CN115494233A - 一种用于检测甲胎蛋白异质体的组合试剂及检测方法 - Google Patents
一种用于检测甲胎蛋白异质体的组合试剂及检测方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN115494233A CN115494233A CN202211151092.4A CN202211151092A CN115494233A CN 115494233 A CN115494233 A CN 115494233A CN 202211151092 A CN202211151092 A CN 202211151092A CN 115494233 A CN115494233 A CN 115494233A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- antibody
- alpha
- fetoprotein
- magnetic beads
- incubation
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 102000013529 alpha-Fetoproteins Human genes 0.000 title claims abstract description 80
- 108010026331 alpha-Fetoproteins Proteins 0.000 title claims abstract description 80
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 68
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 title claims abstract description 61
- 239000011324 bead Substances 0.000 claims abstract description 74
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 claims abstract description 32
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 claims abstract description 17
- 239000011616 biotin Substances 0.000 claims abstract description 17
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 claims abstract description 16
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 claims abstract description 16
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims abstract description 13
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 41
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 claims description 32
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 claims description 32
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 32
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 claims description 25
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 claims description 25
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 25
- 239000002523 lectin Substances 0.000 claims description 25
- 108010034897 lentil lectin Proteins 0.000 claims description 18
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 15
- 102000018071 Immunoglobulin Fc Fragments Human genes 0.000 claims description 11
- 108010091135 Immunoglobulin Fc Fragments Proteins 0.000 claims description 11
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 10
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 claims description 9
- -1 biotin-polyethylene Chemical group 0.000 claims description 8
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 8
- DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N acridine Chemical class C1=CC=CC2=CC3=CC=CC=C3N=C21 DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 238000002372 labelling Methods 0.000 claims description 7
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 claims description 6
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 6
- 230000008878 coupling Effects 0.000 claims description 5
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 claims description 5
- 239000004593 Epoxy Substances 0.000 claims description 4
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 claims description 4
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 claims description 4
- 238000009833 condensation Methods 0.000 claims description 4
- 230000005494 condensation Effects 0.000 claims description 4
