CN1194642A - 用于标记巯基的试剂、其制备以及用其进行标记的方法 - Google Patents
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Abstract
包含通式为(Ⅰ)的吖啶化合物或其中间体的用于标记巯基的试剂;制备吖啶化合物的方法;以及用它们标记分析物的方法;其中A是-(CH2)m1-或-(CH2)m2-Q-(CH2)n-[其中Q是-S+RX--,-N+RR1X--(其中R1是C1-C6烷基或芳基),分子式(a)(其中R2和R3每个独立地是-(CH2)K-(其中K是1—3)或-O(CH2CH2O)I-(其中I是1—3);m1是1—6;m2是0—2;n是1—2];R是C1-C6烷基或芳基;X是阴离子。
Description
技术领域
本发明涉及一种使用含马来酰亚胺基团的吖啶化合物来标记巯基(SH)的试剂。更具体地说,本发明涉及以吖啶化合物作为标记物质的一种巯基标记试剂、其生产方法以及用其进行标记的方法。吖啶化合物中含有马来酰亚胺基团,它能与诸如氨基酸、蛋白质之类(被)分析物中含有的或易于引入的巯基结合,并能产生化学发光。
背景技术
吖啶鎓酯、吖啶化合物由于具有高发光效率,可用作化学发光标记物质。这种吖啶鎓酯作为一种化学发光标记在临床试验的免疫发光分析中的应用可见诸于,例如欧洲专利公报82636及美国专利4,745,181。
已知的吖啶鎓酯包括那些含有亲水性结构的,例如链端含有锍离子的(日本专利申请公开(Kokai)平5-255264)、那些间隔部分中含有离子的(日本专利申请公报(Kokai)平5-255263)以及那些以羧基取代吖啶鎓中甲基之类而获得的化合物(日本专利申请公开(kokai)平6-228102)。这些含亲水结构的吖啶鎓酯实际上是打算用来标记氨基的,因此被认为适合用于标记氨基酸、蛋白质之类,故而用于临床试验的免疫发光分析。
顺便指出,临床试验的免疫发光分析中的分析物大多是氨基酸及蛋白质。由于这些物质含有许多氨基,上述已知的吖啶鎓化合物具有标记操作容易的显著优点。
然而,它们标记的是大量存在于氨基酸及蛋白质中的氨基。结果,有许多位置要标记。这就给标记工作带来一致性及可重复性方面的问题、诸如抗体蛋白之类分析物不溶化的问题,以及当对抗体实施标记时,标记化合物与位于抗原识别部位的氨基相结合,从而使其作为抗体的功能减弱或丧失的问题。当分析物为低分子物质时,即只含有有限数目的氨基时,尚有可能控制标记反应并以恒定的摩尔比方便地进行标记。但是,当分析物为高分子物质时,例如抗体蛋白,则氨基的数目就无法准确地测定,其中存在一个缺点:允许采用恒定摩尔比进行标记的条件不得不通过反复试差的办法临时做些假定。
顺便指出,要提供一种用于实际使用的化学发光标记试剂的化合物,重要的是,该化合物应保证标记反应容易进行并且在标记条件下不产生发光或分解。吖啶鎓酯的标记对象范围很广,首先是低分子化合物,例如氨基酸,甚至也包括高分子化合物,例如酶及抗体。当分析物的氨基作为上述那样的基准时,常常在吖啶鎓酯中引入亚胺基,使之与氨基结合起来,正如上面提到的文献中所公开的那样。当利用这种亚胺基对氨基进行结合反应时,该反应在碱性条件下进行得很顺利。但是,吖啶鎓化合物是一种不稳定的化合物,它在碱性条件下能产生发光或分解。因此,既要保持发光活性,又要保证标记的有效进行,势必要求彼此矛盾的反应条件,因而不易办到。
有鉴于此,一直希望找到一种标记化合物,它能在用于免疫发光分析之类的化学发光标记方法中在温和的条件下与诸如氨基酸或蛋白质相结合,并在具备高度专一性的同时具有足够的结合力,还希望提供一种借助该标记化合物来稳定而精确地检出分析物的方法。
发明内容
