CN104762410A - 用于全ras突变检测的引物、探针及检测试剂盒 - Google Patents
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- CN104762410A CN104762410A CN201510215782.5A CN201510215782A CN104762410A CN 104762410 A CN104762410 A CN 104762410A CN 201510215782 A CN201510215782 A CN 201510215782A CN 104762410 A CN104762410 A CN 104762410A
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Abstract
本发明公开了一种用于全RAS突变检测的引物、探针，包括全RAS的特异引物与探针，全RAS的特异引物与探针包括KRAS 2、3、4外显子的27种突变类型及NRAS 2、3、4外显子的23种突变类型。一种用于全RAS突变检测的检测试剂盒，提取DNA样本并进行PCR反应。本发明采用特异的MGB Blocker探针，NRAS和KRAS特异探针和引物，可检测肿瘤组织中DNA中RAS的突变；利用MGB Blocker阻滞NRAS和KRAS非特异性的扩增，提高灵敏度，大于ARMS的1%；可在循环肿瘤DNA中检测RAS的突变；操作简单，检测廉价，可以大规模推广；检测速度快，检测过程大约需要2小时就可完成。
Description
技术领域
本发明涉及一种生物技术领域，尤其涉及一种用于全RAS突变检测的引物、探针及检测试剂盒。
背景技术
RAS基因家族是原癌基因，包括KRAS、NRAS和HRAS三个基因。KRAS基因定位于人12号染色体，在人类肿瘤发生发展过程中起重要的作用。KRAS就像一种分子开关：正常时能控制调控细胞生长的路径；发生异常如KRAS基因突变时，该基因永久活化，使细胞内信号传导紊乱，导致细胞持续生长，并阻止细胞凋亡从而发生癌变。KRAS基因突变发生在肿瘤的早期，并且原发灶和转移灶的KRAS基因高度保持一致。一般认为，KRAS基因状态不会因治疗而发生变化。KRAS基因在多种肿瘤中发生了突变，其发生率在结直肠癌约为40%，胰腺癌为90%以上，肺癌约为15%。KRAS基因突变主要集中发生在第2外显子的12和13密码子（≥90%），这些突变破坏了KRAS蛋白内在的GTPase活性，从而使得KRAS蛋白处于持续活性状态（Fedorenko I V et al.Oncogene.2012）。研究表明检测KRAS基因突变，具有重大的临床意义：KRAS基因突变患者对EGFR抑制剂如西妥昔单抗（Cetuximab）和帕尼单抗（panitumumab）显示无效，只有KRAS野生型患者才被建议接受EGFR抑制剂的治疗（De Roock W et al. Lancet Oncol.2010;11:753-762.）。
NRAS基因定位于人染色体1p13.2，基因全长12438bp，包含7个外显子，为原癌基因。NRAS基因激活构成癌基因，其表达产物NRAS蛋白发生构型及功能的改变，活化状态的Ras蛋白持续地激活PLC产生第二信使，造成细胞不可控制地增殖，恶变（D. Lambrechts et al.Journal of Clinical Oncology 2009: 4020）。
NRAS基因改变主要为点突变, 多发生在以第61密码子为代表的2、3、4外显子。这些密码子编码的氨基酸是Ras蛋白和GTP酶活化蛋白（GAP）的作用位点。突变导致RAS-GTP处于持续激活状态，引起细胞恶性增殖和转移。研究表明：KRAS、NRAS、BRAF基因同为野生型的患者cetuximab治疗效果较好，而NRAS基因突变患者无法从cetuximab治疗中获益（Cecily P. Vaughn et al.GenesChromosomes and Cancer 2011:307-312， M. Di Bartolomeoet al.Targeted Oncology 2014:155-162.）。
2015年NCCN指南明确指明患有侵润性结直肠癌的患者，在利用西妥昔和帕尼单抗等EGFR单抗类药物时要进行全RAS检测（NCCN Clinical Practice Guidelines in Oncology for Colon Cancer. 2015）。目前临床上有的RAS检测产品只包括KRAS基因的第12,13密码子位点检测，检测位点比较少，已远远不能满足临床检测的需要。
发明内容
本发明的目的：提供一种用于全RAS突变检测的引物、探针及检测试剂盒，能检测位点全，与现有技术的KRAS临床检测7种突变类型相比，检测KRAS 27种突变类型、NRAS 23种突变类型，很好的满足了临床的需求；利用了MGB Blocker封闭探针，提高了检测的灵敏度，降低了非专一性结合，使得临床检测结果更好判读。
为了实现上述目的，本发明的技术方案是：
一种用于全RAS突变检测的引物、探针，包括全RAS的特异引物与探针，所述的全RAS的特异引物与探针包括KRAS 2、3、4外显子的27种突变类型及NRAS 2、3、4外显子的23种突变类型。
所述的KRAS外显子2的12，13 外显子位点点突变引物,FAM-MGB Taqman探针以及Blocker封闭的MGB探针具体为：
K35-1B 5-ACTTGTGGTAGTTGGAGCTGA-3 SEQ ID NO.01
K35-3B 5-ACTTGTGGTAGTTGGAGCTGT-3 SEQ ID NO.02
K35-2B 5-CTTGTGGTAGTTGGAGCTGC-3 SEQ ID NO.03
K34-2B 5-AACTTGTGGTAGTTGGAGCTC-3 SEQ ID NO.04
K34-1B 5-AAACTTGTGGTAGTTGGAGCTA-3 SEQ ID NO.05
K34-3B 5-AACTTGTGGTAGTTGGAGCTT-3 SEQ ID NO.06
K38-1B-1 5-TGGTGGTTGGAGCAGGTGA-3 SEQ ID NO.07
K38-2B-1 5-GGTGGTTGGAGCAGGTGC-3 SEQ ID NO.08
K38-3B-1 5-TGGTGGTTGGAGCAGGTGT-3 SEQ ID NO.09
K37-1B 5-TGTGGTAGTTGGAGCTGGTA-3 SEQ ID NO.10
K37-2B 5-TGTGGTAGTTGGAGCTGGTC-3 SEQ ID NO.11
K37-3B 5-TGTGGTAGTTGGAGCTGGTT-3 SEQ ID NO.12
KWT34MGB 5-GGAGCTGGTGGCGTAG-3-MGB SEQ ID NO.13
KR-R 5-AGAATGGTCCTGCACCAGTAATAT-3 SEQ ID NO.14
KR-Taqman FAM-5- CAAGAGTGCCTTGACGATAC-3-BHQ-MGB SEQ ID NO.15；
所述的KRAS外显子3的61 编码子位点点突变引物，FAM-MGB Taqman探针以及Blocker封闭的MGB探针具体为：
K181-1B 5-GATATTCTCGACACAGCAGGTA-3 SEQ ID NO.16
K181-2B 5-ATATTCTCGACACAGCAGGTG-3 SEQ ID NO.17
K182-1B 5-TCTCGACACAGCAGGTCC-3 SEQ ID NO.18
K182-2B 5-TCTCGACACAGCAGGTCG-3 SEQ ID NO.19
K182-3B 5-ATTCTCGACACAGCAGGTCT-3 SEQ ID NO.20
K183-1B 5-TCTCGACACAGCAGGTCAC-3 SEQ ID NO.21
K183-2B 5-TCTCGACACAGCAGGTCAT-3 SEQ ID NO.22
K181R 5-AATACACAAAGAAAGCCCTCCC-3 SEQ ID NO.23
K181WTMGB 5-GACACAGCAGGTCAAGAGG-3-MGB SEQ ID NO.24
K181taqman FAM-5-AATGAGGGACCAGTACATG-3-BHQ-MGB SEQ ID NO.25；
所述的KRAS外显子4的117编码子位点点突变引物,FAM-MGB Taqman探针以及Blocker封闭的MGB探针具体为：
K349-1B-1 5-ACCTATGGTCCTAGTAGGAAATG-3 SEQ ID NO.26