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 claims description 4
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 claims description 4
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 claims description 4
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 claims description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 4
- 125000002088 tosyl group Chemical group [H]C1=C([H])C(=C([H])C([H])=C1C([H])([H])[H])S(*)(=O)=O 0.000 claims description 4
- VUDQSRFCCHQIIU-UHFFFAOYSA-N 1-(3,5-dichloro-2,6-dihydroxy-4-methoxyphenyl)hexan-1-one Chemical compound CCCCCC(=O)C1=C(O)C(Cl)=C(OC)C(Cl)=C1O VUDQSRFCCHQIIU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 241000224495 Dictyostelium Species 0.000 claims description 3
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 claims description 3
- BFBPISPWJZMWJN-UHFFFAOYSA-N methyl 2-[(7-hydroxy-3,7-dimethyloctylidene)amino]benzoate Chemical compound COC(=O)C1=CC=CC=C1N=CCC(C)CCCC(C)(C)O BFBPISPWJZMWJN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 claims 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 abstract description 23
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 abstract description 23
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 abstract description 23
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 11
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 abstract description 10
- 101710186708 Agglutinin Proteins 0.000 abstract description 2
- 101710146024 Horcolin Proteins 0.000 abstract description 2
- 101710189395 Lectin Proteins 0.000 abstract description 2
- 101710179758 Mannose-specific lectin Proteins 0.000 abstract description 2
- 101710150763 Mannose-specific lectin 1 Proteins 0.000 abstract description 2
- 101710150745 Mannose-specific lectin 2 Proteins 0.000 abstract description 2
- 239000000910 agglutinin Substances 0.000 abstract description 2
- 230000022811 deglycosylation Effects 0.000 abstract description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 17
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 16
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 13
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 11
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 11
- 239000012224 working solution Substances 0.000 description 10
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 description 8
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 description 8
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 7
- 239000000047 product Substances 0.000 description 7
- LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide Substances CCN=C=NCCCN(C)C LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 6
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 6
- 238000007885 magnetic separation Methods 0.000 description 6
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 6
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 6
- RXNXLAHQOVLMIE-UHFFFAOYSA-N phenyl 10-methylacridin-10-ium-9-carboxylate Chemical group C12=CC=CC=C2[N+](C)=C2C=CC=CC2=C1C(=O)OC1=CC=CC=C1 RXNXLAHQOVLMIE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000007987 MES buffer Substances 0.000 description 5
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 5
