CN111850154B - 多重荧光pcr熔解曲线法检测幽门螺杆菌耐药基因多态性的试剂盒 - Google Patents

多重荧光pcr熔解曲线法检测幽门螺杆菌耐药基因多态性的试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种多重荧光PCR熔解曲线法检测幽门螺杆菌耐药基因多态性的试剂盒，幽门螺杆菌耐药基因为以下3个基因：23S rRNA基因、16S rRNA基因、gyr A基因；试剂盒包括核酸提取试剂和核酸扩增试剂；核酸提取试剂包括超顺磁性氧化硅纳米磁珠、裂解液、洗涤液、洗脱液；核酸扩增试剂包括：分别与幽门螺杆菌耐药基因23S rRNA基因、16S rRNA基因、gyr A基因、内标基因人类管家基因β‑globin对应的引物对和探针。本发明可在单管中同时检测三个耐药位点和1个内标基因，提高样本检测通量；同时改善检测体系中多对引物探针间的干扰，有效提高试剂检测的灵敏度和特异性。

Description

多重荧光PCR熔解曲线法检测幽门螺杆菌耐药基因多态性的 试剂盒
技术领域
本发明属于生物学检测技术领域，涉及一种多重荧光PCR熔解曲线法检测幽门螺杆菌耐药基因多态性的试剂盒。本试剂盒用于胃粘膜组织样本中对幽门螺杆菌gyrA基因、23S rRNA基因、16S rRNA基因上常见耐药突变的定性检测，辅助临床治疗的药物选择。
背景技术
目前对幽门螺杆菌耐药的检测方法包括药敏检测、核酸测序、TaqMan实时荧光PCR法等。药敏检测为幽门螺杆菌耐药检测的金标准方法，可以直观确定幽门螺杆菌对何种抗生素具有耐药性；核酸测序法可以借助不同的测序引物对待测样本进行测序，通过对耐药基因核酸序列进行比对，评估耐药基因是否发生突变；TaqMan实时荧光PCR法借助荧光检测平台，实现分别对待测物各耐药基因的检测，可有效区分各耐药基因的突变方向。
现有技术存在的问题：
目前对幽门螺杆菌耐药检测的方法有多种，临床上使用较多的是体外药敏试验，即通过培养幽门螺杆菌与不同种类的抗生素进行体外培养从而确定其的最低抑菌浓度，从而判断是否对所测试抗生素具有耐药性。该方法大概可分为肉汤微量稀释法、纸片扩散法、E-test、琼脂稀释法等。纸片扩散法操作简单，价格较为低廉，但是缺乏可用的标准纸片浓度，没有标准的有效抑制直径，只能得到定性数据；肉汤微量稀释法操作较为繁琐，但能够得到细菌临床分离株对于抗菌药物的MIC值；琼脂稀释法是CLSI规定的检测幽门螺杆菌抗菌药物敏感性的标准方法，能够快速、准确得到临床分离株是否对某种抗生素具有耐药性，但是该方法操作繁琐，技术要求高，需要花费大量时间，常被用作评估其他方法的对照法或进行大样本的研究，不适合运用于临床个例；E-test法可测定连续的MIC值，且适合运用于幽门螺杆菌这种生产缓慢的细菌，操作简单，在临床标本的使用上比较方便，但价格较高、不易普及推广。
中国发明专利申请CN201610943701公开了一种检测幽门螺杆菌耐药突变位点的试剂盒和方法，该专利是利用经过blocker修饰的引物对未发生突变的耐药位点进行封闭，然后利用ARMS引物针对突变的耐药位点进行扩增，通过ARMS引物对各耐药位点进行突变检测。在该检测过程中存在以下几方面问题：1、Blocker修饰的引物与扩增引物竞争与靶标结合，降低扩增引物与靶标的结合效率，导致灵敏度降低；2、ARMS引物检测原理是依靠个别碱基差异进行型别区分，因此会出现由于引物错配引起的假阳性结果，导致特异性降低；3、该体系中需要针对不同的突变位点需设置不同的ARMS引物和blocker引物，试剂成本会比较高，提高检测成本，增加病人的检测费用。4、检测一个样本的7个碱基突变方向，需要1个样本检测8次，以确定碱基是否发生突变，导致在临床检测中操作繁琐、检测通量低，检测费用高，不适于临床使用。
中国发明专利申请CN201810901562公开了一种基于人工模拟核酸分子信标的检测幽门螺杆菌克拉霉素耐药位点的方法与试剂盒，该专利的本质是进行荧光PCR检测，只是检测探针使用具有茎环结构的beacon探针，增加探针的稳定性，降低背景值。但是它存在以下几方面问题：1、使用荧光PCR法对幽门螺杆菌进行突变检测，单孔中只能进行一个突变位点的单个方向的突变检测，不同位点及不同突变方向需要在不同的反应管中进行，样本的检测通量小；2、该专利只能检测幽门螺杆菌的23S rRNA基因2142、2143位点是否发生突变，不能判断该样本是否感染野生型的幽门螺杆菌；3、该专利只能检测幽门螺杆菌23S rRNA基因上2142和2143位点的突变，不能同时对喹诺酮类抗生素和四环素的耐药基因进行突变检测，增加临床检测的成本及时间。4、该专利所描述的试剂盒中不设置内对照，不能监控样本从取样、提取、扩增等过程中是否存在异常，不能保证结果的准确性。
中国发明专利申请CN201911327235公开了检测幽门螺杆菌的分子信标探针、试剂盒及其检测方法，该专利利用beacon探针进行荧光原位杂交检测，存在以下几个问题：1、检测过程步骤较为繁琐，经过杂交，多次清洗等步骤，操作时间较长，且操作过程中容易丢失信号，出现假阴性结果；2、探针不能达到100%杂交到靶片段上，杂交率受到探针的影响，降低检测灵敏度；3、在胃粘膜样本中利用探针杂交的方法检测幽门螺杆菌，未经过PCR扩增，样本中的幽门螺杆菌含量低时，不能检出阳性，导致漏检，降低灵敏度。4、该方法虽然不需要配备PCR仪，但是后期杂交结果需要通过显微镜目测进行判读，结果保存不完整、结果判定受到人为因素影响较大，且显微镜的使用限制该种检测方法无法推广到临床单位或基础医疗单位进行相关检测。
