CN117683919A - 一种检测突变位点的单碱基替换的引物及其在制备检测幽门螺杆菌耐药基因相关产品中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测突变位点的单碱基替换的引物及其在制备检测幽门螺杆菌耐药基因相关产品中的应用。与现有技术中检测幽门螺杆菌耐药基因突变位点的常用方法相比，本发明不必针对每一个突变位点设计单独的一对引物探针组合，而是能够实现多个突变位点共用一对下游引物和探针，且10个突变位点只用一管反应即可全部检出，操作简便，经济高效。并且本发明的pool‑ARMS方法的最低检测限仅为1pg/μL，特异性高，重复性好，结果准确可靠，极大提高了幽门螺旋杆菌耐药性的临床判定效率，具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及一种检测突变位点的单碱基替换的引物及其在制备检测幽门螺杆菌耐药基因相关产品中的应用。
背景技术
幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)是一种螺旋形、微需氧的革兰氏阴性杆菌，在美国卫生及公共服务部发布的第15版致癌物报告中，Hp被列为明确致癌物。Hp感染首先引起慢性胃炎，并导致胃溃疡和胃萎缩，严重者发展为胃癌或黏膜相关组织淋巴瘤，严重危害人类的健康。在我国居民人口中，Hp的感染率为59％，是重要的公共卫生问题。
根除幽门螺杆菌通常采用四联疗法，即两种抗生素、胃黏膜保护剂和质子泵抑制剂联合治疗。用于治疗幽门螺杆菌感染的抗生素主要有阿莫西林、克拉霉素、四环素、左氧氟沙星、甲硝唑、呋喃唑酮等。然而，临床治疗中已发现Hp对抗生素耐药性的快速发展。在过去二十年中，全球范围内报告了Hp抗生素耐药性的增加，同时根除成功率持续下降，各个国家或地区推荐的一线方案的治疗指南对大约10～30％患者治疗持续失败。除阿莫西林、四环素和呋喃唑酮的耐药率保持在0～5％，克拉霉素和左氧氟沙星的耐药率已达20～45％，甲硝唑的耐药率则达到40～70％。同时尽管四环素和呋喃唑酮的耐药率较低，但二者的用药十分严格，只能在初次治疗失败后才会施用，并且2018年国家药监局也颁布了修订呋喃唑酮片说明书公告，将呋喃唑酮限用于“难以根除的Hp感染”。甲硝唑由于其高耐药率，已经不在临床考虑范围。所以，幽门螺杆菌耐药性的检测评定对于临床治疗及根除HP具有重要的指导意义。
目前，现有技术中通常通过检测幽门螺杆菌的耐药基因型来评定其耐药性。CN114592081A公开了ARMS-PCR的方法检测幽门螺杆菌耐药基因突变，存在以下几个问题：1、△Ct cut-off值取决于突变位点的外控Ct值，每一管PCR反应必须检测外控Ct值且外控Ct值须保持一致，批间一致性无法保证；2、上下游引物均进行了硫代修饰，提高检测成本，增加病人的检测费用；3、没有菌种鉴定基因引物探针，无法判断是否感染野生型幽门螺杆菌。CN111850154A公开了一种利用多重荧光PCR溶解曲线法检测幽门螺杆菌耐药基因多态性的试剂盒，但是结果判读繁琐，野生型和突变型的溶解峰需要人工查验，耗费大量时间。因此，目前缺少快速、准确且便捷地检测幽门螺杆菌的耐药基因并分型的方法。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供了一种检测突变位点的单碱基替换的引物及其在制备检测幽门螺杆菌耐药基因相关产品中的应用。
本发明的第一个目的是提供一种检测突变位点的单碱基替换的上游引物。
本发明的第二个目的是提供一种检测突变位点的单碱基替换的引物组。
本发明的第三个目的是提供所述引物组在制备幽门螺杆菌耐药基因的检测产品中的应用。
本发明的第四个目的是提供一种检测幽门螺杆菌的耐药基因的突变位点的引物探针组合物。
本发明的第五个目的是提供所述引物探针组合物在制备检测幽门螺杆菌耐药基因的试剂盒中的应用。
本发明的第六个目的是提供一种检测幽门螺杆菌耐药基因的试剂盒。
为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：