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 4
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 4
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000006287 biotinylation Effects 0.000 description 3
- 238000007413 biotinylation Methods 0.000 description 3
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 3
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 3
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 3
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 102000004641 Fetal Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010003471 Fetal Proteins Proteins 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 2
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 2
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 208000019423 liver disease Diseases 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 2
- 150000003384 small molecules Chemical group 0.000 description 2
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 3-(dimethylamino)propyliminomethylidene-ethylazanium;chloride Chemical compound Cl.CCN=C=NCCCN(C)C FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AAYSIOJYGRABGS-UHFFFAOYSA-N 3-[9-[4-(2,5-dioxopyrrolidin-1-yl)oxycarbonyl-2,6-dimethylphenoxy]carbonylacridin-10-ium-10-yl]propane-1-sulfonate Chemical compound C=1C(C)=C(OC(=O)C=2C3=CC=CC=C3[N+](CCCS([O-])(=O)=O)=C3C=CC=CC3=2)C(C)=CC=1C(=O)ON1C(=O)CCC1=O AAYSIOJYGRABGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 206010008909 Chronic Hepatitis Diseases 0.000 description 1
- SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N D-mannomethylose Natural products CC1OC(O)C(O)C(O)C1O SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PNNNRSAQSRJVSB-SLPGGIOYSA-N Fucose Natural products C[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)C=O PNNNRSAQSRJVSB-SLPGGIOYSA-N 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 1
- SHZGCJCMOBCMKK-DHVFOXMCSA-N L-fucopyranose Chemical compound C[C@@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O SHZGCJCMOBCMKK-DHVFOXMCSA-N 0.000 description 1
- 241000872931 Myoporum sandwicense Species 0.000 description 1
- NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N N-Hydroxysuccinimide Chemical compound ON1C(=O)CCC1=O NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 1
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 1
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 208000019425 cirrhosis of liver Diseases 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 238000010219 correlation analysis Methods 0.000 description 1
- 239000007822 coupling agent Substances 0.000 description 1
- 230000006735 deficit Effects 0.000 description 1
- 238000003748 differential diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- CCIVGXIOQKPBKL-UHFFFAOYSA-M ethanesulfonate Chemical compound CCS([O-])(=O)=O CCIVGXIOQKPBKL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 1
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 238000000760 immunoelectrophoresis Methods 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000012417 linear regression Methods 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 description 1
- 239000007800 oxidant agent Substances 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 1
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 1