分子生物学技术检测幽门螺杆菌耐药性的方法也较多，其中以PCR技术及其衍生的分子技术是重要的检测手段，常规的荧光PCR检测进行多个耐药基因的突变检测时，由于本身检测原理及扩增仪荧光检测通道个数的限制，导致临床样本的检测通量降低，增加临床检测的工作量。熔解曲线法是在PCR扩增后加入熔解曲线程序，通过杂交荧光值的变化判断待检物的检测结果。由于荧光染料多为非特异性结合，限制了单个反应管中的靶标检测个数，因此采用荧光熔解曲线法检测幽门螺杆菌多个耐药基因目前存在一定的技术困难或技术障碍。目前尚未有文献公开采用熔解曲线法检测幽门螺杆菌多个耐药基因的应用。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种多重荧光PCR熔解曲线法检测幽门螺杆菌耐药基因（16S rRNA、23S rRNA、gyrA基因）多态性的试剂盒。其解决了现有技术熔解曲线法由于荧光染料多为非特异性结合，限制了单个反应管中的靶标检测个数的局限性。本发明使用荧光素对不同靶标进行标记，根据荧光素的差异，区分同一样本管中不同靶标的检出结果。通过不同的体系优化和引物筛选，本发明可在单管中同时检测三个耐药位点和1个内标基因，提高样本检测的检测通量；同时改善了检测体系中多对引物探针间的干扰，对探针进行优化降低背景荧光值，有效提高试剂检测的灵敏度和特异性，从而最终达到利用荧光熔解曲线同时检测幽门螺杆菌三个耐药位点的目的，为临床治疗幽门螺杆菌耐药基因的检测提供快速、高效的方法。
为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
一种多重荧光PCR熔解曲线法检测幽门螺杆菌耐药基因多态性的试剂盒，所述幽门螺杆菌耐药基因为以下3个基因：23S rRNA基因、16S rRNA基因、gyrA基因；所述耐药基因突变位点为：克拉霉素（2142A>G、2142A>C、2143A>G），四环素（926-928AGA），喹诺酮类（Asn87-Lys Asp91-Gly/Asn/Tyr）；所述试剂盒包括核酸提取试剂和核酸扩增试剂；所述核酸提取试剂包括超顺磁性氧化硅纳米磁珠、裂解液、洗涤液、洗脱液；所述核酸扩增试剂包括：与幽门螺杆菌耐药基因23S rRNA基因对应的引物对和探针、与幽门螺杆菌耐药基因16SrRNA基因对应的引物对和探针、与幽门螺杆菌耐药基因gyrA基因对应的引物对和探针、以及与内标基因人类管家基因β-globin对应的引物对和探针；
所述与幽门螺杆菌耐药基因23S rRNA基因对应的引物对和探针，其上游引物为如SEQ ID NO.1所示序列，其下游引物为如SEQ ID NO.2所示序列，其探针序列为如SEQ IDNO.3所示序列；
所述与幽门螺杆菌耐药基因16S rRNA基因对应的引物对和探针，其上游引物为如SEQ ID NO.4所示序列，其下游引物为如SEQ ID NO.5所示序列，其探针序列为如SEQ IDNO.6所示序列；
所述与幽门螺杆菌耐药基因gyrA基因对应的引物对和探针，其上游引物为如SEQID NO.7所示序列，其下游引物为如SEQ ID NO.8所示序列，其探针序列为如SEQ ID NO.9所示序列。
所述探针的5’端和3’端分别连接有荧光报告基团和荧光淬灭基团；其中，荧光报告基团选自FAM、HEX、TET、CY3、Red-X、TAMRA、ROX中的任意两种；荧光淬灭基团选自Dabcy1、BHQ1、BHQ2、MGB中的任意一种或两种。所述与幽门螺杆菌耐药基因23S rRNA基因对应的探针优选为：探针KLMS-P: 5’ HEX- GACGGAAAGACCCCGT-BHQ1 3’ ，如SEQ ID NO.3所示。所述与幽门螺杆菌耐药基因16S rRNA基因对应的探针优选为：探针TET-P: 5’ FAM-TGGTTTAATTCGAAGATACACGAA-BHQ1 3’ ，如SEQ ID NO.6所示。所述与幽门螺杆菌耐药基因gyrA基因对应的探针优选为：探针KNT-P: 5’FAM-CGATAATGCGTTTATGATGC-BHQ1 3’ ，如SEQID NO.9所示。
使用上述的引物对搭配相应的探针可对3个耐药基因的突变位点同时进行检测，并可单管完成3个耐药基因的突变检测，检测时间短，扩增效率及灵敏度高、成本低、操作方便。
所述核酸提取试剂中，裂解液为异硫氰酸胍、盐酸胍和柠檬酸三钠中的任意一种或多种；洗涤液为乙醇和/或胍盐；洗脱液为TE缓冲液。本试剂盒采用磁珠提取法用于胃粘膜组织核酸提取，该法运用纳米技术对超顺磁性纳米颗粒的表面进行改良和表面修饰后，制备成超顺磁性氧化硅纳米磁珠。该磁珠能在微观界面上与核酸分子特异性地识别和高效结合。利用氧化硅纳米微球的超顺磁性，在裂解液（盐酸胍、异硫氰酸胍等）的作用下，使血液、动物组织、食品、病原微生物等样本中的细胞裂解，然后加入磁珠，当溶液的PH值小于6.5时，磁珠选择性的与提取的DNA/RNA结合，此时将吸附有DNA/RNA的磁珠置于磁场中，通过洗涤液（乙醇等）去除没有被吸附的杂质（蛋白等），然后将磁珠置于PH值8.5的洗脱液（TE缓冲液）中，纯化的DNA/RNA即可进入洗脱液中，然后用于作为后续PCR扩增的模板。磁珠法提取核酸既可以保证较高的核酸提取效率，同时有利于核酸检测过程自动化的实行。
本试剂盒采用人类管家基因β-globin的引物对，其序列如下：
上游引物：5’- GTGCACCTGACTCCTGAGGA -3’ ，如SEQ ID NO.10所示序列；
下游引物：5’- CTTGATACCAACCTGCCCAG -3’ ，如SEQ ID NO.11所示序列；
