CN107447013A - 检测Kras基因第12、13密码子突变位点的方法及其试剂盒 - Google Patents
检测Kras基因第12、13密码子突变位点的方法及其试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种检测Kras基因第12、13密码子突变位点的方法及其试剂盒，该方法包括步骤：1)提取样本DNA，作为DNA模板；2)利用一组ARMS引物，其上游引物选自SEQ ID NO.1‑8所示序列的任意一种，其下游引物为如SEQ ID NO.9所示序列；如SEQ ID NO.17所示的荧光探针和如SEQ ID NO.18所示的封闭探针，对DNA模板进行荧光PCR扩增；3)检测荧光PCR扩增中的反应体系的荧光强度，并根据荧光强度达到设定的阈值时所需要的循环次数Ct值来判断Kras基因第12、13密码子突变位点的突变。该试剂盒包括：上述ARMS引物、荧光探针和封闭探针。本发明能克服现有测序技术低通量、耗时长、检测能力有限等缺点，且具有快速、通量高、灵敏度高、特异性好等优点。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种检测Kras基因第12、13密码子突变位点的试剂盒。本试剂盒用于石蜡包埋病理组织样本中对人类KRAS基因12号密码子和13号密码子上7种常见突变的定性检测。此外，本发明还涉及一种检测Kras基因第12、13密码子突变位点的方法。
背景技术
KRAS是一种原癌基因，长约35kb，位于12号染色体，是RAS基因家族成员之一，该基因编码的蛋白质与肿瘤的生成、增殖、迁移、扩散以及血管生成均有关系。KRAS基因在各种肿瘤中突变概率很高，常见突变位点为KRAS基因2号外显子的12号密码子和13号密码子，最常见的7个突变热点为：G12C、G12S、G12R、G12V、G12D、G12A、G13D，这7种突变占到了所有突变的98.5％以上。
KRAS基因突变状态直接影响EGFR(表皮生长因子)靶向治疗药物的疗效。KRAS基因野生型患者能从此类药物治疗中获益，而KRAS基因突变的结直肠癌患者治疗效果较差。欧洲药监局和美国FDA明确规定了在使用靶向药物治疗转移性大肠癌患者前必须检测KRAS基因的基因型。中国卫生部公布的《结直肠癌诊疗规范(2010年版)》也规定转移性结直肠癌患者在接受EGFR靶向药物之前须进行KRAS突变检测。
目前，Kras突变检测技术主要有测序技术和定量PCR技术两大类：测序技术中包含一代测序即sanger测序技术和新一代测序技术也称为二代测序技术。其中一代测序技术一般一次只能检测一个位点一个样本，检测通量低且耗时长，并且一代测序只能准确检测某个基因位点纯合(100％)或杂合突变(50％)的突变比例；而二代测序技术，检测通量高，但是检测前有复杂的样本处理及测序文库建立过程，检测后有复杂的生物信息学分析过程，整个检测周期很长，且一般5％-10％以下的突变比例检测如果测序深度不够，会影响检测结果准确性，如果加大测序深度，则二代测序成本会提高很多。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种检测Kras基因第12、13密码子突变位点的方法及其试剂盒。该方法是基于优选扩增反应引物、荧光探针和封闭探针(block探针)的ARMS-qPCR系统的荧光PCR检测方法，其能克服现有一代测序技术低通量、耗时长、检测能力有限的问题，也可以克服二代测序操作繁琐、分析复杂、成本高等缺点。进一步地，由于KRAS基因突变位点与野生型仅有一个碱基差异，易造成检出假阳性以及位点之间的交叉反应，本试剂盒采用了封闭探针的方法。因此本试剂盒具有高效、快速、准确性高、灵敏度高、成本低等优点。
为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
在本发明的一方面，提供一种检测Kras基因第12、13密码子突变位点的方法，包括以下步骤：
1)提取样本DNA，将其作为DNA模板；
