CN115825429A - 一种化学发光基团偶联凝集素试剂及其制备方法以及基于它的检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物医药应用领域，具体涉及一种化学发光基团偶联凝集素试剂及其制备方法以及基于它的检测试剂盒。其技术要点如下：偶联凝集素试剂由化学发光基团与凝集素通过有机官能团偶联的方式制备得到的；其中，化学发光基团是吖啶酯及其衍生物、磺基化的吖啶酯及其衍生物、鲁米诺、异鲁米诺、鲁米诺酰肼、鲁米诺环酰肼、邻苯三酚、间苯三酚、间苯二酚、（金刚烷）‑1，2‑二氧环乙烷及其衍生物、过氧草酸酯、光泽精、洛粉碱或海萤萤光素类似物；凝集素是植物凝集素、动物凝集素或微生物凝集素。本发明针对生物传感检测过程中存在的灵敏度问题，提供一种可提高发光效率、增强检测灵敏度的化学发光基团偶联凝集素的发光试剂。

Description

一种化学发光基团偶联凝集素试剂及其制备方法以及基于它 的检测试剂盒

技术领域

本发明涉及生物医学应用领域，具体涉及一种化学发光基团偶联凝集素试剂及其制备方法以及基于它的检测试剂盒。

背景技术

凝集素(lectin)是一类除酶和抗体之外的糖结合蛋白，存在于从病毒、细菌到植物、动物的几乎一切生物系统当中。凝集素与糖的相互作用构成了细胞识别和粘附的基础，二者以“锁钥互配”的形式发挥作用，并广泛应用于生物传感器中。

近年来，生物传感器作为一种新兴的分析设备，将分析物和生物受体之间的相互作用引起的微小变化转化为可检测的信号，从而达到检测的目的。但是生物传感器通常受制于换能器的性质而存在灵敏度差的问题。

有鉴于上述现有聚丙烯材料存在的缺陷，本发明人基于从事此类材料多年丰富经验及专业知识，配合理论分析，加以研究创新，开发一种化学发光基团偶联凝集素试剂及基于它的试剂盒。

发明内容

本发明的目的是针对生物传感检测过程中，尤其是酶联免疫分析检测信号中存在的灵敏度问题，基于化学发光具有区别于光致发光，无需外部激发光源，避免了能量转移过程中的损失，显示出极低的背景光，显著提升发光效率和检测灵敏度。基于此本发明提供一种可提高发光效率、增强检测灵敏度的化学发光基团偶联凝集素的发光试剂。

本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：

本发明提供的一种化学发光基团偶联凝集素试剂，偶联凝集素试剂由化学发光基团与凝集素通过有机官能团偶联的方式制备得到的；

其中，化学发光基团是吖啶酯及其衍生物、磺基化的吖啶酯及其衍生物、鲁米诺、异鲁米诺、鲁米诺酰肼、鲁米诺环酰肼、邻苯三酚、间苯三酚、间苯二酚、(金刚烷)-1,2-二氧环乙烷及其衍生物、过氧草酸酯、光泽精、洛粉碱或海萤萤光素类似物；

凝集素是植物凝集素、动物凝集素或微生物凝集素；

有机官能团偶联方式采用的有机官能团是烷基-N-琥珀酰亚胺酯、琥珀酰亚胺酯或烷基-马来酰亚胺；吖啶酯的侧链上还连接有甲氧基官能团。

进一步的，吖啶酯上连接可修饰的羧基官能团。本发明通过吖啶酯上连接的甲氧基的位置的调整，可根据不同的底物，有针对性构建吖啶酯的结构，从而有效提高发光效率。

本发明针对现有的吖啶酯及其衍生物存在水溶性差，从而导致化学发光显色构架过程中的非特性信号的产生。通过吖啶酯结构上可修饰结构的调整，有针对性构建吖啶酯的结构，有效增强其生物相容性，提高其化学发光性能。

本发明通过有机官能团偶联剂作为桥梁，将化学发光基团与凝集素通过化学键的方式连接起来，形成夹心结构，使发光基团偶联抗体或凝集素体系存在发光基团影响偶联的抗体或凝集素夹心性能。并通过探索抗体或凝集素与发光基团之间的连接基团，通过化学手段调控连接基团的长短，来优化发光基团偶联抗体或凝集素体系的识别性能和显色信号稳定性。