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 1
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 239000000439 tumor marker Substances 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000001325 yolk sac Anatomy 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
- G01N33/54326—Magnetic particles
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/531—Production of immunochemical test materials
- G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
Abstract
本发明公开一种用于检测甲胎蛋白异质体的组合试剂及检测方法，其中，所述组合试剂包括被标记物标记的凝集素、被链霉亲和素修饰的磁珠以及被生物素修饰的甲胎蛋白抗体，所述甲胎蛋白抗体为去糖基化修饰的抗体。本发明技术方案通过采用游离于溶液的生物素化甲胎蛋白抗体在溶液均相反应体系中与待测抗原结合，增大了待测抗原与组合试剂中的甲胎蛋白抗体的结合效率，进而提高了组合试剂的检测灵敏度。
Description
技术领域
本发明涉及体外诊断技术领域，尤其涉及一种用于检测甲胎蛋白异质体的组合试剂及检测方法。
背景技术
甲胎蛋白(AFP)是目前临床应用最广泛的肝癌辅助诊断血清标志物。但是早期肝癌AFP的检出率只有30％-40％，而且在肝脏良性疾病，特别是肝癌高危人群，如慢性肝炎、肝硬化中也有部分患者会出现AFP升高；其较低的特异性，对AFP轻度升高的肝癌和慢性肝病的鉴别诊断造成较大困难。AFP是一种单链糖蛋白，根据其与小扁豆凝集素(Lensculinaris agglutinin，LCA)的亲和力从低到高依次分为AFP-L1、AFP-L2和AFP-L3。AFP-L1主要见于良性肝病，AFP-L2主要由卵黄囊产生并多见于孕妇，而AFP-L3主要来源于肝癌细胞，也被称为甲胎蛋白异质体。AFP-L3对肝癌是高特异性的指标，特异性可达到95％以上，也是诊断肝癌特异性最强的肿瘤标记物。美国食品与药品监督管理局(FDA)已于2005年批准AFP-L3检测试剂和方法用于临床肝癌预警。
然而，AFP亚型间的结构差异仅为糖基化基团，无法被抗体有效特异性识别区分，因此无法通过常规的双抗体夹心等免疫检测手段进行AFP-L3的检测。目前用于AFP-L3的检测方法有植物凝集素亲和层析法、聚丙烯酰胺凝胶电泳法、亲和印迹法、免疫电泳法、亲和离心柱法、化学发光法等。由于现有的这些检测方法中采用的抗AFP抗体的Fc片段都是被糖基化修饰的，同样会与LCA结合，从而可能导致检测背景异常，甚至出现假阳性的检测结果。
通过酶切制备不含糖基化修饰的Fc片段的抗AFP抗体的F(ab')2片段，并使用该F(ab')2片段包被磁珠及用于样本中AFP的捕获的检测方法可以解决上述技术问题。该方法可有效消除抗体Fc片段糖基化造成的干扰，从而实现快速、准确地检测AFP-L3。然而，该方法中采用F(ab')2片段包被磁珠后，所检测出的AFP-L3抗原信号强度较完整抗体的信号强度表现出明显降低。
发明内容
本发明的主要目的是提出一种用于检测甲胎蛋白异质体的组合试剂及检测方法，旨在基于上述去糖基化抗体的检测方法中提高待测抗原与抗体的结合效率，以提高检测灵敏度。
为实现上述目的，本发明提出的用于检测甲胎蛋白异质体的组合试剂，包括：
被标记物标记的凝集素；
被链霉亲和素修饰的磁珠；
被生物素修饰的甲胎蛋白抗体，所述甲胎蛋白抗体为去糖基化修饰的抗体。
在一实施例中，所述甲胎蛋白抗体选自F(ab')2抗体片段、Fab'抗体片段、Fab抗体片段、Fv抗体片段或其他去除Fc片段的抗体中的一种或多种。
在一实施例中，所述凝集素选自小扁豆凝集素、橙黄网包盘菌凝集素或刀豆凝集素中的一种或多种。
在一实施例中，所述磁珠选自羧基磁珠、氨基磁珠、羟基磁珠、环氧基磁珠或甲苯磺酰基磁珠中的一种或多种。
本发明还提出一种甲胎蛋白异质体的检测方法，使用了上述组合试剂进行检测，检测步骤包括：
S1.将所述被生物素修饰的甲胎蛋白抗体与待测样本在第一预设温度下进行第一次孵育，获得第一次孵育复合物；
S2.将所述第一次孵育复合物与所述被链霉亲和素修饰的磁珠在第二预设温度下进行第二次孵育，孵育完成后进行洗涤处理，获得第二次孵育复合物；
S3.将所述第二次孵育复合物与所述被标记物标记的凝集素在第三预设温度下进行第三次孵育，孵育完成后进行洗涤处理，得到第三次孵育复合物；
S4.激发所述第三孵育复合物发光，检测所述第三孵育复合物的相对发光强度，通过检测得到的相对发光强度，计算待测样本中甲胎蛋白异质体的含量。
在一实施例中，所述被链霉亲和素修饰的磁珠通过采用EDC/NHS两步法缩合偶联的方式获得，其中，每毫克所述磁珠投料18-22μg链霉亲和素。
在一实施例中，所述甲胎蛋白抗体选自F(ab')2抗体片段，所述甲胎蛋白抗体的制备步骤包括：采用F(ab')2制备试剂盒对抗甲胎蛋白鼠单克隆抗体进行酶切以及产物纯化，得到F(ab')2抗体片段。
在一实施例中，所述被生物素修饰的甲胎蛋白抗体的制备步骤包括：采用磷酸盐缓冲液将得到的所述F(ab')2抗体片段的浓度调整至1.5-2.5mg/mL，而后按照生物素与F(ab')2抗体片段的摩尔比为(80:1)-(120：1)加入生物素-聚乙二醇-活性酯试剂，在室温下震荡孵育，孵育完成后经超滤离心除去过量的生物素-聚乙二醇-活性酯试剂。
在一实施例中，所述标记物选自吖啶酯。
在一实施例中，所述被标记物标记的凝集素的制备步骤包括：将凝集素与吖啶酯按照质量比为(24:1)-(16：1)混合，混合均匀后，置于旋转混匀仪上，避光室温反应25-35min，反应结束，而后进行纯化处理，得到被吖啶酯标记的凝集素。
本发明技术方案通过采用生物素对去糖基化的甲胎蛋白抗体进行修饰，增大了待测抗原与组合试剂中的甲胎蛋白抗体的结合效率，进而提高了组合试剂的检测灵敏度。在本发明的技术方案中，所述甲胎蛋白抗体被修饰上小分子生物素，当采用本发明的组合试剂对待测样本进行检测时，被生物素修饰的甲胎蛋白抗体会以游离形式分散在缓冲液中与待测抗原结合，即所述被生物素修饰的甲胎蛋白抗体在溶液中与待测抗原结合时处于游离状态，而非固定在磁珠或其他固相载体表面，避免了所述甲胎蛋白抗体的抗原结合位点受磁珠表面空间位阻的影响，有助于待测抗原与所述甲胎蛋白抗体的充分结合，从而提升待测抗原与所述甲胎蛋白抗体结合效率，进而提高了组合试剂的检测灵敏度。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图示出的结构获得其他的附图。
图1是本发明的甲胎蛋白异质体的检测方法在一实施例中的流程示意图；
图2为本发明的实施组组合试剂检测甲胎蛋白异质体所得到的测试浓度与理论浓度的相关性测试图。
本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
