JP2012254988A - 改変された特異性を有するプロテアーゼを作製する方法およびスクリーニングする方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】基質配列を切断するプロテアーゼを同定する方法であって、該方法が、プロテアーゼ配列のライブラリーを生成する工程であって、該ライブラリーの各メンバーが、野生型骨格配列に対してN個の変異を有するプロテアーゼ骨格を有する、工程;該基質配列を切断する際における該ライブラリーの各メンバーの活性を測定する工程;および各メンバーの該活性を該ライブラリーの平均活性に対して比較する工程であって、それによりどのプロテアーゼが最も高い切断活性を有するかを同定する、工程を包含し、ここでNは正の整数である、方法。
【選択図】図1
Description
(1.骨格の選択)
本発明の別の実施形態では、骨格プロテアーゼが、以下の要件を用いて選択される:1)プロテアーゼは、公知の配列のヒトまたは哺乳動物プロテアーゼである;2)プロテアーゼは、現在の分子生物学技術によって操作され得る;3)プロテアーゼは、適切な宿主において相対的に高いレベルで異種発現され得る;および4)プロテアーゼは、スクリーニングに十分なレベルで化学的にコンピテントな形態(chemicallycompetent form)にまで精製され得る。本発明の他の実施形態では、変異される骨格プロテアーゼは、細胞外に見出されるタンパク質を切断する。この細胞外タンパク質は、例えば、レセプター、シグナリングタンパク質、またはサイトカインである。変異の際に骨格プロテアーゼの2つのファミリーの活性および特異性に影響する残基を、ここに記載する。好ましくは、プロテアーゼに関する三次元構造情報が利用可能である。また、プロテアーゼの初期基質特異性の知識があることが好ましい。また、プロテアーゼがインビトロで活性であり、かつ安定性であること、およびプロテアーゼの高分子モジュレーターの知識が利用可能であることが好ましい。また、病状に影響を及ぼす(例えば、病状のタンパク質エフェクターを不活性化する)のに関連している標的を切断するプロテアーゼが、好ましい。
本発明の別の実施形態では、変化した特異性を有するセリンプロテアーゼが、構造ベースの設計アプローチによって生成される。各プロテアーゼは、活性部位ポケットを並べ、基質と直接接触させる一連のアミノ酸を有する。キモトリプシンファミリー中で、基質と酵素との間の骨格の相互作用は完全に保存されるが、側鎖の相互作用はファミリー中でかなり変動する。活性部位決定基のS1〜S4ポケットを含むアミノ酸の同一性(identity)が、その特定ポケットの基質特異性を決定する。1つのセリンプロテアーゼのアミノ酸を同じ折り畳みの別のプロテアーゼに対して継ぎ合わせることにより、そのプロテアーゼの特異性を他方のプロテアーゼの特異性に改変する。例えば、S2ポケット中99位で小さなアミノ酸に変異させることにより、P2基質位置中の大きな疎水性の残基に対する優先性が付与される。この選択的変異誘発プロセス、続いて基質ライブラリースクリーニングを用いて、種々の疾患と関係するタンパク質に対して新規な基質特異性を有するプロテアーゼが設計される。
パパイン様システインプロテアーゼは、パパインに対する構造類似性によって関連されるチオール依存性エンドペプチダーゼのファミリーである。それらは、2ドメインタンパク質を形成し、これらドメインは、RおよびL(右および左に対して)と示され、そして両ドメインからのループは、基質認識割れ目を形成する。それらは、Cys25、His159、およびAsn175のアミノ酸で構成される触媒性三つ組を有する。セリンプロテアーゼ(これは、基質のβシートコンフォメーションに基づいて標的ペプチドを認識し、タンパク質分解する)とは異なり、プロテアーゼのこのファミリーは、基質認識についての十分に規定されたポケットを有さない。主要な基質認識は、(セリンプロテアーゼにおけるP1残基に比較して)、P2アミノ酸で生じる。
変化した基質認識プロフィールを有する改変体プロテアーゼを作製するために、基質選択性に寄与する三次元構造中のアミノ酸(特異性決定基)が、変異誘発の標的とされる。セリンプロテアーゼについて、ファミリーメンバーの多数の構造は、拡張された基質特異性に寄与する表面残基を規定した(Wangら,Biochemistry2001 Aug 28;40(34):10038−46;Hopfnerら,Structure Fold Des.1999 Aug 15;7(8):989−96;FriedrichらJBiol Chem.2002 Jan 18;277(3):2160−8;Waughら,Nat Struct Biol.2000 Sep;7(9):762−5)。種々のプロテアーゼについての構造決定基を、拡張された特異性が知られていると決定されたファミリーメンバーのサブセット中のアミノ酸の列挙と共に、表3中に列挙する。セリンプロテアーゼについては、一次配列中の以下のアミノ酸は、特異性の決定基である:195、102、57(触媒性三つ組);189、190、191、192、および226(P1);57、58と64との間のループ、および99(P2);192、217、218(P3)、Cys168とCys180との間のループ、215、および97〜100(P4)。
グランザイムBは、キモトリプシン折り畳みセリンプロテアーゼのファミリーのメンバーであり、そしてグランザイムファミリーの他のメンバー(グランザイムC−G、カテプシンG、およびラット肥胖細胞プロテアーゼIIが含まれる)に対して50%より大きな同一性を有する。このタンパク質は、短いα−へリックスによって連結された6本の逆平行鎖のβ−樽型ドメイン2つによるサンドイッチである。触媒性三つ組は、Asp102、His57、およびSer195で構成される。これら表面ループは、α−キモトリプシンに比較した付加および欠失に従って番号付けられ、この構造ファミリーの最も可変の領域を表す。特異性の決定基は、エコチン(ecotin)[IEPD](基質様結合ループを有する高分子インヒビター(Waughら,NatureStruct.Biol))と複合体化したラットグランザイムBの三次元構造によって規定される。特異性のこれらの構造決定基は、以下を含む:Ile99、Arg192、Asn218、Tyr215、Tyr174、Leu172、Arg226、およびTyr151(キモトリプシン番号付けによる)。興味深いことに、セリンプロテアーゼのグランザイムファミリーの他のメンバーは、これらのアミノ酸の2つのみをグランザイムBと共有する。それらは、Tyr215およびLeu172であり、これら2つの残基は、全構造ファミリーにわたってまさにほとんど変動しない。このことは、これらグランザイムの配列同一性は高いが、それらの基質特異性は非常に異なることを示唆する。