2)利用一组ARMS引物，一个如SEQ ID NO.17所示的荧光探针(特异性双环分子信标荧光探针)和一个如SEQ ID NO.18所示的封闭探针，对步骤1)的DNA模板进行荧光PCR扩增(即进行荧光PCR扩增突变基因序列)；所述一组ARMS引物的上游引物选自SEQ IDNO.1-8所示序列的任意一种，其下游引物为如SEQ ID NO.9所示序列；
3)检测荧光PCR扩增中的反应体系的荧光强度，并根据荧光强度达到设定的阈值时所需要的循环次数Ct值来判断Kras基因第12、13密码子突变位点的突变。
作为本发明优选的技术方案，所述步骤1)中，所述样本包括：新鲜组织样本、石蜡包埋组织切片样本。
作为本发明优选的技术方案，所述步骤2)中，所述荧光探针为特异性双环分子信标荧光探针，其环状部分以及探针内部双链结合区可以和靶标序列结合形成一种热力学更稳定的复式结构，通过与特异性引物扩增得到的产物相结合，双环探针环状结构消失，引起荧光的产生。所述荧光探针的5’端和3’端分别连接有荧光基团和淬灭基团；其中，5’端的荧光基团包括：FAM、HEX、CY5或ROX，优选为FAM或ROX；3’端的淬灭基团可包括：BHQ(如BHQ 1等)、Eclipse和TAMRA，优选为BHQ；
作为本发明优选的技术方案，所述步骤2)中，所述荧光PCR扩增的总体积为40μL的反应体系如下：
其中，所述荧光PCR扩增中的2×Premix Ex Taq(Probe qPCR)来自TAKARA公司，水来自LIFE TECH公司。
作为本发明优选的技术方案，所述步骤2)中，所述荧光PCR扩增的反应条件如下：
96℃预变性3分钟，12个循环，95℃变性15秒，70℃退火延伸20秒，64℃退火延伸20秒，72℃延伸10秒；35个循环，95℃变性15秒，70℃退火延伸20秒，64℃退火延伸34秒，72℃延伸10秒；并且35个循环在退火时，检测FAM荧光信号。
作为本发明优选的技术方案，所述步骤2)中，还包括：利用如SEQ ID NO.22-23所示的质控基因引物和SEQ ID NO.24所示的质控基因探针对步骤1)的DNA模板进行荧光PCR扩增。
作为本发明优选的技术方案，所述步骤3)中，判断Kras基因第12、13密码子突变位点的突变的标准为：
检测荧光PCR扩增中的反应体系的FAM荧光信号，以内参基因FAM荧光信号达到设定阈值时，表明上样DNA量在允许范围内，FAM信号结果可信；以FAM达到设定的阈值时所需要的循环次数Ct值作为阴阳性判断的标准，Ct值大于等于35：阴性；Ct值小于35：阳性。
表1 序列
另外，本发明还提供一种用于上述方法的检测试剂盒，其包括：一组ARMS引物，其上游引物选自SEQ ID NO.1-8所示序列的任意一种，其下游引物为如SEQ ID NO.9所示序列；一个如SEQ ID NO.17所示的荧光探针和一个如SEQ ID NO.18所示的封闭探针。
作为本发明优选的技术方案，所述试剂盒还可包括：如SEQ ID NO.21-22所示的质控基因引物和SEQ ID NO.23所示的质控基因探针。
进一步地，所述试剂盒还可包括：PCR反应所需要的试剂，如2×Premix Ex Taq(Probe qPCR)。
本发明中，根据Kras基因第12、13密码子突变位点野生型基因序列和相应突变基因序列，设计一组ARMS引物和一个特异性双环分子信标荧光探针，并配制荧光PCR扩增突变位点基因序列的反应体系，以及用上述引物和特异性双环分子信标荧光探针同时扩增待测的基因序列，利用双环分子信标荧光探针与扩增产物的杂交，检测反应体系的荧光强度，从而最终进行Kras基因第12、13密码子突变位点的检测。