另外，若本发明实施例中有涉及“第一”、“第二”等的描述，则该“第一”、“第二”等的描述仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示其相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。本文中“包括”、“包含”、“含”、“含有”、“具有”或其它变体意在涵盖非封闭式包括，这些术语之间不作区分。术语“包含”是指可加入不影响最终结果的其它步骤和成分。术语“包含”还包括术语“主要由…组成”和“基本上由…组成”。本发明的组合物和方法/工艺包含、由其组成和基本上由本文描述的必要元素和限制项以及本文描述的任一的附加的或任选的成分、组分、步骤或限制项组成。
在说明书和权利要求书中使用的涉及组分量、工艺条件等的所有数值或表述在所有情形中均应理解被“约”修饰。涉及相同组分或性质的所有范围均包括端点，该端点可独立地组合。本发明中所用原料、设备，若无特别说明，均为本领域的常用原料、设备；本发明中所用方法，若无特别说明，均为本领域的常规方法。如无特殊说明，本说明书中的术语的含义与本领域技术人员一般理解的含义相同，但如有冲突，则以本说明书中的定义为准。
在现有AFP-L3(甲胎蛋白异质体)检测技术中，植物凝集素亲和层析法、聚丙烯酰胺凝胶电泳法、亲和印迹法等方法操作繁琐、耗时且步骤复杂，对操作人员素质要求高，无法实现高通量检测。亲和吸附离心管法同样采用手工操作，步骤繁琐，无法实现自动化，对配套试剂及设备要求多，且需要结合其他AFP检测试剂进行测定。日本和光
i30检测系统采用荧光电泳的方法，一次进样即可得出AFP-L3的结果，但是该方法系统复杂、试剂昂贵、临床使用成本高。双磁珠系统由分离磁珠和检测磁珠构成，其中分离磁珠利用LCA(小扁豆凝集素)和AFP-L3的亲和力从样本中分离出AFP-L3，检测系统则采用常规的双抗夹心的方法检测分离磁珠所分离的AFP-L3，这种方法由于分离步骤的引入，检测所需时间较长，且多一次分离环节，不利于提高整个检测的精密度。其他多种基于抗体和LCA夹心法检测AFP-L3的试剂则由于抗体Fc片段岩藻糖修饰的干扰，可能产生假阳性结果。而采用不含糖基化修饰的Fc片段的抗AFP抗体的F(ab')2片段包被磁珠并用于待测样本中AFP-L3的捕获可解决上述检测假阳性的问题，该方法可有效消除抗体Fc片段糖基化造成的干扰，从而较为准确地检测出AFP-L3的含量。
然而，直接利用F(ab')2的氨基与磁珠表面的羧基或其他基团反应从而将F(ab')2包被于磁珠微球表面的方法无法保证F(ab')2的取向，导致F(ab')2的抗原结合域可能靠近固相载体表面，从而造成较大空间位阻，影响抗原与抗体的结合，导致灵敏度受损。也就是说，虽然采用不含糖基化修饰的抗AFP抗体的F(ab')2片段包被磁珠并用于待测样本中AFP-L3的捕获，可以避免上述因背景异常导致的假阳性问题，但却会减小抗体与待测抗原的结合效率，从而导致检测灵敏度下降。
为了解决上述技术问题，本发明提出一种用于检测甲胎蛋白异质体的组合试剂。
在本发明实施例中，该组合试剂包括被标记物标记的凝集素、被链霉亲和素修饰的磁珠以及被生物素修饰的甲胎蛋白抗体，所述甲胎蛋白抗体为去糖基化修饰的抗体。
本发明技术方案通过采用生物素对去糖基化的甲胎蛋白抗体进行修饰，增大了待测抗原与组合试剂中的甲胎蛋白抗体的结合效率，进而提高了组合试剂的检测灵敏度。在本发明的技术方案中，所述甲胎蛋白抗体被修饰上小分子生物素，当采用本发明的组合试剂对待测样本进行检测时，被生物素修饰的甲胎蛋白抗体会以游离形式分散在缓冲液中与待测抗原结合，即所述被生物素修饰的甲胎蛋白抗体在溶液中与待测抗原结合时处于游离状态，而非固定在磁珠或其他固相载体表面，避免了所述甲胎蛋白抗体的抗原结合位点受磁珠表面空间位阻的影响，有助于待测抗原与所述甲胎蛋白抗体的充分结合，从而提升待测抗原与所述甲胎蛋白抗体结合效率，进而提高了组合试剂的检测灵敏度。
根据本发明的组合试剂，所述甲胎蛋白抗体可选自F(ab')2抗体片段、Fab'抗体片段、Fab抗体片段、Fv抗体片段或其他去除Fc片段的抗体中的一种或多种。IgG(免疫球蛋白)经木瓜蛋白酶水解可形成2个相同的Fab片段和1个Fc片段，IgG经胃蛋白酶水解可形成一个F(ab')2抗体片段和若干个多肽碎片(pFc'),F(ab')2重链间的二硫键断裂可形成2个Fab'片段，且Fab'片段可进一步被酶解成Fv片段。F(ab')2抗体片段、Fab'抗体片段以及Fab抗体片段均可通过市面上已有的、相应的制备试剂盒获取；另外，还可以通过NaIO4氧化等方法获取其他去除Fc片段的抗体，上述提及的制备方法均可参考本领域常规的制备工艺进行，在此不做详述。优选的，所述甲胎蛋白抗体选自F(ab')2抗体片段；一方面，市面上已有F(ab')2抗体片段的制备试剂盒，且该制备试剂盒操作简便、价格较为便宜；另一方面，相较其他几种抗体片段来说，F(ab')2片段作为二价抗体片段，与抗原结合更佳，同时，保留相对更加完整的抗体结构，有助于在磁珠封闭时不被封闭分子覆盖，有助于暴露抗原结合位点；基于该片段制得的组合试剂，在用于AFP-L3检测时，灵敏度更高。
根据本发明的组合试剂，所述凝集素可选自小扁豆凝集素、橙黄网包盘菌凝集素或刀豆凝集素中的一种或多种，当然，也可以根据实际情况选用其他类型的凝集素，本发明不做特别限定。由于小扁豆凝集素与AFP-L3具有高度亲和力，优选的，所述凝集素选用小扁豆凝集素，以进一步提高本发明的组合试剂的检测灵敏度。
根据本发明的组合试剂，所述磁珠选自羧基磁珠、氨基磁珠、羟基磁珠、环氧基磁珠或甲苯磺酰基磁珠中的一种或多种。优选的，所述磁珠选用羧基磁珠，相对于其他几种磁珠，羧基磁珠的生产技术最为成熟、稳定性高且价格相对更低。氨基磁珠、环氧基磁珠及甲苯磺酰磁珠均可采用其他反应条件与链霉亲和素偶联，其详细偶联方法可参考现有技术，在此不做详述。当然，所述磁珠还可以为商业化的链霉亲和素修饰的磁珠，本发明对此不做特别限定，本领域技术人员可根据实际情况做适当调整。
根据本发明的组合试剂，所述凝集素被标记物修饰，所述标记物可以为直接参与发光反应的标记物，或以催化作用或能量传递参与发光反应的酶标记物，或以能量传递参与发光反应的非酶标记物。在一实施例中，所述标记物选用吖啶酯，吖啶酯属于直接参与发光反应的标记物，其含有可发光的特殊基团，在加入氧化剂及pH纠正液后，吖啶酯不需要催化剂就可直接分解、发光，整个发光过程2秒内完成。通过选用吖啶酯作为标记物，可提高甲胎蛋白异质体的检测速率和检测准确度。
请参阅图1，本发明还提供了一种甲胎蛋白异质体的检测方法，使用了上述组合试剂进行检测，检测步骤包括：
S1.将所述被生物素修饰的甲胎蛋白抗体与待测样本在第一预设温度下进行第一次孵育，获得第一次孵育复合物，即获得生物素-甲胎蛋白抗体(去糖基化)-AFP复合物。
其中，所述第一预设温度为35-40℃，通常情况下，所述被生物素修饰的甲胎蛋白抗体与待测样本在常温下进行第一次孵育，当然，本领域技术人员可根据实际情况适当调节所述第一预设温度。
S2.将所述第一次孵育复合物与所述被链霉亲和素修饰的磁珠在第二预设温度下进行第二次孵育，孵育完成后进行洗涤处理，获得第二次孵育复合物，即获得磁珠-链霉亲和素-生物素-甲胎蛋白抗体(去糖基化)-AFP复合物。
其中，所述第二预设温度为35-40℃，通常情况下，所述第一次孵育复合物与所述被链霉亲和素修饰的磁珠在常温下进行第二次孵育，当然，本领域技术人员可根据实际情况适当调节所述第二预设温度。
S3.将所述第二次孵育复合物与所述被标记物标记的凝集素在第三预设温度下进行第三次孵育，孵育完成后进行洗涤处理，得到第三次孵育复合物，即获得磁珠-链霉亲和素-生物素-甲胎蛋白抗体(去糖基化)-AFP-凝集素-标记物复合物，该复合物中形成甲胎蛋白抗体(去糖基化)-(AFP-L3)-凝集素-标记物的夹心结构。
在所述S3中，所述第三预设温度为35-40℃，通常情况下，所述第二次孵育复合物与所述被标记物标记的凝集素在常温下进行第三次孵育，当然，本领域技术人员可根据实际情况适当调节所述第三预设温度。