表4および5から、ラットグランザイムBにおいて変化されるように選択される特異性の決定基は、以下の通りである:Ser195、Asp102、His57、Ala189、Ser190、Phe191、Arg192、Arg226、Ser58、Gly59、Ser60、Lys61、Ile62、Asn63、Ile99、Gln217、Asn218、Glu169、Ser170、Tyr171、Leu171A(キモトリプシンに比較して1アミノ酸の挿入があることに留意のこと)、Lys172、Asn173、Tyr174、Phe175、Asp176、Lys177、Ala178、Asn179、Glu180、Ile181、Tyr215、Lys97、Thr98、Ile99、およびSer100。
(2.骨格プロテアーゼの変異誘発)
所与のアミノ酸についての所与のサブ部位(S1−S4)の基質優先性を変更するために、結合ポケットを並べる特異性決定基が変異される(個々にまたは組み合わせてのいずれかで)。本発明の1つの実施形態では、飽和変異誘発技術が用いられ、この技術では、ポケットを並べる残基(1つまたは複数)が20の可能なアミノ酸の各々に変異される。これは、Kunkle方法を用いて達成され得る(CurrentProtocols in Molecular Biology,John Wiley and Sons,Inc.,Media Pa.)。簡潔に言えば、所望のコドンでNNSまたはNNKのいずれかのランダム化を含む変異誘発オリゴヌクレオチドプライマーが、合成される。このプライマーは、一本鎖DNA鋳型にアニーリングされ、そしてDNAポリメラーゼが添加されて、鋳型の相補鎖を合成する。連結後、二本鎖DNA鋳型が、増幅のためにE.coliに形質転換される。あるいは、標準的な市販の部位特異的変異誘発キット(例えば、QuikChange(Stratagene))を用いて、1アミノ酸変更がなされる。別の実施形態では、部位特異的アミノ酸変異について当該分野で一般的に知られる任意の方法が使用され得る。
プロテアーゼは、活性または不活性なチモーゲン形態で発現され得る。プロテアーゼは、異種発現系(例えば、E.coli、Pichiapastoris、S.cerevisae、またはバキュロウイルス発現系)中にあり得る。タンパク質は、細胞内環境において発現され得るか、または培地中に分泌され得る。プロテアーゼはまた、インビトロ発現系において発現され得る。改変体プロテアーゼを精製するために、カラムクロマトグラフィーが使用され得る。プロテアーゼは、ニッケルカラムにおける精製のために、C末端6−Hisタグを含み得る。プロテアーゼのpIに依存して、カチオン交換カラムまたはアニオン交換カラムが適切であり得る。プロテアーゼは、それ自体を分解しないように、その触媒活性を最小限にする、低いpH緩衝液中に保存され得る。精製はまた、免疫吸着、ゲル濾過、または当該分野で一般的に用いられる任意の他の精製方法によって成し遂げられ得る。
当業者は、本発明のペプチドおよびライブラリーを調製するために、多くの方法が用いられ得ることを認識する。例示の実施形態では、ライブラリーは、固体支持体に蛍光発生(fluorogenically)タグ化基質ペプチドを付着させることにより、スクリーニングされる。基質ペプチドからの蛍光発生遊離基は、N−Fmocクマリン誘導体を酸不安定性Rinkリンカーに縮合させることにより合成され、ACC樹脂を提供する(BackesらNat Biotechnol.2000 Feb;18(2):187−93)。Fmoc除去により、遊離アミンを生じる。天然アミノ酸、非天然アミノ酸、および改変アミノ酸がこのアミンに結合され得、さらなるアミノ酸の結合により仕上げられ得る。ペプチドの合成が完了した後、ペプチド蛍光発生部分結合体が、固体支持体から切断され得るか、または別に、結合体は、固体支持体につなぎとめられたままであり得る。
本発明の方法を用いて生成されたプロテアーゼ中の必須アミノ酸は、当該分野で公知の手順に従って同定され、このような技術は、例えば、部位特異的変異誘発または活性部位残基の飽和変異誘発である。後者の技術では、特異性の重要な決定基であることが示されているS1−S4ポケットを形成する残基が、あらゆる可能なアミノ酸に変異される(単独または組み合わせのいずれかで)。例えば、Legendreら,JMB(2000)296:87−102を参照のこと。得られた変異体の基質特異性は、ACC位置走査ライブラリーを用いて、および単一基質速度論アッセイによって決定される(Harrisら、PNAS,2000,97:7754−7759)。
1つの実施形態では、プロテアーゼファージディスプレイが、以下に記載されるように、特異的基質配列に対する種々の親和性について変異体プロテアーゼのプールをスクリーニングするために使用される:Legendreら,JMB,2000:296:87−102,およびCoreyら,Gene,1993Jun 15;128(1):129−34。ファージ技術により、タンパク質とそれをコードする遺伝情報との間の物理的な関連が提供される。目的のタンパク質は、細菌性ウイルスの表面コートタンパク質への遺伝的融合物として構築される。ウイルス粒子が細菌宿主において生成される場合、目的のタンパク質が、融合タンパク質として生成され、そしてウイルスの表面上に提示される。そしてその遺伝子が、ウイルスのカプシド粒子内にパッケージングされる。ファージディスプレイランダムタンパク質ライブラリーは、固定化された標的への結合についてスクリーニングされる。ファージのライブラリー(各ファージは、個々の変異体を提示する)は、標的に対する親和性の増強について選別される。セリンプロテアーゼがファージの表面上に提示されており、そしてこの技術は、プロテアーゼ改変体の多様ライブラリーを生成するために、適切な変異誘発技術と合わせて使用される。
本発明の別の実施形態では、酵素的に活性なプロテアーゼの存在についてアッセイするための方法。この方法は、以下を包含する:(a)サンプルをプロテアーゼと、当該プロテアーゼの作用の際に蛍光発生部分がペプチド基質配列から放出されるように接触させる工程であって、それにより蛍光部分を生じさせる、工程;および(b)当該サンプルが蛍光における検出可能な変化を受けているか否かを観察する工程であって、ここで当該検出可能な変化が、当該サンプル中の酵素的に活性なプロテアーゼの存在の指標である、工程。
別の好ましい実施形態では、標的配列を特異的に切断する酵素について、および好ましくは、酵素的に活性なプロテアーゼについて選択されるこれらの方法が使用される。この方法は、以下を包含する:(a)内部クエンチングされた蛍光体を含むランダムペプチドライブラリーであって、ここでは、蛍光体は、例えば、ο−アミノベンゾイルであり、そしてクエンチャーは、例えば、3−ニトロチロシンである;(b)切断について標的とされた配列に対応するペプチド基質配列であって、これはまた、内部クエンチングされた蛍光体を含み、ここでは、蛍光体は、例えば、Cy3Bであり、そしてクエンチャーは、例えば、Cy5Qである;(c)当該ランダムペプチドライブラリーおよびペプチド基質配列を1:1比で混合する工程;(d)当該混合物を改変体プロテアーゼに露出し、次いでο−アミノベンゾイル蛍光に対するCy3B蛍光の比を定量する工程。プロテアーゼが標的ペプチドに対して選択的である場合、これは、標的ペプチドのみを切断し、ランダムライブラリーを切断せず、従って、ο−アミノベンゾイル蛍光に対してCy3B蛍光の比は高くなる。(MeldalおよびBreddam,Anal.Biochem.(1991)195:141−147;GronらBiochemistry(1992)31:6011−6018)。
方法は、拡張された結合サブ部位P2、P3、およびP4の各々で所望の特異性および選択性を有する改変体プロテアーゼを作出するために、反復して繰り返される。いくつかの場合において、セリンプロテアーゼにおける変異は、活性部位(S1−S4)を形成するサブ部位の各々が互いから独立して機能しており、1つのサブ部位での特異性の改変が隣接したサブ部位での特異性にほとんど影響しないことが示された。従って、拡張された結合部位中の基質特異性および選択性の操作は、順次的に成し遂げられ得る。
本発明に従うポリペプチドは、プロテアーゼのアミノ酸配列を含むポリペプチドを含み、その配列が、本明細書中に記載の骨格のいずれか1つにおいて提供される。本発明はまた、変異体または改変体プロテアーゼ、またはそれらの機能的フラグメントを含むが、これらプロテアーゼでは残基のいずれかが、そのプロテアーゼ活性および生理学的機能を維持するタンパク質をなおコードしながらも、本明細書中に記載の骨格のいずれか1つにおいて示される対応残基から変更され得る。好ましい実施形態では、変異は、本明細書中に詳述するように、プロテアーゼのS1−S4領域において生じる。
2つのアミノ酸配列または2つの核酸の相同性パーセントを決定するために、これら配列が最適比較目的に整列される(例えば、第二のアミノ酸または核酸配列との最適な整列のために、ギャップが、第一のアミノ酸または核酸配列の配列中に導入され得る)。次いで、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置のアミノ酸残基またはヌクレオチドが比較される。第一の配列における位置が、第二の配列における対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドによって占められる場合、これら分子は、その位置で相同である(すなわち、本明細書中に使用されるアミノ酸または核酸「相同性」は、アミノ酸または核酸「同一性」と等価である)。
本発明はまた、プロテアーゼキメラまたは融合タンパク質を提供する。本明細書中で使用されるように、プロテアーゼ「キメラタンパク質」または「融合タンパク質」は、非プロテアーゼポリペプチドに作動可能に連結されたプロテアーゼポリペプチドを含む。「プロテアーゼポリペプチド」は、本明細書中に記載の骨格の1つまたはこの骨格の変異体の1つに対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドをいうが、「非プロテアーゼポリペプチド」は、骨格の1つに実質的に相同ではないタンパク質(例えば、その骨格とは異なり、同じ生物または異なる生物に由来するタンパク質)に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドをいう。プロテアーゼ融合タンパク質においては、プロテアーゼポリペプチドは、プロテアーゼタンパク質の全てまたは一部に対応し得る。1つの実施形態では、プロテアーゼ融合タンパク質は、プロテアーゼタンパク質の少なくとも1つの生物学的に活性な部分を含む。別の実施形態では、プロテアーゼ融合タンパク質は、プロテアーゼタンパク質の少なくとも2つの生物学的に活性な部分を含む。なお別の実施形態では、プロテアーゼ融合タンパク質は、プロテアーゼタンパク質の少なくとも3つの生物学的に活性な部分を含む。融合タンパク質においては、用語「作動可能に連結された」は、プロテアーゼポリペプチドと非プロテアーゼポリペプチドとが互いとインフレームに融合されることを示すことが意図される。非プロテアーゼポリペプチドは、プロテアーゼポリペプチドのN末端またはC末端に融合され得る。
本発明はまた、プロテアーゼアゴニスト(すなわち、模倣物)またはプロテアーゼアンタゴニストのいずれかとして機能する、プロテアーゼタンパク質の改変体に関する。プロテアーゼタンパク質の改変体は、変異誘発(例えば、プロテアーゼタンパク質の個別の点変異または短縮化)によって生成され得る。プロテアーゼタンパク質のアゴニストは、プロテアーゼタンパク質の天然に存在する形態の生物学的活性と実質的に同じ活性、またはその生物学的活性のサブセットを保持し得る。プロテアーゼタンパク質のアンタゴニストは、プロテアーゼタンパク質の天然に存在する形態の活性の1つ以上を阻害し得る(例えば、プロテアーゼタンパク質と同じ標的タンパク質を切断することにより)。従って、特異的生物学的効果は、限定された機能の改変体での処置によって誘起され得る。1つの実施形態では、タンパク質の天然に存在する形態の生物学的活性のサブセットを有する改変体での被験体の処置は、被験体において、プロテアーゼタンパク質の天然に存在する形態での処置よりも副作用が少ない。
(アポトーシスを阻害する方法)
また、本発明には、アポトーシスを阻害する方法が含まれる。アポトーシス(これは、プログラムされた細胞死としても公知である)は、発生、加齢、および種々の病状状態において役割を演じる。生物(脊椎動物および無脊椎動物の両方)の発生において、細胞は、通常の形態発生プロセスの部分として特定時に特定位置で死亡する。アポトーシスのプロセスは、いくつかの事象によって特徴付けられるが、これらに限定されない。細胞は、それらの細胞接合および微絨毛を喪失し、細胞質が凝縮し、そして核クロマチンは、多数の別個の塊に縁を付ける。核が断片化するにつれ、細胞質は収縮し、そしてミトコンドリアおよびリボソームは密に圧縮されるようになる。小胞体の拡張およびその原形質膜との融合後、細胞はばらならになって、いくつかの膜結合型小胞、アポトーシス体になり、これらは、通常、隣接する本体によって貪食される。オリゴヌクレオチドフラグメントへのクロマチンの断片化がアポトーシスの最終段階の特徴であるので、DNA切断パターンが、その発生についてのインビトロアッセイとして使用され得る(Cory,Nature367:317−18,1994)。
また、本発明には、アポトーシスを誘発する方法が含まれる。1つの局面では、アポトーシスは、アポトーシスを誘発するのに十分な量でプロテアーゼを投与することにより、その必要のある被験体において誘発される。被験体は、例えば、任意の哺乳動物、霊長類(例えば、ヒト)、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、またはブタであり得る。種々の局面では、被験体は、癌または自己免疫障害に対して感受性である。
野生型ラットグランザイムB構築物を、以前に記載(Harrisら,JBC,1998,(273):27364−27373)されたように調製した。以下の点変異を、pPICZαAプラスミドに導入した:N218A、N218T、N218V、I99A、I99F、I99R、Y174A、Y174V。各変異を、5’AOX領域および3’AOX領域に対するプライマーを用いて配列決定し、続いてX33細胞に形質転換し、ゼオシン(Invitrogen,LaJolla CA)を用いて選択することにより、確認した。各改変体についての発現および精製は、野生型ラットグランザイムBについて以前に記載された方法(Harrisら,JBC,1998,(273):27364−27373)と同一とした。
(配列番号5)。以下を含むポリメラーゼ連鎖反応を行った:野生型二本鎖DNA、変異に重なり合う2つのプライマー、反応緩衝液、dNTP’s、およびDNAポリメラーゼ。アニーリングおよび増幅を30ラウンド行った後、反応を停止させた。酵素DpnIを添加し、改変塩基対を含む野生型DNAを消化し、得られたニックDNA鎖を細菌に形質転換した。ゼオシンに対する選択は、ポジティブクローンのみが増殖することを確実にする。この変異を、グランザイムB遺伝子を配列決定することにより確認した。同じプロトコルを用いて、変異誘発プライマーに適切な変更を加えて、残りのグランザイムB変異体を作製した。
(ACC−樹脂合成)
7−Fmoc−アミノクマリン−4−酢酸を、7−アミノクマリン−4−酢酸をFmoc−Clで処理することにより調製した。7−アミノクマリン−4−酢酸(10.0g、45.6mmol)とH20(228ml)とを混合した。NaHCO3(3.92g、45.6mmol)を少しずつ添加し、続いてアセトン(228ml)を添加した。この溶液を、氷浴を用いて冷却し、そしてFmoc−Cl(10.7g、41.5mmol)を、1時間にわたって攪拌しながら添加した。この氷浴を除去し、そしてこの溶液を終夜攪拌した。ロータリーエバポレーションを用いてアセトンを除去し、そして得られた粘着性の固体を濾過によって採集し、数部分にわたってヘキサンで洗浄した。ACC−樹脂を、RinkAmide AM樹脂と7−Fmoc−アミノクマリン−4−酢酸との縮合によって調製した。Rink Amide AM樹脂(21g、17mmol)をDMF(200ml)で溶媒和した。この混合物を30分間かき混ぜ、そしてフィルターカニューレを用いて濾過し、それに20%ピペリジン(DMF(200ml)中)を添加した。25分間かき混ぜた後、この樹脂を濾過し、そしてDMF(3回、各200ml)で洗浄した。7−Fmoc−アミノクマリン−4−酢酸(15g、34mmol)、HOBt(4.6g、34mmol)、およびDMF(150ml)を添加し、続いてジイソプロピルカルボジイミド(DICI)(5.3ml、34mmol)を添加した。この混合物を終夜かき混ぜ、濾過し、洗浄し(DMF、200mlで3回;テトラヒドロフラン、200mlで3回;MeOH、200mlで3回)、そしてP2O5で乾燥させた。樹脂の置換レベルは、0.58mmol/g(>95%)であった(Fmoc分析により決定)。
個別P1置換Fmoc−アミノ酸ACC−樹脂(約25mg、0.013mmol)をMultiChem96ウェル反応装置のウェルに添加した。樹脂含有ウェルをDMF(0.5ml)で溶媒和した。濾過した後、20%ピペリジン(DMF溶液(0.5ml)中)を添加し、続いて30分間かき混ぜた。反応ブロックのウェルを濾過し、そしてDMF(0.5mlで3回)で洗浄した。ランダム化したP2位を導入するために、Fmoc−アミノ酸の等速性混合物[4.8mmol、10当量/ウェル;Fmoc−アミノ酸、mol%:Fmoc−Ala−OH、3.4;Fmoc−Arg(Pbf)−OH、6.5;Fmoc−Asn(Trt)−OH、5.3;Fmoc−Asp(O−t−Bu)OH、3.5;Fmoc−Glu(O−t−Bu)−OH、3.6;Fmoc−Gln(Trt)−OH、5.3;Fmoc−Gly−OH、2.9;Fmoc−His(Trt)−OH、3.5;Fmoc−Ile−OH、17.4;Fmoc−Leu−OH、4.9;Fmoc−Lys(Boc)−OH、6.2;Fmoc−Nle−OH、3.8;Fmoc−Phe−OH、2.5;Fmoc−Pro−OH、4.3;Fmoc−Ser(O−t−Bu)−OH、2.8;Fmoc−Thr(O−t−Bu)−OH、4.8;Fmoc−Trp(Boc)−OH、3.8;Fmoc−Tyr(O−t−Bu)−OH、4.1;Fmoc−Val−OH、11.3]をDICI(390μl、2.5mmol)、およびHOBt(340mg、2.5mmol)(DMF(10ml)中)でプレ活性化した。この溶液(0.5ml)をウェルの各々に添加した。反応ブロックを3時間かき混ぜ、濾過し、そしてDMF(0.5mlで3回)で洗浄した。ランダム化されたP3位およびP4位を、同様にして組み込んだ。P4アミノ酸のFmocを除去し、そして樹脂をDMF(0.5mlで3回)で洗浄し、そしてAcOH(150μl、2.5mmol)、HOBt(340mg、2.5mmol)、およびDICI(390μl、2.5mmol)(DMF(10ml)中)のキャッピング溶液0.5mlで処理した。4時間かき混ぜたあと、樹脂をDMF(0.5mlで3回)およびCH2Cl2(0.5mlで3回)で洗浄し、そして95:2.5:2.5のTFA/TIS/H2Oの溶液で処理した。1時間インキュベートしたあと、反応ブロックを開いて、96深ウェルタイタープレート上に配し、そしてウェルをさらなる切断溶液(0.5mlで2回)で洗浄した。採集プレートを濃縮し、そして基質含有ウェル中の物質をEtOH(0.5ml)で希釈して、2倍濃縮した。個々のウェルの内容物をCH3CN/H2O混合物から凍結乾燥した。単一基質の収量に基づいて、各ウェル中の基質の総量を内輪に見積もると、0.0063mmol(50%)であった。
数グラム量のP1置換ACC−樹脂を、記載の方法によって合成し得た。Fmoc−アミノ酸置換ACC−樹脂を、96ウェル反応ブロックの57ウェル中に配した:サブライブラリーを、19アミノ酸でなる第二の固定位置(P4、P3、P2)によって示した(システインを省き、ノルロイシンをメチオニンの代わりに用いた)。基質の合成、キャッピング、および切断は、P2、P3、およびP4サブライブラリーについて、等速性混合物ではなく、個々のアミノ酸(5当量のFmoc−アミノ酸モノマー、5当量のDICI、および5当量のHOBt(DMF中))を、空間的に配置されたP2位、P3位、またはP4位に取り込んだことを除いて、前の節の記載と同一とした。
個別速度論測定を、Spectra−MaxDelta蛍光計(fluorimeter)を用いて実施した。各プロテアーゼを、アッセイ緩衝液中50nM〜1μMの間に希釈した。全てのACC基質を、5〜500μMの間にMeSOで希釈し、AMC基質を20〜2000μMの間に希釈した。各アッセイは、5%未満のMeSOを含んだ。酵素活性を、全部で10分の間、それぞれ380nmの励起波長および460nmの放射波長で、15秒毎にモニタリングした。全てのアッセイを、1%DMSO中で実施した。
(レセプター切断)
新鮮に単離された好中球(PMN)を、0.2%ウシ胎児血清(FCS)を有するRPMI1640中1×107細胞/mlで再懸濁し、そしてTNF−RlまたはTNF−R2の茎部領域に特異的なプロテアーゼの種々の濃度とインキュベートした。37℃での1〜40分にインキュベーション後、プロテアーゼインヒビターを添加し、反応を停止させ、そして培地中に放出されたTNF−Rの量を、ELISA(Roche)を用いて定量した。
125I−TNF(40,000cpm)を種々の濃度のプロテアーゼとインキュベートし、次いでこのサンプルをSDS−PAGEサンプル緩衝液中でボイルし、そして12%ポリアクリルアミドゲル上で調べた。ゲルを乾燥し、そして−70℃でX線フィルム(Kodak)に露出させた。
125I−TNFまたはPMNを、上述のように、種々の濃度のプロテアーゼとインキュベートした。正常PMNへのプロテアーゼに露出された125I−TNFの結合、またはプロテアーゼに露出されたPMNへの正常125I−TNFの結合を、シンチレーションを用いて定量した。簡潔に言えば、105細胞を、プロテアーゼインヒビターの存在下で、96ウェルフィルタープレート(Millipore)中の種々の濃度の125I−TNFとインキュベートした。次いで、細胞を真空吸引によって3回洗浄し、次いで、30μlのシンチレーション液(Wallac)を各ウェルに添加した。次いで、シンチレーションをWallac Microbetaシンチレーションカウンターで計数した。(vanKesselら,J.Immunol.(1991)147:3862−3868、およびPorteauら,JBC(1991)266:18846−18853から採用)。
ファージミドを、このファージミドが、(i)M13ファージ形態発生に必要な遺伝子の全てを有し;(ii)パッケージングシグナルを有し(このシグナルは、ファージ複製起点と相互作用して、一本鎖DNAの生産を開始させる);(iii)破壊されたファージ複製起点を有し;そして(iv)アンピシリン耐性遺伝子を有するように、構築する。
(A.P1多様ライブラリー)
(A(i).合成)
個別P1置換Fmocアミノ酸ACC−樹脂(約25mg、0.013mmol)をMulti−Chem96ウェル反応装置のウェルに添加した。樹脂含有ウェルを、DMF(0.5mL)で溶媒和した。20%ピペリジン(DMF溶液(0.5mL)中)を添加し、続いて30分間かき混ぜた。反応ブロックのウェルを濾過し、そしてDMF(3×0.5mL)で洗浄した。ランダム化したP2位を導入するために、Fmoc−アミノ酸の等速性混合物(Ostresh,J.M.ら,(1994)Biopolymers34:1681−9)(4.8mmol,10当量/ウェル;Fmoc−アミノ酸、mol%:Fmoc−Ala−OH、3.4;Fmoc−Arg(Pbf)−OH、6.5;Fmoc−Asn(Trt)−OH、5.3;Fmoc−Asp(O−t−Bu)−OH、3.5;Fmoc−Glu(O−t−Bu)−OH、3.6;Fmoc−Gln(Trt)−OH、5.3;Fmoc−Gly−OH、2.9;Fmoc−His(Trt)−OH、3.5;Fmoc−Ile−OH、17.4;Fmoc−Leu−OH、4.9;Fmoc−Lys(Boc)−OH、6.2;Fmoc−Nle−OH、3.8;Fmoc−Phe−OH、2.5;Fmoc−Pro−OH、4.3;Fmoc−Ser(O−t−Bu)−OH、2.8;Fmoc−Thr(O−t−Bu)−OH、4.8;Fmoc−Trp(Boc)−OH、3.8;Fmoc−Tyr(O−t−Bu)−OH、4.1;Fmoc−Val−OH、11.3)を、DICI(390μL、2.5mmol)、およびHOBt(340mg、2.5mmol)(DMF(10mL)中)でプレ活性化した。溶液(0.5mL)をウェルの各々に添加した。反応ブロックを3時間かき混ぜ、濾過し、そしてDMF(0.5mLで3回)で洗浄した。ランダム化されたP3位およびP4位を、同様にして組み込んだ。P4アミノ酸のFmocを除去し、そして樹脂をDMF(3×0.5ml)で洗浄し、そしてAcOH(150μL、2.5mmol)、HOBt(340mg、2.5mmol)、およびDICI(390μl、2.5mmol)(DMF(10ml)中)のキャッピング溶液0.5mlで処理した。4時間かき混ぜたあと、樹脂をDMF(3×0.5mL)、CH2Cl2(3×0.5ml)で洗浄し、そして95:2.5:2.5のTFA/TIS/H2Oの溶液で処理した。1時間インキュベートしたあと、反応ブロックを開いて、96深ウェルタイタープレート上に配し、そしてウェルをさらなる切断溶液(2×0.5ml)で洗浄した。採集プレートを濃縮し、そして基質含有ウェルをEtOH(0.5ml)で希釈して、2倍濃縮した。個々のウェルの内容物をCH3CN/H2O混合物から凍結乾燥した。単一基質の収量に基づいて、各ウェル中の基質の総量を内輪に見積もると、0.0063mmol(50%)であった。
タンパク質分解酵素の濃度を、280nmで測定した吸光度によって決定した(Gill,S.C.ら,(1989)AnalBiochem 182:319−26)。触媒活性トロンビン、プラスミン、トリプシン、uPA、tPA、およびキモトリプシンの割合を、MUGBまたはMUTMACを用いた活性部位滴定によって定量した(Jameson,G.W.ら,(1973)BiochemicalJournal 131:107−117)。
基質配列におけるP1部位への全てのアミノ酸の付着の可能性を調べるために、P1多様テトラペプチドライブラリーを作出した。P1多様ライブラリーは、20ウェルからなり、これらウェルでは、P1位のみが、全てのアミノ酸(システインを除き、ノルロイシンを含む)であるように系統的に一定に保持された。P2、P3、およびP4位は、ウェルあたり全部で6,859の基質配列について、全てのアミノ酸の等モル混合物からなる。いくつかのセリンおよびシステインプロテアーゼをプロファイリングし、最適なP1アミノ酸の同定についてのこのライブラリーの適用性を調べた。キモトリプシンは、大きな疎水性アミノ酸に対して期待された特異性を示した。トリプシンおよびトロンビンは、P1−塩基性アミノ酸に対して優先性を示した(Arg>Lys)。プラスミンもまた、塩基性アミノ酸に対して優先性を示した(Lys>Arg)。グランザイムB(P1−Asp特異性を有する唯一の既知の哺乳動物セリンプロテアーゼ)は、全ての他のアミノ酸(他の酸性アミノ酸Gluを含む)よりもアスパラギン酸に対して明瞭な優先性を示した。ヒト好中球エラスターゼについてのP1−プロフィールは、アラニンおよびバリンに対して通常の優先性を有する。システインプロテアーゼ、パパイン、およびクルザインは、アルギニンに対して適度の優先性があるが、これらの酵素について知られている広範なP1−基質配列特異性を示した。
所望の特異性プロフィールに適合する変異体プロテアーゼ(基質ライブラリーによって決定)を、所望の切断配列に対応する個別ペプチド基質を用いてアッセイする。個別速度論測定を、Spectra−MaxDelta 蛍光計(Molecular Devices)を用いて実施する。各プロテアーゼをアッセイ緩衝液中50nM〜1μMの間に希釈する。全てのACC基質をMeSOで5〜500μMの間に希釈し、AMC基質を20〜2000μMの間に希釈する。各アッセイは、5%未満のMeSOを含む。酵素活性を、全部で10分の間、380nmの励起波長および460nmの放射波長で、15秒毎にモニタリングする。全てのアッセイを1%DMSO中で実施する。
改変体プロテアーゼをアッセイして、全長タンパク質の背景で提示される場合にそれらが所望の配列を切断することを確認し、そして標的タンパク質の活性をアッセイして、その機能が切断事象によって破壊されたかを検証する。切断事象を、精製された全長タンパク質を改変体プロテアーゼとインキュベートした後にSDS−PAGEによってモニタリングする。タンパク質を、標準クマシーブルー染色を用いて、放射性標識タンパク質を用いるオートラジオグラフィーによって、または適切な抗体を用いるウェスタンブロットによって可視化する。あるいは、標的タンパク質が細胞表面レセプターである場合、標的タンパク質を発現する細胞を改変体プロテアーゼに露出させる。切断事象を、細胞を溶解し、次いでSDS−PAGEによってタンパク質を分離し、続いてウェスタンブロットによって可視化することによりモニタリングする。あるいは、タンパク質分解により放出された可溶性レセプターをELISAによって定量する。
125I−TNF(40,000cpm)を種々の濃度のプロテアーゼとインキュベートし、サンプルをSDS−PAGEサンプル緩衝液中でボイルし、そして12%ポリアクリルアミドゲル上で調べた。ゲルを乾燥し、−70℃でX線フィルム(Kodak)に露出させた。
125I−TNFまたはPMNを、上述のように、種々の濃度のプロテアーゼとインキュベートした。正常PMNへのプロテアーゼに露出された125I−TNFの結合、またはプロテアーゼに露出されたPMNへの正常125I−TNFの結合を、シンチレーションを用いて定量した。簡潔に言えば、105細胞を、プロテアーゼインヒビターの存在下で、96ウェルフィルタープレート(Millipore)中の種々の濃度の125I−TNFとインキュベートした。細胞を真空吸引によって3回洗浄し、そして30μlのシンチレーション液(Wallac)を各ウェルに添加した。シンチレーションをWallac Microbetaシンチレーションカウンターで計数した。(vanKesselら,J.Immunol.(1991)147:3862−3868およびPorteauら,JBC(1991)266:18846−18853から採用)。
切断および不活性化について標的とされるタンパク質を、以下の基準によって同定する:1)そのタンパク質が、病状に関与している;2)そのタンパク質が、病状を処置するための介入の臨界点である、強い証拠がある;3)そのタンパク質のタンパク質分解切断が、その機能を破壊するようである。標的タンパク質内の切断部位を、以下の基準によって同定する:1)それらは、タンパク質の露出表面上に位置する;2)それらは、原子構造または構造推定アルゴリズムによって決定されるような二次構造(すなわち、βシートまたはαへリックス)が欠けている領域中に位置する;これらの領域は、タンパク質の表面上のループまたは細胞表面レセプター上の茎部である傾向がある;3)それらは、その公知の機能に基づいて、タンパク質を不活性化するようである部位に配置される。切断配列は、例えば、多くのセリンプロテアーゼの拡張された基質特異性に適合する4残基長であり得るが、これより長くも短くもあり得る。
腫瘍壊死因子(TNF)は、単球、マクロファージ、およびリンパ球によって主に生成される炎症誘発性サイトカインである。TNFは、2つの表面結合レセプターであるp55腫瘍壊死因子レセプター(TNF−R1)およびp75腫瘍壊死因子レセプター(TNF−R2)のいずれかと相互作用することによってシグナル伝達を開始させる。TNFは、慢性関節リウマチ(RA)の病態生理学において中心的な役割を演じ、そしてRAを有する患者の滑膜および滑液の高濃度で見い出される。TNFシグナリング事象は、他の炎症誘発性サイトカイン(Il−1、Il−6、GM−CSF)の生成を生じ、メタロプロテイナーゼ(例えば、コラゲナーゼおよびストロメライシン)の生成を誘発し、そして破骨細胞の増殖および活性を増大させる;これらの事象の全てが、滑膜炎ならびに組織および骨破壊に至る。両タイプのTNFレセプターとも、それらのリガンド結合能を保持する可溶形態として細胞の表面から脱落する。これらの可溶性TNFRは、インビトロおよびインビボの両方でTNF活性を中和し得、そして天然インヒビターとして作用してTNFシグナリングを弱めると考えられる。
血管内皮増殖因子(VEGF)は、胚形成および成体生活の間に正常に生成される内皮細胞特異的マイトジェンである。VEGFは、種々の正常プロセスおよび病状プロセス(腫瘍発達を含む)において新脈管形成の重大なメディエーターである。腫瘍血管新生は、それが転移し得る段階に腫瘍が進行する生命プロセスである。は、VEGFに対する3つの高親和性の同族レセプターが同定されている:VEGFR−l/Flt−1、VEGFR−2/KDR、およびVEGFR−3/Flt−4。VEGFRは、血管発達の間にシグナリング分子として機能する細胞表面レセプターチロシンキナーゼである。
レセプターチロシンキナーゼのErbBファミリーは、4つのメンバーを含む:EGFR(Her−1)、ErbB2(Her−2)、ErbB3(Her−3)、およびErbB4(Her−4)。全てが、正常な発達に必須であり、正常細胞の機能に関与する。ErbBレセプター、特にEGFRおよびErbB2は、一般的に、ヒト癌の特定の優勢な形態において調節解除される。ErbBシグナリングの調節不全は、種々の機構(遺伝子増幅、レセプター転写を増大させる変異、またはレセプター活性を増大させる変異を含む)によって生じる。内皮増殖因子(EGF)の結合によるErbBレセプターの活性化は、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ(MAPK)およびAkt/ホスホイノシチド3−キナーゼ(PI3−キナーゼ)経路を通して最終的に細胞増殖、分化、および新脈管形成に至る、下流シグナリングを生じる。
上記のタンパク質についてのタンパク質分解切断部位を、以下、表7に示す。
(実施例11.グランザイムBI99A/N218A変異体の切断プロフィール)
図1は、カスパーゼ−3(多くの細胞型のアポトーシス経路に関係しているタンパク質)の配列を示す。野生型グランザイムBは、残基175のアスパラギン酸と残基176のセリンとの間でカスパーゼ3を切断する。グランザイムBの99位と218位での変異が、残基263のアスパラギン酸と残基264のアラニンとの間で切断するように、このプロテアーゼの特異性を変更する。
本明細書中において特定の実施形態を詳細に開示してきたが、これは、単なる例証の目的で例として開示したものであり、続く添付の特許請求の範囲に関して限定されることを意図しない。特に、本発明者らによって、種々の置換、変更、および改変が、特許請求の範囲によって定義される本発明の精神および範囲から逸脱することなく、本発明に対してなされ得ることが企図される。スクリーニング方法、プロテアーゼ骨格、またはライブラリータイプの選択は、本明細書中に記載した実施形態の知識を有する当業者にとって肝要の事項であると考えられる。他の局面、利点、および改変は、以下の特許請求の範囲内であると考えられる。
Claims (44)
- 基質配列を切断するプロテアーゼを同定する方法であって、該方法が、プロテアーゼ配列のライブラリーを生成する工程であって、該ライブラリーの各メンバーが、野生型骨格配列に対してN個の変異を有するプロテアーゼ骨格を有する、工程;該基質配列を切断する際における該ライブラリーの各メンバーの活性を測定する工程;および各メンバーの該活性を該ライブラリーの平均活性に対して比較する工程であって、それによりどのプロテアーゼが最も高い切断活性を有するかを同定する、工程を包含し、ここでNは正の整数である、方法。
- 前記プロテアーゼが、セリンまたはシステインプロテアーゼである、請求項1に記載の方法。
- Nが1である、請求項1に記載の方法。
- Nが1〜5である、請求項1に記載の方法。
- Nが5〜10である、請求項1に記載の方法。
- Nが10〜20である、請求項1に記載の方法。
- 前記プロテアーゼ骨格が、トリプシン、キモトリプシン、サブチリシン、トロンビン、プラスミン、第Xa因子、uPA、tPA、MTSP−1、グランザイムA、グランザイムB、グランザイムM、エラスターゼ、カイメース、パパイン、好中球エラスターゼ、血漿カリクレイン、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子、補体因子セリンプロテアーゼ、ADAMTS13、神経性エンドペプチダーゼ/ネプリライシン、フューリン、およびクルザインからなる群のメンバーの1つのアミノ酸配列を有する、請求項1に記載の方法。
- 標的タンパク質が病状と関係している、請求項1に記載の方法。
- 前記病状が、慢性関節リウマチ、敗血症、癌、後天性免疫不全症候群、気道感染症、インフルエンザ、心血管疾患、および喘息からなる群のメンバーである、請求項8に記載の方法。
- 前記標的タンパク質が、前記病状を引き起こすように関与している、請求項8に記載の方法。
- 標的タンパク質がアポトーシスに関与している、請求項1に記載の方法。
- 前記標的タンパク質がカスパーゼ−3である、請求項11に記載の方法。
- 前記検出されたプロテアーゼの活性が前記ライブラリーの平均活性に比較して少なくとも10倍増大されている、請求項1に記載の方法。
- 前記検出されたプロテアーゼの活性が前記ライブラリーの平均活性に比較して少なくとも100倍増大されている、請求項1に記載の方法。
- 前記検出されたプロテアーゼの活性が前記ライブラリーの平均活性に比較して少なくとも1000倍増大されている、請求項1に記載の方法。
- 以下の工程:
増大された切断活性を有すると同定された、前記プロテアーゼライブラリーの2つ以上のメンバーを提供する工程;第一の骨格における変異と第二の骨格における変異とを組み合わせて、第三の骨格を生成する工程;および該組み合わせが、前記基質配列に関して増大された切断活性を有する組み合わせ特異性プロテアーゼを生じるか否かを同定する工程をさらに包含する、請求項1に記載の方法。 - プロテアーゼにより特異的に切断される基質配列を同定する方法であって、該方法が、基質配列のライブラリーを生成する工程であって、該ライブラリーの各メンバーが、ランダム化されたアミノ酸配列を有する、工程;該プロテアーゼにより該ライブラリーの各メンバーが切断される度合いを測定する工程であって、それにより該プロテアーゼによって、どの基質配列が、該ライブラリーの他のメンバーの平均切断に比較して最も効率的に切断されるかを検出する、工程を包含する、方法。
- 前記プロテアーゼがセリンプロテアーゼである、請求項17に記載の方法。
- 前記基質配列ライブラリーの各メンバーが4アミノ酸長である、請求項17に記載の方法。
- 前記基質配列ライブラリーの各メンバーが5〜10アミノ酸長である、請求項17に記載の方法。
- 前記基質配列ライブラリーの各メンバーが15アミノ酸長である、請求項17に記載の方法。
- 前記基質配列ライブラリーの各メンバーが20アミノ酸長である、請求項17に記載の方法。
- 標的タンパク質が前記基質配列を含む、請求項17に記載の方法。
- 前記標的タンパク質が、病状に関与している、請求項23に記載の方法。
- 前記病状が、慢性関節リウマチ、敗血症、癌、後天性免疫不全症候群、気道感染症、インフルエンザ、心血管疾患、炎症、および喘息からなる群のメンバーである、請求項24に記載の方法。
- 前記標的タンパク質が、前記病状を引き起こすように関与している、請求項24に記載の方法。
- 前記検出された基質配列の切断の効率が、前記ライブラリーの平均活性に比較して少なくとも10倍増大されている、請求項17に記載の方法。
- 前記検出された基質配列の切断の効率が、前記ライブラリーの平均活性に比較して少なくとも100倍増大されている、請求項17に記載の方法。
- 前記検出された基質配列の切断の効率が、前記ライブラリーの平均活性に比較して少なくとも1000倍増大されている、請求項17に記載の方法。
- 病状を有する患者を処置するための方法であって、該方法が、該患者にN個の変異を有する野生型プロテアーゼを投与する工程を包含し、ここで該プロテアーゼが、該病状と関係している標的タンパク質を切断するのに十分な量で投与され、ここで該タンパク質の切断が、該病状の処置をもたらし、そしてここでNは、正の整数である、方法。
- Nが1である、請求項30に記載の方法。
- Nが1〜5である、請求項30に記載の方法。
- Nが5〜10である、請求項30に記載の方法。
- Nが10〜20である、請求項30に記載の方法。
- 前記病状が、慢性関節リウマチ、敗血症、癌、後天性免疫不全症候群、気道感染症、インフルエンザ、心血管疾患、炎症、および喘息からなる群のメンバーである、請求項30に記載の方法。
- 前記プロテアーゼがセリンプロテアーゼである、請求項30に記載の方法。
- 前記標的タンパク質が、前記病状を引き起こす、請求項30に記載の方法。
- 前記患者が哺乳動物である、請求項30に記載の方法。
- 前記患者がヒトである、請求項30に記載の方法。
- 前記標的タンパク質が、腫瘍壊死因子レセプター、インターロイキン−1、インターロイキン−1レセプター、インターロイキン−2、インターロイキン−2レセプター、インターロイキン−4、インターロイキン−4レセプター、インターロイキン−5、インターロイキン−5レセプター、インターロイキン−12、インターロイキン−12レセプター、インターロイキン−13、インターロイキン−13レセプター、p−セレクチン、p−セレクチン糖タンパク質リガンド、サブスタンスP、ブラジキニン、第IX因子、免疫グロブリンE、免疫グロブリンEレセプター、CCR5、CXCR4、糖タンパク質120、糖タンパク質41、CD4、ヘマグルチニン、RSウイルス融合タンパク質、B7、CD28、CD2、CD3、CD4、CD40、血管内皮増殖因子、VEGFレセプター、線維芽細胞増殖因子、FGFレセプター、内皮増殖因子、EGFレセプター、トランスフォーミング増殖因子、TGFレセプター、CCR1、CXCR3、CCR2、Src、Akt、Bcl−2、BCR−Abl、グルカゴンシンターゼキナーゼ−3、cdk−2、およびcdk−4からなる群のメンバーである、請求項30に記載の方法。
- グランザイムBのアミノ酸配列に95%同一のポリペプチドを含む組成物であって、ここで該ポリペプチドが、171位、174位、180位、215位、192位、218位、99位、57位、189位、190位、または226位の少なくとも1つに変異を有する、組成物。
- 前記変異が、99位でイソロイシンがアラニンで置換されている、請求項41に記載の組成物。
- 前記変異が、218位でアスパラギンがアラニンで置換されている、請求項41に記載の組成物。
- 前記変異が、99位でイソロイシンがアラニンで置換され、かつ218位でアスパラギンがアラニンで置換されている、請求項41に記載の組成物。
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