K350-1B-1 5-ACCCTATGGTCCTAGTAGGAAATAG-3 SEQ ID NO.27
K351-1B-1 5-CCTATGGTCCTAGTAGGAAATAAC-3 SEQ ID NO.28
K351-2B-1 5-CCTATGGTCCTAGTAGGAAATAAT-3 SEQ ID NO.29
K349R 5-ACTTCTTGCTAAGTCCTGAGCCT-3 SEQ ID NO.30
KWT349MGB1 5-GTCCTAGTAGGAAATAAATGTGA-3-MGB SEQ ID NO.31
K349Taqman FAM-5-ATTTGCCTTCTAGAACAGTAG-3-BHQ-MGB SEQ ID NO.32；
所述的KRAS外显子4的146编码子位点点突变引物，FAM-MGB Taqman探针以及Blocker封闭的MGB探针具体为：
K436-1B 5-GTTACTTACCTGTCTTGTCTTTGT-3 SEQ ID NO.33
K436-2B 5-TACTTACCTGTCTTGTCTTTGG-3 SEQ ID NO.34
K437-1B 5-TGTTACTTACCTGTCTTGTCTTTC-3 SEQ ID NO.35
K437-2B 5-TGTTACTTACCTGTCTTGTCTTTA-3 SEQ ID NO.36
K436R 5-TGATTTGCCTTCTAGAACAGTAGAC-3 SEQ ID NO.37
KWT436MGB 5-CTGTCTTGTCTTTGCTGATG-3-MGB SEQ ID NO.38
K436Taqman FAM-5- ACTTCTTGCTAAGTCCTGAGC-3-BHQ-MGB SEQ ID NO.39；
所述的NRAS外显子2的12，13 编码子位点点突变引物,FAM-MGB Taqman探针以及Blocker封闭的MGB探针具体为：
N34-1B 5-TGGTGGTGGTTGGAGCAA-3 SEQ ID NO.40
N34-2B 5-TGGTGGTGGTTGGAGCAC-3 SEQ ID NO.41
N34-3B 5-TGGTGGTGGTTGGAGCAT-3 SEQ ID NO.42
N35-1B 5-GGTGGTGGTTGGAGCAGA-3 SEQ ID NO.43
N35-2B 5-GGTGGTGGTTGGAGCAGC-3 SEQ ID NO.44
N35-3B 5-GGTGGTGGTTGGAGCAGT-3 SEQ ID NO.45
N37-1B 5-GTGGTGGTTGGAGCAGGTA-3 SEQ ID NO.46
N37-2B 5-GGTGGTTGGAGCAGGTC-3 SEQ ID NO.47
N37-3B 5-GTGGTGGTTGGAGCAGGTT-3 SEQ ID NO.48
N38-1B 5-GGTGGTTGGAGCAGGTGA-3 SEQ ID NO.49
N38-2B 5-GTGGTTGGAGCAGGTGC-3 SEQ ID NO.50
N38-3B 5-GGTGGTTGGAGCAGGTGT-3 SEQ ID NO.51
N34R 5-CTCACCTCTATGGTGGGATCATAT-3 SEQ ID NO.52
N34taqman FAM-5- AAGCGCACTGACAATCC-3-BHQ-MGB SEQ ID NO.53
NWT34MGB 5-GTTGGAGCAGGTGGTGTTG-3-MGB SEQ ID NO.54；
所述的NRAS外显子3的61 编码子位点点突变引物,FAM-MGB Taqman探针以及Blocker封闭的MGB探针具体为：
N181R 5-ATGGCAAATACACAGAGGAAGC-3 SEQ ID NO.55
N181-1B 5-GACATACTGGATACAGCTGGAA-3 SEQ ID NO.56
N181-2B 5-GACATACTGGATACAGCTGGAG-3 SEQ ID NO.57
N181-3B 5-GACATACTGGATACAGCTGGAT-3 SEQ ID NO.58
N182-1B 5-CATACTGGATACAGCTGGACC-3 SEQ ID NO.59
N182-2B 5-ATACTGGATACAGCTGGACG-3 SEQ ID NO.60
N182-3B 5-ACATACTGGATACAGCTGGACT-3 SEQ ID NO.61
N183-1B 5-CATACTGGATACAGCTGGACAC-3 SEQ ID NO.62
N183-2B 5-CATACTGGATACAGCTGGACAT-3 SEQ ID NO.63
N181Taqman FAM-5- AATACATGAGGACAGGCG-3-BHQ-MGB SEQ ID NO.64
NWT181MGB 5-GATACAGCTGGACAAGAAGAG-3-MGB SEQ ID NO.65；
所述的NRAS外显子4的146编码子位点点突变引物,FAM-MGB Taqman探针以及Blocker封闭的MGB探针具体为：
N436-1B 5-ATTCCATTCATTGAAACCTCAA-3 SEQ ID NO.66
N437-1B 5-ATTCCATTCATTGAAACCTCAGT-3 SEQ ID NO.67
NWT436MGB 5-ATTGAAACCTCAGCCAAGAC-3-MGB SEQ ID NO.68
N436R 5-GAATATGGATCACATCTCTACCAG-3 SEQ ID NO.60
N436Taqman FAM-5-ACAGCTTTCAGCATTTGTG-3-BHQ-MGB SEQ ID NO.70。
上述的用于全RAS突变检测的引物、探针，其中，还包括人类基因组野生型位点引物,FAM-MGB Taqman探针，参考加样孔具体为：
RefF CCAAGGCACGAGTAACAAGCT SEQ ID NO：49
RefR AATTCCCAAGGACCACCTCAC SEQ ID NO：50
Ref-Taqman FAM-5-TCTCAGCCTCCAGAGGAT-3-BHQ-MGB SEQ ID NO：51。
一种用于全RAS突变检测的检测试剂盒，其中，通过所述的检测试剂盒提取DNA样本，并进行PCR反应，所述的PCR反应扩增体系如下：
10XPCR Buffer 稀释为1X
dNTP 0.2mM
模板 2uL
各引物 200-400 nM
各探针 100-400 nM
各封闭探针 200-400 nM
热启动Taq酶 1U
MgCL2 2-5mM
总体积 20uL。
上述的用于全RAS突变检测的检测试剂盒，其中，所述的PCR反应的条件如下。
一种用于全RAS突变检测的检测试剂盒的检测方法，其中，该方法至少包括如下步骤：
步骤1：针对突变位点设计合成引物、封闭探针和检测探针。
步骤2：样本处理与DNA的提取。
步骤3：建立PCR扩增反应体系。
步骤4：分析图像后调节Baseline的Start值、End值和阈值线，判定结果。
上述的用于全RAS突变检测的检测试剂盒的检测方法，其中，所述的DNA样本包括新鲜肿瘤组织或新鲜病理组织或石蜡包埋组织。
上述的用于全RAS突变检测的检测试剂盒的检测方法，其中，取样的所述的DNA样本为1克。
本发明采用了特异的MGB Blocker探针，NRAS和KRAS特异探针和引物，可以检测肿瘤组织中DNA中RAS的突变；创新性的利用MGB Blocker阻滞了NRAS和KRAS非特异性的扩增，提高了其灵敏度，大于ARMS的1%；可以在循环肿瘤DNA中检测RAS的突变；操作简单，检测廉价，可以大规模推广；检测速度快，检测过程大约需要2小时就可完成。
附图说明
图1是本发明用于全RAS突变检测的引物、探针及检测试剂盒的没有MGB blocker 封闭KRAS p.12/13野生型位点检测图。
图2是本发明用于全RAS突变检测的引物、探针及检测试剂盒的MGB blocker 封闭KRAS p.12/13野生型位点检测图。
图3是本发明用于全RAS突变检测的引物、探针及检测试剂盒的全RAS临床样本 KRAS p.12/13位点点突变检测图。
图4是本发明用于全RAS突变检测的引物、探针及检测试剂盒的全RAS临床样本 KRAS p.61位点点突变检测图。
图5是本发明用于全RAS突变检测的引物、探针及检测试剂盒的全RAS临床样本 NRAS p.61位点点突变检测图。
具体实施方式
以下结合附图进一步说明本发明的实施例。
请参见附图1至附图5所示，一种用于全RAS突变检测的引物、探针，包括全RAS的特异引物与探针，所述的全RAS的特异引物与探针包括KRAS 2、3、4外显子的27种突变类型及NRAS 2、3、4外显子的23种突变类型。
