FR3077296A1

FR3077296A1 - Dimeres de variants du facteur x

Info

Publication number: FR3077296A1
Application number: FR1850851A
Authority: FR
Inventors: Jean-Luc Plantier; Toufik Abache
Original assignee: LFB SA
Current assignee: LFB SA
Priority date: 2018-02-01
Filing date: 2018-02-01
Publication date: 2019-08-02
Also published as: WO2019150050A1; WO2019150050A8

Abstract

La présente invention concerne des dimères de variants du facteur X, et leur utilisation pour le traitement des troubles de la coagulation sanguine.

Description

La présente invention concerne des dimères de variants du facteur X (aussi appelé « FX muté »), et leur utilisation pour le traitement des troubles de la coagulation sanguine.

De manière surprenante, les présents inventeurs ont mis en évidence qu’un variant du facteur X (aussi appelé « FX muté ») possède une activité significativement augmentée lorsqu’ils se trouvent sous forme dimérique.

Un autre objet de l’invention est une méthode d’augmentation de l’activité coagulante d’un variant du facteur X par dimérisation.

Un autre objet de l'invention est un polynucléotide codant pour un variant préféré du facteur X du dimère selon l’invention.

Un autre objet de l'invention est un vecteur d'expression comprenant ledit polynucléotide.

Un autre objet de l'invention est une cellule hôte comprenant ledit vecteur d'expression ou ledit polynucléotide.

Un autre objet de l’invention est une méthode de préparation dudit variant du facteur X du dimère selon la présente invention.

Un autre objet de l'invention est l'utilisation dudit dimère comme médicament. En particulier, ledit dimère peut être utilisé pour le traitement, notamment chronique, des troubles de la coagulation sanguine, notamment les troubles hémorragiques, tels que les hémophilies A, B (déficit en facteur VIII ou IX) et C (déficit en facteur XI), voire des déficits en facteur X, voire encore des besoins en coagulation d’urgence pour se substituer au Facteur Vlla. Lorsqu’une réponse procoagulante puissante et rapide est requise, ladite protéine peut être utilisée en combinaison avec d’autres molécules hémostatiques, telles que le facteur Vlla et/ou le fibrinogène, voire en association avec des composés procoagulants (transfusion de plaquettes, mélange procoagulant comme FEIBA, Kaskadil, Kanokad etc), qui pourront renforcer l’efficacité du traitement.

Le terme «protéine» se réfère à une séquence d'acides aminés ayant plus de 100 acides aminés. De préférence, la protéine consiste en une séquence d'acides aminés ayant entre 100 et 1000 acides aminés, de préférence entre 120 et 600 acides aminés.

Le terme « dimère » se réfère à une molécule résultant de la combinaison de deux sousunités, identiques dans le cas d'un homodimère, différentes dans un hétérodimère.

Le dimère selon l’invention est un dimère d’un variant du facteur X caractérisé en ce que ladite protéine est fusionnée au niveau de l’extrémité C-terminale à au moins un fragment Fc de type sauvage ou à au moins un fragment scFc de type sauvage, optionnellement muté.

Le facteur X, appelé également facteur de Stuart-Power, est codé par le gène F10 et se réfère à la sérine protéase EC3.4.21.6. Le facteur X est composé d’une chaîne lourde, de 306 acides aminés, et d’une chaîne légère, de 139 acides aminés.

Le facteur X est une protéine de 488 acides aminés, constitué d’un peptide signal, d’un propeptide, et des chaînes légère et lourde.

Le facteur X humain peut être trouvé dans UniProtKB sous le numéro d’accession P00742. Sa structure primaire est illustrée en Figure 1. La protéine est traduite sous forme de prépropeptide. Après clivage du peptide signal, le propeptide est finalement coupé, résultant en une chaîne légère et une chaîne lourde (respectivement de 142 et 306 acides aminés) (zymogène). Suite au déclenchement de la coagulation, la chaîne lourde est finalement activée par clivage du peptide d’activation, pour ne contenir que 254 acides aminés aminés (les 52 premiers acides aminés sont clivés lors du traitement): c’est la chaîne lourde du facteur Xa (SEQ ID NO :6).

Le prépropeptide de facteur X humain correspond à SEQ ID NO: 4. La chaîne lourde du facteur X humain non activé correspond à SEQ ID NO: 1, et la chaîne légère correspond à SEQ ID NO: 5. Le peptide d’activation de la chaîne lourde correspond à SEQ ID NO :3, et comprend 52 acides aminés. Le peptide signal correspond à SEQ ID NO :7, et comprend 31 acides aminés. Le propeptide naturel du facteur X correspond à SEQ ID NO : 8, et comprend 9 acides aminés.

SEQ ID NO: 2 est identique aux acides aminés 1 à 182 de SEQ ID NO: 4.

SEQ ID NO: 1 est identique aux acides aminés 183 à 488 de SEQ ID NO: 4.

La chaîne lourde du facteur Xa (SEQ ID NO :6) correspond à la SEQ ID NO :1, dans laquelle le peptide d’activation représenté par la SEQ ID NO :3 a été clivé.

Dans le cadre de l’invention, par «propeptide naturel du facteur X», on entend de préférence un variant du propeptide naturel du facteur X humain représenté par la séquence SEQ ID NO :9 qui comprend 9 acides aminés.

La protéine (Facteur X ou un de ses variants) du dimère selon l’invention est fusionnée en C-terminal à au moins un fragment d’immunoglobuline de type sauvage, optionnellement muté. On entend, par fragment d’immunoglobuline de type sauvage, un fragment choisi parmi les fragments Fc de type sauvage et les fragments scFc de type sauvage, optionnellement mutés.

Par fragment Fc, on entend la région constante d'une immunoglobuline de longueur totale à l'exclusion du premier domaine de région constante d'immunoglobuline (i.e. CH1-CL). Ainsi le fragment Fc fait référence à un homodimère, chaque monomère comprenant les deux derniers domaines constants des IgA, IgD, IgG (i.e. CH2 et CH3), ou les trois derniers domaines constants des IgE et IgM (i.e. CH2, CH3 et CH4), et la région charnière flexible N-terminale de ces domaines. Le fragment Fc, lorsqu’il est issu d’IgA ou d’IgM, peut comprendre la chaîne J. De préférence, la région Fc d’une IgGl se compose de la charnière flexible N-terminale et des domaines CH2-CH3, c’est-à-dire la portion à partir de l’acide aminé C226 jusqu’à l'extrémité C-terminale, la numérotation étant indiquée selon l’indice EU ou équivalent dans Kabat.

Par « fragment scFc » (« single chain Fc »), on entend un fragment Fc simple chaîne, obtenu par fusion génétique de deux monomères Fc reliés par un linker polypeptidique. Le linker peut notamment être -(GGGGS)n-, où n est un entier de 1 à 3. Le scFc se replie naturellement en une région Fc dimérique fonctionnelle. Le fragment scFc a de préférence la séquence SEQ ID NO :42 (ce qui correspond à SEQ ID NO :36 fusionnée en C-terminal à -GGGGS- fusionnée en C-terminal à SEQ ID NO :37) éventuellement suivie d’une lysine. La fusion de la protéine selon l’invention à au moins un fragment d’immunoglobuline de type sauvage (notamment un fragment Fc ou scFc) en Cterminal, permet une dimérisation naturelle entre lesdites protéines par appariement des fragments Fc ou scFc. De préférence, le fragment Fc de type sauvage est choisi parmi la séquence SEQ ID NO :36 et la séquence SEQ ID NO :37 éventuellement suivie d’une lysine en C-terminal (226 ou 227 acides aminés respectivement pour la SEQ ID NO :36 ; 231 ou 232 acides aminés respectivement pour la SEQ ID NO : 37). Le fragment Fc correspondant à la séquence SEQ ID NO :36 comprend les domaines constants CH2 et CH3 d’une IgG de type sauvage et la région charnière partielle en Nterminal (DKTHTCPPCP, SEQ ID NO :38). Le fragment correspondant à la séquence SEQ ID NO :37 comprend les domaines constants CH2 et CH3 d’une IgG de type sauvage et la région charnière entière en N-terminal (séquence EPKSSDKTHTCPPCP, SEQ ID NO :39, variante de la séquence naturelle présente sur une IgG de type sauvage, de séquence EPKSCDKTHTCPPCP, SEQ ID NO :81).

De préférence, le variant du facteur X selon l’invention fusionné à un fragment Fc de type sauvage en C-terminal a pour séquence SEQ ID NO :40 éventuellement suivie d’une lysine en C-terminal. Son acide nucléique correspondant a pour séquence SEQ ID NO :41 éventuellement suivie d’un codon codant pour une lysine en C-terminal. Alternativement et de préférence, son acide nucléique a été obtenu par synthèse de gènes avec optimisation de codons pour Homo Sapiens et a pour séquence SEQ ID NO :82.

De préférence, le variant du facteur X selon l’invention fusionné à un fragment scFc de type sauvage en C-terminal a pour séquence SEQ ID NO :43 éventuellement suivie d’une lysine en C-terminal. Son acide nucléique correspondant a pour séquence SEQ ID NO :44 éventuellement suivie d’un codon codant pour une lysine en C-terminal.

Le fragment Fc de type sauvage ou le fragment scFc de type sauvage utilisé selon l’invention peut être muté selon la technologie « knobs-into-holes ». Cette technologie est décrite dans la demande WO96/27011 de Genentech : elle consiste en l’obtention d’hétérodimères, qui comprennent et s’apparient de préférence au niveau d’un domaine constant CH3 d’anticorps. Ces hétérodimères, de préférence 2 fragments Fc ou un scFc, comprennent différentes mutations ponctuelles, qui induisent une interface « protubérance-dans-cavité » (en anglais « knobs-into-holes »). Une première mutation sur le premier monomère induit une protubérance, et une seconde mutation sur le second monomère induit une cavité, de sorte que l’hétérodimère s’apparie de façon préférentielle.

De préférence, le fragment Fc de type sauvage ou le fragment scFc de type sauvage est muté pour comprendre la mutation T366Y ou Y407T.

De préférence, le premier monomère (i.e. un fragment Fc ou un monomère Fc du fragment scFc) comprend la mutation T366Y, et le second monomère (i.e. un fragment Fc ou un monomère Fc du fragment scFc) comprend la mutation Y407T.

Dans un mode de réalisation, les deux protéines du dimère sont liés par un linker ou une molécule non-peptidique structurante.

Dans un mode de réalisation particulier, afin d’obtenir le dimère selon la présente invention, les deux monomères dudit facteur X muté selon l’invention peuvent être liés par un linker polypeptidique ou nucléique type ADN ou ARN, optionnellement modifiés, des ponts disulfures, ou via des mutations favorisant l’association des 2 monomères, une protéine de fusion, ou encore des agents chimiques de pontages covalents, cette liste n’étant pas limitative. Dans ce mode de réalisation, les deux protéines du dimère selon l’invention ne sont pas fusionnées à un fragment Fc ou scFc. De préférence, le linker polypeptidique comprend la séquence (GSSG)n ou (ou G^Sjn, où n est un entier de 1 à 10, de préférence de 5 à 8, de préférence encore de 8. D’autres linkers bien connus peuvent également être utilisés dont la séquence varie en type et en nombre d’acides aminés.

Dans un mode de réalisation particulier, afin d’obtenir le dimère selon la présente invention, les deux monomères dudit facteur X muté selon l’invention sont fusionnés à un fragment Fc et les deux monomères FX-Fc sont reliés entre eux par un linker peptidique entre la partie C-terminale du fragment Fc du premier monomère à la partie N-terminale du propeptide du facteur X du second monomère FX-Fc. De préférence, un tel dimère de facteur X correspond à la séquence SED ID NO : 82. Le linker peptidique est de préférence la séquence (GSSG)s. Dans ce mode de réalisation, ledit second monomère de FX-Fc ne contient pas de peptide signal du FX.

Dans un autre mode de réalisation particulier, afin d’obtenir le dimère selon la présente invention, les deux monomères dudit facteur X muté selon l’invention sont fusionnés à un fragment Fc et les deux monomères FX-Fc sont reliés entre eux par un linker peptidique entre la partie C-terminale du fragment Fc du premier monomère à la chaîne légère du facteur X du second monomère FX-Fc. De préférence, un tel dimère de facteur X correspond à une séquence SED ID NO : 83. Le linker peptidique est de préférence la séquence (GSSG)s.

De préférence, la protéine du dimère selon l’invention est un variant du facteur X tel que décrit dans la demande FRI 654098. La demande FRI 654098 décrit des mutants spécifiques du facteur X (appelés également facteurs X variants), qui sont efficacement activés par la thrombine, permettant ainsi de restaurer la coagulation en absence de facteur VIII, de facteur IX et de facteur XI. De préférence, ces mutants spécifiques du facteur X peuvent également restaurer la coagulation en absence de facteur X.

Dans un mode de réalisation, la présente invention concerne un dimère d’une protéine qui est un variant du facteur X comprenant une séquence mutée de SEQ ID NO :1, ladite protéine comprenant à son extrémité N-terminale, le peptide signal naturel du facteur X représenté par la séquence SEQ ID NO :7, un propeptide différent du propeptide naturel du facteur X, et fusionnée au niveau de l’extrémité C-terminale à au moins un fragment Fc de type sauvage ou à au moins un fragment scFc de type sauvage, optionnellement muté.

Ledit variant du facteur X du dimère comprend une séquence mutée de SEQ ID NO :1, de préférence ladite séquence mutée de SEQ ID NO :1 comprenant une mutation A, B, ou C, dans laquelle :

la mutation A consiste en la substitution des acides aminés 43 à 52 de la séquence SEQ ID NO :1 par la séquence DFLAEGLTPR, la mutation B consiste en l’insertion de la séquence DFLAEGLTPR, entre les acides aminés 52 et 53 de la séquence SEQ ID NO :1, la mutation C consiste en l’insertion de la séquence DFLAEGLTPR, entre les acides aminés 52 et 53 de la séquence SEQ ID NO :1, et en la délétion des acides aminés 4 à 13 de la séquence SEQ ID NO :1, ladite protéine comprenant à son extrémité N-terminale le peptide signal de séquence SEQ ID NO :7 fusionné à un propeptide différent du propeptide naturel du facteur X.

De préférence, ledit variant du facteur X du dimère comprenant une séquence mutée de SEQ ID NO :1, ladite séquence mutée de SEQ ID NO :1 comprenant une mutation consistant en l’insertion de la séquence DFLAEGLTPR, entre les acides aminés 52 et 53 de la séquence SEQ ID NO :1 (i.e. la mutation B ci-dessus), ledit variant du facteur X du dimère comprenant à son extrémité N-terminale le peptide signal de séquence SEQ ID NO :7 fusionné à un propeptide d’un facteur de coagulation différent du facteur X, et fusionnée au niveau de l’extrémité C-terminale à au moins un fragment Fc de type sauvage ou à au moins un fragment scFc de type sauvage, optionnellement muté.

Ledit variant du facteur X du dimère comprend donc une combinaison de séquences de l’extrémité N-terminale à C-terminale, à savoir :

- un propeptide différent du propeptide naturel du facteur X

- le peptide signal de séquence SEQ ID NO :7

-une séquence mutée de SEQ ID NO :1 selon l’invention. Cette combinaison permet d’impacter directement la gamma-carboxylation du facteur X exprimé, augmentée par rapport à un facteur X comprenant une séquence mutée de SEQ ID NO :1 selon l’invention, mais ne comprenant pas à son extrémité N-terminale le peptide signal de séquence SEQ ID NO :7 fusionné à un propeptide d’un facteur de coagulation différent du facteur X et fusionnée au niveau de l’extrémité C-terminale à au moins un fragment Fc de type sauvage ou à au moins un fragment scFc de type sauvage, optionnellement muté.

Une telle protéine est un facteur X muté, qui est efficace dans le traitement de troubles de la coagulation. De manière surprenante, le dimère de cette protéine, notamment du facteur X fusionné au niveau de l’extrémité C-terminale à au moins un fragment Fc de type sauvage et produit sous forme de dimère, ou un dimère constitué de deux molécules de facteur X, greffées à au moins un fragment scFc de type sauvage, optionnellement muté, présente une activité coagulante plus de 10 fois supérieure à celle du monomère de facteur X.

De préférence, ledit variant du facteur X du dimère présente un taux de gammacarboxylation au moins égal à 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% de la gamma-carboxylation du facteur X plasmatique, considérée à 100 %.

Ledit variant du facteur X du dimère selon l’invention est un mutant (ou variant) de facteur X. La mutation préférée selon l’invention consiste en l’insertion de la séquence DFLAEGLTPR, entre les acides aminés 52 et 53 de la séquence SEQ ID NO :1 (« mutation B ») De préférence, la mutation selon l’invention consiste en l’insertion de la séquence DFLAEGLTPR entre les acides aminés 52 et 53 de la séquence SEQ ID NO :1.

La séquence SEQ ID NO :1 comprenant une mutation selon l’invention est également appelée « séquence mutée de SEQ ID NO :1 ».

En d’autres termes, de préférence, la séquence SEQ ID NO :1 comprenant la mutation selon l’invention consiste en la séquence SEQ ID NO :3, fusionnée à son extrémité Cterminale à la séquence DFLAEGLTPR, elle-même fusionnée à son extrémité Cterminale à la séquence SEQ ID NO :6.

Lorsque la mutation consiste en l’insertion de la séquence DFLAEGLTPR, la séquence mutée de SEQ ID NO : 1 correspond à SEQ ID NO : 11.

Le propeptide utilisé dans ledit variant du facteur X du dimère selon l’invention est différent du propeptide naturel du facteur X. Le propeptide utilisé selon l’invention peut être celui d’une protéine vitamine K dépendante. Le propeptide utilisé dans ledit variant du facteur X du dimère selon l’invention peut être choisi parmi le propeptide de la protéine S, le propeptide de la protéine Z, le propeptide du FIX, le propeptide de l’une des protéines GAS6, BGP, MGP, et PRGP1, PRGP2, TMG3 et TMG4, le propeptide de la thrombine, le propeptide du facteur VII, le propeptide de la protéine C, incluant leurs isoformes naturelles ou leurs versions modifiées.

De préférence, le propeptide différent du propeptide naturel du facteur X est choisi parmi le propeptide de la thrombine, le propeptide du facteur VII, le propeptide de la protéine C, et leurs versions modifiées. Par « version modifiée », on entend que le propeptide utilisé est tronqué, et comprend éventuellement l’insertion d’un ou plusieurs acides aminés, par exemple à son extrémité N-terminale. De préférence, le propeptide utilisé dans ledit variant du facteur X du dimère selon l’invention est celui d’un facteur de coagulation différent du facteur X. Ainsi, le propeptide utilisé dans ledit variant du facteur X du dimère selon l’invention est préférentiellement le propeptide naturel d’un facteur de coagulation différent du facteur X. De préférence, le propeptide est choisi parmi le propeptide de la thrombine, le propeptide du facteur VII, le propeptide de la protéine C, leurs isoformes naturelles ou leurs versions modifiées. De préférence, le propeptide du facteur VII selon l’invention correspond à l’isoforme A du propeptide du facteur VII (ou «FVIIvl ») et a pour séquence SEQ ID NO :14. De préférence, le propeptide du facteur VII selon l’invention correspond à l’isoforme B du propeptide du facteur VII (ou « FVIIv2 ») et a pour séquence SEQ ID NO : 15.

Plus préférentiellement, le propeptide est choisi parmi les séquences SEQ ID NO :13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO :15 et SEQ ID NO :16. Plus préférentiellement, le propeptide a pour séquence SEQ ID NO :14.

De préférence, le peptide signal de séquence SEQ ID NO :7 fusionné à un propeptide différent du propeptide naturel du facteur X est choisi parmi les séquences SEQ ID NO : 18, SEQ ID NO :19, SEQ ID NO :20 et SEQ ID NO :21. Plus préférentiellement, le peptide signal de séquence SEQ ID NO :7 fusionné à un propeptide différent du propeptide naturel du facteur X est représenté par la séquence SEQ ID NO : 19.

Ledit variant du facteur X du dimère selon l’invention comprend de préférence une séquence intermédiaire, entre le peptide signal de séquence SEQ ID NO :7 fusionné à un propeptide différent du propeptide naturel du facteur X et la séquence mutée de SEQ ID NO : 1. De préférence, ladite séquence intermédiaire est fusionnée à son extrémité Nterminale, au peptide signal de séquence SEQ ID NO :7 fusionné à un propeptide différent du propeptide naturel du facteur X, et à son extrémité C-terminale, à la séquence mutée de SEQ ID NO : 1. De préférence, ladite séquence intermédiaire est la séquence de la chaîne légère du facteur X, de préférence la séquence SEQ ID NO :5.

Ledit variant du facteur X du dimère selon l’invention comprend ainsi de préférence, de l’extrémité N-terminale à C-terminale :

a. le peptide signal de séquence SEQ ID NO :7 fusionné à un propeptide différent du propeptide naturel du facteur X, puis

b. la séquence SEQ ID NO :5, puis

c. ladite séquence mutée de SEQ ID NO : 1, puis

d. au moins un fragment Fc de type sauvage ou à au moins un fragment scFc de type sauvage, optionnellement muté.

Plus particulièrement, ledit variant du facteur X du dimère comprend, dans le sens N- à C-terminal, le peptide signal de séquence SEQ ID NO :7 fusionné à un propeptide différent du propeptide naturel du facteur X, puis la séquence SEQ ID NO :5, puis la séquence mutée de SEQ ID NO :1.

Ledit variant du facteur X du dimère comprend de préférence, de l’extrémité Nterminale à C-terminale :

b. la séquence SEQ ID NO :5, puis

c. la séquence SEQ ID NO : 11, puis

Ainsi, ledit variant du facteur X du dimère comprend de préférence, de l’extrémité Nterminale à C-terminale : le peptide signal de séquence SEQ ID NO :7 fusionné à un propeptide différent du propeptide naturel du facteur X, puis fusionné à la séquence SEQ ID NO :17, puis fusionnée au niveau de l’extrémité C-terminale à au moins un fragment Fc de type sauvage ou à au moins un fragment scFc de type sauvage, optionnellement muté.

De préférence, ledit variant du facteur X du dimère selon l’invention comprend, de préférence consiste en, une séquence choisie parmi SEQ ID NO : 40 et SEQ ID NO : 43.

La séquence mutée de SEQ ID NO : 1 comprenant une mutation A, B, ou C, peut comprendre en outre au moins une mutation d’au moins un acide aminé n’altérant pas l’activité fonctionnelle dudit variant du facteur X du dimère selon l’invention. De préférence, la séquence mutée de SEQ ID NO : 1 comprenant une mutation A, B, ou C 5 et comprenant en outre au moins une mutation additionnelle d’au moins un acide aminé n’altérant pas l’activité fonctionnelle, présente au moins 80% d’identité, au moins 81% au moins 82%, au moins 83%, au moins 84%, au moins 85%, au moins 86%, au moins 87%, au moins 88%, au moins 89%, au moins 90%, au moins 91%, au moins 92%, au moins 93%, au moins 94%, au moins 95%, au moins 96%, au moins 97%, au moins 10 98%, au moins 99% d’identité avec la séquence mutée de SEQ ID NO :1 comprenant uniquement une mutation A, B, ou C.

Les séquences décrites dans la présente demande peuvent être résumées comme suit:

SEQ ID NO :	Protéine
1	Chaîne lourde de facteur X humain (306 acides aminés), comprenant le peptide d’activation
2	Peptide signal, propeptide, et chaîne légère de facteur X humain (182 acides aminés)
3	Peptide d’activation de la chaîne lourde (52 acides aminés)
4	Prépropeptide de facteur X humain (488 acides aminés)
5	Chaîne légère de facteur X humain (142 acides aminés)
6	Chaîne lourde du Facteur X humain activé (FXa) (254 acides aminés)
7	Peptide signal du facteur X humain (31 acides aminés)
8	Propeptide du facteur X humain (9 acides aminés)
9	Variant du propeptide du facteur X humain (9 acides aminés)
10	FX-WT (488 acides aminés)
11	Séquence mutée de SEQ ID NO :1 comprenant l’insertion

	de DFLAEGLTPR entre les acides aminés 52 et 53 (mutation selon l’invention)
12	Aptamère anti-Gla
13	Propeptide de la thrombine (19 acides aminés)
14	Propeptide du facteur VII version 1 (« FVIIvl ») (40 acides aminés)
15	Propeptide du facteur VII version 2 (« FVIIv2 ») (18 acides aminés)
16	Propeptide de la protéine C (24 acides aminés)
17	FX-IIa (458 acides aminés)
18	Peptide signal du facteur X humain fusionné au propeptide de la thrombine
19	Peptide signal du facteur X humain fusionné à FVIIvl
20	Peptide signal du facteur X humain fusionné à FVIIv2
21	Peptide signal du facteur X humain fusionné au propeptide de la protéine C
22	variant du facteur X (SEQ ID NO : 18 fusionnée à SEQ ID NO :17)
23	variant du facteur X (SEQ ID NO : 19 fusionnée à SEQ ID NO :17)
24	variant du facteur X (SEQ ID NO :20 fusionnée à SEQ ID NO :17)
25	variant du facteur X (SEQ ID NO :21 fusionnée à SEQ ID NO :17)
26	Séquence nucléique codant pour SEQ ID NO :7
27	Séquence nucléique codant pour SEQ ID NO : 13
28	Séquence nucléique codant pour SEQ ID NO : 14
29	Séquence nucléique codant pour SEQ ID NO : 15
30	Séquence nucléique codant pour SEQ ID NO : 16
31	Séquence nucléique codant pour SEQ ID NO : 17
32	Séquence nucléique codant pour SEQ ID NO :22

33	Séquence nucléique codant pour SEQ ID NO :23
34	Séquence nucléique codant pour SEQ ID NO :24
35	Séquence nucléique codant pour SEQ ID NO :25
36	Fragment Fc sauvage, éventuellement suivi d’une lysine
37	SEQ ID NO :36 comprenant la région charnière entière en N-terminal, éventuellement suivie d’une lysine
38	Région charnière partielle en N-terminal
39	Région charnière entière en N-terminal
40	Variant du Facteur X du dimère selon l’invention - Protéine SEQ ID NO :23 fusionnée au fragment Fc sauvage SEQ ID NO :36, éventuellement suivie d’une lysine
41	Acide nucléique codant pour la protéine SEQ ID NO :40, éventuellement suivi d’un codon codant pour une lysine
42	Fragment scFc sauvage, éventuellement suivie d’une lysine
43	Variant du Facteur X du dimère selon l’invention Protéine SEQ ID NO :23 fusionnée au fragment scFc sauvage SEQ ID NO :42, éventuellement suivie d’une lysine
44	Acide nucléique codant pour la protéine SEQ ID NO :43 éventuellement suivi d’un codon codant pour une lysine
45	VKORC1 humaine sauvage
46	Acide nucléique codant pour la sous-unité SEQ ID NO :45
47	Peptide signal de la prothrombine
48	Peptide signal du facteur VII
49	Peptide signal de la protéine C
50 à 80	Amorces des exemples
81	Région charnière entière native en N-terminal
82	Séquence d’acide nucléique optimisée codant pour la

	protéine SEQ ID NO :40, éventuellement suivi d’un codon codant pour une lysine
83	Variant du Facteur X du dimère selon l’invention correspondant à la SEQ ID NO :23, fusionnée à SEQ ID NO: 36, fusionnée à un linker (GSSGjs fusionnée à SEQ ID NO: 14, fusionnée à SEQ ID NO: 17 fusionnée à SEQ ID NO: 36.
84	Variant du Facteur X du dimère selon l’invention correspondant à la SEQ ID NO :23, fusionnée à SEQ ID NO: 36, fusionnée à un linker (GSSGjs, fusionnée à SEQ ID NO: 17 fusionnée à SEQ ID NO: 36.

Un autre objet de l'invention est un acide nucléique (polynucléotide) codant pour ledit variant du facteur X du dimère. De préférence, l’acide nucléique est choisi parmi les séquences SEQ ID NO :32 à 35.

Un autre objet de l'invention est un vecteur d'expression comprenant ledit polynucléotide codant pour ledit variant du facteur X du dimère, ou une cassette d’expression comprenant ledit polynucléotide. Selon l'invention, les vecteurs d'expression appropriés pour une utilisation selon l'invention peuvent comprendre au moins un élément de contrôle d'expression fonctionnellement lié à la séquence d'acide nucléique. Les éléments de contrôle d'expression sont insérés dans le vecteur et permettent de réguler l'expression de la séquence d'acide nucléique. Des exemples d'éléments de contrôle d'expression incluent notamment des systèmes lac, le promoteur du phage lambda, les promoteurs de levure ou les promoteurs viraux. D’autres éléments opérationnels peuvent être incorporés, comme une séquence de tête, des codons de terminaison, des signaux de polyadénylation et des séquences nécessaires pour la transcription et la traduction ultérieure de la séquence d'acide nucléique dans le système hôte. Il sera compris par l'homme de l'art que la combinaison correcte des éléments de contrôle d'expression dépend du système hôte choisi. Il sera également entendu que le vecteur d'expression doit contenir les éléments supplémentaires nécessaires pour le 14 transfert et la réplication ultérieure du vecteur d'expression contenant la séquence d'acide nucléique dans le système hôte.

De tels vecteurs sont facilement construits en utilisant des méthodes conventionnelles ou disponibles dans le commerce.

De préférence, le vecteur d'expression utilisé est un vecteur polycistronique comprenant un polynucléotide codant pour ledit variant du facteur X du dimère selon l’invention, un polynucléotide codant pour l’enzyme VKOR, de préférence pour la sous-unité 1 du complexe de vitamine K époxyde réductase (VKORC1) humaine sauvage, et optionnellement un polynucléotide codant pour la fiirine. La co-expression de la furine permet d’optimiser le clivage naturel à l’intérieur de la cellule au niveau des sites naturels de clivage présents sur le facteur X (RRKR). De préférence, le vecteur d'expression utilisé est un bicistronique comprenant un polynucléotide codant pour ledit variant du facteur X du dimère selon l’invention, et un polynucléotide codant pour l’enzyme VKOR, de préférence pour la sous-unité 1 du complexe de vitamine K époxyde réductase (VKORC1) humaine sauvage.

La sous-unité 1 du complexe de vitamine K époxyde réductase (VKORC1) humaine sauvage est la sous-unité catalytique du complexe ; c’est une protéine de 163 acides aminés. La séquence de cette sous-unité humaine sauvage peut être trouvée dans UniProt sous le numéro d’accession Q9BQB6 (SEQ ID NO :45). L’acide nucléique codant pour cette protéine a pour séquence SEQ ID NO :46. Cette protéine est présente dans le réticulum endoplasmique des cellules. Le polynucléotide codant pour l’enzyme VKOR peut également être un polynucléotide codant pour une VKOR mutée.

Alternativement, le vecteur d'expression utilisé est un bicistronique comprenant un polynucléotide codant pour ledit variant du facteur X du dimère selon l’invention, et un polynucléotide codant pour l’enzyme furine.

De préférence, alternativement, les vecteurs d'expression utilisés sont autant de vecteurs que de polynucléotides à exprimer, l’un comprenant un polynucléotide codant pour ledit variant du facteur X du dimère selon l’invention, fusionné ou non en C-terminal avec un fragment Fc ou scFc, un autre comprenant un polynucléotide codant pour l’enzyme VKOR citée ci-dessus et un autre comprenant un polynucléotide codant pour un fragment Fc ou scFc, optionnellement un autre encore comprenant un polynucléotide codant pour la furine.

Un autre objet de l'invention est une cellule recombinante comprenant un vecteur d'expression tel que décrit ci-dessus, ou un polynucléotide tel que décrit ci-dessus. Selon l'invention, des exemples de cellules hôtes qui peuvent être utilisées sont des cellules eucaryotes, comme les cellules animales, végétales, d’insectes et de levure ; et des cellules procaryotes, comme E. coli. Les moyens par lesquels le vecteur portant le gène peut être introduit dans les cellules comprennent notamment la microinjection, l'électroporation, la transduction ou la transfection à l'aide de DEAE-dextran, la lipofection, le phosphate de calcium ou d'autres procédures connues de l'homme de l'art. Dans un mode de réalisation préféré, les vecteurs d'expression permettant une expression dans les cellules eucaryotes sont utilisés. Des exemples de tels vecteurs comprennent les vecteurs viraux tels que les rétrovirus, adénovirus, virus de l'herpès, virus de la vaccine, virus de la variole, le poliovirus, lentivirus, les vecteurs d'expression bactériens ou des plasmides tels que pcDNA5. Les lignées cellulaires eucaryotes préférées comprennent les cellules COS, les cellules CHO, les cellules HEK notamment HEK293 (ATCC # CRL1573), les cellules YB2/0, les cellules BHK, les cellules PerC6, les cellules HeLa, les cellules NIH/3T3, des cellules T2, les cellules dendritiques ou les monocytes. De préférence, les cellules utilisées sont des cellules HEK. De préférence encore, les cellules utilisées sont des cellules CHO.

Un autre objet de l'invention est un procédé de production dudit variant du facteur X du dimère selon l’invention, ledit variant du facteur X du dimère comprenant une chaîne légère (de préférence SEQ ID NO :5), comprenant :

a) l’expression d’un vecteur polycistronique, de préférence bicistronique, de préférence en présence de vitamine K, dans une cellule hôte, de préférence une cellule HEK, ledit vecteur comprenant un polynucléotide codant pour ledit variant du facteur X du dimère selon l’invention, et un polynucléotide codant pour l’enzyme VKOR de préférence pour la sous-unité 1 du complexe de vitamine K époxyde réductase (VKORC1) humaine sauvage, de préférence encore une cellule CHO, ledit vecteur comprenant un polynucléotide codant pour ledit variant du facteur X du dimère selon l’invention, et un polynucléotide codant pour l’enzyme furine ;

b) la culture de ladite cellule hôte ;

c) la récupération du surnageant cellulaire ;

d) optionnellement au moins une des étapes choisies parmi :

-la clarification du surnageant, suivi optionnellement d’une étape de filtration,

-la concentration du surnageant,

-la neutralisation des protéases activées par l’ajout d’inhibiteurs de protéases ;

e) la purification dudit variant du facteur X du dimère selon l’invention par passage du surnageant de production obtenu en c) ou d) sur une colonne d’aptamères capable de se fixer au domaine Gla du facteur X,

f) optionnellement, entre les étapes d) et e) ou après l’étape e), la purification dudit variant du facteur X du dimère selon l’invention par passage du surnageant de production obtenu en d) ou e) sur une colonne de chromatographie capable de se fixer au fragment Fc ou scFc.

Une chromatographie capable de se fixer au fragment Fc ou scFc peut être choisie parmi une chromatographie d’affinité utilisant un ligand qui fixe la partie Fc de la molécule (des exemples de ligand sont la protéine A, un nanobody (VHH), un aptamère anti-Fc etc...), une chromatographie échangeuse d’ions, une chromatographie par exclusion stérique, cette liste n’étant pas limitative et comprenant tout procédé chromatographique permettant de collecter séparément le variant du facteur X dimère, des autres contaminants ou fragments présents.

Toutes conditions de culture bien connues de l’homme du métier peuvent être utilisées pour la culture de la cellule hôte à l’étape b). Par exemple, tout mode de production peut être choisi, la culture pouvant être ainsi réalisée en mode de production type batch, fedbatch, perfusion continue ou XD process, sans être limitatif.

La concentration du surnageant optionnellement réalisée à l’étape d) peut être réalisée par toute technique bien connue, telle que par passage sur des cassettes de concentration, par filtration tangentielle, ou par utilisation de colonnes de chromatographies permettant de concentrer le produit.

a) l’expression de deux vecteurs d'expression, de préférence en présence de vitamine K, dans une cellule-hôte, de préférence une cellule CHO, l’un des vecteurs comprenant un polynucléotide codant pour ledit variant du facteur X du dimère selon l’invention, et l’autre comprenant un polynucléotide codant pour l’enzyme furine, de préférence encore une cellule HEK, l’un des vecteurs comprenant un polynucléotide codant pour ledit variant du facteur X du dimère selon l’invention, et l’autre comprenant un polynucléotide codant pour l’enzyme VKOR citée ci-dessus, de préférence pour la sous-unité 1 du complexe de vitamine K époxyde réductase (VKORC1) humaine sauvage ;

b) la culture de ladite cellule hôte ;

c) la récupération du surnageant cellulaire ;

d) optionnellement au moins une des étapes choisies parmi :

-la concentration du surnageant,

f) optionnellement, entre les étapes d) et e) ou après l’étape e), la purification de la protéine selon l’invention par passage du surnageant de production obtenu en d) ou e) sur une colonne de chromatographie capable de se fixer au fragment Fc ou scFc.

Les deux procédés cités ci-dessus permettent avantageusement l’obtention dudit variant du facteur X du dimère selon l’invention présentant un taux de gamma-carboxylation identique à celui du facteur X plasmatique, avoisinant les 100%.

Les aptamères utilisés dans les procédés décrits ci-dessus sont notamment ceux décrits dans la demande de brevet WO2011/012831. En particulier, l’aptamère utilisé à la séquence suivante :

5’ CCACGACCTCGCACATGACTTGAAGTAAAACGCGAATTAC 3’ (SEQ ID NO: 12).

De façon avantageuse, cet aptamère se lie spécifiquement aux formes biologiquement actives de facteur X. Ainsi, les procédés de production d’une protéine selon l’invention, comprenant une étape de purification utilisant une colonne d’aptamères décrits cidessus, permettent l’obtention de formes biologiquement actives de facteur X.

Un autre objet de l'invention est une méthode d’augmentation de l’activité coagulante d’un facteur de la coagulation comprenant :

la production dudit variant du facteur X ou un de leurs variants, de manière encore plus préférée ledit variant du facteur X du dimère selon l’invention, une étape de dimérisation dudit facteur de coagulation.

Dans un mode de réalisation, le facteur de coagulation est fusionné au niveau de l’extrémité C-terminale à au moins un fragment Fc de type sauvage ou à au moins un fragment scFc de type sauvage, optionnellement muté, et l’étape de dimérisation correspond au rapprochement des fragments Fc ou scFc lors de la maturation de la protéine au cours de sa biosynthèse intracellulaire. Le rapprochement se fait avantageusement dans la cellule hôte par la propriété naturelle des fragments Fc à s’associer entre eux (par l’appariement des ponts disulfures présents sur la région charnière mais aussi par des régions d’interactions notamment les CH3). Dans le mode de réalisation où les séquences de deux facteurs de coagulation sont fusionnées à un fragment Fc de type sauvage, et reliés en outre par un linker peptidique (séquence SEQ ID NO : 83 ou séquence SEQ ID NO : 84), les deux facteurs de coagulation peuvent avantageusement se rapprocher dans une configuration spatiale équivalente à celle obtenue lors d’une fusion à un fragment Fc, et sont en outre reliés par une liaison covalente via le linker peptidique, pendant la production, jusqu’à ce que le propeptide soit clivé par une protéase spécifique du site de clivage sur le propeptide. Avantageusement, le linker permet d’optimiser le rapprochement des deux facteurs de coagulation.

La protéine du dimère selon l’invention peut être produite dans le lait d’animaux transgéniques.

Dans ce cas, selon un premier aspect, l’expression du polynucléotide codant pour la protéine du dimère selon l’invention est contrôlée par un promoteur de caséine de mammifère ou un promoteur de lactosérum de mammifère, ledit promoteur ne contrôlant pas naturellement la transcription dudit gène, et le polynucléotide contenant en outre une séquence de sécrétion de la protéine. La séquence de sécrétion comprend un signal de sécrétion interposé entre le gène et le promoteur.

L’animal transgénique utilisé est capable non seulement de produire la protéine désirée, mais également de transmettre cette capacité à sa descendance. La sécrétion de la protéine dans le lait facilite la purification et évite l’utilisation de produits sanguins. L’animal peut ainsi être choisi parmi la souris, la chèvre, la lapine, la brebis ou la vache.

Le dimère selon l'invention peut être utilisé en tant que médicament. Par conséquent, le dimère peut être introduit dans une composition pharmaceutique. En particulier, le dimère selon l'invention peut être utilisé pour le traitement des troubles de la coagulation, notamment des troubles hémorragiques.

La composition pharmaceutique de l'invention peut être combinée avec des excipients pharmaceutiquement acceptables, et éventuellement des matrices à libération prolongée, comme des polymères biodégradables, pour former une composition thérapeutique.

La composition pharmaceutique de la présente invention peut être administrée par voie orale, sublinguale, sous-cutanée, intramusculaire, intraveineuse, intra-artérielle, intrathécale, intraoculaire, intracérébrale, transdermique, locale ou rectale. Le principe actif, seul ou en association avec un autre principe actif, peut alors être administré sous forme unitaire d'administration, en mélange avec des supports pharmaceutiques classiques. Des formes unitaires d'administration comprennent les formes par voie orale telles que les comprimés, les gélules, les poudres, les granules et les solutions ou suspensions orales, les formes d'administration sublinguale et buccale, les aérosols, les implants sous-cutanés, transdermique, topique, intrapéritonéale, intramusculaire, intraveineuse, sous-cutanée, intrathécale, les formes d'administration par voie intranasale et les formes d'administration rectale.

De préférence, la composition pharmaceutique contient un véhicule pharmaceutiquement acceptable pour une formulation susceptible d'être injectée. Il peut s'agir en particulier de formules isotoniques, stériles, de solutions salines (avec phosphate monosodique ou disodique, chlorure de sodium, de potassium, de calcium ou de magnésium et analogues, ou des mélanges de tels sels), ou de compositions lyophilisées, qui, lors de l'addition d'eau stérilisée ou de sérum physiologique selon les cas, permettent la constitution de solutés injectables.

Les formes pharmaceutiques appropriées pour une utilisation injectable comprennent des solutions aqueuses stériles ou des dispersions, des formulations huileuses, y compris l'huile de sésame, l'huile d'arachide, et des poudres stériles pour la préparation extemporanée de solutions injectables stériles ou de dispersions. Dans tous les cas, la forme doit être stérile et doit être fluide dans la mesure où elle doit être injectée par seringue. Elle doit être stable dans les conditions de fabrication et de stockage et doit être préservée contre l'action contaminante de micro-organismes, comme les bactéries et les champignons.

Les dispersions selon l’invention peuvent être préparées dans du glycérol, des polyéthylèneglycols liquides ou leurs mélanges, ou dans des huiles. Dans des conditions normales de stockage et d'utilisation, ces préparations contiennent un conservateur pour empêcher la croissance des micro-organismes.

Le véhicule pharmaceutiquement acceptable peut être un solvant ou milieu de dispersion contenant, par exemple, l'eau, l'éthanol, un polyol (par exemple, la glycérine, le propylène glycol, le polyéthylène glycol, et analogues), des mélanges appropriés de ceux-ci, et/ou les huiles végétales. La fluidité convenable peut être maintenue, par exemple, par rutilisation d'un tensioactif, tel que la lécithine. La prévention de l'action de micro-organismes peut être provoquée par divers agents antibactériens et antifongiques, par exemple, des parabènes, le chlorobutanol, le phénol, l'acide sorbique ou encore le thimérosal. Dans de nombreux cas, il sera préférable d'inclure des agents isotoniques, par exemple, des sucres ou du chlorure de sodium. L'absorption prolongée des compositions injectables peut être provoquée par l'utilisation dans les compositions d'agents retardant l'absorption, par exemple, le monostéarate d'aluminium ou la gélatine. Les solutions injectables stériles sont préparées en incorporant les substances actives en quantité requise dans le solvant approprié avec plusieurs des autres ingrédients énumérés ci-dessus, le cas échéant, suivie d'une stérilisation par filtration. En règle générale, les dispersions sont préparées en incorporant les divers ingrédients actifs stérilisés dans un véhicule stérile qui contient le milieu de dispersion basique et les autres ingrédients requis parmi ceux énumérés ci-dessus. Dans le cas de poudres stériles pour la préparation de solutions injectables stériles, les procédés de préparation préférés sont le séchage sous vide et la lyophilisation. Lors de la formulation, les solutions seront administrées d'une manière compatible avec la formulation posologique et en une quantité thérapeutiquement efficace. Les formulations sont facilement administrées dans une variété de formes galéniques, telles que les solutions injectables décrites ci-dessus, mais les capsules de libération de médicament et similaires peuvent également être utilisés. Pour l'administration parentérale dans une solution aqueuse par exemple, la solution doit être convenablement tamponnée et le diluant liquide rendu isotonique avec suffisamment de solution saline ou de glucose. Ces solutions aqueuses particulières conviennent particulièrement pour une administration intraveineuse, intramusculaire, sous-cutanée et intrapéritonéale. A cet égard, les milieux aqueux stériles qui peuvent être utilisés sont connus de l'homme de l'art. Par exemple, une dose peut être dissoute dans 1 ml de solution de NaCl isotonique puis ajoutée à 1000 ml de liquide approprié, ou injectée sur le site proposé de la perfusion. Certaines variations de posologie devront nécessairement se produire en fonction de l'état du sujet traité.

La composition pharmaceutique de l'invention peut être formulée dans un mélange thérapeutique comprenant environ 0.0001 à 1.0 milligrammes, soit environ 0.001 à 0.1 milligrammes, soit environ de 0.1 à 1.0 milligrammes, voire environ 10 milligrammes par dose ou plus. Des doses multiples peuvent également être administrées. Le niveau de dose thérapeutiquement efficace spécifique pour un patient particulier dépendra d'une variété de facteurs, y compris le trouble qui est traité et la gravité de la maladie, l'activité du composé spécifique employé, la composition spécifique utilisée, l'âge, le poids corporel, la santé générale, le sexe et le régime alimentaire du patient, le moment de l'administration, la voie d'administration, le taux d'excrétion du composé spécifique utilisé, la durée du traitement, ou encore les médicaments utilisés en parallèle.

Le dimère selon l'invention peut également être utilisé comme produit d’une thérapie génique ou cellulaire.

A cet effet, la présente invention concerne également un vecteur d’expression comprenant un polynucléotide codant pour une protéine du dimère selon l’invention, ledit polynucléotide étant tel que décrit ci-dessus. Ce vecteur d’expression peut être utilisé comme médicament, de préférence comme médicament de thérapie génique.

Ce vecteur d’expression peut également être utilisé comme médicament de thérapie cellulaire : dans ce cas, il est destiné à être injecté ex vivo à un échantillon de cellules de patient, avant leur réinjection.

Les exemples suivants sont donnés en vue d'illustrer divers modes de réalisation de l'invention.

Légende des figures

Figure 1 : Structure primaire du facteur X humain

Figure 2 : Vecteur bicistronique HKgenEFss-FX-Fcmuté-furine

Figure 3 : Coloration par PAGE-Blue du facteur X plasmatique, facteur X muté et facteur X-Fc-muté issus de CHO-S après séparation en SDS-PAGE 4-12%

Les différents produits ont été séparés en gel d’acrylamide 4-12% et révélés par coloration au PAGE-Blue (InVitroGen). Les masses des témoins de poids moléculaires (PM) sont indiqués à la gauche des gels (piste 1). Piste 2, facteur X plasmatique (Haematologic Technologies) ; piste 3, FX muté issu de CHO-S aptamopurifié ; piste 4, témoins de poids moléculaires ; piste 5, FX-Fc muté issu de CHO-S aptamopurifié.

Figure 4 : Coloration par PAGE-Blue du facteur X plasmatique, facteur X muté et facteur X-Fc-muté issus de HEK 293 Freestyle (293F) après séparation en SDSPAGE 4-12%

Les différents produits ont été séparés en gel d’acrylamide 4-12% et révélés par coloration au PAGE-Blue (InVitroGen). Les masses des témoins de poids moléculaires (PM) sont indiqués entre les deux gels (piste 2 et 3). Piste 1, FX muté issu de HEK 293F aptamopurifié ; piste 4, facteur X plasmatique (Haematologic Technologies) ; piste 5, facteur X plasmatique réduit (Haematologic Technologies) ; piste 6, FX-Fc muté issu de HEK 293F aptamopurifié; piste 7, FX-Fc muté issu de HEK 293F, aptamopurifié et réduit.

Figure 5 : Génération de thrombine par le FX muté en doses croissantes issues de CHO-Sen plasma déficient en FVIII

La génération de thrombine a été suivie au cours du temps dans un plasma normal ou déficient en facteur VIII stimulé par 0,5 pM de facteur tissulaire en présence de phospholipides. Signal obtenu avec un plasma normal (·), en plasma déficient en facteur VIII (o), déficient en FVIII en présence de 0,1 U/ml de FVIII recombinant (□), en présence de 1 U/ml de FVIII recombinant (), en présence de 10 pg/ml (Δ), de 20 pg/ml (A), de 30 pg/ml (0), de 40 pg/ml (♦), de 50 pg/ml (+) de FX muté aptamopurifié issu de CHO-S.

Figure 6 : Génération de thrombine par le FX-Fc muté issus de CHO-S en plasma déficient en FVIII

La génération de thrombine a été suivie au cours du temps dans un plasma normal ou déficient en facteur VIII stimulé par 0,5 pM de facteur tissulaire en présence de phospholipides. Signal obtenu avec un plasma normal (·), en plasma déficient en facteur VIII (o), déficient en FVIII en présence de 0,1 U/ml de FVIII recombinant (□), en présence de 1 U/ml de FVIII recombinant (), en présence de 2 pg/ml (Δ) ou de 4 pg/ml (A) de FX-Fc muté aptamopurifié issu de CHO-S.

Figure 7 : Génération de thrombine par le FX muté en doses croissantes issues de HEK 293F en plasma déficient en FVIII

La génération de thrombine a été suivie au cours du temps dans un plasma normal ou déficient en facteur VIII stimulé par 0,5 pM de facteur tissulaire en présence de phospholipides. Signal obtenu avec un plasma normal (·), en plasma déficient en facteur VIII (o), déficient en FVIII en présence de 0,1 U/ml de FVIII recombinant (□), en présence de 1 U/ml de FVIII recombinant (), en présence de 20 pg/ml (Δ) ou de 40 pg/ml (A) de FX muté aptamopurifié issu de HEK 293F.

Figure 8 : Génération de thrombine par le FX-Fc muté en doses croissantes issues de HEK 293F en plasma déficient en FVIII

La génération de thrombine a été suivie au cours du temps dans un plasma normal ou déficient en facteur VIII stimulé par 0,5 pM de facteur tissulaire en présence de phospholipides. Signal obtenu avec un plasma normal (·), en plasma déficient en facteur VIII (o), déficient en FVIII en présence de 0,1 U/ml de FVIII recombinant (□), en présence de 1 U/ml de FVIII recombinant (), en présence de 2 pg/ml (Δ) ou de 4 pg/ml (A) de FX muté aptamopurifié issu de HEK 293F.

Figure 9 : Exemples de structures schématiques de dimères de facteur X selon l’invention

Légende :

HC : Chaîne lourde (Heavy Chain) du facteur X

LC : Chaîne légère (Light Chain) du facteur X

CH2 et CH3 : domaines de la chaîne lourde au niveau du fragment Fc

9A: Dimère d’un variant du facteur X dans lequel le facteur X est fusionné au niveau de l’extrémité C-terminale à un fragment Fc, tel que le variant du facteur X correspondant à la séquence ID NO : 40.

9B : Dimère d’un variant du facteur X comprenant en contigu une séquence correspondant à une première molécule de facteur X, une séquence correspondant à un fragment Fc, un linker peptidique (trait plein), une seconde molécule de facteur X contenant optionnellement un propeptide, une séquence correspondant à un fragment Fc, tel que le variant du facteur X correspondant à la séquence ID NO : 83.

9C: Dimère d’un variant du facteur X dans lequel le facteur X est fusionné au niveau de l’extrémité C-terminale à un fragment scFc, tel que le variant du facteur X correspondant à la séquence ID NO : 43.

Exemples

Exemple 1 : Construction d’un FX muté fusionné au fragment Fc d’une immunoglobuline G1 (IgGl)

La séquence ADN codante correspondant à la séquence protéique du FX muté fusionné au fragment Fc d’une IgGl (SEQ ID NO :40) et la séquence ADNc de la furine ont été obtenues par synthèse de gène. Une optimisation de la séquence et une optimisation des codons pour Homo sapiens a été réalisée selon des techniques bien connues (SEQ ID NO :82). Dans le cas du FX muté fusionné au fragment Fc (FX-Fc muté), une séquence peptide signal générique est ajoutée en 5’ de la séquence du propeptide afin de permettre sa sécrétion dans le milieu extracellulaire.

- Insertion de la furine dans le vecteur d’expression bicistronique HKgenEFss :

La séquence ADN de la furine est extraite du vecteur de clonage par PCR d’assemblage en utilisant les couples d’amorces suivants :

5fùrine-l ET Furine2 / amplicon de 1044pb.

Furine 1 et furine4 : amplicon de 381pb

Furine3 et furineô : amplicon de 442pb

Furine5 et 3Furine-l : amplicon de 674pb

La PCR d’assemblage finale est réalisée avec les amorces 5furine-l et 3furine-l permettant d’obtenir un fragment de 2460 pb.

Ce fragment est ensuite inséré par ligation « in fusion » dans un vecteur bicistronique générique préalablement digéré par les enzymes de restriction Nhe I-Ascl.

Après une étape de transformation bactérienne, les colonies sont criblées par PCR en utilisant les amorces HGH4 et elf4g-l (amplicon de 2629 pb). Sur les clones positifs, l’intégrité de la séquence ADN est vérifiée par séquençage avec les amorces HGH4 et 5EFla.

Le clone bactérien final est isolé, sauvegardé en glycérol et amplifié afin d’extraire le plasmide HKgenEFss-furine (kit de préparation de plasmide tel que réf : 740424, Macherey-Nagel)

- Insertion du FX muté fusionné au fragment Fc des IgGl (FX-Fc muté) dans le vecteur d’expression bicistronique HKgenEFss-Furine :

La séquence ADN du FX-Fc muté est extraite du vecteur de clonage par digestion au niveau des sites de restriction Spel - Xbal. Le fragment obtenu de 2319 pb est ensuite purifié sur gel avec le kit Nucleospin extract II (réf : 636972, Macherey-Nagel) puis cloné par ligation dans le vecteur HKgenEFss-furine, préalablement digéré au niveau des sites de restriction Spel - Xbal et déphosphorylé.

Après une étape de transformation bactérienne, les colonies sont criblées par PCR en utilisant les amorces 5EFla et 2BghpA (amplicon de 2467 pb). Sur les clones positifs, l’intégrité de la séquence ADN est vérifiée par séquençage avec les amorces HGH4, GAI et 5EFla.

Le clone bactérien final est isolé, sauvegardé en glycérol et amplifié afin d’extraire le plasmide HKgenEFss-FX-Fcmuté-furine (kit de préparation de plasmide tel que réf : 740424, Macherey-Nagel)

Dans le cas de transfection cellulaire stable, le plasmide HKgenEFss-FX-Fcmuté-furine est linéarisé par l’enzyme de restriction EcoRV.

Séquences des amorces :

5furine-l : TCTTCCATTTCAGCTAGCGCCGCCACCATGGAACTGAGAC

3furine-l : GATCCTCGGCGCGCCCTATCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGC

Furinel : GAAGCCTGCTCTAGTTCTCTGGCTACC

Furine2 : GGTAGCCAGAGAACTAGAGCAGGCTTC

Furine3 : GAAGTGCATCATTCATATCCTGACCGAG

Furine4 : CTCGGTCAGGATATGAATGATGCACTTC

Furine5 : GCAAGACACTGACAAGTTCACAGGCC

Furineô : GGCCTGTGAACTTGTCAGTGTCTTGC elf4g-l : ATTCGAGATCCAAACCAAGGAG

HGH4 : AACTTCCAGGGCCAGGAGAG

5EFla : GTGGAGACTGAAGTTAGGCCAG

2BghpA : CAGATGGCTGGCAACTAGAA

GAI : GCCCCTGATAGCATCACATGGAAG

Exemple 2 : Production du FX muté et du FX-Fc muté dans la lignée de production CHO-S Freestyle

1. Réactifs

Milieu de culture proCHO4

L-glutamine

Milieu de transfection des cellules CHO-S : Opti-Pro SFM

Vitamine Kl

2. Protocole

Les FX et FX-Fc mutés ont été produits dans des cellules eucaryotes CHO-S (Invitrogen).

Les CHO-S ont été cultivées en milieu proCHO4, supplémenté de 4 mM de Lglutamine, en conditions agitées à 135 rpm en atmosphère contrôlée (8% CO₂) à 37°C. Les protéines ont été produites soit à partir de clones ou pools stables obtenus par clonage cellulaire en dilution limite, soit par expression transitoire dans des cellules transfectées à l’aide d’un agent de lipofection.

Pour ces dernières, la veille du jour de transfection, les cellules ont été ensemencées à une densité de 6.10⁵ cellules/ml. Le jour de la transfection, l’ADN et l’agent de transfection (AT) ont été pré-incubés séparément en milieu Opti-Pro SFM durant 5 minutes puis mélangés et incubés durant 20 minutes pour permettre la formation du complexe ADN/AT. L’ensemble a été ajouté à une préparation cellulaire de 1.10⁶cellules/ml dans un volume de 30 ml.

Dans le cas des co-transfections, les 2 vecteurs (contenant soit le FX muté soit la furine) ont été ajoutés à différents ratios pour obtenir une quantité totale d’ADN de 20-45 pg. Immédiatement après la transfection, la vitamine Kl (5 pg/ml) a été ajoutée dans le milieu. Les taux de transfections ont été évalués le lendemain de la transfection à l’aide d’un plasmide contrôle exprimant la GFP.

Une fois les cellules transfectées ou sélectionnées, les productions ont été réalisées en mode « batch » durant 7 jours. En fin de production, les cellules et le surnageant ont été séparés par centrifugation. Les cellules ont été éliminées et le surnageant a été récolté, filtré en 0.22pm, concentré 10X puis congelé.

Exemple 3 : Production du FX muté et du FX-Fc muté dans la lignée de production HEK293 FreeStyle

1. Réactifs

Milieu de culture Freestyle™ F17

L-glutamine

Milieu de transfection des cellules HEK : Opti-MEM

Vitamine Kl

2. Protocole

Le facteur X de type sauvage et les FX modifiés ont été produits dans des cellules eucaryotes HEK 293 Freestyle (HEK 293F) en expression transitoire.

Les HEK 293F ont été cultivées en milieu F17, supplémenté de 8 mM de L-glutamine, en conditions agitées à 135 rpm en atmosphère contrôlée (8% CO₂) à 37°C. La veille du jour de transfection, les cellules ont été ensemencées à une densité de 7.10⁵ cellules/ml.

Le jour de la transfection, l’ADN (30 pg) et 60 pl d’agent de transfection (AT) ont été pré-incubés séparément en milieu Opti-MEM durant 5 minutes puis mélangés et incubés durant 20 minutes pour permettre la formation du complexe ADN/AT. L’ensemble a été ajouté à une préparation cellulaire de 1.10⁶ cellules/ml dans un volume de 30 ml.

Dans le cas des co-transfections, les 2 vecteurs (contenant soit le FX muté soit la VKOR) ont été ajoutés à différents ratios pour obtenir une quantité totale d’ADN de 2030 pg. Immédiatement après la transfection, la vitamine Kl (5 pg/ml) a été ajoutée dans le milieu. Les taux de transfections ont été évalués le lendemain de la transfection à l’aide d’un plasmide contrôle exprimant la GFP (Green Fluorescent Protein). Les productions ont été réalisées en mode « batch » durant 7 jours. En fin de production, les cellules et le surnageant ont été séparés par centrifugation. Les cellules ont été éliminées et le surnageant a été récolté, filtré en 0.22pm, concentré 10X puis congelé.

Exemple 4 : Purification des FX et FX-Fc mutés issus de CHO-S ou de HEK 293F sur une colonne d’aptamères capable de fixer le domaine Gla du facteur X

1. Protocole

Le surnageant de culture concentré issu de CHO-S ou de HEK 293F a été décongelé à 37°C et dilué (V/V) en Tris-HCl 50 mM pH 7.5. Du gel QAE Sephadex 0.25% (wt/vol) a ensuite été ajouté et l’ensemble a été agité au moins 1 heure à +4°C. Le mélange est décanté durant 15-30 min à température ambiante et le surnageant écarté. Le gel est coulé dans un corps de colonne et le matériel lié élué par du Tris 50 mM pH 7.5, NaCl 500 mM. Les fractions protéiques ont ensuite été diluées au Vi en tampon d’équilibration (Tris HCl 50 mM, CaCb 10 mM, pH 7,5) puis purifiées sur une colonne d’aptamère anti-Gla qui a été préalablement équilibrée dans le même tampon. La colonne a été lavée en tampon d’équilibration. Le FX a ensuite été élué par un tampon Tris HCl 50 mM, EDTA 10 mM, pH 7,5. La colonne a été replacée en tampon d’équilibration avant stockage à 4°C. Le FX a été traité par 2 mM de PMSF, concentré, et stocké à -80°C.

Les produits purifiés ont ensuite été séparés sur gel dénaturant de polyacrylamide 412% (Gel NuPAGE Novex Bis-Tris ; InVitrogen) en tampon à 200 V pendant 50 min puis coloré par une solution de PAGE-Blue (Nu PAGE MOPS SDS running buffer; InVitrogen).

2. Résultats

Le FX muté et le FX-Fc muté produit dans CHO-S et aptamopurifiés ont été visualisés après coloration au PAGE-Blue. En contrôle, du facteur X plasmatique (pdFX ; 60 kDa) a été déposé (Figure 3, piste 2). Le FX muté migre à 65 kDa, légèrement moins que le pdFX, dû à la présence d’un peptide supplémentaire (Figure 3, piste 3). Le FX-Fc à quand à lui une migration très ralentie qui correspond à un poids moléculaire d’environ 220 kDa. Il est composé principalement de deux FX mutés et d’un fragment Fc complet. Alors que le FX muté apparaît après purification, sous une seule forme moléculaire, le FX-Fc muté montre la présence d’une bande minoritaire supplémentaire à environ 130 kDa. Compte tenu de ce poids moléculaire, il s’agit d’une molécule de FX-Fc qui ne contient qu’un seul FX muté greffé au Fc complet. Cette bande minoritaire ne gêne pas l’analyse des deux produits.

Le FX muté et le FX-Fc muté produit dans HEK 293F et aptamopurifiés ont été visualisés après coloration au PAGE-Blue (Figure 4). Le FX dérivé du plasma migre avec un poids moléculaire attendu de 68 kDa sous la forme d’une bande homogène (piste 4). Après réduction par le β-mercaptoéthanol, les chaînes lourde et légère du FX sont séparées et migrent respectivement à 50 kDa et 18,5 kDa (piste 5). Le FX muté produit en HEK 293F migre à 61 kDa (piste 1). Compte tenu de la quantité de produit chargé, il n’est pas possible de voir la différence de migration avec le FX plasmatique. Par ailleurs, la surcharge de produit montre la présence de quelques bandes contaminantes minoritaires. Le FX-Fc muté purifié a ensuite été visualisé sous forme native (piste 6) ou réduite après un traitement au β-mercaptoéthanol (piste 7). La forme FX-Fc muté purifiée migre à 223 kDa, comme la molécule produite en CHO, et s’accompagne de produits contaminants eux aussi minoritaires. Notamment, une bande à 250 kDa et une bande à 136 kDa qui, disparaissent après la réduction car constituées des fragments du FX-Fc et ne gênent pas l’analyse.

Exemple 5 : Mesure en temps de génération de thrombine (TGT) de la capacité procoagulante des facteurs X variants issus de CHO: Activation de la voie extrinsèque de la coagulation (FT 0.5 pM/PL 4 uM) en plasma déficient en FVIII

1. Protocole expérimental

1.1. Réactifs

Thrombin calibrator, PPP reagent low, CK-Prest, Fluca Kit (Fluo-buffer + Fluosubstrat) et le PNP étaient disponibles dans le commerce, par exemple chez Stago. Le plasma déficient en FVIII (e.g. Siemens Healthcare) et le Facteur VIII recombinant humain de contrôle provient de chez Baxter (Advate).

1.2, Protocole

Le test de génération de thrombine consiste à activer la coagulation ex vivo à l’aide d’un mélange de facteur tissulaire et de phospholipides (activation de la voie extrinsèque de la coagulation) et à mesurer ensuite la concentration et la quantité maximale de thrombine générée au cours du temps ainsi que sa vitesse de formation (vélocité). Les tests de génération de thrombine ont été réalisés sur 80 μΐ d’un pool de plasma contenant du produit purifié ou les contrôles, en présence de 20 μΐ de réactif PPP contenant au final 0.5 pM de Facteur Tissulaire (FT) et 4 μΜ de phospholipides (PL). Différents plasmas peuvent être utilisés : plasma normal ou déficient en facteur VIII.

La réaction a été démarrée par l’ajout de 20 pL de Fluca-kit (substrat + CaCl₂) qui constitue le début de la mesure de l’apparition de thrombine. L’apparition de fluorescence a été mesurée sur un fluorimètre de type Fluoroskan Ascent (ThermoLabsystems) à une longueur d’onde d’excitation de 390 nm et à une longueur d’onde d’émission de 460 nm. Les thrombinogrammes (courbes représentant l’intensité de fluorescence en fonction du temps) ont ensuite été analysés grâce au logiciel Thrombinoscope™ qui transforme la valeur de fluorescence en nM de thrombine par calcul comparatif.

2, Résultats

Les plasmas Unicalibrator (ou plasma normal lyophilisé), ainsi que les plasmas déficients en FVIII reconstitués par 0, 0.1 ou 1 U/ml de FVIII recombinant ont été utilisés comme témoins. Comme attendu suite à l’activation de la coagulation par le facteur tissulaire, le plasma déficient en FVIII (o) a donné le signal le plus faible, correspondant au bruit de fond de l’expérience (Figure 5). Le plasma Unicalibrator (·) a fourni un signal plus faible que le plasma déficient en FVIII reconstitué par la concentrations de FVIII 1 U/ml () mais proche de celle de 0.1 U/ml FVIII (□).

Une réponse en fonction de la dose a été observée pour le FX variant avec un temps de latence qui se raccourcit lorsque la dose augmente et une amplitude qui augmente. L’amplitude du signal atteint et dépasse la reconstitution par 1 U/ml de FVIII suggérant que le FX muté permet de normaliser la coagulation. Ainsi la quantification de la dose totale de thrombine formée (ETP), la dose maximale de thrombine (pic) et la vélocité de la formation de thrombine montrent une efficacité croissante avec la dose et capable de rivaliser avec celle obtenue avec un plasma normal (Tableau 1 ; PN)

Le temps de latence reste toutefois augmenté par rapport à une initiation de la coagulation normale.

Le pouvoir coagulant du FX-Fc muté a ensuite été évalué de la même manière avec les mêmes contrôles. Dès 2 pg/ml, le FX-Fc muté (Δ) restaure une quantité normale de thrombine ainsi que plus de 80% du maximum de thrombine généré (Figure 6 ; Tableau 1). Seule la vélocité reste moins forte de l’ordre de 60 %.

En conséquence, le FX-Fc muté produit dans CHO est beaucoup plus efficace que la molécule de FX muté.

Si 10 pg/ml de FX muté (soit 170 nM) corrigent la déficience en génération de thrombine seuls 2 pg/ml de FX-Fc muté suffisent soit une molarité de 9 nM. Le FX-Fc muté est donc 19X plus efficace tout en comprenant 2 molécules de FX mutées par moles. Ramené à l’activité du FX muté, le fait de dimériser un FX, notamment muté selon l’invention, par exemple en greffant la molécule sur un fragment Fc permettant le rapprochement dans l’espace des 2 molécules de FX, lui permet d’augmenter son activité molaire de 9,5 fois.

Tableau 1 : Propriétés correctrices de la génération de thrombine des FX muté et FX-Fc muté issus de CHO-S

Espèce moléculaire	ETP (% de PN)	Hauteur du pic (% de PN)	Vélocité (% de PN)
FX muté (10 Pg/ml)	85,2	56,9	24,6
FX muté (20 pg/ml)	87,3	86,1	56,6
FX muté	90,70	108,8	94,3

(30 gg/ml)
FX muté (40 gg/ml)	90,77	121,8	129,1
FX muté (50 gg/ml)	90,71	132,6	158.0
FX-Fc muté (2gg/ml)	98,04	84,18	59,76
FX-Fc muté (4 gg/ml)	98,53	83,79	57,70

Données issues des figures 5 et 6

Exemple 6 : Mesure en temps de génération de thrombine (TGT) de la capacité procoagulante des facteurs X variants issus de HEK 293F: Activation de la voie extrinsèque de la coagulation (FT 0.5 pM/PL 4 uM) en plasma déficient en FVIII

1. Protocole expérimental

Le protocole expérimental de l’évaluation du temps de génération de thrombine est identique à celui décrit pour l’exemple 5.

2. Résultats

Les plasmas Unicalibrator et déficient en FVIII reconstitués par 0, 0.1 ou 1 U/ml de FVIII recombinant ont été utilisés comme témoins. Comme attendu suite à l’activation de la coagulation par le facteur tissulaire, le plasma déficient en FVIII (o) a donné le signal le plus faible, correspondant au bruit de fond de l’expérience (Figure 7). Le plasma Unicalibrator (·) a fourni un signal intermédiaire entre le plasma déficient en FVIII reconstitué par les concentrations de FVIII (0.1 (□) ou 1 U/ml (). Une correction importante est obtenue avec le FX muté à partir de 20 pg/ml (Figure 7). En doublant la dose, le produit ne confère pas d’augmentation significative de la génération de thrombine totale. Toutefois à 40 pg/ml, la quantité maximale de thrombine (pic) et la vélocité augmentent modérément (Tableau 2).

Lorsque le FX-Fc muté produit en HEK 293 F a été étudié, une correction maximale a été obtenue dès la dose de 2 pg/ml (Tableau 2, Figure 8). La dose de 4 pg/ml ne permet 34 pas d’augmenter significativement la quantité de thrombine formée mais permet d’augmenter la quantité maximale de thrombine fournie (pic) et la vélocité de cette formation avec des valeurs par rapport à un plasma normal identiques à celles obtenues avec 20 pg/ml de FX muté (Tableau 2).

En plasma déficient en FVIII, le FX-Fc muté permet d’obtenir un signal identique à celui du FX muté à une concentration massique 10X moindre. Avec les produits issus de HEK 293F, 2 pg/ml de FX-Fc muté (soit 9 nM) sont aussi efficaces que 20 pg/ml de FX muté (soit 340 nM). Le FX-Fc muté est donc 37X plus efficace en molarité et ramener à la mole de FX muté 18.5X plus efficace. En conséquence, le rapprochement dans l’espace, notamment par la dimérisation, de deux molécules de FX muté par l’intermédiaire d’un fragment Fc, augmente de manière très importante l’activité procoagulante du FX muté et ce quelle que soit la lignée exprimant la molécule (Tableau 3).

Tableau 2 : Propriétés correctrices de la génération de thrombine des FX muté et FX-Fc muté issus de HEK 293F

Espèce moléculaire	ETP (% de PN)	Hauteur du pic (% de PN)	Vélocité (% de PN)
FX muté (20 pg/ml)	99,3	78,3	44,0
FX muté (40 pg/ml)	98,3	83,1	53,6
FX-Fc muté (2 pg/ml)	105,17	79,18	47,57
FX-Fc muté (4 pg/ml)	108,95	85,74	57,35

Données issues des figures 7 et 8

Tableau 3 : Comparaison des propriétés correctrices de la génération de thrombine des FX muté et FX-Fc muté issus de CHO-S et HEK 293F

Espèce moléculaire	Equivalent de correction en CHO-S (nM)	Amélioration de l’activité FX	Equivalent de correction en HEK293 (nM)	Amélioration de l’activité FX
FX muté	340 nM	IX	170 nM	IX
FX-Fc muté	9 nM	18.5X	9 nM	9.25X

REVENDICATIONS

Claims

1. Dimère d’un variant du facteur X caractérisé en ce que ledit variant du facteur X est fusionné au niveau de l’extrémité C-terminale à au moins un fragment Fc de type sauvage ou à au moins un fragment scFc de type sauvage..

2. Dimère selon la revendication 1, caractérisée en ce que le fragment Fc de type sauvage a la séquence SEQ ID NO :36 ou SEQ JD NO :37, éventuellement suivie d’une lysine en Cterminal.

3. Dimère selon la revendication 1, caractérisée en ce que le fragment scFc de type sauvage a la séquence SEQ ID NO :42.

4. Dimère selon l’une des revendications précédentes, caractérisée en ce que le fragment Fc de type sauvage ou le fragment scFc de type sauvage est muté pour comprendre la mutation T366Y ou Y407T.

5. Dimère selon l’une des revendications précédentes, caractérisé en ce que le variant du facteur X comprend une séquence mutée de SEQ ID NO :1, et comprend en outre à son extrémité N-terminale le peptide signal de séquence SEQ ID NO :7 fusionné à un propeptide différent du propeptide naturel du facteur X.

6. Dimère selon la revendication 5 caractérisé en ce que ladite séquence mutée de SEQ ID NO : 1 comprend une mutation A, B, ou C, dans laquelle :

la mutation A consiste en la substitution des acides aminés 43 à 52 de la séquence SEQ ID NO :1 par la séquence DFLAEGLTPR, la mutation B consiste en l’insertion de la séquence DFLAEGLTPR, entre les acides aminés 52 et 53 de la séquence SEQ ID NO : 1, la mutation C consiste en l’insertion de la séquence DFLAEGLTPR,, entre les acides aminés 52 et 53 de la séquence SEQ ID NO :1, et en la délétion des acides aminés 4 à 13 de la séquence SEQ ID NO : 1.

7. Dimère selon la revendication 6, caractérisé en ce que la séquence mutée de SEQ ID NO :1 comprend la mutation B.

8. Dimère selon l’une des revendications 5 à 7, caractérisé en ce que le propeptide différent du propeptide naturel du facteur X est choisi parmi le propeptide de la thrombine, le propeptide du facteur VII, le propeptide de la protéine C, et leurs versions modifiées.

9. Dimère selon l’une des revendications 5 à 8, caractérisé en ce que le propeptide est choisi parmi les séquences SEQ ID NO : 13, SEQ ID NO : 14, SEQ JD NO : 15 et SEQ ID NO : 16.

10. Dimère selon l’une des revendications 5 à 9, caractérisé en ce que le peptide signal de séquence SEQ ID NO :7 fusionné à un propeptide différent du propeptide naturel du facteur X est choisi parmi les séquences SEQ ID NO : 18, SEQ ID NO : 19, SEQ ID NO :20 et SEQ ID NO :21.

11. Dimère selon l’une des revendications 5 à 10, caractérisé en ce que ledit variant du facteur X comprend, entre le peptide signal de séquence SEQ ID NO :7 fusionné à un propeptide différent du propeptide naturel du facteur X, et la séquence mutée de SEQ ID NO :1, une séquence correspondant à la chaîne légère du facteur X, de préférence la séquence SEQ ID NO :5.

12. Dimère selon l’une des revendications 5 à 11, caractérisé en ce que ledit variant du facteur X comprend, de l’extrémité N-terminale à C-terminale :

b. la séquence SEQ ID NO :5, puis

c. ladite séquence mutée de SEQ ED NO :1, puis

13. Dimère selon l’une des revendications 5 à 11, caractérisé en ce que ledit variant du facteur X comprend, de l’extrémité N-terminale à C-terminale :

a. le peptide signal de séquence SEQ ED NO :7 fusionné à un propeptide différent du propeptide naturel du facteur X, puis

b. la séquence SEQ ID NO :5, puis

c. la séquence SEQ ID NO : 11, puis

14. Dimère selon l’une des revendications 5 à 13, caractérisée en ce que ledit variant du facteur X a la séquence SEQ ID NO :40 ou SEQ ID NO :43.

15. Acide nucléique caractérisé en ce qu’il code pour ledit variant du facteur X selon l’une des revendications 5 à 14.

16. Acide nucléique selon la revendication 15, caractérisé en ce qu’il est choisi parmi les séquences SEQ ID NO :41 et SEQ ID NO :44.

17. Cassette d’expression comprenant l’acide nucléique selon la revendication 15 ou 16.

18. Vecteur d’expression, caractérisé en ce qu’il comprend la cassette d’expression selon la revendication 17.

19. Cellule recombinante comprenant l’acide nucléique selon la revendication 16, ledit acide nucléique étant préférentiellement compris dans le vecteur selon la revendication 18.

20. Dimère selon l’une des revendications 1 à 14 pour son utilisation en tant que médicament.

21. Dimère selon l’une des revendications 1 à 14 pour son utilisation pour traiter les troubles hémorragiques.

22. Procédé de production dudit variant du facteur X du dimère selon l’une des revendications 5 à 14 comprenant :

a) l’expression d’un vecteur polycistronique, de préférence bicistronique, de préférence en présence de vitamine K, dans une cellule hôte, de préférence une cellule HEK, ledit vecteur comprenant un polynucléotide codant pour ledit variant du facteur X du dimère, et un polynucléotide codant pour l’enzyme VKOR, de préférence pour la sous-unité 1 du complexe de vitamine K époxyde réductase (VKORC1) humaine sauvage, de préférence encore une cellule CHO, ledit vecteur comprenant un polynucléotide codant pour ledit variant du facteur X du dimère, et un polynucléotide codant pour l’enzyme furine, ;

b) la culture de ladite cellule hôte ;

c) la récupération du surnageant cellulaire ;

d) optionnellement au moins une des étapes choisies parmi :

la clarification du surnageant, suivi optionnellement d’une étape de filtration, la concentration du surnageant, la neutralisation des protéases activées par l’ajout d’inhibiteurs de protéases ;

e) la purification dudit variant du facteur X par passage du surnageant de production obtenu en c) ou d) sur une colonne d’aptamères capable de se fixer au domaine Gla du facteur X,

f) optionnellement, entre les étapes d) et e) ou après l’étape e), la purification dudit variant du facteur X par passage du surnageant de production obtenu en d) ou e) sur une colonne de chromatographie capable de se fixer au fragment Fc ou scFc.

23. Procédé de production dudit variant du facteur X du dimère selon l’une des revendications 5 à 14, comprenant :

a) l’expression de deux vecteurs d'expression, de préférence en présence de vitamine K, dans une cellule-hôte, de préférence une cellule CHO, l’un des vecteurs comprenant un polynucléotide codant pour ledit variant du facteur X du dimère, et l’autre comprenant un polynucléotide codant pour l’enzyme furine, de préférence encore une cellule HEK, l’un des vecteurs comprenant un polynucléotide codant pour ledit variant du facteur X du dimère, et l’autre comprenant un polynucléotide codant pour l’enzyme

VKOR, de préférence pour la sous-unité 1 du complexe de vitamine K époxyde réductase (VKORC1) humaine sauvage ;

b) la culture de ladite cellule hôte ;

c) la récupération du surnageant cellulaire ;

d) optionnellement au moins une des étapes choisies parmi :

f) optionnellement, entre les étapes d) et e) ou après l’étape e), la purification de la protéine par passage du surnageant de production obtenu en d) ou e) sur une colonne de chromatographie capable de se fixer au fragment Fc ou scFc.

24. Méthode d’augmentation de l’activité coagulante du variant du facteur X selon les revendications 5 à 14 comprenant :

la production dudit variant du facteur X selon les revendications 5 à 14, une étape de dimérisation dudit variant du facteur X selon les revendications 5 à 14.

25. Méthode selon la revendication 24, ledit variant du facteur X selon les revendications 5 à

14 étant fusionné au niveau de l’extrémité C-terminale à au moins un fragment Fc de type sauvage ou à au moins un fragment scFc de type sauvage, et ladite étape de dimérisation correspondant au rapprochement des fragments Fc ou scFc lors de la maturation de la protéine 10 au cours de sa biosynthèse intracellulaire.

26. Méthode selon la revendication 25, ledit facteur de coagulation étant le variant du facteur X de séquence SEQ ID NO :40 ou SEQ ID NO :43.