为解决上面提到的问题,本发明人首先想到,作为被标记基团采用巯基来替代目前使用的氨基,因为巯基具有良好的反应性,尽管它们通常在氨基酸、蛋白质之类物质中的含量并不多。于是,本发明人发现,用分子中引入了马来酰亚胺基团的吖啶鎓化合物作为标记此种巯基的巯基标记试剂是有利的,结果使得本发明终获成功。
其中,
A代表如下基团:
-(CH2)m1-
或者
-(CH2)m2-Q-(CH2)n-
其中Q代表基团-S+RX--、基团-N+RR1X--,其中R1代表含有1~6个碳原子的烷基或芳基、基团
其中R2及R3可以相同或不同并且每一个独立地是基团-(CH2)k-(k:1~3的数)或者是-O(CH2CH2O)l-(l:1~3的数),
m1代表1~6的数,
m2表示0~2的数,
n表示1~2的数;
R代表含有1~6个碳原子的烷基或芳基;以及
X-代表阴离子。
本发明的另一个目的是提供一种含有作为上述吖啶化合物的中间体的巯基标记试剂,该中间体即用下式(II)代表的吖啶化合物:
其中
A’代表如下基团:
-(CH2)m1-
或者
-(CH2)m2-Q’-(CH2)n-
其中Q’代表基团-S-、基团-NR1-,其中R1代表含有1~6个碳原子的烷基、基团
其中R2及R3可以相同或不同并且每一个独立地是基团-(CH2)k-(k:1~3的数)或者是-O(CH2CH2O)l-(l:1~3的数),以及
m1、m2及n的含义同上面的规定。
本发明的又一个目的是提供制备分别用上面的式(I)及式(II)代表的吖啶化合物的方法。
本发明的再一个目的是提供分别用上面的式(I)及式(II)代表的吖啶化合物来标记分析物的方法。
实施本发明的最佳方式
用式(I)代表的化合物,即按照本发明的化合物,可按照例如下述的方法1或方法2中之一来制备。
方法1:
在按照本发明的吖啶化合物当中,每一个化合物(Ia),其中A是基团-(CH2)m1-,其中m1的含义如上面所规定,可通过烷基化试剂(III)与用式(IIa)代表的化合物(以下称“中间体(IIa)”)采用本身为技术上已知的方式按照下列反应式进行反应制成,
(插入第8页的反应式)
其中X代表易于转化为阴离子的消去基团,R及m1的含义同上面的规定。
上述反应中使用的烷基化试剂(R-X)的例子是卤代烷基,例如碘甲烷、溴乙烷及碘乙烷、三氟甲烷磺酸甲酯、氟代磺酸甲酯、甲烷磺酸甲酯及对甲苯磺酸甲酯。因此,式(Ia)中的X-最典型地是卤素离子,例如I-或Br-、CF3SO3 -、FSO3 -或P-CH3C6H4SO3 -,R含有1~6个碳原子的烷基,例如甲基或乙基或者芳基。作为可用于上述反应的溶剂,可举出乙醚、甲苯、乙腈等例子。
具体地说,化合物(II)例如可这样制备:根据《临床化学》31(10),1664~1668页,1985,在以乙酸钠、碳酸钾等作为碱,以乙酸、丙酸等作为溶剂的条件下,在大约80~140℃的温度下,让化合物(IV)与化合物(V)进行反应。
顺便指出,上述中间体(IIa)以通式的形式公开在日本专利申请公开(Kokai)昭62-61969中。但是,该专利公开并未公开任何内容,更不用说可为制备该化合物提供线索的工作实例了。因此,据信该化合物实际上是一种新化合物。
方法2:
在按照本发明的吖啶化合物当中,每一化合物(Ib),其中A是基团-(CH2)m2-Q’-(CH2)n-,其中Q’、m2及n的含义如上面所规定,是一种新化合物,而作为此种化合物的特定例子可举出如下结构式的化合物。
化合物(Ib)例如可通过烷基化试剂(III)与用式(IIb)代表的化合物(以下称“中间体(IIb)”)采用本身为技术上已知的方式按照下列反应式进行反应制成。其中Q、Q’、R、X-、m2及n的含义同上面的规定。