同时还能够通过偶联剂引入不同的基团，提升吖啶酯衍生物等发光基团在不同pH值环境的响应稳定性及其发光性能。

进一步的，植物凝集素是小扁豆凝集素、大豆球蛋白、大豆凝集素或花生凝集素中的任意一种。

进一步的，动物凝集素是C-型凝集素、S-型凝集素、P-型凝集素、I-型凝集素或正五聚蛋白中的任意一种。

进一步的，微生物凝集素是病毒凝集素、细菌凝集素、真菌凝集素、细胞黏真菌凝集素或原生动物凝集素中的任意一种。

本发明的第二个目的是提供一种化学发光基团偶联凝集素试剂的制备方法，具有同样的技术效果。

本发明的上述技术目的是由以下技术方案实现的：

本发明提供的化学发光基团偶联凝集素试剂的制备方法，有机官能团偶联的方式具体是，在化学发光基团上修饰偶联基团，使偶联基团与所述凝集素上的氨基酸发生共价偶联。

进一步的，有机官能团偶联的方式具体是，在修饰烷基-N-琥珀酰亚胺酯后，使烷基-N-琥珀酰亚胺酯与所述凝集素上的氨基酸的氨基共价偶联。

其反应方程式如下：

或

进一步的，有机官能团偶联的方式具体是，在化学发光基团上修饰烷基-马来酰亚胺，利用马来酰亚胺与凝集素上氨基酸的巯基通过点击反应形成共价偶联。

其反应方程式如下：

进一步的，烷基-N-琥珀酰亚胺酯或烷基-马来酰亚胺中烷基的碳原子数n＝0～18，当n＝0时，烷基-N-琥珀酰亚胺酯是琥珀酰亚胺酯，不含有烷基链。

本发明提供的化学发光基团，可以根据不同的检测对象，选择不同链长的有机官能团，得到结构更加合理的夹心结构，调整信号强度和信号稳定性。

进一步的，有机官能团偶联的方式具体是用碳酸盐缓冲液CBS(pH 8.5)溶解待修饰的凝集素试剂，然后分别称取凝集素试剂100倍当量浓度的吖啶盐-N-琥珀酰亚胺酯(NSP-DMAE-NHS)溶于10μL DMSO加入到待修饰的凝集素溶液中，室温下搅拌反应12h。使吖啶酯发光基团与凝集素的氨基进行共价偶联得到吖啶酯偶联凝集素试剂。应结束后移入透析袋(MW:7000)中，在0℃下使用去离子水进行充分透析，每次透析12h，透析三次。透析完成后使用超滤管(MW:7000)进行浓缩，BCA法测定蛋白浓度并定容至0.1mg/mL。

本发明的第三个目的是提供基于化学发光基团偶联凝集素试剂的检测试剂盒，具有同样的技术优势。

本发明的上述技术目的是由以下技术方案实现的：

本发明提供的基于化学发光基团偶联凝集素试剂的检测试剂盒，检测试剂盒中包括检测抗体或检测抗原、化学发光基团偶联凝集素试剂和化学发光触发液。

进一步的，检测抗体或检测抗原修饰于纳米磁珠表面。

进一步的，采用检测抗原或检测抗体修饰纳米磁珠表面的具体方法如下：首先将1μm的修饰链霉亲和素磁性微球MBs-SA(10mg/mL)置于漩涡振荡器上30s，振荡重悬磁微粒，用移液枪移取50μL磁微粒于1.5mL EP离心管中，磁性分离，用移液枪移去上清液，加入200μL生物素化抗体(Biotin-antibody，0.1mg/mL)和800μL的PBS缓冲液，置于漩涡振荡器上，充分振荡重悬磁微粒，转入37℃恒温摇床中转速180孵育25～30min，磁分离后用移液枪移除上清液，加入1mL Washing buffer(PBST)，充分振荡重悬磁微粒，磁性分离，用移液枪移去上清液，该步骤重复两次，共洗涤三次，洗去多余的未与链霉亲和素结合的生物素化抗体，洗涤之后加入1mL的PBS得磁微粒浓度为0.5mg/mL的MBs-SA@Biotin-antibody复合物。

