성 정제에 사용될 수 있다. 또한, 발현 작제물은 단백질에 대해 myc 에피토프, GST 융합 또는 His6과 같은 친화성 태그를 부가하도록 조작되어, 각각 myc 항체, 글루타티온 수지, 및 Ni-수지로 친화성 정제될 수 있다. 순도는 겔 전기영동 및 염색과 분광분석 기술을 포함하는 당업계에 공지된 임의의 방법으로 평가될 수 있다.
상기에서 논의된 바와 같이, FX 프로테아제는 불활성형(지모겐 형)이도록 발현 및 정제될 수 있거나, 또는 대안적으로 발현된 프로테아제는 활성형으로 정제될 수 있다. FX 지모겐 폴리펩티드는 먼저 포유류 세포에서 생산 후에 정제를 포함하나 이에 제한되지 않는 본원에 기술된 임의의 생산 방법에 의해 준비될 수 있다. 활성화 펩티드의 제거를 통해 활성화된 FXa 폴리펩티드는 시험관내에서 준비될 수 있다(즉, FXa; 이중쇄형). FX 폴리펩티드의 활성화 프로테아제 형, FXa으로의 절단은, 활성화제(예컨대 러셀 살모사 독 FX 활성화제)와의 반응, 활성화제의 제거 및 불활성형의 추가적인 제거에 의해 성취될 수 있다.
3. 융합 단백질
변형 FX 폴리펩티드 및 하나 이상의 다른 폴리펩티드를 함유하는 융합 단백질도 또한 제공된다. 이러한 융합 단백질을 적당한 경로를 통해 투여하기 위해 제형화한 약학적 조성물도 제공된다. 융합 단백질은 변형 FX 폴리펩티드 및 제제, 예컨대 항체 또는 이의 단편, 성장인자, 수용체, 리간드, 및 FX 폴리펩티드의 정제를 용이하게 하고, 상기 폴리펩티드를 표적화된 세포 또는 조직으로 유도하는 등에 의해 FX 폴리펩티드의 약력학적 성질을 변경시키고/변경시키거나 FX 폴리펩티드의 발현 또는 분비를 증가시키기 목적의 다른 제제를 임의의 순서대로 연결시켜 형성된다. 전형적으로, 임의의 FX 융합 단백질은 비융합 FX 폴리펩티드와 비교하여 적어도 약 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95% 촉매적 활성, 예컨대 비융합 폴리펩티드와 비교하여 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 촉매적 활성을 유지한다.
다른 폴리펩티드와 FX 폴리펩티드의 연결은 직접 또는 링커를 통해 간접적으로 실시될 수 있다. 일 예에서, 결합은 이종이작용기제(heterobifunctional agent) 또는 티올 연결 또는 다른 이러한 연결과 같은 화학적 연결에 의해 이루어질 수 있다. 또한, 융합은 재조합 수단에 의해 달성될 수도 있다. FX 폴리펩티드와 다른 폴리펩티드의 융합은 FX 폴리펩티드의 N-말단 또는 C-말단에 이루어질 수 있다. 본원에서 제공되는 FX 폴리펩티드와 함께 융합 단백질에 사용될 수 있는 폴리펩티드의 비제한적 예로는 예컨대 GST(글루타티온 S-트랜스퍼라제) 폴리펩티드, 면역글로불린 G 유래의 Fc 도메인 또는 이종성 신호 서열(예컨대 트롬빈으로부터)을 포함한다. 융합 단백질은 세포들에 의한 단백질의 흡수에 도움을 주는 E. coli 말토스 결합 단백질(MBP)과 같은 추가 성분을 함유할 수 있다(국제 PCT 출원번호 WO01/32711호 참조).
융합 단백질은 표준 재조합 기술로 생산할 수 있다. 예를 들면, 다른 폴리펩티드 서열을 암호화하는 DNA 단편은, 예를 들면, 라이게이션(liagtion)을 위한 평활-말단(blunt-ended) 또는 스태거-말단(stagger-ended), 적합한 말단을 제공하기 위한 제한 효소 소화분해(digestion), 바람직하지 않은 접합, 및 효소 라이게이션을 피하기 위해 적합한, 알카리성 포스파타제 처리로서 점착성 말단의 충전(filling-in)을 사용하여 통상적인 기술에 따라 프레임내로 함께 라이게이션될 수 있다. 또다른 구현예에서, 융합 유전자는 자동 DNA 합성기를 포함하는 통상적인 기술로 합성될 수 있다. 대안적으로, 유전자 단편의 PCR 증폭은 후속적으로 어닐링되고 재증폭되어 키메라 유전자 서열을 생성할 수 있는 2개의 연속적인 유전자 단편 사이에 상보적 오버행을 생성시키는 앵커 프라이머를 사용하여 수행될 수 있다(예를 들어, Ausubel et al. (eds.) CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, 1992 참조). 또한, 융합 모이어티(예를 들면, GST 폴리펩티드)를 이미 암호화하고 있는 다수의 발현 벡터는 상업적으로 이용가능하다. FX 암호화 핵산은 융합 모이어티가 프로테아제 단백질에 인프레임식으로 연결되도록 이러한 발현 벡터에 클로닝될 수 있다.
4. 폴리펩티드 변형
변형 FX 폴리펩티드는 나출 폴리펩티드 또는 복합체로서 제조될 수 있다. 일부 적용에서, 번역후 변형 또는 다른 화학적 변형없이 변형 FX를 "나출" 형태로 제조하는 것이 바람직할 수 있다. 나출 폴리펩티드 쇄는 FX를 번역후 변형시키지 않는 적합한 숙주 내에서 제조될 수 있다. 또한, 이러한 폴리펩티드는 시험관내 시스템에서 화학적 폴리펩티드 합성을 이용하여 제조할 수도 있다. 다른 적용에서, 페길화, 알부민화, 글리코실화, 카복실화, 히드록실화, 인산화, 또는 다른 공지된 변형을 포함한 특정 변형이 바람직할 수 있다. 변형은 시험관내에서 이루어지거나, 또는 이러한 변형을 생산하는 적당한 숙주에서 변형 FX를 생산하여 이루어질 수 있다.
5. 뉴클레오티드 서열
FX 또는 변형 FX 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자가 본원에서 제공된다. 핵산 분자는 임의의 암호화된 FX 폴리펩티드의 대립유전자 변이체 또는 스플라이스 변이체를 포함한다. 본원에서 제공되는 핵산 분자의 예는 본원에서 제공되는 변형 FX 폴리펩티드를 암호화하는 임의의 것, 예컨대 서열번호 4-133 또는 417-546 중 임의의 서열번호로 기재된 폴리펩티드, 또는 이의 성숙, 지모겐, 활성 또는 촉매적 활성형이다. 일 구현예에서, 본원에서 제공되는 핵산 분자는 본원에서 제공되는 본원에서 제공되는 FX 폴리펩티드를 암호화하는 임의의 핵산의 전장의 적어도 70%를 따라 중간 또는 높은 엄중도(stringency) 조건 하에 혼성화하거나 또는 적어도 50, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 또는 99% 서열 상동성을 가진다. 또 다른 구현예에서, 핵산 분자는 본원에서 제공되는 임의의 FX 폴리펩티드를 암호화하는 축퇴성 코돈 서열을 갖는 것을 포함할 수 있다.
F. 변형 FX 폴리펩티드의 활성 평가
FX 폴리펩티드의 활성 및 성질은 시험관내 및/또는 생체내에서 평가될 수 있다. 이러한 평가의 검정은 당업자에게 공지되어 있고, 시험된 활성과 치료적 및 생체내 활성에 대한 결과를 상호관련짓는 것으로 알려져 있다. 일 예에서, FX 변이체는 비변형된 및/또는 야생형 FX와 비교하여 평가될 수 있다. 다른 예에서, 변형 FX 폴리펩티드의 활성은 AT-Ⅲ에 대한 시험관내 또는 생체내 노출 후에 평가되고 AT-Ⅲ에 노출된 바 없는 변형 FX 폴리펩티드의 활성과 비교될 수 있다. 이러한 검정은 FVa의 존재 또는 부존재 하에서 수행될 수 있다. 시험관내 검정은 당업자에 알려진 임의의 실험실 검정(laboratory assay), 예컨대 예를 들어, 응고 검정(coagulation assay), 결합 검정, 단백질 검정, 및 분자 생물학 검정을 포함하는 세포-기반 검정(cell-based assay)을 포함한다. 생체내 검정은 인간에 대한 투여뿐만 아니라 동물 모델에서의 FX 검정을 포함한다. 일부 경우에, 생체내 FX의 활성은 혈액, 혈청, 또는 다른 체액을 검정 결정인자(assay determinats)에 대해 평가하여 결정될 수 있다. FX 변이체, 예컨대 본원에서 제공되는 것들은, 또한 활성 또는 성질, 예컨대 치료 효과를 평가하기 위해 생체내에서 시험될 수 있다.
전형적으로, 본원에서 기술된 검정은 FX의 활성회된 형태, 즉, FXa에 관한 것이다. 이러한 검정은, 이러한 형태가 FX의 응고 활성에 요구되는 단백분해 또는 촉매적 활성을 전형적으로 포함하지 않기 때문에 음성 대조군을 제공하기 위하여, 또한 불활성, 지모겐 형태와 함께 수행될 수 있다. 또한, 이러한 검정은 또한 FX 활성을 증대시킬 수 있는, 보조인자, 예컨대 FVa의 존재하에서 수행될 수 있다.
1. 시험관내 검정
시험관내 검정의 예로는 폴리펩티드 변형 및 활성을 평가하는 검정들을 포함한다. 변형은 글리코실화, γ-카복실화 및 다른 번역후 변형을 평가하는 시험관내 검정, 단백질 검정 및 당업계에 공지된 구조적 검정(conformational assay)을 사용하여 평가될 수 있다. 활성에 대한 검정은 다른 응고 인자, 예컨대, 인자 FVa 및 프로트롬빈과 FXa의 상호작용의 측정, FXa 폴리펩티드의 단백분해 활성을 측정하는 단백분해 검정, 포스파티딜세린 및 다른 인지질에 대한 FXa 폴리펩티드의 결합 및/또는 친화력을 결정하는 검정, 및 FXa 폴리펩티드가 응고에 미치는 영향을 결정하는 세포 기반 검정을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
변형 FXa 펩티드의 농도는 당업계에 공지된 방법으로 평가할 수 있으며, 그 예로는 효소결합 면역흡착 검정(ELISA), SDS-PAGE; 브래드포드(Bradford), 로우리(Lowry), 비신코닌산(BCA) 방법; UV 흡광도, 및 다른 정량가능한 단백질 표지 방법, 예컨대 면역학적, 방사성, 형광 방법 및 관련 방법(이에 제한되지 않는다)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 프로트롬빈 폴리펩티드의 절단 또는 FXa 프로테아제 활성에 의해 생산된 산물을 포함하는, 단백분해 반응의 절단 산물의 평가는 발색원성 기질 절단, HPLC, SDS-PAGE 분석, ELISA, 웨스턴 블롯팅, 면역조직화학, 면역침전, NH2-말단 시퀀싱 및 단백질 표지화를 포함하나, 이에 제한되지 않는 방법을 사용하여 수행될 수 있다.
또한, 변형 FXa 폴리펩티드의 구조적 성질도 평가될 수 있다. 예를 들어, 변형 FXa 폴리펩티드의 X선 결정학, 핵자기공명(NMR), 및 저온전자 현미경(cryoelectron microscopy)(크라이오-EM)은 FXa 폴리펩티드의 3차원 구조 및/또는 FXa 폴리펩티드의 다른 성질, 예컨대 Ca2+ 또는 보조인자 결합을 평가하기 위해 수행될 수 있다.
또한, FXa 분해의 존재 및 정도는 표준 기술, 예컨대 소듐 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE) 및 전기영동된 FXa를 함유하는 시료의 웨스턴 블롯팅에 의해 측정될 수 있다. 프로테아제에 노출된 FXa 폴리펩티드는 변형 FXa 폴리펩티드의 절단 부위의 위치 또는 변화를 결정하기 위해 N-말단 시퀀싱으로 처리될 수도 있다.
a. 번역후 변형
FX/FXa 폴리펩티드는 번역후 변형의 존재에 대해 평가할 수 있다. 이러한 검정은 당업계에 공지되어 있고, 예컨대 글리코실화, 히드록실화 및 카복실화를 측정하는 검정을 포함한다. 글리코실화에 대한 예시적 검정에서는 탄수화물 분석이 예컨대 히드라진분해 또는 엔도글리코시다제 처리에 노출된 FX/FXa 폴리펩티드의 SDS PAGE 분석에 의해 수행될 수 있다. 히드라진분해는 무수 히드라진과의 항온처리에 의해 당단백질로부터 N-연결 및 O-연결된 글리칸을 방출시키는 반면, 엔도글리코시다제 해리는 당단백질로부터 대부분의 N-글리칸을 방출시키는 PNGase F를 수반한다. FX/FXa 폴리펩티드의 히드라진분해 또는 엔도글리코시다제 처리는 형광단 또는 발색단 라벨로 태그화될 수 있는 환원성 말단을 생성한다. 표지화된 FX/FXa 폴리펩티드는 형광단 보조의 탄수화물 전기영동(FACE)에 의해 분석될 수 있다. 글리칸을 위한 형광 태그는 또한 단당류 분석, HPLC에 의한 복합 글리코실화 패턴의 핑거프린팅 또는 프로파일링에 사용될 수 있다. 예시적 HPLC 방법으로는 소수성 상호작용 크로마토그래피, 전자 상호작용, 이온교환, 소수성 상호작용 및 크기배제 크로마토그래피를 포함한다. 글리칸 프로브의 예로는, 3-(아세틸아미노)-6-아미노아크리딘(AA-Ac) 및 2-아미노벤조산(2-AA)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 또한, 탄수화물 모이어티는 글리코실화된 FX/FXa 폴리펩티드를 인식하는 특이적 항체의 사용을 통해 검출할 수도 있다.
β-히드록실화를 측정하는 예시적 검정은 알칼리성 가수분해의 대상이 된 FX/FXa 폴리펩티드의 역상 HPLC 분석을 포함한다(Fernlund, P and J. Stenflo (1983) J Biol. Chem. 258(20): 12509-12). FX/FXa 폴리펩티드의 카복실화 및 γ-카복실화는 알칼리성 가수분해 후 양이온 교환 컬럼을 사용하는 HPLC를 사용하여 평가될 수 있고, 변형된 잔기는 에드만(Edman) 분해를 사용하는 아미노-말단 시퀀싱 분석 후에 확인될 수 있다(Camire et al. (2000) Biochemistry. 39(46):14322-14329). 프로펩티드(pro-FX)를 포함하는 FX 폴리펩티드와 번역후 γ-카복실레이트 변형을 담당하는 카복실라제와의 상호작용 또한 평가될 수 있다. 예를 들어, FX 폴리펩티드의 카복실라제에 대한 상대적 친화성은 제Ⅸ 인자 프로펩티드/감마-카복시글루탐산 도메인 기질을 향한 저해 상수(Ki)를 결정함으로써 비교될 수 있다(Stanley, T. B. (1999) J. Biol. Chem. 274:16940-16944).
b. 단백분해 활성(촉매적 활성)
변형 FXa 폴리펩티드는 단백분해 활성으로 시험할 수 있다. FXa의 단백분해 활성은 발색원성 기질, 예컨대 F-3301 (CHsOCO-D-CHA-Gly-Arg-pNA-AcOH; Sigma Aldrich), S-2222 Bz-Ile- Glu(g-OR)-Gly-Arg-pNA-HCl; R=H (50%) 및 R=CH3 (50%); DiaPharma), S-2337 (benzoyl-Ile-Glu-(y-piperidyl)-Gly-Arg-p-nitroaniline; Kabi Diagnostica), CBS 39.31 (Diagnostic Stago Ltd.) 또는 Pefafluor FXa (CH3SO2-D-CHA-Gly-Arg-AMC-AcOH; Pentapharm)과 같은 형광원성 기질을 사용하여 측정될 수 있다. FXa 폴리펩티드는 단독 또는 FVa의 존재 하에 다양한 농도의 발색원성 기질과 배양한다. 기질의 절단은 입수용이한 소프트웨어를 사용하여 선형 회귀 분석으로 측정된 기질 가수분해 속도와 흡광도를 통해 모니터할 수 있다.
인자 Xa 단백분해 활성은 또한 FXa 기질, 예컨대 프로트롬빈 기질의 활성화를 모니터링함으로써 간접적으로 평가될 수 있다. FVa와 전배양을 하거나 또는 FVa와 전배양 없이, 인지질의 존재에서 FXa 폴리펩티드는 정제된 프로트롬빈과 함께 배양될 수 있다(상업적으로 이용가능함). 프로트롬빈의 FXa 폴리펩티드 절단의 결과로 생산된 활성 트롬빈의 양은 그 후, 형광 변화(US 2005/0142032호, 또한 하기 실시예 4 참조)로서 모니터링되는 형광원성 기질, 예컨대 Pefafluor TH (H-D-CHA-Ala-Arg-AMC·2AcOH; Centerchem)에 대한, 또는 흡광 변화에 의해 모니터링되는 발색원성 기질, 예컨대 T3068(β-Ala-Gly-Arg p-nitroanilide diacetate; Sigma Aldrich)에 대한 트롬빈의 활성으로서 측정된다. 인자 Xa 폴리펩티드는 그 후 측정된 트롬빈 활성으로부터 추론될 수 있다.
c. 응고 활성
FX/FXa 폴리펩티드는 당업계에 공지된 검정을 사용하여 응고 활성에 대해 시험할 수 있다. 예를 들어, 일부 검정으로는 2단계 응고 검정(Skogen et al, (1983) J. Biol. Chem. 259(4):2306-2310); 프로트롬빈 시간 분석; PT 시험의 변형인 검정; 활성화된 부분 트롬보플라스틴 검정(aPTT); 활성화된 응고 시간(ACT); 희석 활성화 인자 X-활성화 응고 시간(XACT)(Exner et al. (2000) Blood Coagul Fibrinolysis. 14(8):773-779); 재석회화된 활성화된 응고 시간; 리-화이트(Lee-White) 응고 시간; 또는 트롬보엘라스토그래피(thromboelastography)(TEG); 또는 회전 트롬보엘라스토메트리(ROTEM)을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, 변형 FX/FXa 폴리펩티드의 응고 활성은 FX/FXa가 FX-결핍 혈장으로 희석되고, 프로트롬빈 시간 시약(인지질 및 칼슘과) 혼합되는 PT 기반 검정, 예컨대 Dade Behring으로부터 이용가능한 Innovin™으로 측정할 수 있다. 응괴 형성은 시각적으로 검출할 수 있고, 응괴까지의 시간을 측정하여 FX 결핍 혈장 단독과 비교했다.
d. 다른 단백질들에 대한 결합 및/또는 이들에 의한 저해
저해 검정은 항트롬빈 Ⅲ(AT-Ⅲ)/헤파린 복합체와 같은 FXa 저해제에 대한 변형 FXa 폴리펩티드의 내성을 측정하는데 사용할 수 있다. 다른 저해제들에 대한 저해의 평가도 시험될 수 있고, 그 예로는 다른 세린 프로테아제 저해제, 예컨대 단백질 Z-의존적 프로테아제 저해제(ZPI), 및 FXa-특이적 항체가 있으나, 이에 제한되지 않는다. 저해는 분획되지 않은 헤파린과 FXa 폴리펩티드 및 상업적으로 이용가능한 AT-Ⅲ의 배양에 의해 평가될 수 있다. FXa의 활성은 그 다음 전술한 어느 하나 이상의 활성 또는 응고 검정을 사용하여 측정할 수 있고, AT-Ⅲ 또는 ZPI에 의한 저해는 저해제와 함께 배양된 FXa 폴리펩티드의 활성과 저해제와 함께 배양되지 않은 FXa 폴리펩티드의 활성을 비교하여 평가할 수 있다.
FXa 폴리펩티드는 다른 응고 인자 및 저해제에 대한 결합성에 대해 시험될 수 있다. 예를 들어, FVa와 같은 보조인자, 프로트롬빈과 같은 기질, 항트롬빈 Ⅲ, ZPI 및 헤파린과 같은 저해제와의 FXa 직접 및 간접 상호작용은 당업계에 공지된 임의의 결합 검정, 예컨대 면역침전, 컬럼 정제, 비환원성 SDS-PAGE, BIAcore? 검정을 포함하는, 표면 플라즈몬 공명(SPR), 형광 공명 에너지 전이(FRET), 형광 편광(FP), 등온적정 열계량법(ITC), 원형 광이색성(CD), 단백질 단편 상보 검정(PCA), 핵자기공명(NMR) 분광검정, 광산란, 침강 평형, 소구역 겔 여과 크로마토그래피, 광 지연, 파(Far)-웨스턴 블롯팅, 형광 편광, 히드록시-라디칼 단백질 풋프린팅, 파지 디스플레이, 및 다양한 이중 혼성화 시스템 등으로 평가할 수 있다. 한 예에 따르면, FXa의 인지질-결합된 FVa에 대한 결합 친화성은 방사선표지된 FXa 및 FVa 및 오일 원심분리를 사용하여 결정되었다(Tracy et al., (1981) J Biol. Chem. 256(2): 743-751).
e. 인지질 친화도
포스파티딜세린(PS) 및 다른 인지질에 대한 변형 FX/Fxa 폴리펩티드 결합 및/또는 친화도는 당업계에 공지된 검정을 이용해서 결정할 수 있다(예컨대 Burri et al., (1987) Biochimica et Biophysica Acta. 923(2): 176-186 참조). 유기 용매 중의 고순도 인지질(예컨대, 공지된 농도의 소의 PS 및 난(egg) 포스파티딜콜린(PC), Sigma 등에서 시판되고 있음)은 작은 단층 인지질 소포를 제조하는데 사용될 수 있다. 이러한 PS/PC에 대한 FX/FXa 폴리펩티드 결합은 입사광에 대해 90°에서의 상대적 광산란을 통해 결정될 수 있다. PC/PS 단독과 및 PC/PS/FX 또는 PC/PS/FXa와의 광산란의 강도는 해리 상수를 결정하기 위해 측정될 수 있다(Burri et al., (1987) Biochimica et Biophysica Acta. 923(2): 176-186). BIAcore 바이오센서 기구에서와 같은 표면 플라즈마 공명은 인지질 막에 대한 FX/FXa 폴리펩티드의 친화도를 측정하는데 사용될 수 있다(Erb et al., (2002) Eur. J. Biochem. 269(12):3041-3046).
2. 비-인간 동물 모델
비-인간 동물 모델은 변형 FX/FXa 폴리펩티드의 활성, 효능 및 안전성을 평가하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 비-인간 동물은 질환 또는 상태의 모델로서 사용될 수 있다. 비-인간 동물은 지혈의 효과를 모니터링하기 위해, 예컨대 표 14에 기재된 임의의 FX/FXa 변이체, 그리고 특히 FXa의 지모겐, 또는 이의 촉매적 활성형의 투여 전에, 질환 및/또는 표현형 유도 물질의 주사를 맞을 수 있는데, 예컨대 항응고제 치료제를 과다복용할 수 있다.
유전적 모델도 유용하다. 마우스와 같은 동물은 하나 이상의 유전자의 과잉발현, 과소발현 또는 녹아웃(knock-out)에 의해 질환 또는 상태를 모방하는 동물이 생성될 수 있고, 그 예로는 혈우병 A를 나타내는 인자 Ⅷ 녹아웃 마우스(Bi et al.(1995) Nat Gen 10: 119-121)이다. 인자 Ⅶ 결핍; 인자 Ⅸ 결핍(예컨대 혈우병 B); 인자 X 결핍; 인자 XI 결핍(혈우병 C 모델); 인자 XII 결핍; 및 Ⅰ, Ⅱ, Ⅳ, Ⅴ형 가족성 다중 응고 인자 결핍(familial multiple coagulation factor deficiencies (FMFD))을 포함하는, 다른 응고 인자의 결핍도 FX/FXa를 시험하기 위해 생성될 수 있다(Roberts, HR and MD Bingham, "Other Coagulation Factor Deficiencies" Thrombosis and Hemorrhage, 2nd ed. Baltimore, MD: Williams & Wilkins, 1998: 773-802 참조). 이러한 동물은 당업계에 공지된 형질전환 동물 생산 기술 또는 천연발생 또는 유도된 돌연변이 종을 사용하여 수득할 수 있다. FX/FXa와 관련이 있는 질환의 유용한 비-인간 동물 모델의 예로는, 출혈 질병 모델, 특히 혈우병 또는 혈전증 질환 모델을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상해 또는 외상에 대한 비-인간 동물 모델, 및 후 외상후 혈액희석 응고장애(post trauma hemodilutional coagulopathy) 또는 급성 외상적 응고장애의 동물 모델 또한 FX/FXa 폴리펩티드의 활성, 예컨대 응고 활성을 평가하는데 사용될 수 있다. 이러한 비-인간 동물 모델은 야생형 FX/FXa 폴리펩티드에 비해 FX/FXa 변이체의 활성을 모니터링하는데 사용될 수 있다.
또한, 동물 모델은 변형 FX/FXa 폴리펩티드의 안정성, 반감기 및 제거율을 모니터링하는 데에도 사용될 수 있다. 이러한 검정은 변형 FX/FXa 폴리펩티드를 비교하고, 나아가 비-인간 동물 및 인간 시험을 위한 용량 및 투여 요법을 계산하는데 유용하다. 예를 들어, 변형 FX/FXa 폴리펩티드, 예컨대, 예를 들어, 표 14의 임의에 기재된 임의의 것, 및 특히 지모겐, FXa 또는 이의 촉매적 활성 부분을 포함하는, 본원에서 제공되는 임의의 FX/FXa 변이체는, 마우스의 꼬리 정맥으로 주사를 놓을 수 있다. 그 다음, 주사 후 시점들(예컨대, 분, 시간 및 일 이상)마다 혈액 시료를 채취하고, 혈청 또는 혈장을 포함한(이에 제한되지 않는다) 신체 시료에 존재하는 변형 FX/FXa 폴리펩티드의 수준을 ELSIA 또는 방사선면역측정법 등으로 특정 시점에서 모니터링할 수 있다. FX/FXa 폴리펩티드의 주사 후에 다양한 시점에서의 혈액 시료는 또한 실시예 8에 기술된 것과 같은 다양한 방법에 의해 응고 활성이 시험될 수도 있다. 이러한 유형의 약동학적 연구는 FX/FXa 폴리펩티드의 반감기, 제거율 및 안정성에 관한 정보를 제공하여, 응혈원으로서 투여하기에 적합한 용량을 결정하는데 도움을 줄 수 있다.
변형 FX/FXa 폴리펩티드, 예컨대 표 14에 기재된 임의의 것, 특히 지모겐, FXa 또는 이의 촉매적 활성형은, 혈우병 동물 모델을 사용하여 치료 효과를 시험할 수 있다. 비제한적인 한 예에 따르면, 마우스와 같은 동물 모델이 사용될 수 있다. 혈우병 마우스 모델은 당업계에서 이용할 수 있고, 변형 FX/FXa 폴리펩티드를 시험하는데 이용될 수 있다. 예를 들어, 항-FⅧ 항체 주사에 의해 생산되는 혈우병 A 마우스 모델은 응고 인자 폴리펩티드의 응고 활성을 평가하는데 사용될 수 있고(예컨대 Tranholm et al., Blood (2003) 102: 3615-3620) 혈우병의 유도된 모델에서 변형된 FX/FXa 폴리펩티드의 시험이 고려될 수 있다. 혈우병 A(Bi et al. (1995) Nat Gen 10:119-121) 또는 혈우병 B(Margaritis et al. (2004) J Clin Invest 113: 1025-1031)의 유전적 마우스 모델도 FX/FXa 폴리펩티드를 시험하는데 사용될 수 있다.
출혈 질병의 비마우스 모델도 존재한다. FX/FXa 폴리펩티드 활성은 와파린 유도성 출혈 또는 멜라가트란 유도성 출혈이 있는 랫트(Diness et al.(1992) Thromb Res 67: 233-241, Elg et al.(2001) Thromb Res 101: 145-157) 및 헤파린 유도성 출혈이 있는 토끼(Chan et al.(2003) J Thromb Haemost 1: 760-765)에서 평가될 수 있다. 항응고제 과다복용의 영장류 모델(Gruber et al., (2008) Blood 112: 초록 3825) 또한 변형 FX/FXa 폴리펩티드 활성을 시험하기 위해 사용될 수 있다. 또한, 심한 출혈을 나타내는 근교배 혈우병 A, 혈우병 B 및 폰빌레브란트 질환 개를 변형 FX/FXa 폴리펩티드를 이용한 비-인간 동물 연구에 사용할 수도 있다(Brinkhous et al.(1989) PNAS 86: 1382-1386). 또한, 변형 FX/FXa 폴리펩티드의 활성은 감마 조사 및 혈소판 항체의 사용의 조합에 의해 저혈소판증이 유도된 출혈 토끼 모델에서도 평가될 수 있다(Tranholm et al.(2003) Thromb Res 109: 217-223).
전신 출혈 질병이 있는 동물 외에, 후천적 응고장애의 상해 및 외상 모델도 변형 FX/FXa 폴리펩티드의 활성을 평가하고, 이의 응고 치료제로서의 안전성 및 효능을 평가하는데 사용될 수 있다. 이러한 모델의 비제한적 예로는 토끼 관상동맥협착증 모델(Fatorutto et al.(2004) Can J Anaesth 51: 672-679), 돼지의 V 등급 간 상해 모델(Kopelman et al. (2000) Cryobiology; 40:210-217; Martinowitz et al. (2001) J Trauma; 50:721-729), 돼지 대동맥절개술 모델(Sondeen et al.(2004) Shock; 22: 163-168), 돼지 외상의 급성 응고장애 모델(Harr et al., (2011) J Surg Res; 170(2):319-324); 및 돼지 외상의 후천적 응고장애 모델(Dickneite, G.and I. Pragst, (2009) Br J Anaesth; 1 02(3):345-354)을 포함한다.
3. 임상 검정
FX/FXa의 활성을 임상용으로 평가하는데 사용할 수 있는 검정은 다수가 있다. 이러한 검정으로는, 응고, 단백질 안정성 및 생체내 반감기의 평가, 및 표현형 검정을 포함할 수 있다. 표현형 검정 및 FX/FXa 치료의 치료 효과를 평가하는 검정은 FX/FXa의 혈액 수준의 평가(예컨대, 체질량지수(BMI)에 대해 보정한, 투여전 및 투여 후의 시점들, 예컨대 1차 투여후, 최종 투여 직후 및 시점들 사이 등에서의 혈청 FX/FXa의 측정), FX/FXa 치료 후에 전술한 방법을 이용한 시험관내 혈액 응고 평가(예컨대 PT 검정), 및 비변형 및/또는 야생형 FX/FXa 또는 위약 치료 대상체와 비교하여 경시적으로 증상의 호전을 포함한 FX/FXa 치료에 대한 표현형 반응을 포함한다. FX/FXa 폴리펩티드 치료를 받은 환자는 혈액 소실, 수혈 필요 및 헤모글로빈에 대한 모니터링을 받을 수 있다. 환자는 통상적인 투여 또는 반복 투여의 일정 시간 동안 정기적인 모니터링을 받거나, 출혈, 외상 또는 외과적 과정과 같은 급성 사건에 대하여 투여 후에 모니터링 받을 수 있다.
G. 제형 및 투여
출혈 질병의 치료에 사용되는, 변형 FX 지모겐 및 변형 FXa 폴리펩티드를 포함하는, 변형 FX 폴리펩티드의 조성물이 제공된다. 이러한 조성물은 본원에서 기술된 바와 같이 변형 FX 지모겐 또는 FXa 폴리펩티드의 치료 유효량을 함유한다. FX 폴리펩티드 또는 이의 약학적으로 허용가능한 유도체의 유효 농도는 전신, 국부 또는 국소 투여에 적합한 약학적 담체 또는 비히클과 혼합된다. 화합물은 선택된 질병을 치료하는데 유효한 양으로 함유된다. 조성물에 활성 화합물의 농도는 활성 화합물의 흡수, 불활성화, 배출 속도, 용량 계획 및 투여되는 함량 뿐만 아니라 당업자에게 공지된 기타 인자들에 따라 달라질 것이다.
본원에서 제공되는 화합물의 투여에 적합한 약학적 담체 또는 비히클은 특정 투여 방식에 적합한 것으로 당업자에게 공지된 임의의 담체를 포함한다. 또한, 본원에서 기술되는 FX 폴리펩티드의 치료적 유효량을 포함하는 약학적 조성물은 투여 직전에 멸균수 등에 의해 재구성되는 동결건조 분말로 제공될 수도 있다.
1. 제형
변형 FX 지모겐 및 변형 FXa 폴리펩티드를 포함하는, 변형 FX 폴리펩티드를 함유하는 약학적 조성물은 통상적인 임의의 방식에 따라 폴리펩티드의 선택 양과 하나 이상의 생리학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 혼합하여 제형화할 수 있다. 담체 또는 부형제의 선택은 투여 직업의 기술 범위 안에 있고, 다수의 매개변수에 따라 달라질 수 있다. 그 예에는, 투여 방식(즉, 전신, 경구, 비강, 폐, 국소, 국부 또는 임의의 다른 방식) 및 치료되는 질병을 포함한다.
화합물은 미크론 형태 또는 다른 적당한 형태로 현탁될 수 있고, 또는 더욱 가용성인 활성 산물로 유도체화될 수 있다. 야기되는 혼합물의 형태는 의도된 투여 방식 및 선택된 담체 또는 비히클에 화합물의 가용성 등을 포함한 다수의 요인에 따라 달라진다. 야기되는 혼합물은 용액, 현탁액, 유탁액 및 이러한 기타 혼합물이고, 비수성 또는 수성 혼합물, 크림, 겔, 연고, 유탁액, 용액, 엘릭시르, 로션, 현탁액, 팅크제, 페이스트, 발포제, 에어로졸, 관주제, 스프레이, 좌약, 붕대, 또는 전신, 국부 또는 국소 투여용으로 적당한 임의의 다른 제형으로 제형화될 수 있다. 근육내, 비경구 또는 관절내 투여와 같은 국소 내부 투여 시에는, 폴리펩티드를 등장성 식염수와 같은 수성계 매질에 현탁 용액으로서 제형화하거나, 내부 투여용인 생체화합성 지지체 또는 생체접착제와 조합한다.
일반적으로, 약학적으로 허용되는 조성물은 동물과 인간에 사용하기 위해 공인된 약전에 따라 제조하거나, 또는 규제기구의 승인을 고려하여 제조한다. 약학적 조성물은 동형단백질과 함께 투여되는 희석제, 보강제, 부형제 또는 비히클과 같은 담체를 포함할 수 있다. 이러한 약학적 담체는 멸균 액체, 예컨대 물 및 석유계, 동물, 식물 또는 합성 기원의 오일을 포함한 오일, 예컨대 땅콩유, 대두유, 광유 및 참깨유 등일 수 있다. 물은 약학적 조성물이 정맥내로 투여될 때 전형적인 담체이다. 또한, 식염수 용액 및 수성 덱스트로스 및 글리세롤 용액도 액체 담체로서, 특히 주사 용액용 담체로서 이용될 수 있다. 조성물은 활성 성분과 함께 다음과 같은 성분을 포함할 수 있다: 락토스, 수크로스, 디칼슘 포스페이트 또는 카복시메틸셀룰로스와 같은 희석제; 마그네슘 스테아레이트, 칼슘 스테아레이트 및 탈크와 같은 윤활제; 및 결합제, 예컨대 전분, 천연 검, 예를 들어 아카시아 젤라틴, 글루코스, 당밀, 폴리비닐피롤리딘, 셀룰로스 및 이의 유도체, 포비돈, 크로스포비돈 및 기타 당업자에게 공지된 결합제. 적당한 약학적 부형제로는 전분, 글루코스, 락토스, 수크로스, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 초크, 실리카겔, 소듐 스테아레이트, 글리세롤 모노스테아레이트, 탈크, 염화나트륨, 건조 탈지유, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물 및 에탄올을 포함한다. 희망되는 경우, 조성물은 소량의 함습제 또는 유화제, 또는 pH 완충제, 예컨대 아세테이트, 소듐 시트레이트, 사이클로덱스트린 유도체, 소르비탄 모노라우레이트, 트리에탄올아민 소듐 아세테이트, 트리에탄올아민 올레이트 및 이러한 기타 제제를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 조성물은 용액, 현탁액, 유탁액, 정제, 환제, 캡슐, 분말 형태 및 지속방출 제형일 수 있다. 또한, 치료 화합물과 적당한 분말 기제, 예컨대 락토스 또는 전분의 분말 혼합물을 함유하는, 흡입기 또는 취입기에 사용되는 젤라틴 등의 캡슐 및 카트리지가 제형화될 수 있다. 조성물은 통상의 결합제 및 담체, 예컨대 트리글리세라이트를 이용하여 좌약으로 제형화될 수 있다. 경구 제형은 약학적 등급의 만니톨, 락토스, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 사카린, 셀룰로스, 마그네슘 카보네이트 및 이러한 기타 제제 등의 표준 담체를 포함할 수 있다. 경구 투여용 제제는 또한 프로테아제 저해제, 예컨대 바우만-버크(Bowman-Birk) 저해제, 컨쥬게이션된 바우만-버크 저해제, 아프로티닌 및 카모스태트(camostat)와 함께 제형화되는 것이 적당할 수 있다. 적당한 약학적 담체의 예는 문헌["Remington's Pharmaceutical Sciences" by E.W. Martin]에 기술되어 있다. 이러한 조성물은 일반적으로 정제된 형태인 화합물의 치료적 유효량과 대상체 또는 환자에게 적당한 투여 형태를 제공하기 위한 담체의 적당한 양을 함유할 수 있다.
제형은 투여 방식에 적합해야 한다. 예를 들어, 변형 FX 지모겐 및 변형 FXa 폴리펩티드를 포함하는, 변형 FX를 포함하는 조성물이 주사(예컨대 볼루스 주사 또는 연속적 주입)에 의한 비경구적 투여를 위해 제형화될 수 있다. 주사성 조성물은 유성 또는 수성 비히클 중의 현탁액, 용액 또는 유탁액과 같은 형태일 수 있다. 또한, 멸균 주사성 제제는 1,4-부탄디올 중의 용액과 같은 비독성 비경구적으로 허용되는 희석제 또는 용매 중의 멸균 주사성 용액 또는 현탁액일 수 있다. 멸균된 고정유는 통상적으로 용매 또는 현탁용 매질로서 이용되고 있다. 이러한 목적으로, 임의의 순한(bland) 고정유가 이용될 수 있으며, 그 예로는 합성 모노- 및 디-글리세라이드, 지방산(예컨대, 올레산), 천연발생의 식물유, 예컨대 참깨유, 코코넛유, 땅콩유, 면실유 및 기타 오일, 또는 합성 지방산 비히클, 예컨대 에틸 올레이트 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 완충액, 보존제, 항산화제 및 적당한 성분은 필요하면 첨가될 수 있거나, 또는 제형에 포함될 수 있다.
폴리펩티드는 조성물에 유일한 약학적 활성 성분으로 제형화되거나 또는 다른 활성 성분과 조합될 수 있다. 폴리펩티드는 항체와 같은 표적화제에 컨쥬게이션 등에 의해 전달을 위해 표적화할 수 있다. 리포좀 현탁액, 예컨대 조직 표적화된 리포좀도 약학적으로 허용되는 담체로서 적합할 수 있다. 이는 당업자에게 공지된 방법에 따라 제조할 수 있다. 예를 들어, 리포좀 제형은 미국 특허 4,522,811호에 기술된 바와 같이 제조할 수 있다. 또한, 리포좀 전달은 피브로넥틴으로 변형된 리포좀 및 콜라겐 겔과 같은 약학적 기질을 포함하는 서방형 제형을 포함할 수 있다(예컨대, Weiner et al.(1985) J Pharm Sci. 74(9): 922-5 참조). 본원에서 제공되는 조성물은 추가로 전달을 용이하게 위한 하나 이상의 보강제, 예컨대 불활성 담체, 또는 콜로이드성 분산계(이에 제한되지 않는다)를 포함할 수 있다. 이러한 불활성 담체의 대표적인 비제한적 예는 물, 이소프로필 알코올, 기체성 플루오로카본, 에틸 알코올, 폴리비닐 피롤리돈, 프로필렌글리콜, 겔생산성 물질, 스테아릴 알코올, 스테아르산, 스퍼마세티, 소르비탄 모노올레이트, 메틸셀룰로스 뿐만 아니라 2종 이상의 적당한 조합물 중에서 선택될 수 있다. 활성 화합물은 치료받는 대상체에 바람직하지 않은 부작용을 일으킴이 없이 치료적으로 유용한 효과를 발휘하기에 충분한 양으로 약학적으로 허용되는 담체에 포함된다. 치료적 유효 농도는 본원에 제공된 검정과 같은 공지된 시험관내 및 생체내계에서 화합물을 시험하여 실험적으로 측정할 수 있다.
a. 용량(dosage)
본원에서 제공되는, 변형 FX 지모겐 및 변형 FXa 폴리펩티드를 포함하는, 변형 FX 폴리펩티드를 포함하는 약학적 조성물은 단일(직접) 용량 투여, 다중 용량 투여 또는 희석 또는 기타 변형을 위해 제형화될 수 있다. 제형 내의 화합물의 농도는 투여시, 의도된 치료를 위해 유효한 양의 전달을 위해 유효하다. 전형적으로, 조성물은 단일 용량 투여를 위해 제형화된다. 조성물의 제형화를 위해, 화합물 또는 혼합물의 무게 분획이 치료되는 상태가 완화 또는 호전되는 유효 농도로 선택된 비히클 내에 용해, 현탁, 분산, 또는 그 외 혼합된다.
투여되는 치료제의 정확한 양 또는 용량은 특정 FX 폴리펩티드(예컨대 FX 지모겐 또는 FXa 및/또는 특정 변형), 투여의 경로, 및 기타 고려사항, 예컨대 질환의 중증도 및 대상체의 무게 및 일반적 상태에 의존한다. 치료제의 국소적 농도가, 일부 경우에, 전신적 투여시 안전성을 달성할 수 있는 것보다 국소적 투여 후에 더 높음에도 불구하고, 치료제의 국소적 투여는 전형적으로 전신적 투여의 임의의 방식보다 더 적은 용량을 요구할 것이다.
필요한 경우, 특정 용량 및 지속기간 및 치료 프로토콜이 경험적으로 결정되거나 외삽될 수 있다. 예를 들어, 재조합 및 천연 FX 폴리펩티드의 예시적 용량은 적절한 용량을 결정하기 위한 출발점으로서 사용될 수 있다. 일반적으로, 본원에서 제공되는 변형 FX 폴리펩티드는 재조합 야생형 FX 폴리펩티드와 비교하여 감소된 용량 양 및/또는 빈도에서 유효할 수 있다. 치료의 지속기간 및 주사 간의 간격은 출혈의 중증도 및 치료에 대한 환자의 반응에 따라 다양할 것이며, 이에 따라 조정될 수 있다. 비변형 FX와 비교할 때 변형 FX의 활성의 수준 및 반감기와 같은 인자가 용량 결정을 하는 데 고려될 수 있다. 특정 용량 및 요법이 경험적으로 결정될 수 있다. 예를 들어, 비변형 FX 폴리펩티드보다 더 긴 반감기를 나타내는 변형 FX 폴리펩티드는 비변형 FX 폴리펩티드보다 더 낮은 용량으로 및/또는 더 적은 빈도로 투여될 수 있다. 유사하게, 비변형 FX 폴리펩티드와 비교하여 증가된 응고 활성을 나타내는 변형 FX 폴리펩티드를 사용하는 치료적 효과를 위해 요구되는 용량은 빈도 및 양에 있어서 감소될 수 있다. 특정 용량 및 요법은 당업자에 의해 경험적으로 결정될 수 있다.
FX 지모겐 또는 FXa를 포함하는, 변형 FX 폴리펩티드의 용량 양은 FX 폴리펩티드 형의 정상 양의 약 10% 내지 약 400%, 50% 내지 100% 또는 100% 내지 250%으로 폴리펩티드의 혈액 수준을 상승시키는 양일 수 있다. 용량 수준을 모니터링 또는 조정하기 위해 투여된 FX 폴리펩티드에 대한 혈장 또는 혈액 수준을 모니터링하는 것은 당업자의 수준 내이다.
조성물은 약 50 유닛/mL 내지 1000 유닛/mL, 예컨대 50 유닛/mL 내지 500 유닛/mL, 100 유닛/mL 내지 600 유닛/mL 또는 400 유닛/mL 내지 1000 유닛/mL인 양으로 FX 폴리펩티드와 제형화될 수 있다. 조성물의 부피는 0.5 mL 내지 100 mL, 예컨대 0.5 mL 내지 5 mL, 1 mL 내지 10 mL, 5 mL 내지 50 mL 또는 30 mL 내지 60 mL일 수 있다.
예를 들어, 본원에서 제공되는 변형 FX 폴리펩티드는 0.01 내지 1,000 mg, 예컨대 0.05 내지 500 mg, 예를 들어 1 mg 내지 500 mg의 용량으로 환자에 대한 투여를 위해 제형화될 수 있다. 약물의 유효한 양은 하루에 체중의 0.0002 mg/kg 내지 약 20 mg/kg, 예컨대 하루에 체중의 약 0.001 mg/kg 내지 7 mg/kg, 예를 들어, 0.01 mg/kg 내지 1 mg/kg, 0.05 mg/kg 내지 0.5 mg/kg, 0.01 mg/kg 내지 0.250 mg/kg, 0.01 mg/kg 내지 0.075 mg/kg 또는 적어도 약 0.04 mg/kg인 용량 수준으로 일반적으로 공급된다. 일반적으로, 용량은, 적어도 충분한 개선이 관찰되기 전까지는, 적어도 1일 1회이다. 용량은 수 분(예컨대 1 내지 10분 또는 2 내지 5분)에 걸쳐 볼루스 주입에 의해 달성될 수 있다. 또는, 환자는 매 1 내지 3 시간마다 볼루스 주입을 받을 수 있고, 또는 충분한 개선이 관찰된다면, 1일 1회 폴리펩티드의 주입이 수행될 수 있다. 따라서, 일부 예에서, 투여는 매 시간, 매일, 매주 또는 매월 반복될 수 있다. 예를 들어, 출혈 에피소드를 경험하는 환자, 예컨대 응고 인자 결핍 또는 기타 관련된 외상을 가진 환자의 치료를 위해, 지혈이 달성될 때까지, 용량은 매 1-24시간, 예컨대 매 2-12시간 또는 4-6시간마다 반복될 수 있다.
b. 투여형태(dosage form)
약학적 치료 활성 화합물 및 이의 유도체는 전형적으로 단위 투여형태 또는 다중 투여형태로 제형화되고 투여된다. 제형은 인간과 동물에게 투여형태로 투여하기 위해 준비될 수 있으며, 그 예로는 화합물이나 이의 약학적으로 허용되는 유도체를 적당한 함량으로 함유하는 정제, 캡슐, 환제, 분말, 과립, 멸균 비경구 용액 또는 현탁액, 경구 용액 또는 현탁액 및 수중유 유탁액이 포함되나, 이에 제한되지 않는다. 각 단위 용량은 필요한 약학적 담체, 비히클 또는 희석제와 함께 희망되는 치료 효과를 나타내기에 충분한 미리 결정된 함량의 치료적 활성 화합물을 함유한다. 단위 용량 형태의 예로는 앰플 및 주사기, 개별 포장된 정제 또는 캡슐을 포함한다. 일부 예에서, 단위 용량은 투여전에 재구성되는 동결건조 분말로 제공된다. 예를 들어, FX 폴리펩티드는 주사를 위한 단일 용량 용액으로 제조하기 위해 적당한 용액에 의해 재구성되는 동결건조 분말로서 제공될 수 있다. 일부 구현예에 따르면, 동결건조된 분말은 FX 폴리펩티드와 추가 성분, 예컨대 염을 함유할 수 있으며, 이에 따라 멸균 증류수로 재구성 시에 완충 용액 또는 식염수 용액 중의 FX 폴리펩티드를 야기된다. 단위 용량 형태는 분획 또는 이의 다중 형태로 투여될 수 있다. 다중 용량 형태는 분리된 단위 용량 형태로 투여할 단일 용기 내에 포장된 복수의 동일한 단위 투여형태이다. 다중 용량 형태의 예로는 바이알, 정제 또는 캡슐의 병 또는 파인트 또는 갤론 병이 포함된다. 따라서, 다중 용량 형태는 포장으로 분리되어 있지 않은 다중 단위 용량이다.
2. 변형 FX 폴리펩티드의 투여
본원에서 제공되는, FX 지모겐 또는 FXa 폴리펩티드를 포함하는, 변형 FX 폴리펩티드(즉, 활성 화합물)는 체액 또는 다른 조직 시료과 같은 혼합물을 변형 FX 폴리펩티드와 접촉시켜 시험관내, 생체외 또는 생체내에서 투여될 수 있다. 예를 들어, 생체외로 화합물을 투여할 때, 대상체 유래의 체액 또는 조직 시료는 튜브 또는 필터, 예컨대 우회 기구 중의 튜브 또는 필터에 코팅된 FX 폴리펩티드와 접촉될 수 있다. 생체내 투여될 때, 활성 화합물은 액체, 반액체 또는 고체 형태로 임의의 적당한 경로, 예컨대 경구, 비강, 폐, 비경구, 정맥내, 피내, 피하, 관절내, 두개골내, 안내, 뇌실내, 경막내, 근육내, 복강내, 기관내 또는 국부로 투여할 수 있을 뿐만 아니라 임의의 2종 이상의 조합물로 투여될 수 있고, 각 투여 경로에 적합한 방식으로 제형화된다. 변형 FX 폴리펩티드는 1회 또는 1회 이상, 예컨대 2회, 3회, 4회 또는 치료 효과를 달성하는데 요구되는 임의의 횟수로 투여될 수 있다. 다중 투여는 임의의 경로 또는 경로의 조합을 통해 실시할 수 있고, 매시간마다(예컨대, 매 2시간마다, 매 3시간마다, 매 4시간마다 또는 그 이상마다), 매일, 매주 또는 매월 투여될 수 있다.
가장 적합한 투여 경로는 치료받는 질환 상태, 예컨대 출혈 질병의 위치에 따라 달라질 것이다. 일반적으로, FX 폴리펩티드는 정맥내 볼루스 주사에 의해 투여될 것이다. 투여(주입) 시간은 수 분, 예컨대 대략 1 내지 10 분 또는 2 내지 5분에 걸친 것일 수 있다. 다른 예에 따르면, 희망되는 FX의 혈액 수준은 혈장 수준에 의해 확인되는 바와 같이 활성 제제의 연속적 주입에 의해 유지될 수 있다. 물론, 주치의는 독성이나 골수, 간, 신장 기능이상 등으로 인해 치료를 종결하거나, 중단하거나 또는 낮은 용량으로 조정하는 방법과 시기를 알고 있을 것이다. 이와 반대로, 주치의는 임상 반응이 적당하지 않다면(독성 부작용은 배제), 치료 수준을 높이는 방법 및 시기도 알고 있을 것이다.
다른 예로서, 출혈 질병의 위치는 FX 제형이 대체 경로를 통해 투여되고 있음을 시사할 수도 있다. 예를 들어, 국소 투여, 예컨대 뇌 내로의 투여(예컨대, 뇌실내)는 뇌에 출혈이 있는 환자에게 수행될 수 있다. 유사하게, 관절에 출혈이 있을 때의 치료는 치료제를 관절 내로 주사하는 국소 투여(즉, 관절내, 정맥내 또는 피하 방식)가 이용될 수 있다. 다른 예에 따르면, 치료제의 피부로의 국부 투여, 예컨대 크림, 겔 또는 연고로 제형화된 경우의 투여, 또는 흡입에 의한 폐로의 투여 또는 기관내(intratracheal)로의 투여는 출혈이 이 부위에 제한적일 때 적당할 것이다.
변형 FX 폴리펩티드가 데포(depot) 제제로 제형화되어야 하는 경우, 지속성 제형이 이식에 의해(예컨대, 피하 또는 근육내) 또는 근육내 주사에 의해 투여될 수 있다. 따라서, 예컨대 치료 화합물은 적합한 폴리머 물질 또는 소수성 물질(예컨대, 허용되는 오일 중의 유탁액으로서) 또는 이온교환수지로 제형화되거나, 또는 난용성 유도체, 예컨대 난용성 염으로서 제형화될 수 있다.
희망되는 경우, 조성물은 활성 성분을 함유하는 하나 이상의 단위 투여형태를 포함할 수 있는 포장(package), 키트 또는 디스펜서 기구에 제공될 수 있다. 예를 들어, 포장은 금속 또는 플라스틱 호일, 예컨대 블리스터 팩을 함유한다. 팩 또는 디스펜서 기구는 투여 지침서를 동반할 수 있다. 활성 제제를 함유하는 조성물은 포장재, 본원에서 제공되는 제제 및 이 제제가 제공되는 질병을 나타내는 라벨을 포함하는 제조품으로 포장될 수 있다.