本发明提出了一种新的检测幽门螺杆菌耐药基因突变的方法，该方法不仅简化了探针和引物的设计与数量，可多个突变位点共用一对下游引物和探针，无需一个位点设计一对引物探针，大大节省成本，同时还只会对突变型核酸进行扩增，野生型核酸无扩增，判读结果简单。
一种检测突变位点的单碱基替换的上游引物，所述上游引物靶向结合所述突变位点的下游15bp～25bp的区域；
将模板链上的所述突变位点的野生型碱基记为X1，X1在非模板链上的互补碱基记为X1’；将模板链上的X1下游第一位碱基记为Y，Y在非模板链上的互补碱基记为Y’；将模板链上的突变位点的突变型碱基记为X2；将上游引物3’端的倒数第二个碱基和第一个依次记为Y”和Z，Y”与Y’的碱基种类不同，Z与X2的碱基种类相同；
X2和X1’的碱基种类为A-T、T-A、A-C、C-A、T-G、G-T、C-G、G-C、A-A或G-G中的一种，则调整Y”的碱基种类使得Y”和Y’的碱基种类为A-G、G-A、T-T、T-C、C-T或C-C中的一种；
X2和X1’依次为A-G、G-A、T-T、T-C、C-T或C-C中的一种，则调整Y”的碱基种类使得Y”和Y’依次为A-T、T-A、A-C、C-A、T-G、G-T、C-G、G-C、A-A或G-G中的一种。
优选地，所述X2和X1’的碱基种类为A-T、T-A、A-C、C-A、T-G、G-T、C-G、G-C、A-A或G-G中的一种，所述上游引物中的Z还设有锁核酸修饰。
一种检测突变位点的单碱基替换的引物组，包含上游引物和下游引物，所述上游引物靶向结合所述突变位点的下游15bp～25bp的区域；
将模板链上的所述突变位点的野生型碱基记为X1，X1在非模板链上的互补碱基记为X1’；将模板链上的X1下游第一位碱基记为Y，Y在非模板链上的互补碱基记为Y’；将模板链上的突变位点的突变型碱基记为X2；将上游引物3’端的倒数第二个碱基和第一个依次记为Y”和Z，Y”与Y’的碱基种类不同，Z与X2的碱基种类相同；
X2和X1’的碱基种类为A-T、T-A、A-C、C-A、T-G、G-T、C-G、G-C、A-A或G-G中的一种，则调整Y”的碱基种类使得Y”和Y’的碱基种类为A-G、G-A、T-T、T-C、C-T或C-C中的一种；
X2和X1’依次为A-G、G-A、T-T、T-C、C-T或C-C中的一种，则调整Y”的碱基种类使得Y”和Y’依次为A-T、T-A、A-C、C-A、T-G、G-T、C-G、G-C、A-A或G-G中的一种。
优选地，所述X2和X1’的碱基种类为A-T、T-A、A-C、C-A、T-G、G-T、C-G、G-C、A-A或G-G中的一种，所述上游引物中的Z还设有锁核酸修饰。
优选地，所述突变位点有若干个，且相隔距离为1bp～12bp，则所述引物组包含若干个所述上游引物和1个所述下游引物。
任一所述引物组在制备检测幽门螺杆菌耐药基因的试剂盒中的应用也应在本发明的保护范围之内。
一种检测幽门螺杆菌耐药基因的引物探针组合物，包含探针和引物组，所述引物组，包含上游引物和下游引物，所述上游引物靶向结合所述突变位点的下游15bp～25bp的区域；
将模板链上的所述突变位点的野生型碱基记为X1，X1在非模板链上的互补碱基记为X1’；将模板链上的X1下游第一位碱基记为Y，Y在非模板链上的互补碱基记为Y’；将模板链上的突变位点的突变型碱基记为X2；将上游引物3’端的倒数第二个碱基和第一个依次记为Y”和Z，Y”与Y’的碱基种类不同，Z与X2的碱基种类相同；
X2和X1’的碱基种类为A-T、T-A、A-C、C-A、T-G、G-T、C-G、G-C、A-A或G-G中的一种，则调整Y”的碱基种类使得Y”和Y’的碱基种类为A-G、G-A、T-T、T-C、C-T或C-C中的一种；
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优选地，所述X2和X1’的碱基种类为A-T、T-A、A-C、C-A、T-G、G-T、C-G、G-C、A-A或G-G中的一种，所述上游引物中的Z还设有锁核酸修饰。