所述的KRAS外显子2的12，13 外显子位点点突变引物,FAM-MGB Taqman探针以及Blocker封闭的MGB探针（mix1）具体为：
K35-1B 5-ACTTGTGGTAGTTGGAGCTGA-3 SEQ ID NO.01
K35-3B 5-ACTTGTGGTAGTTGGAGCTGT-3 SEQ ID NO.02
K35-2B 5-CTTGTGGTAGTTGGAGCTGC-3 SEQ ID NO.03
K34-2B 5-AACTTGTGGTAGTTGGAGCTC-3 SEQ ID NO.04
K34-1B 5-AAACTTGTGGTAGTTGGAGCTA-3 SEQ ID NO.05
K34-3B 5-AACTTGTGGTAGTTGGAGCTT-3 SEQ ID NO.06
K38-1B-1 5-TGGTGGTTGGAGCAGGTGA-3 SEQ ID NO.07
K38-2B-1 5-GGTGGTTGGAGCAGGTGC-3 SEQ ID NO.08
K38-3B-1 5-TGGTGGTTGGAGCAGGTGT-3 SEQ ID NO.09
K37-1B 5-TGTGGTAGTTGGAGCTGGTA-3 SEQ ID NO.10
K37-2B 5-TGTGGTAGTTGGAGCTGGTC-3 SEQ ID NO.11
K37-3B 5-TGTGGTAGTTGGAGCTGGTT-3 SEQ ID NO.12
KWT34MGB 5-GGAGCTGGTGGCGTAG-3-MGB SEQ ID NO.13
KR-R 5-AGAATGGTCCTGCACCAGTAATAT-3 SEQ ID NO.14
KR-Taqman FAM-5- CAAGAGTGCCTTGACGATAC-3-BHQ-MGB SEQ ID NO.15；
所述的KRAS外显子3的61 编码子位点点突变引物，FAM-MGB Taqman探针以及Blocker封闭的MGB探针（mix2）具体为：
K181-1B 5-GATATTCTCGACACAGCAGGTA-3 SEQ ID NO.16
K181-2B 5-ATATTCTCGACACAGCAGGTG-3 SEQ ID NO.17
K182-1B 5-TCTCGACACAGCAGGTCC-3 SEQ ID NO.18
K182-2B 5-TCTCGACACAGCAGGTCG-3 SEQ ID NO.19
K182-3B 5-ATTCTCGACACAGCAGGTCT-3 SEQ ID NO.20
K183-1B 5-TCTCGACACAGCAGGTCAC-3 SEQ ID NO.21
K183-2B 5-TCTCGACACAGCAGGTCAT-3 SEQ ID NO.22
K181R 5-AATACACAAAGAAAGCCCTCCC-3 SEQ ID NO.23
K181WTMGB 5-GACACAGCAGGTCAAGAGG-3-MGB SEQ ID NO.24
K181taqman FAM-5-AATGAGGGACCAGTACATG-3-BHQ-MGB SEQ ID NO.25；
所述的KRAS外显子4的117编码子位点点突变引物,FAM-MGB Taqman探针以及Blocker封闭的MGB探针（mix3）具体为：
K349-1B-1 5-ACCTATGGTCCTAGTAGGAAATG-3 SEQ ID NO.26
K350-1B-1 5-ACCCTATGGTCCTAGTAGGAAATAG-3 SEQ ID NO.27
K351-1B-1 5-CCTATGGTCCTAGTAGGAAATAAC-3 SEQ ID NO.28
K351-2B-1 5-CCTATGGTCCTAGTAGGAAATAAT-3 SEQ ID NO.29
K349R 5-ACTTCTTGCTAAGTCCTGAGCCT-3 SEQ ID NO.30
KWT349MGB1 5-GTCCTAGTAGGAAATAAATGTGA-3-MGB SEQ ID NO.31
K349Taqman FAM-5-ATTTGCCTTCTAGAACAGTAG-3-BHQ-MGB SEQ ID NO.32；
所述的KRAS外显子4的146编码子位点点突变引物，FAM-MGB Taqman探针以及Blocker封闭的MGB探针（mix4）具体为：
K436-1B 5-GTTACTTACCTGTCTTGTCTTTGT-3 SEQ ID NO.33
K436-2B 5-TACTTACCTGTCTTGTCTTTGG-3 SEQ ID NO.34
K437-1B 5-TGTTACTTACCTGTCTTGTCTTTC-3 SEQ ID NO.35
K437-2B 5-TGTTACTTACCTGTCTTGTCTTTA-3 SEQ ID NO.36
K436R 5-TGATTTGCCTTCTAGAACAGTAGAC-3 SEQ ID NO.37
KWT436MGB 5-CTGTCTTGTCTTTGCTGATG-3-MGB SEQ ID NO.38
K436Taqman FAM-5- ACTTCTTGCTAAGTCCTGAGC-3-BHQ-MGB SEQ ID NO.39；
所述的NRAS外显子2的12，13 编码子位点点突变引物,FAM-MGB Taqman探针以及Blocker封闭的MGB探针（mix5）具体为：
N34-1B 5-TGGTGGTGGTTGGAGCAA-3 SEQ ID NO.40
N34-2B 5-TGGTGGTGGTTGGAGCAC-3 SEQ ID NO.41
N34-3B 5-TGGTGGTGGTTGGAGCAT-3 SEQ ID NO.42
N35-1B 5-GGTGGTGGTTGGAGCAGA-3 SEQ ID NO.43
N35-2B 5-GGTGGTGGTTGGAGCAGC-3 SEQ ID NO.44
N35-3B 5-GGTGGTGGTTGGAGCAGT-3 SEQ ID NO.45
N37-1B 5-GTGGTGGTTGGAGCAGGTA-3 SEQ ID NO.46
N37-2B 5-GGTGGTTGGAGCAGGTC-3 SEQ ID NO.47
N37-3B 5-GTGGTGGTTGGAGCAGGTT-3 SEQ ID NO.48
N38-1B 5-GGTGGTTGGAGCAGGTGA-3 SEQ ID NO.49
N38-2B 5-GTGGTTGGAGCAGGTGC-3 SEQ ID NO.50
N38-3B 5-GGTGGTTGGAGCAGGTGT-3 SEQ ID NO.51
N34R 5-CTCACCTCTATGGTGGGATCATAT-3 SEQ ID NO.52
N34taqman FAM-5- AAGCGCACTGACAATCC-3-BHQ-MGB SEQ ID NO.53
NWT34MGB 5-GTTGGAGCAGGTGGTGTTG-3-MGB SEQ ID NO.54；
所述的NRAS外显子3的61 编码子位点点突变引物,FAM-MGB Taqman探针以及Blocker封闭的MGB探针（mix6）具体为：
N181R 5-ATGGCAAATACACAGAGGAAGC-3 SEQ ID NO.55
N181-1B 5-GACATACTGGATACAGCTGGAA-3 SEQ ID NO.56
N181-2B 5-GACATACTGGATACAGCTGGAG-3 SEQ ID NO.57
N181-3B 5-GACATACTGGATACAGCTGGAT-3 SEQ ID NO.58
N182-1B 5-CATACTGGATACAGCTGGACC-3 SEQ ID NO.59
N182-2B 5-ATACTGGATACAGCTGGACG-3 SEQ ID NO.60
N182-3B 5-ACATACTGGATACAGCTGGACT-3 SEQ ID NO.61
N183-1B 5-CATACTGGATACAGCTGGACAC-3 SEQ ID NO.62
N183-2B 5-CATACTGGATACAGCTGGACAT-3 SEQ ID NO.63
N181Taqman FAM-5- AATACATGAGGACAGGCG-3-BHQ-MGB SEQ ID NO.64
NWT181MGB 5-GATACAGCTGGACAAGAAGAG-3-MGB SEQ ID NO.65；
所述的NRAS外显子4的146编码子位点点突变引物,FAM-MGB Taqman探针以及Blocker封闭的MGB探针（mix7）具体为：
N436-1B 5-ATTCCATTCATTGAAACCTCAA-3 SEQ ID NO.66