3. 변형 FX 폴리펩티드를 암호화하는 핵산의 투여(유전자 치료)
또한, 본 발명은 유전자 치료에 적합한 변형 FX 폴리펩티드를 암호화하는 발현 벡터 및 변형 FX 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자의 조성물을 제공한다. 단백질 전달 대신에, 핵산은 생체내로, 예컨대 전신 또는 다른 경로로, 또는 생체외로, 예컨대 림프구를 포함한 세포의 제거, 여기에 핵산의 도입 및 숙주 또는 양립가능한 수여체로의 재도입 등에 의해 투여될 수 있다.
변형 FX 폴리펩티드는 핵산 분자의 발현에 의해 세포 및 조직으로 전달될 수 있다. 변형 FX 폴리펩티드는 생체외 기술 및 직접 생체내 발현을 포함해서, 변형 FX 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자로 투여될 수 있다. 핵산은 당업자에게 공지된 임의의 방법에 의해 세포 및 조직으로 전달될 수 있다. 단리된 핵산 서열은 추가 조작을 위해 벡터에 통합시킬 수 있다. 본원에 사용된, 벡터(또는 플라스미드)는 이의 발현 또는 복제를 위해 이종성 DNA를 세포내로 도입시키는데 사용되는 별개의 구성요소를 의미한다. 이러한 비히클의 선택 및 사용은 당업자의 기술범위 내에 포함된다.
암호화 핵산 분자의 발현에 의한 변형 FX 폴리펩티드의 투여 방법은 재조합 벡터의 투여를 포함한다. 이 벡터는 복제 기점의 부가 등에 의한 에피솜성을 유지하도록 설계되거나, 또는 세포의 염색체 내로 통합되도록 설계될 수 있다. 또한, 변형 FX 폴리펩티드는 비바이러스성 벡터를 이용하는 생체외 유전자 발현 요법에 사용될 수 있다. 예를 들어, 세포는 변형 FX 폴리펩티드를 발현하도록 조작될 수 있으며, 예컨대 이는 변형 FX 폴리펩티드 암호화 핵산을 조절 서열에 작동가능하게 연결시켜 게놈 위치에 통합시키거나 또는 상기 핵산을 게놈 위치의 조절 서열에 작동가능하게 연결되도록 통합시켜 실시할 수 있다. 이러한 세포는 그 다음 치료를 요하는 환자와 같은 대상체에게 국소 투여되거나 또는 전신 투여될 수 있다.
바이러스 벡터는 예컨대 아데노바이러스, 아데노관련 바이러스(AAV), 폭스바이러스, 헤르페스 바이러스, 레트로바이러스 및 유전자 치료에 이용할 수 있도록 설계된 기타 형태를 포함한다. 벡터는 에피솜 형태를 유지할 수 있거나, 또는 치료받는 대상체의 염색체 내로 통합될 수 있다. 변형 FX 폴리펩티드는 치료를 요하는 대상체에게 투여되는 바이러스에 의해 발현될 수 있다. 유전자 치료에 적합한 바이러스 벡터로는 아데노바이러스, 아데노관련 바이러스(AAV), 레트로바이러스, 렌티바이러스, 백시니아 바이러스 및 앞에서 언급한 기타 바이러스를 포함한다. 예를 들어, 아데노바이러스 발현 기술은 당업계에 공지되어 있고, 아데노바이러스 생산 및 투여 방법도 잘 알려져 있다. 아데노바이러스 혈청형은 아메리칸 타입 컬처 컬렉션(ATCC, Rockville, MD) 등에서 입수용이하다. 아데노바이러스는 생체외에서 사용될 수 있고, 예를 들어, 세포는 치료를 요하는 환자로부터 단리해서, 변형 FX 폴리펩티드를 발현하는 아데노바이러스 벡터로 형질도입시킨다. 형질도입된 세포는 적당한 배양 기간 후에 대상체에게 국소적으로 및/또는 전신으로 투여한다. 또는, 변형 FX 폴리펩티드 발현성 아데노바이러스 입자는 단리하여, 대상체의 질환 또는 상태를 예방, 치료 또는 호전시키기에 치료적으로 유효한 양으로 전달하기 위해 약학적으로 허용되는 담체 중에 제형화한다. 전형적으로, 아데노바이러스 입자는 대상체 체중 1kg당 입자 1 내지 1014개 범위, 일반적으로 대상체 체중 1kg당 입자 106 또는 108개 내지 1012개의 범위의 용량으로 전달한다.
일부 상황에서는, 핵산 급원에 세포를 표적화하는 제제, 예컨대 세포 표면 막 단백질 또는 표적 세포에 특이적인 항체, 또는 표적 세포 상의 수용체에 대한 리간드를 제공하는 것이 바람직할 수 있다. 또한, FX는 특정 세포 유형으로 전달되도록 표적화될 수 있다. 예를 들어, FX 폴리펩티드를 암호화하는 아데노바이러스 벡터는 간세포와 같이 비분열성 세포에서 안정한 발현용으로 사용될 수 있다(Margaritis et al.(2004) J Clin Invest 113: 1025-1031). 다른 예에 따르면, FX 폴리펩티드를 암호화하는 바이러스성 또는 비바이러스성 벡터는 후속 전달을 위해 단리된 세포 내로 형질도입될 수 있다. FX의 발현 및 전달을 위한 추가의 세포 유형으로는 섬유아세포 및 내피 세포를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
핵산 분자는 인공 염색체 및 다른 비바이러스성 벡터 내로 도입될 수 있다. 인공 염색체, 예컨대 ACES(Lindenbaum et al.(2004) Nucleic Acids Res. 32(21):e172 참조)는 동형단백질을 암호화하여 발현하도록 조작될 수 있다. 간략히 설명하면, 포유류 인공 염색체(MAC)는 유전적 정보의 대형 페이로드(payload)를 세포 내로 자율 복제성, 비통합 형식으로 도입시키는 수단을 제공한다. MAC 중에서 독특한, 포유류 위성 DNA 기반의 인공 염색체 발현(ACE)은 여러 종의 세포주에서 재현가능하게 새로 제조될 수 있고, 숙주 세포의 염색체로부터 용이하게 정제될 수 있다. 정제된 포유류 ACE는 그 다음 다양한 수용체 세포주로 재도입될 수 있고, 여기서 ACE계를 사용한 선택 압력의 부재 하에 장기간 동안 안정하게 유지되었다. 이러한 시도를 사용하여, 하나 또는 두개의 유전자 표적의 특이적인 부하가 LMTK(-) 및 CHO 세포에서 달성되었다.
변형 FX 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 도입시키는 또 다른 방법은 효모 인공 염색체(YAC) 내에 클로닝된 완전 아데노바이러스 게놈(Ad2; Ketner et al.(1994) PNAS 91: 6186-6190) 및 YAC 클론 내의 특정 영역을 표적화하는 아데노바이러스 서열, 상기 유전자를 위한 발현 카세트 및 양성 및 음성 선별 마커를 함유하는 플라스미드를 출발 물질로 사용하는 효모의 2단계 유전자 교체 기술이다. YAC는 큰 유전자의 통합을 허용하기 때문에 특히 유익하다. 이러한 시도는 포유류 세포 또는 전체 동물로 유전자 전이를 하기 위해 기술된 변형 FX 폴리펩티드 중 임의의 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 보유하는 아데노바이러스 기반 벡터를 작제하는데 사용될 수 있다.
핵산은 세균 세포, 특히 약독화된 세균과 같은 세포로 도입되거나 또는 바이러스 벡터로 도입되거나, 또는 리포좀과 같은 비히클에 캡슐화될 수 있다. 예를 들어, 리포좀이 이용될 때에는, 엔도사이토시스(endocytosis)와 관련된 세포 표면 막 단백질에 결합하는 단백질이 표적화 및/또는 흡수를 용이하게 하는데 사용될 수 있고, 그 예로는 특정 세포 유형에 지향성인 캡시드 단백질 또는 이의 단편, 사이클링에서 내재화를 일으키는 단백질에 대한 항체, 및 세포내 국재화를 표적화하고 세포내 반감기를 향상시키는 단백질이 있다.
생체외 및 생체내 방법에 대해, 변형 FX 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자는 적당한 공여체 또는 치료받는 대상체 유래인 세포 내로 도입된다. 치료 목적으로 핵산이 도입될 수 있는 세포로는, 예컨대 치료될 질환 또는 상태에 적당한 임의의 희망되는 입수용이한 세포 유형을 포함하며, 그 예로는 상피 세포, 내피 세포, 각질세포, 섬유아세포, 근육 세포, 간세포; 혈액 세포, 예컨대 T 림프구, B 림프구, 단핵구, 대식세포, 호중구, 호산구, 거대핵세포, 과립세포; 다양한 줄기 또는 선조 세포, 특히 조혈 줄기 또는 선조 세포, 예컨대 골수, 제대혈, 말초혈액, 태아 간 및 기타 급원에서 수득된 줄기 세포를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
생체외 치료 시, 치료받는 대상체와 양립가능한 공여체 유래의 세포 또는 세포를 치료해야 하는 대상체 유래의 세포를 제거하고, 이와 같이 단리된 세포에 핵산을 도입시킨 뒤, 변형된 세포를 대상체에 투여한다. 치료는 직접 투여, 예컨대 다공성 막에 캡슐화하여 환자에게 이식하는 투여(예컨대, 미국 특허 4,892,538호 및 5,283,187호 참조, 각각 전문이 참고인용됨)를 포함한다. 핵산을 시험관내에서 포유류 세포 내로 전이시키기에 적합한 기술에는 리포좀 및 양이온성 지질(예, DOTMA, DOPE 및 DC-Chol) 전기천공, 미량주사, 세포 융합, DEAE-덱스트란 및 인산칼슘 침전법의 사용을 포함한다. DNA 전달 방법은 생체내에서 변형 FX 폴리펩티드를 발현시키기 위해 사용될 수 있다. 이러한 방법은 핵산의 리포좀 전달 및 나출형 DNA 전달, 예컨대 전기천공, 초음파 및 인산칼슘 전달 등과 같은 국소 및 전신 전달을 포함한다. 다른 기술로는 미량주사, 세포융합, 염색체 매개의 유전자 전이, 마이크로셀 매개의 유전자 전이 및 스페로플라스트 융합을 포함한다.
변형 FX 폴리펩티드의 생체내 발현은 추가 분자를 발현시키기 위해 연결될 수 있다. 예를 들어, 변형 FX 폴리펩티드의 발현은 조작된 바이러스에서와 같은 세포독성 산물의 발현과 연결될 수 있고, 또는 세포독성 바이러스에서 발현될 수 있다. 이러한 바이러스는 치료 효과의 표적인 특정 세포 유형에 대해 표적화될 수 있다. 발현된 변형 FX 폴리펩티드는 바이러스의 세포독성을 향상시키기 위해 사용될 수 있다.
변형 FX 폴리펩티드의 생체내 발현은 세포 특이적 또는 조직 특이적 프로모터와 같은 특정 조절 서열에 변형 FX 폴리펩티드 암호화 핵산 분자를 작동가능하게 결합시키는 것을 포함할 수 있다. 또한, 변형 FX 폴리펩티드는 표적 세포 유형 및/또는 조직에서 특이적으로 감염 및/또는 복제되는 벡터로부터 발현될 수도 있다. 변형 FX 폴리펩티드 발현을 선택적으로 조절하기 위해 유도성 프로모터를 사용할 수 있다. 조절성 발현계의 예는 독시사이클린-유도성 유전자 발현계로서, 재조합 FX 발현을 조절하는데 사용된 바 있다(Srour et al.(2003) Thromb Haemost. 90(3): 398-405).
나출형 핵산으로서 또는 벡터, 인공 염색체, 리포좀 및 다른 비히클 중의 핵산 분자는 전신 투여, 국부 투여, 국소 투여 및 다른 투여 경로에 의해 대상체에게 투여될 수 있다. 전신 및 생체내 투여 시에, 핵산 분자 또는 핵산 분자를 함유하는 비히클은 세포에 대해 표적화될 수 있다.
또한, 투여는 일반적으로 세포 또는 조직을 표적으로 하는 세포 또는 벡터의 투여 등에 의해 직접적일 수 있다. 예를 들어, 종양 세포 및 증식성 세포는 변형 FX 폴리펩티드의 생체내 발현을 위해 표적화된 세포일 수 있다. 또한, 변형 FX 폴리펩티드의 생체내 발현에 사용되는 세포는 환자 자신의 세포를 포함한다. 이러한 세포는 환자로부터 단리한 후, 변형 FX 폴리펩티드의 발현을 위한 핵산을 도입시키고, 그 다음 주사 또는 접목 등으로 환자에게 투여한다.
H. 치료적 용도
본원에서 제공되는 변형 FX/FXa 폴리펩티드는 FX 지모겐 또는 FXa가 사용되는 진단적 방법 뿐 아니라 다양한 치료적 방법에서도 사용될 수 있다. 이러한 방법은 하기 기술되고 열거되는 생리학적 및 의학적 상태의 치료의 방법을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 전형적으로, 이러한 치료는 응고의 증가, 예컨대 지혈 반응의 증가가 희망되는 경우를 포함한다. 예를 들어, 본원에서 제공되는 변형 폴리펩티드는, 예를 들어 혈우병 환자에서 발생하는, 출혈 질병의 치료에서 사용될 수 있다. 변형 FX/FXa 폴리펩티드는 응고 경로에서 그것의 중심적 역할에 의해, 결핍된 인자의 요구를 우회하기 때문에, 특히 혈우병 A(인자 Ⅷ 결핍), 혈우병 B(인자 Ⅸ 결핍) 또는 혈우병 C(인자 XI 결핍)을 포함하나 이에 제한되지 않는 응고 인자 결핍 환자를 치료하는데 특히 적합하다. 본원에서 제공되는 변형 폴리펩티드는 외과수술 또는 기타 외상과 함께 사용될 수 있다.
본원의 방법에서, 본원에서 제공되는 변형 FX 폴리펩티드의 임의의 FX 지모겐 또는 FXa 형 또는 이의 촉매적 활성 단편은 대상체에 투여될 수 있다. 본원에서 제공되는 변형 폴리펩티드는 치료 활성을 유지하지만 변형된 성질, 특히 증가된 보조인자 의존성, 증가된 촉매적 활성, 증가된 기질 친화성, 변경된 글리코실화 및/또는 증가된 AT-Ⅲ에 대한 내성을 나타내도록 설계된다. 이와 같은 변형된 성질은 예컨대 보조인자의 존재에 제한되는 변형 FX/FXa 폴리펩티드의 응고 활성 증가로 인해 폴리펩티드의 치료 효과를 향상시킬 수 있다. 변경된 성질은 증가된 반감기를 야기할 수 있다. 본원에서 제공되는 변경된 FX/FXa 폴리펩티드는 동일한 효과를 달성하는 용량 저하를 포함하여, 야생형 FX/FXa와 비교하여 생체내 활성 및 치료 효과의 향상, 및 투여 빈도의 감소, 부작용 감소 및 치료 효과의 증가와 같은 기타 투여 및 치료의 개선을 나타낼 수 있다.
예를 들어, 실질적 제한은 비변형 FXa 폴리펩티드를 포함하는 FXa 폴리펩티드의 혈액 질병의 치료를 위한 우회적 전략으로서의 임상적 사용을 제한해 왔다. 예를 들어, 순환 비변형 FXa는 20-40 시간의 생물학적 FX 반감기(Roberts et al., (1965) Thromb Diath Haemorrh. 13:305-313)를 1-2분 미만(Gitel et al., (1984) J Biol Chem. 259:6890-6895)으로 감소시키는, 내인성, 순환 프로테아제 저해제에 의해 급속하게 불활성화된다. 또한, 응고제의 병리적 활성화는 FXa 폴리펩티드 단독 또는 약학적 조성물 내의 투여와 관련된 우려이다 (Gitel et al., (1984) J Biol Chem. 259:6890-6895; Lechler (1999) Thromb Res. 95(Suppl. 1):S39-S50). 이는 FXa 폴리펩티드의 투여가 파종성 혈관내 응고(DIC)의 동물 모델을 생성하는데 사용될 수 있다는 사실에 의해 증명된다(Kruithof et al., (1997) Thrombosis and Haemostasis. 77(2):308-311; Giles et al., (1984) J Clin Invest. 74:2219-2225).
본원에서 기술되는 변형 FX 폴리펩티드는 FXa 폴리펩티드의 임상적 사용의 제한을 다루기 위해 변형되었다. FX 폴리펩티드의 투여시 과도한 응고를 방지하기 위해, 본원에서 기술되는 변형 FX 폴리펩티드는 FXa 폴리펩티드가 보조인자 FVa가 존재하지 않는 한 최소 내지 무활성을 나타내도록 변형 FXa 폴리펩티드를 제한하도록 FXa 형의 증가된 보조인자 의존성(실시예 4 참조)을 나타내도록 변형된다. FVa 이용가능성 및 연합에 기초한, 변형 FXa 폴리펩티드 활성의 제한은, 비변형 FXa 폴리펩티드 치료와 관련된 혈전증(thrombosis) 위험을 감소 또는 제거한다. 중요하게, 그러나, FVa의 존재에서, 본원에서 기술되는 변형 FXa 폴리펩티드는 정상, 그리고 일부 사례에서 정상 초과의, 촉매적 활성을 보여준다. 변형 FXa 폴리펩티드를 포함하여, 변형 FX 폴리펩티드는, 본원에서 기술되는 변형 FXa 폴리펩티드의 증가된 보조인자 의존성이 원치않는 응고를 감소 또는 제거하는 동시에, 본원에서 개선된 약동학적 및 약력학적 성질, 예컨대 비변형 FXa 폴리펩티드와 비교하여 증가된 혈청 반감기, 증가된 저해제에 대한 내성, 증가된 촉매적 활성, 및/또는 증가된 응고 활성을 나타낸다.
일부 예에서, FX 지모겐 또는 FXa 형을 포함하는, FX 폴리펩티드의 치료 방법은, 지속되는 치료적 효과를 달성하기 위한 작용의 더 긴 지속 시간을 요구한다. 이는 혈우병 환자 및 기타 선천적 또는 만성 출혈 질병의 치료에서 특히 진실이다. 본원의 다른 부분에서 논의되는 바와 같이, FXa의 반감기는 부분적으로는 AT-Ⅲ와 같은 저해제에 의한 저해로 인해, 40시간 미만이다. AT-Ⅲ 내성을 나타내는 및/또는 비-천연 글리코실화 부위의 도입에 의해 과글리코실화된 본원에서 제공되는 변형 FX 폴리펩티드는 증가된 반감기를 나타낼 수 있다. 따라서, 본원에서 기술되는 이러한 변형 FX 폴리펩티드는 응고 질병에 대해 더 긴 지속되는 치료를 전달하는 데 사용될 수 있다.
특히, 변형 FX/FXa 폴리펩티드는 FX/FXa가 치료를 위해 사용될 수 있는 치료적 방법에서 사용을 위해 의도된다. 전형적으로, 본원에서 제공되는 변형 FX 폴리펩티드는 응혈원이고 선천적 출혈 질병 및 후천적 출혈 질병을 포함하는 출혈 질병을 치료하는 데 사용될 수 있다. 예시적인 질환 및 질병은, 혈액 응고 질병, 혈액학적 질병, 출혈 질병, 혈우병, 응고 인자 결핍, 및 외상 및 외과수술과 관련된 출혈을 포함하는 후천적 출혈 질병을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 일부 예에서, FX/FXa 폴리펩티드에 의해 치료될 출혈은 뇌, 내이 영역, 눈, 간, 폐, 종양 조직, 위장관과 같은 기관에서 일어난다. 다른 구현예에서, 출혈은 출혈성 위염과 같이 미만성이고, 산후 여성에서와 같이 과다 자궁 출혈이다.
혈우병 A 및 B와 같은 출혈 질병이 있는 환자는 종종 수술이나 외상 중에 출혈 합병증의 위험이 있다. 이러한 출혈은 급성 혈관절증(관절의 출혈), 만성 혈우병 관절병증, 혈종(예, 근육, 복막뒤, 설하 및 인두뒤), 혈뇨(신장관 유래의 출혈), 중추신경계 출혈, 위장 출혈(예, UGI 출혈) 및 뇌출혈로 확인될 수 있고, 이 역시 변형 FX/FXa 폴리펩티드에 의해 치료될 수 있다. 또한, 외과수술(예, 간절제술) 또는 발치와 관련된 모든 출혈은 변형 FX/FXa 폴리펩티드에 의해 치료될 수 있다.
변형 FX/FXa 폴리펩티드에 의한 질환 및 상태의 치료는 본원에 기술된 적당한 제형을 이용한 임의의 적당한 투여 경로에 의해 달성될 수 있고, 그 예로는 주사, 폐, 구강 및 경피 투여를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 치료는 전형적으로 정맥내 볼루스 투여로 실시된다.
필요하다면, 특정 용량 및 기간과 치료 프로토콜은 실험적으로 측정되거나 외삽될 수 있다. 야생형 또는 비변형 FX 지모겐 또는 FXa 폴리펩티드의 용량은 변형 FX 지모겐 또는 FXa 폴리펩티드의 용량을 결정하기 위한 지침으로서 사용될 수 있다. 변형 FX 지모겐 또는 FXa 폴리펩티드에 대한 용량 또한 관련된 동물 연구로부터 결정 또는 외삽될 수 있다. 비변형 FX/FXa와 비교할 때 변형 FX/FXa의 활성의 수준 및 반감기는 이러한 결정을 할 때 사용될 수 있다. 특정 용량 및 요법은 다양한 인자에 기초하여 경험적으로 결정될 수 있다. 이러한 인자들은 개인의 체중, 일반적 건강, 연령, 이용된 특정 화합물의 활성, 성별, 식이, 투여 시간, 배출속도, 약물 조합, 질환의 중증도 및 경과, 및 질환에 대한 환자의 소인과 주치의의 판단을 포함한다. 활성 성분인 폴리펩티드는 전형적으로 약학적 유효 담체와 조합된다. 단일 투여형태 또는 다중 투여형태로 담체 물질과 조합될 수 있는 활성 성분의 양은 치료받는 숙주 및 특정 투여 방식에 따라 달라질 수 있다.
일부 예에서, 변형 FX 폴리펩티드의 불활성 지모겐 형은 병리학적 출혈을 통제하기 위해 투여될 수 있다. 예를 들어, FX 폴리펩티드는 50 내지 800 유닛/ml의 용량으로 투여될 수 있는데, 여기에서 FX 지모겐의 특이적 활성은 약 20 내지 130 유닛/mg 단백질(US 4,501,731호)이다. 변형 FX 폴리펩티드의 지모겐 형이 투여되는 사례에서, 내인성 테나제 복합체는 투여된 FX 지모겐을 절단하여, 활성 FX(FXa)를 생성하고, 이는 치료적 활성을 부여한다.
일부 예에서, 본원에서 기술되는 변형 FX 폴리펩티드는 활성 FX 형(FXa)에서 병리학적 출혈을 통제하기 위해 투여될 수 있다. 예를 들어, 정제된 FX 폴리펩티드는 러셀 살모사 독 FX 활성화제(Haematologic Technologies) 또는 기타 응고 인자에 의해, 투여 전 시험관내에서, 예컨대 실시예 2B에 기술된 정제 동안에, 활성화될 수 있다. 지모겐-유사 활성을 나타내도록 변형된, 본원에서 기술되는 변형 FXa 폴리펩티드는, 10-1000 ㎍/kg 사이의 용량, 예컨대 10-250 ㎍/kg 사이의 용량 그리고 일반적으로 10-75 ㎍/kg 사이의 용량, 예컨대 40 ㎍/kg의 용량으로 투여될 수 있다(예컨대, 미국 특허 공개번호 US20090175931호 참조).
다른 예에서, 본원에서 기술되는 변형 FX 폴리펩티드는 치료적 조성물, 예를 들어 직접적 FX 활성화제를 함유하거나 함유하지 않는 조성물의 일부로서 투여될 수 있다. 예를 들어, 치료적 조성물은 테나제 복합체, 예컨대 인자 Ⅱ 및/또는 프로트롬빈의 일부를 형성하지 않는 기타 응고 인자를 함유할 수 있다. 다른 예에서, 변형 FX 폴리펩티드는 선택적으로 활성 또는 지모겐 형으로 FX 활성화 효소, 예컨대 FⅦ 또는 FⅦa, FⅨ 또는 FⅨa를 포함하는 치료적 조성물에서 제공될 수 있다. FX 폴리펩티드는 활성화 인자 Ⅶ(FⅦa)와 조합으로, 예컨대 10:1의 비율로서, 저해제와 함께 혈우병 환자에게 투여될 수 있다(Shirahata et al., (2012) Haemophilia 18:94-101). 다른 예에서, 0.58 IU/ml FX 및 0.29 IU/ml FⅨ를 포함하는 치료적 농도가 항응고제 약물의 과다복용에 의해 유도된 응고장애(coagulopathy)를 치료하기 위해 사용될 수 있다(Olesen et al., (2009) J. Thrombosis and Haemostasis 7(S2):Abstract No. PP-MO-386). 다른 예에서, 변형 프로트롬빈 복합체 농도가 단백질 C 및 단백질 S 뿐 아니라, 변형 FX 폴리펩티드 및 혈액 응고 인자 Ⅱ,Ⅶ, 및 Ⅸ를 사용하여 생성될 수 있다.
FX/FXa 폴리펩티드가 혈액의 응고 시간에 미치는 영향은 당업계에 공지된 임의의 응고 시험을 통해 모니터링할 수 있으며, 그 예로는 전혈 프로트롬빈 시간(PT), 활성화된 부분 트롬보플라스틴 시간(aPTT), 활성화된 응고 시간(ACT), 재석회화 활성화된 응고 시간 또는 리-화이트(Lee-White) 응고 시간을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
환자 상태의 개선 후에는, 유지 용량의 화합물 또는 조성물이 필요에 따라 투여될 수 있고; 용량, 투여형태 또는 투여 빈도 또는 이의 조합은 변형될 수 있다. 일부 경우에, 대상체는 질환 증상의 임의의 재발 후에 장기간을 기준으로 한 간헐 치료 또는 계획 용량을 기초로 한 간헐 치료를 필요로 할 수 있다. 다른 경우에는, 출혈, 외상 또는 외과수술 과정과 같은 급성 사건에 대한 반응으로 추가 투여를 필요로 할 수 있다.
변형 FX/FXa 폴리펩티드는 단독으로 또는 다른 제제와 조합으로 치료적 활성을 갖는다. 이 섹션은 예시적인 용도 및 투여 방법을 제공한다. 이러한 기술되는 치료는 예시적이고 변형 FX/FXa 폴리펩티드의 적용을 제한하지 않는다. 다음은 FX/FXa가 단독으로 또는 다른 제제와 조합하여 치료제로서 사용될 수 있는 몇몇 예시적 상태이다.
1. 선천적 출혈 질병
본원에서 기술된 바와 같은, 변형 FX 지모겐 및 FXa 폴리펩티드는 선천적 출혈 질병을 치료하기 위하여 사용될 수 있다. 예를 들어, FX 및 FXa 폴리펩티드는 내인성 또는 외인성 응고 경로에서 모든 응고 인자를 우회하고, 이들의 결핍으로 인한 응고장애를 치료하는 데 사용될 수 있다. 선천적 응고 인자 결핍으로 생기는 출혈 질병은 혈우병 A (인자 VIII 결핍); 혈우병 B (인자 IX 결핍); 혈우병 C (인자 Xi 결핍); 인자 VII 결핍; 인자 X 결핍; 인자 XII 결핍; 및 타입 Ⅰ, Ⅱ, Ⅳ, Ⅴ, 및 Ⅵ 가족성 다중 응고 인자 결핍(familial multiple coagulation factor deficiency, FMFD)을 포함한다(Reberts, HR 및 MD Bingham, "Other Coagulation Factor Deficiencies," Thrombosis and Hemorrhage, 2nd ed. Baltimore, MD: Williams & Wilkins, 1998: 773-802 참고). 변형 FX/FXa 폴리펩티드는 또한, 이에 한정되지는 않지만, 폰 빌레브란트 질병(Von Willebrand's disease), 유전성 혈소판 질병(예를 들어, 체디아크 히가시 증후군(Chediak-Higashi syndrome) 및 헤르만스키-푸드락 증후군(Hermansky-Pudlak syndrome)과 같은 저장 풀 질병(storage pool disease), 트롬복산 A2 기능장애, 혈소판무력증(Glanzmann's thrombasthenia) 및 베르나르-술리에 증후군(Bernard Soulier syndrome)), 및 Rendu-Osler-Weber 증후군으로 알려진 유전성 출혈성 모세혈관 확장증(Hereditary Hemorrhagic Telangiectsasia)과 같은, 추가적인 선천적 출혈 질병 및 질환의 치료에 사용될 수 있다.
a. 혈우병
본원에서 기술된 바와 같은, 변형 FX 지모겐 및 FXa 폴리펩티드는 혈우병과 같은 선천적 출혈 질병을 치료하기 위하여 사용될 수 있다. 혈우병은 하나 이상의 혈액 응고 인자가 결핍됨으로써 초래되는 출혈 질병이다. 혈우병은 조직 상처 부위에서 응괴(blood clot)를 형성하는 능력을 감소시키는 것을 특징으로 한다. 선천적 X 연관 혈우병은 FVIII 및 FIX, 각각의 결핍으로 야기되는 돌연변이(들)에 의해 초래되는 혈우병 A 및 혈우병 B를 포함한다. 혈우병 A는 10,000명의 남성 중 1명의 비율로 발생하고, 반면 혈우병 B는 50,000명의 남성 중 1명의 비율로 발생한다. 혈우병 A와 B는 다시 경증, 중등증, 중증으로 분류된다. 정상적인 기능을 하는 인자 VIII 또는 IX를 5~25% 가진 혈장 수준을 경증, 1~5%를 중등증, 및 1% 미만을 중증으로 분류한다. FXI 결핍으로도 종종 불리는 혈우병 C는 상대적으로 경증이고, 100000명의 사람 중에 약 1명으로 나타나는 드문 상염색체 열성 질병이다.
혈우병 환자들은 관절과 근육 혈액 순환으로부터 고통받고, 이는 외상에 대한 반응이거나 자연적인 것일 수 있다. 출혈은 심각한 급성 고통을 초래할 수 있고, 움식임을 제한할 수 있고, 활액분비 비대(synovial hypertrophy)를 포함한 이차 합병증으로 이끌 수 있다. 또한, 관절에서의 혈액 순환은 만성 활액분비를 초래할 수 있는데, 이는 활액, 연골 그리고 골을 파괴하면서 관절 손상을 초래할 수 있다. 출혈은 일반적으로 신선한 냉동 혈장(FFP)의 수혈, FXI 대체(replacement) 요법으로 치료되며, 외부 상처 또는 발치와 같은 국부 치료를 위해서는 피브린 글루로 치료된다. 혈우병 A 또는 B의 치료를 위한 가장 일반적인 치료법은 대체(replacement) 요법이고, 이 때 환자들은 FVIII 또는 FIX가 투여된다. 제제(formulation)는 혈장 유래 또는 재조합 제품들로서 상업적으로 이용가능하고, 재조합 단백질은 현재 치료받은 적이 없는 환자들에게 최상의 치료법이다. 이러한 치료들은 매우 성공적일 수 있지만, 만약 환자가 새롭게 투여된 인자 VIII 또는 인자 IX에 대한 저해제를 발생시킨다면 합병증이 발생한다.
저해제들은 대부분 IgG4 서브클래스인 IgG 항체이며, 이들은 FVIII 또는 FIX와 반응하고 응혈원 기능을 방해한다. 저해제는 중증 혈우병 A 환자 5명에서 약 1명에게 영향을 미친다. 대부분의 개체들은 유아기에 종종 이루어지는 인자 VIII의 최초 주입 투여 직후 상기 저해제를 발생시키나, 이후 생애에 발생시키는 개체도 있다. 저해제는 또한 경증 또는 중등증 혈우병 A 환자 15명 중 약 1명에 영향을 미친다. 이들 저해제들은 주로 성인시절에 발생되어 투여된 외인성 FVIII를 파괴시킬 뿐 아니라, 내인성 FVIII도 파괴시킨다. 그 결과, 경증 및 중등증 혈우병 환자들이 중증이 된다. 임상적으로 저해제를 가진 혈우병 A 환자들은 그들이 FVIII에 재-노출될 때 그들이 경험한 병력 반응의 강도에 따라 고반응자 및 저반응자로 분류된다. 저해제들은 혈우병 B 환자 100명 중 약 1명에게 영향을 미친다. 대부분의 사례에서 저해제들은 치료적 인자 IX의 최초 주입 후에 발생되며 알러지 반응이 동반될 수 있다.
본원에서 제공되는 변형 FX 지모겐 및 FXa 폴리펩티드와 본원에서 제공되는 상기 변형 FX 폴리펩티드를 암호화하는 핵산은 저해제를 가진 혈우병 환자들을 포함하여, 혈우병 환자들을 위한 치료제로 광범위하게 사용될 수 있고, 혈우병 연관 출혈 상태의 치료를 위해 사용될 수 있다. 본원에서 제공되는 변형 FX 폴리펩티드는 FVIIIa 및/또는 FIXa 의 필요조건을 우회하면서 트롬빈 생성을 강화함으로써, 예를 들어, 자연스런 출혈 에피소드를 통제하거나 예방하기 위하여, 외상 또는 수술 과정에 따르는 출혈을 통제하거나 예방하기 위하여 사용될 수 있다.
변형 FX 폴리펩티드는 예를 들어 동물 모델을 사용함으로써, 치료적 효과를 테스트할 수 있다. 예를 들어, FVIII 또는 FIX-결핍 마우스, 항체-유도 혈우병 마우스, 또는 혈우병을 위한 모든 다른 알려진 질병 모델이 변형 FX 폴리펩티드로 치료될 수 있다. 질병 증상 및 표현형의 진행을 모니터하여 변형 FX 폴리펩티드의 효과를 검정한다. 변형 FX 폴리펩티드는 또한 비변형 FX 폴리펩티드를 이용하여 위약 대조군 및/또는 대조군과의 비교로 인 비보(in vivo) 효과를 검정하기 위하여 임상시험과 같이, 개체 뿐 아니라 동물 모델에도 투여될 수 있다.
b. 기타 응고 인자 결핍
본원에서 기술된 바와 같은, 변형 FX 지모겐 및 FXa 폴리펩티드는 또한 FVIII 및 FIX 이외의 응고 인자 결핍으로 초래되는 응고장애 환자들을 치료하기 위하여 사용될 수 있다. 예를 들어, FX 폴리펩티드는 인자 VII 결핍, 인자 X 결핍, 인자 XIII 결핍, 및 타입 II, IV, V, 및 VI 가족성 다중 응고 인자 결핍(familial multiple coagulation factor deficiency, FMFD) 환자를 치료하기 위해 사용될 수 있다(Reberts, HR 및 MD Bingham, "Other Coagulation Factor Deficiencies," Thrombosis and Hemorrhage, 2nd ed. Baltimore, MD: Williams & Wilkins, 1998: 773-802 참고).
i. 인자 VII 결핍
본원에서 기술된 바와 같은, 변형 FX 지모겐 및 FXa 폴리펩티드는 인자 VII 결핍 환자 또는 개체에 사용될 수 있다. 인자 VII 결핍은 사람 500,000명 중 약 1명에 영향을 미치는 상염색체 열성 질병이다. FVII 결핍은 임상적으로 경증, 중등증 또는 증증일 수 있고, 수술 및 외상 후 출혈 증가를 특징으로 한다. 중증 FVII 결핍 환자(1% 미만의 FVII 활성)는 혈우병과 유사한 증상을 경험한다. 예를 들어, FVII-결핍 개체들은 관절에서 피가 나고, 자발적인 코피가 나며, 위장관 출혈, 비뇨기관 출혈이 일어나기 쉽다. 뇌내 출혈(intracerebral hemorrhage) 및 근육 출혈도 보고된 바 있고, 한편 여성들은 중증의 월경 과다증 (심각한 월경 출혈)을 경험할 수 있다. 치료는 혈장, PCCs 및 재조합 FVIIa를 이용한 대체(replacement) 요법에 영향을 받는다(Hender et al., (1993) Transfusion Med Rev, 7:78-83; US 2009-0291890). 본원에서 기술된 변형 FX 폴리펩티드는 응고 경로에서 FVII의 다운스트림으로 작용하고, 그러므로 출혈 에피소드의 치료와 FVII-결핍 환자에서 외과적 중재 또는 침습 과정으로 출혈을 예방하는데 사용될 수 있다. 변형 폴리펩티드는 활성 FX (FXa) 폴리펩티드로서 또는 지모겐 형태로 투여될 수 있다.
ii. 인자 X 결핍
본원에서 기술된 바와 같은, 변형 FX 지모겐 및 FXa 폴리펩티드는 인자 X 결핍 환자 또는 개체에 사용될 수 있다. 인자 X 결핍은 사람 1,000,000명 중 1명 정도로 발생하는 드문 상염색체 열성 출혈 질병이다. 인자 X 결핍은 임상적으로 경증(6-10 IU/dL) 부터 중증(<1 IU/dL, 또는 정상 FX 활성의 1<%)에 걸친 다양한 출혈 표현형을 나타낸다. 10-15%의 정상의 인자 X 활성을 가진 개인은 제한된 자발적 출혈을 경험하며, 출혈은 수술 또는 외상과 관련되어서만 발생한다(Peyvandi et al., (1998) Br J Haematol. 102:626-628; Uprichard, J and DJ Perry, (2002) Blood Reviews. 16:97-110; Roberts HR and MD Bingham, "Other Coagulation Factor Deficiencies," Thrombosis and Hemorrhage, 2nd ed. Baltimore, MD: Williams & Wilkins, 1998:773-802). FX-결핍 환자가 코피를 경험하는 것은 일반적이며, 50%의 FX-결핍 여성 환자는 월경 과다증이 나타난다. 관절혈증(hemarthroses), 중증의 수술후 출혈 및 중추신경계 출혈도 몇몇 사례의 환자들에서 보고된 바 있다.
현재, 인자 X 결핍을 위한 대체 치료는 혈액(Girolami et al. (1970) Thromb Diath Haemorrh 24(1): 175-184), 신선한 냉동 혈장(FFP)(Girolami et al., (1970) Br J Haematol 19(2):179-192), 및 복합요법, 예를 들어 인자(Lechler, E(1999) Thromb Res 95(Suppl 1):S39-S50)를 함유하는 프로트롬빈분해효소 복합체 농축물(prothrombinase complex concentrate, PCCs)에 제한된다. FX를 함유하는 복합 요법은 섹션 I에 추가 기술되어 있다. FX 폴리펩티드 투여는 현재 이용가능하지 않다. 본원에서 기술된 변형 FXa 폴리펩티드는 출혈 에피소드를 치료하고 FX-결핍성 환자에서 수술적 중재 또는 침습 과정에서의 출혈을 예방하기 위하여 사용될 수 있다.
iii. 가족성 다중 응고 인자 결핍(familial multiple coagulation factor deficiency)
본원에서 기술된 바와 같은, 변형 FX 지모겐 및 FXa 폴리펩티드는 또한 가족성 다중 응고 인자 결핍이라고도 불리는, 다중 응고 인자의 유전성 결핍으로 초래된 응고장애 환자들을 치료하기 위하여 사용될 수 있다. 인자들이 영향을 받게되는 것에 기초하여 분류되는 여섯 종류의 FMFD가 있다. 타입 I FMFD는 인자 V 및 VIII의 결핍으로 초래된다; 타입 II FMFD는 인자 VIII 및 IX의 결핍으로 초래된다; 타입 III FMFD 환자들은 비타민 K-의존성 응고 인자들(즉, 인자 II, VII, IX 및 X)가 결핍이다; 타입 IV FMFD는 인자 VII 및 VIII의 결핍으로 초래된다; 인자 VIII, IX 및 XI의 결핍은 타입 V FMFD을 발생시키고, 및 인자 IX 및 XI의 결핍은 타입 VI FMFD로 분류된다. FMFD 타입 II 및 IV는 응고 경로에서 FX의 응고인자 업스트림에 결핍을 함유하고, 그러므로 본원에서 기술되는 변형 FX 폴리펩티드 단독 또는 다른 치료제와 조합한 치료로 효과를 얻을 수 있다. 본원에서 기술된 FX 폴리펩티드는 또한 주로 병용 요법의 일부로서 다른 타입의 FMFD를 치료하기 위하여 사용될 수 있다. FMFD 중에서, 단지 타입 I 및 타입 III가 광범위하게 특징지어졌다.
타입 III FMFD의 임상 징후들은 인자 결핍 또는 장애의 정도에 따라서 무증상에서 중증 출혈까지 이른다. FII, FVII, FIX 및 FX 합성 동안 카르복실화 단계의 결함으로 이어지는, 감마 글루타밀 카복실레이즈 및 비타민 K 에폭시드 리덕테이즈 복합제의 결함은 이들 네 개 인자의 연합된 결핍을 발생시킬 수 있다(Brenner et al., (1998) J Clin Invest. 69:1253-1260). 그러나, 출혈 에피소드의 치료는 결핍 인자를 대체할 요법을 요구한다(Roberts, HR and MD Bingham, "Other Coagulation Factor Deficiencies," Thrombosis and Hemorrhage, 2nd ed. Baltimore, MD: Williams & Wilkins, 1998: 773-802). 그러므로, 본원에서 기술된 변형 FX 폴리펩티드는 FMFD 일부 타입을 위한 치료법 중 일부로 사용될 수 있다.
c. 기타
기타 선천적 출혈 질병들은 응고를 촉진하기 위하여 본원에서 제공되는, FX 지모겐 또는 FXa 폴리펩티드를 포함하는 FX 폴리펩티드로 치료될 수 있다. 폰 빌레브란트 질병(Von Willebrand's disease, vWD)에 연관된 자발적 및 수술 연관의 출혈 에피소드는 본원에서 제공되는 변형 FX 폴리펩티드를 사용하여 치료될 수 있다. vWD는 혈액 응고 단백질, 폰 빌레브란트 인자(vWF)의 결함 또는 결핍에 의하여 초래되는 출혈 질병이고, 인구의 1% 내지 2%에서 발생되는 것으로 추측된다. vWD 개체들은 쉽게 타박상이 생기고, 되풀이되는 코피와, 발치 후 출혈, 편도선 수술 또는 다른 수술 후 출혈이 있고 여성 환자들은 증가된 월경 출혈이 있을 수 있다. 변형 FX 폴리펩티드는 vWD 환자에서 자발적 및 수술 연관된 출혈의 개선를 위하여 사용될 수 있다.
기타 혈소판-관련 출혈 질병들, 예를 들어 혈소판무력증(Glanzmann's thrombasthenia) 및 헤르만스키-푸드락 증후군(Hermansky-Pudlak syndrome)도 감소된 내인성 응고 활성에 연관되어 있다. 혈소판 관련 출혈 질병 환자에서 과도한 자발적 또는 수술-연관 출혈도 변형 FX 폴리펩티드의 치료적 복용에 의해서 통제될 수 있다. 예를 들어, 수술 중인 혈소판무력증 환자는 많은 혈액 손실을 예방하기 위하여 수술 전, 도중 및/또는 후에 변형 FX 폴리펩티드로 치료될 수 있다. 변형 FX 폴리펩티드는 불활성 지모겐 형태 또는 활성 FX (FXa) 폴리펩티드로 투여될 수 있다.
2. 후천적 출혈 질병
출혈질명은 또한 선천적이 아니라 후천적일 수 있다. 본원에서 기술되는, 변형 FX 지모겐 및 FXa 폴리펩티드는 또한 후천적 출혈 질병을 치료하기 위하여 사용될 수 있다. 후천적 출혈 질병은 수술 과정 또는 약물-유도된 응고장애, 예를 들어 화학치료요법에 의한 혈소판 감소증의 결과로서의 응고장애를 포함한다. 하나의 예에서, 변형 FX 폴리펩티드는 항-응고 치료제의 과다복용에 대한 해독제로서 사용될 수 있다(US 2011/0014128). 변형 FX 폴리펩티드는 또한 간 질환, 비타민 K 결핍과 같은 후천적 인자 X 결핍과 같은 후천적 응고 인자 결핍을 치료하기 위하여 사용될 수 있다. 변형 FX 폴리펩티드로 이득을 볼 수 있는 다른 후천적 출혈 질병은 용혈성 요독성 증후군(hemolytic-uremic syndrome), 알러지성 자반(Henoch Schonlein purpura) 및 파종성 혈관내 응고(disseminated intravascular coagulation, DIC)를 포함한다.
하나의 예에서, 변형 FX/FXa 폴리펩티드는 개체에서 외상 또는 수술, 또는 혈소판의 낮아진 수치 또는 활성에 의한 출혈 에피소드를 치료하기 위하여 사용될 수 있다. 예를 들어, 혈액 수혈의 결과로 혈액희석 응고장애, 또는 외상에 뒤따르는 급성 외상성 응고장애는 변형 FX/FXa 폴리펩티드로 치료될 수 있다. 수술 중 환자들을 위한 예시적인 방법은 이에 제한되지 않지만, 심장 수술, 혈관성형술, 폐 수술, 복부 수술, 척추 수술, 뇌 수술, 혈관 수술, 치과 수술 또는 골수, 심장, 폐, 이자 또는 간의 이식을 포함하는 기관 이식 수술과 같은 수술의 전, 도중, 또는 후의 치료 및 출혈을 예방하는 치료를 포함한다.
a. 화학요법으로 얻어진 혈소판 감소증
예를 들어 백혈병 및 기타 암들을 위한 화학요법 치료는 혈소판 감소증을 초래할 수 있다. 이는 화학요법을 받는 환자들의 골수에서 혈소판 생성 부족에 의한 것일 것이고, 일반적으로 투약 후 6-10일 후에 발생한다. 후천적 혈소판 감소증의 치료는 일반적으로 혈소판, 적혈구 또는 혈장 수혈에 의하고, 이는 혈소판 결핍으로 초래될 수 있는 임의의 비정상 자발적 출혈을 예방하는 작용을 한다. 화학요법-유도성 혈소판 감소증 환자 또는 기타 다른 선천적 또는 후천적 혈소판 감소증 환자들에서의 출혈도 본원에서 제공되는 변형 FX 폴리펩티드의 치료적 양의 투여에 의해 제어될 수 있다. 예를 들어, 위장관에서 통제되지 않은 출혈이 있는 혈소판 감소증 환자는 출혈을 멈추기 위하여 FX 폴리펩티드의 치료적 양의 정맥 볼루스 주사가 투여될 수 있다. 변형 FX 폴리펩티드는 불활성 지모겐 형태 또는 활성 FX (FXa) 폴리펩티드로서 투여될 수 있다.
b. 기타 응고장애
기타 후천적 응고장애는 본원에 제시된 변형 FX 폴리펩티드를 사용하여 치료될 수 있다. 응고장애는 이에 제한되지 않지만, 전격성 간부전(fulminant hepatic failure, FHF; 간독성 약물, 독, 대사 질환, 감염성 질환 및 빈혈에 의해서 초래되는 것과 같은), 간경변 및 윌슨씨 병(Wilson's disease)에 연관된 질환을 포함하는 기타 간 질환, 비타민 K 결핍(항생제 치료 또는 다이어트로 초래되는 것과 같은), 용혈성 요독성 증후군(hemolytic-uremic syndrome), 혈전성 혈소판 감소증(thrombotic thrombocytopenia, TTC) 및 파종성 혈관내 응고(DIC)를 포함하는 상태로부터 초래될 수 있다. 전통적인 치료는 혈장, 적혈구(RBC) 또는 혈소판의 수혈에 의한 것이지만, 성공적이지 않을 수 있다.
하나의 예에서, 변형 FX 폴리펩티드는 출혈을 예방하기 위해서 침습 과정이 진행중인 FHF 환자에게 투여될 수 있다. 신선한 냉동 혈장(FFP)을 이용한 전통적인 치료는 종종 성공적이지 않았고 다량의 혈장을 필요로 할 수 잇어, 전신부종(부종 유체의 피하 결합조직으로의 전신 침윤) 및 혈량 과부하를 일으킨다. 예를 들어 간 생검, 간 이식과 같은 침습 수술 동안, 전 및/또는 후에 정맥 볼루스에 의해서 변형 FX 폴리펩티드의 치료적 양을 이용한 치료는 FHF 환자에서 출혈을 예방하고 지혈을 확립시킬 수 있다. 환자는 치료의 유효성을 확인하기 위하여 혈액의 PT로 감시될 수 있다.
다른 예에서, FX는 예를 들어, 응고장애와 관련이 있는 중증 출혈, 예컨대 통상의 수혈 주입에 반응하지 않은 간 기능이상 및 DIC와 관련이 있는 중증 제왕절개 후 복강내 출혈이 있는 환자에게 투여될 수 있다. 또한, 변형 FX 폴리펩티드는 신생아 및 소아 환자의 응고장애를 치료하는데 사용될 수 있다.
본원에서 제공되는 변형 FX 폴리펩티드는 비변형 FX 폴리펩티드와 비교하여 증가된 응고 활성 및 증가된 반감기에 대한 강화된 FVa 의존성을 나타내므로, 예컨대, 더 적은 부작용으로, 더 적은 용량에서 덜 빈번하게 투여될 수 있다. 변형 FX 폴리펩티드는 내재성 효소에 의해 활성화되는 불활성 지모겐 형태로 또는 활성화된 FX (FXa) 폴리펩티드로 투여될 수 있다.
c. 이식으로 얻어진 출혈
골수 이식(BMT) 및 줄기세포 이식(SCT)에 뒤따르는 중증 출혈은 혈소판 감소로 인해, 상기 처치들과 관련이 있는 비교적 일반적이고 생명을 위협하는 합병증이다. 예를 들어, 미만성 폐포 출혈(DAH)은 BMT의 폐 합병증으로, 이식 집단에서 추정되는 발생빈도가 1 내지 21%이고 치사율이 60 내지 100%이다. 이러한 출혈 에피소드들의 통상적인 치료법은 코르티코스테로이드 치료 및 혈장, 혈소판 및/또는 RBC 수혈을 포함하지만, 총 치사율이 약 50%로 대부분 성공적이지 못하다(Hicks et al.(2002) Bone Marrow Transpl 30: 975-978). 코르티코스테로이드 및/또는 혈소판 수혈로 동시에 치료하거나 동시에 치료함이 없이 정맥 볼루스에 의한 FX의 투여는 DAH를 치료하고 지혈을 확립시키기 위해 수행될 수 있다. 본원에서 제공되는 변형 FX 폴리펩티드는 비변형 FX 폴리펩티드에 비해 증가된 응고 활성 및 증가된 반감기에 대한 강화된 FVa-의존성을 나타내므로, 예컨대, 더 적은 부작용으로, 더 적은 용량에서 덜 빈번하게 투여될 수 있다. 변형 FX 폴리펩티드는 내재성 효소에 의해 활성화되는 불활성 지모겐 형태로 또는 활성화된 FX (FXa) 폴리펩티드로 투여될 수 있다.
d. 항응고제 요법 유도성 출혈
혈전색전증과 같은 상태를 치료하기 위해 항응고제 요법을 받는 환자는 와파린, 헤파린, 폰다파리눅스(fondaparinux) 및 리바록사반(Rivaroxaban)과 같은 항응고제의 급성 투여 시에 출혈 에피소드를 나타내거나 또는 이러한 요법의 장기 사용의 결과로서 출혈 장애를 발생시킬 수 있다. 출혈 에피소드의 치료는 일반적으로 헤파린을 중화시키는 프로타민, 외인성 FIX, 혈장, 비타민 K와 같은 응혈원의 투여를 포함한다. 또한, 약학적 제제 중 단독 또는 일부로서의 외인성 FVII의 투여는 항응고제의 효과를 중화시키고, PT, aPTT 및/또는 다른 응고 마커를 증가시키고, 지혈을 확립시키기 위해 수행될 수 있다(Gruber et al., 2008 Blood. 112: Abstract 3825). 본원에서 제공되는 변형 FX 폴리펩티드는 항응고제 치료로 인해 후천적 출혈 장애가 있는 환자의 출혈 에피소드를 제어하기 위한 치료에 사용될 수 있다. 변형 FX 폴리펩티드는 내재성 효소에 의해 활성화되는 불활성 지모겐 형태로 또는 활성화된 FX (FXa) 폴리펩티드로 투여될 수 있다. 보다 신속한 치료를 위하여, 변형 폴리펩티드는 일반적으로 활성화된 FX (FXa) 폴리펩티드로 투여된다.
e. 후천적 혈우병
인자 VIII 저해제는 다른 면에서 건강한 개체 중에서 자발적으로 발생하여, "후천적 혈우병"으로 알려진 병태를 초래한다. 후천적 혈우병은 드문 병태이며, 매년 발생빈도가 백만명당 0.2 내지 1.0명이다. 자가항체는 주로 IgG4 항체이고, 이는 FVIII에 결합할 때, 트롬빈 절단, 폰빌레브란트 인자 상호작용 및/또는 인지질 결합을 방해하여 FVIII 활성을 저해한다. 그 결과, 환자의 약 87%에서 생명을 위협하는 출혈이 발생한다. 일반적인 출혈 부위는 피부, 점막, 근육 및 복막뒤이며, 주로 관절과 근육에서 출혈이 일어나는 유전성 혈우병 환자와 대조적이다. 후천적 혈우병은 출혈 에피소드를 제어하기 위해 활성화된 프로트롬빈 복합체 농축물 또는 재조합 활성화된 인자 VII (NovoSeven?, Novo Nordisk)로 치료될 수 있다. 본원에서 제공되는 변형 FX 폴리펩티드는 증가된 응고 활성을 나타내고, FVII 대체 치료에 대한 요구(need)를 우회한다. 변형 FX 폴리펩티드는 내재성 효소에 의해 활성화되는 불활성 지모겐 형태로 또는 활성화된 FX (FXa) 폴리펩티드로 투여될 수 있다. 예를 들어 수술 중과 같은, 보다 신속한 해결이 요구되는 경우, 변형 폴리펩티드는 활성화된 FX (FXa) 폴리펩티드로 투여될 수 있다.