所述人类管家基因β-globin的探针序列如下：
5’- AGGTGAACGTGGATGAAGTTGGTGG -3’，如SEQ ID NO.12所示序列或其互补链；探针的5’端标记HEX基团作为荧光基团，3’端使用BHQ1作为淬灭基团。
以人类管家基因β-globin作为内标和幽门螺杆菌同时进行核酸提取，PCR扩增等过程，可以监测整个检测过程，保证结果的有效性。
所述核酸扩增试剂除包含各耐药基因检测的引物对及探针外，还包括核酸扩增所需的其他试剂，如PCR缓冲溶液和盐溶液。PCR缓冲溶液优选Tris-HCl，盐溶液可选MgSO4、KCl等。按照反应体系25μL计算 ，限制性引物（限制性引物指浓度受到限制的引物，如SEQID NO.1、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.10所示引物）的浓度为0.01-0.1μM，过量引物（过量引物指过量加入的引物，如：SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.8、SEQ IDNO.11所示引物）的浓度为0.1-1μM，探针浓度为0. 1-0.2μM；DNA聚合酶1U/test-5U/test；PCR缓冲液包括：Tris的浓度为0.5mM-2 mM；KCl浓度为0.5mM-2 mM；Mg2+浓度为2 mM -5 mM；dNTPs浓度为2 mM -5mM。
本试剂盒除包含PCR反应液外还包含阳性对照品和阴性对照品。阳性对照品中含有所述三个耐药基因的突变质粒和野生型质粒，阴性对照品为含有人基因组的TE缓冲液。
所述试剂盒检测23S rRNA基因的突变位点为2142、2143耐药位点，检测16S rRNA基因的突变位点为926-928耐药位点，检测gyrA基因的突变位点为260-261、271-272耐药位点，采用该试剂盒进行23S rRNA基因、16S rRNA基因、gyrA基因突变位点检测的方法包括以下步骤：
第一步，样本的核酸提取：将胃粘膜样本经过预处理后，依次加入核酸提取试剂，在核酸提取仪中进行操作，最后取洗脱液作为PCR反应模板；
第二步，试剂配制：将PCR反应液、引物探针溶液按照18:2的比例配制PCR扩增反应液；
第三步，PCR扩增：将第二步中配制的PCR扩增反应液中加入第一步中得到的PCR反应模板进行PCR扩增反应，并且阳性对照品与阴性对照品与样本同时进行PCR扩增反应；
第四步，检测PCR反应体系中的各通道检出熔解峰Tm值得差异判断待检样本中是否存在幽门螺杆菌耐药基因的突变。
作为优选的技术方案，第三步所述PCR扩增中，PCR扩增程序为： 95℃热变性2min；按95℃ 10sec，60℃ 40sec交替循环40次；熔解曲线程序为：95℃保持2min，25℃保温2min，25℃-75℃升温并以4.4℃/s的升温速度进行熔解曲线分析，并采集FAM及HEX通道的荧光信号。
作为优选的技术方案，第四步中，三个耐药基因和内标基因对应的荧光基团及其Tm值关系如下表1所示：
Figure 482586DEST_PATH_IMAGE001
如表1所示，本方法对待测样本中的幽门螺杆菌耐药基因16S rRNA、23S rRNA、gyrA基因进行多重检测，可通过多个荧光通道下的熔解曲线峰的Tm值判断耐药基因是否发生突变。本发明中只采用两种荧光基团标记便可以单管同时检测3种耐药基因和1种内标基因的检测，相比荧光探针检测法的检测通量更高，成本更低。
本发明采用不对称PCR(asymmetric PCR)和熔解曲线相结合的方法，实现单管多重荧光PCR熔解曲线检测的目的。
荧光PCR熔解曲线分析法利用基因发生突变导致DNA双链的结合力下降，从而导致相应的DNA熔解温度（Tm值）下降，即野生型基因有特定的Tm值，而突变型基因由于核酸结合能力下降导致Tm值发生变化，Tm值下降的幅度与发生错配的碱基数、位置和碱基类型有关，根据Tm值得差异区分和检测出突变型和野生型。
根据待测基因设计一对引物和探针，将引物添加浓度设置为不同的浓度水平，实现不对称PCR的目的，从而产生大量的单链靶标序列，便于后续探针进行熔解曲线程序，从而根据探针的荧光标记以及检出Tm值的差异，判断所检测样本中各耐药基因是否发生突变。
本发明所包含的药物及耐药基因突变位点为：克拉霉素（2142A>G、2142A>C、2143A>G
），四环素（926-928AGA），喹诺酮类（Asn87-Lys Asp91-Gly/Asn/Tyr）。针对上述突变位点的碱基设计特异性引物，扩增各耐药位点的靶标片段，并在上下游引物之间针对突变位点设计一条探针，5’端标记荧光报告基团，3’端标记荧光淬灭基团。探针未与靶标序列结合时，探针为自由状态，报告基团和淬灭基因距离较近，报告基团发射的荧光被淬灭基团吸收，仪器检测不到信号。随着PCR的进行，核酸经过多循环的变性、退火、延伸，使得单链靶标在反应管中积累。在PCR反应结束后，进行熔解曲线程序，使产物从低温向高温变化，低温时探针为自由状态时，由于荧光报告基团与荧光淬灭基团靠近，荧光被淬灭；当温度升高，扩增产物和探针的二级结构遭到破坏，探针与靶序列结合后，探针的空间构型发生改变，荧光基团与淬灭基团远离，从而产生荧光信号；随着温度的继续升高，探针从靶序列上脱离下来，二级结构呈现自由卷曲，荧光信号降低，从而荧光信号经计算后产生一个峰型，根据产生熔解峰的Tm值即可判断耐药基因是否发生突变。
