JP2002542832A

JP2002542832A - プロテインｃ誘導体

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Publication number: JP2002542832A
Application number: JP2000615776A
Authority: JP
Inventors: ブルース・エドワード・ガーリッツ; ブライアン・エドワード・ジョーンズ
Original assignee: Eli Lilly and Co
Current assignee: Eli Lilly and Co
Priority date: 1999-04-30
Filing date: 2000-04-13
Publication date: 2002-12-17
Also published as: KR20010053345A; EP1090130A1; CA2338799A1; AR029627A1; HUP0102444A3; PE20010066A1; IL140326A0; WO2000066754A1; AU4188500A; BR0006088A; HUP0102444A2

Abstract

(57)【要約】新規プロテインＣ誘導体について記載する。これらのポリペプチドは野生型ヒトプロテインＣの生物学的活性を保持し、ヒト血液中で実質的により長い半減期を有する。これらのポリペプチドでは野生型ヒトプロテインＣと比べて血管閉塞疾患、凝固性亢進状態、血栓症疾患、及び血栓症の素因となる疾病状態の処置において、より少ない回数の投与、及び/または、より少ない投与量が必要とされる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、1999年4月30日に出願した米国仮出願第60/131,801号に基づき、優
先権主張する。

【０００２】本発明は新規ポリヌクレオチド、それによりコードされるポリペプチド、並び
に、このようなポリヌクレオチド、及び、ポリペプチドの使用に関する。より具
体的には、本発明はセルピンによる不活性化に対して耐性なプロテインＣ誘導体
、その生産、及び、これらのプロテインＣ誘導体を含む医薬組成物に関する。

【０００３】プロテインＣはセリンプロテアーゼであり、凝固カスケード中の第Ｖa因子、
及び、第VIIIa因子を不活性化することにより恒常性の調節において役割を果た
す天然に存在する抗凝固物質である。ヒトプロテインＣはイン・ビボで、461アミ
ノ酸からなる単一のポリペプチドとして作られる。該ポリペプチドは、(1)42ア
ミノ酸のシグナル配列の切断、(2)リジン、及び、アルギニン残基(156位、及び
、157位)の切断による、2本鎖の不活性な前駆体、または、酵素前駆体の形成(15
5個のアミノ酸残基からなる軽鎖が、ジスルフィド架橋により262個のアミノ酸残
基からなる重鎖に結合)、(3)軽鎖の9個のグルタミン酸残基のビタミンＫ依存性
カルボキシル化による9個のγ-カルボキシグルタミン酸残基の生成、並びに、(4
)4部位での炭水化物結合(1つは軽鎖中、3つが重鎖中)を含む複数の、翻訳後修飾
を受ける。最終的に、重鎖のＮ末端のドデカペプチドを除去し、2本鎖酵素前駆
体よりも強い酵素活性を有する活性化プロテインＣ(ａＰＣ)を製造することによ
り、2本鎖酵素前駆体を活性化することができる。

【０００４】他のポリペプチドと共に、ａＰＣは血栓症を防ぐのに重要な抗凝血物質として
機能し、そのサイトカイン産生阻害(例えば、ＴＮＦ、及び、ＩＬ-１)による抗
炎症効果、並びに、血塊の溶解を容易にする前繊溶特性を発揮する。従って、ａ
ＰＣは抗凝固、抗炎症、及び、繊溶の機構を提供する。

【０００５】恒常性の調節におけるａＰＣの重要な役割は、ヘテロ接合性疾患、プロテイン
Ｃ耐性(例えば、よくある第Ｖ因子ライデン(Leiden)変異)、及び、未処置のホモ
接合プロテインＣ欠損の致命的表出での血栓症の割合の増加により例示される。
血漿由来、並びに、組換により産生されたａＰＣは、静脈性、及び、動脈性の血
栓症の両方の種々の動物モデルにおいて有効で、安全な抗血栓症剤であることが
示されてきた。

【０００６】また、以下の疾病、及び、症状でプロテインＣレベルが異常に低いことが示さ
れてきた：播種性血管内凝固(ＤＩＣ)[Fourrierら、Chest 101:816〜823(1992年
)]、敗血症[Gersonら、Pediatrics 91:418〜422(1993年)]、重篤な外傷/生命の
危険を伴う手術[Thomasら、Am.J.Surg. 158:491〜494(1989年)]、火傷[Loら、Bu rns 20:186〜187(1994年)]、成人呼吸障害症候群(ＡＲＤＳ)[Hasegawaら、Chest 105(1):268〜277(1994年)]、及び、移植[Gordonら、Bone Marrow Trans. 11:61
〜65(1993年)]。さらに、例えば、ヘパリン誘導性血小板減少(ＨＩＴ)[Phillips
ら、Annals of Pharmacotherapy 28:43〜45(1994年)]、鎌状血球症、または、サ
ラセミア[Karayalcinら、The American Journal of Pediatric Hematology/Onco logy 11(3):320〜323(1989年)]、ウイルス性出血熱[Lacyら、Advances in Pedia tric Infectious Disease 12:21〜53(1997年)]、血栓性血小板減少性紫斑病(Ｔ
ＴＰ)、及び、溶血尿毒症症候群(ＨＵＳ)[Moake、Seminars in Hematology 34(2
):83〜89(1997年)]等の血栓症性の異常を伴うか、または、血栓症の合併症を伴
う、ａＰＣによる処置が有用な多数の疾病が存在する。さらに、殺菌-浸透性増
強蛋白質(ＢＰＩ)と組合せたａＰＣは、敗血症の処置において有用であるかもし
れない[Fisherら、Crit.Care Med. 22(4):553〜558(1994年)]。

【０００７】最後に、血小板阻害は血栓症疾病の予防、及び、処置の両方で有効である。し
かしながら、アスピリン等の抗血小板薬(antiplatelet agent)の使用は出血の危
険を増大させ、薬剤の用量、及び、処置の存続期間が制限される。ａＰＣ及び抗
血小板薬の組合わせにより、ａＰＣ、及び、抗血小板薬の両方の投与量を減らせ
るという相乗作用が得られる。組合せ治療における薬剤の投与量の減少により、
抗凝固/抗血小板組合せ治療でしばしば観察される出血の増加等の副作用が減少
される。

【０００８】血漿からプロテインＣを得たり、組換ＤＮＡ技術によりプロテインＣ、ａＰＣ
、及び、プロテインＣ/ａＰＣポリペプチドを得る種々の方法が、当分野におい
て公知であり、記述されてきた。例えば、米国特許第4,775,624号、及び、第5,3
58,932号参照。組換ＤＮＡ技術によるａＰＣの製造方法における進歩にもかかわ
らず、ａＰＣ、及び、そのポリペプチドの製造は困難で、高価につき、そしてイ
ン・ビボにおいて比較的短い半減期を有する。

【０００９】短い半減期の理由は、ａＰＣと共有結合して不活性なセルピン/ａＰＣ複合体
を形成するセルピン(セリンプロテアーゼ阻害剤)として知られる分子により、ａ
ＰＣの血中レベルが制御されているためである。ａＰＣが結合し、セルピン内の
反応性部位のループを蛋白質分解により切断することによりセルピン/ａＰＣ複
合体は形成され、切断の際、セルピンはａＰＣを不可逆的に不活性化するような
構造変化を受ける。その後、セルピン/ａＰＣ複合体に対する肝臓の受容体を介
してセルピン/ａＰＣ複合体は血流から除去される。結果として、ａＰＣは酵素
前駆体と比べて相対的に短い半減期を有し、ａＰＣはおよそ20分であるのに対し
、ヒトプロテインＣ酵素前駆体はおよそ10時間である(Okajimaら、Thromb.Haemo st 63(1):48〜53(1990年))。

【００１０】基質と直接相互作用する残基(一般に、活性部位の中、または、近傍)における
セリンプロテアーゼのアミノ酸配列の変異はセリンプロテアーゼの特異性を変え
ることができ、適当な凝固因子に対する比活性の増加、及び、セルピンに対する
耐性の増加を潜在的に与える(Rezaie、J.Biol.Chem. 271(39):23807〜23814(199
6年)；Rezaie及びEsmon、Eur.J.Biochem. 242:477〜484(1996年))。従って、ａ
ＰＣの所望の生物学的活性(例えば、抗凝固、繊溶、及び、抗炎症活性)を維持し
つつ、セルピンによる不活性化に対し増幅された耐性を示すａＰＣポリペプチド
は、血漿半減期が増幅され、そのため、親化合物よりも効果的により強力で、治
療適用において実質的に減少された投与量、または、より少ない頻度での投与を
必要とする化合物を提供する。