3. 외상 및 수술 출혈
변형 FX 폴리펩티드는 정상 응고계를 가진 개체에서 수술중 및 외상성 혈액 상실과 관련이 있는 출혈을 치료하는 치료법으로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 변형 FX 폴리펩티드는 응고를 촉진하고 수술과 관련된 혈액 상실을 감소시키기 위해, 나아가 혈액 수혈의 필요성을 저하시키기 위해 환자에게 투여할 수 있다.
일부 예에서, 변형 FX 폴리펩티드는 빠른 지혈과 혈액 손실을 감소시키기 위하여 다양한 종류의 수술이 진행중인 정상 응고 체계를 가진 환자에게 투여될 수 있다. 변형 FX 폴리펩티드의 치료는 수술 부위의 지혈을 촉진하고 혈액 손실을 감소시킴으로써, 수혈의 필요를 감소시키거나 없앤다. 본원에서 제공되는 FX 폴리펩티드 일부는 증가된 반감기, 순환하는 프로테아제 저해제에 대한 증가된 저항성 및 증가된 촉매 활성과 같은 개선된 물성을 나타내고, 그러므로 예를 들어 더 적은 부작용으로, 더 적은 용량에서 덜 빈번하게 투여될 수 있다. 변형 FX 폴리펩티드는 내재성 효소에 의해 활성화되는 불활성 지모겐 형태로 또는 활성화된 FX (FXa) 폴리펩티드로 투여될 수 있다.
본원에서 기술된 바와 같은 변형 인자 X 폴리펩티드는 또한 외상성 상해가 있는 개체에서 혈액 상실을 방지하고 응고를 촉진하기 위해 사용될 수 있다. 외상은 외인성 인자에 의한 생조직에 대한 상해로 정의되며, 미국에서 4번째 주요 사망원인이다. 외상은 둔기 외상(내부 압박, 기관 손상 및 내부 출혈을 초래함) 또는 침투성 외상(신체에 침투하여 조직, 혈관 및 기관을 파괴하여 외부 출혈을 초래하는 인자의 결과)으로 분류된다. 외상은 여러가지 사건에 의해 유발될 수 있으며, 그 예로는 차량 사고(둔기 및/또는 침투성 외상 유발), 총상(침투성 외상 유발), 자상(침투성 외상 유발), 기계 사고(침투성 및/또는 둔기 외상 유발) 및 상당한 높이에서의 추락(침투성 및/또는 둔기 외상 유발)을 포함하나, 이에 국한되지 않는다. 외상의 결과로서 조절되지 않는 출혈은 대부분의 관련 사망률의 원인이다.
미만성 응고장애는 외상 환자와 관련이 있는 비교적 일반적인 합병증으로, 25 내지 36%의 개체에서 일어난다. 응고장애는 상해 직후에 발생하여, 다양한 요인, 예컨대 응고인자 및 혈소판의 희석 및 소비, 섬유소용해, 산증 및 저체온증 등으로부터 야기된다. 통상적인 치료는 산증을 보정하고 저체온증을 치료하는, 신선 냉동 혈장(FFP) 혈소판, RBC 및/또는 동결침전제제의 수혈에 의한 대체 요법을 수반한다. 이 단계들은 출혈을 멈추고 사망을 예방하기에는 불충분하다. 단독 또는 다른 치료제들과의 조합으로 치료량의 FX의 투여에 의한 치료는 응고를 촉진하고 외상 환자의 혈액 상실을 감소시킬 수 있다. 예를 들어, FX 폴리펩티드-함유 치료는 희석혈액 응고장애(dilutional coagluopathy) 돼지 모델에서 응고와 최종 응괴 강도를 강화하였다(Dickneite et al., (2010) J Trauma 68(5):1151-1157; Mitterlechner et al., (2011) J Thrombosis and Haemostasis. 9(4):729-737). 본원에서 제공되는 변형 FX 폴리펩티드는 비변형 FX 폴리펩티드에 비해 증가된 응고 활성 및 증가된 반감기에 대한 강화된 FVa-의존성을 나타내므로, 예컨대, 더 적은 부작용으로, 더 적은 용량에서 덜 빈번하게 투여될 수 있다. 변형 FX 폴리펩티드는 내재성 효소에 의해 활성화되는 불활성 지모겐 형태로 또는 활성화된 FX (FXa) 폴리펩티드로 투여될 수 있다.
I. 병용 요법
본원에서 제공되는 모든 변형 FX 폴리펩티드는 다른 생물제제, 소분자 화합물 및 수술 등, 이에 국한되지 않는 다른 치료 제제 또는 처치와 함께, 그러한 처치 전에, 그러한 처치 중에 간헐적으로, 또는 그러한 처치에 이어서 투여될 수 있다. FX(FXa 및 rFXa 포함해서)가 표시되거나 사용되었었고 다른 제제 및 치료가 이용가능한, 앞에서 예시한 모든 것을 포함한 모든 질환 또는 병태에 대해, FX는 지모겐 또는 활성화 형태로 병용해서 사용될 수 있다. 따라서, 본원에서 제공되는 변형 FX 폴리펩티드는 지모겐 또는 활성화 형태로 유사하게 사용될 수 있다. 치료할 질환 또는 상태에 따라, 예시적 병용은 다른 혈장 정제된 또는 재조합 응고 인자, 응혈원, 예컨대 비타민 K, 비타민 K 유도체 및 단백질 C 저해제, 혈장, 혈소판, 적혈구세포 및 코르티코스테로이드 등(이에 국한되지 않는다)과의 병용을 포함하며, 이에 제한되지 않는다.
일부 예에서, 혈액 및 신선한 동결 혈장(FFP)는 인자 X 수준의 최소 증가를 위한 인자 X 대체 요법의 원천이다(Girolami et al. (1970) Thromb Diath Haemorrh 24(1):175-184; Girolami et al., (1970) Br J Haematol 19(2):179-192). 그러나, 인자 X 결핍 치료는 일반적으로 FII, FVII 및 FIX와 함께 인자 X를 함유하는 프로트롬빈분해효소 복합체 농축물(PCCs)의 치료로 효과가 있다(Lechler, E (1999) Thromb Res 95(Suppl 1):S39-S50). 이러한 농축물들은 상업적으로 이용가능하고, 예를 들어 Konyne 80 (Cutter, USA); Profilnine HT (Alpha, USA); Proplex T (Baxter Hyland, USA; or Bebulin VH (Immuno, USA)가 있다. 활성화 PCCs도 활성화 FX (FXa), 예를 들어 Autoplex (Baxter, Hyland, USA) and FEIBA (Immuno, USA)를 함유하는 것으로 이용가능하다. 일반적으로 지혈은 10-20 IU/dL의 수술후 FX 수준으로 달성된다(Knight et al., (1985) Transfusion, 25(1): 78-80; Bolton-Maggs, PHB/ The rare coagulation disorders. Treatment of hemophilia. Manchester: World Federation of Hemophilia; 2006). FIX 및 FX 농축물은 인자 X 결핍을 치료하는데도 사용되어 왔다. 그러나, 혈전 색전증 에피소드는 PCCs, 활성화 PCCs, 및 비변형 FX 폴리펩티드를 함유한 다른 농축물을 사용할 때의 걱정이다(Lechler (1999) Thromb Res. 95(Suppl.1):S39-S50). 혈전 색전증 에피소드 FX-함유 농축물은 본원에서 기술된 바와 같은 변형 FX 폴리펩티드를 사용함으로써 감소되거나 제거될 수 있다.
본원에서 제공되는 변형 FX 폴리펩티드는 비변형 FX 폴리펩티드에 비해 증가된 응고 활성 및 증가된 반감기에 대한 강화된 FVa-의존성을 나타내므로, 예컨대, 더 적은 부작용으로, 더 적은 용량에서 덜 빈번하게 투여될 수 있다. 변형 FX 폴리펩티드는 내재성 효소에 의해 활성화되는 불활성 지모겐 형태로 또는 활성화된 FX (FXa) 폴리펩티드로 투여될 수 있다.
J. 제조품 및 키트
변형 FX 폴리펩티드 또는 변형 FX 폴리펩티드를 암호화하는 핵산, 또는 이의 유도체 또는 생물학적 활성 부분의 약제학적 화합물은 포장 재료, 지혈 질환 또는 질병을 치료하는데 효과적인 약학적 조성물, 및 지혈 질환 또는 질병을 치료하는데 변형 FX 폴리펩티드 또는 핵산 분자가 사용된다는 것을 나타내는 라벨을 함유하는 제조품으로써 포장될 수 있다.
본원에서 제공되는 제조품은 포장 재료를 함유한다. 약학적 생산품의 포장에 사용되는 포장 재료는 당업자에게 공지되어 있다. 예컨대, 전문이 참고인용되는 미국 특허 5,323,907 및 5,052,558을 참조한다. 약학적 포장 재료의 예로는 블리스터 팩, 병, 튜브, 흡입기, 펌프, 백, 바이엘, 용기, 주사기, 병 및 선택된 제형과 의도된 투여 및 치료 방식에 적합한 임의의 포장 재료를 포함하나, 이에 국한되지 않는다. 임의의 지혈 질환 또는 장애에 대해 다양한 치료법이 있는 만큼, 본원에서 제공되는 화합물과 조성물의 다양한 제형의 어레이가 예상된다.
또한, 변형 FX 폴리펩티드 및 핵산 분자는 키트로도 제공될 수 있다. 키트는 본원에서 기술된 약학적 조성물 및 투여 용품을 포함할 수 있다. 예를 들어, 변형 FX는 주사기, 흡입기, 투여량 컵, 점적기 또는 도포기와 같은 투여용 기구와 함께 공급될 수 있다. 키트는 선택적으로 투여량, 투여 방법 및 투여 방식의 지시를 포함하는 투여 지침서를 포함할 수 있다. 또한, 키트는 본원에서 기술된 약학적 조성물 및 진단 용품을 포함할 수 있다. 예를 들어, 이러한 키트는 개체의 FX 조절계 또는 FX의 농도, 양 또는 활성을 측정하기 위한 용품을 포함할 수 있다.
도 1은 이황화 결합에 의해 연결된 경쇄 및 중쇄를 함유하는 인자 X 지모겐 형의 구조적 설명이다(Venkateswarlu et al., Biophysical Journal 82:1190-1206 (2002)로부터 변형). 돌연변이 생성을 위해 표적화된 아미노산 잔기는 하이라이트 표시되어 있다.
서열번호 134로 기재되는 성숙 인간 지모겐에 대하여, 경쇄는 130 아미노산(서열번호 134의 잔기 1-139에 상응하는)이고 중쇄는 306 아미노산(서열번호 134의 143-448에 상응하는)이다. 경쇄는 γ-카복시글루탐산(GLA)-풍부 도메인(서열번호 134의 잔기 1-39에 상응하는), 그 다음의 짧은 소수성 스택(stack) (서열번호 134의 잔기 40-45에 상응하는) 및 2개의 상피 성장 인자(EGF)-유사 도메인: EGF1(서열번호 134의 아미노산 46-84에 상응하는)및 EGF2(서열번호 134의 아미노산 85-128에 상응하는)을 함유한다. 중쇄는 52 아미노산 잔기 활성화를 중쇄의 아미노 말단에 함유한다. 중쇄는 또한 서열번호 134의 Ile 195에 상응하는 잔기로 시작하는 촉매 도메인을 함유한다. FX의 경쇄 및 중쇄는 서열번호 134로 기재되는 아미노산 잔기를 참고로 Cys132(경쇄의) 및 Cys302(중쇄의) 사이의 이황화 결합에 의해 연결된 채로 유지된다.
중쇄 부분이 활성화 펩티드를 결여하여 서열번호 134로 기재되는 성숙 인자 X의 소수성 잔기 Ile195-G198에 상응하는 신규한 N-말단에서 시작하는 촉매적 도메인(키모트립신-유사 세린 프로테아제 도메인(chymotrypsin-like serin protease domain)이라고도 불리는; 서열번호 134의 잔기 195-448에 상응하는)만을 함유하는 것을 제외하고, FX의 인자 X(FXA)는 인자 X 지모겐 형의 구조적 특징을 함유한다. FXa의 구조는 또한 서열번호 134로 기재되는 잔기에 상응하는 촉매 도메인의 내부에 Ile195와 Asp378의 α-NH2 기 사이의 염 다리의 형성으로 인해 FX 지모겐과 상이하다. 염 다리 형성은 활성화 도메인의 재정렬, 촉매작용에 요구되는 산소음이온 구멍(oxyanion hole)의 형성 및 기질 결합 부위(S1-S4)의 형성을 포함하는 촉매 도메인 구조에 있어서 다수의 변화와 관련된다. 연장된 기질 특이성에 기여하는 엑소사이트(exosite) 영역의 잔기가 또한 노출된다. 촉매 잔기 His236, Asp282, 및 Ser379는 활성 프로테아제의 활성-부위 촉매 트라이어드(triad)를 구성한다. 잔기들을 재정렬하는 구조적 변화는 또한 헤파린에 결합하는 헤파린 결합 잔기를 노출시키고 저해제 AT-Ⅲ에 의한 인식을 용이하게 한다.
도 2는 응고 캐스케이드(cascade)를 묘사한다. 도 2A는 FXa의 독립적 생산 을 위한 응고의 내인성 경로 및 외인성 경로 및 이 경로들이 공통 경로로 수렴되어 응괴 형성을 위한 트롬빈과 피브린을 생성함을 나타낸다. 이 경로들은 상호연관성이 있다. 이 도면은 지모겐이 하나 이상의 펩티드 결합의 절단에 의해 활성화된 프로테아제로 전환되는 활성화 캐스캐이드에 관여하는 분자의 순서를 나타낸다. 활성화된 프로테아제는 이어서 캐스캐이드에서 다음 지모겐 분자에 대한 활성화 프로테아제로서 작용하여, 최종적으로는 응괴를 형성시킨다. 이 도면은 FXa의 활성이 궁극적으로 트롬빈 및 피브린의 생성을 위해 FVa의 존재에 의해 조절된다는 것을 보여준다(FVa-의존적 활성). FXa 단독은 또한 낮은 수준의 트롬빈 활성화가 가능하다(FVa-독립적 활성). 도 2A는 더 나아가 FVa와 독립적으로 수행될 수 있는 응고 경로 밖의 기타 FXa 활성을 묘사한다. 도 2B는 동일한 경로를 묘사하나, 추가적으로 응고를 저해할 수 있는 항트롬빈(AT-Ⅲ)을 포함하는 상기 경로의 조절 인자(regulator)를 묘사한다.
도 3은 기타 FX 폴리펩티드와 서열번호 134로 기재되는 성숙 인간 FX의 예시적 정렬을 묘사한다. "*"는 정렬된 잔기가 동일함을 나타내며, ":"는 정렬된 잔기가 동일하지는 않으나, 유사하고 정렬된 위치에서 보존적 아미노산 잔기를 함유함을 의미하며, "."는 정렬된 잔기가 유사하고 정렬된 위치에서 반-보존적 아미노산 잔기를 함유함을 의미한다. 예시적으로, 아미노산 치환의 비-제한적인, 상응하는 위치가 하이라이트에 의해 표시된다. 예를 들어, 도 3a는 서열번호 404로 기재되는 흰뺨 긴팔원숭이(white-cheeked Gibbon) FX와 서열번호 134로 기재되는 성숙 FX의 정렬을 묘사한다. 도 3b는 서열번호 405로 기재되는 개코원숭이(baboon) FX와 서열번호 134로 기재되는 성숙 FX의 정렬을 묘사한다. 도 3c는 서열번호 406으로 기재되는 레서스 원숭이(Rhesus monkey) FX와 서열번호 134로 기재되는 성숙 FX의 정렬을 묘사한다. 도 3d는 서열번호 407로 기재되는 더스키 티티 원숭이(Dusky titi monkey) FX와 서열번호 134로 기재되는 성숙 FX의 정렬을 묘사한다. 도 3e는 서열번호 408로 기재되는 코끼리 FX와 서열번호 134로 기재되는 성숙 FX의 정렬을 묘사한다. 도 3f는 서열번호 409로 기재되는 마우스 FX와 서열번호 134로 기재되는 성숙 FX의 정렬을 묘사한다. 도 3g는 서열번호 410으로 기재되는 토끼 FX와 서열번호 134로 기재되는 성숙 FX의 정렬을 묘사한다. 도 3h는 서열번호 411로 기재되는 랫트 FX와 서열번호 134로 기재되는 성숙 FX의 정렬을 묘사한다. 도 3i는 서열번호 412로 기재되는 개 FX와 서열번호 134로 기재되는 성숙 FX의 정렬을 묘사한다. 도 3j는 서열번호 135로 기재되는 FX 변이체 Ile195L과 서열번호 134로 기재되는 성숙 FX의 정렬을 묘사한다. 도 3k는 서열번호 549의 아미노산 잔기 41-488로 기재되는 FX 변이체 활성화 펩티드(Ap) 152T와 서열번호 134로 기재되는 성숙 FX의 정렬을 묘사한다.
K. 실시예
이하의 실시예는 실증 목적으로 포함된 것이고, 본 발명의 범위를 제한하는 것이 아니다.
실시예 1
인자 X 폴리펩티드의 클로닝 및 발현
A. pFUSE 벡터로의 인자 X 유전자의 클로닝
488개 아미노산 인간 인자 X (FX) 전구체 폴리펩티드(P00742: 서열번호 1)를 암호화하는 핵산을 신장인자-1α(EF-1α) 코어 프로모터 및 R 세그먼트를 함유하는 합성 프로모터, hEF1-HTLV 및 인간 T-세포 백혈병 바이러스(HTLV) 타입 1 긴말단반복순서의 U5 서열 일부(R-U5')를 함유하는 포유류 발현 벡터, pFUSE-hIgG1-Fc2(이하에서 'pFUSE'라 약칭함)(InvivoGen; 서열번호 266)에 클로닝했다. 공급자에 의해 구체화된 조건에 따라 인-퓨전(In-Fusion) CF 드라이 다운 PCR 클로닝 키트(Clontech)를 사용하였다.
인-퓨전(In-Fusion) 과정에서, 인간 면역글로불린 1(hIgG1) Fc 부분이 없는 플라스미드 pFUSE를 pFUSE-Acc-F1 정방향 프라이머: GTGCTAGCTGGCCAGACATGATAAG (서열번호: 267) 및 pFUSE-Acc-R3 역방향 프라이머: CATGGTGGCCCTCCTTCGCCGGTGATC (서열번호: 268)와 함께 중합효소연쇄반응(PCR)으로 선형화하였고, 이를 어셉터(Acceptor) DNA로 사용하였다. FX의 전체 길이(full-length)를 암호화하는 서열은 FX-wtsp-Invivo-F1 정방향 서열: CGAAGGAGGGCCACC ATG GGGCGCCCACTGCACCTC (서열번호: 269) 및 FX-Invivo-R1 역방향 프라이머: TGTCTGGCCAGCTAGCAC TCACTTTAATGGAGAGGACG (서열번호: 270)을 주형으로 인간 FX cDNA (Origene, Rockville, MD)를 사용하여 PCR로 증폭시켰다. 상기 기재된 두 개의 FX 도너 증폭 프라이머 서열에서, FX 'ATG' 시작 및 상보서열의 'TGA' 종결 코돈은 정방향 및 역방향 프라미어 서열 각각에 밑줄그어져 있다. 18-nt 길이의 상동(homology) 지역, 인-퓨젼(In-Fusion)을 위한 비-풀림 5' 프라이머 꼬리는 굵게 표시되어 있다.
표준 PCR 반응 및 열순환 조건이 제조사에 의해 추천된 바와 같이 Phusion High-Fidelity Master Mix Kit (New England Biolabs)와 함께 사용되었다. 어셉터 및 도너 PCR 제품들은 E.coli-유래 dam 메틸화 PCR 주형 배경을 제거하기 위하여 DpnⅠ 제한 효소로 소화시켰다. 그리고나서 이들을 서로 혼합하여, 공급자에 의해 구체화된 조건을 사용하여 인-퓨전(In-Fusion) 반응을 수행하였다.
반응 믹스로 E.coli XL2Blue 수퍼컴피턴트 세포(Stratagene)를 형질전환시켰다. 25 ppm의 Zeocin (InvivoGen)으로 보충된 2xYT 한천 플레이트에서 콜로니를 선택하였다. 선택된 클론으로부터 플라스미드 DNA를 분리하였고, 정확한 클로닝을 확인하기 위하여 플라스미드 DNA를 정렬하였다. 정확한 서열을 함유하는 클론을 추가 연구를 위하여 사용하였다.
B. 프로-트롬빈 신호- 및 프로-펩티드 서열과 함께 FX 플라스미드의 제조
FX 음성 신호- 및 프로-펩티드 서열을 프로-트롬빈 서열로 바꾸기 위하여, 상기 실시예 1A에서 생성된 플라스미드를 F10-Pro-Acc-F1 정방향 프라이머: GCCAATTCCTTTCTTGAAGAGATG (서열번호: 271) 및 pFUSE-Acc-R3 역방향 프라이머: CATGGTGGCCCTCCTTCGCCGGTGATC (서열번호: 272)로 PCR에 의해 선형화하였고, 이를 어셉터 DNA로 사용하였다. 트로-트롬빈 신호- 및 프로-펩티드(서열번호 415의 아미노산 1-43에 기재 및 서열번호 273에 기재)의 뉴클레오티드 서열은 FⅡ-SP+Pro_F10Acc-F1 정방향 프라이머: CGAAGGAGGGCCACC ATG GCGCACGTCCGAGGCTTG (서열번호: 274) 및 FII-SP+Pro-F10Acc-R1 역방향 프라미어: TTCAAGAAAGGAATTGGCTCGCCGGACCCGCTGGAGCAG (서열번호: 275)를 주형으로 인간 프로-트롬빈 cDNA (Origene)을 사용하여 PCR로 증폭하였다. 상기 기재된 두 프로-트롬빈 도너 증폭 프라이머 서열에서, 18-nt 길이의 상동 지역, 인-퓨젼(In-Fusion)을 위한 비-풀림 5' 프라이머 꼬리는 굵게 표시되어 있고, 프로-트롬빈 'ATG' 시작 코돈은 정방향 프라이머 서열에서 밑줄그어져 있다. 표준 PCR 및 인퓨젼(InFusion) 반응은 상술한 바와 같이 수행하며, 하나의 서열-확인된 클론을 FX 변이체의 생성을 위한 주형으로 사용하기 위해 선택하였다.
C. FX 변이체의 제조
FX 변이체는 새로 합성되는 DNA에 특정 돌연변이를 혼입시키는 프라이머로서 작용하는 특수 설계된 올리고뉴클레오티드와 함께, 제조업자의 지시에 따라QuikChange Lightning Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene)를 사용하여 제조하였다. 목적한 돌연변이를 포함하는 상보성 프라이머는, 클로닝된 FX cDAA 서열을 주형으로 함유하는 실시예 1B에서 제조된, 정제된 이중가닥의 초나선형 플라스미드 DNA를 사용하여 사이클링 동안 신장시켰다. 프라이머를 신장시킨 결과, 새로 합성된 가닥에 관심 돌연변이가 포함되었고, 점착형 닉(nick)을 포함하는 돌연변이 플라스미드가 얻어졌다. 이어지는 증폭에서, 돌연변이유발 생산물은 E.coli- 유래의 플라스미드 DNA의 dam-메틸화된 모 가닥을 제거하기 위하여 DpnⅠ 제한 효소로 소화시켰다. E.coli XL1Blue 수퍼컴피턴트 세포(Stratagene)를 상기 DNA로 형질전환시켰고, 25 ppm Zeocin (InvivoGen)으로 보충된 2 x YT 한천 플레이트에서 선택하였다. 플라스미드 DNA를 선택한 클론으로부터 분리하였고, FX 유전자에 목적하는 위치(들)에서 돌연변이(들)을 포함하는지 확인하기 위하여 정렬하였다.
FX 변이체를 제조하기 위하여 사용된 상보성 프라이머 쌍으로부터의 올리오뉴클레오티드 중 하나의 뉴클레오티드 서열은 아래 표 15에 제공된다. 치환된 아미노산을 암호화하는 뉴클레오티드 트리플렛 서열은 대문자로 나타내었다. 예를 들어, 치환 I16L (키모트립신 넘버링에 의한 I16L; 서열번호 416)함유하는 FX 변이체를 제조하기 위하여, FX-I16L-정방향 프라이머, 및 FX-I16L-정방향에 상보성인 프라이머가 3-bp 'ATC' 야생형 서열을 3-bp 'CTG' 돌연변이 서열로 치환하기 위하여 사용하였다.
아래 표 15는 FX 돌연변이유발을 위해 사용된 올리고뉴클레오티드 프라이머를 기재한다. 키모트립신 넘버링에 의하여, 프라이머를 사용하여 돌연변이유발의 결과로 생성된 돌연변이 트리플렛은 대문자로 나타내었고, 프라이머 이름들은 돌연변이에 상응한다.
표 15: 올리고뉴클레오티드 프라이머
프라이머 이름
(키모트립신 넘버링)		 프라이머 서열 (5' 에서 3') 서열번호
FX-I16L-For gacaacaacctcaccaggCTGgtgggaggccaggaatgc 276
FX-V17A-For CaacaacctcaccaggatcGCCggaggccaggaatgcaag 277
FX-V17I-For caacctcaccaggatcATCggaggccaggaatgc 278
FX-V17L-For caacctcaccaggatcCTGggaggccaggaatgc 279
FX-V17T-For caacctcaccaggatcACCggaggccaggaatgc 280
FX-V17S-For caacctcaccaggatcAGCggaggccaggaatgc 281
FX-V17P-For caacctcaccaggatcCCCggaggccaggaatgc 282
FX-G18A-For accaggatcgtgGCCggccaggaatgcaaggac 283
FX-G18P-For accaggatcgtgCCCggccaggaatgcaaggac 284
FX-G18S-For accaggatcgtgAGCggccaggaatgcaaggac 285
FX-G18V-For accaggatcgtgGTGggccaggaatgcaaggac 286
FX-G18T-For accaggatcgtgACCggccaggaatgcaaggac 287
FX-G19A-For caccaggatcgtgggaGCCcaggaatgcaaggac 288
FX-G19V-For caccaggatcgtgggaGTGcaggaatgcaaggac 289
FX-G19R-For caccaggatcgtgggaCGGcaggaatgcaaggac 290
FX-G19K-For caccaggatcgtgggaAAGcaggaatgcaaggac 291
FX-G19P-For caccaggatcgtgggaCCCcaggaatgcaaggac 292
FX-G19H-For caccaggatcgtgggaCACcaggaatgcaaggac 293
FX-D194N-For gatgcctgccaggggAACagcgggggcccgcac 294
FX-D194S-For gatgcctgccaggggAGCagcgggggcccgcac 295
FX-L32S/G40H-For gtgtccctggcaggccAGCctcatcaatgaggaaaacgagCACttctgtggtggaacc 296
FX-E21A-For gatcgtgggaggccagGCCtgcaaggacggggag 297
FX-E21S-For gatcgtgggaggccagAGCtgcaaggacggggag 298
FX-E21V-For gatcgtgggaggccagGTGtgcaaggacggggag 299
FX-K23S-For ggaggccaggaatgcAGCgacggggagtgtccc 300
FX-R143A-For gtgagcggcttcgggGCCacccacgagaagggc 301
FX-R143S-For gtgagcggcttcgggAGCacccacgagaagggc 302
FX-R143T-For gtgagcggcttcgggACCacccacgagaagggc 303
FX-R143V-For gtgagcggcttcgggGTGacccacgagaagggc 304
FX-R143Q-For gtgagcggcttcgggCAGacccacgagaagggc 305
FX-R143N-For gtgagcggcttcgggAACacccacgagaagggc 306
FX-R143M-For gtgagcggcttcgggATGacccacgagaagggc 307
FX-R143K-For gtgagcggcttcgggAAGacccacgagaagggc 308
FX-R143Y-For gtgagcggcttcgggTACacccacgagaagggc 309
FX-R143D-For gtgagcggcttcgggGACacccacgagaagggc 310
FX-T144A-For gagcggcttcgggcgcGCCcacgagaagggccgg 311
FX-T144L-For gagcggcttcgggcgcCTGcacgagaagggccgg 312
FX-S152A-For gagaagggccggcagGCCaccaggctcaagatg 313
FX-S152T-For gagaagggccggcagACCaccaggctcaagatg 314
FX-S152N-For gagaagggccggcagAACaccaggctcaagatg 315
FX-R154E-For ggccggcagtccaccGAGctcaagatgctggag 316
FX-K156A-For cagtccaccaggctcGCCatgctggaggtgccc 317
FX-K156S-For cagtccaccaggctcAGCatgctggaggtgccc 318
FX-K156N-For cagtccaccaggctcAACatgctggaggtgccc 319
FX-K156D-For cagtccaccaggctcGACatgctggaggtgccc 320
FX-K156R-For cagtccaccaggctcAGGatgctggaggtgccc 321
FX-K156V-For cagtccaccaggctcGTGatgctggaggtgccc 322
FX-K156Y-For cagtccaccaggctcTACatgctggaggtgccc 323
FX-K156M-For cagtccaccaggctcATGatgctggaggtgccc 324
FX-V17S/G18A-For caacctcaccaggatcAGCGCCggccaggaatgcaag 325
FX-I16L/V17S-For gacaacaacctcaccaggCTGAGCggaggccaggaatgcaag 326
FX-I16L/G18A-For gacaacaacctcaccaggCTGgtgGCCggccaggaatgcaaggac 327
FX-S152A/K156M-For gagaagggccggcagGCCaccaggctcATGatgctggaggtgccc 328
FX-N35D-For ccctggcaggccctgctcatcGACgaggaaaacgagggtttctgt 329
FX-N35A-For ccctggcaggccctgctcatcGCCgaggaaaacgagggtttctgt 330
FX-N35S-For ccctggcaggccctgctcatcAGCgaggaaaacgagggtttctgt 331
FX-E37R-For caggccctgctcatcaatgagCGCaacgagggtttctgtggtgga 332
FX-E37K-For caggccctgctcatcaatgagAAGaacgagggtttctgtggtgga 333
FX-E37A-For caggccctgctcatcaatgagGCCaacgagggtttctgtggtgga 334
FX-E37S-For caggccctgctcatcaatgagAGCaacgagggtttctgtggtgga 335
FX-E39R-For ctgctcatcaatgaggaaaacCGCggtttctgtggtggaactatt 336
FX-E39K-For ctgctcatcaatgaggaaaacAAGggtttctgtggtggaactatt 337
FX-E39A-For ctgctcatcaatgaggaaaacGCCggtttctgtggtggaactatt 338
FX-R150A-For gggcgcacccacgagaagggcGCCcagtccaccaggctcaagatg 339
FX-R150D-For gggcgcacccacgagaagggcGACcagtccaccaggctcaagatg 340
FX-R150E-For gggcgcacccacgagaagggcGAGcagtccaccaggctcaagatg 341
FX-R150S-For gggcgcacccacgagaagggcAGCcagtccaccaggctcaagatg 342
FX-R150G-For gggcgcacccacgagaagggcGGCcagtccaccaggctcaagatg 343
FX-R143E-For gggattgtgagcggcttcgggGAGacccacgagaagggccggcag 344
FX-R143D-For gggattgtgagcggcttcgggGACacccacgagaagggccggcag 345
FX-R143M-For gggattgtgagcggcttcgggATGacccacgagaagggccggcag 346
FX-R143N-For gggattgtgagcggcttcgggAACacccacgagaagggccggcag 347
FX-R143Q-For gggattgtgagcggcttcgggCAGacccacgagaagggccggcag 348
FX-R93E-For gaggtggtcatcaagcacaacGAGttcacaaaggagacctatgac 349
FX-R93A-For gaggtggtcatcaagcacaacGCCttcacaaaggagacctatgac 350
FX-R240A-For gccttcctcaagtggatcgacGCCtccatgaaaaccaggggcttg 351
FX-R240E-For gccttcctcaagtggatcgacGAGtccatgaaaaccaggggcttg 352
FX-K236A-For accaaggtcaccgccttcctcGCCtggatcgacaggtccatgaaa 353
FX-K236E-For accaaggtcaccgccttcctcGAGtggatcgacaggtccatgaaa 354
FX-R125A-For gcgcctgcctgcctccccgagGCCgactgggccgagtccacgctg 355
FX-R125E-For gcgcctgcctgcctccccgagGAGgactgggccgagtccacgctg 356
FX-K96A-For atcaagcacaaccggttcacaGCCgagacctatgacttcgacatc 357
FX-K96E-For atcaagcacaaccggttcacaGAGgagacctatgacttcgacatc 358
FX-K236E/R240E-For gtcaccgccttcctcGAGtggatcgacGAGtccatgaaaaccagg 359
FX-K156A-For ggccggcagtccaccaggctcGCCatgctggaggtgccctacgtg 360
FX-K156S-For ggccggcagtccaccaggctcAGCatgctggaggtgccctacgtg 361
FX-E[51]N-For gatggcgaccagtgtAACaccagtccttgccag 362
FX-Q[56]N/Q[58]S-For gagaccagtccttgcAACaacAGCggcaaatgtaaagac 363
FX-Q[58]N/K[60]S-For cagtccttgccagaacAACggcAGCtgtaaagacggcctc 364
FX-K[62]N/G[64]S-For gaaccagggcaaatgtAACgacAGCctcggggaatacacc 365
FX-L[65]N/E[67]S-For caaatgtaaagacggcAACgggAGCtacacctgcacctg 366
FX-E[67]N-For gtaaagacggcctcgggAACtacacctgcacctgtttag 367
FX-L[73]N/G[75]S-For gaatacacctgcacctgtAACgaaAGCttcgaaggcaaaaac 368
FX-G[75]N/E[77]S-For ctgcacctgtttagaaAACttcAGCggcaaaaactgtgaattattc 369
FX-R[86]N/L[88]S-For ctgtgaattattcacaAACaagAGCtgcagcctggacaac 370
FX-T[85]N/K[87]S-For caaaaactgtgaattattcAACcggAGCctctgcagcctggac 371
FX-L[83]N-For ggcaaaaactgtgaaAACttcacacggaagctc 372
FX-E[82]N/F[84]S-For gaaggcaaaaactgtAACttaAGCacacggaagctctgc 373
FX-E[82]S-For gaaggcaaaaactgtAGCttattcacacggaag 374
FX-G[78]N/N[80]S-For gtttagaaggattcgaaAACaaaAGCtgtgaattattcacac 375
FX-E[77]N/K[79]S-For ctgtttagaaggattcAACggcAGCaactgtgaattattc 376
FX-D[95]N/D[97]S-For cagcctggacaacgggAACtgtAGCcagttctgccacgag 377
FX-G[114]N-For gtgctcctgcgcccgcAACtacaccctggctgac 378
FX-K[122]S-For ctggctgacaacggcAGCgcctgcattcccacag 379
FX-D[119]N/G[121]S-For gggtacaccctggctAACaacAGCaaggcctgcattccc 380
FX-K23N/G25S-For ggaggccaggaatgcAACgacAGCgagtgtccctggcag 381
FX-E36N/N38S-For gccctgctcatcaatAACgaaAGCgagggtttctgtggtg 382
FX-R63N/K65S-For ctctaccaagccaagAACttcAGCgtgagggtaggggac 383
FX-E84N/E86S-For ggtgaggcggtgcacAACgtgAGCgtggtcatcaagcac 384
FX-T113N/R115S-For ctcaagacccccatcAACttcAGCatgaacgtggcgcctg 385
FX-K134N/G136S-For acgctgatgacgcagAACacgAGCattgtgagcggcttc 386
FX-R202N/K204S-For ggcccgcacgtcaccAACttcAGCgacacctacttcgtg 387
FX-D205N/Y207S-For gtcacccgcttcaagAACaccAGCttcgtgacaggcatc 388
FX-K204N-For cacgtcacccgcttcAACgacacctacttcgtg 389
FX-T244N/G246S-For gacaggtccatgaaaAACaggAGCttgcccaaggccaag 390
FX-R245N/L247S-For aggtccatgaaaaccAACggcAGCcccaaggccaagagc 391
FX-G[114]N+D[119]N/G[121]S-For gtgctcctgcgcccgcAACtacaccctggctAACaacAGCaaggcctgcattccc 392
표 16은 키모트립신 넘버링에도 기초하여, 서열번호 134에 기재된 성숙 FX 폴리펩티드에 관한 넘버링을 사용하여 표시된 생성된 FX 변이체를 기재한다. 제공되는 서열번호들은 암호화된 전구체 폴리펩티드 및 목록의 돌연변이들의 성숙 서열에 관한 것이다.
표 16: FX 변이체
돌연변이
(성숙 FX 넘버링)		 돌연변이
(키모트립신 넘버링)		 서열번호
(전구체)		 서열번호
(성숙)
I195L I16L 416 135
V196I V17I 417 136
V196S V17S 418 137
T85N/K87S/V196S T[85]N/K[87]S/V17S 419 138
Q56N/Q58S/V196S Q[56]N/Q[58]S/V17S 420 139
K62N/G64S/V196S K[62]N/G[64]S/V17S 421 140
L65N/E67S/V196S L[65]N/E[67]S/V17S 422 141
E67N/V196S E[67]N/V17S 423 142
L73N/G75S/V196S L[73]N/G[75]S/V17S 424 143
G75N/E77S/V196S G[75]N/E[77]S/V17S 425 144
R86N/L88S/V196S R[86]N/L[88]S/V17S 426 145
G114N/V196S G[114]N/V17S 427 146
D95N/D97S/V196S D[95]N/D[97]S/V17S 428 147
E82S/V196S E[82]S/V17S 429 148
E82N/F84S/V196S E[82]N/F[84]S/V17S 430 149
G78N/N80S/V196S G[78]N/N[80]S/V17S 431 150
E77N/K79S/V196S E[77]N/K[79]S/V17S 432 151
D119N/G121S/V196S D[119]N/G[121]S/V17S 433 152
L83N/V196S L[83]N/V17S 434 153
K122S/V196S K[122]S/V17S 435 154
E51N/V196S E[51]N/V17S 436 155
Q58N/K60S/V196S Q[58]N/K[60]S/V17S 437 156
G114N/D119N/G121S/V196S G[114]N/D[119]N/G[121]S/V17S 438 157
G198A G19A 439 158
G198V G19V 440 159
G198R G19R 441 160
G198K G19K 442 161
G198P G19P 443 162
G198H G19H 444 163
L211S/G219H L32S/G40H 445 164
G197P G18P 446 165
D378N D194N 447 166
D378S D194S 448 167
V196L V17L 449 168
V196T V17T 450 169
V196P V17P 451 170
G197V G18V 452 171
G197T G18T 453 172
G197S G18S 454 173
E200A E21A 455 174
E200S E21S 456 175
E200V E21V 457 176
K202S K23S 458 177
R326A R143A 459 178
R326S R143S 460 179
R326T R143T 461 180
R326V R143V 462 181
R326Q R143Q 463 182
R326N R143N 464 183
R326M R143M 465 184
R326K R143K 466 185
R326Y R143Y 467 186
T327A T144A 468 187
T327L T144L 469 188
S334A S152A 470 189
S334T S152T 471 190
S334N S152N 472 191
R336E R154E 473 192
K338A K156A 474 193
K338S K156S 475 194
K338N K156N 476 195
K338R K156R 477 196
K338V K156V 478 197
K338Y K156Y 479 198
K338M K156M 480 199
T327A/K338A T144A/K156A 481 200
T327L/K338M T144L/K156M 482 201
E200V/T327L/K338M E21V/T144L/K156M 483 202
E200V/T327L/S334A/K338M E21V/T144L/S152A/K156M 484 203
V196S/G197A V17S/G18A 485 204
V196S/L211S/G219H V17S/L32S/G40H 486 205
D119N/G121S/V196S/L211S/G219H D[119]N/G[121]S/V17S/L32S/G40H 487 206
G114N/V196S/L211S/G219H G[114]N/V17S/L32S/G40H 488 207
G114N/D119N/G121S/V196S/L211S/G219H G[114]N/D[119]N/G[121]S/V17S/L32S/G40H 489 208
G197A/L211S/G219H G18A/L32S/G40H 490 209
V196S/G197A/L211S/G219H V17S/G18A/L32S/G40H 491 210
I195L/V196S I16L/V17S 492 211
I195L/G197A I16L/G18A 493 212
I195L/L211S/G219H I16L/L32S/G40H 494 213
V196S/N214D V17S/N35D 495 214
V196S/N214A V17S/N35A 496 215
V196S/N214S V17S/N35S 497 216
V196S/E216R V17S/E37R 498 217
V196S/E216K V17S/E37K 499 218
V196S/E216A V17S/E37A 500 219
V196S/E216S V17S/E37S 501 220
V196S/E218R V17S/E39R 502 221
V196S/E218K V17S/E39K 503 222
V196S/E218A V17S/E39A 504 223
V196S/R332A V17S/R150A 505 224
V196S/R332D V17S/R150D 506 225
V196S/R332E V17S/R150E 507 226
V196S/R332S V17S/R150S 508 227
V196S/R332G V17S/R150G 509 228
V196S/R326E V17S/R143E 510 229
V196S/R326D V17S/R143D 511 230
V196S/R326M V17S/R143M 512 231
V196S/R326N V17S/R143N 513 232
V196S/R326Q V17S/R143Q 514 233
V196S/R273E V17S/R93E 515 234
V196S/R273A V17S/R93A 516 235
V196S/R424A V17S/R240A 517 236
V196S/R424E V17S/R240E 518 237
V196S/K420A V17S/K236A 519 238
V196S/K420E V17S/K236E 520 239
V196S/R306E V17S/R125A 521 240
V196S/K276A V17S/K96A 522 241
V196S/K276E V17S/K96E 523 242
V196S/K420E/R424E V17S/K236E/R240E 524 243
V196S/R273E/K420E/R424E V17S/R93E/K236E/R240E 525 244
V196S/R273E/R306E/K420E/R424E V17S/R93E/R125E/K236E/R240E 526 245
V196S/K338A V17S/K156A 527 246
V196S/K338S V17S/K156S 528 247
V196S/E215N/N217S V17S/E36N/N38S 529 248
V196S/E264N/E266S V17S/E84N/E86S 530 249
D119N/G121S/V196S/E264N/E266S D[119]N/G[121]S/V17S/E84N/E86S 531 250
G114N/V196S/E264N/E266S G[114]N/V17S/E84N/E86S 532 251
V196S/R429N/L431S V17S/R245N/L247S 533 252
V196S/R243N/K245S V17S/R63N/K65S 534 253
V196S/T293N/R295S V17S/T113N/R115S 535 254
V196S/D389N/Y391S V17S/D205N/Y207S 536 255
V196S/K388N V17S/K204N 537 256
D119N/G121S/V196S/K388N D[119]N/G[121]S/V17S/K204N 538 257
V196S/T428N/G430S V17S/T244N/G246S 539 258
V196S/L211S/G219H/E264N/E266S V17S/L32S/G40H/E84N/E86S 540 259
D119N/G121S/V196S/L211S/G219H/E264N/E266S D[119]N/G[121]S/V17S/L32S/G40H/E84N/E86S 541 260
G114N/V196S/L211S/G219H/E264N/E266S G[114]N/V17S/L32S/G40H/E84N/E86S 542 261
V196S/E264N/E266S/K388N V17S/E84N/E86S/K204N 543 262
D119N/G121S/V196S/L211S/G219H/K388N D[119]N/G[121]S/V17S/L32S/G40H/K204N 544 263
G114N/V196S/L211S/G219H/K388N G[114]N/V17S/L32S/G40H/K204N 545 264
V196S/L211S/G219H/E264N/E266S/K388N V17S/L32S/G40H/E84N/E86S/K204N 546 265
실시예 2
FX 폴리펩티드의 발현, 정제 및 활성화
A. FX 폴리펩티드의 발현 및 정제
야생형 및 변이체 FX 폴리펩티드를 CHO-발현(CHOX) 세포(Excellgene)에서 발현시켰다. CHO Express (CHOX) 세포는 DM204B 완전 배지(Irvine Scientific)에서 유지시켰고, 생산 종균 배양(production seed culture)을 접종하기 위하여 사용하였다. 형질감염은 WAVE 생물반응기(GE Healthcase)에서 수행하였다. 20 L의 웨이브 백(wave bags)을 1.2×106 vc/mL 의 파종 밀도로 4.6 L의 DM204B 완전 배지와 함께 약 400 mL의 종균배양배지에 접종하였다. WAVE 생물반응기는 세포가 3일 후에 13-16×106 vc/mL의 세포 밀도에 도달하도록 하기 위하여 37.1℃에서 24 rpm의 흔들림 속도 및 6도의 흔들림 각도로 설정하였다. FX 플라스미드 DNA 16 mg과 PEI (폴리에틸렌이민) 102.5 mg을 결합하여 형질감염 복합체를 형성하였고, 상기 형질감염 복합체는 초기 파종 3일 후 WAVE 생물반응기 상에 배양배지를 가하기 전에 TfMAX2 5.0 L로 희석하였다. TfMAX 배지가 첨가된 형질감염 복합체를 웨이브 백(wave bag)에 첨가하였다. 배양배지는 조 FX 용해물을 수확하기 전 4일동안 발현시켰다. 수확을 위하여, 웨이브 백(wave bag)의 내용물들을 4℃에서 3시간 동안 두었다. 배양배지 상청액을 CUNO 깊이 필터를 통하여 수확하였고, 이어서 FX 정제를 하였다.
FX 폴리펩티드는 Q Fast Flow 컬럼(GE Healthcare)를 사용하여, 기능성 Gla 도메인을 가진 FX 폴리펩티드가 흡수될 때까지 정제하였고, 이어서 칼슘 용출 단계를 수행하였다. 일반적으로 형질감염된 세포들로부터의 배양배지 상청액은 pH 8.0의 20 mM의 Tris를 함유하는 용액으로 2배 희석하고, 그리고 pH 8.0의 500 mM의 EDTA를 최종 EDTA 농도 1.5 mM에 도달할 때까지 희석 샘플에 가한다. 샘플은 먼저 버퍼 B (20mM Tris pH 8.0, 1M NaCl), 그리고 버퍼 A (20 mM Tris pH 8.0, 0.15 M NaCl)로 미리 균형을 맞춘 Q Fast Flow 컬럼에 로드하기 전에 여과하였다. 샘플을 로드한 후에, 컬럼 통과액의 280 nm에서의 흡광도가 기준치에 도달할 때까지 컬럼을 버퍼 A로 세척하였다. 버퍼 A를 버퍼 C (20 mM Tris pH 8.0, 0.15 M NaCl, 10 mM CaCl2)로 교체하였고, 펌프 세척은 라인에서 버퍼를 완전히 교체하기 위하여 수행하였다. 펌프 세척을 완료한 후, 분획으로 수집된 FX 폴리펩티드를 용출시키기 위하여 버퍼 C를 컬럼에 적용하였다. 용출 후에, 핑크 색소(배양배지로부터)가 컬럼으로부터 씻겨나갈 때까지, 분획들을 수집하면서, 버퍼 B로 컬럼을 세척하였다. 컬럼을 버퍼 A로 세척함으로써, 재사용을 위하여 재평형화시켰다.
용출된 분획은 Source 15Q 컬럼(GE Healthcare)을 사용하여 추가로 정제하였다. FX를 함유하는 상기 버퍼 C로 수집한 분획을 모아서, 최종농도 20 mM가 될 때까지 EDTA를 가하였다. 합쳐진 분획은 50 mM Tris, pH 8.0으로 2배 희석시켰고, 버퍼 D(20 mM Tris pH 8.0, 0.15 M NaCl, 0.01% Tween 20, 2.5 mM CaCl2)로 미리 평형화시킨 Source 15Q 컬럼에 로드시켰다. 로드된 컬럼을 버퍼 D로 세척한 후, 0.15 M NaCl에서 0.5 M NaCl 그래디언트를 컬럼에 적용하였고, 분획을 수집하였다. FX를 함유하는 분획을 모아서 CaCl2를 12.5 mM까지 가하였다.
B. FX 및 FX 변이체의 활성화
FX 지모겐으로부터 활성화 FX (FXa)를 제조하기 위하여, 바이오틴과 미리 컨쥬게이트된 mL 당 10.1 ㎍의 Russell's Viper Venom FX Activator (Haematologic Technologies)를 실시예 2A에서 제조한 모아진 분획에 첨가하였다. 활성화 반응은 1.5 시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였고, pH 6의 20 mM MES 중에서 1:5로 희석하였다. 그리고나서 Russell's Viper Venom FX Activator를 제거하기 위하여 혼합물을 StrepTrap 컬럼(GE Healthcare)에 적용하였다.
마지막으로, 비활성화 FX를 헤파린 HP 크로마토그래피에 의해 활성화 FXa로부터 분리하였다. StrepTrap 컬럼으로부터의 컬럼 통과액은 헤파린 HP 컬럼(GE Healthcare)에 바로 적용하였고, 상기 헤파린 HP 컬럼은 미리 버퍼 E(20 mM MES, pH 6.0, 50 mM NaCl)로 평형화시켰었다. pH 6.0. 20 mM MES에서 0.1 내지 0.7 M NaCl의 선형 그래디언트를 컬럼에 적용하였고, 분획을 수집하였다. 활성 FXa를 함유하는 분획을 모았고, 버퍼를 디아필트레이션(diafiltration)에 의해 5 mM MES, pH 6.0, 100 mM NaCl로 교환하였다.
실시예 3
스톡 용액(Stock Solution) 중 촉매적 활성 프로테아제(FXa) 농도의 확인
FXa 또는 FXa 변이체의 스톡 용액에서 인자 Xa (FXa)의 촉매적 활성 농도의 확인은 트립신-유사 세린 프로테아제들을 위한 활성 부위 적정제로 개발된 플루오로제닉 에스터 기질인, 플루오레세인-모노-p'-구아니디노벤조에이트(FMGB)와 함께 스톡 프로테아제 샘플의 적정으로 수행하였다. 일부 예에서, 활성 FXa 또는 FXa 변이체의 농도는 또한 야생형 FXa에 대한 피코몰랄 K i를 가지는 대장균(Escherichia coli)로부터의 천연 밀접-결합(tight-binding) 가역적 저해제인, 에코틴을 이용한 적정으로 확인하였다(Seymour et al. (1994) Biochemistry 33:3949-3958). FMGB 적정이 불가능한 FXa 변이체 서브셋에 대해서는 아래 기술된 바와 같이 에코틴 적정이 효과적이었다.
A. 활성부위 적정제 플루오레세인-모노-p'-구아니디노벤조에이트(FMGB)를 사용한 FXa의 활성부위 적정
FXa 스톡 용액 중 촉매적 활성 인자 X (FXa)의 농도는 플루오로제닉 에스터 기질 플루오레세인-모노-p'-구아니디노벤조에이트(FMGB)를 사용하여 Bock 등(Archives of Biochemistry and Biophysics (1989) 273:375-388)에 기술된 적정검정의 변형 버전으로 확인하였다. FMGB의 농도가 포화이고, 촉매작용에 대하여 탈아실화가 특히 느리고 속도 제한인 조건 하에서 실질적으로 안정한 아실-효소 중간체를 형성하기 위하여, FMGB는 FXa와 쉽게 반응하지만, FX 또는 불활성 프로테아제와는 반응하지 않는다. 이러한 조건 하에서, FXa 프로테아제는 플루오레세인 형광단(fluorophore)을 방출하기 위하여 단일한 촉매전도(catalytic turnover)를 겪는다. 형광 발광(fluorescence)의 초기 방출을 플루오레세인 형광 발광의 외부 농도 표준 곡선으로 보정하면, 활성부위 농도를 계산할 수 있다.