优选地，所述突变位点有若干个，且相隔距离为1bp～12bp，则所述引物组包含若干个所述上游引物和1个所述下游引物。
更优选地，所述引物探针组合物包含1个所述探针。
优选地，所述耐药基因包括幽门螺杆菌的23S rRNA基因和gyrA基因。
更优选地，所述23S rRNA基因的突变位点包括A2142G、A2143G、A2143C和A2144G；A2142G的参考基因组为AB088058.1和AB088057.1；A2143G的参考基因组为AB088062.2、AB088059.1、AB088060.1、AB088064.1、AB088065.1和AB088061.1；A2143C的参考基因组为AB088051.1；A2144G的参考基因组为AB162858.1；
所述gyrA基因的突变位点包括A260T、C261A、C261G、G271A、C271A、G271T和A272G；A260T的参考基因组为LC425776.1；C261A的参考基因组为LC567331.1、LC567371.1和LC425777.1；C261G的参考基因组为LC425756.1、LC425776.1和LC425785.1；C271A的参考基因组为LC567329.1、LC567376.1和LC425760.1；G271A的参考基因组为LC425770.1；G271T的参考基因组为LC567137.1、LC567377.1和LC567140.1；A272G的参考基因组为LC567138.1、LC567372.1和LC567136.1。
进一步优选地，检测所述23S rRNA基因的突变位点的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1～3所示；检测所述gyrA基因的突变位点的上游引物的核苷酸序列如SEQ IDNO.6～11所示；
其中，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的上游引物检测23S rRNA基因的A2142G；核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的上游引物检测23S rRNA基因的A2143G和/或A2143C；核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的上游引物检测23S rRNA基因的A2144G；核苷酸序列如SEQ IDNO.6所示的上游引物检测gyrA基因的A260T；核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示的上游引物检测gyrA基因的C261A；核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示的上游引物检测gyrA基因的C261G；核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示的上游引物检测gyrA基因的C271A和/或G271A；核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示的上游引物检测gyrA基因的G271T；核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示的上游引物检测gyrA基因的A272G。
更进一步优选地，所述核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的上游引物的3’端最后一个碱基设有锁核酸修饰。
更进一步优选地，所述核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的上游引物的3’端最后一个碱基设有锁核酸修饰。
更进一步优选地，所述核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示的上游引物的3’端最后一个碱基设有锁核酸修饰。