进一步的，化学发光触发液包括如下组分：碱性溶液、双氧水、微过氧化物酶、过氧化氢酶、次氯血红素、次氯酸盐和超氧离子。

进一步的，检测试剂盒中还包括超顺磁性纳米磁珠，粒径为0.2～10μm。

进一步的，检测试剂盒内还包括待测物测定所需的其他成分。

进一步的，其他成分是标准物、缓冲液、底物、稀释液或说明书中的任意一种或几种的组合。

本发明提供的基于化学发光的检测试剂盒，检测对象主要针对于疾病相关的肿瘤标志物、肿瘤细胞、异常糖蛋白。其中肿瘤标志物为甲胎蛋白、甲胎蛋白异质体、癌胚抗原等。异常糖蛋白为唾液酸糖蛋白、铜蓝蛋白Cp、黏蛋白1MUC1、免疫球蛋白IgA、Mac-2结合蛋白等。肿瘤细胞为三阴性乳腺癌细胞、肝癌细胞等。

综上所述，本发明具有以下有益效果：

本发明提供的化学发光基团偶联凝集素试剂以及基于该试剂的检测试剂盒，能够通过化学发光基团的接入，使生物传感器的信号检测更加灵敏。

附图说明

图1.吖啶酯基团偶联凝集素LcA试剂的定量分析；

图2.吖啶酯基团偶联凝集素LcA试剂的光学性能；

图3.吖啶酯发光基团偶联凝集素ConA试剂的定量分析；

图4.吖啶酯发光基团偶联凝集素ConA试剂的光学性能；

图5.甲胎蛋白异质体AFP-L3检测试剂盒检测结果；

图6.n＝3的吖啶酯衍生物与n＝0的吖啶酯衍生物化学性能对比实验结果。

具体实施方式

为更进一步阐述本发明为达成预定发明目的所采取的技术手段及功效，对依据本发明提出的一种化学发光基团偶联凝集素试剂及其制备方法以及基于它的检测试剂盒，其具体实施方式、特征及其功效，详细说明如后。

本实施方式中采用的材料来源如下：

吖啶酯(50mg)：上海敏韬医药科技有限公司；

凝集素LcA(50mg)：西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司(Sigma-Aldrich)；

凝集素ConA(100mg)：西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司(Sigma-Aldrich)；

N-(2-氨基乙基)马来酰亚胺：西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司(Sigma-Aldrich)；

N-羟基琥珀酰亚胺：西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司(Sigma-Aldrich)。

实施例1：吖啶酯发光基团偶联凝集素LcA试剂及其制备方法

本实施例提供的吖啶酯发光基团偶联凝集素LcA试剂，包括吖啶酯发光基团和凝集素LcA。

其制备方法包括如下操作步骤：

S1、采用烷基-N-琥珀酰亚胺酯对吖啶酯进行修饰得到吖啶盐-N-琥珀酰亚胺酯；具体操作：分别称取浓度比1:1的N-羟基琥珀酰亚胺和两端分别修饰氨基和羧基的烷基链，在1.2倍当量浓度的1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)存在的条件下进行酯化反应，室温下搅拌反应12h，得到一端修饰氨基的烷基-N-琥珀酰亚胺酯基团，进一步按照浓度比1:1与末端携带羧基的吖啶酯基团，在1.2倍当量浓度的1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)存在的条件下进行酰胺化反应，得到吖啶盐-N-琥珀酰亚胺酯。

S2、用碳酸盐缓冲液CBS(pH 8.5)溶解凝集素LcA试剂，然后分别称取100倍当量浓度的吖啶盐-N-琥珀酰亚胺酯(NSP-DMAE-NHS)溶于10μL DMSO加入到待修饰的凝集素溶液中，室温下搅拌反应12h；

S3、使吖啶酯发光基团与凝集素的氨基进行共价偶联得到吖啶酯偶联凝集素试剂。反应结束后移入透析袋(MW:7000)中，在0℃下使用去离子水进行充分透析，每次透析12h，透析三次；