Bock 등에 원래 기술된 검정법의 변형은 1) FXa에 대한 보조인자의 포화량의 포함, 2) 인자 Va (혈장 정제 FVa, Heamatologic Technologies) 및 고농도의 포스포리피드(75% 포스파티딜콜린(PC)/25% 포스파티딜세린(PS); PC/PS 베지클 직경 ~120 mm; Aventi Polar Lipids)의 첨가 및 3) 증가된 FMGB의 농도이다.
FVa 및 PC/PS 베지클의 부재하에, 증명된 증가된 보조인자 의존성을 가진 FXa 변이체는 FMGB 에스터 기질과 거의 반응하지 않거나, 반응하지 않았다. 그러므로, 이러한 변형은 높은 수준의 보조인자 의존성으로 조작된 FXa 변이체의 최대 촉매 활성을 입증하기 위하여 요구된다(실시예 4A 참고).
반응 부피의 최소화와 및 샘플 처리량의 증가를 위해서 96-웰 플레이트 포맷에 대한 검정법을 변형하기 위한 추가적인 수정이 이루어졌다(플레이트당 최대 18개 샘플). 활성부위 적정 검정은 96-웰 블랙 하프-면적 플레이트(Costar # 3694)에서 최종 50 ㎕의 반응 부피로 수행하였다. 현 방법은 10 ~ 100 μM 범위의 스톡 용액에서의 FXa 프로테아제 변이체의 활성부위 적정을 위해 최적화되었다. 상기 범위 외로 추측되는 농도를 가진 프로테아제 스톡에 대해서는, 농축 또는 초기 희석 단계가 필요하였다. 최종 반응물은 1 μM FVa 및 240 μM PC/PS 포스포리피드를 함유하는 1×버퍼 A (50 mM Hepes-NaOH, 50 mM NaCl, 5 mM CaCl2 및 0.1% BSA, pH 7.4) 중에 각 FXa 변이체 ~300-650 nM 및 FMGB 10, 50 또는 75 μM룰 함유하였다. FMGB의 실시 용액은 건조 중량에 기초하여 DMF 중 5 mM FMGB의 스톡 농도로부터 2× 농도로 버퍼 A(20-150 μM)에서 제조하였고, 상기 농도는 인산염 완충 생리식염수(PBS), pH 7.2 중 19,498 M-1cm-1의 흡광계수를 사용하여 452 nm에서 흡광 분광기에 의하여 확인하였다.
활성부위 적정 검정은 다음과 같이 준비하였다: FXa 변이체를 2×FVa 및 PC/PS 베지클(2 μM 및 480 μM, 각각)을 함유하는 1×버퍼 A 중 0.6 ~ 1.3 μM로 희석하였고, 96-웰 블랙 하프-면적 검정 플레이트의 이중 웰 중에서 25 μL 부피로 소분하였다. 반응은 1×버퍼 A 중에 FMGB (20 ~ 150 μM)의 2× 실시용액 25 μL의 첨가로 개시하였다. 반응의 방출 단계에서 플루오레세인 형광 발광의 방출은 매 30초마다 180분 동안, 485 nm의 여기 및 535 nm의 방출로 Envision 마이크로플레이트 리더(Perkin Elmer)를 사용하여 측정하였다.
활성 FXa에 의한 FMGBdml 이어지는 촉매작용으로 방출된 플루오레세인의 화학양론적 양은 1 μM FVa 및 240 μM PC/PS 포스포리피드를 함유한 1×버퍼 A에서 자유 플루오레세인의 표준 곡선을 사용하여 확인하였다. 플루오레세인 표준 용액은 0.1 N NaOH 중 흡광계수 89,125 M-1cm-1를 사용하여 496 nm의 표준 조건하에 흡광 분광기로 확인한 FMGB의 정확한 농도로 DMF 중 ~ 70 ~150 mM의 스톡 용액으로부터 신선하게 제조하였다. 자유 플루오레세인의 표준 곡선은 0 에서 2.5 μM 범위의 FMGB와 함께 1 μM FVa 및 240 μM PC/PS 포스포리피드를 함유하는 1×버퍼 A로 표준 연속 희석으로 준비하였다. 데이타 분석을 위하여, 반응 경로는 Envision 소프트웨어 패키지(Perkin Elmer)로부터 텍스트 파일로 전송하였고 이어서 비-선형 데이타 분석을 마이크로소프트 엑셀 스프레트시트(IDBS software) 환경 내에서 자동 곡선 맞춤과 통계적 분석을 위한 소프트웨어 패키지인 XLfit4로 수행하였다. 배경 FMGB 가수분해 기여도는 FXa가 가해지지 않은 대조군 웰들의 세트를 사용하여 실험적 반응 경로로부터 확인하고 뺐다. 일반적으로 배경 FMGB 가수분해는 총 관찰된 형광 발광 방출의 5% 미만이었다. 보정된 곡선은 선형 요소(탈아실화의 느린 속도를 설명하는)를 가진 단일 지수 방정식에 적합했다: Δ형광 발광 = Y0 + Amp*(1 - exp(-k obs*(X - X0))) + slope*( X - X0)
여기서 파라메터 X 및 X0 = 반응 종결 및 개시 시간, Y0 = 검정 시스템에서 배경 형광 발광을 차지하는 오프셋, Amp = 상술한 포화 검정 조건 하의 방출 단계의 진폭, K obs 는 아실-효소 형성에 대하여 관찰된 일차 반응속도 상수이고, slope(슬로프)는 프로테아제에 의한 FMGB의 완전한 턴오버와 연관된 벌크 반응속도 상수이다. 반응에서 활성 FXa 프로테아제의 농도는 진폭(Amp)에 대한 핏 파라메타의 플루오레세인 표준 곡선에 대한 비교로 계산하였다. 이중 검정에 따른 값을 평균화하고, 표준편차를 확인하였다. 스톡 제제에서 활성 FXa의 농도는 계산된 검정 농도로부터 확인하였고, 검정에 사용된 희석 정도로 조정하였다.
B. 밀접-결합 저해제를 사용한 FXa 활성부위 적정
FMGB 적정이 불가능 할 때, FXa 스톡 용액 중 촉매적 활성 인자 Xa 또는 FXa 변이체의 농도는 대장균(Escherichia coli)으로부터의 FXa 밀접-결합 가역적 저해제인 에코틴의 공지된 양으로 적정하여 확인하였다.
상업적으로 이용가능한 제제(Molecular Innovations, Inc.) 중 활성 에코틴의 농도는 상업적 E. coli 에코틴 제제와 함께 재조합 인간 트립신(rh-Trypsin, Polymun Scientific)의 공지된 농도로 적정함으로써 확인하였다. 적정은 최종 농도 100 nM 활성부위 적정된 rh-트립신 및 0 ~ 200 nM 에코틴의 단계적 용량을 사용하여 2.0 mL 부피의 1×버퍼 B(20 mM Hepes, 150 mM NaCl, 5 mM CaCl2, 0.1% PEG 8000)에서 수행하였다. 96-웰 딥-웰 폴리프로필렌 플레이트에서 상온에서 60분 인큐베이션한 후, 2.0 mL를 깨끗한 석영 큐벳(10 mm × 10 mm)으로 옮겼다. FMGB를 최종 농도 5 μM(5.3 mM 스톡용액에서 1.9 μL/2.0 mL)까지 첨가하였고, 잔여 활성 rh-트립신은 FMGB 방출로부터 확인하였다. 데이타는 에코틴 각 용량에 대한 방출 안정기 50초 이상으로 통합하였고, ΔFobs/ΔFmax,로 전환하였는데, 여기서 ΔFmax는 저해제의 부재하에 rh-트립신 방출의 총 증폭이고, ΔFobs는 저해제 존재하에 방출 증폭이다. 활성 저해제의 실시 농도는 이어서 완전한 저해 및 반응 중 활성 rh-트립신의 공지된 양에서 외삽 X-인터셉트로부터 확인하였다.
에코틴 활성부위 적정 반응은 0.1% BSA로 보충된 1×버퍼 B 중 2× 농도(400 nM ~ 0 nM)에서 에코틴의 1.33배 희석 시리즈(150 μL 에서 50 μL)를 제조함으로써 수행하였다. FXa 또는 FXa 변이체 프로테아제 샘플들은 2×실시 농도(400 nM)로 희석하였고, 50 μL를 6-웰 폴리프로필렌 검정 플레이트의 이중 웰로 소분하였다. 반응은 50 μL의 2×에코틴 12-포인트 희석 시리즈를 100 μL(50 μL + 50 μL)의 반응부피 중 200 nM ~ 0 nM의 에코틴 최종 농도까지 가하여 개시하였다.
저해 반응물은 플루오로제닉 기질, Pefafluor Xa (CH3SO2-D-CHA-Gly-Arg-AMC, Centerchem)과 함께 FXa 또는 FXa 변이체의 잔기 활성을 읽기 전에 상온(~25℃)에서 120분 동안 인큐베이션 하였다. 펩티드 기질에 대한 높은 활성을 가진 야생형 FXa 및 FXa 변이체는 허용될 수 있는 범위의 반응 속도를 얻기 위하여 0.1% BSA 버퍼로 보충된 1×버퍼 B의 최종 75 μL 부피로 10 내지 100배 희석하였다. 펩티드 기질에 대한 낮은 활성을 가진 FXa 변이체들은 희석하지 않고 테스트하였다. 희석하거나 또는 희석하지 않은 샘플들 75 μL를 96-웰 블랙 검정 플레이트로 옮기고, 25 μL의 0.4 mM (0.1 mM 최종) Pefafluor Xa를 가하였다. 반응의 초기 속도는 15 ~ 60분 동안 25℃에서 측정하였다. 희석 변화에 따른 모든 해리(dissociation)는 속도 측정 동안 무시할만한 정도인 것으로 추정되었고, 따라서 인큐베이션 농도가 이후 데이타 분석에서의 저해제 및 프로테아제에 사용될 최종 농도였다.
저해제 부재하의 반응속도(V0)에 대한 저해제 존재하의 반응속도(Vi) 비율은 프로테아제의 고정 농도에서 저해제(에코틴)의 각 농도로 확인하였다. Vi/V0 비율을 표시하였고, 결과로 얻어진 적정 곡선을 Prism 소프트웨어 패키지(Graphpad Software)의 발현 방정식(1)으로 검정하였다. 분석은 저해제/프로테아제 화학양론이 n=1인 것을 가정하고 수행하였다.
방정식 (1):
Vi/V0 = Y-Intercept+slope*[ecotin]
방정식 (1)로부터 추론되는, X-Intercept의 핏(fit) 값은 스톡 FXa 용액 중 활성부위 적정(AST) 농도를 확인하는데 사용하였고, 프로테아제 총 농도로 추정되는 "분획 활성" 값은 공지되었고, 에코틴은 방정식 (2)를 사용한 용량 반응 곡선을 생성하는데 사용된 농도에서 활성이었다. 에코틴 농도를 증가시키기 위한 활성의 선형 손실(0% ~ 90%)에 의해 정의된 값들만을 검정하였다.
방정식 (2):
([X-Intercept]fit-value/[FXa]assay)*[FXa]total protein = [FXa]Ecotin-AST
실시예 4
기질, 프로트롬빈(FII)에 대한 FXa의 촉매 활성의 확인
기질, 프로트롬빈(FII)에 대한 FXa 및 FXa 변이체의 촉매적 활성은 혈장 정제 FXa 및 포스포리피드의 존재(보조인자-의존성) 및 부재(보조인자-독립성) 하에 검정하였다. 각각의 촉매 활성은 플루오로제닉 검정을 사용하여 간접적으로 검정하였는데, 여기서 합성 기질 Pefafluor TH (H-D-CHA-Ala-Arg-AMC; Centerchem)의 트롬빈(FIIa)-매개 절단에 의해 생성된 형광 발광이 트롬빈(FIIa)을 생성하기 위한 프로트롬빈(FII)의 FXa 절단을 검정하기 위하여 사용되었다.
프로트롬빈 농도의 범위는 기질 프로테아제(프로트롬빈)이 보조인자-의존성 검정을 위한 활성화 프로테아제(FXa)의 농도에 대하여 적어도 1000배 이상이고, 변이체 활성에 따른 보조인자-독립성 검정을 위한 활성화 프로테아제(FXa)의 농도에 대하여 적어도 10 내지 1000배 이상이었을 때의 운동속도상수를 계산하기 위하여 사용하였다. 간단하게, 다음 검정은 상온(25℃)에서 30 ~ 60분 코스 동안에 측정된 운동 검정 중, 기질, Pefafluor TH에 대한 트롬빈의 활성을 직접적으로 관찰함으로써, 프로트롬빈분해효소-촉매화된 프로트롬빈 활성화의 운동역학 측정법을 제공한다. FXa/프로트롬빈분해효소 함수(K cat 및 K M)의 운동상수를 확인하기 위하여, 실험은 프로트롬빈의 증가하는 농도(0 내지 8 μM)에서 포스포리피드 베지클(20 μM)을 함유하는 PC/PS 및 인자 Va (20 nM)의 고정 포화량의 존재 또는 부재 하에 인자 Xa의 제한 용량으로 수행하였다. 트롬빈에 의한 Pefafluor TH의 촉매작용에 뒤이은 자유 형광단, AMC (7-아미노-4-메틸쿠마린)의 방출은 반응 과정 중 계속적으로 평가하였고, FXa 변이체의 운동속도상수를 확인하였다.
A. FVa-의존성 검정 프로토콜
FVa (혈장 정제된, Heamatologic Technologies, Inc.) 및 포스포리피드(75% 포스파티딜콜린(PC)/25% 포스파티딜세린(PS; PC/PS 베지클 직경 ~120 nm, Avanti Polar Lipids)의 존재하에 FXa에 의한 프로트롬빈(FII) 활성화의 운동상수를 검정하기 위하여, FXa 변이체들은 전술한 실시예 1 내지 3에서와 같이 발현되고, 정제되고, 활성화되고, 및 활성부위 적정되었다. FXa 변이체들을 2×농도의 FVa (40 nM) 및 PC/PS 베지클(40 μM)을 함유하는 1×버퍼 A (20 mM Hepes/150 mM NaCl/5 mM CaCl2/0.1% BSA/0.1% PEG-8000, pH 7.4)의 2 mL 부피 중에서 2×농도의 0.2 pM으로 연속으로 희석하였다.
5 μM DFP/FPR-cmk 처리된 프로트롬빈(FII) 용액은 0.1 mM Pefafluor TH 기질을 함유하는 1×버퍼 A의 2.0 mL중에서 제조하였다. 이는 테스트된 프로트롬빈의 가장 높은 농도를 나타내는 것이고, 최대 3개의 검정 플레이트를 위한 충분한 부피를 제공하였다. 프로트롬빈/Pefafluor TH 용액은 0.1 mM Pefafluor TH를 함유하는 700 μL의 1×버퍼 A 최종 부피와 함께 12-채널 딥-웰 폴리프로필렌 플레이트에서 연속적으로 1.8배 희석하였고, 그 결과 5000 nM, 2778 nM, 1543 nM, 857 nM, 476 nM, 265 nM, 147 nM, 82 nM, 45 nM, 25 nM, 14 nM 및 0 nM 프로트롬빈의 최종 희석액을 얻었다. 각 프로트롬빈 희석 시리즈의 총 25 μL는 최대 세 개의 96-웰 블랙 하프-면적 검정 플레이트에 소분하였다. 검정 반응은 25 μL의 프로트롬빈분해효소 용액(FXa/FVa/포스포리피드/Ca2+)를 미리 정해진 플레이트 맵(4FXa 변이체/플레이트)에 따라 25 μL는의 프로트롬빈 희석 시리즈를 함유하는 세 개의 검정 플레이트로 나누기 위하여 일반적으로 BioMek FX 액체 조작 시스템 또는 12-채널 마이크로피펫을 사용하여 개시하였다.
검정 중 시약의 최종 농도는 다음과 같았다: 0.1 pM FXa, 20 nM FVa, 20 μM PC/PS 베지클, 50 μM Pefafluor TH, 및 0 nM 내지 2500 nM의 프로트롬빈(FH) 희석액. 반응은 25℃에서 30분 동안 SpectraMax 형광발광 플레이트 리더기로 모니터링하였다. 자유 AMC의 표준 곡선은 0 μM 에서 100 μM AMC를 커버하는 용량 범위를 사용하여 데이타 분석 계산에서 RFU의 μM로의 환산 계수의 역할을 하였다.
B. FVa-독립성 검정 프로토콜
FVa는 부재하이지만, 포스포리피드(75% 포스파티딜콜린(PC)/25% 포스파티딜세린(PS); PC/PS 베지클 직경 ~120 nm; Avanti Polar Lipids)의 존재하에서, FXa에 의한 프로트롬빈(FII)의 활성화의 운동상수를 검정하기 위하여, FXa 변이체들은 상술한 실시예 1 내지 3에서와 같이 발현되고, 정제되고, 활성화되고, 및 활성부위 적정되었다. FXa 변이체들을 2×농도의 PC/PS 베지클(40 μM)을 함유하는 1×버퍼 A의 2 mL 부피 중에서 2×농도의 20 pM (야생형) 또는 1 nM ~ 4 nM (FXa 변이체를 위한)으로 연속으로 희석하였다. 8 μM DFP/FPR-cmk 처리된 프로트롬빈(FII) 용액은 0.1 mM Pefafluor TH 기질을 함유하는 1×버퍼 A의 2.0 mL중에서 제조하였다. 이는 테스트된 프로트롬빈의 가장 높은 농도를 나타내는 것이고, 최대 3개의 검정 플레이트를 위한 충분한 부피를 제공하였다. 프로트롬빈/Pefafluor TH 용액은 0.1 mM Pefafluor TH를 함유하는 700 μL의 1×버퍼 A 최종 부피와 함께 12-채널 딥-웰 폴리프로필렌 플레이트에서 연속적으로 1.8배 희석하였고, 그 결과 8000 nM, 4444 nM, 2469 nM, 1372 nM, 762 nM, 423 nM, 235 nM, 131 nM, 73 nM, 40 nM, 22 nM 및 0 nM 프로트롬빈의 최종 희석액을 얻었다. 각 프로트롬빈 희석 시리즈의 총 25 μL는 최대 세 개의 96-웰 블랙 하프-면적 검정 플레이트에 소분하였다. 검정 반응은 25 μL의 프로트롬빈분해효소 용액(FXa/FVa/포스포리피드/Ca2+)을 미리 정해진 플레이트 맵(4FXa 변이체/플레이트)에 따라 25 μL의 프로트롬빈을 함유하는 세 개의 검정 플레이트로 나누기 위하여 일반적으로 BioMek FX 액체 조작 시스템 또는 12-채널 마이크로피펫을 사용하여 개시하였다.
검정 중 시약의 최종 농도는 다음과 같았다: 10 pM FXa 또는 0.5 ~ 2 nM FXa 변이체, 20 μM PC/PS 베지클, 50 μM Pefafluor TH, 및 0 nM 내지 4000 nM의 프로트롬빈(FH) 희석액. 반응은 25℃에서 30분 동안 SpectraMax 형광발광 플레이트 리더기로 모니터링하였다. 자유 AMC의 표준 곡선은 0 μM 에서 100 μM AMC를 커버하는 용량 범위를 사용하여 데이타 분석 계산에서 RFU의 μM로의 환산 계수의 역할을 하였다.
C. 데이타 분석
FXa에 의한 프로트롬빈(FII)의 촉매작용의 정상상태 운동역학을 확인하기 위하여 사용된 모든 방정식은 Petersen 등의 (1985) Biochem. J. 225:149-158의 "Zymogen-Activation Kinetics: Moldulatory effects of trans-4-(aminomethyl)cyclohexane-1-carboxylic acid and poly-D-lysine on plasminogen activation" 의 참고자료에 기재된 내용을 바탕으로 하였다. 구조도 A에 기술된 시스템의 정상상태 운동역학 이론은 생산물의 포물선 축적을 표시한 방정식 (3)의 표현으로 기술하였다.
구조도 A:
Figure pct00001
방정식 (3)
Figure pct00002
구조도 A의 메커니즘에 따르면, a0는 활성화 프로테아제(FXa)의 농도이고, z0은 지모겐(FII)의 농도이고, k a 및 K z 는 지모겐의 활성 효소(FIIa)로의 활성제-촉매화된 전환을 위한 k cat 및 K M 나타내고, 한편 k e 및 K s 는 주어진 시간 t 동안 FIIa에 의한 기질의 결과물로의 전환을 위한 k cat 및 K M 을 나타낸다.
진전 곡선(progress curve)의 분석을 위하여, 플루오로제닉 기질의 프로트롬빈 가수분해의 정상상태 운동역학이 독립적으로 확인되도록 방정식(3)을 방정식 (4)의 형태로 재구성하였으며, 화합물 상수 k 2 로 치환하였다.
방정식 (4)
Figure pct00003
1×버퍼 A 중 Pefafluor에 대한 트롬빈(FIIa)의 활성은 K M 이 5.7 μM를 가지고, k cat 값이 40.4 s-1을 가지는 것으로 독립적으로 확인하였다. 이들 값의 방정식 (5)로의 치환은 36.6 s-1의 k 2 보정인자를 제공하였다.
방정식 (5)
Figure pct00004
FXa 촉매 활성 정도를 확인하기 위하여, SoftMax Pro application (Molecular Devices)로 수집한 미가공 데이터를 텍스트 파일로 전송하였다. 추가적인 비-선형 데이타 분석은 XE Runner 데이타 분석 모듈(IDBS Software)을 사용한 ActivityBase 소프트웨어 패키지 내에서 직접 수행하였다. 각 프로트롬빈 농도에서 테스트한 FXa 변이체의 포물선 반응 속도(μM/sec2)가 Vmax 및 K M 에 대한 핏(fit) 값을 내기 위하여 방정식 (6)으로 주어진 표준 직사각형 쌍곡선(즉, Michelis Menten 방정식)의 함수에 자동적으로 맞도록 스프레드시트 주형을 설정하였다.
방정식 (6)
Figure pct00005
테스트한 FXa의 kcat 값은 방정식 (7)에 의하여 Vmax((μM/sec2)에 대한 핏(fit) 값으로부터 계산하였다.
방정식 (7)
Figure pct00006
k cat /K M 특이상수는 K M 핏(fit) 값 및 상기 방정식 (7)의 검정으로부터 발생한 계산된 k cat 으로부터 직접 계산하였다.
D. 결과
아래 표 17 내지 18은 촉매 활성을 계산하기 위하여 사용한 운동역학 파라메터를 기재하고, 표 19는 FXa 보조인자(FVa)의 존재 및 부재 중 검정한 FXa 변이체 각각을 기재한다. 재조합 야생형 FXa (FXa WT으로 표시) 및 혈장 정제된 FXa (Haematologic Technologies, Inc) 뿐아니라, 각 FXa 변이체에 대한, Michaelis-Menten의 핏(fit) 값, K M 및 계산된 촉매 반응 상수, K cat 는 각각, 표 17 및 18에 제공한다. 표 17 및 18은 또한 표준 편차(S.D.), 변동계수(퍼센트로; %CV) 및 KM 및 k cat 운동역학 파라메터를 위해 수행된 검정 수를 제공한다. 각 운동역학 파라메터는 FXa 보조인자, FVa의 존재 및 부재하에 FXa 돌연변이에 대하여 확인하였다.
표 18에 기재된 FXa 폴리펩티드에 대한 계산된 k cat 값은, 촉매 활성, k cat /K M (M-1s-1)에 대한 운동 상수를 생성하기 위하여 표 17에 기재된 K M 핏(fit) 값으로 나누었다. FXa 돌연변이의 촉매활성은 촉매 활성 상수, 및 야생형 FXa의 활성 퍼센트와 같이 표 19에 기재하였다. 또한, 표 19에는 상대적 보조인자 의존성을 나타내었는데(좌측 컬럼), 여기서 상기 보조인자 의존성은 FVa (FVa-독립적 촉매 활성) 부재하의 촉매 활성(k cat /K M )으로 나누어진 FVa (FVa-의존적 촉매 활성)의 존재하의 촉매 활성(k cat /K M )의 비율로 정의하였다.
FXa 변이체 활성이 야생형 FXa (WT k cat /K M 의 %)에 비교될 때, 이는 활성의 모든 차이점이 돌연변이(들)의 결과인 것이고, 차이점, 예를 들어 다른 발현 시스템에 관련된 번역후 변형의 결과인 것이 아니라는 점을 확실히 하기 위하여 변이체 FXa 폴리펩티드를 위해 사용된 바와 동일한 조건을 사용하여 발현되고 정제된 재조합 야생형 FXa 폴리펩티드(FXa WT)와 비교되는 것이었다. 그러므로, 비교를 위하여 사용한 야생형 FXa 폴리펩티드는 FX 유전자를 클로닝하는 것으로부터 생성된 재조합 야생형 FXa였고, 상기 FX 유전자의 서열은 서열번호 1에 기재되어 있으며, 아미노산 서열이 실시예 2에 기재된 바와 같이, 서열번호 134의 아미노산 1-139 및 195-448에 기재된 폴리펩티드로서 CHO 세포로부터 발현되었다.
FXa 변이체의 관찰된 촉매 활성(표 19의 k cat /K M )은 몇몇 변이체(예를 들어, FXa-G197P, FXa-G198A, FXa-D378N 및 FXa-I195L/V196S)에서 거의 관찰되기 어려운 프로트롬빈분해효소 활성에서부터 야생형 FXa (예를 들어, FXa-L65N/E67S/V196S, FXa-R236V, FXa-V196S 및 FXa-L211S/G219H)과 비교하여 프로트롬빈(FII)의 활성화에 대한 k cat /K M 의 경미한 증가에 이르렀다. 일부 변이체들은 FXa-V196S, FXa-K338S, FXa-I195L, FXa-G197S 및 이들의 조합, 예를 들어 FXa-V196S/K338S, FXa-V196S/R326M, FXa-V196S/R326N, FXa-V196S/K276E 및 FXa-V196S/R332G와 같은 조합을 포함하여, 야생형 FXa와 비교하여 현저하게 증가된 보조인자 의존성을 나타내었다. 관찰된 증가된 보조인자 의존성은 주로 FVa의 부재에서 FXa 변이체 활성의 감소에 따른 것이었으나, 일부 변이체들은 또한 보조인자의 부재 하에서 더 낮은 기질 친화성을 보여주었고, FVa-의존성 검정에서 3 내지 5배 더 낮은 K M 값을 증명하였다(표 17).
단일 또는 여러 개의 추가적인 글리코실화 부위를 제공하기 위하여 변이된 일부 FXa 변이체들은, 야생형 활성(예를 들어, FXa-E82N/F84S/V196S, FXa-G114N/V196S/E264N/E266S, FXa-V196S/E264N/E266S/K388N 및 FXa-G114N/V196S/L211S/G219H)에 근접한 것을 증명하였으나; 다른 변이체들은 감소된 촉매 활성을 보여주었다.
표 17. FXa 돌연변이에 대한 KM의 핏 값(Fit value)
돌연변이
(성숙 FX 넘버링)		 돌연변이
(키모트립신 넘버링)		 FVa 존재 FVa 없음
KM (nM) S.D. (nM) %CV n KM (nM) S.D. (nM) %CV n
혈장 FXa 혈장 FXa 146.0 49.9 34% 120 145.5 44.4 31% 100
FX WT FX WT 165.2 78.0 47% 38 127.9 22.0 17% 16
I195L I16L 101.8 41.5 41% 28 145.6 63.5 44% 10
V196I V17I 129.5 3.1 2% 2 136.7 11.0 8% 2
V196S V17S 78.2 22.0 28% 47 252.5 185.5 73% 25
T85N/K87S/V196S T[85]N/K[87]S/V17S 38.6 3.1 8% 3 499.5 334.2 67% 3
Q56N/Q58S/V196S Q[56]N/Q[58]S/V17S 76.9 29.9 39% 3 384.8 352.7 92% 3
K62N/G64S/V196S K[62]N/G[64]S/V17S 109.7 16.5 15% 2 461.8 360.4 78% 3
L65N/E67S/V196S L[65]N/E[67]S/V17S 60.8 13.4 22% 2 977.7 766.2 78% 3
E67N/V196S E[67]N/V17S 107.4 29.2 27% 3 713.2 34.2 5% 2
L73N/G75S/V196S L[73]N/G[75]S/V17S 66.7 13.8 21% 3 645.7 502.7 78% 3
G75N/E77S/V196S G[75]N/E[77]S/V17S 63.7 20.7 33% 2 305.5 209.9 69% 3
R86N/L88S/V196S R[86]N/L[88]S/V17S 98.7 22.2 22% 3 105.1 41.8 40% 3
G114N/V196S G[114]N/V17S 113.4 39.1 34% 6 1310.5 976.3 75% 4
D95N/D97S/V196S D[95]N/D[97]S/V17S 53.6 18.7 35% 4 1422.5 534.3 38% 4
E82S/V196S E[82]S/V17S 48.5 12.3 25% 9 194.1 110.0 57% 10
E82N/F84S/V196S E[82]N/F[84]S/V17S 70.6 19.7 28% 2 593.9 198.7 33% 5
G78N/N80S/V196S G[78]N/N[80]S/V17S 53.7 17.2 32% 4 443.0 457.1 103% 5
E77N/K79S/V196S E[77]N/K[79]S/V17S 88.9 33.1 37% 4 398.2 173.4 44% 4
D119N/G121S/V196S D[119]N/G[121]S/V17S 108.5 24.7 23% 4 748.9 526.4 70% 4
L83N/V196S L[83]N/V17S 78.5 26.5 34% 4 266.2 74.8 28% 3
K122S/V196S K[122]S/V17S 134.1 32.4 24% 6 978.3 383.3 39% 5
E51N/V196S E[51]N/V17S 118.6 18.9 16% 2 959.7 278.1 29% 2
Q58N/K60S/V196S Q[58]N/K[60]S/V17S 97.9 10.9 11% 2 911.0 215.4 24% 2
G114N/D119N/G121S/V196S G[114]N/D[119]N/G[121]S/V17S 54.9 15.6 28% 4 92.0 25.0 27% 4
G198A G19A 활성없음 n.d. n.d. 0 n.d. n.d. n.d. 0
G198V G19V 활성없음 n.d. n.d. 0 n.d. n.d. n.d. 0
G198R G19R 활성없음 n.d. n.d. 0 n.d. n.d. n.d. 0
G198K G19K 활성없음 n.d. n.d. 0 n.d. n.d. n.d. 0
G198P G19P 활성없음 n.d. n.d. 0 n.d. n.d. n.d. 0
G198H G19H 활성없음 n.d. n.d. 0 n.d. n.d. n.d. 0
L211S/G219H L32S/G40H 11.7 18% 2 112.1 7.1 6% 2
G197P G18P 활성없음 n.d. n.d. 0 n.d. n.d. n.d. 0
D378N D194N 활성없음 n.d. n.d. 0 n.d. n.d. n.d. 0
D378S D194S 활성없음 n.d. n.d. 0 n.d. n.d. n.d. 0
V196L V17L 107.9 11.4 11% 2 137.1 42.9 31% 2
V196T V17T 116.4 11.5 10% 2 138.8 13.8 10% 2
V196P V17P 활성없음 n.d. n.d. 0 n.d. n.d. n.d. 0
G197V G18V 활성없음 n.d. n.d. 0 n.d. n.d. n.d. 0
G197T G18T 활성없음 n.d. n.d. 0 n.d. n.d. n.d. 0
G197S G18S 103.4 4.0 4% 2 153.9 11.6 8% 2
E200A E21A 116.8 5.6 5% 2 158.9 11.9 7% 2
E200S E21S 157.3 14.5 9% 2 124.1 46.1 37% 2
E200V E21V 127.7 6.9 5% 2 158.8 22.7 14% 2
K202S K23S 105.5 1.4 1% 2 152.4 28.9 19% 2
R326A R143A 119.8 25.5 21% 2 143.2 46.2 32% 2
R326S R143S 101.2 10.2 10% 2 136.9 82.7 60% 2
R326T R143T 81.3 1.4 2% 2 142.0 87.1 61% 2
R326V R143V 63.0 22.1 35% 2 193.5 38.8 20% 2
R326Q R143Q 69.4 9.1 13% 2 143.1 86.1 60% 2
R326N R143N 82.5 5.2 6% 2 136.2 82.6 61% 2
R326M R143M 78.7 5.1 6% 2 174.3 41.2 24% 2
R326K R143K 114.2 19.6 17% 2 158.1 16.9 11% 2
R326Y R143Y 68.2 14.6 21% 2 144.8 29.8 21% 2
T327A T144A 116.5 24.8 21% 2 169.3 60.7 36% 2
T327L T144L 127.1 32.8 26% 3 198.1 91.9 46% 2
S334A S152A 115.4 18.0 16% 2 150.0 67.1 45% 2
S334T S152T 106.6 24.3 23% 2 160.4 52.0 32% 2
S334N S152N 95.6 22.6 24% 2 160.7 58.3 36% 2
R336E R154E 105.7 20.2 19% 3 158.3 39.4 25% 2
K338A K156A 100.0 20.1 20% 5 168.5 34.3 20% 4
K338S K156S 109.7 18.3 17% 5 167.1 20.6 12% 4
K338N K156N 115.0 40.6 35% 3 159.6 60.8 38% 2
K338R K156R 112.2 4.0 4% 2 182.4 55.9 31% 2
K338V K156V 90.1 24.4 27% 2 158.7 35.3 22% 2
K338Y K156Y 151.8 0.5 0% 2 167.1 35.2 21% 2
K338M K156M 180.3 26.3 15% 2 180.0 27.8 15% 2
T327A/K338A T144A/K156A 187.9 19.9 11% 2 255.8 47.3 18% 2
T327L/K338M T144L/K156M 151.7 11.1 7% 2 174.8 27.1 16% 2
E200V/T327L/K338M E21V/T144L/K156M 125.8 9.5 8% 2 163.4 33.4 20% 2
E200V/T327L/S334A/K338M E21V/T144L/S152A/K156M 70.0 7.3 10% 2 171.7 11.9 7% 2
V196S/G197A V17S/G18A 활성없음 n.d. n.d. 0 n.d. n.d. n.d. 0
V196S/L211S/G219H V17S/L32S/G40H 48.2 11.5 24% 11 116.1 12.3 11% 2
D119N/G121S/V196S/L211S/G219H D[119]N/G[121]S/V17S/L32S/G40H 41.3 23.0 56% 2 101.5 52.0 51% 2
G114N/V196S/L211S/G219H G[114]N/V17S/L32S/G40H 37.3 17.1 46% 2 76.2 21.0 28% 2
G114N/D119N/G121S/V196S/L211S/G219H G[114]N/D[119]N/G[121]S/V17S/L32S/G40H 41.4 18.2 44% 3 132.1 55.9 42% 4
G197A/L211S/G219H G18A/L32S/G40H 96.1 28.9 30% 2 114.0 26.6 23% 3
V196S/G197A/L211S/G219H V17S/G18A/L32S/G40H 활성없음 n.d. n.d. 0 n.d. n.d. n.d. 0
I195L/V196S I16L/V17S 활성없음 n.d. n.d. 0 n.d. n.d. n.d. 0
I195L/G197A I16L/G18A 활성없음 n.d. n.d. 0 n.d. n.d. n.d. 0
I195L/L211S/G219H I16L/L32S/G40H 111.0 44.4 40% 4 257.4 147.8 57% 5
V196S/N214D V17S/N35D 63.4 6.4 10% 3 250.7 0.1 0% 2
V196S/N214A V17S/N35A 82.9 16.1 19% 2 185.1 57.9 31% 2
V196S/N214S V17S/N35S 79.5 9.4 12% 2 158.1 24.4 15% 2
V196S/E216R V17S/E37R 59.1 7.9 13% 3 269.3 2.9 1% 2
V196S/E216K V17S/E37K 70.0 1.0 1% 2 258.3 132.8 51% 2
V196S/E216A V17S/E37A 66.6 4.7 7% 2 268.6 91.8 34% 2
V196S/E216S V17S/E37S 79.5 19.0 24% 2 165.7 80.4 49% 2
V196S/E218R V17S/E39R 64.3 15.8 25% 3 231.9 7.1 3% 2
V196S/E218K V17S/E39K 76.6 9.4 12% 2 204.2 41.1 20% 2
V196S/E218A V17S/E39A 79.2 6.3 8% 2 217.1 5.3 2% 2
V196S/R332A V17S/R150A 67.8 19.5 29% 4 372.0 82.3 22% 3
V196S/R332D V17S/R150D 87.0 53.1 61% 5 149.2 53.1 36% 5
V196S/R332E V17S/R150E 55.1 14.2 26% 2 178.2 68.3 38% 2
V196S/R332S V17S/R150S 70.6 32.2 46% 6 147.0 33.9 23% 5
V196S/R332G V17S/R150G 54.5 21.7 40% 5 192.8 74.8 39% 4
V196S/R326E V17S/R143E n.d. n.d. n.d. 0 n.d. n.d. n.d. 0
V196S/R326D V17S/R143D 18.8 8.9 48% 5 2169.5 32.5 1% 2
V196S/R326M V17S/R143M 39.4 1.4 3% 2 265.9 72.4 27% 2
V196S/R326N V17S/R143N 20.1 3.6 18% 3 338.3 100.5 30% 2
V196S/R326Q V17S/R143Q 22.1 5.8 26% 12 892.1 577.8 65% 3
V196S/R273E V17S/R93E 58.7 4.9 8% 3 199.1 38.2 19% 2
V196S/R273A V17S/R93A 62.6 10.7 17% 2 152.0 34.4 23% 2
V196S/R424A V17S/R240A 65.0 15.9 25% 2 107.3 1.5 1% 2
V196S/R424E V17S/R240E 66.3 5.5 8% 7 173.2 70.8 41% 2
V196S/K420A V17S/K236A 54.7 20.3 37% 2 70.9 24.1 34% 2
V196S/K420E V17S/K236E 49.9 16.0 32% 2 102.2 13.1 13% 2
V196S/R306E V17S/R125A 66.6 3.8 6% 2 110.5 n.d. n.d. 1
V196S/K276A V17S/K96A 58.3 11.6 20% 2 339.1 96.2 28% 2
V196S/K276E V17S/K96E 47.0 8.1 17% 2 436.6 51.1 12% 2
V196S/K420E/R424E V17S/K236E/R240E 60.0 22.0 37% 3 167.5 111.4 67% 2
V196S/R273E/K420E/R424E V17S/R93E/K236E/R240E n.d. n.d. n.d. 0 n.d. n.d. n.d. 0
V196S/R273E/R306E/K420E/R424E V17S/R93E/R125E/K236E/R240E 활성없음 n.d. n.d. 0 n.d. n.d. n.d. 0
V196S/K338A V17S/K156A 17.5 2.8 16% 2 820.8 417.6 51% 2
V196S/K338S V17S/K156S 17.9 5.1 29% 10 2996.2 1390.0 46% 8
V196S/E215N/N217S V17S/E36N/N38S 151.7 32.4 21% 3 1078.5 634.6 59% 4
V196S/E264N/E266S V17S/E84N/E86S 97.4 16.0 16% 4 948.7 447.3 47% 4
D119N/G121S/V196S/E264N/E266S D[119]N/G[121]S/V17S/E84N/E86S 101.1 69.8 69% 2 179.5 89.6 50% 2
G114N/V196S/E264N/E266S G[114]N/V17S/E84N/E86S 57.1 19.4 34% 2 88.0 51.4 58% 2
V196S/R429N/L431S V17S/R245N/L247S 110.7 4.7 4% 2 512.1 122.8 24% 2
V196S/R243N/K245S V17S/R63N/K65S 33.2 4.2 13% 3 86.2 57.9 67% 2
V196S/T293N/R295S V17S/T113N/R115S 154.9 45.9 30% 2 944.4 379.5 40% 2
V196S/D389N/Y391S V17S/D205N/Y207S 119.8 98.2 82% 2 95.9 62.6 65% 3
V196S/K388N V17S/K204N 134.0 54.7 41% 5 1522.3 969.2 64% 4
D119N/G121S/V196S/K388N D[119]N/G[121]S/V17S/K204N 61.4 25.3 41% 2 63.7 13.9 22% 2
V196S/T428N/G430S V17S/T244N/G246S 88.5 23.9 27% 2 839.1 63.1 8% 2
V196S/L211S/G219H/E264N/E266S V17S/L32S/G40H/E84N/E86S 30.7 7.2 23% 3 166.0 44.8 27% 2
D119N/G121S/V196S/L211S/G219H/E264N/E266S D[119]N/G[121]S/V17S/L32S/G40H/E84N/E86S 40.5 8.1 20% 2 75.5 18.9 25% 2
G114N/V196S/L211S/G219H/E264N/E266S G[114]N/V17S/L32S/G40H/E84N/E86S 62.4 21.0 34% 4 77.5 17.9 23% 2
V196S/E264N/E266S/K388N V17S/E84N/E86S/K204N 64.2 36.0 56% 2 66.8 15.3 23% 2
D119N/G121S/V196S/L211S/G219H/K388N D[119]N/G[121]S/V17S/L32S/G40H/K204N 57.2 24.5 43% 3 68.0 22.9 34% 2
G114N/V196S/L211S/G219H/K388N G[114]N/V17S/L32S/G40H/K204N 95.7 52.5 55% 4 71.4 23.3 33% 2
V196S/L211S/G219H/E264N/E266S/K388N V17S/L32S/G40H/E84N/E86S/K204N 74.6 1.0 1% 2 133.9 43.3 32% 2
표 18. FXa 돌연변이의 계산된 k cat
돌연변이
(성숙 FX 넘버링)		 돌연변이
(키모트립신 넘버링)		 FVa 존재 FVa 없음
kc at (s-1) S.D. (s-1) %CV n k cat (s-1) S.D. (s-1) %CV n
혈장 FXa 혈장 FXa 46.4 16.4 35% 120 1.6E-02 6.3E-03 40% 100
FX WT FX WT 37.8 14.7 39% 38 9.5E-03 4.1E-03 44% 16
I195L I16L 31.2 8.6 27% 28 3.1E-04 9.4E-05 30% 10
V196I V17I 28.3 4.7 17% 2 3.0E-03 8.6E-05 3% 2
V196S V17S 31.7 10.9 34% 47 3.8E-05 8.1E-06 22% 25
T85N/K87S/V196S T[85]N/K[87]S/V17S 3.8 0.8 20% 3 5.8E-05 4.1E-05 70% 3
Q56N/Q58S/V196S Q[56]N/Q[58]S/V17S 21.1 6.4 30% 3 5.3E-05 3.7E-05 71% 3
K62N/G64S/V196S K[62]N/G[64]S/V17S 42.8 0.2 0% 2 8.5E-05 6.2E-05 72% 3
L65N/E67S/V196S L[65]N/E[67]S/V17S 27.9 9.2 33% 2 1.3E-04 8.3E-05 65% 3
E67N/V196S E[67]N/V17S 28.9 13.9 48% 3 7.2E-05 1.8E-06 3% 2
L73N/G75S/V196S L[73]N/G[75]S/V17S 10.9 3.0 27% 3 6.6E-05 4.6E-05 70% 3
G75N/E77S/V196S G[75]N/E[77]S/V17S 14.8 4.1 28% 2 5.5E-05 2.9E-05 52% 3
R86N/L88S/V196S R[86]N/L[88]S/V17S 30.0 16.0 53% 3 7.3E-05 2.8E-05 39% 3
G114N/V196S G[114]N/V17S 21.4 7.0 33% 6 1.4E-04 8.2E-05 60% 4
D95N/D97S/V196S D[95]N/D[97]S/V17S 13.5 3.1 23% 4 2.5E-05 1.3E-05 53% 4
E82S/V196S E[82]S/V17S 7.2 3.8 53% 9 1.7E-05 5.4E-06 32% 10
E82N/F84S/V196S E[82]N/F[84]S/V17S 15.0 0.9 6% 2 2.6E-05 7.6E-06 29% 5
G78N/N80S/V196S G[78]N/N[80]S/V17S 6.5 2.2 34% 4 1.8E-05 9.6E-06 55% 5
E77N/K79S/V196S E[77]N/K[79]S/V17S 11.3 2.4 22% 4 2.9E-05 9.0E-06 31% 4
D119N/G121S/V196S D[119]N/G[121]S/V17S 22.0 4.9 22% 4 4.4E-05 2.7E-05 60% 4
L83N/V196S L[83]N/V17S 11.2 0.8 7% 4 3.1E-05 1.0E-05 33% 3
K122S/V196S K[122]S/V17S 19.5 6.5 33% 6 6.3E-05 3.1E-05 49% 5
E51N/V196S E[51]N/V17S 27.1 6.7 25% 2 1.2E-04 2.3E-05 20% 2
Q58N/K60S/V196S Q[58]N/K[60]S/V17S 22.5 1.5 7% 2 9.3E-05 1.6E-05 18% 2
G114N/D119N/G121S/V196S G[114]N/D[119]N/G[121]S/V17S 18.0 6.4 36% 4 8.7E-06 2.1E-06 24% 4
G198A G19A 활성없음 n.d. n.d. 0 활성
없음		 n.d. n.d. 0
G198V G19V 활성없음 n.d. n.d. 0 활성
없음		 n.d. n.d. 0
G198R G19R 활성없음 n.d. n.d. 0 활성
없음		 n.d. n.d. 0
G198K G19K 활성없음 n.d. n.d. 0 활성
없음		 n.d. n.d. 0
G198P G19P 활성없음 n.d. n.d. 0 활성
없음		 n.d. n.d. 0
G198H G19H 활성없음 n.d. n.d. 0 활성
없음		 n.d. n.d. 0
L211S/G219H L32S/G40H 28.0 7.7 28% 2 7.0E-03 7.1E-05 1% 2
G197P G18P 활성없음 n.d. n.d. 0 활성
없음		 n.d. n.d. 0
D378N D194N 활성없음 n.d. n.d. 0 활성
없음		 n.d. n.d. 0
D378S D194S 활성없음 n.d. n.d. 0 활성
없음		 n.d. n.d. 0
V196L V17L 39.8 5.1 13% 2 1.1E-03 1.1E-04 10% 2
V196T V17T 39.4 8.0 20% 2 2.8E-04 6.0E-05 22% 2
V196P V17P 활성없음 n.d. n.d. 0 활성
없음		 n.d. n.d. 0
G197V G18V 활성없음 n.d. n.d. 0 활성
없음		 n.d. n.d. 0
G197T G18T 활성없음 n.d. n.d. 0 활성
없음		 n.d. n.d. 0
G197S G18S 20.7 1.7 8% 2 1.6E-04 3.5E-05 23% 2
E200A E21A 29.6 6.8 23% 2 1.5E-03 4.5E-04 29% 2
E200S E21S 17.7 1.7 9% 2 2.8E-03 7.8E-04 27% 2
E200V E21V 30.2 5.5 18% 2 2.1E-03 4.4E-04 22% 2
K202S K23S 39.1 1.7 4% 2 1.6E-03 2.5E-05 2% 2
R326A R143A 19.4 2.6 13% 2 6.1E-03 1.6E-03 27% 2
R326S R143S 17.2 1.6 9% 2 2.6E-03 1.0E-03 39% 2
R326T R143T 16.8 0.5 3% 2 2.2E-03 8.1E-04 36% 2
R326V R143V 27.0 1.7 6% 2 4.7E-03 1.4E-03 30% 2
R326Q R143Q 16.5 0.1 1% 2 1.5E-03 4.7E-04 30% 2
R326N R143N 18.9 0.9 5% 2 2.2E-03 7.3E-04 32% 2
R326M R143M 14.1 0.6 4% 2 3.3E-03 3.0E-04 9% 2
R326K R143K 14.7 1.2 8% 2 9.7E-04 4.7E-05 5% 2
R326Y R143Y 22.3 3.5 16% 2 4.7E-03 1.5E-03 31% 2
T327A T144A 33.9 4.4 13% 2 2.8E-03 7.2E-04 26% 2
T327L T144L 35.2 5.4 15% 3 4.4E-03 4.3E-04 10% 2
S334A S152A 25.9 1.8 7% 2 2.4E-03 5.3E-04 22% 2
S334T S152T 33.2 1.5 4% 2 2.3E-03 8.6E-04 37% 2
S334N S152N 29.7 0.2 1% 2 1.6E-03 3.1E-04 20% 2
R336E R154E 33.4 6.5 20% 3 4.6E-03 9.9E-04 22% 2
K338A K156A 35.6 6.9 19% 5 7.6E-04 3.6E-04 48% 4
K338S K156S 31.8 5.3 17% 5 4.6E-04 2.3E-04 50% 4
K338N K156N 31.3 5.3 17% 3 2.7E-03 5.8E-04 21% 2
K338R K156R 41.2 0.6 1% 2 6.5E-03 4.4E-03 68% 2
K338V K156V 34.2 3.5 10% 2 9.7E-04 3.9E-05 4% 2
K338Y K156Y 47.7 8.3 17% 2 1.6E-03 1.9E-04 12% 2
K338M K156M 53.6 12.2 23% 2 7.2E-03 3.2E-03 44% 2
T327A/K338A T144A/K156A 45.0 3.8 8% 2 2.6E-04 3.9E-07 0% 2
T327L/K338M T144L/K156M 28.3 1.7 6% 2 6.5E-03 5.2E-04 8% 2
E200V/T327L/K338M E21V/T144L/K156M 37.9 1.5 4% 2 4.1E-03 3.1E-04 7% 2
E200V/T327L/S334A/K338M E21V/T144L/S152A/K156M 20.6 2.6 12% 2 6.1E-04 3.3E-05 5% 2
V196S/G197A V17S/G18A 활성없음 n.d. n.d. 0 활성
없음		 n.d. n.d. 0
V196S/L211S/G219H V17S/L32S/G40H 12.6 1.8 15% 11 1.7E-05 3.0E-06 17% 2
D119N/G121S/V196S/L211S/G219H D[119]N/G[121]S/V17S/L32S/G40H 14.6 2.0 14% 2 1.4E-05 3.7E-06 27% 2
G114N/V196S/L211S/G219H G[114]N/V17S/L32S/G40H 12.9 3.0 23% 2 1.3E-05 2.2E-06 17% 2
G114N/D119N/G121S/V196S/L211S/G219H G[114]N/D[119]N/G[121]S/V17S/L32S/G40H 13.4 5.5 41% 3 1.0E-05 2.5E-06 25% 4
G197A/L211S/G219H G18A/L32S/G40H 12.5 2.1 17% 2 2.1E-04 3.9E-05 19% 3
V196S/G197A/L211S/G219H V17S/G18A/L32S/G40H 활성없음 n.d. n.d. 0 활성
없음		 n.d. n.d. 0
I195L/V196S I16L/V17S 활성없음 n.d. n.d. 0 활성
없음		 n.d. n.d. 0
I195L/G197A I16L/G18A 활성없음 n.d. n.d. 0 활성
없음		 n.d. n.d. 0
I195L/L211S/G219H I16L/L32S/G40H 31.3 10.7 34% 4 1.9E-04 1.2E-04 62% 5
V196S/N214D V17S/N35D 13.4 2.1 16% 3 3.6E-05 5.1E-06 14% 2
V196S/N214A V17S/N35A 17.2 0.2 1% 2 3.8E-05 3.7E-06 10% 2
V196S/N214S V17S/N35S 22.8 0.5 2% 2 5.6E-05 5.9E-06 11% 2
V196S/E216R V17S/E37R 13.4 2.9 22% 3 4.6E-05 1.2E-05 25% 2
V196S/E216K V17S/E37K 20.7 1.2 6% 2 4.2E-05 4.2E-06 10% 2
V196S/E216A V17S/E37A 14.7 1.1 7% 2 3.7E-05 1.4E-05 37% 2
V196S/E216S V17S/E37S 15.4 4.2 28% 2 3.0E-05 1.2E-05 41% 2
V196S/E218R V17S/E39R 12.3 3.4 28% 3 4.3E-05 4.6E-06 11% 2
V196S/E218K V17S/E39K 14.6 4.4 30% 2 3.3E-05 1.1E-05 34% 2
V196S/E218A V17S/E39A 19.7 8.1 41% 2 3.9E-05 9.3E-06 24% 2
V196S/R332A V17S/R150A 23.3 4.9 21% 4 8.3E-05 3.3E-05 40% 3
V196S/R332D V17S/R150D 41.6 35.7 86% 5 2.4E-05 2.5E-06 10% 5
V196S/R332E V17S/R150E 19.3 5.2 27% 2 5.4E-05 1.5E-05 28% 2
V196S/R332S V17S/R150S 23.0 11.2 49% 6 2.1E-05 3.6E-06 17% 5
V196S/R332G V17S/R150G 20.8 9.7 47% 5 1.6E-05 3.2E-06 20% 4
V196S/R326E V17S/R143E 활성
없음		 n.d. n.d. 0 활성
없음		 n.d. n.d. 0
V196S/R326D V17S/R143D 2.3 1.0 44% 5 6.9E-06 1.7E-06 25% 2
V196S/R326M V17S/R143M 9.1 0.5 5% 2 5.8E-06 2.1E-06 35% 2
V196S/R326N V17S/R143N 6.2 0.7 10% 3 4.8E-06 1.6E-06 34% 2
V196S/R326Q V17S/R143Q 6.5 1.3 21% 12 6.8E-06 6.8E-06 100% 3
V196S/R273E V17S/R93E 19.5 4.8 25% 3 3.9E-05 1.0E-05 26% 2
V196S/R273A V17S/R93A 16.7 0.2 1% 2 2.7E-05 4.1E-06 15% 2
V196S/R424A V17S/R240A 17.6 3.1 18% 2 2.9E-05 1.6E-05 55% 2
V196S/R424E V17S/R240E 16.3 3.6 22% 7 2.5E-05 1.0E-05 40% 2
V196S/K420A V17S/K236A 15.6 6.1 39% 2 2.7E-05 1.1E-06 4% 2
V196S/K420E V17S/K236E 10.6 1.0 10% 2 2.4E-05 6.3E-06 27% 2
V196S/R306E V17S/R125A 14.8 2.8 19% 2 2.1E-05 n.d. n.d. 1
V196S/K276A V17S/K96A 9.1 2.0 22% 2 1.7E-05 3.0E-06 18% 2
V196S/K276E V17S/K96E 6.4 1.8 28% 2 1.0E-05 2.5E-06 24% 2
V196S/K420E/R424E V17S/K236E/R240E 5.1 3.3 65% 3 2.6E-05 1.3E-05 49% 2
V196S/R273E/K420E/R424E V17S/R93E/K236E/R240E 활성
없음		 n.d. n.d. 0 활성
없음		 n.d. n.d. 0
V196S/R273E/R306E/K420E/R424E V17S/R93E/R125E/K236E/R240E 활성
없음		 n.d. n.d. 0 활성
없음		 n.d. n.d. 0
V196S/K338A V17S/K156A 1.9 0.3 14% 2 3.0E-06 8.5E-07 28% 2
V196S/K338S V17S/K156S 2.5 0.8 33% 10 8.9E-06 3.8E-06 42% 8
V196S/E215N/N217S V17S/E36N/N38S 24.9 3.7 15% 3 9.4E-05 5.4E-05 58% 4
V196S/E264N/E266S V17S/E84N/E86S 27.6 7.9 28% 4 7.1E-05 3.5E-05 50% 4
D119N/G121S/V196S/E264N/E266S D[119]N/G[121]S/V17S/E84N/E86S 12.6 10.9 87% 2 3.0E-05 1.2E-05 42% 2
G114N/V196S/E264N/E266S G[114]N/V17S/E84N/E86S 23.2 0.0 0% 2 2.0E-05 1.7E-06 9% 2
V196S/R429N/L431S V17S/R245N/L247S 25.0 8.1 32% 2 4.1E-05 6.7E-06 16% 2
V196S/R243N/K245S V17S/R63N/K65S 5.1 1.7 34% 3 6.1E-05 4.9E-05 81% 2
V196S/T293N/R295S V17S/T113N/R115S 23.1 9.4 40% 2 7.7E-05 1.6E-05 20% 2
V196S/D389N/Y391S V17S/D205N/Y207S 8.5 2.8 34% 2 1.1E-04 5.3E-05 47% 3
V196S/K388N V17S/K204N 24.3 6.9 28% 5 1.4E-04 9.8E-05 73% 4
D119N/G121S/V196S/K388N D[119]N/G[121]S/V17S/K204N 24.0 0.3 1% 2 1.7E-05 6.4E-06 38% 2
V196S/T428N/G430S V17S/T244N/G246S 21.0 2.4 11% 2 8.2E-05 3.5E-06 4% 2
V196S/L211S/G219H/E264N/E266S V17S/L32S/G40H/E84N/E86S 13.1 5.1 39% 3 1.9E-05 8.8E-06 46% 2
D119N/G121S/V196S/L211S/G219H/E264N/E266S D[119]N/G[121]S/V17S/L32S/G40H/E84N/E86S 13.8 2.7 20% 2 1.8E-05 1.4E-05 76% 2
G114N/V196S/L211S/G219H/E264N/E266S G[114]N/V17S/L32S/G40H/E84N/E86S 15.4 6.8 44% 4 8.4E-06 3.9E-06 47% 2
V196S/E264N/E266S/K388N V17S/E84N/E86S/K204N 17.2 2.3 14% 2 1.0E-05 6.0E-06 59% 2
D119N/G121S/V196S/L211S/G219H/K388N D[119]N/G[121]S/V17S/L32S/G40H/K204N 7.7 2.1 27% 3 9.0E-06 5.2E-06 58% 2
G114N/V196S/L211S/G219H/K388N G[114]N/V17S/L32S/G40H/K204N 24.3 19.3 79% 4 8.3E-06 5.9E-06 71% 2
V196S/L211S/G219H/E264N/E266S/K388N V17S/L32S/G40H/E84N/E86S/K204N 10.4 1.1 11% 2 1.9E-05 1.4E-05 70% 2
표 19. FXa 변이체의 계산된 특이성 상수 (k cat/KM) 및 상대적 보조인자 의존성
돌연변이
(성숙 FX 넘버링)		 돌연변이 (키모트립신 넘버링) FVa-의존적 촉매활성
(FVa 존재)		 FVa-독립적 촉매 활성
(FVa 없음)		 상대적 보조인자 의존성
kc at/K M (M-1s-1) S.D. (M-1s-1) %CV % of WT k cat/K M n k cat/K M (M-1s-1) S.D. (M-1s-1) %CV % of WT k cat/K M n
혈장 FXa 혈장 FXa 3.3E+08 1.1E+08 34% 129% 120 1.1E+05 4.5E+04 40% 151% 100 2,941
FXa WT FXa WT 2.6E+08 1.1E+08 42% 100% 38 7.5E+04 3.0E+04 40% 100% 16 3,427
I195L I16L 3.2E+08 8.3E+07 26% 126% 28 2.3E+03 9.6E+02 41% 3% 10 138,730
V196I V17I 2.2E+08 3.1E+07 14% 85% 2 2.2E+04 1.1E+03 5% 29% 2 9,857
V196S V17S 4.2E+08 1.5E+08 36% 163% 47 2.2E+02 1.2E+02 56% 0.3% 25 1,949,704
T85N/K87S/V196S T[85]N/K[87]S/V17S 9.7E+07 1.2E+07 12% 38% 3 1.2E+02 5.0E+01 41% 0.2% 3 796,199
Q56N/Q58S/V196S Q[56]N/Q[58]S/V17S 2.8E+08 2.7E+07 10% 109% 3 1.7E+02 6.6E+01 40% 0.2% 3 1,689,225
K62N/G64S/V196S K[62]N/G[64]S/V17S 3.9E+08 5.8E+07 15% 153% 2 2.0E+02 6.1E+01 30% 0.3% 3 1,954,206
L65N/E67S/V196S L[65]N/E[67]S/V17S 4.5E+08 5.2E+07 11% 176% 2 1.6E+02 6.3E+01 39% 0.2% 3 2,783,973
E67N/V196S E[67]N/V17S 2.6E+08 8.4E+07 32% 101% 3 1.0E+02 2.3E+00 2% 0.1% 2 2,577,649
L73N/G75S/V196S L[73]N/G[75]S/V17S 1.7E+08 7.6E+07 44% 67% 3 1.1E+02 2.4E+01 22% 0.1% 3 1,622,299
G75N/E77S/V196S G[75]N/E[77]S/V17S 2.6E+08 1.5E+08 58% 99% 2 2.0E+02 5.1E+01 25% 0.3% 3 1,260,991
R86N/L88S/V196S R[86]N/L[88]S/V17S 2.9E+08 1.3E+08 44% 113% 3 7.2E+02 1.9E+02 26% 1% 3 404,779
G114N/V196S G[114]N/V17S 2.0E+08 6.1E+07 31% 77% 6 1.1E+02 3.2E+01 28% 0.2% 4 1,720,332
D95N/D97S/V196S D[95]N/D[97]S/V17S 2.7E+08 1.0E+08 38% 106% 4 1.7E+01 5.5E+00 32% 0.0% 4 15,813,111
E82S/V196S E[82]S/V17S 1.5E+08 9.5E+07 61% 60% 9 1.1E+02 6.1E+01 56% 0.1% 10 1,414,270
E82N/F84S/V196S E[82]N/F[84]S/V17S 2.2E+08 7.5E+07 34% 87% 2 4.8E+01 1.6E+01 33% 0.1% 5 4,676,971
G78N/N80S/V196S G[78]N/N[80]S/V17S 1.3E+08 5.7E+07 45% 49% 4 5.8E+01 3.7E+01 64% 0.1% 5 2,180,187
E77N/K79S/V196S E[77]N/K[79]S/V17S 1.5E+08 8.3E+07 57% 57% 4 7.7E+01 1.9E+01 25% 0.1% 4 1,913,457
D119N/G121S/V196S D[119]N/G[121]S/V17S 2.1E+08 5.2E+07 25% 80% 4 6.2E+01 1.4E+01 23% 0.1% 4 3,348,627
L83N/V196S L[83]N/V17S 1.5E+08 3.8E+07 25% 59% 4 1.2E+02 4.5E+01 37% 0.2% 3 1,261,176
K122S/V196S K[122]S/V17S 1.4E+08 1.9E+07 13% 55% 6 6.5E+01 2.5E+01 39% 0.1% 5 2,200,872
E51N/V196S E[51]N/V17S 2.3E+08 2.0E+07 9% 88% 2 1.2E+02 1.2E+01 10% 0.2% 2 1,858,168
Q58N/K60S/V196S Q[58]N/K[60]S/V17S 2.3E+08 4.1E+07 18% 90% 2 1.0E+02 6.3E+00 6% 0.1% 2 2,265,746
G114N/D119N/G121S/V196S G[114]N/D[119]N/G[121]S/V17S 3.2E+08 4.1E+07 13% 125% 4 1.1E+02 5.4E+01 51% 0.1% 4 3,062,135
G198A G19A 활성없음 n.d. n.d. 0% 0 활성없음 n.d. n.d. n.d. 0 n.d.