更进一步优选地，所述核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示的上游引物的3’端最后一个碱基设有锁核酸修饰。
更进一步优选地，所述核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示的上游引物的3’端最后一个碱基设有锁核酸修饰。
进一步优选地，检测所述23S rRNA基因的突变位点的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；检测所述gyrA基因的突变位点的下游引物的核苷酸序列如SEQ IDNO.12所示。
任一所述引物探针组合物在制备检测幽门螺杆菌耐药基因的试剂盒中的应用也应在本发明的保护范围之内。
一种检测幽门螺杆菌耐药基因的试剂盒，包含任一所述引物探针组合物。
优选地，还包含PCR反应试剂。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
与检测幽门螺杆菌耐药基因突变位点的常用方法ARMS-PCR相比，本发明不必针对每一个突变位点设计一对引物探针组合，在灵敏度保持相当的情况下，本发明中检测10个突变位点可仅用两条探针实现，且10个突变位点可只用一管反应全部检出，操作简便，经济高效。并且本发明的pool-ARMS方法的最低检测限仅为1pg/μL，特异性高，重复性好，结果准确可靠，极大提高了幽门螺旋杆菌耐药性的临床判定效率，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为本发明pool-ARMS方法检测幽门螺杆菌23S rRNA基因和gyrA基因突变位点的原理示意图。
图2为表1所示的下游引物和探针在NCBI数据库的BLAST分析结果。
图3为23S rRNA基因A2142G位点的突变检测限。
图4为23S rRNA基因A2143G和A2143C位点的突变检测限。
图5为23S rRNA基因A2144G位点的突变检测限。
图6为gyrA基因A260T位点的突变检测限。
图7为gyrA基因C261A位点的突变检测限。
图8为gyrA基因C261G位点的突变检测限。
图9为gyrA基因G271A和C271A位点的突变检测限。
图10为gyrA基因G271T位点的突变检测限。
图11为gyrA基因A272G位点的突变检测限。
图12为本发明和sanger测序法对50例粪便样本的检测结果。
图13为检测粪便样本的kappa值计算结果。
具体实施方式
下面结合说明书附图及具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1引物和探针的获得
一、突变位点的分析
收集临床确诊感染幽门螺杆菌的50例患者的粪便样本。使用核酸提取纯化试剂(购自江苏康为世纪生物科技股份有限公司，货号CWY095，苏泰械备20200970号)从粪便样本中提取得到粪便核酸。
利用sanger测序法对幽门螺杆菌23S rRNA(耐克拉霉素)和gyrA基因(耐左氧氟沙星)的基因突变区进行测序，以幽门螺杆菌标准菌株(ATCC：26695)作为对照，导入SnapGene软件分析幽门螺杆菌的耐药突变位点。
最终确定：幽门螺杆菌的23S rRNA基因的A2142G(参考基因组：AB088058.1和AB088057.1)、A2143G(参考基因组：AB088062.2、AB088059.1、AB088060.1、AB088064.1、AB088065.1和AB088061.1)、A2143C(参考基因组：AB088051.1)和A2144G(参考基因组：AB162858.1)共3个突变位点的4种突变类型与幽门螺杆菌的克拉霉素耐药性高度相关；幽门螺杆菌的gyrA基因的A260T(参考基因组：LC425776.1)、C261A(参考基因组：LC567331.1、LC567371.1和LC425777.1)、C261G(参考基因组：LC425756.1、LC425776.1和LC425785.1)、C271A(参考基因组：LC567329.1、LC567376.1和LC425760.1)、G271A(参考基因组：LC425770.1)、G271T(参考基因组：LC567137.1、LC567377.1和LC567140.1)和A272G(参考基因组：LC567138.1、LC567372.1和LC567136.1)共4个突变位点的7种碱基突变类型与幽门螺杆菌的左氧氟沙星耐药性高度相关。