【００１１】ａＰＣの最初の不活性化物質(inactivator)として働く2つのセルピンは、生理
的にはプロテインＣ阻害剤(ＰＣＩ)、及び、α₁-アンチトリプシン(α₁-ＡＴ)で
ある[Heebら、J.Biol.Chem. 263(24):11613〜6(1988年)]。ＰＣＩ、及び、α₁-
ＡＴの両方が播種性血管内凝固等の疾病状態におけるａＰＣの最初の生理学的な
不活性化物質であることが示され[Scullyら、Thromb.Haemost. 69(5):448〜53(1
993年)]、免疫応答を含む多数の疾病状態において、α₁-ＡＴレベルの上昇が観
察されてきた[Somayajuluら、J.Pathol.Microbiol. 39(4):271〜5(1996年)；Mor
ganら、Int.J.Biochem.Cell.Biol. 29(12):1501〜11(1997年)]。セルピンレベル
の上昇はａＰＣを不活性化し、プロテインＣレベルの減少に伴う凝固障害への罹
病性を増加させる結果となる。ヒトプロテインＣ分子を変異させることによりセ
ルピンへの耐性を高めることにより、ａＰＣの血漿半減期を増加させる試みが行
われてきた[例えば、米国特許第5,358,932号]。天然蛋白質を有意に変異させた
後、患者に投与した場合にしばしば免疫原性の増加が観察される。

【００１２】科学的な実験、及び、分析を通じ、発明者らはセルピン/ａＰＣ複合体の形成
に必須のセルピン、及び、プロテインＣ結合部位を同定した。発明者らは、ａＰ
Ｃ分子中の標的アミノ酸残基を変異させ、驚くべきことに、ａＰＣの天然基質(
例えば、第Ｖａ因子、及び、第VIIIａ因子)へのａＰＣポリペプチドの特異性を
維持しつつセルピン/ａＰＣ複合体(ａＰＣを不可逆的に不活性化する複合体)の
形成を阻害できることを発見した。特に、ａＰＣ活性部位内の3つの認識部位は
、基質認識配列と阻害剤認識部位との間で特徴的な相違を示す：Ｓ２、Ｓ３'、
及びＳ４'。発明者らは、以下のアミノ酸：配列番号7の194(Ｌｅｕ)位、195(Ａ
ｌａ)位、228(Ｌｅｕ)位、249(Ｔｙｒ)位、254(Ｔｈｒ)位、302(Ｔｙｒ)位、及
び、316(Ｐｈｅ)位の、のうちの1、または、それ以上を、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｔｈ
ｒ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、及び、Ｇｌｎ
から選択されるアミノ酸により置換する（但し、195位はＡｌａでは置換されず
、254位はＴｈｒで置換されない）ことによってセルピン/ヒトａＰＣポリペプチ
ド結合を阻害できることを発見した。

【００１３】よって、本発明は新規なプロテインＣ誘導体について記載する。これらのプロ
テインＣ誘導体は、野生型プロテインＣ(配列番号７)の重要な生物学的活性を保
持し、人血中で実質的により長い半減期を有する。従って、これらの化合物は、
例えばより少ない頻度での投与、及び/または、より少ない投与量、並びに、そ
のため治療提供での総コストの減少等の種々の利点を示す。さらに、これらの化
合物は、敗血症等のα₁-ＡＴレベルの明らかに上昇した疾病状態でも利点を有す
る。重要なことに、プロテインＣ誘導体の血漿半減期の増加は、単一のアミノ酸
置換によって達成することができ、これは、複数のアミノ酸置換を含む分子と比
べて免疫原性である可能性が低い[米国特許第5,358,932号；Hollyら、Biochemis try 33:1876〜1880(1994年)]。

【００１４】本発明は、194位、195位、228位、249位、254位、302位、または316位がＳｅ
ｒ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌ
ｙ、及びＧｌｎから選択されるアミノ酸で置換された（但し、195位のアミノ酸
はＡｌａではなく、そして、254位のアミノ酸はＴｈｒではない）配列番号１、
並びに、対応する配列番号２に記載のアミノ酸を含むプロテインＣ誘導体を提供
する。本発明はさらに、上述のプロテインＣ誘導体の活性形体を提供する。

【００１５】本発明はまた、特に配列番号８、９、及び１０を含む、先の段落のプロテイン
Ｃ誘導体をコードする組換ＤＮＡ分子を提供する。

【００１６】本発明の別の態様では、特に配列番号３、４、及び、５を含むこれらの同じプ
ロテインＣ誘導体、並びに、該プロテインＣ誘導体の活性形体の蛋白質配列を提
供する。

【００１７】本発明は、次のものを含む血管閉塞疾患、及び、凝固性亢進状態の処置方法を
含む：敗血症、播種性血管内凝固、電撃性紫斑病、重篤な外傷、生命の危険を伴
う手術、火傷、成人呼吸障害症候群、移植、深部静脈血栓症、ヘパリン誘導血小
板減少、鎌状血球症、サラセミア、ウイルス性出血熱、血栓性血小板減少性紫斑
病、及び、溶血尿毒症症候群。本発明はさらに、これら同じ疾病、及び、症状を
上で同定したプロテインＣ誘導体の活性形体を用いた処置を提供する。

【００１８】本発明の別な態様は、本発明のプロテインＣ誘導体を医薬的に有効な量で、殺
菌-浸透性増強蛋白質と組合せて、患者に投与することを含む敗血症の処置方法
である。

【００１９】本発明は、心筋梗塞、及び、不安定狭心症等の急性冠動脈症候群の処置方法を
含む。

【００２０】本発明はさらに、血栓症疾患の処置方法を含む。このような疾患には、これら
に限定されるわけではないが、脳卒中、血管形成術またはステント置換に続く急
な閉塞、及び、末梢血管手術による血栓症が含まれる。

【００２１】本発明はまた、本発明のプロテインＣ誘導体を含む医薬組成物を提供する。

【００２２】上述の適応症、及び、医薬組成物のためのヒトプロテインＣ誘導体は、好まし
くはＬ１９４Ｓ、Ｌ１９４Ｓ:Ｔ２５４Ｓ、及び、Ｌ１９４Ａ:Ｔ２５４Ｓから選
択される。

【００２３】新しく単離されたヒト蛋白質ペプチドを製造する方法、及び、態様もまた、本
発明の態様の1つである。

【００２４】最後に、本発明の態様の1つは、セルピン、ＰＣＩ、及び、α₁-ＡＴの阻害剤
認識配列Ｓ２、Ｓ３'、及び、Ｓ４'への結合を阻害することにより、本明細書中
で定義されるようなプロテインＣ欠損により生じる、または、欠損の結果である
疾病、並びに、症状の処置方法を含む。本発明のこの最終的な態様は、セルピン
、ＰＣＩ、及び、α₁-ＡＴの該阻害剤認識部位への結合を阻害するいずれのａＰ
Ｃ分子のいずれの、そして、あらゆる変異をも意図する。セルピンの特異的阻害
剤認識配列(Ｓ２、Ｓ３'及びＳ４')への結合の阻害は、本発明の本態様の重要な
寄与をするものである。

【００２５】図１．正常ヒト血漿とのインキュベーションの間のヒトａＰＣポリペプチドの
不活性化。残存活性は、実験開始時(時間=0)の活性を標準としたアミド分解(ami
dolytic)活性として測定した。誤差を示す縦線(error bar)は、三連実験の標準
誤差を示す。野生型プロテインＣ(ＷＴ、丸)、Ｔ２５４Ｓ(四角)、Ｌ１９４Ｓ(
三角)、及び、Ａ１９５Ｇ(ダイヤ)についてデータを示す。図２．正常ヒト血漿とのインキュベーションの間のヒトａＰＣポリペプチドの
不活性化。残存活性は、実験開始時(時間=0)の活性を標準としたアミド分解活性
として測定した。誤差を示す縦線(error bar)は、三連実験の標準誤差を示す。
野生型プロテインＣ(ＷＴ、丸)、Ｌ１９４Ａ/Ｔ２５４Ｓ(四角)、及び、Ｌ１９
４Ｓ/Ｔ２５４Ｓ(三角)についてデータを示す。図３．ヘパリン(10Ｕ/ｍＬ)を含む正常ヒト血漿によるヒトａＰＣポリペプチ
ドの不活性化。残存活性は、実験開始時(時間=0)の活性を標準としたアミド分解
活性として測定した。誤差を示す縦線(error bar)は、三連実験の標準誤差を示
す。野生型プロテインＣ(ＷＴ、丸)、Ｔ２５４Ｓ(四角)、Ｌ１９４Ｓ(三角)、及
び、Ａ１９５Ｇ(ダイヤ)についてデータを示す。図４．精製α₁-アンチトリプシンによるヒトａＰＣポリペプチドの不活性化。
残存活性は、実験開始時(時間=0)の活性を標準としたアミド分解活性として測定
した。誤差を示す縦線(error bar)は、三連実験の標準誤差を示す。野生型プロ
テインＣ(ＷＴ、丸)、Ｔ２５４Ｓ(四角)、Ｌ１９４Ｓ(三角)、及び、Ａ１９５Ｇ
(ダイヤ)についてデータを示す。図５．正常な意識のあるウサギ(Ｎ=3)での、0.1ｍｇ/ｋｇのボーラスIV用量に
続く血漿ａＰＣレベル。活性化プロテインＣレベルはimmunocapture分析を用い
て測定し、精製蛋白質のウサギ血漿中の希釈液から作成した標準曲線に対して比
較した。標準曲線は1〜250ｎｇ/ｍＬの範囲で、計算値は標準試料の10％以内で
あった。野生型(ＷＴ、丸)、Ｔ２５４Ｓ(四角)、Ｌ１９４Ｓ(三角)、及び、Ｌ１
９４Ｓ/Ｔ２５４Ｓ(ダイヤ)についてデータを示す。記入された値は、3匹の動物
についての平均誤差、及び、標準誤差である。