熔解曲线分析法是利用探针与靶标结合时，由于靶标序列上存在突变碱基，所以探针在与具有不同突变碱基的序列结合时产生的结合力不同，导致最终熔解曲线中检出融解峰的Tm值不同，根据Tm值差异可判断靶标片段中是否存在碱基突变。
上述技术方案中，不同的耐药基因对应不同的长度的荧光探针，从而使得不同的荧光探针具有不同的检出Tm值，并通过最后的多色荧光熔解曲线分析，在多个荧光通道产生不同Tm值的DNA产物特异熔解峰，从而实现基于熔解曲线分析的PCR多重检测。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1、本发明基于优选扩增反应引物，荧光探针的熔解曲线检测方法，其能克服荧光定量PCR方法检测通量低、成本高等缺点，在单孔反应管利用两种荧光标记实现三个耐药位点和1个内标基因的检测，有效提高检测通量；克服单管内多荧光检测体系中易出现的多引物探针交叉干扰的问题，提高试剂本身的灵敏度和特异性；并平衡各靶标的检测能力差异，使样本不同靶标的检测能力相近，提高试剂检测结果的准确性。因此本试剂盒具有灵敏度高、特异性强、通量高等优点。
2、本发明利用熔解曲线技术，可单管检测多个靶标基因，实现多重检测的目的。
3、可有效区分目的基因是否发生突变，预示该例样本中的幽门螺杆菌是否具有特定药物的耐药性。
4、检测时间较短，3个小时内即可完成96个样本的检测。
5、本发明检出灵敏度高，可有效降低临床检测中假阴性结果的出现。
6、与中国发明专利申请CN201610943701相比，本发明具有更高的灵敏度和特异性，降低试剂成本和检测成本，降低病人的检测费用；在临床检测中操作简单、检测通量高，更适于临床使用。
7、与中国发明专利申请CN201810901562相比，本发明样本的检测通量高，是中国发明专利申请CN201810901562的3倍。本发明不仅能检测幽门螺杆菌16S rRNA、23S rRNA、gyrA基因的位点突变，能判断该样本是否感染野生型的幽门螺杆菌，还能同时对喹诺酮类抗生素和四环素的耐药基因进行突变检测，降低了临床检测的成本及时间；此外，本发明试剂盒设置内对照，能监控样本从取样、提取、扩增等过程中是否存在异常，能保证结果的准确性。
8、与中国发明专利申请CN201911327235相比，本发明检测过程步骤更简单，操作时间较短，准确率更高、检测灵敏度更高；结果保存完整、结果判定不受人为因素影响，适合推广到临床单位或基础医疗单位进行相关检测。
9、根据检索结果，复旦大学申请的一种幽门螺杆菌左氧氟沙星耐药检测方法专利(申请号201910738245.7)中介绍了一种针对左氧氟沙星耐药基因喹诺酮结合位点gyrA基因进行PCR检测的方法，由于相同抗生素的耐药位点均是一致的，所以检测探针的部分序列相同，但本发明针对引物和探针序列进行多次优化，筛选不同的引物位置，针对gyrA基因野生和突变判断界限存在灰区的问题和对空肠弯曲杆菌存在非特异性检出的问题，进行不同方向的优化，最终确定了清晰的结果判断标准，提高了试剂的灵敏度和特异性，达到了现有技术无法预期的效果。经对比试验验证，本发明大大提高了试剂检测结果的准确性，达到了201910738245.7专利申请所预料不到的技术效果。
10、经对比试验验证，本发明与参比文件2（申请号：201710396710）相比，有效缩短检测时间、提高样本检测通量、降低检测费用，达到了参比文件2所预料不到的技术效果。
附图说明
图1为本发明实施例1中幽门螺杆菌23S rRNA 2142、2143耐药位点检测图；
图2为本发明实施例1中幽门螺杆菌16S rRNA 926-928耐药位点检测图；
图3为本发明实施例1中幽门螺杆菌gyrA基因260-261、271-272耐药位点检测图。
具体实施方式
以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1：
本发明试剂盒用于幽门螺杆菌gyrA基因的260-261、271-272耐药位点、23S rRNA基因的2142、2143耐药位点、16S rRNA基因926-928 耐药位点的突变检测。
1、引物探针的设计
根据NCBI中下载的幽门螺杆菌gyrA基因、23S rRNA基和16S rRNA基因的序列经过比对后，根据比对结果围绕待检测耐药位点设计引物探针，遵循引物的设计原则，长度保持在15-25bp,引物Tm保持在53℃±2℃，探针的设计遵循探针的设计原则。设计的引物探针进行BLAST比对，确保引物探针的特异性。引物探针序列如下：
幽门螺杆菌gyrA基因耐药突变位点引物探针序列如下：
上游引物KNT-F: 5’ ATGTGATTGGTAAATACCACCCCc-3’，如SEQ ID NO.7所示；
下游引物KNT-R: 5’ CCATCCACTAATTCCAAACGCAT-3’ ，如SEQ ID NO.8所示；
探针KNT-P: 5’FAM-CGATAATGCGTTTATGATGC-BHQ1 3’ ，如SEQ ID NO.9所示；
幽门螺杆菌23S rRNA基因耐药突变位点引物探针序列如下：
上游引物KLMS-F: 5’ GAGCTGTCTCAACCAGAGATT-3’ ，如SEQ ID NO.1所示；
下游引物KLMS-R: 5’ TCCATAAGAGCCAAAGCCCTTA-3’ ，如SEQ ID NO.2所示；
探针KLMS-P: 5’ HEX- GACGGAAAGACCCCGT-BHQ1 3’ ，如SEQ ID NO.3所示；
幽门螺杆菌16S rRNA基因耐药突变位点引物探针序列如下：
上游引物TET-F: 5’ CACAAGCGGTGGAGCA-3’ ，如SEQ ID NO.4所示；