二、引物和探针的设计
1、突变位点的引物和探针
本发明在传统ARMS-PCR方法的基础上建立新的检测方法，命名为“pool-ARMS”。
pool-ARMS方法中，对于突变位点的引物和探针的设计原则具体如下：
(1)单个突变位点专一的上游引物
DNA共有4种碱基种类(A、G、C和T)，共有16组碱基配对的形式，即：A-T、T-A、A-C、C-A、T-G、G-T、C-G、G-C、A-A、G-G、A-G、G-A、T-T、T-C、C-T和C-C。根据配对碱基之间连接力的由弱到强，将16组碱基互补配对依次划分为以下两个等级的分组：
一级连接力组：A-T、T-A、A-C、C-A、T-G、G-T、C-G、G-C、A-A和G-G；
二级连接力组：A-G、G-A、T-T、T-C、C-T和C-C。
基于上述分组进行上游引物的设计，具体方法如下：
第一步：
突变位点所在的DNA单链为模板链，与模板链反向互补配对的另一条DNA单链即为非模板链；按照常规方法设计长度为15bp～20bp的上游引物(靶向结合模板链所述突变位点的下游15bp～25bp的区域)，其中3’端的最后一个碱基设置为突变位点的突变型碱基；
第二步：
将模板链上的突变位点的野生型碱基记为X1，X1在非模板链上的互补碱基记为X1’；将模板链上的X1下游第一位碱基记为Y，Y在非模板链上的互补碱基记为Y’；将模板链上的突变位点的突变型碱基记为X2；将上游引物3’端的倒数第二个碱基和第一个依次记为Y”和Z，Y”与Y’的碱基种类不同，Z与X2的碱基种类相同；
第三步：
X2-X1’属于一级连接力组，则调整Y”的碱基种类使得Y”-Y’属于二级连接力组，为进一步提高特异性可对上游引物的X2进行锁核酸修饰；X2-X1’属于二级连接力组，则调整Y”的碱基种类使得Y”-Y’属于一级连接力组。
(2)多个突变位点共用的下游引物和探针
本实施例分析所得的突变位点在同一基因上的相隔距离为1bp～12bp，按照常规的引物设计方法，针对同一基因的所有突变位点设计共用的下游引物和探针。
(3)扩增原理
如图1所示，对于突变型的幽门螺旋杆菌，上游引物、下游引物和探针均可与核酸双链正常互补配对并合成完整的新链；而对于野生型幽门螺旋杆菌，虽然下游引物和探针均可与核酸双链正常互补配对，但是上游引物由于在突变位点对应的互补碱基前引入了错配，改变了该处碱基与其前后碱基的连接力，容易发生断裂，导致无法合成完整的新链，无法产生扩增曲线。所以，经过多轮PCR反应扩增后，最终的结果显示为：只有存在突变位点的突变型幽门螺旋杆菌有扩增曲线，野生型幽门螺旋杆菌的无扩增曲线。
根据上述设计原则，针对本实施例分析所得幽门螺旋杆菌的耐药基因23S rRNA基因和gyrA基因共10个突变位点，最终设计得到如表1所示的上游引物、下游引物和探针。
2、内参的引物和探针
本发明以幽门螺旋杆菌的定性基因ureA基因(GenBank:AF373584.1)和常用的人源管家基因GAPDH基因(GenBank:MW770352)作为双内参，按照常规的引物设计方法，设计得到如表1所示的引物和探针。
表1检测幽门螺旋杆菌的耐药基因突变位点的引物及探针
注：表1中，下划线“”表示Y”，方框表示X2，“/iXNA_N/”表示该碱基“N”有锁核酸修饰。
将表1所示的共用下游引物和共用探针在NCBI数据库中进行BLAST分析，如图2所示，结果显示与所述共用下游引物和共用探针匹配度为100％的均为幽门螺杆菌的基因组，说明本发明提供的共用下游引物和共用探针的特异性高。
实施例2检测限的评价
一、实验方法
1、待测核酸的制备