【００２６】本発明について、本明細書中に開示し、そして、特許請求される以下の用語に
ついて以下に定義する。

【００２７】抗血小板薬・・・血小板の凝集能を減少させる、単独、または、組合せた1、
若しくは、それ以上の薬剤。当分野において理解され、認識される薬剤には例え
ば、Remingtonの『The Science and Practice of Pharmacy第19版』第II巻第924
〜25頁(Mack Publishing Co.)（本明細書の一部を構成する)に記載のものが含ま
れる。このような薬剤には、これらに限定されるわけではないが、アスピリン(
ＡＳＡ)、クロピドグレル、ReoPro(登録商標)(abciximax)、ジピリダモール、チ
クロピジン、及び、第IIｂ因子/第IIIａ因子アンタゴニストが含まれる。

【００２８】ａＰＣ、または、活性化プロテインＣは組換ａＰＣを指す。ａＰＣは組換ヒト
ａＰＣを含み、好ましくは組換ヒトａＰＣであるがまた、プロテインＣの蛋白質
分解活性、アミド分解活性、エステル分解活性、及び、生物学的(抗凝固、抗炎
症、または、前繊溶)活性を有する他の種類を含み得る。

【００２９】プロテインＣ誘導体とは、野生型ヒトプロテインＣとは異なるが、活性化され
た場合に本質的な性質、即ち、蛋白質分解活性、アミド分解活性、エステル分解
活性、及び、生物学的(抗凝固、抗炎症、前繊溶)活性を保持する組換により産生
された本発明のプロテインＣを指す。本明細書中で用いるプロテインＣ誘導体の
定義はまた、上で同定したプロテインＣ誘導体の活性形体を含む。

【００３０】処置・・・疾病、症状若しくは疾患を排除、または、疾病、症状若しくは疾患
の徴候、若しくは、合併症の発症を防ぐために、予防的に疾病、症状若しくは疾
患と闘う目的で患者を扱うこと、及び、世話することを意味する。

【００３１】連続点滴・・・明記された期間、静脈へ溶液、または、懸濁液を実質的に連続
して導入し続けること。

【００３２】ボーラス注射・・・最長約120分の範囲の期間で、定義された量(ボラースと呼
ぶ)での薬物の注射。

【００３３】投与に適した・・・治療薬として与えるのに適した凍結乾燥した薬剤、または
、溶液。

【００３４】単位投与量形体・・・ヒト患者への単位投与量として適した、物理的に分離さ
れた単位であって、適当な医薬的賦形剤と共に、所望の医薬効果を奏するよう計
算された予め決められた量の活性材料を各単位は含む。

【００３５】凝固性亢進状態・・・播種性血管内凝固、前血栓症症状、凝固の活性化、また
は、ａＰＣ等の凝固因子の先天的、若しくは、後天的欠損に伴う過度の凝固性。

【００３６】酵素前駆体・・・本明細書中のプロテインＣ酵素前駆体は、1本鎖、または、2
本鎖のプロテインＣの分泌された、不活性形体を指す。

【００３７】医薬的に有効な量・・・医薬化合物の治療的に有効な量。本発明で投与される
化合物の特定の用量は当然、投与される化合物、処置する特定の症状、患者の特
性、及び、同様の考慮を含む症例を取り巻く特定の状況を評価する、かかりつけ
の医師により決定される。

【００３８】急性冠動脈症候群・・・冠動脈虚血、及び/または、心筋梗塞の原因となる冠
動脈血小板破裂(coronary plaque rupture)、重合(superimposed)冠血栓症、及
び、危険に曝された(jeopardized)冠血流量により合併された冠動脈アテローム
性動脈硬化症の臨床的な現れ。急性冠動脈症候群の範囲には、不安定狭心症、非
Ｑ波(即ち、非-ＳＴ部分上昇)心筋梗塞、及び、Ｑ波(即ち、ＳＴ部分上昇)心筋
梗塞が含まれる。

【００３９】血栓症疾患・・・血管中の血塊の形成、若しくは、存在に関連した、または、
作用される疾患。このような疾患には、これらに限定されるわけではないが、脳
卒中、血管形成術、または、ステント置換に続く急な閉塞、及び、末梢血管手術
による血栓症が含まれる。

【００４０】電撃性紫斑病・・・細菌性敗血症、ウイルス感染、細菌感染、または、原生動
物感染に伴う斑状出血皮膚病変、発熱、低血圧。通常、播種性血管内凝固が存在
する。

【００４１】セルピン・・・典型的には超可変性(highly variable)、及び、可動性(mobile
)ペプチドループ中の活性部位により阻害活性が付与されるセリンプロテアーゼ
阻害剤である、構造的に関連する蛋白質群のいずれかであり、これらに限定され
るわけではないが、プロテインＣ阻害剤(ＰＣＩ)、及び、α₁-アンチトリプシン
(α₁-ＡＴ)が含まれる。

【００４２】阻害剤認識配列Ｓ２：ＰＣＩ、またはα₁-ＡＴの切断部位の第2残基Ｎ末端。

【００４３】阻害剤認識配列Ｓ３'：ＰＣＩ、またはα₁-ＡＴの切断部位の第3残基Ｃ末端。

【００４４】阻害剤認識配列Ｓ４'：ＰＣＩ、またはα₁-ＡＴの切断部位の第4残基Ｃ末端。

【００４５】野生型プロテインＣ・・・プロテインＣの天然、若しくは実験室バリアント、
または、ポリペプチド形体に対して天然のヒト集団で優勢なプロテインＣの型。

【００４６】殺菌-浸透性増強蛋白質・・・天然、及び、組換生産された殺菌-浸透性増強(
ＢＰＩ)蛋白質；ＢＰＩ蛋白質の天然、合成、及び、組換の生物学的に活性なポ
リペプチド断片；雑種融合体蛋白質、及び、ダイマーを含む、ＢＰＩ蛋白質、ま
たは、その断片の生物学的に活性なポリペプチドバリアント；システイン置換類
似体を含むＢＰＩ蛋白質、または、その断片、または、そのバリアントの生物学
的に活性なバリアント類似体；並びに、ＢＰＩ誘導ペプチドが含まれる。ヒトＢ
ＰＩの完全長アミノ酸配列、及び、ＢＰＩをコードするＤＮＡのヌクレオチド配
列は、GrayらのJ.Biol.Chem. 264:9505(1989年)に記載される。ＢＰＩホロ蛋白
質、及び、ＢＰＩの断片を含むＢＰＩ蛋白質をコードする組換遺伝子、並びに、
その発現方法は、米国特許第5,198,541号に開示される。該特許文献は本明細書
の一部を構成する。

【００４７】アミノ酸の省略形が米国特許商標庁により、37Ｃ.Ｆ.Ｒ.1.822(ｄ)(1)(1998)
に示されるように受け入れられている。

【００４８】ａＰＣ、または、単離されたヒトａＰＣポリペプチドの活性形体は、組換ヒト
プロテインＣ酵素前駆体、若しくは組換プロテインＣ誘導体酵素前駆体をイン・
ヴィトロで活性化するか、若しくは、プロテインＣの活性形体の直接分泌により
製造することができる。活性化する手段は厳密なものではなく、本発明の工程の
態様には活性化のいずれかの、そしてあらゆる手段が含まれる。プロテインＣ誘
導体は例えば、ヒト腎２９３細胞からの酵素前駆体からの分泌を含む真核細胞、
トランスジェニック動物、または、トランスジェニック植物で産生させることが
でき、その後、当業者に公知の方法により精製、及び、活性化する。

【００４９】本発明により、セルピンに対して耐性が増加され、結果として血漿半減期の延
長された、その活性形体を含むプロテインＣ誘導体が提供される。特定のプロテ
インＣ誘導体にはＬ１９４Ｓ、Ｌ１９４Ｓ:Ｔ２５４Ｓ、及び、Ｌ１９４Ａ:Ｔ２
５４Ｓ、並びに、その活性形体が含まれる。

【００５０】プロテインＣ誘導体Ｌ１９４Ｓは好ましくは、194位に通常この位置でみられ
るロイシン残基ではなくセリン残基を含む。当業者であれば、194位におけるＳ
ｅｒによる置換に加え、他のアミノ酸による置換が、得られたポリペプチド分子
に、増幅されたセルピンに対する耐性を付与するかもしれないことを認識するで
あろう。このようなアミノ酸置換の例にはＡｌａ、Ｔｈｒ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａ
ｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、及び、ＧＬｎが含まれる。プロテインＣ誘導体
Ｌ１９４Ｓの活性形体は、血漿中での延長された半減期(図１)、及び、例えばα ₁ -アンチトリプシン(α₁-ＡＴ)であるセルピンに対する増幅された耐性を示す(
図４)。