通过分析，本试剂盒中检测最常见的7个突变热点为：G12C、G12S、G12R、G12V、G12D、G12A、G13D，这7种突变占到了所有突变的98.5％以上。这7个热点突变位点中有6个位点为KRAS基因2号外显子的12号密码子的两个相邻的两个位置的突变，因此准确地检测区分这6个位点，优化筛选出可以单独特异地准确区分检测这些位点且不与野生型位点以及其他突变位点发生交叉反应，是一个很重要的技术关键点。针对这个技术关键点，本发明设计了封闭探针(Blocker probe)，封闭探针(Blocker probe)是一段与野生型完全匹配互补的核酸序列。探针序列可以与扩增引物重叠或位于突变位点区域，因此可以封闭野生型模板，降低野生型模板的扩增，提高野生型背景中突变型模板的检出能力。封闭探针对于减小实验过程中的交叉反应，提高检测的特异性起到重要作用。封闭探针在本试剂盒中的使用，使得所有突变位点检测得到了准确可靠的检测特异性结果。
本发明的有益效果如下：本发明能克服现有测序技术低通量、耗时长、检测能力有限等缺点，且具有快速、通量高、灵敏度高、特异性好等优点。
1)通量高：本发明采用的定量PCR技术，尤其是ARMS-荧光定量技术(ARMS-qPCR方法)，可以实现一个样本多位点同时检测，并且一次检测可以多个样本同时操作，可一次性分析10个样本的7个突变位点；
2)灵敏度高：10ng基因组DNA即可完成精准分析；ARMS-qPCR的检测灵敏度可以达到1％准确性；
3)特异性好，精度高，位点之间无交叉反应，检测成功率为100％；
4)污染少：检测过程为闭管检测，减少污染的可能性；
5)操作简单快速，整个检测过程耗时短，90分钟内即可得到检测结果，检测效率很高，成本低。
具体实施方式
以下结合具体实施例对上述方案做进一步说明。应理解，这些实施例是用于说明本发明而不限于限制本发明的范围。
本发明以基因工程构建的突变质粒和野生质粒为模板，构建人类Kras基因12、13外显子突变位点ARMS实时荧光PCR检测体系，以FAM为荧光信号检测对象，通过特异ARMS引物的优化组合以及荧光探针检测体系优化，从而实现快速准确、简单地，通量化检测。
检测Kras基因12、13外显子突变位点的方法，包括以下步骤：
1.针对突变位点设计合成ARMS引物组合和探针
根据Kras基因第12、13外显子突变位点的序列，针对突变位点设计多对ARMS引物组合和探针，通过实验优化，实现高灵敏和特异性检测。突变位点信息详见表2中的带横线的碱基。
针对突变位点序列，应用primer 5.0引物设计软件设计多对ARMS引物组合和探针，引物和探针序列如表2所示。其中，引物Actin forward和Actin reverse作为质控基因引物，探针Actin Probe作为质控基因探针，以进行质控。
表2 引物和探针序列
2、待测样本制备和提取
采用商业化的DNA提取试剂盒提取样本DNA，具体操作参考试剂盒说明书。
3、荧光PCR扩增，建立扩增反应体系
将步骤2中得到的DNA样本(即DNA模板)，经紫外分光光度计检测并读取其含量。将DNA模板稀释至10ng/μL。
按照如下扩增体系进行PCR扩增(总体积40μL)：
其中，所述荧光PCR扩增中的2×Premix Ex Taq(Probe qPCR)来自TAKARA公司，水来自LIFE TECH公司。
实时PCR反应条件为：96℃预变性3分钟，12个循环，95℃变性15秒，70℃退火延伸20秒，64℃退火延伸20秒，72℃延伸10秒；35个循环，95℃变性15秒，70℃退火延伸20秒，64℃退火延伸34秒，72℃延伸10秒；并且35个循环在退火时，检测FAM荧光信号。
4、检测荧光信号，以达到设定阈值所需的循环数Ct值作为结果判断的标准：
其中，以FAM的荧光信号为例，具体如下：
检测反应体系的FAM荧光强度，以actin基因的FAM信号达到设定阈值(12<Ct<20)时，表明DNA上样量在允许范围内，FAM信号可信。以FAM达到设定阈值所需Ct值作为判断标准：Ct值大于等于35：阴性；Ct值小于35：阳性。
实施例1
运用含Kras基因第12、13密码子突变位点的质粒模板(与各待测位点对应)，利用表2中引物和探针，分别进行qPCR以优化选择最佳的ARMS引物。
其中，对于下述表格中涉及的野生型质粒及突变型质粒均可按照常规的质粒构建方法并利用PCR克隆方法制备得到。
1)质粒处理和抽提：