下游引物TET-R: 5’- CGACACGAGCTGACGAC-3’ ，如SEQ ID NO.5所示；
探针TET-P: 5’ FAM-TGGTTTAATTCGAAGATACACGAA-BHQ1 3’ ，如SEQ ID NO.6所示；
内标基因-人β-globin基因的引物探针序列如下：
上游引物IC-F: 5’- GTGCACCTGACTCCTGAGGA -3’ ，如SEQ ID NO.10所示；
下游引物IC-R: 5’- CTTGATACCAACCTGCCCAG -3’ ，如SEQ ID NO.11所示；
探针IC-P: 5’- AGGTGAACGTGGATGAAGTTGGTGG -3’ ，如SEQ ID NO.12所示；
2、PCR反应液A的配置
取2ml离心管，分别加入10×buffer 250μL，100mM dATP 5μL，100mM dCTP 5μL，100mM dGTP 5μL，100mM dTTP 10μL，5U/μL DNA聚合酶 50μL，用超纯水补足体积至180μL，混匀后-20℃保存备用。
3、PCR反应液B的配置
取2 ml离心管，分别加入100mM Mg2+ 100μL，100μM的KLMS的上游引物1.25μL，100μM的KLMS的下游引物25μL，100μM的KLMS的探针5μL，100μM的KNT的上游引物1.25μL，100μM的KNT的下游引物25μL，100μM的KNT的探针5μL，100μM的TET的上游引物1.25μL，100μM的TET的下游引物25μL，100μM的TET的探针5μL，用超纯水补足体积至200μL，混匀后-20℃保存备用。
4、核酸提取
将胃黏膜组织样本充分剪碎后，使用商业化的核酸提取试剂盒进行提取，获得核酸提取产物，即可进行后续的PCR检测过程。
5、PCR试剂准备
PCR反应液A与PCR反应液B按照18:2的比例进行混合，混匀后离心数秒，分装至PCR反应管中，每管20 μl，将装有PCR反应液的反应管转移至样本处理区。
6、加样（在样本处理区进行）
在装有PCR反应液的反应管中用带滤芯吸嘴分别加入5μL核酸模板，盖上管盖，混匀、离心后，转移到扩增检测区。
7、PCR扩增检测（在扩增检测区进行）
7.1 将反应管放入荧光PCR仪进行扩增检测。
7.2 循环参数设定：
Figure 151465DEST_PATH_IMAGE002
7.3 结果获取
根据仪器软件进行分析，得到各样本的检测结果。(基线优先考虑仪器自动选择；阈值线选在阴性对照正常扩增曲线的上方)
具体应用如下：
试剂盒性能指标验证
（1）试剂盒耐药基因突变检测能力考察
针对各耐药基因耐药位点的突变方向，制备不同的野生和突变类型的标准品，用于试剂盒突变检测能力的考察。
委托第三方合成公司进行各耐药基因野生型和各突变类型质粒的合成工作，并进行一代核酸测序进行序列准确性验证。将各质粒使用Nanodrop 2000测量浓度，并按照所得浓度进行稀释至检测浓度（50000 copies/mL），使用试剂对其依次进行检测，评估对耐药基因突变的检出能力。
（2）试剂盒分析特异性考察
试剂盒的分析特异性主要从交叉反应和干扰测试两个方面进行测试。交叉反应主要测试可能产生交叉反应的其他肠道病原微生物是否产生假阳性结果，有效降低试剂盒在临床检测过程中的假阳性概率。本试剂共测试交叉反应病原微生物14种，具体信息见表3。干扰测试主要指人胃粘膜组织内源性物质（如取样过程中不可避免的出血）和外源性残留物质（如各种治疗药物）对样本检测产生干扰，导致结果产生假阴性，通过干扰测试，排除各种内源物质和外源物质对样本检测结果的影响，从而提高试剂检测结果的准确性。本试剂干扰物测试选择每种干扰物质的潜在最大浓度（“最差条件”）条件下进行评价，且在待测微生物的检测临界值水平对每种干扰物质的干扰影响进行评价。所测试干扰物质名称见表4。
Figure 144829DEST_PATH_IMAGE003
Figure 102421DEST_PATH_IMAGE004
（3）验证结果
1）试剂盒耐药基因突变检测能力考察
分别对3个耐药基因的不同突变类型在同一反应管中利用两个荧光标记同时进行检测，如图1、图2和图3所示，结果表明本试剂盒可有效区分3个耐药基因的野生型与突变型，但不对具体的突变类型进行细分。
由图1-图3可得出，本试剂盒可单管检测三个靶标，借助不同基因间不同的探针与靶标结合力的差异，从而根据熔解峰Tm值的差异判断样本中3个耐药基因是否发生突变。
2）试剂盒分析特异性考察
对14种具有潜在交叉反应的病原体和12种干扰物质分别对幽门螺杆菌阴性样本和低浓度阳性样本进行检测，各样本结果检出正常，阴性样本检出阴性，阳性样本检出幽门螺杆菌阳性，且对耐药基因突变与否的判断与样本的测序结果相符，说明经过对上述病原体和干扰物质进行测试，本试剂盒对各样本检出结果正常，具有较高的分析特异性，对临床样本的检测具有更好的适用性。
实施例2：引物探针筛选和检测能力比较
引物探针作为试剂盒的关键原材料，引物探针的优化较为重要，根据NCBI中下载的幽门螺杆菌gyrA基因、23S rRNA基和16S rRNA基因的序列经过比对后，根据比对结果围绕待检测耐药位点设计引物探针，遵循引物的设计原则，长度保持在15-30bp，引物Tm保持在53℃±2℃，探针的设计遵循探针的设计原则。设计的引物探针进行BLAST比对，确保引物探针的特异性。
耐药位点序列是已知序列，不同试剂盒围绕相同的序列，对引物探针进行设计和优化，使得试剂盒之间在特异性和灵敏度方面存在较大差异。下面介绍本试剂优化后的引物探针与参比专利中的引物探针对样本检测结果的差异。