N437-1B 5-ATTCCATTCATTGAAACCTCAGT-3 SEQ ID NO.67
NWT436MGB 5-ATTGAAACCTCAGCCAAGAC-3-MGB SEQ ID NO.68
N436R 5-GAATATGGATCACATCTCTACCAG-3 SEQ ID NO.60
N436Taqman FAM-5-ACAGCTTTCAGCATTTGTG-3-BHQ-MGB SEQ ID NO.70。
还包括人类基因组野生型位点引物,FAM-MGB Taqman探针，参考加样孔（mix8）具体为：
RefF CCAAGGCACGAGTAACAAGCT SEQ ID NO：49
RefR AATTCCCAAGGACCACCTCAC SEQ ID NO：50
Ref-Taqman FAM-5-TCTCAGCCTCCAGAGGAT-3-BHQ-MGB SEQ ID NO：51。
一种用于全RAS突变检测的检测试剂盒，通过所述的检测试剂盒提取DNA样本，并进行PCR反应，所述的PCR反应扩增体系如下：
10XPCR Buffer 稀释为1X
dNTP 0.2mM
模板 2uL
各引物 200-400 nM
各探针 100-400 nM
各封闭探针 200-400 nM
热启动Taq酶 1U
MgCL2 2-5mM
总体积 20uL。
所述的PCR反应的条件如下：
一种用于全RAS突变检测的检测试剂盒的检测方法，该方法至少包括如下步骤：
步骤1：针对突变位点设计合成引物、封闭探针和检测探针。
根据COSMIC数据库公布的人类KRAS和NRAS基因序列为野生型序列，针对KRAS 27种突变类型，NRAS 23种突变类型来设计特异引物和探针。通过设计特异性的封闭探针和反应体系优化，实现高灵敏度的检测，KRAS 27个突变位点（见附表1）， NRAS23个突变位点（见附表2）。
针对选定的KRAS27个突变位点，NRAS 23个突变位点，应用primer 5.0 引物设计软件设计出引物和多条封闭探针以及检测探针，引物和探针序列（见附表3）。
步骤2：样本处理与DNA的提取。使用康为世纪 DNA提取试剂盒提取DNA。
步骤3：建立PCR扩增反应体系。
将上述获得的基因组DNA作为模板，用RAS突变检测试剂盒检测（见附表4），具体反应体系如下：
10XPCR Buffer 稀释为1X
dNTP 0.2mM
模板 2uL
各引物 200-400 nM
各探针 100-400 nM
各封闭探针 200-400 nM
热启动Taq酶 1U
MgCL2 2-5mM
总体积 20uL；
实时PCR反应条件如下：
荧光信号的收集定为FAM，数据的采集定在60℃。
步骤4：分析图像后调节Baseline的Start值、End值和阈值线，判定结果。
反应结束后，仪器自动保存结果，分析图像后调节Baseline的Start值、End值（可自行调节，Start值可以在3-10之间，End值位于15-20之间，调整阴性质控品的扩增曲线使其平直或低于阈值线）和阈值线（Threshold值，可手动调整至baseline之上）。
Ct值及△Ct值的确定：用户根据实际情况确定各反应管扩展曲线升起的拐点处，得到其Ct值。△Ct=突变孔FAM荧光Ct值与参照孔Ct值的差值。突变孔Ct值是指样本突变检测孔（mix1～mix7）对应的Ct值；参照孔Ct值是指样本mix8对应的Ct值。一个样本可能同时含有2个或多个突变类型，则该样本应有对应的2个或多个△Ct值。
结果判读如下：Ct≤32，判定结果：突变阳性；Ct＞32，△Ct≤8，判定结果：突变阳性；Ct＞32，△Ct＞8，判定结果：突变阴性。
所述的DNA样本包括新鲜肿瘤组织或新鲜病理组织或石蜡包埋组织。
取样的所述的DNA样本为1克左右。
实施例1：
运用于本发明体系检测质粒，实验用质粒模板（以KRAS p.12/13野生型质粒为例）,利用上述荧光PCR检测检测全RAS突变的方法如下：
（1）质粒的处理与提取：
质粒的提取采用TIANGEN（HighPure Plasmid kid，DP116）的质粒提取试剂盒进行提取，具体提取操作步骤按试剂盒说明操作。所提DNA溶于Tris-HCl (10mM,pH 8.0)，经紫外分光光度计检测提取质量，确定其浓度，然后用Tris-HCl (10mM,pH 8.0)溶液调整DNA浓度到20ng/ul作为稀释母液。
根据公式C拷贝浓度=（C拷贝浓度*6.02*1023）/MWDNA稀释野生型质粒为106个拷贝数/微升。
以K34位点野生型质粒为模板，验证MGB blocker的有效性，反应体系如下：
10XPCR Buffer 稀释为1X
dNTP 0.2mM
野生型质粒模板 2uL
KRAS p.12/13 F+R引物 200-400 uM
KRAS p.12/13探针 100-400 uM
KRAS p.12/13封闭探针 200-400 uM
热启动Taq酶 1U
MgCL2 2-5mM
总体积 20uL
反应条件如下：
荧光信号的收集定为FAM，数据的采集定在60℃。
得到如下结果：当不加KRAS p.12/13 MGB Blocker时，发现非特异性扩增非常严重，如附图1所示，而加入KRAS p.12/13 MGB Blocker以后，非特异性扩增消失，显示KRAS p.12/13 MGB blocker可以很好的封闭野生型基因组的非特异性扩增，如附图2所示。
实施例2
运用本发明检测临床样本，检测120例送本公司检测的转移性结直肠癌患者。其中男性72例，女性48例，年龄为39-75岁，平均年龄57岁，中位年龄54岁，检测结果与传统ARMS-QPCR方法比较。
（1）样本处理与DNA的提取
采用康为世纪的FFPE DNA提取试剂盒提取石蜡切片肿瘤组织中DNA，具体步骤如下：
a取约4-5片切片置于离心管中，加入1ml二甲苯，盖紧管盖，涡旋震荡10秒；
b 12，00rpm离心2分钟后弃上清，然后加入1ml无水乙醇，涡旋震荡均匀。12,000rpm离心2分钟，弃上清；
c 打开管盖，室温或者最高至37度孵育10分钟，直至无乙醇残留；
d 加入180ul Buffer GTL，重悬沉淀，加入20ul proteinase K，涡旋震荡均匀。
e 56度孵育1小时，直至样品完全溶解。90度孵育1小时。短暂离心，使壁管上的溶液收集到管底。
f 加入200ul的buffer GL，涡旋震荡彻底混匀。加入200ul无水乙醇，涡旋震荡彻底混匀。短暂离心，使管壁上的溶液收集到管底。
g 将步骤9所得溶液全部加入已装入收集管的吸附柱中，10,000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
h 向吸附柱中加入500ulbuffer GW1，10,000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
i向吸附柱中加入500ulbuffer GW2，10,000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
j 12，000rpm离心2分钟，倒掉收集管中废液，将吸附柱置于室温数分钟彻底晾干。
k将吸附柱置于一个新的离心管，向吸附柱悬空加入20-100ul buffer GE或蒸馏水，室温放置2-5分钟，10，000rpm离心1分钟，收集DNA溶液用于后续实验
(2)荧光实时定量PCR反应
将上述获得的基因组DNA作为模板，用于全RAS突变检测，具体反应体系如下：
10XPCR Buffer 稀释为1X
dNTP 0.2mM
模板 2uL
各引物 200-400 nM
各探针 100-400 nM
各封闭探针 200-400 nM
热启动Taq酶 1U
MgCL2 2-5mM
总体积 20uL
实时PCR反应条件如下：
荧光信号的收集定为FAM，数据的采集定在60℃。
反应结束后，仪器自动保存结果，分析图像后调节Baseline的Start值、End值（可自行调节，Start值可以在3-10之间，End值位于15-20之间，调整阴性质控品的扩增曲线使其平直或低于阈值线）和阈值线（Threshold值，可手动调整至baseline之上）。
Ct值及△Ct值的确定：用户根据实际情况确定各反应管扩展曲线升起的拐点处，得到其Ct值。△Ct=突变孔FAM荧光Ct值与参照孔Ct值的差值。突变孔Ct值是指样本突变检测孔（mix1～mix7）对应的Ct值；参照孔Ct值是指样本mix8对应的Ct值。一个样本可能同时含有2个或多个突变类型，则该样本应有对应的2个或多个△Ct值。