S4、透析完成后使用超滤管(MW:7000)进行浓缩，BCA法测定蛋白浓度并定容至0.1mg/mL。

其反应方程式如下：

本实施例中的制备方法还可以构建其它结构类型的检测试剂，其反应方程式如下：

本实施例中的制备方法还可以构建其它结构类型的检测试剂，其反应方程式如下：

或

其中n＝0～18。

同时，针对现有的化学发光性能吖啶酯衍生物存在生物相容性，导致在显色过程中非特异性吸附到抗体或蛋白结构中，引发较多的非特异性信号，给定量检测带来了诸多不确定的因素。本发明中，主要针对吖啶酯结构的改进和化学发光性能的提升，其中将结构改进后的吖啶酯衍生物(n＝3)与n＝0时吖啶酯衍生物(NSP-DMAE-NHS)的化学发光性能进行对比，可见由于结构的改变，有效提高了吖啶酯衍生的水溶性，提升了其化学发光信号。具体实验结果如图6所示。

实施例2：吖啶酯发光基团偶联凝集素LcA试剂及其制备方法

本实施例提供的吖啶酯发光基团偶联凝集素LcA试剂，包括吖啶酯发光基团和凝集素LcA。

其制备方法包括如下操作步骤：

S1、采用烷基链修饰的马来酰胺基团对吖啶酯进行修饰得到吖啶酯发光基团；具体操作：分别称取浓度比1:1的N-(2-氨基乙基)马来酰亚胺和两端分别修饰氨基和羧基的烷基链，在1.2倍当量浓度的1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)存在的条件下进行酰胺化反应，室温下搅拌反应12h，得到一端修饰烷基链的马来酰亚胺基团，进一步按照浓度比1：1与末端携带羧基的吖啶酯基团，在1.2倍当量浓度的1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)存在的条件下进行酰胺化反应，室温下搅拌反应12h，得到修饰马来酰亚胺的吖啶酯发光基团(吖啶盐-马来酰胺)。

S2、用碳酸盐缓冲液CBS(pH 8.5)溶解凝集素LcA试剂，然后分别称取100倍当量浓度的吖啶盐-马来酰胺溶于10μL DMSO加入到待修饰的凝集素溶液中，室温下搅拌反应12h；

S3、使吖啶酯发光基团与凝集素的氨基进行共价偶联得到吖啶酯偶联凝集素试剂。应结束后移入透析袋(MW:7000)中，在0℃下使用去离子水进行充分透析，每次透析12h，透析三次；

S4、透析完成后使用超滤管(MW:7000)进行浓缩，BCA法测定蛋白浓度并定容至0.1mg/mL。

其反应方程式如下：

本实施例中的制备方法还可以构建其它结构类型的检测试剂，其反应方程式如下：

其中n＝0～18。

实施例3：吖啶酯发光基团偶联凝集素ConA试剂及其制备方法

本实施例提供的吖啶酯发光基团偶联凝集素ConA试剂，包括吖啶酯发光基团和凝集素ConA。

其制备工艺包括如下操作步骤：

S1、采用烷基-N-琥珀酰亚胺酯对吖啶酯进行修饰得到吖啶盐-N-琥珀酰亚胺酯。具体操作：分别称取浓度比1:1的N-羟基琥珀酰亚胺和两端分别修饰氨基和羧基的烷基链，在1.2倍当量浓度的1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)存在的条件下进行酯化反应，室温下搅拌反应12h，得到一端修饰氨基的烷基-N-琥珀酰亚胺酯基团，进一步按照浓度比1：1与末端携带羧基的吖啶酯基团，在1.2倍当量浓度的1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)存在的条件下进行酰胺化反应，得到吖啶盐-N-琥珀酰亚胺酯。

S2、用碳酸盐缓冲液CBS(pH 8.5)溶解凝集素ConA试剂，然后分别称取100倍当量浓度的吖啶盐-N-琥珀酰亚胺酯(NSP-DMAE-NHS)溶于10μL DMSO加入到待修饰的凝集素溶液中，室温下搅拌反应12h；

S3、使吖啶酯发光基团与凝集素的氨基进行共价偶联得到吖啶酯偶联凝集素试剂。应结束后移入透析袋(MW:7000)中，在0℃下使用去离子水进行充分透析，每次透析12h，透析三次；