S4.激发所述第三孵育复合物发光，检测所述第三孵育复合物的相对发光强度，通过检测得到的相对发光强度，计算待测样本中甲胎蛋白异质体的含量。其中，根据所选择的标记物质的类型，选择不同的方式激发所述第三孵育复合物发光，在此不进行详述。
在一实施例中，所述被链霉亲和素修饰的磁珠通过采用EDC/NHS两步法缩合偶联的方式获得，其中，每毫克所述磁珠投料18-22μg链霉亲和素。在该偶联方式中，EDC是指1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，NHS是指N-羟基琥珀酰亚胺，二者作为偶联剂，均可以在市面上购得。
在一实施例中，所述甲胎蛋白抗体选自F(ab')2抗体片段，所述甲胎蛋白抗体的制备步骤包括：采用F(ab')2制备试剂盒对抗甲胎蛋白鼠单克隆抗体进行酶切以及产物纯化，得到F(ab')2片段。
在一实施例中，所述被生物素修饰的甲胎蛋白抗体的制备步骤包括：采用磷酸盐缓冲液将得到的所述甲胎蛋白抗体的浓度调整至1.5-2.5mg/mL，而后按照生物素与甲胎蛋白抗体的摩尔比为(80:1)-(120：1)加入生物素-聚乙二醇-活性酯试剂，在室温下震荡孵育，孵育完成后经超滤离心除去过量的生物素-聚乙二醇-活性酯试剂。
在一实施例中，所述标记物选自吖啶酯，所述被标记物标记的凝集素的制备步骤包括：将凝集素与吖啶酯按照质量比为(24:1)-(16：1)混合，混合均匀后，置于旋转混匀仪上，避光室温反应25-35min，反应结束，而后进行纯化处理，得到被吖啶酯标记的凝集素。
下面将结合具体的实施组与对照组，以对本发明的用于检测甲胎蛋白异质体的组合试剂及检测方法进一步说明。值得理解的是，下面描述仅是示例性的，而不是对本发明的具体限制。下述未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施组：用于检测甲胎蛋白异质体的组合试剂的制备
F(ab')2抗体片段的制备：根据Thermo Fisher PierceTMF(ab')2制备试剂盒进行抗AFP鼠单抗的酶切及产物纯化，超滤离心后将得到的F(ab')2抗体片段溶于PBS缓冲液；
F(ab')2抗体片段的生物素化修饰：酶切处理后F(ab')2抗体片段的分子量按110kDa计，采用磷酸盐缓冲液(10mM,pH＝7.4)将F(ab')2抗体片段浓度调整至2mg/mL，并按照生物素与F(ab')2抗体片段的摩尔比100:1加入Biotin-PEG-NHS(生物素-聚乙二醇-活性酯试剂)，在室温下震荡孵育2h。反应结束后经超滤离心(MWco＝10kDa)除去过量的Biotin-PEG-NHS(生物素-聚乙二醇-活性酯试剂)。
磁珠包被：采用EDC/NHS两步法缩合偶联的方式，将链霉亲和素按照投料比例为每毫克磁珠投料20μg链霉亲和素包被到羧基磁珠表面。具体地，10mg羧基磁珠采用20mM MES(2-(N-吗啉)乙磺酸)缓冲液(pH＝5.5)清洗3次后，磁分离；然后加入0.5mL含50mg/mL EDC的MES缓冲液及0.5mL含50mg/mL NHS的MES缓冲液，并在室温孵育30分钟；磁分离并去上清后，采用20mM MES缓冲液清洗一次，加入1.0mL MES缓冲液将磁珠充分分散，并加入200μg链霉亲和素，充分混匀后在室温震荡孵育3小时；孵育结束后，磁分离、去上清，并将磁珠分散在20mM Tris(三羟甲基氨基甲烷)缓冲液(pH＝7.4)中，孵育15分钟后磁分离，去上清；而后将磁珠分散在0.5wt％Blockmaster DB1130水溶液中，在室温下震荡孵育1小时进行封闭；封闭结束后，采用20mM Tris缓冲液(pH＝7.4)进行清洗，并分散保存在含1％BSA(牛血清白蛋白)的20mM Tris缓冲液(pH＝7.4)中，得到磁珠标记物。
凝集素的标记：以小扁豆凝集素(LCA)为例，采用10mM PBS缓冲液(磷酸缓冲盐溶液，pH＝7.4)将LCA稀释至2mg/mL，并按照LCA与吖啶酯(NSP-DMAE-NHS)的质量比为20:1混合，混合均匀后，置于旋转混匀仪上，避光室温反应30分钟；反应结束后，加入浓度为10mg/mL的赖氨酸水溶液，进行终止，加入赖氨酸溶液的体积为标记反应混合物的10％，混匀后在室温避光反应30分钟；终止结束后，采用Thermo Fisher ZebaTMSpin Desalting Columns(旋转脱盐柱)进行纯化；收集脱盐后的产物，加入等体积的甘油，得到吖啶酯标记的小扁豆凝集素(LCA-AE)，保存于-20℃备用。
对照组：用于检测甲胎蛋白异质体的组合试剂的制备
凝集素的标记方法与实施组相同；获取F(ab')2抗体片段的方法与实施组中获取F(ab')2抗体片段的方法相同；获得的F(ab')2抗体片段不进行生物素化修饰处理；磁珠标记过程中将实施组中的链霉亲和素替换成未进行生物素化修饰处理的F(ab')2抗体片段，其余制备步骤与实施组基本相同。
免疫检测
(1)甲胎蛋白异质体(AFP-L3)的检测工作液的制备
磁珠工作液(M1)：将上述实施组所制得的链霉亲和素包被的磁珠(2μm)分散于10mM PBS缓冲液(pH＝7.4)至浓度为0.3mg/mL。
标记物工作液(R1)：将上述实施组所制得的生物素修饰的抗AFP的F(ab')2抗体片段溶于10mM PBS缓冲液(pH＝7.4)至浓度为5.0μg/mL。
磁珠工作液(M2)：将上述对照组所制得的F(ab')2包被的羧基磁珠(1.6μm)分散于10mM PBS缓冲液(pH＝7.4)至浓度为0.3mg/mL。
标记物工作液(R2):将制得的吖啶酯标记的小扁豆凝集素(LCA-AE)分别用20mMTris缓冲液(pH＝6.5)稀释至LCA浓度为1.0μg/mL。
(2)检测过程
实施组：50μL样本与50μL标记物工作液(R1)混匀后在37℃孵育5分钟；随后加入50μL磁珠工作液(M1)，磁珠充分分散后在37℃孵育5分钟，磁分离并清洗3次；随后加入50μL标记物工作液(R2)，充分混匀并孵育15分钟，磁分离并清洗2次后加入预激发液、激发液各100μL，并读取光电值，根据标准曲线计算浓度。
对照组：50μL磁珠工作液(M2)与50μL样本混匀后在37℃孵育5分钟后，磁分离并清洗3次；随后加入50μL标记物工作液(R2)，磁珠充分分散后在37℃孵育15分钟，磁分离，并清洗2次后，加入预激发液、激发液各100μL，并读取光电值，根据标准曲线计算浓度。
表1：和对照组均相反应测试空白背景及血清样本对比
根据上述表1的结果显示，实施组的基于F(ab')2及链霉亲和素-生物素体系的均相反应方法检测PBS缓冲液的背景信号略高于对照组的检测试剂所测得的PBS缓冲液的背景信号；但检测含AFP-L3的血清样本，实施组的光电信号强度显著高于对照组，相对于对照组，实施组的检测信号提升了约96％。
将商业化AFP-L3纯品(≥95％)稀释后经罗氏电化学发光甲胎蛋白测定试剂盒测定浓度为3.1ng/mL的样品作为低值校准品，以PBS为零浓度校准品，进行测试计算本发明检测方法的最低检测限。重复测定20次PBS，得出20次结果的RLU值(相对发光值)，计算其平均值(M)和标准差(SD)，得出M+2SD；另测试3次低值校准品，取平均值。根据PBS和低值校准品测试均值之间的浓度—RLU值结果进行两点线性回归拟合得出一次方程，将M+2SD的RLU值代入上述方程，求出对应的浓度值，即为最低检测限(LOB)，具体结果如表2所示。
表2：实施组的组合试剂的最低检测限测试
表3：对照组的组合试剂的最低检测限测试