【００５１】プロテインＣ誘導体Ｌ１９４Ｓ:Ｔ２５４Ｓは好ましくは、194位に通常この部
位で見られるロイシン残基ではなくセリン残基を含み、254位に通常この部位に
みられるスレオニン残基ではなくセリン残基を含む。当業者には、194位、及び
、254位におけるセリンによる置換に加えて、他のアミノ酸による置換が、得ら
れたポリペプチド分子に、セルピンに対する増幅された耐性を付与するかもしれ
ないことが明らかである。このようなアミノ酸置換にはＡｌａ、Ｔｈｒ、Ｈｉｓ
、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、及び、Ｇｌｙが含まれ、
ここで254位はＴｈｒでは置換されていない。ヒトプロテインＣ誘導体Ｌ１９４
Ｓ:Ｔ２５４Ｓの活性形体は、野生型プロテインＣと比べて正常ヒト血漿中で延
長された半減期を示す(図２)。

【００５２】プロテインＣ誘導体Ｌ１９４Ａ:Ｔ２５４Ｓは好ましくは、194位に通常この部
位に存在するロイシン残基ではなくアラニン残基を、そして、254位に通常この
部位に存在するスレオニン残基ではなくロイシン残基を含む。当業者には、194
位、及び、254位におけるセリンによる置換に加えて、他のアミノ酸による置換
が、得られたポリペプチド分子に、セルピンに対する増幅された耐性を付与する
かもしれないことが明らかである。このようなアミノ酸置換にはＡｌａ、Ｔｈｒ
、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、及び、Ｇｌｙが
含まれ、ここで254位はＴｈｒでは置換されていない。ヒトプロテインＣ誘導体
Ｌ１９４Ｓ:Ｔ２５４Ｓの活性形体は、野生型プロテインＣと比べて正常ヒト血
漿中で延長された半減期を示す(図２)。

【００５３】本発明のさらなる態様には、プロテインＣ誘導体：Ｌ１９４Ｔ、Ｌ１９４Ａ、
Ａ１９５Ｇ、Ｌ２２８Ｑ、Ｔ２５４Ｓ、Ｆ３１６Ｎ、Ｙ２４９Ｅ、及び、Ｙ３０
２Ｑ、並びに、セルピンに対する耐性が増幅されたその活性形体が含まれる。

【００５４】プロテインＣ誘導体Ｌ１９４Ｔ、または、Ｌ１９４Ａは好ましくは、194位に
通常この部位にみられるロイシン残基ではなくスレオニン残基、若しくは、アラ
ニン残基を含む。当業者であれば、194位におけるＳｅｒによる置換に加えて、
他のアミノ酸による置換が、得られたポリペプチド分子にセルピンに対する増幅
された耐性を付与するかもしれないことを認識するであろう。このようなアミノ
酸置換にはＨｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、及び、Ｇｌｎが
含まれる。

【００５５】プロテインＣ誘導体Ａ１９５Ｇは好ましくは、195位に通常この部位でみられ
るアラニン残基ではなくグリシン残基を含む。当業者であれば、195位における
Ｇｌｙによる置換に加えて、他のアミノ酸による置換が、得られたポリペプチド
分子に、セルピンに対する増加された耐性を付与するかもしれないことを認識す
るであろう。このようなアミノ酸置換にはＳｅｒ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、Ｈｉｓ、Ｌ
ｙｓ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、及び、Ｇｌｎが含まれる。プロテイン
Ｃ誘導体Ａ１９５Ｇの活性形体は、血漿中での延長された半減期(図１)、及び、
例えばα₁-アンチトリプシン(α₁-ＡＴ)であるセルピンに対する増幅された耐性
を示す(図４)。

【００５６】プロテインＣ誘導体Ｌ２２８Ｑは好ましくは、228位に通常この部位でみられ
るロイシン残基ではなくグルタミン残基を含む。当業者であれば、228位におけ
るＧｌｎによる置換に加えて、他のアミノ酸による置換が、得られたポリペプチ
ド分子に、セルピンに対する増幅された耐性を付与するかもしれないことを認識
するであろう。このようなアミノ酸置換にはＳｅｒ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、Ｈｉｓ、
Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、及び、Ｇｌｙが含まれる。

【００５７】プロテインＣ誘導体Ｔ２５４Ｓは好ましくは、254位に通常この部位でみられ
るスレオニン残基ではなくセリン残基を含む。当業者であれば、254位における
Ｓｅｒによる置換に加えて、他のアミノ酸による置換が、得られたポリペプチド
分子に、セルピンに対する増幅された耐性を付与するかもしれないことを認識す
るであろう。このようなアミノ酸置換にはＡｌａ、Ｔｈｒ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａ
ｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、及び、Ｇｌｙが含まれ、ここで254位
はＴｈｒにより置換されてはいない。プロテインＣ誘導体Ｔ２５４Ｓの活性形体
は、血漿中での延長された半減期(図１)、及び、例えばα₁-アンチトリプシン(
α₁-ＡＴ)であるセルピンに対する増幅された耐性を示す(図４)。

【００５８】プロテインＣ誘導体Ｆ３１６Ｎは好ましくは、316位に通常この部位でみられ
るフェニルアラニン残基ではなくアスパラギン残基を含む。当業者であれば、31
6位におけるＡｓｎによる置換に加えて、他のアミノ酸による置換が得られたポ
リペプチド分子に、セルピンに対する増幅された耐性を付与するかもしれないこ
とを認識するであろう。このようなアミノ酸置換にはＳｅｒ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、
Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、及び、Ｇｌｙが含まれる。

【００５９】プロテインＣ誘導体Ｙ２４９Ｅは好ましくは、249位に通常この部位でみられ
るチロシン残基ではなくグルタミン酸残基を含む。別の追加のポリペプチドは、
249位にチロシンではなくＡｓｐを含む。当業者であれば、249位におけるＧｌｕ
、及び、Ａｓｐによる置換に加えて、他のアミノ酸による置換が得られたポリペ
プチド分子に、セルピンに対する増幅された耐性を付与するかもしれないことを
認識するであろう。このようなアミノ酸置換にはＳｅｒ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、Ｈｉ
ｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、及び、Ｇｌｙが含まれる。

【００６０】プロテインＣ誘導体Ｙ３０２Ｑは好ましくは、302位に通常この部位でみられ
るチロシン残基ではなくグルタミン残基を含む。別の追加のポリペプチドは249
位にチロシン残基ではなくＧｌｕを含む。当業者であれば、249位におけるＧｌ
ｕ、及び、Ｇｌｎによる置換に加えて、他のアミノ酸による置換が得られたポリ
ペプチド分子に、セルピンに対する増幅された耐性を付与するかもしれないこと
を認識するであろう。このようなアミノ酸置換にはＳｅｒ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、Ｈ
ｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、及び、Ｇｌｙが含まれる。

【００６１】さらに、プロテインＣ誘導体は、機能的に同等なポリペプチド分子に相当する
蛋白質を含み得る。このような同等なプロテインＣ誘導体は、上述のプロテイン
Ｃポリペプチド遺伝子配列によりコードされるアミノ酸配列の欠失、付加、また
は、置換を含んでいてもよいが、それによってサイレントな変化(silent change
)が起こり、従って、機能的に同等なプロテインＣ誘導体産物が製造される。含
まれる残基の極性、荷電、溶解性、疎水性、親水性、及び/または、両親媒性の
性質の類似性に基づきアミノ酸置換することができる。

【００６２】従って、本発明のポリペプチドには、少なくとも配列番号３、４、若しくは、
５と等しいアミノ酸配列を有するポリペプチド、または、対応する配列番号３、
４、若しくは５の断片と少なくとも90％相同な断片を含む。好ましくは、これら
全てのポリペプチドは、ヒトａＰＣの生物学的活性を保持する。好ましいポリペ
プチドは、配列番号３、４、または、５と保存的な(conservative)置換、即ち、
類似の特性の残基による置換で異なるものである。典型的な置換は、Ａｌａ、Ｖ
ａｌ、Ｌｅｕ、及び、Ｉｌｅの間での置換、Ｓｅｒ及びＴｈｒの間での置換、Ａ
ｓｐ及びＧｌｕの酸性残基の間での置換、Ａｓｎ及びＧｌｎの間での置換、並び
に、Ｌｙｓ、及び、Ａｒｇの塩基性残基、または、芳香族残基Ｐｈｅ、及び、Ｔ
ｙｒの間での置換である。特に好ましいのは、5〜10個、1〜5個、または、1〜2
個のアミノ酸がいずれかの組合せで置換、削除、または、付加されたポリペプチ
ドである。

【００６３】本発明はまた、プロテインＣ誘導体製造用のＤＮＡ化合物を提供する。これら
のＤＮＡ化合物は、ヒトプロテインＣ酵素前駆体、または、プロテインＣ誘導体
酵素前駆体のプレプロペプチド配列に隣接して下流、そして、同じ翻訳リーディ
ングフレーム内に、ヒトプロテインＣ酵素前駆体、または、プロテインＣ誘導体
酵素前駆体の軽鎖のコード配列を含む。ＤＮＡ配列は好ましくは、プロテインＣ
分子の成熟化の間にプロセシングされるＬｙｓ-Ａｒｇジペプチド、活性化ペプ
チド、及び、プロテインＣ誘導体の重鎖をコードする。