S4、透析完成后使用超滤管(MW:7000)进行浓缩，BCA法测定蛋白浓度并定容至0.1mg/mL。

其反应方程式如下：

本实施例还可以采用下列原料，其反应方程式如下：

进而，本实施例还可以采用如下原料，其反应方程式如下：

或

其中n＝0～18。

实施例4：吖啶酯发光基团偶联凝集素ConA试剂及其制备方法

本实施例提供的吖啶酯发光基团偶联凝集素ConA试剂，包括吖啶酯发光基团和凝集素ConA。

其制备工艺包括如下操作步骤：

S1、采用烷基-马来酰亚胺对吖啶酯进行修饰得到吖啶盐-马来酰亚胺；具体操作：分别称取浓度比1:1的N-(2-氨基乙基)马来酰亚胺和两端分别修饰氨基和羧基的烷基链，在1.2倍当量浓度的1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)存在的条件下进行酰胺化反应，室温下搅拌反应12h，得到一端修饰氨基的烷基链-N-乙胺基马来酰亚胺基团，进一步按照浓度比1:1与末端携带羧基的吖啶酯基团，在1.2倍当量浓度的1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)存在的条件下进行酰胺化反应，室温下搅拌反应12h，得到修饰马来酰亚胺的吖啶酯发光基团。

S2、用碳酸盐缓冲液CBS(pH 8.5)溶解凝集素ConA试剂，然后分别称取100倍当量的吖啶盐-马来酰亚胺溶于10μL DMSO加入到待修饰的凝集素溶液中，室温下搅拌反应12h；

S3、使吖啶酯发光基团与凝集素的氨基进行共价偶联得到吖啶酯偶联凝集素试剂。应结束后移入透析袋(MW:7000)中，在0℃下使用去离子水进行充分透析，每次透析12h，透析三次；

S4、透析完成后使用超滤管(MW:7000)进行浓缩，BCA法测定蛋白浓度并定容至0.1mg/mL。

其反应方程式如下：

本实施例中的发光基团还可以拓展为下列反应方程式：

实施例5：甲胎蛋白异质体AFP-L3的检测试剂盒

本实施例提供的检测试剂盒，其中包括检测抗体甲胎蛋白AFP 6mL、洗涤液20mL、化学发光基团偶联凝集素试剂6mL和化学发光触发液6mL。其中甲胎蛋白异质体AFP购自于菲鹏生物股份有限公司。

通过修饰捕捉抗体的磁性纳米磁珠分离得到均相的待测物，然后加入实施例1中获得的化学发光基团偶联凝集素LcA的显色试剂，孵育15分钟后洗涤，最后加入化学发光触发液，立即使用化学发光检测仪器读取信号，带入标准公式中计算得到待测物的具体浓度。

其中，修饰捕捉抗体的磁性纳米磁珠分离得到均相的待测物的制备方法如下：首先将1μm的修饰链霉亲和素磁性微球MBs-SA(10mg/mL)置于漩涡振荡器上30s，振荡重悬磁微粒，用移液枪移取50μL磁微粒于1.5mL EP离心管中，磁性分离，用移液枪移去上清液，加入200μL甲胎蛋白异质体AFP-L3(0.1mg/mL)和800μL PBS缓冲液，置于漩涡振荡器上，充分振荡重悬磁微粒，转入37℃恒温摇床中转速180孵育25min，磁分离后用移液枪移除上清液，加入1mLWashingbuffer(PBST)，充分振荡重悬磁微粒，磁性分离，用移液枪移去上清液，该步骤重复两次，共洗涤三次，洗去多余的未与链霉亲和素结合的生物素化抗体，洗涤之后加入1mL的PBS得磁微粒浓度为0.5mg/mL的MBs-SA@Biotin-antibody复合物。

性能表征：MS和化学发光信号测定

1、实施例1中的吖啶酯标记LcA(NSP-DMAE-LcA)的MS表征

使用生物质谱法确定LcA和NSP-DMAE-LcA(结构式见实施例1的第一个反应方程式)的分子量，如图1所示。与LcA相比，NSP-DMAE-LcA的分子量增加了953.0977。通过计算得出每分子LcA偶联了约2个NSP-DMAE分子，结果如图1所示。

2、实施例1中的NSP-DMAE-LcA的化学发光性能测试

对NSP-DMAE-LcA(结构式见实施例1的第一个反应方程式)进行化学发光性能测试，分别取不同体积的NSP-DMAE-LcA母液(0.1mg/mL)于纯白(或纯黑)96孔板中，加水稀释至50μL，用排枪各孔加入50μL的化学发光触发液并快速放入化学发光成像分析仪样品仓，测试各孔在加入触发液后10～120s的化学发光强度变化，经随机附带软件ImageQuantTL8.1处理后绘制出不同浓度NSP-DMAE-LcA的化学发光强度随时间的变化关系，加入化学发光触发液后各孔NSP-DMAE-LcA的终浓度为10，50，100nM。

吖啶酯标记在LcA上之后，其仍保持良好的化学发光性能。随着时间的增加，NSP-DMAE-LcA的发光强度逐渐下降。此外，NSP-DMAE-LcA的发光强度具有良好的浓度依赖性，即随着NSP-DMAE-LcA的浓度增加，发光强度也随之增强，这充分体现出，采用本发明提供的偶联方式获得的NSP-DMAE-LcA具有高的发光效率，结果如图2所示。

3、实施例3中的吖啶酯标记ConA(NSP-DMAE-ConA)的MS表征

使用生物质谱法确定ConA和NSP-DMAE-ConA(结构式见实施例1的第一个反应方程式)的分子量，如图3所示。与ConA相比，NSP-DMAE-ConA的分子量增加了2163.75。通过计算得出每分子ConA偶联了约5个NSP-DMAE分子，结果如图3所示。

4、实施例3中的NSP-DMAE-ConA的化学发光性能测试

对实施例3获得的NSP-DMAE-ConA(结构式见实施例1的第一个反应方程式)进行化学发光性能测试，分别取不同体积的NSP-DMAE-ConA母液(0.1mg/mL)于纯白(或纯黑)96孔板中，加水稀释至50μL，用排枪各孔加入50μL的触发液并快速放入化学发光成像分析仪样品仓，测试各孔在加入触发液后10-120s的化学发光强度变化，经随机附带软件ImageQuantTL 8.1处理后绘制出不同浓度NSP-DMAE-ConA的化学发光强度随时间的变化关系，加入触发液后各孔NSP-DMAE-ConA的终浓度为10，50，100nM。

如图4所示，吖啶酯标记在ConA上之后，其仍保持良好的化学发光性能。随着时间的增加，NSP-DMAE-ConA的发光强度逐渐下降。此外，NSP-DMAE-ConA的发光强度具有良好的浓度依赖性，即随着NSP-DMAE-ConA的浓度增加，发光强度也随之增强，同时可以看到经过本发明提供的偶联方式获得的NSP-DMAE-ConA的发光强度更高。结果如图4所示。

5、甲胎蛋白异质体AFP-L3的检测试剂盒的检测结果

如图5所示，甲胎蛋白异质体AFP-L3的检测具体步骤：将1μm MBs-SA置于漩涡振荡器上20s，振荡重悬磁微粒，用移液枪移取5μL磁微粒至1.5mL EP离心管中，磁性分离，用移液枪吸取上清液，分别加入200μL 0.1mg/mL的Biotin-2AFP-27并加入pH为7.4的PBS补足至1mL，37℃摇床中孵育25min后，磁性分离，吸取上清液至1.5mL EP离心管中，加入1mL PBST(Washing buffer)，充分振荡重悬磁微粒，磁性分离，用移液枪移除上清液，重复该步骤三次，共洗涤三次，洗去多余的未与MBs-SA结合的Biotin-2AFP-27，最后加PBS补足至1mL得到MBs-SA@Biotin-2AFP-27复合物。

分别取上述复合物100μL于两个0.5mL EP离心管中，分别加入甲胎蛋白抗原AFP-Ag(500ng/mL和100ng/mL)各100μL，振荡器充分振荡重悬磁微粒，37℃下孵育25min，磁分离并用移液枪移除上清液，加入100μL PBST(Washing buffer)，充分振荡重悬磁微粒，磁性分离，用移液枪移除上清液，重复该步骤三次，洗涤三次，洗去多余的未与MBs-SA@Biotin-2AFP-27结合的AFP-Ag，最后加PBS补足至100μL得到捕获有AFP-Ag的MBs-SA@Biotin-2AFP-27复合物(MBs-SA@Biotin-2AFP-27@AFP)，向其中加入先前配好的NSP-DMAE-LcA(结构式见实施例第2个反应方程式，n取4)(0.1mg/mL)100μL，振荡器充分振荡重悬磁微粒，37℃下孵育25min。

磁分离并用移液枪移除上清液，加入100μL PBST(Washing buffer)，充分振荡重悬磁微粒，磁性分离，用移液枪移除上清液，重复该步骤三次，共洗涤三次，洗去多余的未与MBs-SA@Biotin-2AFP-27@AFP结合的NSP-DMAE-LcA(结构式见实施例第2个反应方程式，n取4)，进而加入50μL PBS得到MBs-SA@Biotin-2AFP-27@AFP@NSP-DMAE-LcA复合物，进一步将夹心复合物及空白组分别振荡重悬后移入白色96孔板中，各加入50μL化学发光触发液后立即放入化学发光成像分析仪样品仓，测试其在加入触发液后10～120s的化学发光强度变化。

最后通过将化学发光荧光强度数值代入标准曲线计算出捕获的甲胎蛋白异质体AFP-L3的具体浓度，结果见图5，根据图5的数据可知，随着浓度的增大，检测灵敏度随之增大，且侧链连接甲氧基后，能够提高发光信号的稳定性。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例展示如上，但并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述揭示的技术内容做出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims (10)

1.一种化学发光基团偶联凝集素试剂，其特征在于，所述偶联凝集素试剂由化学发光基团与凝集素通过有机官能团偶联的方式制备得到的；

其中，所述化学发光基团是吖啶酯及其衍生物、磺基化的吖啶酯及其衍生物、鲁米诺、异鲁米诺、鲁米诺酰肼、鲁米诺环酰肼、邻苯三酚、间苯三酚、间苯二酚、（金刚烷）-1,2-二氧环乙烷及其衍生物、过氧草酸酯、光泽精、洛粉碱或海萤萤光素；

所述凝集素是植物凝集素、动物凝集素或微生物凝集素；

所述有机官能团偶联方式采用的有机官能团是烷基-N-琥珀酰亚胺酯、琥珀酰亚胺酯或烷基-马来酰亚胺；

其中，所述吖啶酯上连接有羧基。

2.根据权利要求1所述的一种化学发光基团偶联凝集素试剂，其特征在于，所述植物凝集素是小扁豆凝集素、大豆球蛋白、大豆凝集素或花生凝集素中的任意一种。

3.根据权利要求1所述的一种化学发光基团偶联凝集素试剂，其特征在于，所述动物凝集素是C-型凝集素、S-型凝集素、P-型凝集素、I-型凝集素或正五聚蛋白中的任意一种。

4.根据权利要求1所述的一种化学发光基团偶联凝集素试剂，其特征在于，所述微生物凝集素是病毒凝集素、细菌凝集素、真菌凝集素、细胞黏真菌凝集素或原生动物凝集素中的任意一种。

5.如权利要求1~4所述的一种化学发光基团偶联凝集素试剂的制备方法，其特征在于，先在发光基团上接枝烷基-N-琥珀酰亚胺酯、琥珀酰亚胺酯或烷基-马来酰亚胺，再与凝集素发生有机官能团偶联。

6.根据权利要求5所述的一种化学发光基团偶联凝集素试剂的制备方法，其特征在于，所述有机官能团偶联的方式具体是，在所述修饰烷基-N-琥珀酰亚胺酯后，使烷基-N-琥珀酰亚胺酯与所述凝集素上的氨基酸的氨基共价偶联。

7.根据权利要求5所述的一种化学发光基团偶联凝集素试剂，其特征在于，所述有机官能团偶联的方式具体是，在所述化学发光基团上修饰烷基-马来酰亚胺，利用马来酰亚胺与凝集素上氨基酸的巯基通过点击反应形成共价偶联。

8.一种基于权利要求1~4任意一项所述的化学发光基团偶联凝集素试剂的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒中包括检测抗体500μL~6mL或检测抗原500μL~6mL、洗涤液6mL~20mL、化学发光基团偶联凝集素试剂500μL~6mL和化学发光触发液500μL~6mL。

9.根据权利要求8所述的基于化学发光基团偶联凝集素试剂的检测试剂盒，其特征在于，所述检测抗体或检测抗原通过化学修饰生物素与表面修饰链霉亲和素的纳米磁珠进行共价偶联。

10.根据权利要求8所述的基于化学发光基团偶联凝集素试剂的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒内还包括待测物测定所需的其他成分。

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