1、实验设计
针对幽门螺杆菌gyrA基因的260-261、271-272耐药位点、23S rRNA基因的2142、2143耐药位点、16S rRNA基因926-928 耐药位点的序列设计的引物探针序列，评估各序列对相同样本的检出能力的差异，筛选最优的引物探针序列。各检测位点引物探针序列见表5-表7 ：
Figure 839432DEST_PATH_IMAGE005
Figure 362818DEST_PATH_IMAGE006
Figure 199187DEST_PATH_IMAGE007
2、试验过程
（1）、按照实施例1所示的配制方法，配制试剂盒相关组分，于-20℃保存备用。
（2）、按照实施例1所示的步骤，进行PCR反应液的混合、加样、上机操作等步骤。检测仪需使用可进行多重熔解曲线检测的扩增仪。本次试验使用的扩增仪为宏石的slan。
3、试验结果
按照实施例1的判断标准，对待测样本的检测结果进行判断，并统计相关数据，统计结果如下：
Figure 440812DEST_PATH_IMAGE009
Figure 715936DEST_PATH_IMAGE011
Figure 624986DEST_PATH_IMAGE013
4、结论
根据上述引物筛选表，gyrA基因耐药位点引物探针筛选组2的灵敏度和特异性最好，该组引物体系检测结果对野生型和突变型的结果判断清晰，可以准确区分幽门螺杆菌野生型和突变型；23S rRNA基因耐药位点引物探针筛选组6相对于其他组别，对核酸序列同源性较高的空肠弯曲杆菌检出阴性，特异性良好，灵敏度较高； 16S rRNA基因各引物筛选组综合各样本熔解峰的检出峰高以及特异性检测结果，选择筛选组10作为最优选择。综合各测试样本的检出结果，当gyrA基因耐药位点的引物探针为筛选组2、23S rRNA基因耐药位点的引物探针为筛选组6、16S rRNA基因耐药位点的引物探针为筛选组10时，各样本的检测结果检出正常，幽门螺杆菌样本检出阳性，对突变结果的判断准确，且其他菌样本检出阴性，说明各耐药位点引物探针分别选择筛选组2、筛选组6、筛选组10时，检测体系的灵敏度和特异性较好，优于其他的引物筛选组。因此，确定gyrA基因选择筛选组2、23S rRNA基因选择筛选组6、16S rRNA基因选择筛选组10为最优的引物探针组合，达到了其它筛选组所预料不到的技术效果。
实施例3：临床适用性验证
（1）、按照实施例1所示的配制方法，配制试剂盒相关组分，于-20℃保存备用。
（2）、从临床单位收集300例左右胃粘膜组织样本，采用本公司已备案的组织提取试剂盒对300例左右临床样本进行提取，并用Nanodrop2000测定提取产物的纯度和浓度，样本OD260/OD280比值均在1.6-2.1之间，核酸浓度均>20ng/μL。
（3）、按照实施例1所示的步骤，进行PCR反应液的混合、加样、上机操作等步骤。检测仪需使用可进行多重熔解曲线检测的扩增仪。本次试验使用的扩增仪为宏石的slan。
按照结果判断标准，对临床样本的检测结果进行判断，并统计相关数据，统计结果如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE015
从上表11分析，针对gyrA耐药位点：本试剂盒与参比文件1（申请号201910738245.7，复旦大学左氧氟沙星耐药检测方法）相比，野生型阳性符合率达到96.75%（置信区间：92.59%，98.94%），阴性符合率达到95.51%（置信区间：90.97%，98.18%）；突变型阳性符合率达到95.71%（置信区间：91.35%，98.26%），阴性符合率达到92.52%（置信区间：87.01%，96.21%）。与参比文件1相比，本试剂盒对野生型和突变型检测的阳性符合率均高于95%，且通过测试发现参比文件1所述试剂对临床样本检测中，有部分临床样本的检出Tm值处于野生型和突变型判断的分界线上，结果判定时存在错判的可能。因此本专利所述试剂盒对临床样本的检测灵敏度更高，能更准确的区分幽门螺杆菌野生型和突变型。
本试剂盒与核酸测序法相比，野生型阳性符合率达到89.08%（置信区间：83.47%，93.30%），阴性符合率达到99.26%（置信区间：95.97%，93.30%）；突变型阳性符合率达到97.48%（置信区间：93.68%，99.31%），阴性符合率达到94.04%（置信区间：88.99%，97.24%）。
Figure DEST_PATH_IMAGE017
从上表12分析，针对23S rRNA耐药位点：本试剂盒与参比文件2相比，野生型阳性符合率达到100%（97.02%，100%），阴性符合率达到89.57%（84.64%，93.35%）；突变型阳性符合率达到96.41%（92.74%，98.54），阴性符合率达到86.09%（78.39%，91.83%）。本专利所述试剂对野生型和突变型的检测结果准确率均高于参比文件2所述试剂，对幽门螺杆菌的检测灵敏度较参比文件2高5.16%，说明本试剂盒的检测对幽门螺杆菌检测的灵敏度优于参比文件2所述试剂。本试剂盒与核酸测序法相比，野生型阳性符合率达到98.32%（94.06%，99.80%），阴性符合率达到97.91%（94.73%，99.43%）；突变型阳性符合率达到99.49%（97.19%，99.99%），阴性符合率达到92.11%（85.54%，96.33%），说明本专利所述试剂盒具有较高的灵敏度和特异性，具有较好的临床适用性。
Figure DEST_PATH_IMAGE019
从上表13分析，针对16S rRNA耐药位点：本试剂盒与核酸测序法相比，野生型阳性符合率达到99.25%（97.33%，99.91%），阴性符合率达到88.10%（74.37%，96.02%）；突变型阳性符合率达到81.40%（66.60%，91.61%），阴性符合率达到98.87%（96.75%，99.77%）。
综合上述内容，本试剂盒分别与参比文件1、参比文件2做同步测试，结果显示，参比专利1与本专利中的gyrA耐药基因的检测位点、方法学相似，但是通过同步对比试验发现参比文件1对临床样本测试过程中有部分样本存在野生型和突变型结果判断存在错判的可能，而本发明则大大提高了试剂检测结果的准确性，达到了参比文件1所预料不到的技术效果。参比文件2与本专利所述试剂检测耐药位点相同，但检测方法学不同，参比专利2检测侧重耐药位点突变方向的区分，从而降低样本的检测通量，增加检测成本，而目前尚无数据显示同一耐药位点不同的突变类型所产生的的耐药性有所区别，因此利用本试剂盒对各耐药位点进行突变检测更适宜临床应用，有效缩短检测时间、提高样本检测通量、降低检测费用，达到了参比文件2所预料不到的技术效果。
综上所述，上述各实施例仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，皆应包含在本发明的保护范围内。
序列表
<110>上海芯超生物科技有限公司
<120>多重荧光PCR熔解曲线法检测幽门螺杆菌耐药基因多态性的试剂盒
<130> PDYS-WH-NP-20-100771
<160> 12
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物
<400> 1
gagctgtctc aaccagagat t 21
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物
<400> 2
tccataagag ccaaagccct ta 22
<210> 3
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 3
gacggaaaga ccccgt 16
<210> 4
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物
<400> 4
cacaagcggt ggagca 16
<210> 5
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物
<400> 5
cgacacgagc tgacgac 17
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 6
tggtttaatt cgaagataca cgaa 24
<210> 7
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物
<400> 7
atgtgattgg taaataccac cccc 24
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物
<400> 8
ccatccacta attccaaacg cat 23
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 9
cgataatgcg tttatgatgc 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物
<400> 10
gtgcacctga ctcctgagga 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物
<400> 11
cttgatacca acctgcccag 20
<210> 12
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 12
aggtgaacgt ggatgaagtt ggtgg 25

Claims (10)

1.一种多重荧光PCR熔解曲线法检测幽门螺杆菌耐药基因多态性的试剂盒，其特征在于，所述幽门螺杆菌耐药基因为以下三个耐药基因：23S rRNA基因、16S rRNA基因、gyrA基因；所述耐药基因突变位点为：克拉霉素2142A>G、2142A>C、2143A>G，四环素926-928AGA，喹诺酮类Asn87-Lys Asp91-Gly/Asn/Tyr；所述试剂盒包括核酸提取试剂和核酸扩增试剂；所述核酸提取试剂包括超顺磁性氧化硅纳米磁珠、裂解液、洗涤液、洗脱液；所述核酸扩增试剂包括：与幽门螺杆菌耐药基因23S rRNA基因对应的引物对和探针、与幽门螺杆菌耐药基因16S rRNA基因对应的引物对和探针、与幽门螺杆菌耐药基因gyrA基因对应的引物对和探针、以及与内标基因人类管家基因β-globin对应的引物对和探针；
所述与幽门螺杆菌耐药基因23S rRNA基因对应的引物对和探针，其上游引物为如SEQID NO.1所示序列，其下游引物为如SEQ ID NO.2所示序列，其探针序列为如SEQ ID NO.3所示序列；
所述与幽门螺杆菌耐药基因16S rRNA基因对应的引物对和探针，其上游引物为如SEQID NO.4所示序列，其下游引物为如SEQ ID NO.5所示序列，其探针序列为如SEQ ID NO.6所示序列；