通过培养临床粪便样本，获取菌株核酸，经过sanger测序得到10个突变型的幽门螺旋杆菌菌株核酸，分别按照质量比50％、25％、10％、5％、1％和0.1％的比例与野生型幽门螺旋杆菌菌株(菌株编号：ATCC43504)的核酸混合均匀，之后将核酸浓度稀释至1pg/μL作为模板。
2、pool-ARMS检测
所用实时荧光PCR扩增反应体系如表2所示，实时荧光PCR扩增程序如表3所示。
表2实时荧光PCR扩增反应体系
表3实时荧光PCR扩增程序
结果判读的方法如下：
如果Texas Red通道(即GAPDH基因)的Ct值＞32.00，则判定模板有问题，需要重新提取该样本的核酸后再进行检测；如果Texas Red通道(即GAPDH基因)的Ct值≤32.00且Hex通道(即ureA基因)的Ct值＞35.00，则判定该样本为幽门螺旋杆菌阴性；如果Texas Red通道(即GAPDH基因)的Ct值≤32.00且Hex通道(即ureA基因)的Ct值≤35.00，则判定该样本为幽门螺旋杆菌阳性，需要根据FAM通道(即23S rRNA基因)和Cy5通道(即gyrA基因)的检测结果进一步判定阳性类型，如果FAM通道(即23S rRNA基因)的Ct值≤36.00则判定该样本为克拉霉素耐药阳性，如果Cy5通道(即gyrA基因)的Ct值≤35.00则判定该样本为左氧氟沙星耐药阳性。
二、实验结果
如图3～11所示，本发明提供的如表1所示的引物和探针能检测出幽门螺旋杆菌阳性以及准确鉴定出23S rRNA基因的A2142G、A2143G、A2143C和A2144G突变位点以及耐左氧氟沙星的gyrA基因的A260T、C261A、C261G、G271A、C271A、G271T和A272G突变位点，最低检测限为1pg/μL，突变菌占比0.1％，检测的灵敏度高。
实施例3一致性的评价
一、实验方法
1、待测核酸
即实施例1中从临床确诊感染幽门螺杆菌的50例患者的粪便核酸。
2、pool-ARMS检测
以本实施例所得待测核酸作为模板，按照实施例2中的表2配制实时荧光PCR扩增反应体系，按照表3进行实时荧光PCR扩增。
3、sanger测序
利用本领域金标准的sanger测序技术检测本实施例所得待测核酸。
4、Kappa分析
对所得pool-ARMS检测结果和sanger测序结果进行Kappa分析。
二、实验结果
如图12所示，pool-ARMS检测结果显示，50例粪便样本中，共有32例幽门螺旋杆菌阴性，18例幽门螺旋杆菌阳性，其中有14例为克拉霉素耐药阳性，7例为左氧氟沙星耐药阳性；sanger测序结果显示，50例胃黏膜组织样本中有30例幽门螺旋杆菌阴性，20例幽门螺旋杆菌阳性，其中有15例为克拉霉素耐药阳性，8例为左氧氟沙星耐药阳性。
如图13所示，Kappa分析结果显示，pool-ARMS检测结果与sanger测序结果的阳性符合率为90％，阴性符合率为100％，总符合率为96.00％，kappa值为0.9153(高于0.75)。
以上结果表明，本发明建立的pool-ARMS检测方法的重复性好，且与sanger测序方法对于幽门螺旋杆菌耐药基因的检测具有较高的一致性。
实施例4一种检测幽门螺旋杆菌耐药基因的试剂盒
一、组成
1、引物和探针
本试剂盒所含引物和探针的序列如表1所示。
2、PCR反应试剂
2×ARMS qPCR mix buffer。
二、使用方法
1、核酸的提取
本试剂盒对提取核酸的方法没有指定要求，一般可用实验室常规方法或核酸提取试剂盒提取待测样本的核酸。
2、反应体系的配制
按照如表2所示的信息配制得到反应体系。
3、检测
在荧光PCR仪上，根据探针上标记的荧光基团，设置相应的荧光检测通道，按照如表3所示的反应程序进行检测。
4、结果判读
根据荧光PCR的扩增结果判断样本的情况，具体判读方法如下：
如果Texas Red通道(即GAPDH基因)的Ct值＞32.00，则判定模板有问题，需要重新提取该样本的核酸后再进行检测；如果Texas Red通道(即GAPDH基因)的Ct值≤32.00且Hex通道(即ureA基因)的Ct值＞35.00，则判定该样本为幽门螺旋杆菌阴性；如果Texas Red通道(即GAPDH基因)的Ct值≤32.00且Hex通道(即ureA基因)的Ct值≤35.00，则判定该样本为幽门螺旋杆菌阳性，需要根据FAM通道(即23S rRNA基因)和Cy5通道(即gyrA基因)的检测结果进一步判定阳性类型，如果FAM通道(即23S rRNA基因)的Ct值≤36.00，则判定该样本为克拉霉素耐药阳性，如果Cy5通道(即gyrA基因)的Ct值≤35.00，则判定该样本为左氧氟沙星耐药阳性。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种检测突变位点的单碱基替换的上游引物，其特征在于，所述上游引物靶向结合所述突变位点的下游15bp～25bp的区域；
将模板链上的所述突变位点的野生型碱基记为X1，X1在非模板链上的互补碱基记为X1’；将模板链上的X1下游第一位碱基记为Y，Y在非模板链上的互补碱基记为Y’；将模板链上的突变位点的突变型碱基记为X2；将上游引物3’端的倒数第二个碱基和第一个依次记为Y”和Z，Y”与Y’的碱基种类不同，Z与X2的碱基种类相同；
X2和X1’的碱基种类为A-T、T-A、A-C、C-A、T-G、G-T、C-G、G-C、A-A或G-G中的一种，则调整Y”的碱基种类使得Y”和Y’的碱基种类为A-G、G-A、T-T、T-C、C-T或C-C中的一种；
X2和X1’依次为A-G、G-A、T-T、T-C、C-T或C-C中的一种，则调整Y”的碱基种类使得Y”和Y’依次为A-T、T-A、A-C、C-A、T-G、G-T、C-G、G-C、A-A或G-G中的一种。
2.根据权利要求1所述的上游引物，其特征在于，所述X2和X1’的碱基种类为A-T、T-A、A-C、C-A、T-G、G-T、C-G、G-C、A-A或G-G中的一种，所述上游引物中的Z还设有锁核酸修饰。
3.一种检测突变位点的单碱基替换的引物组，其特征在于，包含下游引物和权利要求1～2任一所述的上游引物。
4.根据权利要求3所述的引物组，其特征在于，所述突变位点有若干个，且相隔距离为1bp～12bp，则所述引物组包含若干个所述上游引物和1个所述下游引物。
5.权利要求3～4任一所述的引物组在制备幽门螺杆菌耐药基因的检测产品中的应用。
6.一种检测幽门螺杆菌耐药基因的引物探针组合物，其特征在于，包含探针和权利要求3～4任一所述的引物组。
7.根据权利要求6所述的引物探针组合物，其特征在于，所述耐药基因包括幽门螺杆菌的23S rRNA基因和gyrA基因。
8.根据权利要求7所述的引物组合物，其特征在于，所述23S rRNA基因的突变位点包括A2142G、A2143G、A2143C和A2144G；A2142G的参考基因组为AB088058.1和AB088057.1；A2143G的参考基因组为AB088062.2、AB088059.1、AB088060.1、AB088064.1、AB088065.1和AB088061.1；A2143C的参考基因组为AB088051.1；A2144G的参考基因组为AB162858.1；
所述gyrA基因的突变位点包括A260T、C261A、C261G、G271A、C271A、G271T和A272G；A260T的参考基因组为LC425776.1；C261A的参考基因组为LC567331.1、LC567371.1和LC425777.1；C261G的参考基因组为LC425756.1、LC425776.1和LC425785.1；C271A的参考基因组为LC567329.1、LC567376.1和LC425760.1；G271A的参考基因组为LC425770.1；G271T的参考基因组为LC567137.1、LC567377.1和LC567140.1；A272G的参考基因组为LC567138.1、LC567372.1和LC567136.1。
9.权利要求6～8任一所述引物探针组合物在制备检测幽门螺杆菌耐药基因的试剂盒中的应用。
10.一种检测幽门螺杆菌耐药基因的试剂盒，其特征在于，包含权利要求6～8任一所述引物探针组合物。
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