【００６４】当業者は、遺伝子暗号の縮合により、種々のＤＮＡ化合物が上述のポリペプチ
ドをコードすることができることを認識するであろう。米国特許第4,775,624号
には、ヒトプロテインＣ分子の野生型形体が開示される。該特許に教示される全
内容は本明細書の一部を構成する。ＤＮＡ配列中でのどのような変化が本明細書
中に開示した正確なポリペプチドをコードし得るかを、当業者は容易に決定する
ことができる。本発明は開示される特定のＤＮＡ配列に限定されない。従って、
以下に記載の構築、及び、好ましいＤＮＡ化合物についての付随の実施例は単な
る例示であって、本発明の範囲を限定することを意図したものではない。

【００６５】本発明の全てのＤＮＡ化合物を、ヒトプロテインＣ酵素前駆体内の特定の部位
を変異させる部位特異的突然変異誘発を用いて製造した。これらの特定部位で重
要な接触を形成する残基の同定に用いた方法を実施例１に記載する。

【００６６】プロテインＣ誘導体は、真核セルライン、トランスジェニック動物、または、
トランスジェニック植物を用いて当分野において周知の技術により製造すること
ができる。当業者は、適当な宿主真核セルラインには、これらに限定されるわけ
ではないが、ＨｅｐＧ２、ＬＬＣ-ＭＫ₂、ＣＨＯ-Ｋ１、２９３、または、ＡＶ
１２細胞等の米国特許第5,681,932号に記載のものが含まれることを容易に理解
するであろう。該特許は本明細書の一部を形成する。さらに、組換蛋白質のトラ
ンスジェニック産生の例は、米国特許第5,589,604号、及び、第5,650,503号に記
載される。これらの特許文献は本明細書の一部を構成する。

【００６７】当業者は所望のＤＮＡ配列の真核宿主細胞での発現において、多様なベクター
が有用であることを認識する。哺乳動物細胞での発現に適したベクターには、こ
れらに限定されるわけではないがｐＧＴ-ｈ、ｐＧＴ-ｄ、ｐＣＤＮＡ3.0、ｐＣ
ＤＮＡ3.1、ｐＣＤＮＡ3.1＋Ｚｅｏ、及びｐＣＤＮＡ3.1＋Ｈｙｇｒｏ(Invitiro
gen)、並びに、ｐＩＲＥＳ/Ｈｙｇｒｏ、及び、ｐＩＲＥＳ/ｎｅｏ(Clonetech)
が含まれる。本発明で好ましいベクターは、実施例２に記載のｐＩＧ３である。

【００６８】本発明の方法で完全に活性で、作動可能なように、これらのいずれかの方法に
より製造されるプロテインＣ誘導体は、9個のγカルボキシグルタミン酸の付加
、エリスロ-β-ヒドロキシ-Ａｓｐの付加(βヒドロキシ化)、4個のＡｓｎ結合オ
リゴ糖類の付加(糖鎖付加(glycosilation))、及びリーダー配列(42アミノ酸残基
)の除去等の翻訳後修飾を受けなければならない。このような翻訳後修飾なしで
はプロテインＣポリペプチドは完全に機能しないか、または、非機能的である。

【００６９】ヒトプロテインＣ、及び、プロテインＣ誘導体の酵素前駆体形体の活性化ヒト
プロテインＣ、及び活性化プロテインＣ誘導体への活性化方法は古く、当分野に
おいて周知である。ヒトプロテインＣはトロンビン単独、トロンビン/トロンボ
モジュリン複合体、ＲＶＶ-Ｘ、ラッセルクサリヘビ毒由来のプロテアーゼ、脾
臓トリプシン、または、他の蛋白質分解性酵素により活性化することができる。

【００７０】本発明の組換プロテインＣ誘導体は、敗血症、播種性血管内凝固、重篤な外傷
、生命の危険を伴う手術、火傷、成人呼吸障害症候群、移植、深部静脈血栓症、
ヘパリン誘導性血小板減少、鎌状血球症、サラセミア、ウイルス性出血熱、血栓
性血小板減少性紫斑病、及び、溶血尿毒症症候群に伴う血管閉塞疾患、または、
凝固性亢進状態の処置に有用である。別の態様では、本発明の組換プロテインＣ
誘導体は、殺菌-浸透性増強蛋白質と組合せて、敗血症の処置において有用であ
る。本発明のさらに別の態様では、本発明の活性化プロテインＣ誘導体は、血栓
症疾病等の種々の疾患を処置、または予防するために抗血小板薬と組合される。

【００７１】本発明の方法はさらに、野生型ａＰＣと比べてセルピンによる不活性化に対し
耐性を有するヒトプロテインＣ誘導体での心筋梗塞を含む急性冠動脈症候群、及
び、不安定狭心症の処置に用立つ。

【００７２】本発明の組換ヒトプロテインＣ誘導体はまた脳卒中、血管形成術、若しくは、
ステント置換に続く急な閉塞、及び、末梢血管手術による血栓症等の血栓症疾患
の処置で有用である。

【００７３】プロテインＣ誘導体は活性剤としてａＰＣポリペプチドを含み、及び、医薬的
に許容される固体、または、担体を含む医薬組成物を製造する公知の方法により
製剤され得る。例えば、所望の製剤はショ糖等の増量剤、塩化ナトリウム等の塩
、クエン酸ナトリウム等の緩衝液、及び、活性化プロテインＣ誘導体を含む高度
に精製された安定な凍結乾燥産物である。好ましい安定な凍結乾燥された製剤は
、2.5ｍｇ/ｍｌの活性化プロテインＣポリペプチド、15ｍｇ/ｍｌのショ糖、20
ｍｇ/ｍｌのＮａＣｌ、及び、クエン酸緩衝液を含み、該製剤はｐＨ6.0である。
その他の安定な凍結乾燥された製剤は、5.0ｍｇ/ｍｌの活性化プロテインＣポリ
ペプチド、30ｍｇ/ｍｌのショ糖、38ｍｇ/ｍｌのＮａＣｌ、及び、クエン酸緩衝
液を含み、該製剤はｐＨ6.0である。

【００７４】ヒトａＰＣポリペプチドは、有効な形体での血流への運搬を確実にするために
、1〜240時間の範囲の連続的な注入により適当な用量を注射して非経口投与され
るであろう。より好ましくは、ヒトａＰＣは1〜192時間の範囲の連続的な注入に
より投与される。より一層好ましくは、ヒトａＰＣは1〜144時間の範囲の連続的
な注入により投与される。さらに一層好ましくは、ａＰＣポリペプチドは1〜96
時間の範囲の連続的な注入により投与される。

【００７５】投与されるヒトａＰＣポリペプチドの量は、約0.01μｇ/ｋｇ/時間〜約50μｇ
/ｋｇ/時間であろう。より好ましくは、投与されるヒトａＰＣポリペプチドの量
は約0.1μｇ/ｋｇ/時間〜約25μｇ/ｋｇ/時間である。より一層好ましくは、投
与されるヒトａＰＣポリペプチドの量は約1μｇ/ｋｇ/時間〜約15μｇ/ｋｇ/時
間である。投与されるヒトａＰＣポリペプチドの最も好ましい量は、約5μｇ/ｋ
ｇ/時間〜約10μｇ/ｋｇ/時間である。

【００７６】代りに、ヒトａＰＣポリペプチドは、各時間当りの適当な用量の一部(1/3〜1/
2)を、約5分〜約120分の範囲のボーラス注射として注射し、適当な用量を最長24
0時間までで連続的に注入することにより投与されるであろう。

【００７７】別な態様では、ヒトａＰＣ誘導体は、0.01ｍｇ/ｋｇ/日〜約1.0ｍｇ/ｋｇ/日
の用量を、Ｂ.Ｉ.Ｄ.(日に2回)で、1〜10日にわたって注射することにより投与
されるであろう。より好ましくは、ヒトａＰＣ誘導体は、Ｂ.Ｉ.Ｄ.で3日間投与
されるであろう。

【００７８】さらに別の態様では、よりゆっくりとした血流への放出を確実にするため、ヒ
トａＰＣポリペプチドを皮下投与するであろう。皮下製剤のための処方は、この
ような医薬組成物を製造するのに公知の方法を用いて行われるであろう。

【００７９】本発明のさらなる態様は、実施例１に記載されるように、本明細書中のプロテ
インＣ欠損により引き起こされる、または、その結果である疾病、及び、症状を
ＰＣＩ、及び、α₁-ＡＴ等のセルピンの阻害剤認識配列Ｓ２、Ｓ３'、及び、Ｓ
４'への結合を阻害することにより処置することを含む。本発明のこの最終的な
態様は、セルピンＰＣＩ、及び、α₁-ＡＴの該阻害剤認識配列への結合の阻害に
つながるいずれのａＰＣ分子のいずれの、そして、あらゆる改変を意図する。

【００８０】本発明のヒトａＰＣポリペプチドは、野生型ヒトａＰＣと実質的に同じ型の生
物学的活性を有し、実質的により長いヒト血漿中の半減期を有する。従って、こ
れらの化合物は、より少ない頻度での投与、及び/または、より少ない投与量を
必要とするであろう。さらに、これらの化合物は、敗血症などの明らかに上昇し
たα₁-ＡＴレベルでの疾病状態に有利な効果を奏する。最終的、より多数の置換
と比べて免疫原性でとなる可能性が低い1、若しくは、2個のアミノ酸置換によっ
て、ヒトａＰＣポリペプチド血漿半減期でのより優れた増幅が達成され得る。

【００８１】以下の実施例は、単に、さらに本発明を例示するために示す。本発明の範囲が
、以下の実施例のみであると解釈されるべきではない。

【００８２】実施例１部位特異的突然変異誘導セルピンによる不活性化を減少させ、結果として血漿半減期を延長させるヒト
プロテインＣ分子内の特定部位の変異における、部位特異的突然変異誘発の使用
について記載する。2つの基本的なａＰＣ阻害剤α₁-ＡＴ、及び、ＰＣＩ中の認
識配列は、これらの配列と相互作用するａＰＣ中の残基を変異させるのに活用す
ることができる幾つかの相違を示す。表１には、ａＰＣにより認識される配列を
示す。イタリックで示す2つの残基の間が切断部位である。下線部は、特異的な
サブサイトＳ２、Ｓ３'、及び、Ｓ４'を占める残基である。

【００８３】一般に、第Ｖａ因子中の認識される部位は、第VIIIａ因子、または、阻害剤の
どちらかの部位と異なっているため、より重要な第Ｖａ凝固因子をより特異的に
切断すると同時に、ａＰＣのセルピンによる阻害の可能性を減少させるように、
ａＰＣの活性部位を処理することが可能である。

【表１】

【００８４】特に、活性部位中の3つの認識部位は、基質認識配列と阻害剤認識配列との間
で特徴的な相違を示す：Ｓ２(切断部位の第2残基Ｎ末端)、Ｓ３'部位、及び、Ｓ
４'。第Ｖａ因子配列のＳ２部位は、疎水性残基をこの位置に有するＰＣＩ、及
びα₁-ＡＴとは違い、主としての極性残基に占められている。全ての基質配列で
Ｓ３'部位は極性側鎖に占められているが、α₁-ＡＴでは注目に値することに疎
水性側鎖で占められている。全3個の第Ｖａ配列でＳ４'部位は荷電残基で占めら
れているが、第VIIIａ因子、及び阻害剤配列では疎水性残基で占められている。

【００８５】ＰＰＡＣＫ-阻害ａＰＣの結晶構造[Matherら、EMBO J. 15(24):6822〜6831(19
96年)]、及び、Hirulog3-阻害トロンビン[Quiら、Biochemistry 31(47):11689〜
97(1992年)]に基づき、2つのａＰＣ基質モデル構造を構築し、ＣＨＡＲＭｍプロ
トコルを用いてエネルギーを最小限とした：（１）配列は第Ｖａ因子Ｒ５０６開裂配列を表す。（２）ＭｅｔがＡｒｇで置換されたα₁-ＡＴの認識配列(ａＰＣに対して非
常に高い親和性を示す、α₁-ＡＴのポリペプチドに相当)。

【００８６】これらのモデルは、これらの3つの特異的部位で重要な接触を行う残基の同定
を可能にした。活性部位内で特異的な接触を形成し得る残基、並びに、増幅され
た特異性、及び/または、活性を提供することが期待される置換について、表２
にまとめる。一般に、ヒトａＰＣポリペプチドの特異性を2つの主な生理的阻害
剤の認識からかけ離れたものとするように、そして、ヒトａＰＣポリペプチドの
蛋白質分解活性を潜在的に増幅するように、環境変化を反映するように、活性部
位の特異的なサブサイト内で接触を形成する残基の変異は設計されている。

【表２】特異性の改変のために構築した変異

【００８７】実施例２プロテインＣポリペプチドの構築、及び、産生標準的な方法に従って、ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)を用いプロテインＣ誘
導体を構築した。野生型のコード配列の源はプラスミドｐＬＰＣ[Bio/Technolog y 5:1189〜1192(1987年)]であった。使用したユニバーサル(universal)ＰＣＲプ
ライマーには：サブクローニングに用いるＸｂａＩ制限部位(下線)、コザックの
コンセンサス配列(小文字)[Kozak、J.Cell.Biol. 108(2):229〜41(1989年)]、及
び、プロテインＣのコード領域の５'末端をコードするPC001b;5'-GCGATGTCTAGAc
cacc[ATG]TGGCAGCTCACAAGCCTCCTGC-3'：ヒトプロテインＣのコード領域の３'末
端をコードし、サブクローニングのためのＢｃｌＩ制限部位(下線)を含むPC002E
;5'-CAGGGATGATCACTAAGGTGCCCAGCTCTTCTGG-3'が含まれる。突然変異誘発ＰＣＲ
プライマー(各々、センス、及び、アンチセンス方向)には：194位(下線)のＬｅ
ｕ(CTG)からＳｅｒ(TCC)への変異をコードするPC194SF,5'-CTCAAAGAAGAAGTCCGCC
TGCGGGGCAGTGC-3'、及び、PC194SR,5'-GCACTGCCCCGCAGGCGGACTTCTTCTTTGAG-3'；
Ａｌａ(GCC)からＧｌｙ(GGG)への変異をコードするPCA195GF,5'-GAAGAAGCTGGGGT
GCGGGGCAGTGC-3'、及び、PCA195GR,5'-GCACTGCCCCGCACCCCAGCTTCTTC-3'；254位(
下線部)のＴｈｒ(ACC)からＳｅｒ(AGC)への変異をコードするPCT254SF,5'-GCAAG
AGCACCAGCGACAATGAC-ATCGC-3'、及び、PCT254SR,5'-GCGATGTCATTGTCGTCGGTGCTCT
TGC-3'が含まれる。ＰＣＲの最初の回はプロテインＣの2つの断片を増幅するの
に用い、5'断片はPC001b、及び、アンチセンス突然変異誘発プライマーを用いて
製造し、そして、3'断片はPC002e、及び、センス突然変異誘発プライマーを用い
て製造した。得られた増幅産物は標準的な手法により精製した。これらの断片を
一緒にした後、PC001b、及び、PC002eを用いた第2周目のＰＣＲの鋳型として用
いた。最終ＰＣＲ産物をＸｂａＩ、及び、ＢｃｌＩで消化し、同様に消化した発
現ベクターｐＩＧ３中にサブクローニングした。同様に、2つのユニバーサルプ
ライマー、及び、鋳型としてプラスミドｐＬＰＣを用いＰＣＲにより野生型構築
物を製造し、続いてｐＩＧ３中にサブクローニングした。コード鎖、及び、非コ
ード鎖の両方をＤＮＡシークエンシングしてバリアントを確認した。完全な発現
プラスミドは、ｐＩＧ３-ＨＰＣ(野生型プロテインＣ)、ｐＧＨ４１(Ｔ２５４Ｓ
)、ｐＧＨ５１(Ａ１９５Ｇ)、及び、ｐＧＨ９４(Ｌ１９４Ｓ)と名付けた。

【００８８】ｐＩＧ３ベクターは、「内部リボソーム挿入部位」(ＩＲＥＳ)[Jacksonら、Tr ends Biochem.Sci. 15(12):447〜83(1990年)]、及び、グリーン蛍光蛋白質(ＧＦ
Ｐ)[Cormackら、Gene 173:33〜38(1996年)]遺伝子の哺乳動物発現ベクターｐＧ
ＴＤ[Gerlitzら、Biochem.J. 295(Pt 1):131〜40(1993年)]に挿入することによ
り製造した。所望のｃＤＮＡをｐＩＧ３のマルチクローニングサイトにクローン
化すると、重シストロン(bicistronic)ｍＲＮＡ(5'-ｃＤＮＡ-ＩＲＥＳ-ＧＦＰ-
3')をＧＢＭＴプロモーター[Berg、Nucleic Acids Res. 20(20):5485〜6(1992年
]が発現させる。第1のシストロンの効率的な翻訳は、ｍＲＮＡの5'-メチル化キ
ャップ構造へのリボソームサブユニットの標準的な集合により開始されるのに対
し、通常は効率の悪い第2のシストロンの翻訳は、ｍＲＮＡ上の内部リボソーム
集合を可能にするＩＲＥＳ配列により行われる。別々の蛋白質として翻訳される
ｃＤＮＡ、及び、レポーターを単一のｍＲＮＡとしての結合することにより、蛍
光強度に基づいて高産生クローンのスクリーニングが可能になる。発現ベクター
はまた、プラスミドの大腸菌中での維持のためにアンピシリン耐性カセットを含
み、哺乳動物組織発現での選択、及び、増幅目的のための適切な発現配列を備え
たマウスＤＨＦＲ遺伝子を含む。