G198V G19V 활성없음 n.d. n.d. 0% 0 활성없음 n.d. n.d. n.d. 0 n.d.
G198R G19R 활성없음 n.d. n.d. 0% 0 활성없음 n.d. n.d. n.d. 0 n.d.
G198K G19K 활성없음 n.d. n.d. 0% 0 활성없음 n.d. n.d. n.d. 0 n.d.
G198P G19P 활성없음 n.d. n.d. 0% 0 활성없음 n.d. n.d. n.d. 0 n.d.
G198H G19H 활성없음 n.d. n.d. 0% 0 활성없음 n.d. n.d. n.d. 0 n.d.
L211S/G219H L32S/G40H 4.3E+08 4.1E+07 10% 168% 2 6.2E+04 4.6E+03 7% 83% 2 6,920
G197P G18P 활성없음 n.d. n.d. 0% 0 활성없음 n.d. n.d. n.d. 0 n.d.
D378N D194N 활성없음 n.d. n.d. 0% 0 활성없음 n.d. n.d. n.d. 0 n.d.
D378S D194S 활성없음 n.d. n.d. 0% 0 활성없음 n.d. n.d. n.d. 0 n.d.
V196L V17L 3.7E+08 8.6E+07 23% 145% 2 8.4E+03 1.8E+03 22% 11% 2 44,694
V196T V17T 3.4E+08 1.0E+08 30% 134% 2 2.0E+03 2.4E+02 12% 3% 2 172,484
V196P V17P 활성없음 n.d. n.d. 0% 0 활성없음 n.d. n.d. n.d. 0 n.d.
G197V G18V 활성없음 n.d. n.d. 0% 0 활성없음 n.d. n.d. n.d. 0 n.d.
G197T G18T 활성없음 n.d. n.d. 0% 0 활성없음 n.d. n.d. n.d. 0 n.d.
G197S G18S 2.0E+08 8.4E+06 4% 78% 2 1.0E+03 1.5E+02 15% 1% 2 198,192
E200A E21A 2.5E+08 4.6E+07 18% 98% 2 9.5E+03 2.1E+03 22% 13% 2 26,489
E200S E21S 1.1E+08 2.7E+05 0% 44% 2 2.3E+04 2.4E+03 10% 31% 2 4,796
E200V E21V 2.4E+08 3.1E+07 13% 92% 2 1.3E+04 9.5E+02 7% 17% 2 18,368
K202S K23S 3.7E+08 2.1E+07 6% 144% 2 1.1E+04 2.2E+03 20% 14% 2 34,688
R326A R143A 1.6E+08 1.3E+07 8% 64% 2 4.3E+04 2.5E+03 6% 57% 2 3,817
R326S R143S 1.7E+08 1.3E+06 1% 66% 2 2.1E+04 5.1E+03 25% 28% 2 8,216
R326T R143T 2.1E+08 2.6E+06 1% 80% 2 1.7E+04 5.0E+03 29% 23% 2 11,901
R326V R143V 4.5E+08 1.3E+08 29% 176% 2 2.4E+04 2.5E+03 10% 32% 2 18,752
R326Q R143Q 2.4E+08 3.3E+07 14% 93% 2 1.2E+04 3.9E+03 33% 16% 2 19,958
R326N R143N 2.3E+08 3.5E+06 2% 89% 2 1.8E+04 5.7E+03 31% 24% 2 12,662
R326M R143M 1.8E+08 4.6E+06 3% 70% 2 2.0E+04 6.4E+03 32% 26% 2 9,107
R326K R143K 1.3E+08 1.2E+07 9% 50% 2 6.2E+03 9.6E+02 16% 8% 2 20,886
R326Y R143Y 3.3E+08 1.9E+07 6% 128% 2 3.2E+04 3.4E+03 11% 43% 2 10,164
T327A T144A 2.9E+08 2.4E+07 8% 114% 2 1.7E+04 1.7E+03 10% 22% 2 17,524
T327L T144L 2.9E+08 1.1E+08 37% 114% 3 2.4E+04 9.0E+03 37% 32% 2 12,215
S334A S152A 2.3E+08 5.1E+07 22% 89% 2 1.7E+04 4.0E+03 24% 22% 2 13,610
S334T S152T 3.2E+08 8.7E+07 27% 125% 2 1.6E+04 1.1E+04 65% 22% 2 19,693
S334N S152N 3.2E+08 7.3E+07 23% 124% 2 1.0E+04 1.8E+03 17% 14% 2 31,084
R336E R154E 3.2E+08 8.4E+07 26% 126% 3 2.9E+04 1.0E+03 3% 39% 2 11,104
K338A K156A 3.6E+08 4.2E+07 12% 139% 5 4.4E+03 1.8E+03 41% 6% 4 80,902
K338S K156S 2.9E+08 4.5E+07 15% 114% 5 2.7E+03 1.1E+03 41% 4% 4 109,860
K338N K156N 2.9E+08 5.5E+07 19% 111% 3 1.8E+04 3.1E+03 18% 24% 2 16,112
K338R K156R 3.7E+08 7.9E+06 2% 143% 2 3.3E+04 1.4E+04 42% 45% 2 10,973
K338V K156V 3.9E+08 6.7E+07 17% 151% 2 6.3E+03 1.6E+03 26% 8% 2 61,833
K338Y K156Y 3.1E+08 5.4E+07 17% 122% 2 9.7E+03 9.1E+02 9% 13% 2 32,379
K338M K156M 3.0E+08 2.4E+07 8% 115% 2 3.9E+04 1.2E+04 30% 52% 2 7,576
T327A/K338A T144A/K156A 2.4E+08 5.3E+06 2% 93% 2 1.0E+03 1.9E+02 18% 1% 2 231,251
T327L/K338M T144L/K156M 1.9E+08 2.3E+06 1% 73% 2 3.8E+04 2.9E+03 8% 50% 2 4,966
E200V/T327L/K338M E21V/T144L/K156M 3.0E+08 1.1E+07 4% 117% 2 2.5E+04 3.3E+03 13% 34% 2 11,872
E200V/T327L/S334A/K338M E21V/T144L/S152A/K156M 2.9E+08 6.1E+06 2% 114% 2 3.6E+03 5.5E+01 2% 5% 2 82,667
V196S/G197A V17S/G18A 활성없음 n.d. n.d. 0% 0 활성없음 n.d. n.d. n.d. 0 n.d.
V196S/L211S/G219H V17S/L32S/G40H 2.7E+08 7.0E+07 26% 107% 11 1.5E+02 9.9E+00 7% 0.2% 2 1,825,614
D119N/G121S/V196S/L211S/G219H D[119]N/G[121]S/V17S/L32S/G40H 4.0E+08 1.8E+08 44% 156% 2 1.7E+02 1.2E+02 73% 0.2% 2 2,424,835
G114N/V196S/L211S/G219H G[114]N/V17S/L32S/G40H 3.7E+08 8.9E+07 24% 143% 2 1.8E+02 8.0E+01 43% 0.2% 2 1,991,946
G114N/D119N/G121S/V196S/L211S/G219H G[114]N/D[119]N/G[121]S/V17S/L32S/G40H 3.3E+08 2.4E+07 7% 128% 3 8.3E+01 2.4E+01 29% 0.1% 4 3,937,247
G197A/L211S/G219H G18A/L32S/G40H 1.3E+08 1.8E+07 13% 52% 2 1.9E+03 7.0E+02 37% 3% 3 69,315
V196S/G197A/L211S/G219H V17S/G18A/L32S/G40H 활성없음 n.d. n.d. 0% 0 활성없음 n.d. n.d. n.d. 0 n.d.
I195L/V196S I16L/V17S 활성없음 n.d. n.d. 0% 0 활성없음 n.d. n.d. n.d. 0 n.d.
I195L/G197A I16L/G18A 활성없음 n.d. n.d. 0% 0 활성없음 n.d. n.d. n.d. 0 n.d.
I195L/L211S/G219H I16L/L32S/G40H 2.9E+08 2.7E+07 10% 112% 4 7.0E+02 1.1E+02 16% 0.9% 5 411,146
V196S/N214D V17S/N35D 2.1E+08 1.4E+07 7% 82% 3 1.4E+02 2.0E+01 14% 0.2% 2 1,467,332
V196S/N214A V17S/N35A 2.1E+08 3.8E+07 18% 82% 2 2.2E+02 4.7E+01 22% 0.3% 2 982,637
V196S/N214S V17S/N35S 2.9E+08 4.1E+07 14% 112% 2 3.5E+02 1.7E+01 5% 0.5% 2 818,829
V196S/E216R V17S/E37R 2.3E+08 2.4E+07 11% 88% 3 1.7E+02 4.1E+01 24% 0.2% 2 1,319,111
V196S/E216K V17S/E37K 3.0E+08 2.1E+07 7% 115% 2 1.8E+02 7.7E+01 42% 0.2% 2 1,626,388
V196S/E216A V17S/E37A 2.2E+08 3.2E+07 14% 87% 2 1.4E+02 4.6E+00 3% 0.2% 2 1,615,323
V196S/E216S V17S/E37S 1.9E+08 7.2E+06 4% 75% 2 1.8E+02 1.6E+01 9% 0.2% 2 1,039,836
V196S/E218R V17S/E39R 1.9E+08 1.3E+07 7% 74% 3 1.8E+02 1.4E+01 8% 0.2% 2 1,028,287
V196S/E218K V17S/E39K 1.9E+08 3.4E+07 18% 73% 2 1.6E+02 2.3E+01 14% 0.2% 2 1,176,402
V196S/E218A V17S/E39A 2.5E+08 8.3E+07 34% 96% 2 1.8E+02 4.7E+01 26% 0.2% 2 1,364,144
V196S/R332A V17S/R150A 3.5E+08 3.0E+07 9% 136% 4 2.2E+02 3.9E+01 18% 0.3% 3 1,618,345
V196S/R332D V17S/R150D 4.3E+08 1.2E+08 28% 168% 5 1.8E+02 6.7E+01 37% 0.2% 5 2,395,228
V196S/R332E V17S/R150E 3.5E+08 3.8E+06 1% 136% 2 3.4E+02 2.2E+02 63% 0.5% 2 1,019,834
V196S/R332S V17S/R150S 3.3E+08 3.9E+07 12% 126% 6 1.5E+02 3.5E+01 24% 0.2% 5 2,209,279
V196S/R332G V17S/R150G 3.8E+08 6.1E+07 16% 149% 5 9.1E+01 3.4E+01 37% 0.1% 4 4,218,821
V196S/R326E V17S/R143E 활성없음 n.d. n.d. 0% 0 활성없음 n.d. n.d. n.d. 0 n.d.
V196S/R326D V17S/R143D 1.3E+08 2.7E+07 21% 49% 5 3.2E+00 8.3E-01 26% 0.0% 2 39,452,222
V196S/R326M V17S/R143M 2.3E+08 4.1E+06 2% 90% 2 2.2E+01 1.8E+00 8% 0.0% 2 10,595,674
V196S/R326N V17S/R143N 3.1E+08 3.4E+07 11% 121% 3 1.4E+01 6.5E-01 5% 0.0% 2 22,111,090
V196S/R326Q V17S/R143Q 3.0E+08 5.7E+07 19% 118% 12 6.6E+00 2.5E+00 39% 0.0% 3 46,198,526
V196S/R273E V17S/R93E 3.3E+08 5.6E+07 17% 128% 3 2.0E+02 1.4E+01 7% 0.3% 2 1,681,120
V196S/R273A V17S/R93A 2.7E+08 4.2E+07 16% 105% 2 1.9E+02 6.9E+01 37% 0.2% 2 1,446,828
V196S/R424A V17S/R240A 2.7E+08 1.9E+07 7% 106% 2 2.7E+02 1.5E+02 56% 0.4% 2 993,583
V196S/R424E V17S/R240E 2.4E+08 5.1E+07 21% 95% 7 1.5E+02 2.1E+00 1% 0.2% 2 1,663,352
V196S/K420A V17S/K236A 2.8E+08 5.4E+06 2% 111% 2 4.0E+02 1.5E+02 38% 0.5% 2 712,414
V196S/K420E V17S/K236E 2.2E+08 5.0E+07 23% 86% 2 2.4E+02 9.2E+01 39% 0.3% 2 927,406
V196S/R306E V17S/R125A 2.2E+08 5.4E+07 24% 87% 2 1.9E+02 n.d. n.d. 0.2% 1 1,194,201
V196S/K276A V17S/K96A 1.6E+08 3.1E+06 2% 60% 2 5.0E+01 5.3E+00 11% 0.1% 2 3,117,288
V196S/K276E V17S/K96E 1.3E+08 1.5E+07 12% 52% 2 2.3E+01 3.0E+00 13% 0.0% 2 5,713,870
V196S/K420E/R424E V17S/K236E/R240E 7.9E+07 2.3E+07 29% 31% 3 1.7E+02 3.6E+01 21% 0.2% 2 465,277
V196S/R273E/K420E/R424E V17S/R93E/K236E/R240E 활성없음 n.d. n.d. 0% 0 활성없음 n.d. n.d. n.d. 0 n.d.
V196S/R273E/R306E/K420E/R424E V17S/R93E/R125E/K236E/R240E 활성없음 n.d. n.d. 0% 0 활성없음 n.d. n.d. n.d. 0 n.d.
V196S/K338A V17S/K156A 1.1E+08 3.3E+07 30% 43% 2 3.9E+00 9.6E-01 24% 0.0% 2 28,406,569
V196S/K338S V17S/K156S 1.4E+08 4.9E+07 34% 56% 10 3.0E+00 9.4E-01 31% 0.0% 8 47,490,591
V196S/E215N/N217S V17S/E36N/N38S 1.7E+08 4.9E+07 29% 66% 3 8.7E+01 5.2E+00 6% 0.1% 4 1,971,094
V196S/E264N/E266S V17S/E84N/E86S 2.8E+08 6.6E+07 23% 111% 4 7.5E+01 6.0E+00 8% 0.1% 4 3,815,411
D119N/G121S/V196S/E264N/E266S D[119]N/G[121]S/V17S/E84N/E86S 1.1E+08 2.9E+07 26% 44% 2 1.7E+02 1.5E+01 9% 0.2% 2 675,381
G114N/V196S/E264N/E266S G[114]N/V17S/E84N/E86S 4.3E+08 1.5E+08 34% 168% 2 2.8E+02 1.8E+02 66% 0.4% 2 1,562,440
V196S/R429N/L431S V17S/R245N/L247S 2.3E+08 8.3E+07 36% 89% 2 8.2E+01 6.6E+00 8% 0.1% 2 2,791,109
V196S/R243N/K245S V17S/R63N/K65S 1.5E+08 3.5E+07 23% 58% 3 6.6E+02 1.3E+02 19% 0.9% 2 226,278
V196S/T293N/R295S V17S/T113N/R115S 1.5E+08 1.7E+07 12% 57% 2 8.5E+01 1.8E+01 21% 0.1% 2 1,733,605
V196S/D389N/Y391S V17S/D205N/Y207S 9.2E+07 5.1E+07 56% 36% 2 1.3E+03 2.7E+02 21% 2% 3 70,856
V196S/K388N V17S/K204N 2.0E+08 7.1E+07 36% 77% 5 8.7E+01 1.0E+01 12% 0.1% 4 2,288,700
D119N/G121S/V196S/K388N D[119]N/G[121]S/V17S/K204N 4.3E+08 1.8E+08 42% 167% 2 2.6E+02 4.4E+01 17% 0.3% 2 1,661,646
V196S/T428N/G430S V17S/T244N/G246S 2.5E+08 9.4E+07 38% 97% 2 9.8E+01 3.2E+00 3% 0.1% 2 2,555,985
V196S/L211S/G219H/E264N/E266S V17S/L32S/G40H/E84N/E86S 4.2E+08 6.7E+07 16% 163% 3 1.1E+02 2.2E+01 20% 0.2% 2 3,707,889
D119N/G121S/V196S/L211S/G219H/E264N/E266S D[119]N/G[121]S/V17S/L32S/G40H/E84N/E86S 3.4E+08 9.6E+05 0% 132% 2 2.3E+02 1.3E+02 56% 0.3% 2 1,486,131
G114N/V196S/L211S/G219H/E264N/E266S G[114]N/V17S/L32S/G40H/E84N/E86S 2.5E+08 7.7E+07 30% 98% 4 1.2E+02 7.8E+01 66% 0.2% 2 2,147,579
V196S/E264N/E266S/K388N V17S/E84N/E86S/K204N 3.3E+08 2.2E+08 67% 128% 2 1.7E+02 1.3E+02 76% 0.2% 2 1,969,113
D119N/G121S/V196S/L211S/G219H/K388N D[119]N/G[121]S/V17S/L32S/G40H/K204N 1.5E+08 9.1E+07 59% 60% 3 1.3E+02 3.4E+01 27% 0.2% 2 1,218,354
G114N/V196S/L211S/G219H/K388N G[114]N/V17S/L32S/G40H/K204N 2.4E+08 8.5E+07 35% 94% 4 1.1E+02 4.7E+01 44% 0.1% 2 2,222,421
V196S/L211S/G219H/E264N/E266S/K388N V17S/L32S/G40H/E84N/E86S/K204N 1.4E+08 1.3E+07 9% 54% 2 1.7E+02 1.6E+02 92% 0.2% 2 823,652
실시예 5
항트롬빈/헤파린 복합체에 의한 FXa 저해 확인
항트롬빈/헤파린 복합체(AT/헤파린)에 의한 야생형 FXa 또는 FXa 변이체 저해를 소분자 기질, CH3SO2-D-CHG-Gly-Arg-AMC (Pefafluor FXa; Centerchem)에 대한 FXa의 촉매 활성에 대한 AT/헤파린에 의한 저해 수준의 측정으로 검정하였다. K 0.5 값은 테스트한 FXa 변이체 각각에 대하여 확인하였고, 이는 검정의 미리 정해진 조건 하에 FXa 변이체의 촉매활성의 50% 저해(IC50)에 요구되는 AT의 분자 농도에 상응한다. 저해 반응은 더 긴 헤파린 사슬에 의해 제공되는 "templating" 효과에 의해서 저해 반응의 속도를 증가시키는 최대-길이(full-length) 비분획화된 헤파린(UFG; Calbiochem)의 존재 하에 수행하였다(Olson et al, (2004) Thromb Haemost 92(5), 929-939 참고). AT/UFH 복합체에 의한 야생형 FXa 또는 FXa 변이체 저해에 대한 겉보기 이차 반응속도 상수(k app )는 AT/UFH 복합체의 인큐베이션 시간이 다양한 변형 프로토콜을 사용하여 직접 검정하였다.
A. 항트롬빈/UFH 복합체에 의한 FXa의 저해
UFH의 존재 하에 저해 반응을 위하여, 2000 nM, 1000 nM, 200 nM, 또는 100 nM의 AT/UFH (최종 2 μM UFH)의 2×용액은 혈장 정제 인간 AT-III (Molecular Innovations) 20 μM 스톡을, 1×버퍼 A (20 mM Hepes, 150 mM NaCl, 5 mM CaCl2, 0.01% Tween-20, 0.1% PEG 8000, pH 7.4)의 1.0 mL 부피 중 과잉의 UFH (2 μM) 용액으로 희석하여 준비하였다. AT/UFH 용액은 2 μM UFH를 함유하는 500 μL 부피의 1×버퍼 A로 96 딥-웰 폴리프로필렌 플레이트에서 연속적으로 2배 희석되기 전에 상온에서 15분 동안 인큐베이션시켰다. AT의 최종 희석액은 AT의 시작 농도에 의존하였고, 2000 ~ 0 nM, 1000 ~ 0 nM, 200 ~ 0 nM, 또는 100 ~ 0 nM (즉, A-H 열)의 범위를 가졌다. 표준 조건 하에서 AT 저해에 대하여 증가된 저항성을 나타낸 변이체들은 더 높은 농도의 AT를 사용하여 추가 테스트하였다. 각 AT 희석액의 35 μL의 부분표본을 모든 컬럼(즉, 1~12)을 채우기 위하여 96-웰 V-바닥 저장 플레이트의 각 열에 나누었다. FXa 변이체들은 초기에 1×버퍼 A 중에서 100 nM까지 희석하였다. 이어서, 각 100 nM의 FXa 변이체 50 μL를 1×버퍼 A 2.5 mL 중에서 2.0 nM의 농도로 희석하였고, 용액 70μL를 동일한 미리 정해진 플레이트 맵(플레이트 당 4FXa 변이체)에 따라 96-웰 V-바닥 저장 플레이트에 나누어 놓았다.
검정 반응은 각 FXa 변이체에 대한 두 개의 동일한 검정 모두에 대해서 35 μL의 FXa 용액을 웰 당 AT/UFH의 각 희석액을 35 μL 함유하는 플레이트로 나누어 놓도록 프로그램화된 BioMek FX 액체 조작 시스템을 사용하여 개시하였다. 최종 저해 검정 조건은: 1.0 nM FXa 및 1 μM UFH 중 35 nM 내지 0 nM, 50 nM 내지 0 nM, 100 nM 내지 0 nM, 500 nM 내지 0 nM 또는 1000 nM 내지 0 nM의 AT 범위의 AT/UFH 희석액.
저해 반응은 40 μL의 반응 부분표본을 15 mg/ml의 폴리브렌으로 보충된 검정 버퍼 A 중 20 μL의 0.3 mM Pefafluor Xa를 함유하는 96-웰 블랙 하프-면적 플레이트로 BioMek FX를 사용하여 옮기기 전에 상온(~25℃)에서 30초 동안 추가 인큐베이션하였다. AT/UFH 반응을 종료하기 위해서는 최종 농도 5 mg/ml로 폴리브렌(헥사디메트린 브로마이드)를 반응에 가하였다. FXa의 잔여 활성은 25℃로 설정된 형광발광 플레이트 리더기에서 60분 동안 기질 절단의 다음 초기 속도에 의하여 검정하였다. 잔여 활성 확인을 위한 최종 검정 조건은 버퍼 A 중 2.0 nM FXa 변이체, 0.1 mM Pefafluor FX 및 5 mg/mL 폴리브렌이다.
FXa 또는 FXa 변이체를 위한 AT/UFH에 의한 저해 정도를 확인하기 위하여 SoftMax Pro application (Molecular Devices)로 수집한 미가공 데이타를 텍스트 파일로 전송하였다. 추가적인 비-선형 데이타 분석은 XE Runner 데이타 분석 모듈(IDBS Software)을 사용한 ActivityBase 소프트웨어 패키지 내에서 직접 수행하였다. 주형은 AT 희석액 시리즈, FXa에 대한 AT의 비율 및 각 실험 AT 농도에서 각 FXa 리플리케이트에 대한 Vi/Vo의 비율을 계산하기 위하여 사용하였다. 잔여 FXa 활성(Vi/Vo로 표현됨) 대 AT 농도의 비-선형 회귀 분석은 형식 [C+(Amp*(1-(X/(K 0.5 +X))))]; (여기서 C = 오프셋(검정 과정동안에 100%의 저해에 도달하지 않은 데이타 세트의 외삽을 허용하도록 O으로 고정됨), Amp = 핏(fit)의 증폭 및 검정 조건 하에서 반-최대의 저해에 요구되는 AT 농도에 상응하는 K 0.5 )의 쌍곡선의 저해 방정식을 사용하여 수행하였다. 몇몇 FXa 변이체들에 대해서는, 표준 스크리닝 조건 하에 검정을 위한 검출 최대치인, AT의 가장 높은 테스트 농도에서 AT/UFH가 총 프로테아제 활성의 10 ~ 15% 미만으로 저해하였다. 10%의 최대 저해 미만의 변이체들은 그러므로 더 낮은 K 0.5 값 한계인 10000 nM을 부여하였고, 대부분의 경우 보고된 값보다 훨씬 큰 AT 저항성을 가지는 것으로 예상된다.
표 20은 AT/UFH로 수행한 검정 결과를 제공한다. 결과는 맞춰진(fitted) K 0.5 파라메터와 맞춰진 K 0.5 값(K 0.5 변이체/K 0.5 야생형)의 비율로 표현되는 야생형 FXa와 비교한 각 변이체의 AT-III 저항성 정도의 대표값으로 나타내었다. 비교를 위한 야생형 FXa 폴리펩티드는 실시예 1 및 2로부터 제조된 재조합 야생형 FXa였다.
몇몇 FXa 변이체들은 야생형 FXa (FXa WT)와 비교하여 AT에 대하여 500배 이상 증가된 저항성을 나타내었다. 예를 들어, FXa-V196S/K276E, FXa-V196S/R332G, FXa-V196S/R332D, FXa-V196S/R326D, FXa-V196S/K338S, FXa-V196S/K420A 및 FXa-V196S/R424E는 AT-III에 대하여 현저한 저항성을 나타내는 군 중에 있다.
표 20. AT-III/UFH에 의한 FXa 변이체의 저해
돌연변이
(성숙 FX 넘버링)		 돌연변이
(키모트립신 넘버링)		 K0.5 (nM) S.D. (nM) %CV K 0.5-mut /K 0.5-wt n
혈장 FXa 혈장 FXa 2 1 44% 1 23
FXa WT FXa WT 2 1 59% 1 10
I195L I16L 89 41 47% 49 17
V196I V17I 5 2 37% 3 3
V196S V17S 132 25 19% 73 14
L211S/G219H L32S/G40H 8 2 30% 4 3
V196L V17L 18 2 10% 10 3
V196T V17T 48 3 7% 26 2
G197S G18S 75 9 11% 41 2
E200A E21A 5 1 24% 3 2
E200S E21S 2 0 6% 1 2
E200V E21V 4 0 6% 2 2
K202S K23S 5 2 54% 3 2
R326A R143A 3 1 19% 2 2
R326S R143S 3 0 6% 1 2
R326T R143T 5 0 7% 3 2
R326V R143V 10 2 24% 5 2
R326Q R143Q 4 2 45% 2 2
R326N R143N 10 7 69% 6 4
R326M R143M 7 3 43% 4 4
R326K R143K 6 1 14% 3 2
R326Y R143Y 6 1 11% 3 2
T327A T144A 5 1 13% 3 2
T327L T144L 5 2 33% 3 2
S334A S152A 12 8 69% 7 2
S334T S152T 19 9 45% 11 2
S334N S152N 8 0 4% 4 2
R336E R154E 5 0 6% 3 2
K338A K156A 23 3 13% 13 4
K338S K156S 34 8 24% 19 4
K338N K156N 8 1 19% 4 2
K338R K156R 6 1 24% 3 2
K338V K156V 52 2 4% 29 2
K338Y K156Y 7 0 6% 4 2
K338M K156M 4 1 25% 2 2
T327A/K338A T144A/K156A 42 3 8% 23 2
T327L/K338M T144L/K156M 5 1 27% 3 2
E200V/T327L/K338M E21V/T144L/K156M 8 2 27% 4 2
E200V/T327L/S334A/K338M E21V/T144L/S152A/K156M 40 13 31% 22 2
V196S/L211S/G219H V17S/L32S/G40H 194 35 18% 108 4
G197A/L211S/G219H G18A/L32S/G40H 128 43 34% 71 4
I195L/L211S/G219H I16L/L32S/G40H 180 29 16% 100 4
V196S/N214D V17S/N35D 154 18 12% 86 2
V196S/N214A V17S/N35A 185 107 58% 103 2
V196S/N214S V17S/N35S 186 7 4% 103 2
V196S/E216R V17S/E37R 236 57 24% 131 2
V196S/E216K V17S/E37K 400 99 25% 222 4
V196S/E216A V17S/E37A 279 111 40% 155 2
V196S/E216S V17S/E37S 178 31 17% 99 2
V196S/E218R V17S/E39R 321 22 7% 178 2
V196S/E218K V17S/E39K 404 200 49% 224 2
V196S/E218A V17S/E39A 167 38 23% 93 2
V196S/R332A V17S/R150A 3757 2834 75% 2085 4
V196S/R332D V17S/R150D 7284 3841 53% 4042 2
V196S/R332E V17S/R150E 3961 2026 51% 2198 4
V196S/R332S V17S/R150S 7247 3345 46% 4022 4
V196S/R332G V17S/R150G 8357 3285 39% 4638 4
V196S/R326D V17S/R143D 5455 3531 65% 3027 2
V196S/R326M V17S/R143M 850 286 34% 472 4
V196S/R326N V17S/R143N 1178 472 40% 654 4
V196S/R326Q V17S/R143Q 642 148 23% 356 4
V196S/R273E V17S/R93E 1491 923 62% 828 2
V196S/R273A V17S/R93A 1144 552 48% 635 4
V196S/R424A V17S/R240A 1756 811 46% 975 4
V196S/R424E V17S/R240E 3969 3725 94% 2203 4
V196S/K420A V17S/K236A 10000 0 0% 5550 3
V196S/K420E V17S/K236E 10000 0 0% 5550 3
V196S/R306E V17S/R125A 10000 0 0% 5550 3
V196S/K276A V17S/K96A 7450 3606 48% 4135 2
V196S/K276E V17S/K96E 10000 0 0% 5550 2
V196S/K420E/R424E V17S/K236E/R240E 3019 1649 55% 1675 4
V196S/K338A V17S/K156A 1783 692 39% 990 4
V196S/K338S V17S/K156S 2260 975 43% 1254 4
* 10000 nM의 K 0.5 값은 본 검정의 조건 하 10% 미만의 저해를 나타내는 상기 변이체들의 하한값을 가리킨다.
B. 항트롬빈/UFH 복합체에 의한 FXa 저해에 대한 이차 반응속도 상수( K app )의 확인
AT/UFH에 의한 FXa 변이체의 저해에 대한 이차 반응속도 상수(K app )는 사소한 변경과 함께 상술한 실시예 5A에서와 동일한 검정을 사용하여 확인하였다. 사용된 방법은 경쟁 운동역학(competitive kinetic) 또는 불연속적 방법(discontinuous methods)(Olson et al., (2004) Thromb Haemost 92(5), 929-939 참고) 보다 동시에 복수의 변이체들의 이차 반응속도 상수를 평가하는 것을 더 잘 처리할 수 있다.
UFH의 존재 하에 저해 반응을 위하여, 혈장 정제 인간 AT (Molecular Innovations)의 20 μM 스톡용액을, 1×버퍼 A (20 mM Hepes, 150 mM NaCl, 5 mM CaCl2, 0.01% Tween-20, 0.1% PEG 8000, pH 7.4)의 1.0 mL 부피 중 과잉의 UFH (2 μM) 용액으로 희석하여 1000 nM의 AT/UFH 용액을 준비하였다. AT/UFH 용액은 2 μM UFH를 함유하는 최종 부피 500 μL의 1×버퍼 A로 96 딥-웰 폴리프로필렌 플레이트에서 연속적으로 2배 희석하기 전에 상온에서 15분 동안 인큐베이션시켰다. 변형된 K app 검정에 대한 AT-III의 최종 희석액은 500 ~ 0 nM (즉, A-H열)의 범위를 가졌다. 각 AT-III 희석액의 총 35 μL를 모든 컬럼(즉, 1~12)을 채우기 위하여 96-웰 V-바닥 저장 플레이트의 각 열에 소분하였다. FXa 변이체들은 초기에 1×버퍼 A 중에서 100 nM까지 희석하였다. 이어서, 각 100 nM의 FXa 변이체를 1×버퍼 A 2.5 mL 중에서 2.0 nM의 농도로 희석하였고, 이 용액 70μL의 부분표본을 상기와 같이 동일한 미리 정해진 플레이트 맵(플레이트 당 4FXa 변이체)에 따라 96-웰 V-바닥 저장 플레이트에 나누어 놓았다.
검정 반응은 각 FXa 변이체에 대한 두 개의 동일한 검정 모두에 대해서 35 μL의 FXa 용액을 웰 당 AT/UFH의 각 희석액을 35 μL 함유하는 플레이트로 나누어 놓도록 프로그램화된 BioMek FX 액체 조작 시스템을 사용하여 개시하였다. 최종 저해 검정 조건은: 1.0 nM FXa 및 1 μM UFH 중 AT가 500 nM 내지 0 nM의 범위여서 헤파린이 과량으로 남아있는 농도의 AT 희석액. 저해 반응은 예상되는 저해 반응속도 상수에 따라 상온(~25℃)에서 다양한 시간 동안 추가 인큐베이션 하였고, 조정되어 검정에서 AT의 최고 농도(500 nM)에서 >90%의 저해에 도달할 수 있도록 하였다. 일반적인 인큐베이션 시간은 각 변이체 또는 변이체 클래스에 대하여 구체적으로 결정되었지만, 일반적으로 표 21에 기재된 인큐베이션 시간에 따랐다.
표 21. 예상 K app 값에 기초한 인큐베이션 시간의 검정
예상 k app (M-1s-1) FXa/ATIII 인큐베이션(초)
1.0E-07 10
1.0E-06 30
1.0E-05 120
1.0E-04 600
1.0E-03 3600
1.0E-02 7200
미리 정해진 인큐베이션 시간에 이어서, 반응의 40 μL 부분표본을 15 mg/ml의 폴리브렌으로 보충된 검정 버퍼 A 중 20 μL의 0.3 mM Pefafluor Xa를 함유하는 96-웰 블랙 하프-면적 플레이트로 BioMek FX에 의해 옮겼다. AT/UFH 반응을 종료하기 위해서 최종 농도 5 mg/ml로 폴리브렌(헥사디메트린 브로마이드)를 버퍼 A에 가하였다. FXa의 잔여 활성은 25℃로 설정된 형광발광 플레이트 리더기에서 60분 동안 기질 절단의 다음 초기 속도에 의하여 검정하였다. 잔여 활성 확인을 위한 최종 검정 조건은 버퍼 A 중 1.0 nM FXa 변이체, 0.1 mM Pefafluor FX 및 5 mg/mL 폴리브렌이다.
K 0.5 값을 계산하기 위한 데이터 분석은 XE Runner 데이타 분석 모듈(IDBS Software) 및 ActivityBase 소프트웨어 패키지를 사용하여 실시예 5A에서의 AT/UFH 저해 검정에서 기술된 바와 유사한 방법으로 수행하였다. 유사-1차 조건하에 실시예 5A에서 기재한 검정 설정을 사용하고, 다양한 인큐베이션 시간을 테스트하여, 다음 방정식을 사용하여 AT (K app )에 의한 저해에 대한 겉보기 이차 반응속도 상수를 계산하는 것이 가능하였다.
방정식 (8)
Figure pct00007
방정식 (9)
Figure pct00008
핏(fit) 값이 K 0.5 = t1/2에서 [AT] (검정의 시간으로 정의된)이므로, 모든 필요한 값이 K obs 을 계산하기 위하여 이용가능하고, 따라서, AT에 의하여 주어진 FXa 변이체의 저해를 위한 K app 를 계산하기 위하여 이용가능하다. 계산된 K app 값은 화학양론적 저해(S.I)에서 변화의 모든 잠재적 효과를 고려하지 않는데, 상기 S.I.는 이 값이 문헌에서 일반적으로 보고된 것을 반영하므로, 본 계산에서는 주어진 상수 값 1.2이다.
표 22는 AT/UFH를 사용하여 수행한 이차 반응속도 검정의 결과를 제공한다. 결과는 맞춰진(fitted) K 0.5 파라메터와 맞춰진 K 0.5 값(K 0.5 변이체/K 0.5 야생형)의 비율로 표현되는 야생형 FXa와 비교한 각 변이체의 AT-III 저항성 정도의 대표값으로 나타내었다. 비교를 위하여 사용된 야생형 FXa 폴리펩티드는 서열번호 1에 기재된 FX 유전자를 클로닝하는 것으로부터 제조된 재조합 야생형 FXa였고, 실시예 1 내지 3에 기재된 바와 같이, 서열번호 134의 아미노산 1-139 및 195-448에 기재된 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드로서 CHO 세포로부터 발현되었다(즉, FX WT 폴리펩티드). 몇몇 FXa 변이체들은 야생형 FXa와 비교하여 AT에 대하여 300배 이상의 증가된 저항성을 나타내었다. 예를 들어, FXa-V196S/R332G, FXa-V196S/K420E/R424E, FXa-V196S/R332D, FXa-V196S/R332S, 및 FXa-V196S/K338S가 이 군 중에 있고, 이들은 AT에 대하여 현저한 저항성을 나타내었다.
표 22. AT/UFH에 의한 저해에 대한 이차 반응속도 상수
돌연변이
(성숙 FX 넘버링)		 돌연변이
(키모트립신 넘버링)		 k app (M-1s-1) S.D. (M-1s-1) %CV k app-wt /k app-mut n
혈장 FXa 혈장 FXa 1.4E+07 7.2E+06 52% 1 3
FX WT FX WT 9.7E+06 4.6E+06 47% 1 6
I195L I16L 5.3E+05 9.1E+04 17% 18 4
V196S V17S 5.3E+05 1.7E+05 32% 18 11
T85N/K87S/V196S T[85]N/K[87]S/V17S 1.8E+05 2.1E+03 1% 55 2
Q56N/Q58S/V196S Q[56]N/Q[58]S/V17S 3.2E+05 2.1E+04 7% 31 2
K62N/G64S/V196S K[62]N/G[64]S/V17S 2.8E+05 4.3E+03 2% 35 2
L65N/E67S/V196S L[65]N/E[67]S/V17S 3.8E+05 1.7E+04 4% 25 2
E67N/V196S E[67]N/V17S 4.4E+05 4.3E+02 0% 22 2
L73N/G75S/V196S L[73]N/G[75]S/V17S 3.1E+05 7.6E+03 2% 32 2
G75N/E77S/V196S G[75]N/E[77]S/V17S 4.4E+05 5.2E+02 0% 22 2
R86N/L88S/V196S R[86]N/L[88]S/V17S 4.9E+05 5.2E+03 1% 20 2
G114N/V196S G[114]N/V17S 3.4E+05 8.0E+03 2% 28 4
D95N/D97S/V196S D[95]N/D[97]S/V17S 4.1E+05 2.0E+05 49% 24 2
E82S/V196S E[82]S/V17S 2.3E+05 2.2E+05 96% 42 8
E82N/F84S/V196S E[82]N/F[84]S/V17S 4.2E+05 1.6E+05 39% 23 3
G78N/N80S/V196S G[78]N/N[80]S/V17S 1.5E+05 5.0E+04 33% 64 4
E77N/K79S/V196S E[77]N/K[79]S/V17S 2.1E+05 1.2E+05 57% 47 2
D119N/G121S/V196S D[119]N/G[121]S/V17S 7.5E+05 1.7E+05 23% 13 2
L83N/V196S L[83]N/V17S 6.0E+05 3.2E+04 5% 16 2
K122S/V196S K[122]S/V17S 9.3E+05 1.4E+05 15% 11 4
E51N/V196S E[51]N/V17S 8.6E+05 2.9E+04 3% 11 2
Q58N/K60S/V196S Q[58]N/K[60]S/V17S 6.4E+05 1.3E+04 2% 15 2
G114N/D119N/G121S/V196S G[114]N/D[119]N/G[121]S/V17S 1.4E+05 8.1E+04 59% 71 5
V196T V17T 3.2E+06 8.3E+04 3% 3 2
G197S G18S 1.4E+06 3.9E+05 28% 7 2
S334T S152T 1.2E+07 3.1E+06 25% 1 4
K338A K156A 5.8E+06 1.1E+06 19% 2 2
K338S K156S 3.2E+06 1.7E+05 5% 3 2
K338V K156V 3.4E+06 2.1E+05 6% 3 2
T327A/K338A T144A/K156A 1.5E+06 4.6E+05 32% 7 2
T327L/K338M T144L/K156M 5.4E+06 2.7E+06 50% 2 2
E200V/T327L/K338M E21V/T144L/K156M 3.4E+06 1.2E+06 36% 3 2
E200V/T327L/S334A/K338M E21V/T144L/S152A/K156M 3.8E+06 6.9E+05 18% 3 2
V196S/L211S/G219H V17S/L32S/G40H 2.5E+05 3.9E+04 15% 39 4
D119N/G121S/V196S/L211S/G219H D[119]N/G[121]S/V17S/L32S/G40H 9.5E+04 n.d. n.d. 102 1
G114N/V196S/L211S/G219H G[114]N/V17S/L32S/G40H 5.6E+04 n.d. n.d. 173 1
G114N/D119N/G121S/V196S/L211S/G219H G[114]N/D[119]N/G[121]S/V17S/L32S/G40H 6.5E+04 2.2E+04 34% 149 5
G197A/L211S/G219H G18A/L32S/G40H 1.2E+06 5.2E+05 44% 8 2
I195L/L211S/G219H I16L/L32S/G40H 3.1E+05 3.1E+04 10% 31 4
V196S/N214D V17S/N35D 7.6E+05 4.0E+05 53% 13 2
V196S/N214A V17S/N35A 1.4E+06 1.0E+05 7% 7 2
V196S/N214S V17S/N35S 9.0E+05 8.4E+04 9% 11 2
V196S/E216R V17S/E37R 4.5E+05 1.4E+05 31% 22 2
V196S/N216K V17S/E37K 2.5E+05 2.7E+03 1% 39 2
V196S/N216A V17S/E37A 3.3E+05 8.4E+03 3% 29 2
V196S/N216S V17S/E37S 4.7E+05 4.1E+03 1% 21 2
V196S/E218R V17S/E39R 4.1E+05 8.8E+04 22% 24 2
V196S/N218K V17S/E39K 2.1E+05 2.3E+04 11% 48 2
V196S/N218A V17S/E39A 5.4E+05 5.5E+04 10% 18 4
V196S/R332A V17S/R150A 2.9E+04 6.7E+03 23% 339 3
V196S/R332D V17S/R150D 5.6E+03 1.9E+03 35% 1,754 6
V196S/R332E V17S/R150E 2.3E+04 4.9E+03 21% 428 2
V196S/R332S V17S/R150S 9.1E+03 7.9E+03 86% 1,070 5
V196S/R332G V17S/R150G 3.3E+03 1.4E+03 43% 2,926 6
V196S/R326D V17S/R143D 6.3E+03 4.9E+03 78% 1,555 3
V196S/R326M V17S/R143M 3.5E+04 2.9E+03 8% 280 4
V196S/R326N V17S/R143N 2.5E+04 3.0E+03 12% 396 4
V196S/R326Q V17S/R143Q 5.2E+04 1.1E+04 21% 186 4
V196S/R273E V17S/R93E 2.3E+04 4.2E+03 18% 415 2
V196S/R273A V17S/R93A 7.8E+03 1.2E+03 15% 1,257 4
V196S/R424A V17S/R240A 2.7E+04 1.4E+03 5% 364 2
V196S/R424E V17S/R240E 8.3E+03 2.7E+03 33% 1,173 2
V196S/K420A V17S/K236A 2.5E+04 3.9E+03 15% 389 4
V196S/K420E V17S/K236E 1.4E+04 8.4E+03 58% 672 4
V196S/R306E V17S/R125A 3.5E+04 5.4E+03 16% 281 4
V196S/K276A V17S/K96A 4.7E+05 1.6E+05 34% 21 4
V196S/K276E V17S/K96E 3.2E+05 1.8E+05 57% 30 4
V196S/K420E/R424E V17S/K236E/R240E 5.1E+03 2.8E+01 1% 1,929 2
V196S/K338A V17S/K156A 4.5E+04 2.5E+04 55% 218 4
V196S/K338S V17S/K156S 2.3E+04 7.6E+03 33% 421 10
V196S/E215N/N217S V17S/E36N/N38S 7.5E+05 6.4E+03 1% 13 2
V196S/E264N/E266S V17S/E84N/E86S 8.7E+05 6.1E+04 7% 11 2
D119N/G121S/V196S/E264N/E266S D[119]N/G[121]S/V17S/E84N/E86S 4.0E+05 1.8E+04 4% 24 2
G114N/V196S/E264N/E266S G[114]N/V17S/E84N/E86S 2.0E+05 n.d. n.d. 48 1
V196S/R429N/L431S V17S/R245N/L247S 2.4E+05 5.6E+03 2% 40 2
V196S/R243N/K245S V17S/R63N/K65S 5.0E+05 1.2E+04 2% 19 2
V196S/T293N/R295S V17S/T113N/R115S 6.1E+05 1.2E+02 0% 16 2
V196S/D389N/Y391S V17S/D205N/Y207S 7.6E+05 1.7E+04 2% 13 2
V196S/K388N V17S/K204N 7.1E+05 3.0E+04 4% 14 4
D119N/G121S/V196S/K388N D[119]N/G[121]S/V17S/K204N 1.4E+05 4.9E+03 4% 71 2
V196S/T428N/G430S V17S/T244N/G246S 9.5E+05 1.6E+04 2% 10 2
V196S/L211S/G219H/E264N/E266S V17S/L32S/G40H/E84N/E86S 2.1E+05 1.5E+04 7% 46 2
D119N/G121S/V196S/L211S/G219H/E264N/E266S D[119]N/G[121]S/V17S/L32S/G40H/E84N/E86S 1.4E+05 1.7E+04 12% 69 2
G114N/V196S/L211S/G219H/E264N/E266S G[114]N/V17S/L32S/G40H/E84N/E86S 8.3E+04 1.4E+04 16% 118 3
V196S/E264N/E266S/K388N V17S/E84N/E86S/K204N 2.7E+05 1.8E+04 7% 37 2
D119N/G121S/V196S/L211S/G219H/K388N D[119]N/G[121]S/V17S/L32S/G40H/K204N 6.2E+04 7.3E+03 12% 157 4
G114N/V196S/L211S/G219H/K388N G[114]N/V17S/L32S/G40H/K204N 3.7E+04 2.1E+03 6% 267 2
V196S/L211S/G219H/E264N/E266S/K388N V17S/L32S/G40H/E84N/E86S/K204N 2.2E+05 1.2E+04 6% 44 2
실시예 6
보조인자, 인자 Va에 대한 FXa의 기능적 보조인자 결합( K D-app )의 확인
포화 기질, 프로트롬빈(FII)의 존재하에 보조인자 인자 Va (FVa)에 대한 FXa 변이체의 기능적 보조인자 결합(K D-app)은 합성 기질 Pefafluor TH 상에서, FXa에 의한 활성화로 생성되는, 트롬빈(FIIa)의 활성을 검정함으로써 플루오로제닉 검정에서 간접적으로 검정하였다. FVa 농도의 범위는 보조인자(FVa)가 활성화 프로테아제(FXa)의 농도 보다 적어도 1000배 이상 초과하여 존재할 때 겉보기 운동 반응속도 상수(K D-app)를 계산하기 위하여 사용하였다. 검정은 기질, 프로트롬빈(FII)의 포화 수준과 함께 촉매 활성을 검정하기 전에 다양한 농도의 보조인자(FVa)가 프로트롬빈분해효소 복합체를 형성하는 포스포리피드의 존재 하에 FXa와 프리인큐베이션되는 실시예 4(기질, 프로트롬빈(FII)에 대한 FXa의 촉매 활성의 확인)에 기술된 검정의 변형으로 디자인하였다. 간단하게, 활성화된 또는 활성 부위 적정된 FXa 변이체는 포스포리피드 베지클과 함께 칼슘-함유 버퍼에서 희석하였고, 프로트롬빈분해효소 복합체를 형성하기 위하여 다양한 농도의 FVa와 혼합하였으며, 이어서 검정을 개시하기 위하여 포화 농도의 프로트롬빈 및 형광발광 기질, Pefafluor TH (H-D-CHA-Ala-Arg-AMC, Centerchem)과 혼합하였다. 생성된 트롬빈에 의한 Pefafluor TH의 촉매작용에 뒤따르는 자유 형광단, AMC (7-아미노-4-메틸쿠마린)의 방출은 주기에 걸쳐 계속적으로 측정하였고, FXa 변이체의 운동 속도 상수를 확인하였다.
A. 검정 프로토콜
다양한 FVa 농도(혈장 정제 FVa, Heamatologic Technologies, Inc.) 및 포스포리피드의 존재 하에 FXa에 의한 프로트롬빈 활성화의 운동 속도를 평가하는 검정을 위해서, FXa 변이체들이 실시예 1 내지 3에 기술된 바와 같이 발현되고, 정제되고, 활성화되고, 활성부위 적정되었다. FVa 변이체들은 1×버퍼 A (20 nM Hepes/150 mM NaCl/5mM CaCl2/0.1% BSA/0.1% PEG-8000, pH 7.4)의 0.25 mL 부피 중에서 0.4 ~ 8 pM (4×)의 농도로 연속적으로 희석하였다. FVa는 테스트한 변이체들에 따라 다양한 탑(top) 농도로 추가 희석하였지만, 일반적으로 80 μM의 신선하게 재분산된 포스포리피드(75% 포스파티딜콜린(PC)/25% 포스파티딜세린(PS); PC/PS 베지클 직경 ~120 nm; Avanti Polar Lipids)를 함유하는 1×버퍼 A의 1.0 mL 부피 중에서 2 ~ 60 nM의 범위(탑(top) 용량의 4×)로 희석하였다. FVa 용액은 80 μM의 PC/PS 베지클(4×)을 함유하는 1×버퍼 A의 0.4 mL 최종 부피와 함께 12-채널 딥-웰 폴리프로필렌 플레이트에서 연속적으로 1.8배 희석하였다. FVa 희석 시리즈들은 이어서 미리 정해진 플레이트 맵(4FXa 변이체/플레이트)에 따라 96-웰 둥근-바닥 블랙 검정 플레이트에서 4×FXa 희석액(각 25 μL)과 함께 1:1로 혼합하였고 다양화된 농도의 FVa와 함께 평형화된 프로트롬빈분해효소 복합체를 형성하기 위하여 25℃에서 15분 동안 프리인큐베이션하였다. 최종 2×용액(50 μL)은 다음과 같다: 0.2-4 pM FXa 변이체, 60-0 nM FVa 및 40 μM PC/PS 베지클.
5000 nM (2×) 활성부위 적정된 및 DFP/FPR-cmk 처리된 프로트롬빈(FII)의 용액은 4개의 검정에 충분한 부피를 제공하도록 0.1 mM Pefafluor TH 기질을 함유하는 30 mL의 1×버퍼 A 중에서 제조하였다. 이는 실시예 4, 표 17에 보고된 K M 값의 적어도 10-50배 이상일 것인 2×포화 농도의 프로트롬빈(FII)을 의미하였다. 검정 반응은 50 μL의 각 FXa 변이체 및 FVa 희석액(프로트롬빈분해효소 복합체)를 함유하는 4개 검정 플레이트로 50 μL의 FII/Pefafluor TH 희석액을 나누어 놓도록 프로그램화된 BioMek FX 액체 조작 시스템을 사용하여 개시하였다. 검정에서 시약의 최종 농도는 다음과 같다: 0.1 ~ 20 pM FXa, 20 μM PC/PS 베지클, 50 μM Pefafluor TH, 2.5 μM 프로트롬빈(FII) 및 0 ~ 0.5 nM, 0 ~ 0.1 nM, 0 ~ 3.0 nM 또는 0 ~ 10 nM FVa 희석액이고, 다른 FVa 희석액 범위를 때때로 사용하였다. 반응은 25℃에서 30분 동안 SpectraMax 형광발광 플레이트 리더기에서 모니터링하였다. 자유 AMC의 표준 곡선은 0 μM 에서 100 μM AMC를 커버하는 용량 범위를 사용하여 이어지는 데이타 분석 계산에서 RFU의 μM로의 환산 계수의 역할을 하였다.
B. 데이타 분석
촉매적 활성에 기초한 FXa에 대한 Fva 변이체의 기능적 친화성을 확인하기 위해서, SoftMax Pro application (Molecular Devices)로 수집한 미가공 데이타를 텍스트 파일로 전송하였다. 추가적인 비-선형 데이타 분석은 XE Runner 데이타 분석 모듈(IDBS Software)을 사용한 ActivityBase 소프트웨어 패키지 내에서 직접 수행하였다. 데이타 분석은 사소한 변경과 함께 근본적으로 실시예 4C에 기재된 바와 같다. Abase 주형은 각 FVa 농도에서 테스트한 FXa 변이체들의 포물선 반응 속도(μM/sec2)가 Vmax 및 K D-app을 위한 핏(fit) 값을 내기 위하여 방정식 (10)으로 주어진 표준 직사각형 쌍곡선(즉, Michelis Menten 방정식)의 함수에 자동적으로 맞도록 설정하였다.
방정식 (10)
Figure pct00009
표 23은 검정한 각 FXa 변이체들에 대한 기능적 친화성(K D-app)을 기재한다. 또한, 재조합 야생형 FXa (FXa WT로 지칭됨) 및 혈장 정제 FXa (Haematologic Technologies, Inc)도 검정하였다. 표 23은 결과를 친화성에 대한 운동 상수, K D-app (nM)와 FXa 변이체의 기능적 친화성과 비교한 야생형 FXa의 기능적 친화성의 비율로서 표시하고, 여기서 상기 각 FXa 변이체의 기능적 친화성은 기질, 프로트롬빈(FII)의 활성화에 대한 K D-app 값에 의하여 정의된다. FXa 변이체의 활성을 야생형 FXa와 비교할 때, 이는 FXa 변이체 활성을 야생형 FXa과 비교할 때, 이는 활성의 모든 차이점이 돌연변이(들)의 결과인 것이고, 차이점, 예를 들어 다른 발현 시스템에 관련된 번역후 변형의 결과인 것이 아니라는 점을 확실히 하기 위하여 변이체 FXa 폴리펩티드를 위해 사용된 바와 동일한 조건을 사용하여 발현되고 정제된 재조합 야생형 FXa 폴리펩티드(FXa WT)와 비교하였다. 그러므로, 비교를 위하여 사용한 야생형 FXa 폴리펩티드는 FX 유전자를 클로닝하는 것으로부터 생성된 재조합 야생형 FXa였고, 상기 FX 유전자의 서열은 서열번호 1에 기재되어 있으며, 실시예 1 내지 3에 기재된 바와 같이, 서열번호 134의 아미노산 1-139 및 195-448에 기재된 아미노산 서열을 가진 폴리펩티드(즉, FXa WT 폴리펩티드)로서 CHO 세포로부터 발현되었다. 표 23 은 또한 표준 편차(S.D.), 변동계수(퍼센트로; %CV) 및 검정의 수를 제공한다.
일부 변이체들(예를 들어, FXa-R326Y 및 FIXa-FXa-L211S/G219H)이 야생형 친화성과 유사하거나 K D-app에서 얼마 안되는 증가를 보인 반면, 몇몇 변이체들은 K D-app에서 10 ~ 100배 이상의 증가와 함께, 기능적 친화성에서 현저한 감소를 나타내었다. 현저하게 증가된 보조인자 의존성을 가진 변이체들(실시예 4)은 기능적 보조인자 친화성에서 가장 큰 감소를 나타내었다. 예를 들어, FXa-V196S/R326Q, FXa-V196/K420E/R424E, FXa-V196S/R273E 및 FXa-V196/K338S가 이러한 군 중에 있다.
표 23. FXa 변이체의 기능적 보조인자 친화성(K D-app)
돌연변이
(성숙 FX 넘버링)		 돌연변이
(키모트립신 넘버링)		 K D-app (nM) S.D. (nM) %CV K D-WT/ K D-mut n
혈장 FXa 혈장 FXa 0.01 0.00 21% 1.64 5
FX WT FX WT 0.02 0.01 47% 1.00 3
I195L I16L 0.18 0.06 33% 0.09 10
V196S V17S 0.39 0.12 32% 0.04 14
Q56N/Q58S/V196S Q[56]N/Q[58]S/V17S 0.49 0.18 37% 0.03 2
K62N/G64S/V196S K[62]N/G[64]S/V17S 0.72 0.25 34% 0.02 2
E67N/V196S E[67]N/V17S 1.08 0.13 12% 0.01 2
L73N/G75S/V196S L[73]N/G[75]S/V17S 0.45 0.07 16% 0.04 2
G75N/E77S/V196S G[75]N/E[77]S/V17S 0.90 0.28 31% 0.02 2
G114N/V196S G[114]N/V17S 0.73 0.24 32% 0.02 3
D119N/G121S/V196S D[119]N/G[121]S/V17S 0.62 0.19 30% 0.03 3
K122S/V196S K[122]S/V17S 0.46 0.17 37% 0.03 3
E51N/V196S E[51]N/V17S 0.38 0.05 14% 0.04 2
Q58N/K60S/V196S Q[58]N/K[60]S/V17S 0.52 0.19 36% 0.03 3
L211S/G219H L32S/G40H 0.02 0.00 7% 0.67 3
V196L V17L 0.06 0.01 21% 0.27 3
V196T V17T 0.31 n.d. n.d. 0.05 1
G197S G18S 0.18 0.07 39% 0.09 3
R326A R143A 0.03 n.d. n.d. 0.60 1
R326S R143S 0.03 n.d. n.d. 0.55 1
R326T R143T 0.04 n.d. n.d. 0.42 1
R326Q R143Q 0.03 n.d. n.d. 0.50 1
R326N R143N 0.04 0.01 22% 0.44 2
R326M R143M 0.04 n.d. n.d. 0.39 1
R326K R143K 0.03 n.d. n.d. 0.60 1
R326Y R143Y 0.02 0.00 2% 0.86 2
K338A K156A 0.20 n.d. n.d. 0.08 1
K338S K156S 0.15 0.04 25% 0.11 3
K338N K156N 0.06 n.d. n.d. 0.25 1
K338R K156R 0.02 0.01 55% 0.73 2
K338V K156V 0.15 0.05 35% 0.11 3
K338M K156M 0.36 n.d. n.d. 0.04 1
T327A/K338A T144A/K156A 0.24 0.15 59% 0.06 2
T327L/K338M T144L/K156M 0.03 0.00 17% 0.61 2
E200V/T327L/S334A/K338M E21V/T144L/S152A/K156M 0.11 0.04 37% 0.14 3
V196S/L211S/G219H V17S/L32S/G40H 0.32 0.09 29% 0.05 2
I195L/L211S/G219H I16L/L32S/G40H 0.37 0.05 14% 0.04 3
V196S/N214D V17S/N35D 0.32 0.07 23% 0.05 3
V196S/N214A V17S/N35A 0.38 n.d. n.d. 0.04 1
V196S/N214S V17S/N35S 0.33 n.d. n.d. 0.05 1
V196S/E216R V17S/E37R 0.16 0.06 38% 0.10 3
V196S/N216K V17S/E37K 0.25 0.06 23% 0.06 2
V196S/N216A V17S/E37A 0.29 0.12 41% 0.05 2
V196S/N216S V17S/E37S 0.40 0.13 31% 0.04 3
V196S/E218R V17S/E39R 0.34 0.12 34% 0.05 3
V196S/N218K V17S/E39K 0.29 0.05 18% 0.05 2
V196S/N218A V17S/E39A 0.36 0.13 35% 0.04 3
V196S/R332A V17S/R150A 0.54 n.d. n.d. 0.03 1
V196S/R332D V17S/R150D 1.70 0.60 35% 0.01 3
V196S/R332E V17S/R150E 0.49 0.04 7% 0.03 2
V196S/R332S V17S/R150S 0.56 0.11 19% 0.03 2
V196S/R332G V17S/R150G 0.56 0.12 22% 0.03 3
V196S/R326D V17S/R143D 1.02 0.33 32% 0.02 3
V196S/R326M V17S/R143M 0.56 0.27 48% 0.03 4
V196S/R326N V17S/R143N 2.21 0.15 7% 0.01 2
V196S/R326Q V17S/R143Q 1.21 0.26 21% 0.01 3
V196S/R273E V17S/R93E 15.04 3.42 23% 0.001 3
V196S/R273A V17S/R93A 2.45 0.08 3% 0.01 3
V196S/R424A V17S/R240A 5.86 0.11 2% 0.003 2
V196S/R424E V17S/R240E 6.31 1.00 16% 0.002 3
V196S/K420A V17S/K236A 0.37 n.d. n.d. 0.04 1
V196S/K420E V17S/K236E 0.39 n.d. n.d. 0.04 1
V196S/R306E V17S/R125A 2.25 1.49 66% 0.01 5
V196S/K276A V17S/K96A 0.62 0.11 18% 0.03 3
V196S/K276E V17S/K96E 0.70 0.02 3% 0.02 3
V196S/K420E/R424E V17S/K236E/R240E 20.86 13.15 63% 0.001 4
V196S/K338A V17S/K156A 0.93 0.24 26% 0.02 3
V196S/K338S V17S/K156S 0.91 0.19 21% 0.02 3
V196S/E215N/N217S V17S/E36N/N38S 0.28 0.03 10% 0.06 2
V196S/E264N/E266S V17S/E84N/E86S 0.48 0.03 6% 0.03 2
V196S/R429N/L431S V17S/R245N/L247S 1.06 0.34 32% 0.01 2
V196S/T293N/R295S V17S/T113N/R115S 0.64 0.15 23% 0.02 2
V196S/K388N V17S/K204N 0.59 0.06 10% 0.03 2
V196S/T428N/G430S V17S/T244N/G246S 0.73 0.10 14% 0.02 2
실시예 7
FXa 폴리펩티드의 약동학 분석
FXa 변이체 폴리펩티드의 약동학(PK) 물성은 정맥 투여에 뒤따른 다양한 시점에서 마우스 혈장 중의 변이체 FXa의 양을 측정하는 것으로 검정하였다. ELISA 검정은 약동학 물성을 검정하기 위하여 마우스 혈장 중 총 FXa 프로테인을 정량하기 위하여 사용하였다.
A. 동물
Charles Rivers Laboratories (Hollister, CA)에서 공급한 수컷 CD-1 마우스(30-40 gm)을 처치 전에 적어도 3일 동안 격리시켰다. 일련의 PK 연구를 위하여, 수컷 CD-1 마우스(30-37 gm)를 내재하는 목 정맥 캐뉼라에 맞추었다. PD 또는 PK 실험에 사용하기 전에 여과된 수돗물과 음식은 임의 이용가능하였다.
B. 주입 및 혈액 수집
마우스(시점 당 N=3)는 꼬리 정맥을 통하여 정맥으로(0.5 mg/kg, 주입용량 2 ml/kg) FXa 폴리펩티드를 투여하였다. 투여 후 적절한 시간에(2-960분), 동물들을 마취시켰고 말단 심장천자를 통하여 시트레이트가 함유된 주사기로 혈액을 뽑았다. 말단 PK 연구를 위하여 불충분한 양의 단백질이 이용가능한 경우, 4-6의 동물만을 사용한 일련의 출혈 및 비틀거리는 시점을 이용하였다; 두 마우스가 과도한 혈액 용적의 제거 없이 모든 시점을 수집하기 위하여 각 전체 시간 코스에 사용되었다. 일련의 출혈 실험을 위하여, 혈액은 소량의 혈액을 0.9% 생리식염수를 함유하는 0.1 mL 주사기로 첫 번째 제거함으로써 절제된 의식있는 동물 중에서 샘플채취하였다. 0.1 M의 소듐 시트레이트 4.5 μL를 함유한 주사기를 부착하고 0.05 mL의 혈액을 주사기로 뽑았고, 혈액을 1.5 mL의 튜브로 옮겼다. 처음의 주사기를 다시 부착하고 0.07 mL의 생리식염수를 캐뉼라를 통하여 역으로 주입하였다. 캐뉼라는 다음 시점까지 뚜껑을 덮었고, 다음 시점은 상기 과정이 되풀이 될 때였다. 연속적 및 말단 연구 모두에서, 혈액 샘플은 수집 15분 내에 원심분리하였고(9000 rpm, 8분, 4℃), 혈장은 제거하였고, 즉시 액체 질소로 급속 냉동하였고, 얼려서(-70℃) 저장하였다.
C. PK 검정
상기 실시예 7B에 기술한 바와 같이 말단 실험을 위한 심장천자 또는 연속적 실험을 위한 내재 카테터에 의하여 투여 후(즉, 투여 전, 2, 5, 10, 15, 30, 60, 120, 240, 360, 및 960분) 960분까지 다양한 시간에서 시트레이티드 혈액 샘플을 수집하였다. FXa의 혈장 농도는 인간 인자 X/Xa 특이적 ELISA를 사용하여 확인하였다. 다클론 검출 및 캡쳐 항체(#FX-EIA-C, Affinity Biologicals, Ancaster, ON)의 맞춤 쌍을 사용하였다. FX/Xa ELISA는 관심 변이체의 약동학 파라메터를 확인하기 위하여 사용된 수단을 제공하였다.
간단하게, FX/FXa (1:500)에 대한 친화성 정제 다클론 항체를 상온(RT)에서 두 시간 동안 코팅 버퍼(15 mM Na2CO3, 35 mM NaHCO3, pH 9.6) 중 플레이트의 웰 위에 코팅하였다. 플레이트를 Wash Buffer (PBST)로 세적하였고, 샘플 희석액(100 mM Hepes, 100 nM NaCl, 10 mM EDTA, 1.0% BSA, 0.1% Tween-20, pH 7.2) 중에 희석된 FX/FXa를 함유하는 혈장 샘플들을 적용하였다. 모든 샘플들과 표준들은 1:200 CD-1 마우스 혈장의 최종 농도로 정규화하였고, 일관성을 유지하기 위하여 샘플 희석액으로 1:200 희석하였다. 혈장 샘플들을 플레이트 상에서 1:200 및 1:1000으로 희석하였고, 이어서 1:1000 및 1:4000의 추가 희석세트를 제공하는 1:4 희석을 수행하였다. 부착되지 않은 물질들을 제거하기 위하여 플레이트를 세척한 뒤, FX/FXa에 대한 퍼옥시다아제 컨쥬게이티드된 검출 항체(1:1000)를 캡쳐된 FX/FXa에 결합시키기 위해 플레이트에 가하였다. 부착되지 않은 컨쥬게이티드된 항체를 제거하기 위하여 플레이트를 세척한 뒤, 퍼옥시다아제 활성을 화학발광 기질(SuperSignal Femto, #37074, Thermo Scientific)과 함께 인큐베이션하여 개시하였다. 화학발광 신호는 SpectraMax 화학발광 플레이트 리더기를 사용하여 측정하였다. 퍼옥시다아제 활성의 표준 곡선은 0.82 pg/ml 내지 25 ng/ml의 농도 범위에 걸쳐서 특징적으로 선형이었다. FXa 변이체 자체는 다른 FXa 변이체에 대한 항체 친화성의 차이를 제거하기 위하여 표준 곡선을 위하여 사용하였다. 각 샘플을 두 개의 별도 검정 플레이트에서 측정하였고, 표준 곡선의 선형 범위 내의 이러한 측정은 혈장 샘플에서 FXa 변이체이 농도를 계산하기 위하여 사용하였다.
D. PK 데이타 분석
FX 변이체들을 이용한 마우스 연구로부터의 PK (ELISA) 파라메터들은 WinNonLin (v5.1, Pharsight Corp., Mountain View, CA)에서 비 구획분석을 사용하여 계산하였다. FXa 변이체들의 PK는 겉보기 이지수 혈장 감쇠(apparent biexponential plasma decay)를 따랐다. 테스트한 각 변이체에 대한 선택 파라메터들을 표 25에 제공한다. PK 파라메타들은 반감기(말단, 분), MRT(MRT0-last, 분), 곡선 하 면적(AUC), 0-last (분, μg/mL)/용량(mg/kg); 최대 농도(Cmax;(μg/mL)/용량(μg/kg), Vd (mL/kg) 및 클리어런스(CL, mL/min/kg)를 포함하였다.
표 24. 약동학 파라메터를 계산하기 위하여 사용된 정의 및 수식
용어/수식 정의
혈장 반감기 혈장 FXa 농도 대 시간 프로파일의 말단(terminal) 단계 중 FXa 폴리펩티드의 반감기
베타 T1/2 (T1/2β) 혈장 FXa 농도 대 시간 곡선의 로그-선형 플롯의 말단 단계 중 음의 경사로 나뉘는 ln2로 계산됨
MRT0-last FXa 폴리펩티드가 인체에 머무는 평균 시간;
AUMC 0-last /AUC 0-last로 계산되고, AUMC0-last는 첫 순간-대-시간 곡선 하의 총 면적이고, AUC는 이어서 기술된 바와 같음.
AUC0- last /용량 [AUC(0-t)]로 계산되고, t는 IV 용량(mg/kg)으로 나뉘는 FXa 폴리펩티드의 측정가능한 혈장 농도의 마지막 시점임.
AUC0- inf/용량 [AUC(0-t) + Ct/(ln2/ T1/2β)]로 계산되고, t는 IV 용량(mg/kg)으로 나뉘는 FXa 폴리펩티드의 측정가능한 혈장 농도의 마지막 시점임.
Cmax/용량 (mg/kg 당 ug/mL)
Cmax 복용 후의 시간에 상응하는 최대의 측정된 혈장 FXa 농도
Cl (용량 / AUC 0-inf)로 계산되는 전신 클리어런스
Vss MRT*Cl로 계산되는 분배의 정상 상태 부피
Vz l/(ln2/T1/2β)로 계산되는 말단 제거 상수(β)에 기초한 분배 부피
표 25. ELISA에 의해 검정된 FXa 변이체의 PK 물성
돌연변이
(성숙 FX 넘버링)		 돌연변이
(키모트립신 넘버링)		 n Beta T1/2 Tmax Cmax/ 용량 AUC0-last
/용량		 AUC0-inf
/용량		 Vz Cl MRT (0-last) MRT (0-inf)
I195L I16L 4 320 4 16 548 788 577 1.3 81 312
E82S/V196S E[82]S/V17S 1 403 22 29 1719 3388 172 0.3 272 120
V196S V17S 4 523 3 30 1840 2757 306 0.44 241 743
G197S G18S 2 225 6 17 1584 2383 134 0.43 125 310
K338A K156A 2 462 2 21 1411 1844 350 0.56 267 577
K338S K156S 2 570 4 16 795 1770 402 0.71 106 715
V196S/L211S/G219H V17S/L32S/
G40H		 2 405 4 23 1408 1723 336 0.58 248 483
I195L/L211S/G219H I16L/L32S/
G40H		 2 337 4 23 1095 1708 284 0.59 111 377
V196S/R332A V17S/R150A 1 172 5 19 1205 1522 163 0.66 110 213
V196S/R332D V17S/R150D 2 427 2 14 1250 1503 410 0.67 249 473
V196S/R332S V17S/R150S 2 516 2 20 632 1471 382 1.07 67 626
V196S/R332G V17S/R150G 1 266 2 22 1029 1463 262 0.68 101 292
E67N/V196S E[67]N/V17S 2 322 2 20 1113 1396 328 0.72 157 337
R86N/L88S/V196S R[86]N/L[88]S/V17S 2 249 2 21 747 1353 267 0.74 75 309
D95N/D97S/V196S D[95]N/D[97]S/V17S 2 162 10 16 938 1333 178 0.76 75 195
D119N/G121S/V196S D[119]N/G[121]S/V17S 2 473 2 21 755 1312 566 0.82 87 489
L83N/V196S L[83]N/V17S 2 213 4 23 981 1298 251 0.84 91 226
V196S/E264N/E266S V17S/E84N/
E86S		 2 400 2 23 987 1296 441 0.77 149 383
V196S/R243N/K245S V17S/R63N/
K65S		 2 306 4 15 1150 1269 348 0.79 217 329
V196S/D389N/Y391S V17S/D205N/
Y207S		 2 267 2 23 1046 1250 308 0.87 166 306
V196S/K388N V17S/K204N 1 514 2 18 639 1151 644 0.87 104 548
G114N/V196S G[114]N/V17S 2 277 2 22 808 1132 342 0.91 93 285
T85N/K87S/V196S T[85]N/K[87]S/V17S 2 309 2 19 933 1131 370 0.99 175 341
G114N/V196S/L211S/G219H G[114]N/V17S/L32S/G40H 2 326 2 22 928 1098 412 0.92 137 289
G78N/N80S/V196S G[78]N/N[80]S/V17S 1 195 2 14 631 768 373 1.31 93 194
D119N/G121S/V196S/E264N/E266S D[119]N/
G[121]S/V17S/E84N/E86S		 1 384 2 12 611 741 689 1.39 139 351
V196S/L211S/G219H/E264N/E266S V17S/L32S/
G40H/E84N/
E86S		 1 249 2 12 522 658 540 1.55 78 210
D119N/G121S/V196S/L211S/G219H D[119]N/
G[121]S/V17S/L32S/G40H		 1 332 6 11 530 614 786 1.63 112 239
실시예 8
FXa 폴리펩티드 응혈원 활성의 인 비보( In vivo ) 검정
FVIII (FVIII-/-)결함 마우스주가 FXa 폴리펩티드의 응혈원 활성을 평가하기 위하여 혈우병 A의 마우스 모델로 확립되었다. 마우스는 FXa 폴리펩티드로 처리하였고, 20분 안에 소실된 혈액량을 FXa 폴리펩티드의 응혈원 활성을 확인하기 위하여 측정하였다.
A. FXa 폴리펩티드 응혈원 활성의 인 비보( In vivo ) 검정
수컷 FVIII-/- 마우스는 케타민/자일라진 칵테일(생리식염수 중 45 mg/ml 및 3.6 mg/ml)의 복강내 투여로 마취시켰고 체온이 떨어지지 않도록 가열 플랫폼(39℃)에 위치시켰다. 실험방의 온도는 83℉로 유지하였다. 꼬리 절단 10분 전에, 꼬리는 미리 덥혀진 PBS (15 mL 원심분리 튜브; 39℃) 10 mL에 담갔다. 최대 열 다섯마리의 마우스를 단일 주입으로 꼬리 정맥을 통하여 재조합 인간 FXa (5 mM MES pH 5.5, 100 mM NaCl 중에 희석된) 또는 변형 FXa 폴리펩티드(5 mM MES pH 5.5, 100 mM NaCl 중에 희석된)으로 주사하였다. 음성 대조군 마우스는 단지 적절한 버퍼만을 투여하였다. 주사를 놓친 경우, 그 동물은 연구에서 제외하였다.
FXa 폴리펩티드 또는 버퍼 주입은 꼬리 절단 5분 전에 이루어졌다. 꼬리 절단은 꼬리 끝으로부터 5 mm에서 면도날을 사용하여 수행하였고, 혈액은 20분 동안 PBS로 수집하였다. 수집 기간의 끝무렵에 총 혈액 손실을 평가하였다. 수집 튜브를 혼합하고, 각 샘플의 1 mL 부분표본을 취하여 헤모글로빈 수치를 검정하였다. 트리톤 X-100을 멸균수 중에 1:4로 희석하였고 100 μL를 용혈을 일으키기 위하여 1 mL의 샘플에 가하였다. 샘플의 흡광도를 파장 546 nm에서 측정하였다. 혈액 손실량을 계산하기 위하여, PBS 중에 희석되고 트리톤 X-100으로 상기와 같이 용혈된, 뮤린(murine) 혈액의 공지 부피의 546 nm에서의 흡광도를 측정함으로써 생성한 표준 곡선으로 흡광도를 읽었다. 값은 평균±표준편차로 표현하였다.
1. 야생형 FXa 응고제 활성을 검정하는 용량 반응 연구
한 연구에서, 야생형 FXa의 응고제 활성은 0.1, 0.3 및 1 mg FXa/kg 체중의 용량을 사용하여 상기 기술된 바와 같이 FVIII-/- 마우스로 분석하였다. 버퍼(5 mM MES pH 5.5, 100 mM NaCl)를 투여받은, 대조군의 혈액 손실은 940.95±30.78 μL (n=9) 이었다. 0.1 mg/kg에서 야생형 FXa의 처치는 혈액 손실에 저해 효과가 없었고(958.76±31.91 μL, n=9), 반면 0.3 mg/kg 및 1 mg/kg의 처치는 각각 870.36±53.92 μL 및 802.62±52.92 μL (각 용량에서 n=10)로의 혈액 손실 저해 결과를 낳았다. 정확한 ED50 값은 야생형 FXa의 고용량에서 관찰된 독성 때문에 본 연구에서 확인하지 않았다.
이어지는 연구에서, 야생형 FXa의 최대 허용 용량(maximum tolerated dose, MTD)은 0.125 mg/kg인 것으로 확인되었다. 추가 연구는 0.1 mg/kg의 단일 용량에 따르는 응고를 시험하였다. 본 실험에서 야생형 FXa을 이용한 처치는 버퍼만을 투여한 군(890.14±23.97 μL 내지 914.03±23.48, 버퍼 군, n=15; 투여 군, n=10)과 비교하여 저해 효과가 없었다. Dunn's 후 테스트(용량 반응 실험)에 뒤따르는 Kruskall-Wallis를 사용한 통계학적 분석 및 Mann Whitney 테스트(단일 용량 실험) 각각은 0.1 mg/kg의 야생형 FXa는 혈액 손실의 현저한 저해가 없음을 증명하였다.
2. FXa-I195L (I16L) 응고제 활성을 검정한 용량 반응 연구
I195L (키모트립신 넘버링에 따른 I16L) FXa 돌연변이의 응혈원 효과의 용량 반응은 상술한 바와 같이 FVIII-/- 마우스에서 테스트하였다. 첫 분석에서, 버퍼(5 mM MES pH 6, 100 mM NaCl)만을 투여받은 동물군 중 혈액 손실은 930.74±16.33 μL (n=9)이었다. 0.2, 0.6 및 2 mg/kg의 FXa-Il95L (I16L)의 처치는 각각 717.34±41.34 μL (n=8), 704.93±46.45 μL (n=10), 및 488±95.65 μL (n=11)의 혈액 손실의 현저한 저해 결과를 낳았다(Dunn's 후 테스트에 뒤이은 Kruskal-Wallis를 사용하여 p<0.05).
두 번째 테스트에서, 버퍼만의 군 중 혈액 손실은 910.85±23.79 μL (n=12)이었다. 0.46 mg/kg의 FXa-Il95L (I16L)의 처치는 현저하지 않은 혈액 손실 저해(828.24±36.79 μL; n=8) 결과를 낳았다. 그러나, 증가된 용량인 1.53 및 4.58 mg/kg의 FXa-Il95L (I16L)의 처치는 대조군과 비교하여 각각 현저한 혈액 손실 저해: 690.99±41.88 μL (n=9) 및 121.62±76.52 μL (n=7) 결과를 낳았다(Dunn's 후 테스트에 뒤이은 Kruskal-Wallis를 사용하여 p<0.05).
3. FXa-V196S (V17S) 응고제 활성을 검정한 용량 반응 연구
FXa-V196S (키모트립신 넘버링에 따른 V17S) 돌연변이의 응혈원 효과의 용량 반응은 상기 방법을 이용하여 FVIII-/- 마우스에서 검정하였다. 첫 번째 테스트에서, 버퍼(5 mM MES pH 6, 100 mM NaCl)만을 투여받은 동물의 대조군의 혈액 손실은 855.94±62.55 μL (n=9)였다. 0.7 및 2.33 mg/kg의 FXa-Vl96S (V17S)의 처치는 대조군과 비교하여 각각 736.16±21.75 μL (n=8), 및 614.38±75.13 μL (n=8)의 혈액 손실의 현저하지 않은 저해 결과를 낳았다. 그러나, 증가된 용량인 6.98 mg/kg의 FXa-Vl96S (V17S)의 처치는 버퍼만을 투여한 군과 비교하여 현저한 혈액 손실 저해 결과를 낳았다(151.51±32.43 μL (n=7); Dunn's 후 테스트에 뒤이은 Kruskal-Wallis를 사용하여 p<0.05).
두 번째 테스트에서, 버퍼만의 군 중 혈액 손실은 877.36±41.7 μL (n=8)이었다. 0.7 mg/kg의 FXa-Vl96S (V17S)의 처치는 현저하지 않은 혈액 손실 저해(532.80±53.34 μL; n=9) 결과를 낳았다; 반면, 2.33 및 6.98 mg/kg의 FXa-Vl96S (V17S)의 처치는 버퍼만의 군과 비교하여 각각 현저한 혈액 손실 저해가 있었다(189.66±40.14 μL (n=8) 및 89.28±14.46 μL (n=7); Dunn's 후 테스트에 뒤이은 Kruskal-Wallis를 사용하여 p<0.05).
세 번째 테스트에서, 버퍼만의 군에서 혈액 손실은 1018.82±27.13 μL (n=9) 였다. 0.7 mg/kg의 FXa-Vl96S (V17S)의 처치는 현저하지 않은 혈액 손실 저해 결과를 낳았다(760.27±25.92 μL, n=9). 2.33 및 6.98 mg/kg의 FXa-Vl96S (V17S)의 처치는 버퍼만의 군과 비교하여 현저한 혈액 손실 저해가 있었다(각각 414.06±61.89 μL (n=9) 및 187.24±25.08 μL (n=9); Dunn's 후 테스트에 뒤이은 Kruskal-Wallis를 사용하여 p<0.05).
4. 감소된 온도에서 FXa 돌연변이 응고제 활성을 검정하는 용량 반응 연구
FXa-V196S (V17S) 응고 활성은 또한 72 ~ 74℉의 상온에서 검정하였는데, 반면 이전의 연구(실시예 8A1-3)는 82℉의 상온에서 수행하였다. 첫 검정에서, 버퍼만의 군의 혈액 손실은 939.93±19.12 μL (n=9) 였다. 0.7 mg/kg의 FXa-Vl96S (V17S)의 처치는 혈액 손실에서 현저하지 않은 감소를 낳은 반면(789.71±26.04 μL, n=9), 2.33 및 6.98 mg/kg의 FXa-Vl96S (V17S)의 처치는 버퍼만의 군과 비교하여 혈액 손실에 현저한 감소를 낳았다(각각 502.48±93.31 μL (n=8) 및 141.81±30.37 μL (n=9); Dunn's 후 테스트에 뒤이은 Kruskal-Wallis를 사용하여 p<0.05).
72 ~ 74℉의 상온에서의 두 번째 검정에서, 버퍼만의 군의 혈액 손실은 977.42±20.61 μL (n=9) 였다. 0.7 mg/kg의 FXa-Vl96S (V17S)의 처치는 혈액 손실에서 현저하지 않은 감소를 낳았다(690.52±79.41 μL, n=10). 2.33 및 6.98 mg/kg의 FXa-V17S의 처치는 버퍼만의 군과 비교하여 혈액 손실에 현저한 감소를 낳았다(각각 305.74±70 μL (n=10) 및 152.42±37.44 μL (n=10); Dunn's 후 테스트에 뒤이은 Kruskal-Wallis를 사용하여 p<0.05).
다른 FXa 폴리펩티드의 응고 활성은 72 ~ 74℉의 상온에서 상술한 바와 같이 확인하였다. 테스트한 FXa-폴리펩티드에 대한 비-선형 회귀를 이용하여 계산된 ED50 값은 아래 표 26에 나타나있다.
표 26. 용량 반응 ED50 값
돌연변이
(성숙 FX 넘버링)		 돌연변이
(키모트립신 넘버링)		 n/group/expt N (expts) 평균 ED50 (mg/kg)
I195L I16L 7 - 12 2 2.5
V196S V17S 7 - 10 5 2.0
G114N/V196S G[114]N/V17S 8 - 10 2 1.4
D95N/D97S/V196S D[95]N/D[97]S/V17S 8 - 10 2 >3
E82S/V196S E[82]S/V17S 8 - 10 2 >3
G197S G18S 8 - 10* 2 0.7
K338A K156A 7 - 10 3 1.9
K338S K156S 7 - 10 2 1.6
V196S/L211S/G219H V17S/L32S/G40H 7 - 10 3 2.5
I195L/L211S/G219H I16L/L32S/G40H 8 - 9 3 1.7
V196S/R332A V17S/R150A 8 - 10 2 0.2
V196S/R332D V17S/R150D 8 - 10 3 0.08
V196S/R332S V17S/R150S 8 - 9 3 0.1
V196S/R332G V17S/R150G 8 - 10 5 0.2
V196S/ K338A V17S/K156A 8 1 7.9
V196S/ K338S V17S/K156S 8 - 10 1 >5
V196S/E264N/E266S V17S/E84N/E86S 8 - 10 2 2.7
V196S/R243N/K245S V17S/R63N/K65S 8 - 10 2 >3
V196S/L211S/G219H/E264N/E266S V17S/L32S/G40H/E84N/E86S 9 - 10 2 2.1
D119N/G121S/V196S/L211S/G219H/K388N D[119]N/G[121]S/V17S/L32S/G40H/K204N 8 - 10 2 >3
* = 실험 2에서 가장 높은 용량 군은 3 마리의 동물만을 가지며, 이 용량에서 사망이 관찰되었다.