结果判读如下：Ct≤32，判定结果：突变阳性；Ct＞32，△Ct≤8，判定结果：突变阳性；Ct＞32，△Ct＞8，判定结果：突变阴性。
检测结果如下，在120例结直肠癌病人中，本方法检测出KRAS p.12/13位点突变35例，KRAS p.61 突变4例，NRAS p.61 突变7例，与过去普通ARMS-QPCR结直肠癌方法多检测出KRAS非2号外显子突变和NRAS突变，缩小了帕尼单抗和西妥昔单抗用药的有效人群，有效解决了临床问题（附表5），减轻了病人的负担。
附表1：本方法检测的KRAS 27种突变类型
| 氨基酸突变 | 碱基突变 | COSMIC编号 |
| p.G12S | c.34G>A | COSM517 |
| p.G12R | c.34G>C | COSM518 |
| p.G12D | c.35G>A | COSM521 |
| p.G12A | c.35G>C | COSM522 |
| p.G12V | c.35G>T | COSM520 |
| p.G13S | c.37G>A | COSM528 |
| p.G13R | c.37G>C | COSM529 |
| p.G13C | c.37G>T | COSM527 |
| p.G13D | c.38G>A | COSM532 |
| p.G13A | c.38G>C | COSM533 |
| p.G13V | c.38G>T | COSM534 |
| p.Q61K | c.181C>A | COSM549 |
| p.Q61E | c.181C>G | COSM550 |
| p.Q61P | c.182A>C | COSM551 |
| p.Q61R | c.182A>G | COSM552 |
| p.Q61L | c.182A>T | COSM553 |
| p.Q61H | c.183A>C | COSM554 |
| p.Q61H | c.183A>T | COSM555 |
| p.A146G | c.436G>A | COSM19404 |
| p.A146P | c.436G>C | COSM19905 |
| p.A146G | c.437C>G | COSM1360829 |
| p.A146V | c.437C>T | COSM19900 |
| p.K117E | c.349A>G | COSM1360831 |
| p.K117R | c.350A>G | COSM178068 |
| p.K117N | c.351A>T | COSM28519 |
| p.K117N | c.351A>C | COSM19940 |
附表2：NRAS 23种检测的突变类型：
| 氨基酸突变 | 碱基突变 | COSMIC编号 |
| p.G12S | c.34G>A | COSM563 |
| p.G12R | c.34G>C | COSM561 |
| p.G12C | c.34G>T | COSM562 |
| p.G12D | c.35G>A | COSM564 |
| p.G12A | c.35G>C | COSM565 |
| p.G12V | c.35G>T | COSM566 |
| p.G13S | c.37G>A | COSM571 |
| p.G13R | c.37G>C | COSM569 |
| p.G13C | C.37G>T | COSM570 |
| p.G13D | c.38G>A | COSM573 |
| p.G13A | c.38G>C | COSM575 |
| p.G13V | c.38G>T | COSM574 |
| p.Q61K | c.181C>A | COSM580 |
| p.Q61E | c.181C>G | COSM581 |
| p.Q61R | c.181-182CA>AG | COSM579 |
| p.Q61L | c.181_182CA>TT | COSM12725 |
| p.Q61P | c.182A>C | COSM582 |
| p.Q61R | c.182A>G | COSM584 |
| p.Q61L | c.182A>T | COSM583 |
| p.Q61H | c.183A>C | COSM586 |
| p.Q61H | c.183A>T | COSM585 |
| p.A146T | c.436G>A | COSM27174 |
| p.A146V | c.437C>T | COSM4170228 |
附表3：突变位点设计合成引物、封闭探针和检测探针：
| K35-1B | ACTTGTGGTAGTTGGAGCTGA |
| K35-3B | ACTTGTGGTAGTTGGAGCTGT |
| K35-2B | CTTGTGGTAGTTGGAGCTGC |
| K34-2B | AACTTGTGGTAGTTGGAGCTC |
| K34-1B | AAACTTGTGGTAGTTGGAGCTA |
| K34-3B | AACTTGTGGTAGTTGGAGCTT |
| K38-1B-1 | TGGTGGTTGGAGCAGGTGA |
| K38-2B-1 | GGTGGTTGGAGCAGGTGC |
| K38-3B-1 | TGGTGGTTGGAGCAGGTGT |
| K37-1B | TGTGGTAGTTGGAGCTGGTA |
| K37-2B | TGTGGTAGTTGGAGCTGGTC |
| K37-3B | TGTGGTAGTTGGAGCTGGTT |
| KWT34MGB | GGAGCTGGTGGCGTAG |
| KR-R | AGAATGGTCCTGCACCAGTAATAT |
| KR-Taqman | CAAGAGTGCCTTGACGATAC |
| K181WTMGB | GACACAGCAGGTCAAGAGG |
| K181-1B | GATATTCTCGACACAGCAGGTA |
| K181-2B | ATATTCTCGACACAGCAGGTG |
| K182-1B | TCTCGACACAGCAGGTCC |
| K182-2B | TCTCGACACAGCAGGTCG |
| K182-3B | ATTCTCGACACAGCAGGTCT |
| K183-1B | TCTCGACACAGCAGGTCAC |
| K183-2B | TCTCGACACAGCAGGTCAT |
| K181R | AATACACAAAGAAAGCCCTCCC |
| K181taqman | AATGAGGGACCAGTACATG |
| KWT349MGB1 | GTCCTAGTAGGAAATAAATGTGA |
| K349Taqman | ATTTGCCTTCTAGAACAGTAG |
| K349-1B-1 | ACCTATGGTCCTAGTAGGAAATG |
| K350-1B-1 | ACCCTATGGTCCTAGTAGGAAATAG |
| K351-1B-1 | CCTATGGTCCTAGTAGGAAATAAC |
| K351-2B-1 | CCTATGGTCCTAGTAGGAAATAAT |
| K349R | GTCTCGATGTAGGGGATGCC |
| K436R | TGATTTGCCTTCTAGAACAGTAGAC |
| K436Taqman | ACTTCTTGCTAAGTCCTGAGC |
| KWT436MGB | CTGTCTTGTCTTTGCTGATG |
| K436-1B | GTTACTTACCTGTCTTGTCTTTGT |
| K436-2B | TACTTACCTGTCTTGTCTTTGG |
| K437-1B | TGTTACTTACCTGTCTTGTCTTTC |
| K437-2B | TGTTACTTACCTGTCTTGTCTTTA |
| N34R | CTCACCTCTATGGTGGGATCATAT |
| N34taqman | AAGCGCACTGACAATCC |
| N34-1B | TGGTGGTGGTTGGAGCAA |
| N34-2B | TGGTGGTGGTTGGAGCAC |
| N34-3B | TGGTGGTGGTTGGAGCAT |
| N35-1B | GGTGGTGGTTGGAGCAGA |
| N35-2B | GGTGGTGGTTGGAGCAGC |
| N35-3B | GGTGGTGGTTGGAGCAGT |
| N37-1B | GTGGTGGTTGGAGCAGGTA |
| N37-2B | GGTGGTTGGAGCAGGTC |