【００８９】アデノウイルスで形質転換したシリアンハムスターＡＶ１２-６６４セルライ
ンを、10％ウシ胎児血清、50μｇ/ｍＬゲンタマイシン、200μｇ/ｍＬ Genetici
n(Ｇ４１８)、及び、10μｇ/ｍＬビタミンＫ１を補ったダルベッコ変法イーグル
培地中で生育させた。トランスフェクションの1日前に、約10⁵細胞/25ｃｍ²の密
度でプレートに播いた。ＦｓｐＩにより線状化したプラスミドを、リン酸カルシ
ウム手法(ProFection,Gibco BRL-Life Technologies)、または、ＦｕＧｅｎｅ-
６(Boehringer Mannheim)のどちらかを用いて、製造業者の指示に従ってトラン
スフェクトした。トランスフェクションからおよそ48時間後、選択のため、培地
を250ｎＭメトトレキサートを含む培地で置換した。メトトレキサートに耐性の
コロニーを薬剤選択した後、2〜3週間プールし、増殖させた。プールをＧＦＰ蛍
光強度に基づいて蛍光標示式細胞分取器にかけ(Cormack,1996)、蛍光細胞の5％
の最も高い強度のものを確保し、増殖させた。精製用の材料を得るため、1μｇ/
ｍＬヒトインシュリン、1μｇ/ｍＬヒトトランスフェリン、及び、10μｇ/ｍＬ
ビタミンＫ１を含むダルベッコ変法イーグル培地、並びに、ハムのＦ-１２培地
の修飾混合物(1:3)上で組換細胞を生育させた。調節培地を集め、最終濃度5ｍＭ
ベンズアミジン、及び、5ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ8.0に調整し、記載[Yanら、Bio/T echnology 8:655〜661(1990年)]されるように陰イオン交換クロマトグラフィー
により精製した。精製した蛋白質を、緩衝液Ａ(150ｍＭＮａＣｌ、20ｍＭＴｒ
ｉｓ-ＨＣｌ、ｐＨ7.4)を用いUltrafree-CL 30,000NMWL 濾過ユニット(Millipor
e)で脱塩/濃縮し、標準としてウシ血清アルブミン(ＢＳＡ)を用いてピアスＢＣ
Ａ分析により定量した。

【００９０】実施例３組換プロテインＣの活性化プロテインＣ、及び、ポリペプチドの酵素前駆体形体の完全な活性化は、トロ
ンビン-セファロースとのインキュベーションにより行った。トロンビン-セファ
ロースを大量の緩衝液Ａで洗浄した。包装された200μＬのトロンビン-セファロ
ースを、同じ緩衝液中の1ｍＬの250μｇのプロテインＣと混合し、ゆっくりと回
転板上で振盪しながら37℃で4時間インキュベートした。インキュベーションの
間、トロンビン-セファロースを一時的に沈澱し、上清の少量部分を色原体基質
Ｓ-２３６６(DiaPharma)を用いてａＰＣ活性について分析することにより、プロ
テインＣの活性化の程度をモニターした。完全な活性化に続いて、トロンビン-
セファロースを沈澱し、上清を回収した。ａＰＣ濃度をピアースＢＣＡ分析で確
認し、ａＰＣを直接分析するか、または、−80℃で凍結した部分について分析し
た。全てのポリペプチドをＳＤＳ-ＰＡＧＥにより、クマシーブルー染色、また
は、ウエスタンブロット分析で完全な活性化を確認するために分析した[Laemmli
、Nature 227:680〜685(1970年)]。

【００９１】実施例４機能的特性決定組換ヒトａＰＣポリペプチドのアミド分解活性を、トリペプチド基質Ｓ-２３
６６(Ｇｌｕ-Ｐｒｏ-Ａｒｇ-ｐ-ニトロアニリド)、Ｓ-２２３８(Ｐｉｐ-Ｐｒｏ-
Ａｒｇ-ｐ-ニトロアニリド)、及びＳ-２２８８(Ｉｌｅ-Ｐｒｏ-Ａｒｇ-ｐ-ニト
ロアニリド)の加水分解により測定した(表３)。抗凝固活性は、500ｎｇｍＬ^-1
ａＰＣのａＰＴＴ中で測定した凝固時間として示す。色原体基質Ｓ-２３６６を
用いてアミド分解活性は測定した。

【００９２】分析は25℃で、1ｍｇｍＬ^-1ＢＳＡ、3ｍＭＣａＣｌ₂、及び、0.5ｎＭａＰ
Ｃを含む緩衝液Ａ中で行った。反応を96ウェルのマイクロタイタープレート(200
μＬ/ウェル)で行い、ThermoMax動力マイクロメータープレートリーダー中で405
ｎＭの吸光度単位/分における変化として測定した。動力定数は、異なる基質濃
度(16μＭ〜2ｍＭ)での速度データをミカエリス-メンテン方程式に当てはめるこ
とにより得た。Ａ₄₀₅における変化を、通過距離0.53ｃｍ(Molecular Devices Te
chnical Applications Bulletin 4-1)、及び、放出されたｐ-ニトロアニリドの
吸光率を9620Ｍ^-1ｃｍ^-1[Pfleiderer、Methods Enzymol. 19:514〜521(1970年)]
を用いて産物のｍｍｏｌ数に換算した。抗凝固活性は、活性化部分トロンボプラ
スチン凝固分析における凝固時間の延長を測定することにより評価した(Helena
Laboratories)。凝固反応は、濁度変化におけるＶ_maxに対する時間を測定する、
ThermoMax動力微滴定プレートリーダーによりモニターした。

【表３】プロテインＣポリペプチドの機能特性

【００９３】実施例５ａＰＣポリペプチドの不活性化ａＰＣポリペプチドの不活性化の割合を、正常ヒト血漿(Helena Labs)を20ｎ
ＭａＰＣ(または、どちらかのポリペプチド)と一緒に、37℃でインキュベート
することにより測定した(図１)。150ｍＭＮａＣｌ、20ｍＭＴｒｉｓ(ｐＨ7.4)
、及び、1ｍｇｍＬ^-1ＢＳＡを含む最終反応緩衝液中の血漿濃度は90％(容量/容
量)であった。選択した時間において標本を採取し、Ｓ-２３６６を最終濃度1ｍ
Ｍで用いてアミド分解活性として活性を測定した。測定した半減期を表４にまと
める。活性化プロテインＣポリペプチドのＰＣＩによる不活性化の影響を評価す
るために、ＰＣＩによるａＰＣの不活性化において約100倍の刺激を起こすこと
が知られているヘパリン(10ＵｍＬ^-1)[Heebら、J.Biol.Chem. 263(24):11613〜
11616(1988年)；Espanaら、Thromb.Res. 55(3):369〜84(1989年)；Aznarら、Thr omb.Haemost 76(6):983〜988(1996年)]を類似の反応液中に添加した(図３)。α₁ -アンチトリプシン(α₁-ＡＴ)による不活性化を、20ｎＭのａＰＣ、または、誘
導体の40ｍＭα₁-ＡＴ(Sigma)と共に、3ｍＭＣａＣｌ₂、150ｍＭＮａＣｌ、20
ｍＭＴｒｉｓ(ｐＨ7.4)、及び、1ｍｇｍＬ^-1ＢＳＡからなる反応緩衝液中でイ
ンキュベートして測定した。選択した時間において標本を採取し、Ｓ-２３６６
を最終濃度1ｍＭで用いてアミド分解活性として活性を測定した。

【表４】正常ヒト血漿中の活性化プロテインＣポリペプチドの不活性化について
の半減期

【００９４】実施例６イン・ビボ薬物動力学半減期についてのイン・ヴィトロで観察される変異による効果を確認するため
に、正常ウサギ中でイン・ビボ薬物動力学実験を行った。意識のあるウサギの耳
末梢静脈、及び、耳の中央動脈にカニューレを挿入した。緩衝液Ａ(300μｇ/ｍ
ｌ)中の活性化プロテインＣポリペプチドを、耳末梢静脈カテーテルから100μｇ
/ｋｇ、または、0.1ｍｇ/ｋｇボーラスの用量を投与するのに用いた。ベンズア
ミジンを含む3.8％クエン酸0.05ｍｌを含む注射器中に血液をサンプリングした(
0.45ｍｌ)(クエン酸/ベンズアミジン1部に対し、血液9部の最終濃度となるよう
に、注射器/針のデッドスペースを補うよう調節した)。処置後0、5、10、15、30
、45、60、90、120、180、240、300、及び、360分で試料を集め、回収後適宜遠
心し、200μｌの血漿を96ウェルプレートに等分した。活性化プロテインＣポリ
ペプチドのレベルを、以前記述されたように[Gruberら、Blood 79(9):2340〜234
8(1992年)]酵素捕捉分析(enzyme capture assay,ＥＣＡ)を用いて測定し、プー
ルしたウサギ血漿中に希釈した1〜250ｎｇ/ｍＬの範囲のスタンダートと比べた
。野生型、及び、Ｌｅｕ１９４Ｓｅｒについての結果を図５に示す。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】正常ヒト血漿とのインキュベーションの間のヒトａＰＣポリペプ
チドの不活性化。

【図２】正常ヒト血漿とのインキュベーションの間のヒトａＰＣポリペプ
チドの不活性化。

【図３】ヘパリン(10Ｕ/ｍＬ)を含む正常ヒト血漿によるヒトａＰＣポリ
ペプチドの不活性化。

【図４】精製α₁-アンチトリプシンによるヒトａＰＣポリペプチドの不活
性化。

【図５】正常な意識のあるウサギ(Ｎ=3)での、0.1ｍｇ/ｋｇのボーラスIV
用量に続く血漿ａＰＣレベル。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 11/00 Ａ６１Ｐ 17/02 13/00 31/00 17/02 31/12 31/00 37/06 31/12 Ｃ１２Ｎ 1/15 37/06 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 9/64 1/21 15/00 ＺＮＡＡ 5/10 5/00 Ａ 9/64 Ａ６１Ｋ 37/547 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者ブライアン・エドワード・ジョーンズアメリカ合衆国46032インディアナ州カーメル、ビーコン・パーク・ドライブ14772 番Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA14 CA02 CA20 DA02 DA03 EA04 GA11 GA18 GA25 GA27 HA03 HA06 4B050 CC04 DD11 EE01 FF11E GG01 HH01 LL01 LL03 LL05 4B065 AA01X AA58X AA90X AA93Y AB01 AC14 BA01 BA16 BA25 BD14 BD45 CA33 CA44 CA46 4C084 AA02 AA07 BA23 CA53 DC03 NA14 ZA36 ZA40 ZA54 ZA55 ZA59 ZA81 ZA89 ZB08 ZB33