所述与幽门螺杆菌耐药基因gyrA基因对应的引物对和探针，其上游引物为如SEQ IDNO.7所示序列，其下游引物为如SEQ ID NO.8所示序列，其探针序列为如SEQ ID NO.9所示序列。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述探针的5’端和3’端分别连接有荧光报告基团和荧光淬灭基团；其中，荧光报告基团选自FAM、HEX、TET、CY3、Red-X、TAMRA、ROX中的任意两种；荧光淬灭基团选自Dabcy1、BHQ1、BHQ2、MGB中的任意一种或两种。
3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述人类管家基因β-globin的引物对，其序列如下：
上游引物：5’- GTGCACCTGACTCCTGAGGA -3’ ，如SEQ ID NO.10所示序列；
下游引物：5’- CTTGATACCAACCTGCCCAG -3’ ，如SEQ ID NO.11所示序列；
所述人类管家基因β-globin的探针序列如下：
5’- AGGTGAACGTGGATGAAGTTGGTGG -3’，如SEQ ID NO.12所示序列；探针的5’端标记HEX基团作为荧光基团，3’端使用BHQ1作为淬灭基团。
4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述核酸提取试剂中，裂解液为异硫氰酸胍、盐酸胍和柠檬酸三钠中的任意一种或多种；洗涤液为乙醇和/或胍盐；洗脱液为TE缓冲液。
5.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述核酸扩增试剂还包括PCR缓冲溶液和盐溶液。
6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR缓冲溶液为Tris-HCl；所述盐溶液为MgSO4或KCl；按照反应体系25μL计算 ，限制性引物如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.4、SEQ IDNO.7、SEQ ID NO.10所示引物的浓度为0.01-0.1μM，过量引物如：SEQ ID NO.2、SEQ IDNO.5、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.11所示引物的浓度为0.1-1μM，探针浓度为0. 1-0.2μM；DNA聚合酶1U/test-5U/test；PCR缓冲溶液包括：Tris-HCl的浓度为0.5mM-2 mM；KCl浓度为0.5mM-2 mM；Mg2+浓度为2 mM -5 mM；dNTPs浓度为2 mM -5mM。
7.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阳性对照品和阴性对照品；阳性对照品中含有所述三个耐药基因的突变质粒和野生型质粒，阴性对照品为含有人基因组的TE缓冲液。
8.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒检测23S rRNA基因的突变位点为2142、2143耐药位点，检测16S rRNA基因的突变位点为926-928耐药位点，检测gyrA基因的突变位点为260-261、271-272耐药位点，采用该试剂盒进行23S rRNA基因、16S rRNA基因、gyrA基因突变位点检测的方法包括以下步骤：
第一步，样本的核酸提取：将胃粘膜样本经过预处理后，依次加入核酸提取试剂，在核酸提取仪中进行操作，最后取洗脱液作为PCR反应模板；
第二步，试剂配制：将PCR反应液、引物探针溶液按照18:2的比例配置PCR扩增反应液；
第三步，PCR扩增：将第二步中配置的PCR扩增反应液中加入第一步中得到的PCR反应模板进行PCR扩增反应，并且阳性对照品与阴性对照品与样本同时进行PCR扩增反应；
第四步，检测PCR反应体系中的各通道检出熔解峰Tm值的差异判断待检样本中是否存在幽门螺杆菌耐药基因的突变。
9.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，第三步所述PCR扩增中，PCR扩增程序为：95℃热变性2min；按95℃ 10sec，60℃ 40sec交替循环40次；熔解曲线程序为：95℃保持2min，25℃保温2min，25℃-75℃升温并以4.4℃/s的升温速度进行熔解曲线分析，并采集FAM及HEX通道的荧光信号。
10.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，第四步中，三个耐药基因和内标基因对应的荧光基团及其Tm值关系如下：
待检测靶基因为gyrA基因，检测通道为FAM，检测方向为野生时，检出Tm值为：43℃<Tm<51℃；
待检测靶基因为gyrA基因，检测通道为FAM，检测方向为突变时，检出Tm值为：<43℃；
待检测靶基因为16S rRNA，检测通道为FAM，检测方向为野生时，检出Tm值为：69℃±2℃；
待检测靶基因为16S rRNA，检测通道为FAM，检测方向为突变时，检出Tm值为：53℃<Tm<67℃；
待检测靶基因为23S rRNA，检测通道为HEX，检测方向为野生时，检出Tm值为：59℃±2℃；
待检测靶基因为23S rRNA，检测通道为HEX，检测方向为突变时，检出Tm值为：<50℃；
待检测靶基因为β-globin，检测通道为HEX时，检出Tm值为：68℃±2℃。
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