통상의 기술자에세 변형은 자명할 것이기 때문에, 본 발명은 첨부된 청구항의 범위만으로 제한되는 것이 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> Catalyst Biosciences, Inc. Madison, Edwin Thanos, Christopher <120> MODIFIED FACTOR X POLYPEPTIDES AND USES THEREOF <130> 33328-4941PC <140> Not yet assigned <141> Herewith <150> 61/741,806 <151> 2012-07-25 <160> 557 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 1467 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> Factor X coding sequence <300> <308> NCBI: NM_000504.3 <309> 2012-01-23 <400> 1 atggggcgcc cactgcacct cgtcctgctc agtgcctccc tggctggcct cctgctgctc 60 ggggaaagtc tgttcatccg cagggagcag gccaacaaca tcctggcgag ggtcacgagg 120 gccaattcct ttcttgaaga gatgaagaaa ggacacctcg aaagagagtg catggaagag 180 acctgctcat acgaagaggc ccgcgaggtc tttgaggaca gcgacaagac gaatgaattc 240 tggaataaat acaaagatgg cgaccagtgt gagaccagtc cttgccagaa ccagggcaaa 300 tgtaaagacg gcctcgggga atacacctgc acctgtttag aaggattcga aggcaaaaac 360 tgtgaattat tcacacggaa gctctgcagc ctggacaacg gggactgtga ccagttctgc 420 cacgaggaac agaactctgt ggtgtgctcc tgcgcccgcg ggtacaccct ggctgacaac 480 ggcaaggcct gcattcccac agggccctac ccctgtggga aacagaccct ggaacgcagg 540 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Lys Val Arg Val 275 280 285 Gly Asp Arg Asn Thr Glu Gln Glu Glu Gly Gly Glu Ala Val His Glu 290 295 300 Val Glu Val Val Ile Lys His Asn Arg Phe Thr Lys Glu Thr Tyr Asp 305 310 315 320 Phe Asp Ile Ala Val Leu Arg Leu Lys Thr Pro Ile Thr Phe Arg Met 325 330 335 Asn Val Ala Pro Ala Cys Leu Pro Glu Arg Asp Trp Ala Glu Ser Thr 340 345 350 Leu Met Thr Gln Lys Thr Gly Ile Val Ser Gly Phe Gly Arg Thr His 355 360 365 Glu Lys Gly Arg Gln Ser Thr Arg Leu Lys Met Leu Glu Val Pro Tyr 370 375 380 Val Asp Arg Asn Ser Cys Lys Leu Ser Ser Ser Phe Ile Ile Thr Gln 385 390 395 400 Asn Met Phe Cys Ala Gly Tyr Asp Thr Lys Gln Glu Asp Ala Cys Gln 405 410 415 Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Val Thr Arg Phe Lys Asp Thr Tyr Phe 420 425 430 Val Thr Gly Ile Val Ser Trp Gly Glu Gly Cys Ala Arg Lys Gly Lys 435 440 445 Tyr Gly Ile Tyr Thr Lys Val Thr Ala Phe Leu Lys Trp Ile Asp Arg 450 455 460 Ser Met Lys Thr Arg Gly Leu Pro Lys Ala Lys Ser His Ala Pro Glu 465 470 475 480 Val Ile Thr Ser Ser Pro Leu Lys 485 <210> 3 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Gly Gly Gln Glu Cys Lys Asp Gly Glu Cys Pro Trp 195 200 205 Gln Ala Leu Leu Ile Asn Glu Glu Asn Glu Gly Phe Cys Gly Gly Thr 210 215 220 Ile Leu Ser Glu Phe Tyr Ile Leu Thr Ala Ala His Cys Leu Tyr Gln 225 230 235 240 Ala Lys Arg Phe Lys Val Arg Val Gly Asp Arg Asn Thr Glu Gln Glu 245 250 255 Glu Gly Gly Glu Ala Val His Glu Val Glu Val Val Ile Lys His Asn 260 265 270 Arg Phe Thr Lys Glu Thr Tyr Asp Phe Asp Ile Ala Val Leu Arg Leu 275 280 285 Lys Thr Pro Ile Thr Phe Arg Met Asn Val Ala Pro Ala Cys Leu Pro 290 295 300 Glu Arg Asp Trp Ala Glu Ser Thr Leu Met Thr Gln Lys Thr Gly Ile 305 310 315 320 Val Ser Gly Phe Gly Arg Thr His Glu Lys Gly Arg Gln Ser Thr Arg 325 330 335 Leu Lys Met Leu Glu Val Pro Tyr Val Asp Arg Asn Ser Cys Lys Leu 340 345 350 Ser Ser Ser Phe Ile Ile Thr Gln Asn Met Phe Cys Ala Gly Tyr Asp 355 360 365 Thr Lys Gln Glu Asp Ala Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Val 370 375 380 Thr Arg Phe Lys Asp Thr Tyr Phe Val Thr Gly Ile Val Ser Trp Gly 385 390 395 400 Glu Gly Cys Ala Arg Lys Gly Lys Tyr Gly Ile Tyr Thr Lys Val Thr 405 410 415 Ala Phe Leu Lys Trp Ile Asp Arg Ser Met Lys Thr Arg Gly Leu Pro 420 425 430 Lys Ala Lys Ser His Ala Pro Glu Val Ile Thr Ser Ser Pro Leu Lys 435 440 445 <210> 4 <211> 488 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Factor X V196I (V236I) Prepropeptide <400> 4 Met Gly Arg Pro Leu His Leu Val Leu Leu Ser Ala Ser Leu Ala Gly 1 5 10 15 Leu Leu Leu Leu Gly Glu Ser Leu Phe Ile Arg Arg Glu Gln Ala Asn 20 25 30 Asn Ile Leu Ala Arg Val Thr Arg Ala Asn Ser Phe Leu Glu Glu Met 35 40 45 Lys Lys Gly His Leu Glu Arg Glu Cys Met Glu Glu Thr Cys Ser Tyr 50 55 60 Glu Glu Ala Arg Glu Val Phe Glu Asp Ser Asp Lys Thr Asn Glu Phe 65 70 75 80 Trp Asn Lys Tyr Lys Asp Gly Asp Gln Cys Glu Thr Ser Pro Cys Gln 85 90 95 Asn Gln Gly Lys Cys Lys Asp Gly Leu Gly Glu Tyr Thr Cys Thr Cys 100 105 110 Leu Glu Gly Phe Glu Gly Lys Asn Cys Glu Leu Phe Thr Arg Lys Leu 115 120 125 Cys Ser Leu Asp Asn Gly Asp Cys Asp Gln Phe Cys His Glu Glu Gln 130 135 140 Asn Ser Val Val Cys Ser Cys Ala Arg Gly Tyr Thr Leu Ala Asp Asn 145 150 155 160 Gly Lys Ala Cys Ile Pro Thr Gly Pro Tyr Pro Cys Gly Lys Gln Thr 165 170 175 Leu Glu Arg Arg Lys Arg Ser Val Ala Gln Ala Thr Ser Ser Ser Gly 180 185 190 Glu Ala Pro Asp Ser Ile Thr Trp Lys Pro Tyr Asp Ala Ala Asp Leu 195 200 205 Asp Pro Thr Glu Asn Pro Phe Asp Leu Leu Asp Phe Asn Gln Thr Gln 210 215 220 Pro Glu Arg Gly Asp Asn Asn Leu Thr Arg Ile Ile Gly Gly Gln Glu 225 230 235 240 Cys Lys Asp Gly Glu Cys Pro Trp Gln Ala Leu Leu Ile Asn Glu Glu 245 250 255 Asn Glu Gly Phe Cys Gly Gly Thr Ile Leu Ser Glu Phe Tyr Ile Leu 260 265 270 Thr Ala Ala His Cys Leu Tyr Gln Ala Lys Arg Phe Lys Val Arg Val 275 280 285 Gly Asp Arg Asn Thr Glu Gln Glu Glu Gly Gly Glu Ala Val His Glu 290 295 300 Val Glu Val Val Ile Lys His Asn Arg Phe Thr Lys Glu Thr Tyr Asp 305 310 315 320 Phe Asp Ile Ala Val Leu Arg Leu Lys Thr Pro Ile Thr Phe Arg Met 325 330 335 Asn Val Ala Pro Ala Cys Leu Pro Glu Arg Asp Trp Ala Glu Ser Thr 340 345 350 Leu Met 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Artificial Sequence <220> <223> FX-S152A-For primer <400> 313 gagaagggcc ggcaggccac caggctcaag atg 33 <210> 314 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FX-S152T-For primer <400> 314 gagaagggcc ggcagaccac caggctcaag atg 33 <210> 315 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FX-S152N-For primer <400> 315 gagaagggcc ggcagaacac caggctcaag atg 33 <210> 316 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FX-R154E-For primer <400> 316 ggccggcagt ccaccgagct caagatgctg gag 33 <210> 317 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FX-K156A-For primer <400> 317 cagtccacca ggctcgccat gctggaggtg ccc 33 <210> 318 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FX-K156S-For primer <400> 318 cagtccacca ggctcagcat gctggaggtg ccc 33 <210> 319 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FX-K156N-For primer <400> 319 cagtccacca ggctcaacat gctggaggtg ccc 33 <210> 320 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 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<213> Papio anubis <220> <223> mature Factor X protein <400> 405 Ser Asn Ser Phe Leu Glu Glu Leu Lys Lys Gly Asn Leu Glu Arg Glu 1 5 10 15 Cys Met Glu Glu Thr Cys Ser Tyr Glu Glu Ala Arg Glu Val Phe Glu 20 25 30 Asp Ile Asp Lys Thr Asn Glu Phe Trp Asn Lys Tyr Lys Asp Gly Asp 35 40 45 Gln Cys Glu Thr Ser Pro Cys Gln Asn Glu Gly Lys Cys Arg Asp Gly 50 55 60 Leu Gly Glu Tyr Thr Cys Thr Cys Leu Glu Gly Phe Glu Gly Lys Asn 65 70 75 80 Cys Glu Leu Phe Thr Arg Lys Leu Cys Ser Leu Asp Asn Gly Asp Cys 85 90 95 Asp Gln Phe Cys His Glu Glu Gln Asn Ser Val Val Cys Ser Cys Ala 100 105 110 Arg Gly Tyr Thr Leu Ala Asp Asn Gly Lys Ala Cys Ile Pro Thr Gly 115 120 125 Pro Tyr Pro Cys Gly Lys Gln Thr Leu Glu Arg Arg Lys Arg Ser Ala 130 135 140 Ala Gln Ala Thr Asn Ser Ser Gly Glu Ala Ser Asp Ser Ile Ile Trp 145 150 155 160 Lys Pro Asp Asp Ala Ala Asp Leu Asp Ala Thr Glu Asn Pro Phe Asp 165 170 175 Leu Leu Asp Phe Asn Gln Thr Gln Pro Glu Arg Gly Asp Asn Asn Leu 180 185 190 Ile Arg Ile Val Gly Gly Arg Glu 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Glu Arg Arg Lys Arg Ser Val Ala Gln Ala Thr Ser Ser Ser Gly 180 185 190 Glu Ala Pro Asp Ser Ile Thr Trp Lys Pro Tyr Asp Ala Ala Asp Leu 195 200 205 Asp Pro Thr Glu Asn Pro Phe Asp Leu Leu Asp Phe Asn Gln Thr Gln 210 215 220 Pro Glu Arg Gly Asp Asn Asn Leu Thr Arg Ile Val Gly Gly Gln Glu 225 230 235 240 Cys Lys Asp Gly Glu Cys Pro Trp Gln Ala Leu Leu Ile Asn Glu Glu 245 250 255 Asn Glu Gly Phe Cys Gly Gly Thr Ile Leu Ser Glu Phe Tyr Ile Leu 260 265 270 Thr Ala Ala His Cys Leu Tyr Gln Ala Lys Arg Phe Lys Val Arg Val 275 280 285 Gly Asp Arg Asn Thr Glu Gln Glu Glu Gly Gly Glu Ala Val His Glu 290 295 300 Val Glu Val Val Ile Lys His Asn Arg Phe Thr Lys Glu Thr Tyr Asp 305 310 315 320 Phe Asp Ile Ala Val Leu Arg Leu Lys Thr Pro Ile Thr Phe Arg Met 325 330 335 Asn Val Ala Pro Ala Cys Leu Pro Glu Arg Asp Trp Ala Glu Ser Thr 340 345 350 Leu Met Thr Gln Lys Thr Gly Ile Val Ser Gly Phe Gly Arg Thr His 355 360 365 Glu Lys Gly Arg Gln Ser Thr Arg Leu Lys Met Leu Glu Val Pro Tyr 370 375 380 Val Asp 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Ala Thr Thr Phe Tyr Gln 85 90 95 His Leu Ala Asp Ser Lys Asn Asp Asn Asp Asn Ile Phe Leu Ser Pro 100 105 110 Leu Ser Ile Ser Thr Ala Phe Ala Met Thr Lys Leu Gly Ala Cys Asn 115 120 125 Asp Thr Leu Gln Gln Leu Met Glu Val Phe Lys Phe Asp Thr Ile Ser 130 135 140 Glu Lys Thr Ser Asp Gln Ile His Phe Phe Phe Ala Lys Leu Asn Cys 145 150 155 160 Arg Leu Tyr Arg Lys Ala Asn Lys Ser Ser Lys Leu Val Ser Ala Asn 165 170 175 Arg Leu Phe Gly Asp Lys Ser Leu Thr Phe Asn Glu Thr Tyr Gln Asp 180 185 190 Ile Ser Glu Leu Val Tyr Gly Ala Lys Leu Gln Pro Leu Asp Phe Lys 195 200 205 Glu Asn Ala Glu Gln Ser Arg Ala Ala Ile Asn Lys Trp Val Ser Asn 210 215 220 Lys Thr Glu Gly Arg Ile Thr Asp Val Ile Pro Ser Glu Ala Ile Asn 225 230 235 240 Glu Leu Thr Val Leu Val Leu Val Asn Thr Ile Tyr Phe Lys Gly Leu 245 250 255 Trp Lys Ser Lys Phe Ser Pro Glu Asn Thr Arg Lys Glu Leu Phe Tyr 260 265 270 Lys Ala Asp Gly Glu Ser Cys Ser Ala Ser Met Met Tyr Gln Glu Gly 275 280 285 Lys Phe Arg Tyr Arg Arg Val Ala Glu Gly Thr Gln Val Leu Glu Leu 290 295 300 Pro Phe Lys Gly Asp Asp Ile Thr Met Val Leu Ile Leu Pro Lys Pro 305 310 315 320 Glu Lys Ser Leu Ala Lys Val Glu Lys Glu Leu Thr Pro Glu Val Leu 325 330 335 Gln Glu Trp Leu Asp Glu Leu Glu Glu Met Met Leu Val Val His Met 340 345 350 Pro Arg Phe Arg Ile Glu Asp Gly Phe Ser Leu Lys Glu Gln Leu Gln 355 360 365 Asp Met Gly Leu Val Asp Leu Phe Ser Pro Glu Lys Ser Lys Leu Pro 370 375 380 Gly Ile Val Ala Glu Gly Arg Asp Asp Leu Tyr Val Ser Asp Ala Phe 385 390 395 400 His Lys Ala Phe Leu Glu Val Asn Glu Glu Gly Ser Glu Ala Ala Ala 405 410 415 Ser Thr Ala Val Val Ile Ala Gly Arg Ser Leu Asn Pro Asn Arg Val 420 425 430 Thr Phe Lys Ala Asn Arg Pro Phe Leu Val Phe Ile Arg Glu Val Pro 435 440 445 Leu Asn Thr Ile Ile Phe Met Gly Arg Val Ala Asn Pro Cys Val Lys 450 455 460 <210> 554 <211> 432 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> mature Antithrombin III <400> 554 His Gly Ser Pro Val Asp Ile Cys Thr Ala Lys Pro Arg Asp Ile Pro 1 5 10 15 Met Asn Pro Met Cys Ile Tyr Arg Ser Pro Glu Lys Lys Ala Thr Glu 20 25 30 Asp Glu Gly Ser Glu Gln Lys Ile Pro Glu Ala Thr Asn Arg Arg Val 35 40 45 Trp Glu Leu Ser Lys Ala Asn Ser Arg Phe Ala Thr Thr Phe Tyr Gln 50 55 60 His Leu Ala Asp Ser Lys Asn Asp Asn Asp Asn Ile Phe Leu Ser Pro 65 70 75 80 Leu Ser Ile Ser Thr Ala Phe Ala Met Thr Lys Leu Gly Ala Cys Asn 85 90 95 Asp Thr Leu Gln Gln Leu Met Glu Val Phe Lys Phe Asp Thr Ile Ser 100 105 110 Glu Lys Thr Ser Asp Gln Ile His Phe Phe Phe Ala Lys Leu Asn Cys 115 120 125 Arg Leu Tyr Arg Lys Ala Asn Lys Ser Ser Lys Leu Val Ser Ala Asn 130 135 140 Arg Leu Phe Gly Asp Lys Ser Leu Thr Phe Asn Glu Thr Tyr Gln Asp 145 150 155 160 Ile Ser Glu Leu Val Tyr Gly Ala Lys Leu Gln Pro Leu Asp Phe Lys 165 170 175 Glu Asn Ala Glu Gln Ser Arg Ala Ala Ile Asn Lys Trp Val Ser Asn 180 185 190 Lys Thr Glu Gly Arg Ile Thr Asp Val Ile Pro Ser Glu Ala Ile Asn 195 200 205 Glu Leu Thr Val Leu Val Leu Val Asn Thr Ile Tyr Phe Lys Gly Leu 210 215 220 Trp Lys Ser Lys Phe Ser Pro Glu Asn Thr Arg Lys Glu Leu Phe Tyr 225 230 235 240 Lys Ala Asp Gly Glu Ser Cys Ser Ala Ser Met Met Tyr Gln Glu Gly 245 250 255 Lys Phe Arg Tyr Arg Arg Val Ala Glu Gly Thr Gln Val Leu Glu Leu 260 265 270 Pro Phe Lys Gly Asp Asp Ile Thr Met Val Leu Ile Leu Pro Lys Pro 275 280 285 Glu Lys Ser Leu Ala Lys Val Glu Lys Glu Leu Thr Pro Glu Val Leu 290 295 300 Gln Glu Trp Leu Asp Glu Leu Glu Glu Met Met Leu Val Val His Met 305 310 315 320 Pro Arg Phe Arg Ile Glu Asp Gly Phe Ser Leu Lys Glu Gln Leu Gln 325 330 335 Asp Met Gly Leu Val Asp Leu Phe Ser Pro Glu Lys Ser Lys Leu Pro 340 345 350 Gly Ile Val Ala Glu Gly Arg Asp Asp Leu Tyr Val Ser Asp Ala Phe 355 360 365 His Lys Ala Phe Leu Glu Val Asn Glu Glu Gly Ser Glu Ala Ala Ala 370 375 380 Ser Thr Ala Val Val Ile Ala Gly Arg Ser Leu Asn Pro Asn Arg Val 385 390 395 400 Thr Phe Lys Ala Asn Arg Pro Phe Leu Val Phe Ile Arg Glu Val Pro 405 410 415 Leu Asn Thr Ile Ile Phe Met Gly Arg Val Ala Asn Pro Cys Val Lys 420 425 430 <210> 555 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EPR-1 recognition site <400> 555 Leu Phe Thr Arg Lys Leu 1 5 <210> 556 <211> 245 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Chymotrypsinogen B mature <400> 556 Cys Gly Val Pro Ala Ile His Pro Val Leu Ser Gly Leu Ser Arg Ile 1 5 10 15 Val Asn Gly Glu Asp Ala Val Pro Gly Ser Trp Pro Trp Gln Val Ser 20 25 30 Leu Gln Asp Lys Thr Gly Phe His Phe Cys Gly Gly Ser Leu Ile Ser 35 40 45 Glu Asp Trp Val Val Thr Ala Ala His Cys Gly Val Arg Thr Ser Asp 50 55 60 Val Val Val Ala Gly Glu Phe Asp Gln Gly Ser Asp Glu Glu Asn Ile 65 70 75 80 Gln Val Leu Lys Ile Ala Lys Val Phe Lys Asn Pro Lys Phe Ser Ile 85 90 95 Leu Thr Val Asn Asn Asp Ile Thr Leu Leu Lys Leu Ala Thr Pro Ala 100 105 110 Arg Phe Ser Gln Thr Val Ser Ala Val Cys Leu Pro Ser Ala Asp Asp 115 120 125 Asp Phe Pro Ala Gly Thr Leu Cys Ala Thr Thr Gly Trp Gly Lys Thr 130 135 140 Lys Tyr Asn Ala Asn Lys Thr Pro Asp Lys Leu Gln Gln Ala Ala Leu 145 150 155 160 Pro Leu Leu Ser Asn Ala Glu Cys Lys Lys Ser Trp Gly Arg Arg Ile 165 170 175 Thr Asp Val Met Ile Cys Ala Gly Ala Ser Gly Val Ser Ser Cys Met 180 185 190 Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Gln Lys Asp Gly Ala Trp Thr 195 200 205 Leu Val Gly Ile Val Ser Trp Gly Ser Asp Thr Cys Ser Thr Ser Ser 210 215 220 Pro Gly Val Tyr Ala Arg Val Thr Lys Leu Ile Pro Trp Val Gln Lys 225 230 235 240 Ile Leu Ala Ala Asn 245 <210> 557 <211> 304 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Tissue factor pathway inhibitor (TFPI) <300> <308> UniProtKB: P10646 <309> 2013-03-06 <400> 557 Met Ile Tyr Thr Met Lys Lys Val His Ala Leu Trp Ala Ser Val Cys 1 5 10 15 Leu Leu Leu Asn Leu Ala Pro Ala Pro Leu Asn Ala Asp Ser Glu Glu 20 25 30 Asp Glu Glu His Thr Ile Ile Thr Asp Thr Glu Leu Pro Pro Leu Lys 35 40 45 Leu Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Asp Gly Pro Cys Lys 50 55 60 Ala Ile Met Lys Arg Phe Phe Phe Asn Ile Phe Thr Arg Gln Cys Glu 65 70 75 80 Glu Phe Ile Tyr Gly Gly Cys Glu Gly Asn Gln Asn Arg Phe Glu Ser 85 90 95 Leu Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp Asn Ala Asn Arg Ile 100 105 110 Ile Lys Thr Thr Leu Gln Gln Glu Lys Pro Asp Phe Cys Phe Leu Glu 115 120 125 Glu Asp Pro Gly Ile Cys Arg Gly Tyr Ile Thr Arg Tyr Phe Tyr Asn 130 135 140 Asn Gln Thr Lys Gln Cys Glu Arg Phe Lys Tyr Gly Gly Cys Leu Gly 145 150 155 160 Asn Met Asn Asn Phe Glu Thr Leu Glu Glu Cys Lys Asn Ile Cys Glu 165 170 175 Asp Gly Pro Asn Gly Phe Gln Val Asp Asn Tyr Gly Thr Gln Leu Asn 180 185 190 Ala Val Asn Asn Ser Leu Thr Pro Gln Ser Thr Lys Val Pro Ser Leu 195 200 205 Phe Glu Phe His Gly Pro Ser Trp Cys Leu Thr Pro Ala Asp Arg Gly 210 215 220 Leu Cys Arg Ala Asn Glu Asn Arg Phe Tyr Tyr Asn Ser Val Ile Gly 225 230 235 240 Lys Cys Arg Pro Phe Lys Tyr Ser Gly Cys Gly Gly Asn Glu Asn Asn 245 250 255 Phe Thr Ser Lys Gln Glu Cys Leu Arg Ala Cys Lys Lys Gly Phe Ile 260 265 270 Gln Arg Ile Ser Lys Gly Gly Leu Ile Lys Thr Lys Arg Lys Arg Lys 275 280 285 Lys Gln Arg Val Lys Ile Ala Tyr Glu Glu Ile Phe Val Lys Asn Met 290 295 300

Claims (165)

  1. 서열번호 134에 기재된 아미노산 위치를 참고로 성숙 넘버링(mature numbering)에 기초할 때 비변형 활성 인자 X (FXa) 폴리펩티드에서 위치 196에 상응하는 위치에 아미노산 치환을 포함하는, 단리된 변형 활성 인자 X (FXa) 폴리펩티드 또는 이의 촉매적 활성형으로서,
    상기 치환은 중성의 극성 아미노산 잔기로 이루어지고; 및
    상기 비변형 FXa는 서열번호 134의 잔기 1-139로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 및 서열번호 134의 잔기 195-448로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는 FXa에 대하여 적어도 75%의 서열 상동성을 나타내는 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 FXa 폴리펩티드 또는 이의 촉매적 활성형.
  2. 제1항에 있어서, 중성의 극성 아미노산이 아스파라긴(N), 글루타민(Q), 세린(S), 트레오닌(T), 트립토판(W), 시스테인(C) 및 티로신(Y) 중에서 선택되는 것인 단리된 FXa 폴리펩티드.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 변형 FX 폴리펩티드가 서열번호 134에 기재된 아미노산 위치를 참고로 위치 196에 상응하는 위치에서 S로의 아미노산 치환, 또는 196에 상응하는 위치에 S를 포함하지 않는 비변형 FX 폴리펩티드에서 상응하는 아미노산 잔기에 동일한 치환을 포함하는 단리된 FXa 폴리펩티드.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드가 증가된 보조인자 의존성, 저해제에 대한 증가된 저항성, 변경된 글리코실화, 증가된 반감기 및/또는 증가된 촉매 활성을 나타내는 단리된 변형 FXa 폴리펩티드.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 변형 FXa가 아미노산 치환을 함유하지 않는 비변형 FXa 폴리펩티드와 비교하여 적어도 50배의 증가된 FVa 보조인자 의존성을 나타내는 단리된 변형 FXa 폴리펩티드.
  6. 제5항에 있어서, 보조인자 의존성이 비변형 폴리펩티드와 비교하여 적어도 75배, 100배, 125배, 150배, 200배, 250배, 300배, 350배, 400배, 450배, 500배, 600배, 700배, 800배, 900배, 1000배, 2000배 또는 그 이상 증가된 단리된 변형 FXa 폴리펩티드.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 경쇄 또는 중쇄의 프로테아제 도메인에 추가적인 아미노산 치환(들)을 포함하고, 상기 추가적인 아미노산 치환(들)은 변경된 글리코실화, 저해제에 대한 증가된 저항성, 증가된 보조인자 의존성, 증가된 반감기 및/또는 증가된 촉매 활성을 부여하는 단리된 변형 FXa 폴리펩티드.
  8. 제4항 또는 제7항에 있어서, 저해제가 조직 인자 경로 저해제(tissue factor pathway inhibitor (TFPI)) 또는 항-트롬빈 Ⅲ (ATⅢ)인 단리된 FXa 폴리펩티드.
  9. 제8항에 있어서, 저해제가 항-트롬빈 Ⅲ (ATⅢ)인 단리된 변형 FXa 폴리펩티드.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 동일한 형태의 비변형 FXa 폴리펩티드와 비교하여 단지 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개의 아미노산 치환(들)을 포함하는 단리된 변형 FXa 폴리펩티드.
  11. 제7항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 134에 기재된 아미노산 위치를 참고로 성숙 넘버링(mature numbering)에 기초할 때, 211, 214, 216, 218, 219, 273, 276, 306, 326, 332, 338, 420 및 424 중에서 선택되는 위치에 상응하는 아미노산 위치에 아미노산 치환(들)을 포함하고, 여기서 상응하는 아미노산 위치는 비변형 FX 폴리펩티드와 서열번호 134에 기재된 폴리펩티드의 정렬에 의해 확인되는 단리된 변형 FXa 폴리펩티드.
  12. 제7항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 134에 기재된 아미노산 위치를 참고로, 위치 211에 상응하는 위치에서 S; 위치 214에 상응하는 위치에서 D; 위치 214에 상응하는 위치에서 A; 위치 214에 상응하는 위치에서 S; 위치 216에 상응하는 위치에서 R; 위치 216에 상응하는 위치에서 K; 위치 216에 상응하는 위치에서 A; 위치 216에 상응하는 위치에서 S; 위치 218에 상응하는 위치에서 R; 위치 218에 상응하는 위치에서 K; 위치 218에 상응하는 위치에서 A; 위치 219에 상응하는 위치에서 H; 위치 273에 상응하는 위치에서 A; 위치 273에 상응하는 위치에서 E; 위치 276에 상응하는 위치에서 A; 위치 276에 상응하는 위치에서 E; 위치 306에 상응하는 위치에서 E; 위치 326에 상응하는 위치에서 S; 위치 326에 상응하는 위치에서 T; 위치 326에 상응하는 위치에서 V; 위치 326에 상응하는 위치에서 Q; 위치 326에 상응하는 위치에서 N; 위치 326에 상응하는 위치에서 M; 위치 326에 상응하는 위치에서 K; 위치 326에 상응하는 위치에서 Y; 위치 326에 상응하는 위치에서 E; 위치 326에 상응하는 위치에서 D; 위치 332에 상응하는 위치에서 A; 위치 332에 상응하는 위치에서 D; 위치 332에 상응하는 위치에서 E; 위치 332에 상응하는 위치에서 S; 위치 332에 상응하는 위치에서 G; 위치 338에 상응하는 위치에서 A; 위치 338에 상응하는 위치에서 S; 위치 338에 상응하는 위치에서 N; 위치 338에 상응하는 위치에서 R; 위치 338에 상응하는 위치에서 V; 위치 338에 상응하는 위치에서 Y; 위치 338에 상응하는 위치에서 M; 위치 420에 상응하는 위치에서 A; 위치 420에 상응하는 위치에서 E; 위치 424에 상응하는 위치에서 A; 및 위치 424에 상응하는 위치에서 E로의 아미노산 치환(들) 중에서 선택된 아미노산 치환(들), 또는 비변형 FX 폴리펩티드에서 상응하는 아미노산 잔기에 동일한 치환(들)을 포함하는 단리된 변형 FXa 폴리펩티드.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 134에 기재된 아미노산 위치를 참고로 성숙 넘버링(mature numbering)에 기초할 때,
    위치 196에 상응하는 위치에 S, 위치 211에 상응하는 위치에 S 및 위치 219에 상응하는 위치에 H;
    위치 196에 상응하는 위치에 S, 및 위치 214에 상응하는 위치에 D;
    위치 196에 상응하는 위치에 S, 및 위치 214에 상응하는 위치에 A;
    위치 196에 상응하는 위치에 S, 및 위치 214에 상응하는 위치에 S;
    위치 196에 상응하는 위치에 S, 및 위치 216에 상응하는 위치에 R;
    위치 196에 상응하는 위치에 S, 및 위치 216에 상응하는 위치에 K;
    위치 196에 상응하는 위치에 S, 및 위치 216에 상응하는 위치에 A;
    위치 196에 상응하는 위치에 S, 및 위치 216에 상응하는 위치에 S;
    위치 196에 상응하는 위치에 S, 및 위치 218에 상응하는 위치에 R;
    위치 196에 상응하는 위치에 S, 및 위치 218에 상응하는 위치에 K;
    위치 196에 상응하는 위치에 S, 및 위치 218에 상응하는 위치에 A;
    위치 196에 상응하는 위치에 S, 및 위치 273에 상응하는 위치에 E;
    위치 196에 상응하는 위치에 S, 및 위치 273에 상응하는 위치에 A;
    위치 196에 상응하는 위치에 S, 및 위치 276에 상응하는 위치에 A;
    위치 196에 상응하는 위치에 S, 및 위치 276에 상응하는 위치에 E;
    위치 196에 상응하는 위치에 S, 및 위치 306에 상응하는 위치에 E;
    위치 196에 상응하는 위치에 S, 및 위치 326에 상응하는 위치에 E;
    위치 196에 상응하는 위치에 S, 및 위치 326에 상응하는 위치에 D;
    위치 196에 상응하는 위치에 S, 및 위치 326에 상응하는 위치에 M;
    위치 196에 상응하는 위치에 S, 및 위치 326에 상응하는 위치에 N;
    위치 196에 상응하는 위치에 S, 및 위치 326에 상응하는 위치에 Q;
    위치 196에 상응하는 위치에 S, 및 위치 332에 상응하는 위치에 A;
    위치 196에 상응하는 위치에 S, 및 위치 332에 상응하는 위치에 D;
    위치 196에 상응하는 위치에 S, 및 위치 332에 상응하는 위치에 E;
    위치 196에 상응하는 위치에 S, 및 위치 332에 상응하는 위치에 S;
    위치 196에 상응하는 위치에 S, 및 위치 332에 상응하는 위치에 G;
    위치 196에 상응하는 위치에 S, 및 위치 338에 상응하는 위치에 A;
    위치 196에 상응하는 위치에 S, 및 위치 338에 상응하는 위치에 S;
    위치 196에 상응하는 위치에 S, 및 위치 420에 상응하는 위치에 A;
    위치 196에 상응하는 위치에 S, 및 위치 420에 상응하는 위치에 E;
    위치 196에 상응하는 위치에 S, 및 위치 424에 상응하는 위치에 A;
    위치 196에 상응하는 위치에 S, 및 위치 424에 상응하는 위치에 E; 및
    위치 196에 상응하는 위치에 S, 위치 420에 상응하는 위치에 E 및 위치 424에 상응하는 위치에 E로의 아미노산 치환(들) 중에서 선택된 아미노산 치환(들), 또는 비변형 FXa 폴리펩티드에서 상응하는 아미노산 잔기에 동일한 아미노산 치환을 포함하는 단리된 변형 FXa 폴리펩티드.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 134에 기재된 아미노산 위치를 참고로 성숙 넘버링(mature numbering)에 기초할 때, 위치 196에 상응하는 위치에서 S 및 위치 332에 상응하는 위치에서 A로의 아미노산 치환(들) 또는 비변형 FXa 폴리펩티드에서 상응하는 아미노산 잔기에 동일한 아미노산 치환을 포함하는 단리된 변형 FXa 폴리펩티드.
  15. 제7항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 비-천연 글리코실화 부위의 도입에 의하여 글리코실화를 변경하는 추가적인 아미노산 치환(들)을 포함하는 단리된 변형 FXa 폴리펩티드.
  16. 제15항에 있어서, 비-천연 글리코실화 부위가 아미노산 치환(들)에 의해 도입되고, 상기 아미노산 치환은 서열번호 134에 기재된 아미노산 위치를 참고로 성숙 넘버링(mature numbering)에 기초할 때,
    위치 51에 상응하는 위치에 N;
    위치 56에 상응하는 위치에 N 및 위치 58에 상응하는 위치에 S;
    위치 62에 상응하는 위치에 N 및 위치 64에 상응하는 위치에 S;
    위치 65에 상응하는 위치에 N 및 위치 67에 상응하는 위치에 S;
    위치 67에 상응하는 위치에 N;
    위치 73에 상응하는 위치에 N 및 위치 75에 상응하는 위치에 S;
    위치 75에 상응하는 위치에 N 및 위치 77에 상응하는 위치에 S;
    위치 77에 상응하는 위치에 N 및 위치 79에 상응하는 위치에 S;
    위치 78에 상응하는 위치에 N 및 위치 80에 상응하는 위치에 S;
    위치 82에 상응하는 위치에 S;
    위치 83에 상응하는 위치에 N;
    위치 82에 상응하는 위치에 N 및 위치 84에 상응하는 위치에 S;
    위치 85에 상응하는 위치에 N 및 위치 87에 상응하는 위치에 S;
    위치 86에 상응하는 위치에 N 및 위치 88에 상응하는 위치에 S;
    위치 95에 상응하는 위치에 N 및 위치 97에 상응하는 위치에 S;
    위치 114에 상응하는 위치에 N;
    위치 119에 상응하는 위치에 N 및 위치 121에 상응하는 위치에 S;
    위치 122에 상응하는 위치에 S;
    위치 215에 상응하는 위치에 N 및 위치 217에 상응하는 위치에 S;
    위치 243에 상응하는 위치에 N 및 위치 245에 상응하는 위치에 S;
    위치 264에 상응하는 위치에 N 및 위치 266에 상응하는 위치에 S;
    위치 293에 상응하는 위치에 N 및 위치 295에 상응하는 위치에 S;
    위치 388에 상응하는 위치에 N;
    위치 389에 상응하는 위치에 N 및 위치 391에 상응하는 위치에 S;
    위치 428에 상응하는 위치에 N 및 위치 430에 상응하는 위치에 S; 및
    위치 429에 상응하는 위치에 N 및 위치 431에 상응하는 위치에 S로의 아미노산 치환(들), 또는 비변형 FXa 폴리펩티드에서 상응하는 아미노산 잔기에 동일한 치환(들) 중에서 선택되는 단리된 변형 FXa 폴리펩티드.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 134에 기재된 아미노산 위치를 참고로 성숙 넘버링(mature numbering)에 기초할 때,
    위치 196에 상응하는 위치에 S 및 위치 51에 상응하는 위치에 N;
    위치 196에 상응하는 위치에 S, 위치 56에 상응하는 위치에 N 및 위치 58에 상응하는 위치에 S;
    위치 196에 상응하는 위치에 S, 위치 58에 상응하는 위치에 N 및 위치 60에 상응하는 위치에 S;
    위치 196에 상응하는 위치에 S, 위치 62에 상응하는 위치에 N 및 위치 64에 상응하는 위치에 S;
    위치 196에 상응하는 위치에 S, 위치 65에 상응하는 위치에 N 및 위치 67에 상응하는 위치에 S;
    위치 196에 상응하는 위치에 S 및 위치 67에 상응하는 위치에 N;
    위치 196에 상응하는 위치에 S, 위치 73에 상응하는 위치에 N 및 위치 75에 상응하는 위치에 S;
    위치 196에 상응하는 위치에 S, 위치 75에 상응하는 위치에 N 및 위치 77에 상응하는 위치에 S;
    위치 196에 상응하는 위치에 S, 위치 77에 상응하는 위치에 N 및 위치 79에 상응하는 위치에 S;
    위치 196에 상응하는 위치에 S, 위치 78에 상응하는 위치에 N 및 위치 80에 상응하는 위치에 S;
    위치 196에 상응하는 위치에 S 및 위치 82에 상응하는 위치에 S;
    위치 196에 상응하는 위치에 S 및 위치 83에 상응하는 위치에 N;
    위치 196에 상응하는 위치에 S, 위치 82에 상응하는 위치에 N 및 위치 84에 상응하는 위치에 S;
    위치 196에 상응하는 위치에 S, 위치 85에 상응하는 위치에 N 및 위치 87에 상응하는 위치에 S;
    위치 196에 상응하는 위치에 S, 위치 86에 상응하는 위치에 N 및 위치 88에 상응하는 위치에 S;
    위치 196에 상응하는 위치에 S, 위치 95에 상응하는 위치에 N 및 위치 97에 상응하는 위치에 S;
    위치 196에 상응하는 위치에 S 및 위치 114에 상응하는 위치에 N;
    위치 196에 상응하는 위치에 S, 위치 114에 상응하는 위치에 N, 위치 211에 상응하는 위치에 S 및 위치 219에 상응하는 위치에 H;
    위치 196에 상응하는 위치에 S, 위치 119에 상응하는 위치에 N 및 위치 121에 상응하는 위치에 S;
    위치 196에 상응하는 위치에 S, 위치 114에 상응하는 위치에 N, 위치 119에 상응하는 위치에 N 및 위치 121에 상응하는 위치에 S;
    위치 196에 상응하는 위치에 S, 위치 114에 상응하는 위치에 N, 위치 119에 상응하는 위치에 N, 위치 121에 상응하는 위치에 S, 위치 211에 상응하는 위치에 S 및 위치 219에 상응하는 위치에 H;
    위치 196에 상응하는 위치에 S; 위치 119에 상응하는 위치에 N, 위치 121에 상응하는 위치에 S, 위치 211에 상응하는 위치에 S 및 위치 219에 상응하는 위치에 H;
    위치 196에 상응하는 위치에 S 및 위치 122에 상응하는 위치에 S;
    위치 196에 상응하는 위치에 S, 위치 215에 상응하는 위치에 N 및 위치 217에 상응하는 위치에 S;
    위치 196에 상응하는 위치에 S, 위치 243에 상응하는 위치에 N 및 위치 245에 상응하는 위치에 S;
    위치 196에 상응하는 위치에 S, 위치 264에 상응하는 위치에 N 및 위치 266에 상응하는 위치에 S;
    위치 196에 상응하는 위치에 S, 위치 119에 상응하는 위치에 N, 위치 121에 상응하는 위치에 S, 위치 264에 상응하는 위치에 N 및 위치 266에 상응하는 위치에 S;
    위치 196에 상응하는 위치에 S, 위치 211에 상응하는 위치에 S , 위치 219에 상응하는 위치에 H, 위치 264에 상응하는 위치에 N 및 위치 266에 상응하는 위치에 S;
    위치 196에 상응하는 위치에 S, 위치 119에 상응하는 위치에 N, 위치 121에 상응하는 위치에 S, 위치 211에 상응하는 위치에 S, 위치 219에 상응하는 위치에 H, 위치 264에 상응하는 위치에 N 및 위치 266에 상응하는 위치에 S;
    위치 196에 상응하는 위치에 S, 위치 114에 상응하는 위치에 N, 위치 264에 상응하는 위치에 N 및 위치 266에 상응하는 위치에 S;
    위치 196에 상응하는 위치에 S, 위치 114에 상응하는 위치에 N, 위치 211에 상응하는 위치에 S, 위치 219에 상응하는 위치에 H, 위치 264에 상응하는 위치에 N 및 위치 266에 상응하는 위치에 S;
    위치 196에 상응하는 위치에 S, 위치 264에 상응하는 위치에 N, 위치 266에 상응하는 위치에 S 및 위치 388에 상응하는 위치에 N;
    위치 196에 상응하는 위치에 S, 위치 293에 상응하는 위치에 N 및 위치 295에 상응하는 위치에 S;
    위치 196에 상응하는 위치에 S 및 위치 388에 상응하는 위치에 N;
    위치 196에 상응하는 위치에 S, 위치 119에 상응하는 위치에 N, 위치 121에 상응하는 위치에 S 및 위치 388에 상응하는 위치에 N;
    위치 196에 상응하는 위치에 S, 위치 114에 상응하는 위치에 N, 위치 211에 상응하는 위치에 S, 위치 219에 상응하는 위치에 H 및 위치 388에 상응하는 위치에 N;
    위치 196에 상응하는 위치에 S, 위치 211에 상응하는 위치에 S, 위치 219에 상응하는 위치에 H, 위치 264에 상응하는 위치에 N, 위치 266에 상응하는 위치에 S 및 위치 388에 상응하는 위치에 N;
    위치 196에 상응하는 위치에 S, 위치 119에 상응하는 위치에 N, 위치 121에 상응하는 위치에 S, 위치 211에 상응하는 위치에 S, 위치 219에 상응하는 위치에 H 및 위치 388에 상응하는 위치에 N;
    위치 196에 상응하는 위치에 S, 위치 389에 상응하는 위치에 N 및 위치 391에 상응하는 위치에 S;
    위치 196에 상응하는 위치에 S, 위치 428에 상응하는 위치에 N 및 위치 430에 상응하는 위치에 S; 및
    위치 196에 상응하는 위치에 S, 위치 429에 상응하는 위치에 N 및 위치 431에 상응하는 위치에 S로의 아미노산 치환(들), 또는 비변형 FX 폴리펩티드에서 상응하는 아미노산 잔기에 동일한 치환(들) 중에서 선택된 아미노산 치환(들)을 포함하는 단리된 변형 FXa 폴리펩티드.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 비변형 FXa 폴리펩티드가 서열번호 134의 잔기 1-139에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 및 서열번호 134의 잔기 195-448에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는 FXa에 대하여 적어도 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 상동성을 나타내는 단리된 변형 FXa 폴리펩티드 또는 이의 촉매적 활성형.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 비변형 FXa 폴리펩티드가
    a) 서열번호 134의 잔기 1-139에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 및 서열번호 134의 잔기 195-448에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는 활성 FX (FXa) 폴리펩티드; 또는
    b) a)의 촉매적 활성형
    중에서 선택되는 것인 단리된 변형 FXa 폴리펩티드.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 비변형 폴리펩티드가 중쇄 및 경쇄를 함유하고, 서열번호 134의 잔기 1-139에 기재된 아미노산 서열, 및 서열번호 134의 잔기 195-448에 기재된 아미노산 서열로 구성된 것인 단리된 변형 FXa 폴리펩티드.
  21. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
    a) 서열번호 137-157, 169, 205-208, 214-243 및 246-265 중 어느 하나의 잔기 1-139에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 및 잔기 195-448에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는 아미노산 서열,
    또는 서열번호 137-157, 169, 205-208, 214-243 및 246-265 중 어느 하나의 잔기 1-139에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 및 잔기 195-448에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는 아미노산 서열 중 어느 하나에 대하여 적어도 75%의 서열 상동성을 나타내고 아미노산 치환(들)을 함유하는 아미노산 서열; 및
    b) 아미노산 치환(들)을 포함하고 촉매적 활성을 나타내는 a)의 촉매적 활성형 중에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 단리된 변형 FXa 폴리펩티드.
  22. 서열번호 134에 기재된 아미노산 위치를 참고로 성숙 넘버링(mature numbering)에 기초할 때 비변형 인자 X (FX) 폴리펩티드에서 위치 196에 상응하는 위치에 아미노산 치환을 포함하는, 단리된 변형 인자 X (FX) 폴리펩티드로서,
    상기 아미노산 치환은 중성의 극성 아미노산으로 이루어지고;
    상기 비변형 FX 폴리펩티드는 서열번호 134에 기재된 아미노산 서열을 가지거나, 또는 지모겐, 이의 활성형 또는 촉매적 활성형이거나, 또는 서열번호 134 또는 지모겐, 이의 활성형 또는 촉매적 활성형 각각에 대하여 적어도 75%의 서열 상동성을 가지는 아미노산 서열을 가지고; 및
    상기 FX 폴리펩티드는 변형 활성화 펩티드를 포함하지 않는 단리된 변형 인자 X (FX) 폴리펩티드.
  23. 제22항에 있어서, 중성의 극성 아미노산이 아스파라긴(N), 글루타민(Q), 세린(S), 트레오닌(T), 트립토판(W), 시스테인(C) 및 티로신(Y) 중에서 선택되는 것인 단리된 변형 FX 폴리펩티드.
  24. 제22항 또는 제23항에 있어서, 변형 FX 폴리펩티드가 서열번호 134에 기재된 아미노산 위치를 참고로 성숙 넘버링(mature numbering)에 기초할 때 위치 196에 상응하는 위치에 S로의 아미노산 치환을 포함하거나, 또는 비변형 FX 폴리펩티드에서 상응하는 아미노산 잔기에 동일한 아미노산 치환을 포함하는 것인 단리된 변형 FX 폴리펩티드.
  25. 제22항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 변형 폴리펩티드의 활성 FX (FXa)형이 FVa-의존적 촉매 활성을 나타내는 단리된 변형 FX 폴리펩티드.
  26. 제24항 또는 제25항에 있어서, 하나 이상의 증가된 보조인자 의존성, 저해제에 대한 증가된 저항성, 변경된 글리코실화, 증가된 반감기 또는 증가된 촉매 활성을 부여하는 추가적인 아미노산 치환을 포함하는 단리된 변형 FX 폴리펩티드.
  27. 제22항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 변형 폴리펩티드의 활성 FX (FXa)형이 변형 FX 폴리펩티드와 동일하지만 아미노산 치환(들)을 함유하지 않는 FXa 폴리펩티드와 비교하여 증가된 보조인자 의존성, 저해제에 대한 증가된 저항성, 변경된 글리코실화, 증가된 반감기 및/또는 증가된 촉매 활성을 나타내는 단리된 변형 FX 폴리펩티드.
  28. 비변형 인자 X (FX) 폴리펩티드에서 적어도 두 개의 아미노산 치환(들)을 포함하는 변형 인자 X (FX) 폴리펩티드로서,
    상기 비변형 FX 폴리펩티드는 서열번호 134에 기재된 아미노산 서열을 가지거나, 또는 지모겐, 이의 활성형 또는 촉매적 활성형이거나, 또는 서열번호 134, 지모겐, 이의 활성형 또는 촉매적 활성형 각각에 대하여 적어도 75%의 서열 상동성을 가지는 아미노산 서열을 갖고;
    상기 변형 FX 폴리펩티드는
    서열번호 134에 기재된 아미노산 위치를 참고로 성숙 넘버링(mature numbering)에 기초할 때 비변형 FX 폴리펩티드에서 위치 196에 상응하는 위치에 아미노산 치환을 포함하고, 여기서 상기 아미노산 치환은 중성의 극성 아미노산으로 이루어지고; 및
    하나 이상의 증가된 보조인자 의존성, 저해제에 대한 증가된 저항성, 변경된 글리코실화, 증가된 반감기 또는 증가된 촉매 활성을 부여하는 추가적인 아미노산 치환을 포함하고, 여기서 상기 추가적인 아미노산 치환은 서열번호 134에 기재된 아미노산 위치를 참고로 위치 195에 상응하는 위치에 이소류신(I), 알라닌(A), 세린(S) 또는 트레오닌(T)으로의 치환 또는 비변형 FX 폴리펩티드에서 상응하는 아미노산 잔기에 동일한 치환이 아닌 변형 인자 X (FX) 폴리펩티드.
  29. 제28항에 있어서, 중성의 극성 아미노산이 아스파라긴(N), 글루타민(Q), 세린(S), 트레오닌(T), 트립토판(W), 시스테인(C) 및 티로신(Y) 중에서 선택되는 변형 FX 폴리펩티드.
  30. 제28항 또는 제29항에 있어서, 변형 FX 폴리펩티드가 서열번호 134에 기재된 아미노산 위치를 참고로 성숙 넘버링(mature numbering)에 기초할 때 위치 196에 상응하는 위치에 S로의 아미노산 치환, 또는 비변형 FX 폴리펩티드에서 상응하는 아미노산 잔기에 동일한 아미노산 치환을 포함하는 변형 FX 폴리펩티드.
  31. 제28항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 변형 폴리펩티드의 활성 FX (FXa)형이 FVa-의존적 촉매 활성을 나타내는 변형 FX 폴리펩티드.
  32. 제28항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 변형 폴리펩티드의 활성 FX (FXa)형이 변형 FX 폴리펩티드와 동일하지만 아미노산 치환(들)을 함유하지 않는 FXa 폴리펩티드와 비교하여, 증가된 보조인자 의존성, 저해제에 대한 증가된 저항성, 변경된 글리코실화, 증가된 반감기 및/또는 증가된 촉매 활성을 나타내는 변형 FX 폴리펩티드.
  33. 제27항 또는 제32항에 있어서, 변형 폴리펩티드의 활성 FXa형이 증가된 보조인자 의존성을 나타내고, 상기 변형 폴리펩티드의 활성 FX (FXa)형은 변형 FX 폴리펩티드와 동일하지만 아미노산 치환(들)을 함유하지 않는 FXa 폴리펩티드와 비교하여 적어도 50배의 증가된 FVa 보조인자 의존성을 나타내는 변형 FX 폴리펩티드.
  34. 제33항에 있어서, 보조인자 의존성이 비변형 폴리펩티드와 비교하여 적어도 75배, 100배, 125배, 150배, 200배, 250배, 300배, 350배, 400배, 450배, 500배, 600배, 700배, 800배, 900배, 1000배, 2000배 또는 그 이상으로 증가되는 변형 FX 폴리펩티드.
  35. 제27항 또는 제32항에 있어서, 변형 FX 폴리펩티드의 활성 FXa형이 저해제에 대한 증가된 저항성을 나타내며 상기 저해제는 조직 인자 경로 저해제(tissue factor pathway inhibitor (TFPI)) 또는 항-트롬빈 Ⅲ (ATⅢ)인 변형 FX 폴리펩티드.
  36. 제35항에 있어서, 저해제가 항-트롬빈 Ⅲ (ATⅢ)인 변형 FX 폴리펩티드.
  37. 제22항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 동일한 형태의 비변형 폴리펩티드와 비교하여 단지 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개의 아미노산 치환(들)을 포함하는 변형 FX 폴리펩티드.
  38. 제26항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 134에 기재된 아미노산 위치를 참고로 성숙 넘버링(mature numbering)에 기초할 때, 211, 214, 216, 218, 219, 273, 276, 306, 326, 332, 338, 420 및 424 중에서 선택되는 위치에 상응하는 아미노산 위치에 아미노산 치환(들)을 포함하고, 여기서 상응하는 아미노산 위치는 비변형 FX 폴리펩티드와 서열번호 134에 기재된 폴리펩티드의 정렬에 의해 확인되는 변형 FX 폴리펩티드.
  39. 제38항에 있어서, 서열번호 134에 기재된 아미노산 위치를 참고로,
    위치 211에 상응하는 위치에 S; 위치 214에 상응하는 위치에 D; 위치 214에 상응하는 위치에 A; 위치 214에 상응하는 위치에 S; 위치 216에 상응하는 위치에 R; 위치 216에 상응하는 위치에 K; 위치 216에 상응하는 위치에 A; 위치 216에 상응하는 위치에 S; 위치 218에 상응하는 위치에 R; 위치 218에 상응하는 위치에 K; 위치 218에 상응하는 위치에 A; 위치 219에 상응하는 위치에 H; 위치 273에 상응하는 위치에 A; 위치 273에 상응하는 위치에 E; 위치 276에 상응하는 위치에 A; 위치 276에 상응하는 위치에 E; 위치 306에 상응하는 위치에 E; 위치 326에 상응하는 위치에 S; 위치 326에 상응하는 위치에 T; 위치 326에 상응하는 위치에 V; 위치 326에 상응하는 위치에 Q; 위치 326에 상응하는 위치에 N; 위치 326에 상응하는 위치에 M; 위치 326에 상응하는 위치에 K; 위치 326에 상응하는 위치에 Y; 위치 326에 상응하는 위치에 E; 위치 326에 상응하는 위치에 D; 위치 332에 상응하는 위치에 A; 위치 332에 상응하는 위치에 D; 위치 332에 상응하는 위치에 E; 위치 332에 상응하는 위치에 S; 위치 332에 상응하는 위치에 G; 위치 338에 상응하는 위치에 A; 위치 338에 상응하는 위치에 S; 위치 338에 상응하는 위치에 N; 위치 338에 상응하는 위치에 R; 위치 338에 상응하는 위치에 V; 위치 338에 상응하는 위치에 Y; 위치 338에 상응하는 위치에 M; 위치 420에 상응하는 위치에 A; 위치 420에 상응하는 위치에 E; 위치 424에 상응하는 위치에 A; 및 위치 424에 상응하는 위치에 E로의 아미노산 치환(들), 또는 비변형 FX 폴리펩티드에서 상응하는 아미노산 잔기에 동일한 치환(들)을 포함하는 변형 FXa 폴리펩티드.
  40. 제22항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 134에 기재된 아미노산 위치를 참고로 성숙 넘버링(mature numbering)에 기초할 때,
    위치 196에 상응하는 위치에 S, 위치 211에 상응하는 위치에 S 및 위치 219에 상응하는 위치에 H;
    위치 196에 상응하는 위치에 S, 및 위치 214에 상응하는 위치에 D;
    위치 196에 상응하는 위치에 S 및 위치 214에 상응하는 위치에 A;
    위치 196에 상응하는 위치에 S 및 위치 214에 상응하는 위치에 S;
    위치 196에 상응하는 위치에 S 및 위치 216에 상응하는 위치에 R;
    위치 196에 상응하는 위치에 S 및 위치 216에 상응하는 위치에 K;
    위치 196에 상응하는 위치에 S 및 위치 216에 상응하는 위치에 A;
    위치 196에 상응하는 위치에 S 및 위치 216에 상응하는 위치에 S;
    위치 196에 상응하는 위치에 S 및 위치 218에 상응하는 위치에 R;
    위치 196에 상응하는 위치에 S 및 위치 218에 상응하는 위치에 K;
    위치 196에 상응하는 위치에 S 및 위치 218에 상응하는 위치에 A;
    위치 196에 상응하는 위치에 S 및 위치 273에 상응하는 위치에 E;
    위치 196에 상응하는 위치에 S 및 위치 273에 상응하는 위치에 A;
    위치 196에 상응하는 위치에 S 및 위치 276에 상응하는 위치에 A;
    위치 196에 상응하는 위치에 S 및 위치 276에 상응하는 위치에 E;
    위치 196에 상응하는 위치에 S 및 위치 306에 상응하는 위치에 E;
    위치 196에 상응하는 위치에 S 및 위치 326에 상응하는 위치에 E;
    위치 196에 상응하는 위치에 S 및 위치 326에 상응하는 위치에 D;
    위치 196에 상응하는 위치에 S 및 위치 326에 상응하는 위치에 M;
    위치 196에 상응하는 위치에 S 및 위치 326에 상응하는 위치에 N;
    위치 196에 상응하는 위치에 S 및 위치 326에 상응하는 위치에 Q;
    위치 196에 상응하는 위치에 S 및 위치 332에 상응하는 위치에 A;
    위치 196에 상응하는 위치에 S 및 위치 332에 상응하는 위치에 D;
    위치 196에 상응하는 위치에 S 및 위치 332에 상응하는 위치에 E;
    위치 196에 상응하는 위치에 S 및 위치 332에 상응하는 위치에 S;
    위치 196에 상응하는 위치에 S 및 위치 332에 상응하는 위치에 G;
    위치 196에 상응하는 위치에 S 및 위치 338에 상응하는 위치에 A;
    위치 196에 상응하는 위치에 S 및 위치 338에 상응하는 위치에 S;
    위치 196에 상응하는 위치에 S 및 위치 420에 상응하는 위치에 A;
    위치 196에 상응하는 위치에 S 및 위치 420에 상응하는 위치에 E;
    위치 196에 상응하는 위치에 S 및 위치 424에 상응하는 위치에 A;
    위치 196에 상응하는 위치에 S 및 위치 424에 상응하는 위치에 E; 및
    위치 196에 상응하는 위치에 S, 위치 420에 상응하는 위치에 E 및 위치 424에 상응하는 위치에 E로의 아미노산 치환(들) 중에서 선택되는 아미노산 치환(들) 또는 비변형 FX 폴리펩티드에서 상응하는 아미노산 잔기에 동일한 아미노산 치환, 또는 비변형 FX 폴리펩티드에서 상응하는 아미노산 잔기에 동일한 치환(들)을 포함하는 변형 FX 폴리펩티드.
  41. 제22항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 134에 기재된 아미노산 위치를 참고로 성숙 넘버링(mature numbering)에 기초할 때, 위치 196에 상응하는 위치에 S 및 위치 332에 상응하는 위치에 A로의 아미노산 치환 또는 비변형 FX 폴리펩티드에서 상응하는 아미노산 잔기에 동일한 아미노산 치환, 또는 비변형 FX 폴리펩티드에서 상응하는 아미노산 잔기에 동일한 치환(들)을 포함하는 변형 FX 폴리펩티드.
  42. 제22항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 비-천연 글리코실화 부위의 도입에 의하여 글리코실화를 변경하는 추가적인 아미노산 치환(들)을 포함하는 변형 FX 폴리펩티드.
  43. 제42항에 있어서, 비-천연 글리코실화 부위가 아미노산 치환(들)에 의해 도입되고, 상기 아미노산 치환은 서열번호 134에 기재된 아미노산 위치를 참고로,
    위치 51에 상응하는 위치에 N;
    위치 56에 상응하는 위치에 N 및 위치 58에 상응하는 위치에 S;
    위치 62에 상응하는 위치에 N 및 위치 64에 상응하는 위치에 S;
    위치 65에 상응하는 위치에 N 및 위치 67에 상응하는 위치에 S;
    위치 67에 상응하는 위치에 N;
    위치 73에 상응하는 위치에 N 및 위치 75에 상응하는 위치에 S;
    위치 75에 상응하는 위치에 N 및 위치 77에 상응하는 위치에 S;
    위치 77에 상응하는 위치에 N 및 위치 79에 상응하는 위치에 S;
    위치 78에 상응하는 위치에 N 및 위치 80에 상응하는 위치에 S;
    위치 82에 상응하는 위치에 S;
    위치 83에 상응하는 위치에 N;
    위치 82에 상응하는 위치에 N 및 위치 84에 상응하는 위치에 S;
    위치 85에 상응하는 위치에 N 및 위치 87에 상응하는 위치에 S;
    위치 86에 상응하는 위치에 N 및 위치 88에 상응하는 위치에 S;
    위치 95에 상응하는 위치에 N 및 위치 97에 상응하는 위치에 S;
    위치 114에 상응하는 위치에 N;
    위치 119에 상응하는 위치에 N 및 위치 121에 상응하는 위치에 S;
    위치 122에 상응하는 위치에 S;
    위치 215에 상응하는 위치에 N 및 위치 217에 상응하는 위치에 S;
    위치 243에 상응하는 위치에 N 및 위치 245에 상응하는 위치에 S;
    위치 264에 상응하는 위치에 N 및 위치 266에 상응하는 위치에 S;
    위치 293에 상응하는 위치에 N 및 위치 295에 상응하는 위치에 S;
    위치 388에 상응하는 위치에 N;
    위치 389에 상응하는 위치에 N 및 위치 391에 상응하는 위치에 S;
    위치 428에 상응하는 위치에 N 및 위치 430에 상응하는 위치에 S; 및
    위치 429에 상응하는 위치에 N 및 위치 431에 상응하는 위치에 S로의 아미노산 치환(들), 또는 비변형 FX 폴리펩티드에서 상응하는 아미노산 잔기에 동일한 치환(들) 중에서 선택되는 변형 FX 폴리펩티드.
  44. 제22항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 134에 기재된 아미노산 위치를 참고로,
    위치 196에 상응하는 위치에 S 및 위치 51에 상응하는 위치에 N;
    위치 196에 상응하는 위치에 S, 위치 56에 상응하는 위치에 N 및 위치 58에 상응하는 위치에 S;
    위치 196에 상응하는 위치에 S, 위치 58에 상응하는 위치에 N 및 위치 60에 상응하는 위치에 S;
    위치 196에 상응하는 위치에 S, 위치 62에 상응하는 위치에 N 및 위치 64에 상응하는 위치에 S;
    위치 196에 상응하는 위치에 S, 위치 65에 상응하는 위치에 N 및 위치 67에 상응하는 위치에 S;
    위치 196에 상응하는 위치에 S 및 위치 67에 상응하는 위치에 N;
    위치 196에 상응하는 위치에 S, 위치 73에 상응하는 위치에 N 및 위치 75에 상응하는 위치에 S;
    위치 196에 상응하는 위치에 S, 위치 75에 상응하는 위치에 N 및 위치 77에 상응하는 위치에 S;
    위치 196에 상응하는 위치에 S, 위치 77에 상응하는 위치에 N 및 위치 79에 상응하는 위치에 S;
    위치 196에 상응하는 위치에 S, 위치 78에 상응하는 위치에 N 및 위치 80에 상응하는 위치에 S;
    위치 196에 상응하는 위치에 S 및 위치 82에 상응하는 위치에 S;
    위치 196에 상응하는 위치에 S 및 위치 83에 상응하는 위치에 N;
    위치 196에 상응하는 위치에 S, 위치 82에 상응하는 위치에 N 및 위치 84에 상응하는 위치에 S;
    위치 196에 상응하는 위치에 S, 위치 85에 상응하는 위치에 N 및 위치 87에 상응하는 위치에 S;
    위치 196에 상응하는 위치에 S, 위치 86에 상응하는 위치에 N 및 위치 88에 상응하는 위치에 S;
    위치 196에 상응하는 위치에 S, 위치 95에 상응하는 위치에 N 및 위치 97에 상응하는 위치에 S;
    위치 196에 상응하는 위치에 S 및 위치 114에 상응하는 위치에 N;
    위치 196에 상응하는 위치에 S, 위치 114에 상응하는 위치에 N, 위치 211에 상응하는 위치에 S 및 위치 219에 상응하는 위치에 H;
    위치 196에 상응하는 위치에 S, 위치 119에 상응하는 위치에 N 및 위치 121에 상응하는 위치에 S;
    위치 196에 상응하는 위치에 S, 위치 114에 상응하는 위치에 N, 위치 119에 상응하는 위치에 N 및 위치 121에 상응하는 위치에 S;
    위치 196에 상응하는 위치에 S, 위치 114에 상응하는 위치에 N, 위치 119에 상응하는 위치에 N, 위치 121에 상응하는 위치에 S, 위치 211에 상응하는 위치에 S 및 위치 219에 상응하는 위치에 H;
    위치 196에 상응하는 위치에 S; 위치 119에 상응하는 위치에 N, 위치 121에 상응하는 위치에 S, 위치 211에 상응하는 위치에 S 및 위치 219에 상응하는 위치에 H;
    위치 196에 상응하는 위치에 S 및 위치 122에 상응하는 위치에 S;
    위치 196에 상응하는 위치에 S, 위치 215에 상응하는 위치에 N 및 위치 217에 상응하는 위치에 S;
    위치 196에 상응하는 위치에 S, 위치 243에 상응하는 위치에 N 및 위치 245에 상응하는 위치에 S;
    위치 196에 상응하는 위치에 S, 위치 264에 상응하는 위치에 N 및 위치 266에 상응하는 위치에 S;
    위치 196에 상응하는 위치에 S, 위치 119에 상응하는 위치에 N, 위치 121에 상응하는 위치에 S, 위치 264에 상응하는 위치에 N 및 위치 266에 상응하는 위치에 S;
    위치 196에 상응하는 위치에 S, 위치 211에 상응하는 위치에 S , 위치 219에 상응하는 위치에 H, 위치 264에 상응하는 위치에 N 및 위치 266에 상응하는 위치에 S;
    위치 196에 상응하는 위치에 S, 위치 119에 상응하는 위치에 N, 위치 121에 상응하는 위치에 S, 위치 211에 상응하는 위치에 S, 위치 219에 상응하는 위치에 H, 위치 264에 상응하는 위치에 N 및 위치 266에 상응하는 위치에 S;
    위치 196에 상응하는 위치에 S, 위치 114에 상응하는 위치에 N, 위치 264에 상응하는 위치에 N 및 위치 266에 상응하는 위치에 S;
    위치 196에 상응하는 위치에 S, 위치 114에 상응하는 위치에 N, 위치 211에 상응하는 위치에 S, 위치 219에 상응하는 위치에 H, 위치 264에 상응하는 위치에 N 및 위치 266에 상응하는 위치에 S;
    위치 196에 상응하는 위치에 S, 위치 264에 상응하는 위치에 N, 위치 266에 상응하는 위치에 S 및 위치 388에 상응하는 위치에 N;
    위치 196에 상응하는 위치에 S, 위치 293에 상응하는 위치에 N 및 위치 295에 상응하는 위치에 S;
    위치 196에 상응하는 위치에 S 및 위치 388에 상응하는 위치에 N;
    위치 196에 상응하는 위치에 S, 위치 119에 상응하는 위치에 N, 위치 121에 상응하는 위치에 S 및 위치 388에 상응하는 위치에 N;
    위치 196에 상응하는 위치에 S, 위치 114에 상응하는 위치에 N, 위치 211에 상응하는 위치에 S, 위치 219에 상응하는 위치에 H 및 위치 388에 상응하는 위치에 N;
    위치 196에 상응하는 위치에 S, 위치 211에 상응하는 위치에 S, 위치 219에 상응하는 위치에 H, 위치 264에 상응하는 위치에 N, 위치 266에 상응하는 위치에 S 및 위치 388에 상응하는 위치에 N;
    위치 196에 상응하는 위치에 S, 위치 119에 상응하는 위치에 N, 위치 121에 상응하는 위치에 S, 위치 211에 상응하는 위치에 S, 위치 219에 상응하는 위치에 H 및 위치 388에 상응하는 위치에 N;
    위치 196에 상응하는 위치에 S, 위치 389에 상응하는 위치에 N 및 위치 391에 상응하는 위치에 S;
    위치 196에 상응하는 위치에 S, 위치 428에 상응하는 위치에 N 및 위치 430에 상응하는 위치에 S; 및
    위치 196에 상응하는 위치에 S, 위치 429에 상응하는 위치에 N 및 위치 431에 상응하는 위치에 S로의 아미노산 치환(들), 또는 비변형 FX 폴리펩티드에서 상응하는 아미노산 잔기에 동일한 치환(들)을 중에서 선택된 아미노산 치환(들) 포함하는 변형 FX 폴리펩티드.
  45. 제22항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비변형 FX 폴리펩티드는
    a) 서열번호 134의 잔기 1-139에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 및 서열번호 134의 잔기 143-448에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는 지모겐 FX 폴리펩티드, 또는 서열번호 134의 잔기 1-139에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 및 서열번호 134의 잔기 143-448에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는 지모겐 FX 폴리펩티드에 대하여 적어도 75%의 서열 상동성을 나타내는 아미노산 서열;
    b) 서열번호 134의 잔기 1-139에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 및 서열번호 134의 잔기 195-448에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는 활성 FX (FXa) 폴리펩티드, 또는 서열번호 134의 잔기 1-139에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 및 서열번호 134의 잔기 195-448에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는 FXa에 대하여 적어도 75%의 서열 상동성을 나타내는 아미노산 서열; 및
    c) b)의 촉매 활성형 중에서 선택되는 변형 FX 폴리펩티드.
  46. 제22항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 비변형 FX 폴리펩티드가 서열번호 134 또는 지모겐, 이의 활성형 또는 촉매 활성형에 대하여 적어도 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 상동성을 나타내는 변형 FX 폴리펩티드.
  47. 제22항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서,
    a) 서열번호 137-157, 169, 205-208, 214-243 및 246-265 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열, 또는 서열번호 137-157, 169, 205-208, 214-243 및 246-265 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열 중 어느 하나에 대하여 적어도 75%의 서열 상동성을 나타내고 아미노산 치환(들)을 함유하는 아미노산 서열;
    b) 서열번호 137-157, 169, 205-208, 214-243 및 246-265 중 어느 하나의 잔기 1-139에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 및 잔기 143-448에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는 아미노산 서열, 또는
    서열번호 137-157, 169, 205-208, 214-243 및 246-265 중 어느 하나의 잔기 1-139에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 및 잔기 143-448에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는 아미노산 서열 중 어느 하나에 대하여 적어도 75%의 서열 상동성을 나타내고 아미노산 치환(들)을 함유하는 아미노산 서열;
    c) 서열번호 137-157, 169, 205-208, 214-243 및 246-265 중 어느 하나의 잔기 1-139에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 및 잔기 195-448에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는 아미노산 서열, 또는 서열번호 137-157, 169, 205-208, 214-243 및 246-265 중 어느 하나의 잔기 1-139에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 및 잔기 195-448에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는 아미노산 서열 중 어느 하나에 대하여 적어도 75%의 서열 상동성을 나타내고 아미노산 치환(들)을 함유하는 아미노산 서열; 및
    d) 변형(들)을 포함하고 촉매 활성을 나타내는 c)의 촉매적 활성형 중에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 변형 FX 폴리펩티드.
  48. 비변형 인자 X (FX) 폴리펩티드에서 아미노산 치환을 포함하는 변형 인자 X (FX) 폴리펩티드로서,
    상기 비변형 FX 폴리펩티드는 서열번호 134에 기재된 아미노산 서열을 갖거나, 또는 지모겐, 이의 활성형 또는 촉매 활성형이거나, 또는 서열번호 134 또는 지모겐, 이의 활성형 또는 촉매 활성형 각각에 대하여 적어도 75%의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 가지고; 및
    상기 변형 폴리펩티드의 활성 FX (FXa)형은 변형된 FX 폴리펩티드와 동일하지만 아미노산 치환(들)을 함유하지 않는 FXa 폴리펩티드와 비교하여 저해제에 대하여 적어도 80배의 증가된 저항성을 나타내는 변형 인자 X (FX) 폴리펩티드.
  49. 제48항에 있어서, 저해제에 대한 증가된 저항성이 비변형 폴리펩티드와 비교하여 적어도 90배, 100배, 200배, 300배, 400배, 500배, 600배, 700배, 800배, 900배, 1000배, 2000배 또는 그 이상으로 증가된 변형 FX 폴리펩티드.
  50. 제48항 또는 제49항에 있어서, 저해제가 조직 인자 경로 저해제(tissue factor pathway inhibitor (TFPI)) 또는 항-트롬빈 Ⅲ (ATⅢ)인 변형 FX 폴리펩티드.
  51. 제50항에 있어서, 저해제가 항-트롬빈 Ⅲ (ATⅢ)인 변형 FX 폴리펩티드.
  52. 제48항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 134에 기재된 아미노산 위치를 참고로 성숙 넘버링(mature numbering)에 기초할 때, 위치 196, 197, 200, 202, 211, 214, 216, 218, 219, 273, 276, 306, 326, 327, 332, 334, 336, 338, 420 및 424 중에서 선택되는 위치에 상응하는 아미노산 위치에 아미노산 치환(들)을 포함하고, 여기서 상응하는 아미노산 위치는 비변형 FX 폴리펩티드와 서열번호 134에 기재된 폴리펩티드의 정렬에 의해 확인되는 변형 FX 폴리펩티드.
  53. 제52항에 있어서, 서열번호 134에 기재된 아미노산 위치를 참고로,
    위치 196에 상응하는 위치에 I; 위치 196에 상응하는 위치에 S; 위치 196에 상응하는 위치에 L; 위치 196에 상응하는 위치에 T; 위치 197에 상응하는 위치에 S; 위치 197에 상응하는 위치에 A; 위치 200에 상응하는 위치에 A; 위치 200에 상응하는 위치에 V; 위치 200에 상응하는 위치에 S; 위치 202에 상응하는 위치에 S; 위치 211에 상응하는 위치에 S; 위치 214에 상응하는 위치에 D; 위치 214에 상응하는 위치에 A; 위치 214에 상응하는 위치에 S; 위치 216에 상응하는 위치에 R; 위치 216에 상응하는 위치에 K; 위치 216에 상응하는 위치에 A; 위치 216에 상응하는 위치에 S; 위치 218에 상응하는 위치에 R; 위치 218에 상응하는 위치에 K; 위치 218에 상응하는 위치에 A; 위치 219에 상응하는 위치에 H; 위치 273에 상응하는 위치에 A; 위치 273에 상응하는 위치에 E; 위치 276에 상응하는 위치에 A; 위치 276에 상응하는 위치에 E; 위치 306에 상응하는 위치에 E; 위치 326에 상응하는 위치에 A; 위치 326에 상응하는 위치에 S; 위치 326에 상응하는 위치에 T; 위치 326에 상응하는 위치에 V; 위치 326에 상응하는 위치에 Q; 위치 326에 상응하는 위치에 N; 위치 326에 상응하는 위치에 M; 위치 326에 상응하는 위치에 K; 위치 326에 상응하는 위치에 Y; 위치 326에 상응하는 위치에 E; 위치 326에 상응하는 위치에 D; 위치 327에 상응하는 위치에 A; 위치 327에 상응하는 위치에 L; 위치 332에 상응하는 위치에 A; 위치 332에 상응하는 위치에 D; 위치 332에 상응하는 위치에 E; 위치 332에 상응하는 위치에 S; 위치 332에 상응하는 위치에 G; 위치 334에 상응하는 위치에 A; 위치 334에 상응하는 위치에 T; 위치 334에 상응하는 위치에 N; 위치 336에 상응하는 위치에 E; 위치 338에 상응하는 위치에 A; 위치 338에 상응하는 위치에 S; 위치 338에 상응하는 위치에 N; 위치 338에 상응하는 위치에 R; 위치 338에 상응하는 위치에 V; 위치 338에 상응하는 위치에 Y; 위치 338에 상응하는 위치에 M; 위치 420에 상응하는 위치에 A; 위치 420에 상응하는 위치에 E; 위치 424에 상응하는 위치에 A; 및/또는 위치 424에 상응하는 위치에 E;로의 아미노산 치환(들), 또는 비변형 FX 폴리펩티드에서 상응하는 아미노산 잔기에 동일한 치환(들) 중에서 선택된 아미노산 치환(들)을 포함하는 변형 FX 폴리펩티드.
  54. 비변형 인자 X (FX) 폴리펩티드에서 아미노산 치환을 포함하는 변형 인자 X (FX) 폴리펩티드로서,
    상기 비변형 FX 폴리펩티드는 서열번호 134에 기재된 아미노산 서열을 가지거나, 또는 지모겐, 이의 활성형 또는 촉매 활성형이거나, 또는 서열번호 134, 지모겐, 이의 활성형 또는 촉매 활성형 각각에 대하여 적어도 75%의 서열 상동성을 가지며;
    상기 아미노산 치환은 서열번호 134에 기재된 아미노산 위치를 참고로 198, 202, 211, 214, 217, 219, 327 및 338 중에서 선택되는 천연 아미노산 잔기 또는 198, 202, 211, 214, 217, 219, 327 및 338 중에서 선택되는 아미노산 잔기에 상응하는 잔기에서 이루어지고;
    상응하는 아미노산 잔기는 비변형 FX 폴리펩티드와 서열번호 134의 폴리펩티드의 정렬에 의해 확인되고; 및
    상기 변형 FX 폴리펩티드는 FVa-의존적 촉매 활성을 나타내는 변형 인자 X (FX) 폴리펩티드.
  55. 제54항에 있어서, 서열번호 134에 기재된 아미노산 위치를 참고로,
    위치 202에 상응하는 위치에 S; 위치 211에 상응하는 위치에 S; 위치 214에 상응하는 위치에 D; 위치 214에 상응하는 위치에 A; 위치 214에 상응하는 위치에 S; 위치 217에 상응하는 위치에 S; 위치 219에 상응하는 위치에 H; 위치 327에 상응하는 위치에 A; 위치 327에 상응하는 위치에 L; 위치 338에 상응하는 위치에 A; 위치 338에 상응하는 위치에 S; 위치 338에 상응하는 위치에 N; 위치 338에 상응하는 위치에 R; 위치 338에 상응하는 위치에 V; 위치 338에 상응하는 위치에 Y 및 위치 338에 상응하는 위치에 M으로의 아미노산 치환(들), 또는 비변형 FX 폴리펩티드에서 상응하는 아미노산 잔기에 동일한 치환(들) 중에서 선택되는 아미노산 치환(들)을 포함하는 변형 FX 폴리펩티드.
  56. 제53항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 134에 기재된 아미노산 위치를 참고로, 위치 211에 상응하는 위치에 S 및 위치 219에 상응하는 위치에 H로의 아미노산 치환(들), 또는 비변형 FX 폴리펩티드에서 상응하는 아미노산 잔기에 동일한 치환들 중에서 선택되는 아미노산 치환들을 포함하는 변형 FX 폴리펩티드.
  57. 제48항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 134에 기재된 아미노산 위치를 참고로,
    위치 196에 상응하는 위치에 S, 위치 211에 상응하는 위치에 S 및 위치 219에 상응하는 위치에 H;
    위치 197에 상응하는 위치에 A, 위치 211에 상응하는 위치에 S 및 위치 219에 상응하는 위치에 H; 및
    위치 195에 상응하는 위치에 L, 위치 211에 상응하는 위치에 S 및 위치 219에 상응하는 위치에 H로의 아미노산 치환(들), 또는 비변형 FX 폴리펩티드에서 상응하는 아미노산 잔기에 동일한 아미노산 치환들 중에서 선택되는 아미노산 치환을 포함하는 변형 FX 폴리펩티드.
  58. 제54항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 134에 기재된 아미노산 위치를 참고로 각각,
    위치 327에 상응하는 위치에 A 및 위치 338에 상응하는 위치에 A로의 아미노산 치환(들); 또는
    위치 327에 상응하는 위치에 L 및 위치 338에 상응하는 위치에 M으로의 아미노산 치환(들), 또는 비변형 FX 폴리펩티드에서 상응하는 아미노산 잔기에 동일한 아미노산 치환들을 포함하는 변형 FX 폴리펩티드.
  59. 제54항 내지 58항 중 어느 한 항에 있어서,
    위치 200에 상응하는 위치에 V, 위치 327에 상응하는 위치에 L, 및 위치 338에 상응하는 위치에 M으로의 아미노산 치환(들); 또는
    위치 200에 상응하는 위치에 V, 위치 327에 상응하는 위치에 L, 위치 334에 상응하는 위치에 A 및 위치 338에 상응하는 위치에 M으로의 아미노산 치환(들)을 포함하는 변형 FX 폴리펩티드.
  60. 비변형 인자 X (FX) 폴리펩티드에서 아미노산 치환을 포함하는 변형 인자 X (FX) 폴리펩티드로서,
    상기 비변형 FX 폴리펩티드는 서열번호 134에 기재된 아미노산 서열을 가지거나, 지모겐, 이의 활성형 또는 촉매 활성형이거나, 또는 서열번호 134, 지모겐, 이의 활성형 또는 촉매 활성형 각각에 대하여 적어도 75%의 서열 상동성을 가지며;
    상기 아미노산 치환은 서열번호 134에 기재된 아미노산 위치를 참고로 각각,
    위치 197에 상응하는 위치에 S; 위치 200에 상응하는 위치에 A; 위치 200에 상응하는 위치에 V; 위치 326에 상응하는 위치에 S; 위치 326에 상응하는 위치에 T; 위치 326에 상응하는 위치에 V; 위치 326에 상응하는 위치에 N; 위치 326에 상응하는 위치에 M; 위치 326에 상응하는 위치에 K; 위치 326에 상응하는 위치에 Y; 위치 327에 상응하는 위치에 A; 위치 327에 상응하는 위치에 L; 위치 334에 상응하는 위치에 A; 위치 334에 상응하는 위치에 T; 위치 334에 상응하는 위치에 N; 위치 336에 상응하는 위치에 E; 위치 338에 상응하는 위치에 A; 위치 338에 상응하는 위치에 S; 위치 338에 상응하는 위치에 N; 위치 338에 상응하는 위치에 R; 위치 338에 상응하는 위치에 V; 위치 338에 상응하는 위치에 Y; 및 위치 338에 상응하는 위치에 M, 또는 비변형 FX 폴리펩티드에서 상응하는 아미노산 잔기에 동일한 치환(들) 중에서 선택되고;
    상응하는 아미노산 잔기는 비변형 FX 폴리펩티드와 서열번호 134의 폴리펩티드의 정렬에 의해 확인되며; 및
    변형 FX 폴리펩티드는 FVa-의존적 촉매 활성을 나타내는 변형 인자 X (FX) 폴리펩티드.
  61. 제60항에 있어서, 위치 196에 상응하는 위치에 S, 위치 196에 상응하는 위치에 I; 위치 196에 상응하는 위치에 L; 위치 196에 상응하는 위치에 T; 위치 326에 상응하는 위치에 A 및 위치 326에 상응하는 위치에 Q 중에서 선택되는 아미노산 치환(들)을 추가로 포함하는 변형 FX 폴리펩티드.
  62. 제48항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 비-천연 글리코실화 부위의 도입에 의하여 글리코실화를 변경시키는 추가적인 아미노산 치환(들)을 포함하는 변형 FX 폴리펩티드.
  63. 제62항에 있어서, 비-천연 글리코실화 부위는 아미노산 치환(들)에 의해 도입되고, 상기 아미노산 치환은
    위치 51에 상응하는 위치에 N; 위치 56에 상응하는 위치에 N 및 위치 58에 상응하는 위치에 S; 위치 62에 상응하는 위치에 N 및 위치 64에 상응하는 위치에 S; 위치 65에 상응하는 위치에 N 및 위치 67에 상응하는 위치에 S; 위치 67에 상응하는 위치에 N; 위치 73에 상응하는 위치에 N 및 위치 75에 상응하는 위치에 S; 위치 75에 상응하는 위치에 N 및 위치 77에 상응하는 위치에 S; 위치 77에 상응하는 위치에 N 및 위치 79에 상응하는 위치에 S; 위치 78에 상응하는 위치에 N 및 위치 80에 상응하는 위치에 S; 위치 82에 상응하는 위치에 S; 위치 83에 상응하는 위치에 N; 위치 82에 상응하는 위치에 N 및 위치 84에 상응하는 위치에 S; 위치 85에 상응하는 위치에 N 및 위치 87에 상응하는 위치에 S; 위치 86에 상응하는 위치에 N 및 위치 88에 상응하는 위치에 S; 위치 95에 상응하는 위치에 N 및 위치 97에 상응하는 위치에 S; 위치 114에 상응하는 위치에 N; 위치 119에 상응하는 위치에 N 및 위치 121에 상응하는 위치에 S; 위치 122에 상응하는 위치에 S; 위치 215에 상응하는 위치에 N 및 위치 217에 상응하는 위치에 S; 위치 243에 상응하는 위치에 N 및 위치 245에 상응하는 위치에 S; 위치 264에 상응하는 위치에 N 및 위치 266에 상응하는 위치에 S; 위치 293에 상응하는 위치에 N 및 위치 295에 상응하는 위치에 S; 위치 388에 상응하는 위치에 N; 위치 389에 상응하는 위치에 N 및 위치 391에 상응하는 위치에 S; 위치 428에 상응하는 위치에 N 및 위치 430에 상응하는 위치에 S; 및 위치 429에 상응하는 위치에 N 및 위치 431에 상응하는 위치에 S로의 아미노산 치환(들), 또는 비변형 FX 폴리펩티드에서 상응하는 아미노산 잔기에 동일한 치환(들) 중에서 선택되는 변형 FX 폴리펩티드.
  64. 제54항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서,
    위치 119에 상응하는 위치에 N, 위치 121에 상응하는 위치에 S, 위치 196에 상응하는 위치에 S, 위치 211에 상응하는 위치에 S 및 위치 219에 상응하는 위치에 H;
    위치 114에 상응하는 위치에 N, 위치 196에 상응하는 위치에 S, 위치 211에 상응하는 위치에 S 및 위치 219에 상응하는 위치에 H;
    위치 114에 상응하는 위치에 N, 위치 119에 상응하는 위치에 N, 위치 121에 상응하는 위치에 S, 위치 196에 상응하는 위치에 S, 위치 211에 상응하는 위치에 S 및 위치 219에 상응하는 위치에 H;
    위치 196에 상응하는 위치에 S, 위치 211에 상응하는 위치에 S, 위치 219에 상응하는 위치에 H, 위치 264에 상응하는 위치에 N 및 위치 266에 상응하는 위치에 S;
    위치 119에 상응하는 위치에 N, 위치 121에 상응하는 위치에 S, 위치 196에 상응하는 위치에 S, 위치 211에 상응하는 위치에 S, 위치 219에 상응하는 위치에 H, 위치 264에 상응하는 위치에 N 및 위치 266에 상응하는 위치에 S;
    위치 114에 상응하는 위치에 N, 위치 196에 상응하는 위치에 S, 위치 211에 상응하는 위치에 S, 위치 219에 상응하는 위치에 H, 위치 264에 상응하는 위치에 N 및 위치 266에 상응하는 위치에 S;
    위치 119에 상응하는 위치에 N, 위치 121에 상응하는 위치에 S, 위치 196에 상응하는 위치에 S, 위치 211에 상응하는 위치에 S, 위치 219에 상응하는 위치에 H 및 위치 388에 상응하는 위치에 N;
    위치 114에 상응하는 위치에 N, 위치 196에 상응하는 위치에 S, 위치 211에 상응하는 위치에 S, 위치 219에 상응하는 위치에 H 및 위치 388에 상응하는 위치에 N; 및
    위치 196에 상응하는 위치에 S, 위치 211에 상응하는 위치에 S, 위치 219에 상응하는 위치에 H, 위치 264에 상응하는 위치에 N, 위치 266에 상응하는 위치에 S 및 위치 388에 상응하는 위치에 N으로의 아미노산 치환(들) 중에서 선택되는 아미노산 치환을 포함하는, 변형 FX 폴리펩티드.
  65. 비-천연 글리코실화 부위를 포함하는 변형 FX 폴리펩티드로서,
    상기 비-천연 글리코실화 부위는 하나 또는 두 개의 아미노산 치환에 의한 아미노산 치환(들)에 의해 도입되고;
    상기 비변형 FX 폴리펩티드는 서열번호 134에 기재된 아미노산 서열을 가지거나, 지모겐, 이의 활성형 또는 촉매 활성형이거나, 또는 서열번호 134, 지모겐, 이의 활성형 또는 촉매 활성형 각각에 대하여 적어도 75%의 서열 상동성을 가지며;
    상기 아미노산 치환(들)은, 서열번호 134에 기재된 아미노산 위치를 참고로,
    위치 51에 상응하는 위치에 N;
    위치 56에 상응하는 위치에 N 및 위치 58에 상응하는 위치에 S;
    위치 62에 상응하는 위치에 N 및 위치 64에 상응하는 위치에 S;
    위치 65에 상응하는 위치에 N 및 위치 67에 상응하는 위치에 S;
    위치 67에 상응하는 위치에 N;
    위치 73에 상응하는 위치에 N 및 위치 75에 상응하는 위치에 S;
    위치 75에 상응하는 위치에 N 및 위치 77에 상응하는 위치에 S;
    위치 77에 상응하는 위치에 N 및 위치 79에 상응하는 위치에 S;
    위치 78에 상응하는 위치에 N 및 위치 80에 상응하는 위치에 S;
    위치 82에 상응하는 위치에 S;
    위치 83에 상응하는 위치에 N;
    위치 82에 상응하는 위치에 N 및 위치 84에 상응하는 위치에 S;
    위치 85에 상응하는 위치에 N 및 위치 87에 상응하는 위치에 S;
    위치 86에 상응하는 위치에 N 및 위치 88에 상응하는 위치에 S;
    위치 95에 상응하는 위치에 N 및 위치 97에 상응하는 위치에 S;
    위치 114에 상응하는 위치에 N;
    위치 119에 상응하는 위치에 N 및 위치 121에 상응하는 위치에 S;
    위치 122에 상응하는 위치에 S;
    위치 215에 상응하는 위치에 N 및 위치 217에 상응하는 위치에 S;
    위치 243에 상응하는 위치에 N 및 위치 245에 상응하는 위치에 S;
    위치 264에 상응하는 위치에 N 및 위치 266에 상응하는 위치에 S;
    위치 293에 상응하는 위치에 N 및 위치 295에 상응하는 위치에 S;
    위치 388에 상응하는 위치에 N;
    위치 389에 상응하는 위치에 N 및 위치 391에 상응하는 위치에 S;
    위치 428에 상응하는 위치에 N 및 위치 430에 상응하는 위치에 S; 및
    위치 429에 상응하는 위치에 N 및 위치 431에 상응하는 위치에 S로의 아미노산 치환(들), 또는 비변형 FX 폴리펩티드에서 상응하는 아미노산 잔기에 동일한 치환(들) 중에서 선택되고 ;
    상응하는 아미노산 잔기는 비변형 FX 폴리펩티드와 서열번호 134의 폴리펩티드의 정렬에 의하여 확인되고;
    상기 변형 FX 폴리펩티드는 FVa-의존적 촉매 활성을 나타내는 변형 FX 폴리펩티드.
  66. 제48항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 단지 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개의 아미노산 치환(들)을 포함하는 변형 FX 폴리펩티드.
  67. 제48항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 비변형 FX 폴리펩티드가
    a) 서열번호 134의 잔기 1-139에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 및 서열번호 134의 잔기 143-448에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는 지모겐 FX 폴리펩티드, 또는 서열번호 134의 잔기 1-139에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 및 서열번호 134의 잔기 143-448에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는 지모겐 FX 폴레펩티드에 대하여 적어도 75%의 서열 상동성을 나타내는 아미노산 서열;
    b) 서열번호 134의 잔기 1-139에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 및 서열번호 134의 잔기 195-448에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는 활성 FX (FXa) 폴리펩티드, 또는 서열번호 134의 잔기 1-139에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 및 서열번호 134의 잔기 195-448에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는 FXa에 대하여 적어도 75%의 서열 상동성을 나타내는 아미노산 서열; 및
    c) b)의 촉매 활성형
    중에서 선택되는 변형 FX 폴리펩티드.
  68. 제48항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 비변형 FX 폴리펩티드가 서열번호 134 또는 지모겐, 이의 활성형 또는 촉매 활성형에 대하여 적어도 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 상동성을 나타내는 변형 FX 폴리펩티드.
  69. 제54항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서,
    a) 서열번호 164, 173, 174, 176, 177, 179-181, 183-190, 192-203, 205-209, 213, 259-261 및 263-265 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열 또는 서열번호 164, 173, 174, 176, 177, 179-181, 183-190, 192-203, 205-209, 213, 259-261 및 263-265 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열 중 어느 하나와 적어도 75%의 서열 상동성을 나타내고 아미노산 치환(들)을 함유하는 아미노산 서열;
    b) 서열번호 164, 173, 174, 176, 177, 179-181, 183-190, 192-203, 205-209, 213, 259-261 및 263-265 중 어느 하나의 잔기 1-139에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 및 잔기 143-448에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는 아미노산 서열, 또는 서열번호 164, 173, 174, 176, 177, 179-181, 183-190, 192-203, 205-209, 213, 259-261 및 263-265 중 어느 하나의 잔기 1-139에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 및 잔기 143-448에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는 아미노산 서열 중 어느 하나와 적어도 75%의 서열 상동성을 나타내고 아미노산 치환(들)을 포함하는 아미노산 서열;
    c) 서열번호 164, 173, 174, 176, 177, 179-181, 183-190, 192-203, 205-209, 213, 259-261 및 263-265 중 어느 하나의 잔기 1-139에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 및 잔기 195-448에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는 아미노산 서열, 또는 서열번호 164, 173, 174, 176, 177, 179-181, 183-190, 192-203, 205-209, 213, 259-261 및 263-265 중 어느 하나의 잔기 1-139에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 및 잔기 195-448에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는 아미노산 서열 중 어느 하나와 적어도 75%의 서열 상동성을 나타내고 아미노산 치환(들)을 포함하는 아미노산 서열; 및
    d) 아미노산 치환(들)을 포함하고 촉매 활성을 나타내는 c)의 촉매 활성형
    중에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 변형 FX 폴리펩티드.
  70. 제48항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 활성 FX (FXa)형이 아미노산 치환(들)을 함유하지 않는 동일한 FXa 폴리펩티드와 비교하여 증가된 FVa 보조인자 의존성을 나타내는 변형 FX 폴리펩티드.
  71. 제6항, 제27항 또는 제70항에 있어서, 보조인자 의존성이 적어도 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 20배, 30배, 40배, 50배, 100배, 200배, 300배, 400배, 500배, 600배, 700배, 800배, 900배, 1000배, 1200배 또는 1500배 증가된 변형 FX 폴리펩티드.
  72. 제1항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 활성 FX (FXa)형이 아미노산 치환(들)을 함유하지 않는 동일한 FXa 폴리펩티드와 비교하여, 증가된 항-트롬빈 Ⅲ (ATⅢ) 저항성을 나타내는 변형 FX 폴리펩티드.
  73. 제72항에 있어서, ATⅢ 저항성이 적어도 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 20배, 30배, 40배, 50배, 60배, 70배, 80배, 90배, 100배, 200배, 300배, 400배, 500배, 600배, 700배, 800배, 900배, 1000배, 1500배, 2000배, 2500배, 3000배, 3500배, 4000배, 4500배, 5000배, 5500배 또는 6000배 증가된 변형 FX 폴리펩티드.
  74. 제1항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 활성 FX (FXa)형이 아미노산 치환(들)을 함유하지 않는 동일한 FXa의 적어도 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190% 또는 그 이상의 촉매 활성을 나타내는 변형 FX 폴리펩티드.
  75. 제74항에 있어서, 촉매 활성이 FVa의 존재 하에 있는 변형 FX 폴리펩티드.
  76. 제74항에 있어서, 촉매 활성이 FVa의 부재 하에 있는 변형 FX 폴리펩티드.
  77. 제1항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 134에 기재된 아미노산 위치를 참고로 위치 195에 상응하는 위치에 L, 또는 비변형 FX 폴리펩티드에서 상응하는 아미노산 잔기에 동일한 치환(들) 중에서 선택되는 아미노산 치환을 추가로 포함하는 변형 FX 폴리펩티드.
  78. 제1항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 폴리펩티드인 변형 FX 폴리펩티드.
  79. 제1항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 비-인간 폴리펩티드인 변형 FX 폴리펩티드.
  80. 제22항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 지모겐 폴리펩티드인 변형 FX 폴리펩티드.
  81. 제22항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 두-사슬 폴리펩티드인 변형 FX 폴리펩티드.
  82. 제22항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 단일-사슬 폴리펩티드인 변형 FX 폴리펩티드.
  83. 제22항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 활성 또는 활성화된 변형 FX 폴리펩티드.
  84. 제83항에 있어서, 활성화가 TF/TVIIa 또는 FVIIIa/FIXa 테나제 복합체 또는 러셀 살모사 독 FX 활성화제(Russeell's Viper Venom FX Activator)에 의한 단백질 분해성 절단(proteolytic cleavage)에 의해 영향을 받는 것인 변형 FX 폴리펩티드.
  85. 제1항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서, 일차 서열만이 변형된 변형 FX 폴리펩티드.
  86. 제1항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서, 화학적 변형 또는 번역후 변형을 추가로 포함하는 변형 FX 폴리펩티드.
  87. 제86항에 있어서, 변형 FX 폴리펩티드가 글리코실화, 카복실화, 히드록실화, 황산화, 인산화, 알부민화, 폴리에틸렌글리콜(PEG) 모이어티에 컨쥬게이트화된 변형 FX 폴리펩티드.
  88. 제1항 내지 제87항 중 어느 한 항에 있어서, 키메라 또는 융합 단백질인 변형 FX 폴리펩티드.
  89. 제1항 내지 제88항 중 어느 한 항의 변형 FX 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자.
  90. 제89항의 핵산 분자를 포함하는 벡터.
  91. 제90항에 있어서, 벡터가 원핵생물 벡터, 바이러스 벡터 또는 진핵생물 벡터인 벡터.
  92. 제90항 또는 제91항에 있어서, 벡터가 포유동물 벡터인 벡터.
  93. 제91항 또는 92항에 있어서, 바이러스 벡터가 아데노바이러스, 아데노-연관-바이러스, 레트로바이러스, 헤르페스 바이러스, 렌티바이러스, 폭스바이러스, 및 사이토메갈로바이러스 중에서 선택되는 것인 벡터.
  94. 제90항 내지 제93항 중 어느 한 항의 벡터를 포함하는 단리된 세포.
  95. 제94항에 있어서, 진핵생물 세포인 세포.
  96. 제95항에 있어서, 진핵생물 세포가 포유동물 세포인 세포.
  97. 제96항에 있어서, 포유동물 세포가 새끼 햄스터 신장 세포(BHK-21) 또는 293 세포 또는 CHO 세포 중에서 선택되는 것인 세포.
  98. 제94항 내지 제97항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 변형 FX 폴리펩티드를 발현하는 세포.
  99. 제94항 내지 제98항 중 어느 한 항의 세포에 의해서 생산되는 변형 FX 폴리펩티드.
  100. 약학적으로 허용가능한 비히클 중에 제1항 내지 제88항 중 어느 한 항의 변형 FX 폴리펩티드, 제89항의 핵산, 또는 제90항 내지 제93항 중 어느 한 항의 벡터를 포함하는 약학적 조성물.
  101. 제100항에 있어서, 국부(local), 전신 또는 국소(topical) 투여용으로 제형화된 약학적 조성물.
  102. 제100항 또는 제101항에 있어서, 경구, 비강, 폐, 구강, 경피, 피하, 십이지장내, 장, 비경구, 정맥, 또는 근육내 투여용으로 제형화된 약학적 조성물.
  103. 제100항 내지 제102항 중 어느 한 항에 있어서, 제어-방출용으로 제형화된 약학적 조성물.
  104. 제100항 내지 제103항 중 어느 한 항에 있어서, 단일-용량 투여용으로 제형화된 약학적 조성물.
  105. 서열번호 134에 기재된 아미노산 위치를 참고로 성숙 넘버링(mature numbering)에 기초할 때 비변형 FX 폴리펩티드에서 위치 196에 상응하는 아미노산 위치로 인자 X 폴리펩티드에 아미노산 치환을 도입하는 것을 포함함으로써 변형 폴리펩티드의 활성 FX (FXa)형이 증가된 보조인자 의존성을 나타내는, 활성 인자 Xa 폴리펩티드의 보조인자 의존성을 증가시키는 방법.
  106. 제105항에 있어서, 상기 비변형 FX 폴리펩티드는 서열번호 134에 기재된 아미노산 서열을 가지거나, 또는 지모겐, 이의 활성형 또는 촉매 활성형이거나, 또는 서열번호 134, 지모겐, 이의 활성형 또는 촉매 활성형 각각에 대하여 적어도 75%의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 방법.
  107. 제105항 또는 제106항에 있어서, 아미노산 치환이 중성의 비극성 아미노산으로의 치환인 방법.
  108. 제107항에 있어서, 중성의 극성 아미노산이 아스파라긴(N), 글루타민(Q), 세린(S), 트레오닌(T), 트립토판(W), 시스테인(C) 및 티로신(Y) 중에서 선택되는 것인 방법.
  109. a) 제80항에 기재된 변형 FX 지모겐을 포함하는 조성물을 제공하고; 및
    b) 상기 지모겐의 활성화 절단에 의하여 폴리펩티드로부터 활성화 펩티드를 제거하고, 이로써 변형 FXa 폴리펩티드를 생산하는 것을 포함하는 변형 활성 인자 X (FXa) 폴리펩티드를 생산하는 방법.
  110. a) 서열번호 134에 기재된 아미노산 1-139의 서열, 또는 서열번호 134의 아미노산 1-139 서열에 대하여 적어도 75%의 서열 상동성을 나타내고 아미노산 치환(들)을 함유하는 아미노산 서열을 갖는 경쇄; 및
    서열번호 136-265 중 어느 하나의 아미노산 143-448 서열, 또는 서열번호 136-265 중 어느 하나의 아미노산 143-448 서열에 대하여 적어도 75%의 서열 상동성을 나타내고 비변형 FX 폴리펩티드와 비교하여 아미노산 치환(들)을 함유하는 아미노산 서열을 갖는 중쇄;를 포함하는 지모겐 중에서 선택된 변형 FX 지모겐을 포함하는 조성물을 제공하고; 및
    b) 상기 지모겐의 활성화 절단에 의하여 폴리펩티드로부터 활성화 펩티드를 제거하고, 이로써 변형 FXa 폴리펩티드를 생산하는 것을 포함하는 변형 활성 인자 X (FXa) 폴리펩티드를 생산하는 방법.
  111. 제109항 또는 제110항에 있어서, 활성화 절단이 생체내(in vivo) 또는 시험관내(in vitro)에서 영향을 받는 방법.
  112. 제109항 내지 제111항 중 어느 한 항에 있어서, 활성화 절단이 TF/TVIIa 또는 FVIIIa/FIXa 테나제 복합체 또는 러셀 살모사 독 FX 활성화제(Russeell's Viper Venom FX Activator) 중에서 선택되는 활성제에 의해 영향을 받는 방법.
  113. 제109항 내지 제112항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물로부터 활성제를 제거하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  114. 제109항 내지 제113항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물로부터 활성화 펩티드를 제거하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  115. 제109항 내지 제114항 중 어느 한 항에 있어서, FX 지모겐은 서열번호 4-133 또는 136-265 및 417-546 중 어느 하나에 기재된 폴리펩티드를 암호화하는 핵산, 또는 서열번호 4-133, 또는 136-265 및 417-546 중 어느 하나에 대하여 적어도 75%의 서열 상동성을 갖고 비변형 FX 폴리펩티드와 비교하여 아미노산 치환(들)을 함유하는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산의 발현에 의하여 생산되는 것인 방법.
  116. 제1항 내지 제88항 중 어느 한 항의 변형 FX 폴리펩티드 또는 제100항 내지 제104항 중 어느 한 항의 약학적 조성물을 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 출혈 질병을 치료하는 질환 또는 상태를 치료하는 방법.
  117. 제116항에 있어서, 변형 FX 폴리펩티드가 아미노산 치환(들)을 함유하는 지모겐, FXa 또는 이의 촉매 활성 부분(portion)인 방법.
  118. 제116항 또는 제117항에 있어서, 약학적 조성물로의 치료는 질환 또는 상태와 연관된 증상을 개선하거나 완화하는 것인 방법.
  119. 제116항 내지 제118항 중 어느 한 항에 있어서, 출혈 질병에 연관된 증상의 변화에 대하여 개체를 모니터링하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  120. 제116항 내지 제119항 중 어느 한 항에 있어서, 출혈 질병이 선천적 출혈 질병 또는 후천적 출혈 질병인 방법.
  121. 제116항 내지 제120항 중 어느 한 항에 있어서, 출혈 질병이 응고 인자 결핍에 의한 질병, 응고인자에 대한 후천적 저해제의 존재에 의한 질병, 혈액 질병, 출혈 질병, 폰 빌레브란트 질병(Von Willebrand's disease), 비타민-K 길항제를 이용한 항응고제 치료로 야기된 질병, 유전성 혈소판 질병, 비타민 K 에폭시드 리덕테이즈 C1 결핍, 감마-카복실레이즈 결핍, 외상과 연관된 출혈, 부상, 혈전증, 혈소판감소증, 뇌졸중, 응고장애, 파종성 혈관내 응고(DIC), 베르나르-술리에 증후군(Bernard Soulier syndrome), 혈소판무력증(Glanzman thromblastemia) 및 저장 풀 결핍(storage pool deficiency) 중에서 선택되는 것인 방법.
  122. 제116항 내지 제121항 중 어느 한 항에 있어서, 출혈 질병이 응고 인자의 결핍에 의한 것이거나, 응고 인자에 대한 후천적 저해제의 존재에 의한 것이고, 상기 응고 인자는 인자 Ⅶ, 인자 Ⅸ, 인자 Ⅹ, 인자 XI, 인자 V, 인자 XII, 인자 Ⅱ 및 폰 빌레브란트 인자(von Willebrand factor) 중에서 선택되는 것인 방법.
  123. 제116항 내지 제122항 중 어느 한 항에 있어서, 출혈 질병이 응고 인자의 결핍에 의한 것이고, 상기 응고 인자는 인자 Ⅶ, 인자 Ⅷ, 인자 Ⅸ, 인자 XI 중에서 선택되는 것인 방법.
  124. 제116항 내지 제123항 중 어느 한 항에 있어서, 출혈 질병이 혈우병 A, 혈우병 B 또는 혈우병 C 중에서 선택되는 것인 방법.
  125. 제116항 내지 제122항 중 어느 한 항에 있어서, 출혈 질병이 응고 인자의 결핍에 의한 것이고, 상기 질병은 가족성 다중 응고 인자 결핍(familial multiple coagulation factor deficiency, FMFD)인 것인 방법.
  126. 제116항 내지 제122항 중 어느 한 항에 있어서, 출혈 질병이 응고 인자에 대한 후천적 저해제의 존재에 의한 것이고, 상기 응고 인자는 인자 Ⅶ, 인자 Ⅷ, 인자 Ⅸ, 인자 Ⅹ, 인자 XI, 및 인자 XII 중에서 선택되는 것인 방법.
  127. 제126항에 있어서, 후천적 저해제가 자가항체인 방법.
  128. 제126항 또는 제127항에 있어서, 출혈 질병이 후천적 혈우병인 방법.
  129. 제1126항 내지 제121항 중 어느 한 항에 있어서, 출혈 질병이 체디아크 히가시 증후군(Chediak-Higashi syndrome), 헤르만스키-푸드락 증후군(Hermansky-Pudlak syndrome), 트롬복산 A2 기능장애, 혈소판무력증(Glanzmann's thrombasthenia) 및 베르나르-술리에 증후군(Bernard Soulier syndrome) 중에서 선택되는 유전성 혈소판 질병인 방법.
  130. 제112항 내지 제120항 중 어느 한 항에 있어서, 질병이 비타민-K 길항제를 이용한 항응고제 치료로 야기된 것이고, 상기 비타민-K 길항제는 헤파린, 오당류, 와파린, 소분자 항혈전제(small molecular antithrombotics) 및 FXa 저해제 중에서 선택되는 것인 방법.
  131. 제112항 내지 제121항 중 어느 한 항에 있어서, 질병이 혈전증, 혈소판감소증, 뇌졸중 및 응고장애 중에서 선택되는 것인 방법.
  132. 제112항 내지 제121항 중 어느 한 항에 있어서, 질병이 외상, 수술 또는 상처로 야기된 것인 방법.
  133. 제132항에 있어서, 출혈이 급성 혈관절증(acute haemarthroses), 만성 혈우병성 관절증(chronic haemophilic arthropathy), 혈종, 혈뇨, 중추신경계 출혈, 위장 출혈, 또는 뇌 출혈로서 나타나는 것인 방법.
  134. 제132항에 있어서, 출혈이 발치(dental extraction)에 의한 것인 방법.
  135. 제132항에 있어서, 수술이 심장 수술, 혈관성형술, 폐 수술, 복부 수술, 척추 수술, 뇌 수술, 혈관 수술, 치아 수술, 또는 장기 이식 수술인 방법.
  136. 제135항에 있어서, 이식 수술이 골수, 심장, 폐, 이자 및 간의 이식 중에서 선택되는 것인 방법.
  137. 제112항 내지 제136항 중 어느 한 항에 있어서, 변형 FX 폴리펩티드가 비변형 FX 폴리펩티드와 비교하여 증가된 반감기를 나타내는 방법.
  138. 제137항에 있어서, 증가된 반감기가 AT-Ⅲ에 대한 증가된 저항성 또는 도입된 비-천연 글리코실화 부위의 글리코실화에 의한 과글리코실화(hyperglycosylation)에 의해 영향을 받는 것인 방법.
  139. 제112항 내지 제138항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 추가적인 응고 인자를 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  140. 제139항에 있어서, 상기 하나 이상의 추가 응고 인자가 혈장 정제 또는 재조합 응고 인자, 비타민 K, 비타민 K 유도체 및 단백질 C 저해제와 같은 응혈원, 혈장, 혈소판, 적혈구 및 코르티코스테로이드 중에서 선택되는 것인 방법.
  141. 출혈 질병을 치료하는데 사용하기 위한 제1항 내지 제88항 중 어느 한 항의 변형 FX 폴리펩티드.
  142. 출혈 질병의 치료를 위한 약제 제조에의 제100항 내지 제104항 중 어느 한 항의 변형 FX 폴리펩티드를 포함하는 약학적 조성물의 용도.
  143. 제141항 또는 제142항에 있어서, 변형 FX 폴리펩티드가 아미노산 치환(들)을 함유하는 지모겐, FXa 또는 이의 촉매 활성형인 변형 FX 폴리펩티드 또는 용도.
  144. 제141항 내지 제143항 중 어느 한 항에 있어서, 출혈 질병이 선천적 출혈 질병 또는 후천적 출혈 질병인 변형 FX 폴리펩티드 또는 용도.
  145. 제141항 내지 제144항 중 어느 한 항에 있어서, 출혈 질병이 응고 인자의 결핍에 의한 질병, 응고 인자에 대한 후천적 저해제의 존재에 의한 질병, 혈액 질병, 출혈 질병, 폰 빌레브란트 질병(Von Willebrand's disease), 비타민-K 길항제를 이용한 항응고제 치료로 야기된 질병, 유전성 혈소판 질병, 비타민 K 에폭시드 리덕테이즈 C1 결핍, 감마-카복실레이즈 결핍, 외상과 연관된 출혈, 부상, 혈전증, 혈소판감소증, 뇌졸중, 응고장애, 파종성 혈관내 응고(DIC), 베르나르-술리에 증후군(Bernard Soulier syndrome), 혈소판무력증(Glanzman thromblastemia) 및 저장 풀 결핍(storage pool deficiency) 중에서 선택되는 것인 변형 FX 폴리펩티드 또는 용도.
  146. 제145항에 있어서, 출혈 질병이 응고 인자의 결핍에 의한 것이거나, 응고 인자에 대한 후천적 저해제의 존재에 의한 것이고, 상기 응고 인자는 인자 Ⅶ, 인자 Ⅸ, 인자 Ⅹ, 인자 XI, 인자 V, 인자 XII, 인자 Ⅱ 및 폰 빌레브란트 인자(von Willebrand factor) 중에서 선택되는 것인 변형 FX 폴리펩티드 또는 용도.
  147. 제146항에 있어서, 출혈 질병이 응고 인자의 결핍에 의한 것이고, 상기 응고 인자는 인자 Ⅶ, 인자 Ⅷ, 인자 Ⅸ, 인자 XI 중에서 선택되는 것인 변형 FX 폴리펩티드 또는 용도.
  148. 제141항 내지 제147항 중 어느 한 항에 있어서, 출혈 질병이 혈우병 A, 혈우병 B 또는 혈우병 C 중에서 선택되는 것인 변형 FX 폴리펩티드 또는 용도.
  149. 제141항 내지 제145항 중 어느 한 항에 있어서, 출혈 질병이 응고 인자의 결핍에 의한 것이고, 상기 질병은 가족성 다중 응고 인자 결핍(familial multiple coagulation factor deficiency, FMFD)인 변형 FX 폴리펩티드 또는 용도.
  150. 제141항 내지 제145항 중 어느 한 항에 있어서, 출혈 질병이 응고 인자에 대한 후천적 저해제의 존재에 의한 것이고, 상기 응고 인자는 인자 Ⅶ, 인자 Ⅷ, 인자 Ⅸ, 인자 Ⅹ, 인자 XI 및 인자 XII 중에서 선택되는 것인 변형 FX 폴리펩티드 또는 용도.
  151. 제150항에 있어서, 후천적 저해제가 자가항체인 변형 FX 폴리펩티드 또는 용도.
  152. 제150항 또는 제151항에 있어서, 출혈 질병이 후천적 혈우병인 변형 FX 폴리펩티드 또는 용도.
  153. 제141항 내지 제145항 중 어느 한 항에 있어서, 출혈 질병이 체디아크 히가시 증후군(Chediak-Higashi syndrome), 헤르만스키-푸드락 증후군(Hermansky-Pudlak syndrome), 트롬복산 A2 기능장애, 혈소판무력증(Glanxmann's thrombasthenia) 및 베르나르-술리에 증후군(Bernard-Soulier syndrome) 중에서 선택되는 유전성 혈소판 질병인 변형 FX 폴리펩티드 또는 용도.
  154. 제141항 내지 제145항 중 어느 한 항에 있어서, 질병이 비타민-K 길항제를 이용한 항응고제 치료로 야기된 것이고, 상기 비타민-K 길항제는 헤파린, 오당류, 와파린, 소분자 항혈전제(small molecular antithrombotics) 및 FXa 저해제 중에서 선택되는 것인 변형 FX 폴리펩티드 또는 용도.
  155. 제141항 내지 제145항 중 어느 한 항에 있어서, 질병이 혈전증, 혈소판감소증, 뇌졸중 및 응고장애 중에서 선택되는 것인 변형 FX 폴리펩티드 또는 용도.
  156. 제141항 내지 제145항 중 어느 한 항에 있어서, 질병이 외상, 수술 또는 상처로 야기된 것인 변형 FX 폴리펩티드 또는 용도.
  157. 제156항에 있어서, 출혈이 급성 혈관절증(acute haemarthroses), 만성 혈우병성 관절증(chronic haemophilic arthropathy), 혈종, 혈뇨, 중추신경계 출혈, 위장 출혈, 또는 뇌 출혈로서 나타나는 것인 변형 FX 폴리펩티드 또는 용도.
  158. 제156항에 있어서, 출혈이 발치(dental extraction)에 의한 것인 변형 FX 폴리펩티드 또는 용도.
  159. 제156항에 있어서, 수술이 심장 수술, 혈관성형술, 폐 수술, 복부 수술, 척추 수술, 뇌 수술, 혈관 수술, 치아 수술, 또는 장기 이식 수술인 것인 변형 FX 폴리펩티드 또는 용도.
  160. 제159항에 있어서, 이식 수술이 골수, 심장, 폐, 이자 및 간의 이식 중에서 선택되는 것인 변형 FX 폴리펩티드 또는 용도.
  161. 제141항 내지 제160항 중 어느 한 항에 있어서, 변형 FX 폴리펩티드가 비변형 FX 폴리펩티드와 비교하여 증가된 반감기를 나타내는 변형 FX 폴리펩티드 또는 용도.
  162. 제161항에 있어서, 증가된 반감기는 AT-Ⅲ에 대한 증가된 저항성 또는 도입된 비-천연 글리코실화 부위의 글리코실화에 의한 과글리코실화(hyperglycosylation)에 의해 영향을 받는 변형 FX 폴리펩티드 또는 용도.
  163. 포장 재료 안에 함유된 제100항 내지 제104항 중 어느 한 항의 약학적 조성물 및 포장 재료를 포함하는 제조품.
  164. 제163항에 있어서, 변형 FX 폴리펩티드는 출혈 질병의 치료에 효과적이고, 포장 재료는 변형 FX 폴리펩티드가 출혈 질병의 치료용으로 사용됨을 지시하는 라벨을 포함하는 것인 제조품.
  165. 제100항 내지 제104항 중 어느 한 항의 약학적 조성물, 상기 조성물의 투여용 장치 및, 선택적으로, 투여를 위한 지침을 포함하는 키트.
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