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】配列番号１、及び、配列番号２の対応するアミノ酸を含むプ
ロテインＣ誘導体であって、194、195、228、249、254、302、または、316位の1
、若しくは、それ以上のアミノ酸がＳｅｒ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、
Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、及び、Ｇｌｎから選択されるアミノ
酸で置換されているプロテインＣ誘導体（但し、195位のアミノ酸はＡｌａで置
換されず、254位のアミノ酸はＴｈｒで置換されない）。
【請求項２】該アミノ酸置換により、野生型活性化ヒトプロテインＣと比
べてセルピンによる不活性化に対して増幅された耐性となった、請求項１に記載
のプロテインＣ誘導体。
【請求項３】該プロテインＣ誘導体が活性化された形体のものである、請
求項１に記載のプロテインＣ誘導体。
【請求項４】 194位のＬｅｕがＳｅｒで置換された(配列番号３)、請求項
１に記載のプロテインＣ誘導体。
【請求項５】 194位のＬｅｕがＳｅｒで置換され、254位のＴｈｒがＳｅｒ
で置換された(配列番号４)、請求項１に記載のプロテインＣ誘導体。
【請求項６】 194位のＬｅｕがＡｌａで置換され、254位のＴｈｒがＳｅｒ
で置換された(配列番号５)、請求項１に記載のプロテインＣ誘導体。
【請求項７】請求項４に記載のプロテインＣ誘導体をコードする、配列番
号８に記載の組換ＤＮＡ分子。
【請求項８】請求項５に記載のプロテインＣ誘導体をコードする、配列番
号９に記載の組換ＤＮＡ分子。
【請求項９】請求項６に記載のプロテインＣ誘導体をコードする、配列番
号１０に記載の組換ＤＮＡ分子。
【請求項１０】血管閉塞疾患、及び、凝固性亢進状態の処置方法であって
：Ｌ１９４Ｓ、Ｌ１９４Ｓ:Ｔ２５４Ｓ、及び、Ｌ１９４Ａ:Ｔ２５４Ｓからなる
群より選択される、セルピンに対する耐性が増加されたプロテインＣ誘導体を、
処置を必要とする患者に医薬的に有効な量で投与することを含む方法。
【請求項１１】血管閉塞疾患、及び、凝固性亢進状態が敗血症、播種性血
管内凝固、電撃性紫斑病、重篤な外傷、生命の危険を伴う手術、火傷、成人呼吸
障害症候群、移植、深部静脈血栓症、ヘパリン誘導血小板減少症、鎌状血球症、
サラセミア、ウイルス性出血熱、血栓性血小板減少性紫斑病、及び、溶血尿毒症
症候群を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】血栓症疾患、及び、血栓症の素因となる疾病状態の処置方
法であって、Ｌ１９４Ｓ、Ｌ１９４Ｓ:Ｔ２５４Ｓ、及びＬ１９４Ａ:Ｔ２５４Ｓ
からなる群より選択される、セルピンに対する耐性が増加されたプロテインＣ誘
導体を、処置を必要とする患者に医薬的に有効な量で投与することを含む方法。
【請求項１３】血栓症疾患、及び、疾病状態が心筋梗塞、不安定狭心症、
及び、脳卒中を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】敗血症の処置方法であって、Ｌ１９４Ｓ、Ｌ１９４Ｓ:Ｔ
２５４Ｓ、及び、Ｌ１９４Ａ:Ｔ２５４Ｓからなる群より選択される、セルピン
に対する耐性が増加されたプロテインＣ誘導体を医薬的に有効な量で、殺菌浸透
性増強蛋白と組合せて、処置を必要とする患者に投与することを含む方法。
【請求項１５】Ｌ１９４Ｓ、Ｌ１９４Ｓ:Ｔ２５４Ｓ、及び、Ｌ１９４Ａ:
Ｔ２５４Ｓからなる群より選択される、セルピンに対する耐性が増加されたプロ
テインＣ誘導体を医薬的に許容される希釈剤中に含む医薬組成物。
【請求項１６】該プロテインＣ誘導体が活性化されている、請求項１５に
記載の医薬組成物。
【請求項１７】請求項７に記載の核酸を含むベクター。
【請求項１８】請求項１７に記載のベクターにより形質転換された宿主細
胞。
【請求項１９】請求項８に記載の核酸を含むベクター。
【請求項２０】請求項１９に記載のベクターにより形質転換された宿主細
胞。
【請求項２１】請求項９に記載の核酸を含むベクター。
【請求項２２】請求項２１に記載のベクターにより形質転換された宿主細
胞。
【請求項２３】配列番号３、４、及び、５から選択される蛋白質配列のア
ミノ酸の少なくとも90％をコードするヒトプロテインＣポリヌクレオチドを含む
、単離された核酸。
【請求項２４】さらに、配列番号３の１９４Ｔ、または、１９４Ａからな
る群より選択される少なくとも1つの置換を含む、請求項２２に記載の単離され
た核酸。
【請求項２５】配列番号３、４、及び、５から選択される蛋白質配列のア
ミノ酸の少なくとも90％を含むヒトプロテインＣ誘導体。
【請求項２６】さらに、配列番号３の１９４Ｔ、または１９４Ａから選択
される少なくとも1つの置換を含む、請求項２５に記載のプロテインＣ誘導体。
【請求項２７】該プロテインＣ誘導体が活性化されている、請求項２５に
記載のプロテインＣ誘導体。
【請求項２８】血栓症疾患の処置方法であって、Ｌ１９４Ｓ、Ｌ１９４Ｓ
:Ｔ２５４Ｓ、及び、Ｌ１９４Ａ:Ｔ２５４Ｓからなる群より選択される、セルピ
ンに対する耐性が増加されたプロテインＣ誘導体を医薬的に有効な量で、抗血小
板薬と組合せて、処置を必要とする患者に投与することを含む方法。
【請求項２９】血栓症疾患、または、血管閉塞疾患、及び、凝固性亢進状
態の処置方法であって、セルピン、ＰＣＩ、及び、α₁-ＡＴの阻害剤認識配列へ
の、活性化プロテインＣポリペプチドの結合を阻害することを含む方法。
【請求項３０】阻害剤認識部位がＳ２、Ｓ３'、及び、Ｓ４'から選択され
る、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】包装材料、及び、野生型ヒトプロテインＣと比べた場合に
セルピンに対する耐性を有する凍結乾燥ヒトプロテインＣ誘導体を含む瓶を含む
、ヒト医薬用途の製造物品。
【請求項３２】該包装材料が、該プロテインＣ誘導体を約0.01μｇ/ｋｇ/
時間〜約50μｇ/ｋｇ/時間の投薬量で投与することを指示するラベルを含む、請
求項３１に記載のヒト医薬用途の製造物品。
【請求項３３】野生型プロテインＣと比べてセルピンよる不活性化に対し
て耐性を有するヒトプロテインＣ誘導体であって、 (ａ)宿主細胞をヒトプロテインＣ誘導体をコードする核酸を含むベクター
で形質転換し、 (ｂ)該ヒトプロテインＣ誘導体の発現に適した培地中で、該宿主細胞を培
養し、 (ｃ)該ヒトプロテインＣ誘導体を培養培地から単離し、そして、 (ｄ)該ヒトプロテインＣ誘導体を活性化することを含む方法により製造されるヒトプロテインＣ誘導体。
【請求項３４】核酸が、Ｌ１９４Ｓ、Ｌ１９４Ｓ:Ｔ２５４Ｓ、及び、Ｌ
１９４Ａ:Ｔ２５４Ｓからなる群より選択されるヒトプロテインＣ誘導体をコー
ドする、請求項３３に記載のベクター。
【請求項３５】該宿主細胞が２９３細胞、及び、ＡＶ１２細胞からなる群
より選択される、請求項３３に記載の宿主細胞。
【請求項３６】急性冠動脈症候群、及び、血栓症の素因となる疾病状態の
処置方法であって、Ｌ１９４Ｓ、Ｌ１９４Ｓ:Ｔ２５４Ｓ、及び、Ｌ１９４Ａ:Ｔ
２５４Ｓからなる群より選択される、野生型プロテインＣと比べてセルピンによ
る不活性化に対して耐性を有するヒトプロテインＣ誘導体の医薬的に有効な量を
、処置を必要とする患者に投与することを含む方法。
【請求項３７】急性冠動脈症候群、及び、血栓症の素因となる疾病状態が
心筋梗塞、及び、不安定狭心症からなる群より選択される、請求項３６に記載の
方法。