质粒的提取采用TIANGEN(HighPure Plasmid Kit，DP116)的质粒提取试剂盒进行，具体操作步骤详见产品说明书。所提DNA溶解于Tris-HCl中(10mmol/L，pH8.0)，紫外分光光度计检测样本质量并测定浓度。然后，将样本稀释至2000copies/uL。取5μL进行PCR反应。
2)按照如下扩增体系进行PCR扩增(qPCR体系，总体积40μL)
其中，所述荧光PCR扩增中的2×Premix Ex Taq(Probe qPCR)来自TAKARA公司，水来自LIFE TECH公司。
3)PCR反应条件为96℃预变性3分钟，12个循环，95℃变性15秒，70℃退火延伸20秒，64℃退火延伸20秒，72℃延伸10秒；35个循环，95℃变性15秒，70℃退火延伸20秒，64℃退火延伸34秒，72℃延伸10秒；并且35个循环在退火时，检测FAM荧光信号。
4)检测荧光信号，根据Ct值作为结果判断的标准(参考上述)。
5)优化ARMS引物，将表中引物分为38组(见表3)。
表3 引物探针组
下游引物均为Kras-exon12,13-rv，探针均为Kras-exon12,13-probe，组内上游引物同下游引物配对检测相应突变位点。其他qPCR体系中成分固定不变，结果如表4所示，引物组15-22结果最佳。
表4 引物探针优化研究结果
6)灵敏度分析：将质粒模板从2000个拷贝开始稀释，直至稀释至5个拷贝，然后分别对其进行检测，结果表明本发明的荧光PCR方法灵敏度高，引物检测对应质粒样本，25拷贝/40微升即可检出(如表5所示)。
表5 质粒梯度稀释结果
| 检测位点 | 10000拷贝 | 1000拷贝 | 100拷贝 | 25拷贝 |
| M1(G12D) | 20.35 | 24.33 | 28.98 | 30.54 |
| M2(G12A) | 17.83 | 22.19 | 25.32 | 27.06 |
| M3(G12V) | 20.9 | 25.26 | 27.94 | 31.95 |
| M4(G12S) | 20.26 | 24.8 | 29.39 | 31.22 |
| M5(G12R) | 18.74 | 22.61 | 26.67 | 29.12 |
| M6(G12C) | 21.76 | 25.74 | 30.24 | 33.29 |
| M7(G13D) | 22.04 | 25.97 | 28.75 | 33.25 |
| wild | 21.07 | 24.85 | 28.32 | 31.58 |
检测结果表明，本发明的检测体系选择最优的ARMS引物对和探针(即SEQ IDNO.1-9所示的引物和SEQ ID NO.17所示的探针)，可准确识别突变位点，检测的灵敏度可达到25拷贝/40微升。
7)特异性分析：用7个突变位点的引物探针组合分别检测7个位点的质粒标准品，从而获得突变类型之间的交叉反应结果(如表6，表7)。加入K Blocker probe之前M1引物探针与M2质粒，M3质粒，M4质粒，M5质粒，M6质粒，M7质粒均发生交叉反应，M2引物探针与M1质粒，M3质粒发生交叉反应，体系中加入K Blocker probe之后M1引物探针与M2质粒，M3质粒，M4质粒，M5质粒，M6质粒，M7质粒均无交叉反应，M2引物探针与M1质粒，M3质粒的交叉反应消失，特异性显著提高。
表6 加入K Blocker probe之前的交叉反应结果
表7 加入K Blocker probe之后的交叉反应结果
如表6、表7所示，本结果表明，加入K Blocker probe(封闭探针)之后交叉反应减小，反应特异性显著提高。
实施例2
运用本发明检测突变细胞系DNA样本，培养含各突变位点对应细胞系细胞，抽提DNA，利用本发明中特异ARMS引物和荧光探针PCR体系对其检测，并同时进行最低检测限测定。
步骤如下：
1)样本处理和DNA提取：
采用商业化的DNA提取试剂盒提取样本DNA，具体操作参考试剂盒说明书。
样本稀释至10ng/μL。
2)按照如下扩增体系进行PCR扩增(总体积40μL)
其中，上述PCR扩增中的引物为如SEQ ID NO.1-9所示的引物，探针为如SEQ IDNO.17所示的探针。
另外，PCR扩增中的2×Premix Ex Taq(Probe qPCR)来自TAKARA公司，水来自LIFETECH公司。
3)PCR反应条件为：96℃预变性3分钟，12个循环，95℃变性15秒，70℃退火延伸20秒，64℃退火延伸20秒，72℃延伸10秒；35个循环，95℃变性15秒，70℃退火延伸20秒，64℃退火延伸34秒，72℃延伸10秒；并且35个循环在退火时，检测FAM荧光信号。
4)检测荧光信号，根据Ct值作为结果判断的标准(参考上述)。
5)本发明的最低检测限，具体如下：
在扩增反应终体系特定核酸浓度下，检测突变序列所占百分率的最低检测限，结果如表8。
在特定突变序列百分率下，检测反应终体系中核酸浓度的最低检测限，结果如表8。
表8 最低检测限实验结果
6)本结果表明本发明的最低检测限为10ng上样量中可检测到1％的突变。
实施例3
运用本发明检测组织切片样本，66个组织切片样本抽提DNA后，利用本发明中特异ARMS引物和荧光探针PCR体系对其检测，并进行一代测序验证。运用本发明检测组织切片样本，79个组织切片样本抽提DNA后，利用本发明中特异ARMS引物和荧光探针PCR体系对其检测，并进行二代测序验证。
步骤如下：
1)样本处理和DNA提取：
采用商业化的DNA提取试剂盒提取样本DNA，具体操作参考试剂盒说明书。
样本稀释至10ng/μL。
2)按照如下扩增体系进行PCR扩增(总体积40μL)
其中，上述PCR扩增中的引物为如SEQ ID NO.1-9所示的引物以及SEQ ID NO.21-22所示的质控基因引物，探针为如SEQ ID NO.17所示的探针和如SEQ ID NO.23所示的质控基因探针。
另外，PCR扩增中的2×Premix Ex Taq(Probe qPCR)来自TAKARA公司，水来自LIFETECH公司。
3)PCR反应条件为：96℃预变性3分钟，12个循环，95℃变性15秒，70℃退火延伸20秒，64℃退火延伸20秒，72℃延伸10秒；35个循环，95℃变性15秒，70℃退火延伸20秒，64℃退火延伸34秒，72℃延伸10秒；并且35个循环在退火时，检测FAM荧光信号。
4)检测荧光信号，根据Ct值作为结果判断的标准(参考上述)。
5)检测结果表明本发明检测结果同DNA测序结果一致(如表9，表10所示)。
表9 样本检测统计结果
| 样本数 | 突变名称 | qPCR检测结果 | 一代测序结果 | 一致性 |
| 4 | M1 | 35G>A | 35G>A | 一致 |
| 3 | M2 | 35G>C | 35G>C | 一致 |
| 4 | M3 | 35G>T | 35G>T | 一致 |
| 3 | M4 | 34G>A | 34G>A | 一致 |
| 2 | M5 | 34G>C | 34G>C | 一致 |
| 5 | M6 | 34G>T | 34G>T | 一致 |
| 2 | M7 | 38G>A | 38G>A | 一致 |
| 43 | 野生型 | 无突变 | 无突变 | 一致 |
表10 样本检测统计结果
实施例4
根据上述实施例中的检测方法，为了更加简便和快捷地用来检测待测样品(如组织切片)，将本发明的检测方法中所用到的试剂制备成一种试剂盒。
该试剂盒的组分为一组ARMS引物，其上游引物选自SEQ ID NO.1-8所示序列的任意一种，其下游引物为如SEQ ID NO.9所示序列；一个如SEQ ID NO.17所示的荧光探针和一个如SEQ ID NO.18所示的封闭探针。
另外，根据需要，该试剂盒还可包括：如SEQ ID NO.21-22所示的质控基因引物和SEQ ID NO.23所示的质控基因探针。
进一步地，所述试剂盒还可包括：PCR反应所需要的试剂，如2×Premix Ex Taq(Probe qPCR)。
序列表
<110> 上海伯豪生物技术有限公司
<120> 检测Kras基因第12、13密码子突变位点的方法及其试剂盒
<130> HJ17-13722
<160> 23
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tgtatcaaag aatggtcctg 20
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<213> 人工序列(未知)
<400> 23
atctcgtaag gagatcactg ccctgcagtg 30
Claims (10)
1.一种检测Kras基因第12、13密码子突变位点的方法，该方法不包括疾病的诊断和治疗方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)提取样本DNA，将其作为DNA模板；
2)利用一组ARMS引物、一个如SEQ ID NO.17所示的荧光探针和一个如SEQ ID NO.18所示的封闭探针，对步骤1)的DNA模板进行荧光PCR扩增；所述一组ARMS引物的上游引物选自SEQ ID NO.1-8所示序列的任意一种，其下游引物为如SEQ ID NO.9所示序列；
3)检测荧光PCR扩增中的反应体系的荧光强度，并根据荧光强度达到设定的阈值时所需要的循环次数Ct值来判断Kras基因第12、13密码子突变位点的突变。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤1)中，所述样本包括：新鲜组织样本、石蜡包埋组织切片样本；
步骤2)中，所述荧光探针为特异性双环分子信标荧光探针；所述荧光探针的5’端和3’端分别连接有荧光基团和淬灭基团；其中，荧光基团包括：FAM、HEX、CY5和ROX；淬灭基团包括：BHQ、Eclipse和TAMRA。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述荧光基团为FAM或ROX；所述淬灭基团为BHQ。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤2)中，荧光PCR扩增的总体积为40μl的反应体系如下：
5.如权利要求1或4所述的方法，其特征在于：步骤2)中，所述荧光PCR扩增的反应条件如下：
96℃预变性3分钟，12个循环，95℃变性15秒，70℃退火延伸20秒，64℃退火延伸20秒，72℃延伸10秒；35个循环，95℃变性15秒，70℃退火延伸20秒，64℃退火延伸34秒，72℃延伸10秒；并且35个循环在退火时，检测FAM荧光信号。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤2)中，还包括：利用如SEQ IDNO.21-22所示的质控基因引物和SEQ ID NO.23所示的质控基因探针对步骤1)的DNA模板进行荧光PCR扩增。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤3)中，判断Kras基因第12、13密码子突变位点的突变的标准为：
检测荧光PCR扩增中的反应体系的FAM荧光信号，以质控基因FAM荧光信号达到设定阈值时，表明上样DNA量在允许范围内，FAM信号结果可信；以FAM达到设定的阈值时所需要的循环次数Ct值作为阴阳性判断的标准，Ct值大于等于35：阴性；Ct值小于35：阳性。
8.一种用于如权利要求1～7任一项所述的方法的检测试剂盒，其特征在于，包括：一组ARMS引物，其上游引物选自SEQ ID NO.1-8所示序列的任意一种，其下游引物为如SEQ IDNO.9所示序列；一个如SEQ ID NO.17所示的荧光探针和一个如SEQ ID NO.18所示的封闭探针。
9.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括：如SEQ ID NO.21-22所示的质控基因引物和SEQ ID NO.23所示的质控基因探针。
10.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括：2×Premix Ex Taq(Probe qPCR)。
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