根据上述表2和表3可知，在相同的检测条件下，与对照组相比较，实验组的组合试剂的检测线约为对照组的组合试剂的检测限的一半，即实施组的组合试剂检测灵敏度提高了将近一倍，本发明的用于检测甲胎蛋白异质体的通过对去糖基化的甲胎蛋白抗体进行生物素化修饰，增大了抗体蛋白和待测抗原地结合效率，从而使得组合试剂的检测灵敏度得以较大幅度地提高。
将商业化AFP-L3纯品抗原(≥95％)稀释至300ng/mL，并分别用实施组和对照组的组合试剂进行精密度测试。两种组合试剂分别测试10次，分析统计均值、标准差及变异系数，结果如表4所示。
表4：实施组组合试剂和对照组组合试剂的精密度测试
测试结果显示，对高值抗原的测试中，实验组获得的光电值信号显著高于对照方法，变异系数分别为CV＝5.7％、5.2％，水平相当；由此可知，相对于对照组的组合试剂，本发明的组合试剂具有相当水平的精密度。
将1000ng/mL的AFP-L3纯品分别稀释成500ng/mL，200ng/mL，50ng/mL，10ng/mL，2ng/mL，0.4ng/mL。用实施组的组合试剂及检测方法对各浓度样品分别测试3次，取平均值，并与理论浓度做相关性分析，相关结果如表5所示。
表5：实施组组合试剂的线性范围测试
| 理论浓度(ng/mL) | 测试浓度(ng/mL) |
| 1000 | 922.4 |
| 500 | 451.7 |
| 200 | 186.3 |
| 50 | 45.1 |
| 10 | 9.02 |
| 2 | 1.81 |
| 0.4 | 0.44 |
将理论浓度与测试浓度进行线性相关性拟合，结果如图2所示。结果显示在0.4-1000ng/mL范围内，理论浓度与测试浓度相关性稀释R2＝0.9999，表明本发明的组合试剂及检测方法的线性检测范围可达0.4-1000ng/mL。
前述的实例仅是说明性的，用于解释本发明所述方法的一些特征。所附的权利要求旨在要求可以设想的尽可能广的范围，且本文所呈现的实施例仅是根据所有可能的实施例的组合的选择的实施方式的说明。因此，申请人的用意是所附的权利要求不被说明本发明的特征的示例的选择限制。在权利要求中所用的一些数值范围也包括了在其之内的子范围，这些范围中的变化也应在可能的情况下解释为被所附的权利要求覆盖。
Claims (10)
1.一种用于检测甲胎蛋白异质体的组合试剂，其特征在于，包括：
被标记物标记的凝集素；
被链霉亲和素修饰的磁珠；
被生物素修饰的甲胎蛋白抗体，所述甲胎蛋白抗体为去糖基化修饰的抗体。
2.如权利要求1所述的组合试剂，其特征在于，所述甲胎蛋白抗体选自F(ab')2抗体片段、Fab'抗体片段、Fab抗体片段、Fv抗体片段或其他去除Fc片段的抗体中的一种或多种。
3.如权利要求2所述的组合试剂，其特征在于，所述凝集素选自小扁豆凝集素、橙黄网包盘菌凝集素或刀豆凝集素中的一种或多种。
4.如权利要求2所述的组合试剂，其特征在于，所述磁珠选自羧基磁珠、氨基磁珠、羟基磁珠、环氧基磁珠或甲苯磺酰基磁珠中的一种或多种。
5.一种甲胎蛋白异质体的检测方法，其特征在于，使用了如权利要求1至4任一所述的组合试剂进行检测，检测步骤包括：
S1.将所述被生物素修饰的甲胎蛋白抗体与待测样本在第一预设温度下进行第一次孵育，获得第一次孵育复合物；
S2.将所述第一次孵育复合物与所述被链霉亲和素修饰的磁珠在第二预设温度下进行第二次孵育，孵育完成后进行洗涤处理，获得第二次孵育复合物；
S3.将所述第二次孵育复合物与所述被标记物标记的凝集素在第三预设温度下进行第三次孵育，孵育完成后进行洗涤处理，得到第三次孵育复合物；
S4.激发所述第三孵育复合物发光，检测所述第三孵育复合物的相对发光强度，通过检测得到的相对发光强度，计算待测样本中甲胎蛋白异质体的含量。
6.如权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述被链霉亲和素修饰的磁珠通过采用EDC/NHS两步法缩合偶联的方式获得，其中，每毫克所述磁珠投料18-22μg链霉亲和素。
7.如权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述甲胎蛋白抗体选自F(ab')2抗体片段，所述甲胎蛋白抗体的制备步骤包括：采用F(ab')2制备试剂盒对抗甲胎蛋白鼠单克隆抗体进行酶切以及产物纯化，得到F(ab')2抗体片段。
8.如权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述被生物素修饰的甲胎蛋白抗体的制备步骤包括：采用磷酸盐缓冲液将得到的所述F(ab')2抗体片段的浓度调整至1.5-2.5mg/mL，而后按照生物素与F(ab')2抗体片段的摩尔比为(80:1)-(120：1)加入生物素-聚乙二醇-活性酯试剂，在室温下震荡孵育，孵育完成后经超滤离心除去过量的生物素-聚乙二醇-活性酯试剂。
9.如权利要求5至8任一所述的检测方法，其特征在于，所述标记物选自吖啶酯。
10.如权利要求9所述的检测方法，其特征在于，所述被标记物标记的凝集素的制备步骤包括：将凝集素与吖啶酯按照质量比为(24:1)-(16：1)混合，混合均匀后，置于旋转混匀仪上，避光室温反应25-35min，反应结束，而后进行纯化处理，得到被吖啶酯标记的凝集素。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202211151092.4A CN115494233A (zh) | 2022-09-21 | 2022-09-21 | 一种用于检测甲胎蛋白异质体的组合试剂及检测方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202211151092.4A CN115494233A (zh) | 2022-09-21 | 2022-09-21 | 一种用于检测甲胎蛋白异质体的组合试剂及检测方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN115494233A true CN115494233A (zh) | 2022-12-20 |
Family
ID=84470118
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202211151092.4A Pending CN115494233A (zh) | 2022-09-21 | 2022-09-21 | 一种用于检测甲胎蛋白异质体的组合试剂及检测方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN115494233A (zh) |
Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20120190576A1 (en) * | 2009-07-14 | 2012-07-26 | Hisashi Narimatsu | Glycan Markers as Measure of Disease State of Hepatic Diseases |
| CN102625915A (zh) * | 2009-07-14 | 2012-08-01 | 独立行政法人产业技术综合研究所 | 糖蛋白质的测定方法、肝病的检查方法、糖蛋白质定量用试剂及肝病病情指标糖链标记糖蛋白质 |
| WO2015112382A1 (en) * | 2014-01-21 | 2015-07-30 | Morehouse School Of Medicine | Exosome-mediated detection of infections and diseases |
| CN109239368A (zh) * | 2018-09-29 | 2019-01-18 | 迈克生物股份有限公司 | 测定孕酮的方法及试剂盒 |