| N37-3B | GTGGTGGTTGGAGCAGGTT |
| N38-1B | GGTGGTTGGAGCAGGTGA |
| N38-2B | GTGGTTGGAGCAGGTGC |
| N38-3B | GGTGGTTGGAGCAGGTGT |
| NWT34MGB | GTTGGAGCAGGTGGTGTTG |
| N181R | ATGGCAAATACACAGAGGAAGC |
| N181-1B | GACATACTGGATACAGCTGGAA |
| N181-2B | GACATACTGGATACAGCTGGAG |
| N181-3B | GACATACTGGATACAGCTGGAT |
| N182-1B | CATACTGGATACAGCTGGACC |
| N182-2B | ATACTGGATACAGCTGGACG |
| N182-3B | ACATACTGGATACAGCTGGACT |
| N183-1B | CATACTGGATACAGCTGGACAC |
| N183-2B | CATACTGGATACAGCTGGACAT |
| N181Taqman | AATACATGAGGACAGGCG |
| NWT181MGB | GATACAGCTGGACAAGAAGAG |
| N436R | GAATATGGATCACATCTCTACCAG |
| N436-1B | ATTCCATTCATTGAAACCTCAA |
| N437-1B | ATTCCATTCATTGAAACCTCAGT |
| NWT436MGB | ATTGAAACCTCAGCCAAGAC |
| N436Taqman | ACAGCTTTCAGCATTTGTG |
附表4：全RAS检测试剂盒组分：
| 管号 | 试剂管 | 体积 |
| Mix1 | KRAS 12、13密码子检测反应混合液MIX1 | 210ul |
| Mix2 | KRAS 61密码子检测反应混合液MIX2 | 210ul |
| Mix3 | KRAS 117密码子检测反应混合液MIX3 | 210ul |
| Mix4 | KRAS 146密码子检测反应混合液MIX4 | 210ul |
| Mix5 | NRAS 12、13密码子检测反应混合液MIX5 | 210ul |
| Mix6 | NRAS 61密码子检测反应混合液MIX6 | 210ul |
| Mix7 | NRAS 146密码子检测反应混合液MIX7 | 210ul |
| Mix8 | 参考混合液MIX8 | 210ul |
附表5：全RAS突变检测和ARMS-QPCR方法检测KRAS方法比较：
| 突变类型 | 全RAS组织检测 | KRAS组织检测 |
| KRAS 2号外显子 | 35 | 35 |
| KRAS 3号外显子 | 4 | 0 |
| NRAS 3号外显子 | 7 | 0 |
综上所述，本发明采用了特异的MGB Blocker探针，NRAS和KRAS特异探针和引物，可以检测肿瘤组织中DNA中RAS的突变；创新性的利用MGB Blocker阻滞了NRAS和KRAS非特异性的扩增，提高了其灵敏度，大于ARMS的1%；可以在循环肿瘤DNA中检测RAS的突变；操作简单，检测廉价，可以大规模推广；检测速度快，检测过程大约需要2小时就可完成。
以上所述仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构变换，或直接或间接运用附属在其他相关产品的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
<110>上海允英医疗科技有限公司
<120>用于全RAS突变检测的引物、探针及检测试剂盒
<160>70
<210>1
<211>21
<212>DNA
<213>人工合成
<400>1
ACTTGTGGTAGTTGGAGCTGA 21
<210>2
<211>21
<212>DNA
<213>人工合成
<400>2
ACTTGTGGTAGTTGGAGCTGT 21
<210>3
<211>20
<212>DNA
<213>人工合成
<400>3
CTTGTGGTAGTTGGAGCTGC 20
<210>4
<211>21
<212>DNA
<213>人工合成
<400>4
AACTTGTGGTAGTTGGAGCTC 21
<210>5
<211>22
<212>DNA
<213>人工合成
<400>5
AAACTTGTGGTAGTTGGAGCTA 22
<210>6
<211>21
<212>DNA
<213>人工合成
<400>6
AACTTGTGGTAGTTGGAGCTT 21
<210>7
<211>19
<212>DNA
<213>人工合成
<400>7
TGGTGGTTGGAGCAGGTGA 19
<210>8
<211>18
<212>DNA
<213>人工合成
<400>8
GGTGGTTGGAGCAGGTGC 18
<210>9
<211>19
<212>DNA
<213>人工合成
<400>9
TGGTGGTTGGAGCAGGTGT
<210>10
<211>20
<212>DNA
<213>人工合成
<400>10
TGTGGTAGTTGGAGCTGGTA 20
<210>11
<211>20
<212>DNA
<213>人工合成
<400>11
TGTGGTAGTTGGAGCTGGTC 20
<210>12
<211>20
<212>DNA
<400>12
<213>人工合成
TGTGGTAGTTGGAGCTGGTT 20
<210>13
<211>16
<212>DNA
<213>人工合成
<400>13
GGAGCTGGTGGCGTAG 16
<210>14
<211>24
<212>DNA
<213>人工合成
<400>14
AGAATGGTCCTGCACCAGTAATAT 24
<210>15
<211>20
<212>DNA
<213>人工合成
<400>15
CAAGAGTGCCTTGACGATAC 20
<210>16
<211>19
<212>DNA
<213>人工合成
<400>16
GACACAGCAGGTCAAGAGG 19
<210>17
<211>22
<212>DNA
<213>人工合成
<400>17
GATATTCTCGACACAGCAGGTA 22
<210>18
<211>21
<212>DNA
<213>人工合成
<400>18
ATATTCTCGACACAGCAGGTG 21
<210>19
<211>18
<212>DNA
<213>人工合成
<400>19
TCTCGACACAGCAGGTCC 18
<210>20
<211>18
<212>DNA
<213>人工合成
<400>20
TCTCGACACAGCAGGTCG 18
<210>21
<211>20
<212>DNA
<213>人工合成
<400>21
ATTCTCGACACAGCAGGTCT 20
<210>22
<211>19
<212>DNA
<213>人工合成
<400>22
TCTCGACACAGCAGGTCAC 19
<210>23
<211>19
<212>DNA
<213>人工合成
<400>23
TCTCGACACAGCAGGTCAT 19
<210>24
<211>22
<212>DNA
<213>人工合成
<400>24
AATACACAAAGAAAGCCCTCCC 22
<210>25
<211>19
<212>DNA
<213>人工合成
<400>25
AATGAGGGACCAGTACATG 19
<210>26
<211>23
<212>DNA
<213>人工合成
<400>26
GTCCTAGTAGGAAATAAATGTGA 23
<210>27
<211>21
<212>DNA
<213>人工合成
<400>27
ATTTGCCTTCTAGAACAGTAG 21
<210>28
<211>23
<212>DNA
<213>人工合成
<400>28
ACCTATGGTCCTAGTAGGAAATG 23
<210>29
<211>25
<212>DNA
<213>人工合成
<400>29
ACCCTATGGTCCTAGTAGGAAATAG 25
<210>30
<211>24
<212>DNA
<213>人工合成
<400>30
CCTATGGTCCTAGTAGGAAATAAC 24
<210>31
<211>24
<212>DNA
<213>人工合成
<400>31
CCTATGGTCCTAGTAGGAAATAAT 24
<210>32
<211>23
<212>DNA
<213>人工合成
<400>32
ACTTCTTGCTAAGTCCTGAGCCT 23
<210>33
<211>25
<212>DNA
<213>人工合成
<400>33
TGATTTGCCTTCTAGAACAGTAGAC 25
<210>34
<211>21
<212>DNA
<213>人工合成
<400>34
ACTTCTTGCTAAGTCCTGAGC 21
<210>35
<211>20
<212>DNA
<213>人工合成
<400>35
CTGTCTTGTCTTTGCTGATG 20
<210>36
<211>24
<212>DNA
<213>人工合成
<400>36
GTTACTTACCTGTCTTGTCTTTGT 24
<210>37
<211>22
<212>DNA
<213>人工合成
<400>37
TACTTACCTGTCTTGTCTTTGG 22
<210>38
<211>24
<212>DNA
<213>人工合成
<400>38
TGTTACTTACCTGTCTTGTCTTTC 24
<210>39
<211>24
<212>DNA
<213>人工合成
<400>39
TGTTACTTACCTGTCTTGTCTTTA 24
<210>40
<211>24
<212>DNA
<213>人工合成
<400>40
CTCACCTCTATGGTGGGATCATAT 24
<210>41
<211>17
<212>DNA
<213>人工合成
<400>41
AAGCGCACTGACAATCC 17
<210>42
<211>18
<212>DNA
<213>人工合成
<400>42
TGGTGGTGGTTGGAGCAA 18
<210>43
<211>18
<212>DNA
<213>人工合成
<400>43
TGGTGGTGGTTGGAGCAC 18
<210>44
<211>18
<212>DNA
<213>人工合成
<400>444
TGGTGGTGGTTGGAGCAT 18
<210>45
<211>18
<212>DNA
<213>人工合成
<400>45
GGTGGTGGTTGGAGCAGA 18
<210>46
<211>18
<212>DNA
<213>人工合成
<400>46
GGTGGTGGTTGGAGCAGC 18
<210>47
<211>18
<212>DNA
<213>人工合成
<400>47
GGTGGTGGTTGGAGCAGT 18
<210>48
<211>19
<212>DNA
<213>人工合成
<400>48
GTGGTGGTTGGAGCAGGTA 19
<210>49
<211>17
<212>DNA
<213>人工合成
<400>49
GGTGGTTGGAGCAGGTC 17
<210>50
<211>19
<212>DNA
<213>人工合成
<400>50
GTGGTGGTTGGAGCAGGTT 19
1023
<210>51
<211>18
<212>DNA
<213>人工合成
<400>51
GGTGGTTGGAGCAGGTGA 18
<210>52
<211>17
<212>DNA
<213>人工合成
<400>52
GTGGTTGGAGCAGGTGC 17
<210>53
<211>18
<212>DNA
<213>人工合成
<400>53
GGTGGTTGGAGCAGGTGT 18
<210>54
<211>19
<212>DNA
<213>人工合成
<400>54
GTTGGAGCAGGTGGTGTTG 19
<210>55
<211>22
<212>DNA
<213>人工合成
<400>55
ATGGCAAATACACAGAGGAAGC 22
<210>56
<211>22
<212>DNA
<213>人工合成
<400>56
GACATACTGGATACAGCTGGAA 22
<210>57
<211>22
<212>DNA
<213>人工合成
<400>57
GACATACTGGATACAGCTGGAG 22
<210>58
<211>22
<212>DNA
<213>人工合成
<400>58
GACATACTGGATACAGCTGGAT 22
<210>59
<211>21
<212>DNA
<213>人工合成
<400>59
CATACTGGATACAGCTGGACC 21
<210>60
<211>20
<212>DNA
<213>人工合成
<400>60
ATACTGGATACAGCTGGACG 20
<210>61
<211>22
<212>DNA
<213>人工合成
<400>61
ACATACTGGATACAGCTGGACT 22
<210>62
<211>22
<212>DNA
<213>人工合成
<400>62
CATACTGGATACAGCTGGACAC 22
<210>63
<211>22
<212>DNA
<213>人工合成
<400>63
CATACTGGATACAGCTGGACAT 22
<210>64
<211>18
<212>DNA
<213>人工合成
<400>64
AATACATGAGGACAGGCG 18
<210>65
<211>21
<212>DNA
<213>人工合成
<400>65
GATACAGCTGGACAAGAAGAG 21
<210>66
<211>24
<212>DNA
<213>人工合成
<400>66
GAATATGGATCACATCTCTACCAG 24
<210>67
<211>22
<212>DNA
<213>人工合成
<400>67
ATTCCATTCATTGAAACCTCAA 22
<210>68
<211>23
<212>DNA
<213>人工合成
<400>68
ATTCCATTCATTGAAACCTCAGT 23
<210>69
<211>20
<212>DNA
<213>人工合成
<400>69
ATTGAAACCTCAGCCAAGAC 20
<210>70
<211>19
<212>DNA
<213>人工合成
<400>70
ACAGCTTTCAGCATTTGTG 19
Claims (7)
1.一种用于全RAS突变检测的引物、探针，其特征在于：包括全RAS的特异引物与探针，所述的全RAS的特异引物与探针包括KRAS 2、3、4外显子的27种突变类型及NRAS 2、3、4外显子的23种突变类型；
所述的KRAS外显子2的12，13 外显子位点点突变引物，FAM-MGB Taqman探针以及Blocker封闭的MGB探针具体为：
K35-1B 5-ACTTGTGGTAGTTGGAGCTGA-3 SEQ ID NO.01
K35-3B 5-ACTTGTGGTAGTTGGAGCTGT-3 SEQ ID NO.02
K35-2B 5-CTTGTGGTAGTTGGAGCTGC-3 SEQ ID NO.03
K34-2B 5-AACTTGTGGTAGTTGGAGCTC-3 SEQ ID NO.04
K34-1B 5-AAACTTGTGGTAGTTGGAGCTA-3 SEQ ID NO.05
K34-3B 5-AACTTGTGGTAGTTGGAGCTT-3 SEQ ID NO.06
K38-1B-1 5-TGGTGGTTGGAGCAGGTGA-3 SEQ ID NO.07
K38-2B-1 5-GGTGGTTGGAGCAGGTGC-3 SEQ ID NO.08
K38-3B-1 5-TGGTGGTTGGAGCAGGTGT-3 SEQ ID NO.09
K37-1B 5-TGTGGTAGTTGGAGCTGGTA-3 SEQ ID NO.10
K37-2B 5-TGTGGTAGTTGGAGCTGGTC-3 SEQ ID NO.11
K37-3B 5-TGTGGTAGTTGGAGCTGGTT-3 SEQ ID NO.12
KWT34MGB 5-GGAGCTGGTGGCGTAG-3-MGB SEQ ID NO.13
KR-R 5-AGAATGGTCCTGCACCAGTAATAT-3 SEQ ID NO.14
KR-Taqman FAM-5- CAAGAGTGCCTTGACGATAC-3-BHQ-MGB SEQ ID NO.15；
所述的KRAS外显子3的61 编码子位点点突变引物，FAM-MGB Taqman探针以及Blocker封闭的MGB探针具体为：
K181-1B 5-GATATTCTCGACACAGCAGGTA-3 SEQ ID NO.16
K181-2B 5-ATATTCTCGACACAGCAGGTG-3 SEQ ID NO.17
K182-1B 5-TCTCGACACAGCAGGTCC-3 SEQ ID NO.18
K182-2B 5-TCTCGACACAGCAGGTCG-3 SEQ ID NO.19
K182-3B 5-ATTCTCGACACAGCAGGTCT-3 SEQ ID NO.20
K183-1B 5-TCTCGACACAGCAGGTCAC-3 SEQ ID NO.21
K183-2B 5-TCTCGACACAGCAGGTCAT-3 SEQ ID NO.22
K181R 5-AATACACAAAGAAAGCCCTCCC-3 SEQ ID NO.23
K181WTMGB 5-GACACAGCAGGTCAAGAGG-3-MGB SEQ ID NO.24
K181taqman FAM-5-AATGAGGGACCAGTACATG-3-BHQ-MGB SEQ ID NO.25；
所述的KRAS外显子4的117编码子位点点突变引物,FAM-MGB Taqman探针以及Blocker封闭的MGB探针具体为：
K349-1B-1 5-ACCTATGGTCCTAGTAGGAAATG-3 SEQ ID NO.26
K350-1B-1 5-ACCCTATGGTCCTAGTAGGAAATAG-3 SEQ ID NO.27
K351-1B-1 5-CCTATGGTCCTAGTAGGAAATAAC-3 SEQ ID NO.28
K351-2B-1 5-CCTATGGTCCTAGTAGGAAATAAT-3 SEQ ID NO.29
K349R 5-ACTTCTTGCTAAGTCCTGAGCCT-3 SEQ ID NO.30
KWT349MGB1 5-GTCCTAGTAGGAAATAAATGTGA-3-MGB SEQ ID NO.31
K349Taqman FAM-5-ATTTGCCTTCTAGAACAGTAG-3-BHQ-MGB SEQ ID NO.32；
所述的KRAS外显子4的146编码子位点点突变引物，FAM-MGB Taqman探针以及Blocker封闭的MGB探针体为：
K436-1B 5-GTTACTTACCTGTCTTGTCTTTGT-3 SEQ ID NO.33
K436-2B 5-TACTTACCTGTCTTGTCTTTGG-3 SEQ ID NO.34
K437-1B 5-TGTTACTTACCTGTCTTGTCTTTC-3 SEQ ID NO.35
K437-2B 5-TGTTACTTACCTGTCTTGTCTTTA-3 SEQ ID NO.36
K436R 5-TGATTTGCCTTCTAGAACAGTAGAC-3 SEQ ID NO.37
KWT436MGB 5-CTGTCTTGTCTTTGCTGATG-3-MGB SEQ ID NO.38
K436Taqman FAM-5- ACTTCTTGCTAAGTCCTGAGC-3-BHQ-MGB SEQ ID NO.39；
所述的NRAS外显子2的12，13 编码子位点点突变引物,FAM-MGB Taqman探针以及Blocker封闭的MGB探针具体为：
N34-1B 5-TGGTGGTGGTTGGAGCAA-3 SEQ ID NO.40
N34-2B 5-TGGTGGTGGTTGGAGCAC-3 SEQ ID NO.41
N34-3B 5-TGGTGGTGGTTGGAGCAT-3 SEQ ID NO.42
N35-1B 5-GGTGGTGGTTGGAGCAGA-3 SEQ ID NO.43
N35-2B 5-GGTGGTGGTTGGAGCAGC-3 SEQ ID NO.44
N35-3B 5-GGTGGTGGTTGGAGCAGT-3 SEQ ID NO.45
N37-1B 5-GTGGTGGTTGGAGCAGGTA-3 SEQ ID NO.46
N37-2B 5-GGTGGTTGGAGCAGGTC-3 SEQ ID NO.47
N37-3B 5-GTGGTGGTTGGAGCAGGTT-3 SEQ ID NO.48
N38-1B 5-GGTGGTTGGAGCAGGTGA-3 SEQ ID NO.49
N38-2B 5-GTGGTTGGAGCAGGTGC-3 SEQ ID NO.50
N38-3B 5-GGTGGTTGGAGCAGGTGT-3 SEQ ID NO.51
N34R 5-CTCACCTCTATGGTGGGATCATAT-3 SEQ ID NO.52
N34taqman FAM-5- AAGCGCACTGACAATCC-3-BHQ-MGB SEQ ID NO.53
NWT34MGB 5-GTTGGAGCAGGTGGTGTTG-3-MGB SEQ ID NO.54；
所述的NRAS外显子3的61 编码子位点点突变引物，FAM-MGB Taqman探针以及Blocker封闭的MGB探针具体为：
N181R 5-ATGGCAAATACACAGAGGAAGC-3 SEQ ID NO.55
N181-1B 5-GACATACTGGATACAGCTGGAA-3 SEQ ID NO.56
N181-2B 5-GACATACTGGATACAGCTGGAG-3 SEQ ID NO.57
N181-3B 5-GACATACTGGATACAGCTGGAT-3 SEQ ID NO.58
N182-1B 5-CATACTGGATACAGCTGGACC-3 SEQ ID NO.59
N182-2B 5-ATACTGGATACAGCTGGACG-3 SEQ ID NO.60
N182-3B 5-ACATACTGGATACAGCTGGACT-3 SEQ ID NO.61
N183-1B 5-CATACTGGATACAGCTGGACAC-3 SEQ ID NO.62
N183-2B 5-CATACTGGATACAGCTGGACAT-3 SEQ ID NO.63
N181Taqman FAM-5- AATACATGAGGACAGGCG-3-BHQ-MGB SEQ ID NO.64
NWT181MGB 5-GATACAGCTGGACAAGAAGAG-3-MGB SEQ ID NO.65；
所述的NRAS外显子4的146编码子位点点突变引物，FAM-MGB Taqman探针以及Blocker封闭的MGB探针具体为：
N436-1B 5-ATTCCATTCATTGAAACCTCAA-3 SEQ ID NO.66
N437-1B 5-ATTCCATTCATTGAAACCTCAGT-3 SEQ ID NO.67
NWT436MGB 5-ATTGAAACCTCAGCCAAGAC-3-MGB SEQ ID NO.68
N436R 5-GAATATGGATCACATCTCTACCAG-3 SEQ ID NO.60
N436Taqman FAM-5-ACAGCTTTCAGCATTTGTG-3-BHQ-MGB SEQ ID NO.70。
2.根据权利要求1所述的用于全RAS突变检测的引物、探针，其特征在于：还包括人类基因组野生型位点引物，FAM-MGB Taqman探针，参考加样孔具体为：
RefF CCAAGGCACGAGTAACAAGCT SEQ ID NO：49
RefR AATTCCCAAGGACCACCTCAC SEQ ID NO：50
Ref-Taqman FAM-5-TCTCAGCCTCCAGAGGAT-3-BHQ-MGB SEQ ID NO：51。
3.一种的用于全RAS突变检测的检测试剂盒，其特征在于：通过所述的检测试剂盒提取DNA样本，并进行PCR反应，所述的PCR反应扩增体系如下：
10XPCR Buffer 稀释为1X
dNTP 0.2mM
模板 2uL
各引物 200-400 nM
各探针 100-400 nM
各封闭探针 200-400 nM
热启动Taq酶 1U
MgCL2 2-5mM
总体积 20uL。
4.根据权利要求3所述的用于全RAS突变检测的检测试剂盒，其特征在于：所述的PCR反应的条件如下。
5.一种用于全RAS突变检测的检测试剂盒的检测方法，其特征在于：该方法至少包括如下步骤：
步骤1：针对突变位点设计合成引物、封闭探针和检测探针；
步骤2：样本处理与DNA的提取；
步骤3：建立PCR扩增反应体系；
步骤4：分析图像后调节Baseline的Start值、End值和阈值线，判定结果。
6.根据权利要求5所述的用于全RAS突变检测的检测试剂盒的检测方法，其特征在于：所述的DNA样本包括新鲜肿瘤组织或新鲜病理组织或石蜡包埋组织。
7.根据权利要求5所述的用于全RAS突变检测的检测试剂盒的检测方法，其特征在于：取样的所述的DNA样本为1克。
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