关于上述反应中使用的烷基化试剂(R-X)的例子,可举出方法1中所使用的烷基化试剂。因此,式(Ib)中的X-最典型的是卤素离子,例如I-或Br-、CF3SO3 -、FSO3 -、CH3SO3 -或P-CH3C6H4SO3 -,R是含有1~6个碳原子的烷基,例如甲基或乙基或者芳基。作为可用于上述反应的溶剂,可举出乙醚、甲苯、乙腈等例子。
中间体(IIb)可通过下述的方法之一制备。
(i)按照下述反应路线,含消去基团的苯酚化合物(VI)与9-吖啶羧酸的活性衍生物(VII)进行反应,制成在分子一端带有消去基团的吖啶酯衍生物(VIII);一端含有可能已根据需要用一种保护基团保护起来的伯氨基而在其相反的一端带有伯或仲氨基的多胺(IX)在合适的碱的存在下与上述吖啶酯进行反应,制成一端含有可能已根据需要用一种保护基团保护起来的伯氨基的吖啶酯(X);当有端伯氨基的保护基团时,消去该保护基团,然后以马来酐(V)与该伯氨基反应生成马来酰亚胺基团,于是就得到了化合物(IIb’)。其中Ra每一个独立地是氢原子或氨基保护基团,Y1及Y2代表消去基团,而Q1代表基团-NR1-或基团其中R2及R3的含义同上面的规定,m2及n的含义也同上面的规定。
(ii)按照如下反应方案,一端键合着用保护基团保护起来的伯氨基的、含有硫醚或聚醚的苯酚衍生物(XI)与9-吖啶羧酸的活性衍生物(VII)进行反应,制成吖啶鎓酯(XII),解除端氨基的保护之后,让马来酐(V)与该端伯氨基反应,使之转化为马来酰亚胺基团,于是就得到了化合物(IIb”)。其中Q2代表-S-基或基团-O(CH2CH2O)l-,Ra、Y2、m2及n的含义同上面的规定。
在方法(i)中,含消去基团的苯酚化合物(VI)中的苯酚化合物的例子可包括4-(甲苯磺酰氧甲基)苯酚、4-(3-氯丙基)苯酚及4-(2-甲苯磺酰氧乙基)苯酚,而其消去基团的例子可包括甲苯磺酰氧基、甲磺酰氧基以及卤素原子(氯、溴、碘)。另一方面,9-吖啶羧酸的活性衍生物(VII)的例子是酰基卤,例如氯化物及溴化物,酸酐及活性酸酯。而,多胺(IX)的例子可包括N-(2-氨乙基)哌嗪、1,3-二氨基丙烷以及4-(氨乙基)哌啶,其保护基团的例子可包括叔丁氧羰基(Boc)、苄氧羰基(Cbz)以及苯邻二甲酰亚胺。另外,在化合物(VI)与(VII)的反应中以及在化合物(VIII)与(IX)的反应中使用的碱的例子是三乙胺和吡啶。适用于上述反应的溶剂的例子可包括二氯甲烷、氯仿(氯仿)、乙醚、甲苯及吡啶。
为了消去化合物(IX)中的伯氨基的保护基团,脱保护反应可按照本身为技术上已知的方式采用酸催化还原条件或在碱的存在下,在无溶剂或合适的溶剂中进行。可用的酸的例子可包括三氟化硼(BF3)、三氟乙酸及盐酸。用于催化还原的溶剂的例子可包括钯-碳、钯黑及铂黑。碱的例子是肼、氢氧化钠及氢氧化钾。溶剂的例子可包括乙醚、二噁烷、甲醇、乙醇、水、乙腈及乙酸。
而对在化合物(X)中已根据需要消去保护基团的伯氨基进行的马来酰亚胺化反应(maleimidation),可通过在马来酐及碱的存在下以及在溶剂中加热的条件下将该化合物加热,以马来酐与该伯氨基反应来实现。适用的碱的例子可包括乙酸钠和碳酸钾。溶剂的例子可包括乙酸及丙酸。
另一方面,在说到方法(ii)时提到的含端氨基并具有硫醚或聚醚结构的苯酚衍生物中,该具有硫醚的苯酚衍生物的例子可包括4-(2-氨乙硫代)苯酚及4-(3-氨丙硫代)苯酚,而具有聚醚结构的苯酚衍生物的例子可包括4-(3-(2-氨乙氧基)丙氧基)苯酚及4-(2-(2-氨乙氧基)乙氧基)苯酚。作为上述氨基的保护基团的范例,可举出Boc、Cbz、苯邻二甲酰亚胺等基团。另外,可用的碱的例子可包括三乙胺及吡啶,而溶剂的范例是二氯甲烷、乙醚、甲苯及吡啶。