| CN113433318A (zh) * | 2021-06-29 | 2021-09-24 | 山东中鸿特检生物科技有限公司 | 一种检测甲胎蛋白异质体afp-l3含量的试剂盒及其检测方法和应用 |
| CN114303062A (zh) * | 2019-09-02 | 2022-04-08 | 富士瑞必欧株式会社 | 凝集素结合性物质测定方法和凝集素结合性物质测定试剂盒、以及用于它们的嵌段化标记凝集素 |
| CN114487385A (zh) * | 2021-12-29 | 2022-05-13 | 深圳市国赛生物技术有限公司 | 甲胎蛋白异质体检测组合物及其制备方法和应用 |
-
2022
- 2022-09-21 CN CN202211151092.4A patent/CN115494233A/zh active Pending
Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20120190576A1 (en) * | 2009-07-14 | 2012-07-26 | Hisashi Narimatsu | Glycan Markers as Measure of Disease State of Hepatic Diseases |
| CN102625915A (zh) * | 2009-07-14 | 2012-08-01 | 独立行政法人产业技术综合研究所 | 糖蛋白质的测定方法、肝病的检查方法、糖蛋白质定量用试剂及肝病病情指标糖链标记糖蛋白质 |
| WO2015112382A1 (en) * | 2014-01-21 | 2015-07-30 | Morehouse School Of Medicine | Exosome-mediated detection of infections and diseases |
| CN109239368A (zh) * | 2018-09-29 | 2019-01-18 | 迈克生物股份有限公司 | 测定孕酮的方法及试剂盒 |
| CN114303062A (zh) * | 2019-09-02 | 2022-04-08 | 富士瑞必欧株式会社 | 凝集素结合性物质测定方法和凝集素结合性物质测定试剂盒、以及用于它们的嵌段化标记凝集素 |
| CN113433318A (zh) * | 2021-06-29 | 2021-09-24 | 山东中鸿特检生物科技有限公司 | 一种检测甲胎蛋白异质体afp-l3含量的试剂盒及其检测方法和应用 |
| CN114487385A (zh) * | 2021-12-29 | 2022-05-13 | 深圳市国赛生物技术有限公司 | 甲胎蛋白异质体检测组合物及其制备方法和应用 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| JINLONG LI 等: "An electrochemical biosensor for the assay of alpha-fetoprotein-L3 with practical applications" * |
| KAI WANG 等: "Automatic Time-Resolved Fluorescence Immunoassay of Serum Alpha Fetoprotein-L3 Variant via LCA Magnetic Cationic Polymeric Liposomes Improves the Diagnostic Accuracy of Liver Cancer" * |
| 张爱英 等: "甲胎蛋白异质体分离方法的优化" * |
| 李金龙: "肝癌相关标志蛋白电化学检测新方法研究" * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US11959912B2 (en) | Fluorescence immunochromatographic detection card and a preparation method therefor and use thereof | |
| KR102138192B1 (ko) | 다수 개의 검사선을 구비한 임신진단용 면역크로마토그래피 스트립 및 이를 포함하는 임신진단키트 | |
| CN108318680B (zh) | 一种抗药抗体的检测方法及检测试剂盒 | |
| EP1887358B1 (en) | Method of immunologically analyzing plasmin degradation product of stabilized fibrin | |
| CN107957495B (zh) | 一种ck-mb检测试剂盒及其使用方法 | |
| CN114487385A (zh) | 甲胎蛋白异质体检测组合物及其制备方法和应用 | |
| CN111175491A (zh) | 一种sBCMA磁微粒化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法和应用 | |
| CN113433318A (zh) | 一种检测甲胎蛋白异质体afp-l3含量的试剂盒及其检测方法和应用 | |
| CN109001471A (zh) | 游离人绒毛膜促性腺激素β亚单位化学发光检测试剂盒及其制备方法和使用方法 | |
| CN111351924B (zh) | 一种基于酶诱导磷酸根离子激活的近红外荧光免疫分析试剂盒及检测方法 | |
| CN113640511B (zh) | 一种磁微粒电化学发光试剂盒 | |
| EP0399464A2 (en) | Assay method for a substance with a specific sugar chain | |
| CN110954693A (zh) | 一种肿瘤标志物Cyfra21-1的Simoa试剂盒及其应用 | |
| JPS6396557A (ja) | 免疫学的測定法 | |
| CN113933521A (zh) | 磁微粒化学发光检测试剂盒及其制备方法和应用 | |
| CN111721934B (zh) | 一种改良型特异性生长因子检测试剂盒及其应用 | |
| CN112540177A (zh) | 一种高灵敏度肌酸激酶同工酶检测试剂盒及其制备方法 | |
| CN115494233A (zh) | 一种用于检测甲胎蛋白异质体的组合试剂及检测方法 | |
| CN109085343B (zh) | 一种测定抗Jo-1抗体的试剂盒及检测方法 | |
| CN111487409A (zh) | 一种s100b蛋白的化学发光法检测试剂盒及其使用方法 | |
| CN115651065A (zh) | 一种用于肝纤维化和肝硬化检测的试剂盒 | |
| CN114354916A (zh) | 一种酶联免疫荧光法检测试剂盒及其在检测蛋白含量中的应用 | |
| CN112710858A (zh) | 试剂盒及其制备方法和应用 | |
| CN111239410A (zh) | 检测肝癌、肝炎和/或肝硬化的试剂盒及在akr1b10和afp联合定量测定中应用 | |
| CN115541873B (zh) | 测定三联吡啶钌浓度的方法和组合物 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20221220 |
|
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |