CN109799350A - 蛋白热稳定测量结合双向稳定同位素标记蛋白组学筛选药物靶标的方法及应用 - Google Patents
蛋白热稳定测量结合双向稳定同位素标记蛋白组学筛选药物靶标的方法及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种蛋白热稳定测量结合双向稳定同位素标记蛋白组学筛选药物靶标的方法及应用。该方法是利用正向‑反向同位素标记的定量方法结合蛋白热稳定变化测量技术，其能够通过观测细胞内部哪些蛋白在药物的包裹下发生热力学变化，全局性地鉴定与药物相互作用的靶标蛋白。本发明的方法克服了传统鉴定方法的假阳性率高的缺点，其具有高通量、高深度、高精度、检测范围广，耗时短的特点，打破现有技术在药物靶标鉴定方面的局限性，为药物靶标研究提供有力的支撑。
Description
技术领域
本发明属于药物靶标蛋白筛选领域，特别涉及一种蛋白热稳定测量结合双向稳定同位素标记蛋白组学筛选药物靶标的方法及应用。
背景技术
小分子药物在生理状态下特异性与靶标蛋白结合(Drug Target Interaction)是成功治疗疾病的关键。鉴定药物的特异性靶标蛋白，分析药物的分子机理是贯穿药物研发各个阶段的重要任务，也是药物临床前研究的核心内容。然而，在生理条件下，单一小分子药物在体内可能存在多个靶标蛋白，因此全面鉴定小分子药物的结合蛋白有助于药物临床应用的推广及其副作用评估。
鉴定小分子药物与靶标蛋白相互作用是药物研发的核心问题，传统的鉴定方法主要有亲和层析技术、生物素化探针技术[1,2](如依赖于生物素的蛋白富集及质谱鉴定：利用生物素(biotin)连接小分子药物，对靶标蛋白进行富集及质谱鉴定分析)，放射性标记或者荧光探针法[3]、依赖于计算机的分子模拟对接等[4]。虽然这些方法都在一定程度生取得进展，但这些传统的方法局限性在于操作繁琐，耗时，假阳性高，仍是药物开发领域的瓶颈。因此，高效、高准确性、高通量的鉴定药物-蛋白相互作用技术仍需进一步开发。
蛋白热稳定变化测量技术能够很大程度弥补传统技术的缺陷。早在2002年，研究发现药物与蛋白结合能够提高蛋白的热稳定性[5]，在此基础上人们开发了蛋白热稳定性测量方法[6]。这技术最早应用于检测某一小分子化合物与特定蛋白直接是否存在相互结合的。近几年来，高通量技术的引入为该项技术带来新的血液，特别是在针对已知蛋白寻找特异结合的小分子化合物方面，已经有科研团队利用该技术从小分子化合物库中高通量(384孔板)筛选特异靶向该蛋白的小分子抑制剂[7]。目前，针对某小分子药物寻找其靶标蛋白的最好方法是将蛋白热稳定变化测量技术与高通量质谱联用。然而，在众多质谱定量方法中，最为稳健、精确的方法是SILAC(stable isotope labeling with amino acids in cellculture)标记定量蛋白质组学技术。
SILAC标记定量蛋白质组学技术凭借其高精准的定量优势，已经得到了大规模的使用[8,9]。而传统的SILAC标记技术主要是将实验组和对照组细胞蛋白中精氨酸与赖氨酸分别替换为重链和轻链同位素标记的精氨酸与赖氨酸，通过质谱分析对比轻链和重链的丰度即定量实验组和对照组中整体的蛋白变化情况。
现有技术在寻找小分子药物靶标的研究中由于检测范围小、检测精度低而造成多种潜在的靶标蛋白未能全局性呈现，给后期的实验验证带来极大困难，非常有必要寻求一种高通量、高精确度的药物靶标鉴定方法。但是到目前为止，在鉴定特定小分子药物的靶标蛋白领域，尚未有研究团队采用蛋白热稳定变化测量技术结合正向-反向同位素标记的定量蛋白质组学的相关报道。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种蛋白热稳定测量结合双向稳定同位素标记蛋白组学筛选药物靶标的方法。
本发明的另一目的在于提供所述蛋白热稳定测量结合双向稳定同位素标记蛋白组学筛选药物靶标的方法的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：一种蛋白热稳定测量结合双向稳定同位素标记蛋白组学筛选药物靶标的方法，包括如下步骤：
(1)SILAC标记：分别用含有重链同位素和轻链同位素标记的氨基酸的细胞培养液对细胞进行培养，并进行传代，得到重链同位素标记的细胞和轻链同位素标记的细胞；
(2)细胞裂解：分别将步骤(1)中重链同位素标记的细胞和轻链同位素标记的细胞进行裂解，得到重链同位素标记的蛋白裂解液和轻链同位素标记的蛋白裂解液；然后将重链同位素标记的蛋白裂解液分成2n份，记为蛋白裂解液A1、A2、A3……An，B1、B2、B3……Bn，同时将轻链同位素标记的蛋白裂解液分成2n份，记为蛋白裂解液C1、C2、C3……Cn，D1、D2、D3……Dn；其中，n为正整数，且n≥3；
(3)正向-反向实验：正向实验为将小分子药物分别加入到步骤(2)中获得的蛋白裂解液A1、A2、A3……An中，依次得到蛋白裂解液A1′、A2′、A3′……An′，同时将药物载体分别加入到蛋白裂解液B1、B2、B3……Bn中，依次得到蛋白裂解液B1′、B2′、B3′……Bn′；反向实验为将小分子药物分别加入到步骤(2)中获得的蛋白裂解液C1、C2、C3……Cn，依次得到蛋白裂解液C1′、C2′、C3′……Cn′，同时将药物载体分别加入到蛋白裂解液D1、D2、D3……Dn中，依次得到蛋白裂解液D1′、D2′、D3′……Dn′；
(4)酶解和质谱检测：将步骤(3)中得到的蛋白裂解液A1′、B1′和C1′、D1′放入温度1中进行处理，将A2′、B2′和C2′、D2′放入温度2中进行处理，将A3′、B3′、C3′和D3′放入温度3中进行处理，以此类推，将An′、Bn′、Cn′和Dn′放入温度n中进行处理，待处理结束后分别离心，得到蛋白A1″、A2″、A3″……An″，B1″、B2″、B3″……Bn″，C1″、C2″、C3″……Cn″，D1″、D2″、D3″……Dn″；然后将蛋白A1″与B1″、A2″与B2″、A3″与B3″……An″与Bn″分别进行等体积混合，依次得到混合液E1、E2、E3……En，同时，将C1″与D1″、C2″与D2″、C3″与D3″……Cn″与Dn″分别进行等体积混合，依次得到混合液F1、F2、F3……Fn；再向混合液E1、E2、E3……En，以及F1、F2、F3……Fn中加入蛋白酶进行消化，得到蛋白消化液E1′、E2′、E3′……En′，以及F1′、F2′、F3′……Fn′；最后对其分别进行质谱鉴定，依次得到蛋白定量结果G1、G2、G3……Gn，以及H1、H2、H3……Hn；其中，温度n>温度3>温度2>温度1；
(5)结果判断：分别计算蛋白定量结果G2、G3……Gn与G1的比值，得到R1、R2……Rn-1，同时，分别计算蛋白定量结果H2、H3……Hn与H1的比值，得到R1′、R2′……Rn-1′；若Rn-1……>R2>R1>1，且Rn-1′……R2′>R1′>1，则该蛋白为所述小分子药物(潜在)的靶标蛋白。
步骤(1)中所述的细胞为癌细胞；优选为肺腺癌细胞；更优选为肺腺癌A549细胞或H1299细胞。
步骤(1)中所述的重链同位素标记的氨基酸为Arg10和Lys8；优选为ThermoFisher Scientific公司的Arg10和Lys8。
步骤(1)中所述的轻链同位素标记的氨基酸为Arg0和Lys0；优选为Thermo FisherScientific公司的Arg0和Lys0。
步骤(1)中所述的传代为培养至细胞内部的蛋白质全部含有重链或轻链同位素标记，或培养至标记效率在95％以上；所述的传代的次数优选为7代以上。
步骤(2)中所述的裂解为采用蛋白裂解液进行裂解；优选为通过如下步骤获得：将重链同位素标记的细胞和轻链同位素标记的细胞分别用蛋白裂解液在冰上裂解30min，然后离心去除沉淀，得到重链同位素标记的蛋白裂解液和轻链同位素标记的蛋白裂解液。
步骤(2)中所述的重链同位素标记的蛋白裂解液的蛋白浓度优选为5u/μL。
步骤(2)中所述的轻链同位素标记的蛋白裂解液的蛋白浓度优选为5u/μL。
步骤(2)中所述的n的取值可以根据实际需要确定；n的数值优选为3。
步骤(2)中所述的蛋白裂解液A1、A2、A3……An，B1、B2、B3……Bn均为等体积的蛋白裂解液A1、A2、A3……An，B1、B2、B3……Bn。
步骤(2)中所述的蛋白裂解液C1、C2、C3……Cn，D1、D2、D3……Dn均为等体积的蛋白裂解液C1、C2、C3……Cn，D1、D2、D3……Dn。
步骤(3)中所述的小分子药物为信号传导抑制剂；优选为p38MAPK抑制剂；更优选为p38MAPK抑制剂SB202190。
步骤(3)中所述的小分子药物的浓度优选为10mM。
步骤(3)中所述的蛋白裂解液A1、A2、A3……An与小分子药物的体积比均为1000：1。
步骤(3)中所述的蛋白裂解液C1、C2、C3……Cn与小分子药物的体积比均为1000：1。
步骤(3)中所述的药物载体为用于溶解小分子药物的溶剂(药物载体作为对照，如以水为溶剂，则药物载体为水)；优选为DMSO(二甲基亚砜)和水中的至少一种。
步骤(3)中所述的蛋白裂解液B1、B2、B3……Bn与药物载体的体积比均为1000：1。
步骤(3)中所述的蛋白裂解液D1、D2、D3……Dn与药物载体的体积比均为1000：1。
步骤(4)中所述的温度1的温度范围为40℃～60℃；优选为45℃～55℃；更优选为45℃。
步骤(4)中所述的温度2的温度范围为40℃～60℃；优选为45℃～55℃；更优选为50℃。
步骤(4)中所述的温度3的温度范围为40℃～60℃；优选为45℃～55℃；更优选为55℃。
步骤(4)中所述的温度n的温度范围为40℃～60℃；优选为45℃～55℃。
步骤(4)中所述的处理的时间均为3～5min；优选为3min。
步骤(4)中所述的蛋白酶为胰酶。
步骤(4)中所述的混合液E1、E2、E3……En与蛋白酶的质量比均为40：1。
步骤(4)中所述的混合液F1、F2、F3……Fn与蛋白酶的质量比均为40：1。
步骤(4)中所述的质谱鉴定为采用Thermo公司的Orbitrap Fusion Lumos质谱仪进行质谱鉴定；优选为用配备EASY-nLC 1200(Thermo)HPLC系统的Orbitrap Fusion Lumos(Thermo)质谱仪进行质谱鉴定。
所述的蛋白热稳定测量结合双向稳定同位素标记蛋白组学筛选药物靶标的方法在筛选药物靶标中的应用。
所述的药物靶标为小分子药物的靶标。
所述的小分子药物为信号传导抑制剂；优选为p38MAPK抑制剂；更优选为p38MAPK抑制剂SB202190。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
1、传统的鉴定方法依赖于理化性质的富集方法经常出现假阳性结果，且由于通量低、准确度低，耗时较长，给后期的实验验证带来极大困难。由于小分子药物在体内不止存在单一的结合蛋白，全面了解这些潜在的靶标蛋白有助于指导药物的临床应用。本发明为了在高精准定量的SILAC技术上进一步提高质谱鉴定的准确性，我们创建了正向-反向同位素标记的定量方法结合蛋白热稳定变化测量技术，高通量、高精准鉴定小分子药物的靶标蛋白群，很大程度弥补了上述技术的缺点。
2、蛋白热稳定变化测量技术结合基于细胞稳定同位素双向标记的蛋白质组学技术这一发明能够稳健、高通量、高精度鉴定针对特定药物的靶标蛋白。利用这一技术可以高精准、高通量测定药物在细胞中的多种不同靶标蛋白，有助于从多方面了解药物的分子机理及毒副作用。本发明中利用蛋白热稳定变化测量技术能够检测蛋白，在加入小分子药物后，部分蛋白的热稳定相较于对照组发生了变化，这部分蛋白为该小分子药物的靶标蛋白；而另外大部分没有发生热稳定变化的蛋白，很大程度与该小分子没有直接结合。这种方法鉴定的靶标蛋白区别于传统技术上依赖于物化性质的相互作用，高通量定量蛋白质组学的引入能够全局性证明细胞内部哪些蛋白在药物的包裹下发生热力学稳定。
3、为克服传统技术低通量，高耗时的缺点，本发明在蛋白热稳定变化测量技术上引入高通量定量蛋白质组学，其能够通过观测细胞内部哪些蛋白在药物的包裹下发生热力学稳定，全局性鉴定与药物相互作用的靶标蛋白。SILAC定量蛋白质组学技术(细胞培养稳定同位素标记技术)是利用含有N15和C13等重链同位素标记的氨基酸(Arg和Lys)或者含有N14和C12等轻链氨基酸对细胞进行培养，之后经过质谱鉴定换算出蛋白质变化比率而对蛋白质变化进行定量。而双向SILAC标记技术是指2次独立生物学重复中对实验组和对照组交换轻链和重链，已达到提高定量的精准定量的效果。
4、本发明中使用正向-反向同位素标记的定量方法结合蛋白热稳定变化测量技术能够在短时间(2～3天)完成对某一小分子药物的潜在结合蛋白进行全局性鉴定。传统的技术只能单一地检测某小分子化合物与蛋白之间的相互作用，并且对蛋白的纯度要求高，蛋白纯化难度较大，很大程度延长实验周期。
5、本发明中正向-反向稳定同位素标记的定量方法相较于其他质谱定量技术有着较高的准确性，而本发明引入了正向-反向稳定同位素标记的定量方法进一步提高质谱鉴定结果的准确性。另外，该技术检测范围广，之前尚未发现的低丰度蛋白质也能够得到鉴定。
6、本发明中的技术相较与传统技术有更低的假阳性率，如亲和层析技术和探针法所鉴定到的潜在靶标蛋白可能是由于非特异性结合所造成的非特异结合，为后续的实验验证带来极大的困难。本发明利用了蛋白结合了小分子后热稳定性提高这一原理，在实验中设置了不同的温度梯度来探索蛋白热稳定性的变化。如果一个药物不与某些蛋白结合，这蛋白并不会发生热稳定性的变化。因此该技术很大程度降低了鉴定的假阳性率。
7、本发明的技术方案结合了蛋白热稳定变化测量技术和正向-反向同位素标记的定量方法既能保证鉴定过程的时效性，也能对所有蛋白质进行高通量、高深度、高精度的鉴定，避免了现有技术在药物靶标鉴定方面的局限性。使之成为药物靶标研究的有力支撑。
附图说明
图1是本发明的技术方案的具体流程图。
图2是正向与反向SILAC重复鉴定SB202190靶标蛋白的鉴定结果图。
图3是免疫印迹法检测SB202190对p38α蛋白的稳定性影响图；其中，图A为Westernblotting结果；图B为不同温度对蛋白的稳定性影响。
图4是SB202190靶标蛋白的功能分析图。
图5是细胞活性增殖实验检测肺腺癌细胞中SB202190对细胞活性影响图；其中，图A为在肺腺癌细胞A549中的检测结果；图B为在肺腺癌细胞H1299中的检测结果。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。除非特别说明，本发明所用试剂、生物材料等均可通过市售获得。
本发明实施例中以p38MAPK的抑制剂SB202190为例子，利用正向-反向同位素标记的定量方法结合蛋白热稳定变化测量技术在肺癌细胞A549中证明该方法的有效性及可行性，进一步挖掘SB202190小分子的潜在靶标蛋白：
首先对肺癌细胞A549进行SILAC标记，分别使用含有重链同位素(Arg10,Lys8)和轻链同位素标记氨基酸(Arg0，Lys0)的细胞培养液对细胞进行7代左右培养，此时细胞内部的蛋白质将全部含有同位素标记；其中，Arg10表示精氨酸(Arg)标记后，能够使到氨基酸的质量提高10道尔顿(Da)；同理，Lys8表示赖氨酸(Lys)标记后，能够使到氨基酸的质量提高8Da；Arg0和Lys0表示该标记下，精氨酸(Arg)和赖氨酸(Lys)的质量没有发生变化，一般作为对照组。
随后，将重链和轻链的A549分别分成两部分作为2次独立生物学重复。正向实验(Forward)：将小分子药物SB202190加入重链同位素标记的细胞裂解的蛋白中，将载体DMSO加入轻链细胞裂解的蛋白中；反向实验(Reverse)：将小分子药物SB202190加入轻链同位素标记的细胞裂解的蛋白中，而将载体DMSO加入重链细胞裂解的蛋白中。
接下来，将以上各种处理的蛋白裂解液分别放入45℃，50℃和55℃中15min；
最后，将各种处理的蛋白进行离心后分别将重链同位素标记的蛋白和轻链标记的蛋白按体积比1:1进行合并，并通过酶解消化后进行质谱鉴定，经过生物信息学计算收集到的轻链蛋白质和重链蛋白质的比例就可以获得某一蛋白质在不同温度下的稳定性，将Forward和Reverse两次重复鉴定到的蛋白是潜在的SB202190靶标蛋白。
此外，我们还利用Western Blotting的方法针检测SB202190对p38α蛋白稳定性的影响，已确证我们开发方法的准确性。
实施例1
以人肺腺癌A549细胞为模型，以p38MAPK小分子抑制剂SB202190为例，验证本发明的技术方案的可行性以及优势，其流程图如图1所示，具体步骤如下：
1、首先使用SILAC细胞培养液(SILAC细胞培养液为含有重链同位素(Arg10,Lys8)细胞培养液和含有轻链同位素标记氨基酸(Arg0，Lys0)的细胞培养液分别对A549细胞(ATCC,Manassas,VA,USA)进行重链标记和轻链标记培养；其中，SILAC代谢标记系统购自Thermo Fisher Scientific，Rockford，United States【即Thermo Fisher Scientific的试剂盒：试剂盒包括含有重链同位素(Arg10,Lys8)标记的氨基酸(货号：89990和88209)，含有轻链同位素(Arg0，Lys0)标记的氨基酸，SILAC-专用DMEM/1640培养基(货号：88364)和透析血清(货号：26400044)】，并进行传代(7代左右)，当标记效率经检测达到95％以上可以进行下一步实验，得到重链同位素标记的A549细胞和轻链同位素标记的A549细胞。
2、将重链和轻链同位素标记的A549细胞分别分成两部分作为2次独立生物学重复。先将重链同位素标记的A549细胞和轻链同位素标记的A549细胞(汇合率达到80％)分别用蛋白裂解液(Western及IP细胞裂解液，货号P0013，江苏省，中国)进行冰上裂解30min，离心去除沉淀后获得蛋白裂解液。将裂解进行蛋白浓度检测，控制蛋白浓度在5u/μL左右，体积约200μL。
正向实验(Forward)：分别将以上准备的每种蛋白裂解液，按照等体积分配到6个PCR管中(加药组(重链组)命名为A1、B1、C1；对照组(轻链组)命名为D1、E1、F1)，每管体积为50μL。接下来，将小分子药物SB202190(10mM)按照体积比为1:1000的比例，等量加入到A1、B1、C1中，而将DMSO(二甲基亚砜)按照体积比为1:1000的比例，等量加入到D1、E1、F1中；
反向实验(Reverse)：分别将以上准备的每种蛋白裂解液，按照等体积分配到6个PCR管中(加药组(轻链组)命名为A2、B2、C2；对照组(重链组)命名为D2、E2、F2)，每管体积为50μL。接下来，将小分子药物SB202190(10mM)按照体积比为1:1000的比例，等量加入到A2、B2、C2中，而将DMSO按照体积比为1:1000的比例，等量加入到D2、E2、F2中；
3、将以上各种处理的蛋白裂解液(共12管：正向处理中加药组3个，对照组3个；反向处理中加药组3个，对照组3个)分别放入45℃，50℃和55℃中3min(即将PCR管A1、D1、A2和D2放入45℃中3min，将PCR管B1、E1、B2和E2放入50℃中3min，将PCR管C1、F1、C2和F2放入55℃中3min)。
4、将上述各种处理的蛋白进行离心，然后分别将重链同位素标记的蛋白和轻链标记的蛋白按体积比1:1进行合并(即A1与D1合并，A2与D2合并；同理，B1与E1，B2与E2，C1与F1、C2与F2合并)，并通过胰酶(胰酶蛋白的质量比1:40)进行酶解，酶解后的肽段用配备EASY-nLC1200(Thermo)HPLC系统的Orbitrap Fusion Lumos(Thermo)质谱仪进行质谱鉴定。用Proteome Discoverer v2.1(Thermo)这一搜库软件进行搜库，搜库的定量结果中正向组为L(SB202190):H(DMSO)，反向组为H(SB202190):L(DMSO)，再分别将50℃与55℃的定量结果除以45℃的定量结果，计算出每个蛋白随温度升高的定量变化，即可得到每个蛋白随温度变化其稳定性变化情况。将正向组与反向组中的蛋白取交集，在两组中变化趋势一致且随温度升高定量结果相应升高的蛋白(即55℃：45℃>50℃：45℃>45℃：45℃)为潜在的SB202190靶标蛋白。收集到的轻链蛋白质和重链蛋白质的比例就可以获得某一蛋白质在不同温度下的稳定性，将Forward和Reverse两次重复鉴定到的蛋白为潜在的SB202190靶标蛋白(图2)。经过生物信息学分析及严格的统计学筛选，发现有18个蛋白为SB202190潜在的结合靶点(表1和图2)。
表1蛋白热稳定变化测量技术和正向-反向同位素标记的定量方法鉴定的SB202190靶标蛋白
5、我们从质谱的鉴定结果中，可以看到p38α能够随着SB202190的加入产生明显的热稳定性。我们进一步利用免疫印迹技术验证(从两个方面重复验证：一是在与质谱样品做上述温度梯度刺激的时候，多准备一份样品在后期进行免疫印迹分析；二是重新独立重复进行以上实验，因重复得到的结果相同，因此，这里只给出了前者的实验结果)这一质谱结果。从图3中，我们可以看到随着温度的增加，许多DMSO处理组p38α蛋白在50℃时已经明显降解，而SB202190处理组的p38α蛋白在60℃时才出现明显降解，表明SB202190能够与p38α蛋白相结合并显著提高该蛋白的热稳定性，也证明蛋白热稳定变化测量技术和正向-反向同位素标记的定量方法的可靠性。
6、在本次实验中，我们还发现SB202190存在许多潜在的靶标蛋白(图4)，如PRMT5，LDHA等关键蛋白。我们进一步将该18个蛋白进行基因功能分析。结果如图4所示，SB202190靶标蛋白的生物学功能主要富集在细胞周期、细胞增殖、DNA损伤修复及侵袭等方面，暗示SB202190在调控p38 MAPK通路外，还可能通过靶向潜在蛋白并参与细胞周期和增殖的调控。
7、之前的研究将SB202190小分子作为p38信号通路的抑制剂，主要应用与各种细胞生物学实验，而p38 MAPK信号通路的激活在肿瘤发生发展中扮演着抑癌的角色。显著SB202190抑制该信号通路显然不会对肿瘤细胞有抑制作用。而在本次的研究中，我们通过对SB202190的靶标蛋白进行全局性的鉴定，意外地从潜在靶标蛋白中发现该小分子存在其他的生物学功能，比如调控肿瘤细胞周期、细胞增殖、DNA损伤修复等方面。于是我们分别在两株肺腺癌细胞A549和H1299中检测SB202190的生物学功能，具体方法：将H1299和A549细胞(细胞购于ATCC)铺于96孔板中，每孔3000个细胞，每孔体积为100μL。铺板10h后，在两种细胞中加入不同浓度的SB202190(0，12.5，25，50，100，150μM)，分别处理24h和48h，利用WST-1细胞活检检测试剂盒(货号C0035，碧云天)检测细胞的活性(具体检测过程按照公司说明书进行即可)，结果如图5所示，我们发现SB202190能够抑制肿瘤细胞的增殖，并呈浓度和时间依赖性。暗示着小分子药物SB202190有可能成为新型的抗癌药物。
以上实验证明蛋白热稳定变化测量技术和正向-反向同位素标记的定量方法是鉴定全局性药物靶标蛋白的有效手段，与传统技术相比，其能够更加准确，高效，高通量地针对某一小分子鉴定其相互作用的靶标蛋白。为疾病的药物研发及临床应该提供了便利，也为开发药物新功能及全面认识药物分子机理提供重要的技术支持。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
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Claims (10)
1.一种蛋白热稳定测量结合双向稳定同位素标记蛋白组学筛选药物靶标的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)SILAC标记：分别用含有重链同位素和轻链同位素标记的氨基酸的细胞培养液对细胞进行培养，并进行传代，得到重链同位素标记的细胞和轻链同位素标记的细胞；
(2)细胞裂解：分别将步骤(1)中重链同位素标记的细胞和轻链同位素标记的细胞进行裂解，得到重链同位素标记的蛋白裂解液和轻链同位素标记的蛋白裂解液；然后将重链同位素标记的蛋白裂解液分成2n份，记为蛋白裂解液A1、A2、A3……An，B1、B2、B3……Bn，同时将轻链同位素标记的蛋白裂解液分成2n份，记为蛋白裂解液C1、C2、C3……Cn，D1、D2、D3……Dn；其中，n为正整数，且n≥3；
(3)正向-反向实验：正向实验为将小分子药物分别加入到步骤(2)中获得的蛋白裂解液A1、A2、A3……An中，依次得到蛋白裂解液A1′、A2′、A3′……An′，同时将药物载体分别加入到蛋白裂解液B1、B2、B3……Bn中，依次得到蛋白裂解液B1′、B2′、B3′……Bn′；反向实验为将小分子药物分别加入到步骤(2)中获得的蛋白裂解液C1、C2、C3……Cn，依次得到蛋白裂解液C1′、C2′、C3′……Cn′，同时将药物载体分别加入到蛋白裂解液D1、D2、D3……Dn中，依次得到蛋白裂解液D1′、D2′、D3′……Dn′；
(4)酶解和质谱检测：将步骤(3)中得到的蛋白裂解液A1′、B1′和C1′、D1′放入温度1中进行处理，将A2′、B2′和C2′、D2′放入温度2中进行处理，将A3′、B3′、C3′和D3′放入温度3中进行处理，以此类推，将An′、Bn′、Cn′和Dn′放入温度n中进行处理，待处理结束后分别离心，得到蛋白A1″、A2″、A3″……An″，B1″、B2″、B3″……Bn″，C1″、C2″、C3″……Cn″，D1″、D2″、D3″……Dn″；然后将蛋白A1″与B1″、A2″与B2″、A3″与B3″……An″与Bn″分别进行等体积混合，依次得到混合液E1、E2、E3……En，同时，将C1″与D1″、C2″与D2″、C3″与D3″……Cn″与Dn″分别进行等体积混合，依次得到混合液F1、F2、F3……Fn；再向混合液E1、E2、E3……En，以及F1、F2、F3……Fn中加入蛋白酶进行消化，得到蛋白消化液E1′、E2′、E3′……En′，以及F1′、F2′、F3′……Fn′；最后对其分别进行质谱鉴定，依次得到蛋白定量结果G1、G2、G3……Gn，以及H1、H2、H3……Hn；其中，温度n>温度3>温度2>温度1；
(5)结果判断：分别计算蛋白定量结果G2、G3……Gn与G1的比值，得到R1、R2……Rn-1，同时，分别计算蛋白定量结果H2、H3……Hn与H1的比值，得到R1′、R2′……Rn-1′；若Rn-1……>R2>R1>1，且Rn-1′……R2′>R1′>1，则该蛋白为所述小分子药物的靶标蛋白。
2.根据权利要求1所述的蛋白热稳定测量结合双向稳定同位素标记蛋白组学筛选药物靶标的方法，其特征在于：
步骤(4)中所述的温度1的温度范围为40℃～60℃；
步骤(4)中所述的温度2的温度范围为40℃～60℃；
步骤(4)中所述的温度3的温度范围为40℃～60℃；
步骤(4)中所述的温度n的温度范围为40℃～60℃。
3.根据权利要求2所述的蛋白热稳定测量结合双向稳定同位素标记蛋白组学筛选药物靶标的方法，其特征在于：
步骤(4)中所述的温度1的温度范围为45℃～55℃；
步骤(4)中所述的温度2的温度范围为45℃～55℃；
步骤(4)中所述的温度3的温度范围为45℃～55℃；
步骤(4)中所述的温度n的温度范围为45℃～55℃。
4.根据权利要求1所述的蛋白热稳定测量结合双向稳定同位素标记蛋白组学筛选药物靶标的方法，其特征在于：
步骤(2)中所述的n的取值为3；
步骤(4)中所述的温度1的温度范围为45℃；
步骤(4)中所述的温度2的温度范围为50℃；
步骤(4)中所述的温度3的温度范围为55℃。
5.根据权利要求1所述的蛋白热稳定测量结合双向稳定同位素标记蛋白组学筛选药物靶标的方法，其特征在于：
步骤(1)中所述的重链同位素标记的氨基酸为Arg10和Lys8；
步骤(1)中所述的轻链同位素标记的氨基酸为Arg0和Lys0。
6.根据权利要求1所述的蛋白热稳定测量结合双向稳定同位素标记蛋白组学筛选药物靶标的方法，其特征在于：
步骤(1)中所述的细胞为癌细胞；
步骤(3)中所述的小分子药物为p38MAPK抑制剂；
步骤(3)中所述的药物载体为用于溶解小分子药物的溶剂。
7.根据权利要求6所述的蛋白热稳定测量结合双向稳定同位素标记蛋白组学筛选药物靶标的方法，其特征在于：
步骤(1)中所述的细胞为肺腺癌细胞；
步骤(3)中所述的小分子药物为p38MAPK抑制剂SB202190；
步骤(3)中所述的药物载体为二甲基亚砜和水中的至少一种。
8.根据权利要求1所述的蛋白热稳定测量结合双向稳定同位素标记蛋白组学筛选药物靶标的方法，其特征在于：
步骤(3)中所述的小分子药物的浓度为10mM；
步骤(3)中所述的蛋白裂解液A1、A2、A3……An与小分子药物的体积比均为1000：1；
步骤(3)中所述的蛋白裂解液C1、C2、C3……Cn与小分子药物的体积比均为1000：1；
步骤(3)中所述的蛋白裂解液B1、B2、B3……Bn与药物载体的体积比均为1000：1；
步骤(3)中所述的蛋白裂解液D1、D2、D3……Dn与药物载体的体积比均为1000：1；
步骤(4)中所述的混合液E1、E2、E3……En与蛋白酶的质量比均为40：1；
步骤(4)中所述的混合液F1、F2、F3……Fn与蛋白酶的质量比均为40：1。
9.根据权利要求1所述的蛋白热稳定测量结合双向稳定同位素标记蛋白组学筛选药物靶标的方法，其特征在于：
步骤(1)中所述的传代的次数为7代以上；
步骤(2)中所述的裂解为采用蛋白裂解液进行裂解；
步骤(2)中所述的重链同位素标记的蛋白裂解液的蛋白浓度为5u/μL；
步骤(2)中所述的轻链同位素标记的蛋白裂解液的蛋白浓度为5u/μL；
步骤(4)中所述的处理的时间均为3～5min；
步骤(4)中所述的蛋白酶为胰酶。
10.权利要求1～9任一项所述的蛋白热稳定测量结合双向稳定同位素标记蛋白组学筛选药物靶标的方法在筛选药物靶标中的应用。
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