伯氨基的脱保护及马来酰亚胺化反应可按照类似于上面关于方法(i)中所述方法进行。
下面,将讲述用本发明的化合物(I)与氨基酸或蛋白质中的巯基进行反应来标记该物质的方法。
例如,要用本发明的化合物(I)来标记抗体,首先用胃蛋白酶消化该抗体,得到F(ab’)2,然后在温和的还原条件下将其还原,制备成Fab’。然后,本发明化合物(I)中的马来酰亚胺基团与溶液中的Fab’的巯基发生反应,从而完成了标记。
Fab’与本发明化合物(I)之间的反应进行的条件为:Fab’与本发明化合物(I)按1∶1~1∶10的摩尔比进行反应,在pH5~7的,优选地在pH6~6.5的、1~37℃,优选地4~10℃的温度的含水溶液中,反应时间为10分钟~72小时,优选地约48小时,同时使用大约1~5毫摩尔的EDTA保护巯基免遭反应溶液中的溶解氧的氧化。
采用本发明化合物(I)的标记反应通常是在pH等于或低于7的含水介质中进行的。如果分析物微溶或不溶于水,则标记反应可按照下述的方式进行。即,向分析物在少量能与水充分混溶的惰性溶剂(以下称“惰性溶剂”)中的溶液内加入水,从而制备成分析物的含水溶液。在该溶液中,混入化合物(I)的含水溶液以便使马来酰亚胺与巯基间的反应在pH值等于或小于7之下进行。该反应是由于分析物对本发明化合物(I)中的马来酰亚胺基团的不饱和键发生亲核加成而进行的。即使在分析物中除了巯基外还含有氨基,但氨基的亲核性受到了抑制,因而不会生成与氨基的反应产物,因为该反应是在pH等于或小于7之下进行的。正因为如此,本发明的化合物可当作一种对巯基有选择性的试剂。
标记反应中使用的惰性溶剂,例如是N,N-二甲基乙酰胺、二甲亚砜、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、1,4-二噁烷以及吡啶。
标记之后,被标记的分析物可借助例如凝胶色谱法、离子交换色谱法、亲合色谱法或高性能液体色谱法等分离方法分离出来。就是说,采用上述方法,在恒定摩尔比的条件下进行标记是可行的。
即使当分析物不含巯基时,本发明的标记方法仍然适用,此时可在温和的条件下利用S-乙酰基巯基琥珀酐或类似的试剂将巯基引入到分析物的羟基、氨基和/或类似基团上既可。在这种情况下,引入巯基的数量应使得能够对分析物与巯基之间的比例作出估计。因此,适用于本发明的标记方法的分析物可以是任何物质,只要该物质含有巯基或者可以引入巯基既可。即使如氨基酸这样的低分子物质也可以采用本发明的化合物(I)以类似于上述的方式在温和的条件下进行标记。
象上面那样获得的被标记物质能够在已知的吖啶鎓酯发光的条件下,例如通过在碱性条件下加入过氧化氢等,而被导致发光。利用化学发光检测剂探测到所发出的这种光,就可判定该物质的存在。而且,根据化学发光的数量,可测出被标记物质的数量。因此本发明的标记方法可应用于药物在活体内分布的示踪,以及用于诸如诊断之类的各种要求痕量检测的领域中的定性分析及定量分析。
下面,讲述有关利用本发明的化合物(I)的标记方法的具体应用实例。
作为本发明标记方法的一个应用,例如有一种测定样品中某种分析物的方法,该方法包括:利用分析物与一种已被结合在载体上的某物质之间的结合反应从而专一地与分析物结合在一起将分析物捕获,正如所谓化学发光免疫检验夹心(immunoassay sandwich)方法中那样;继而使得一种也能专一地与该分析物结合并且以本发明的化合物(I)做过标记的物质与上面被捕获的分析物相结合;然后测定其发光强度。
还有一种测定样品中分析物的方法,正如在所谓化学发光竞争免疫检验中所使用的那样,包括:用本发明的化合物(I)来标记分析物;预先加入规定浓度的该被标记分析物;然后在利用一种反应,即样品中分析物及被标记分析物同时与一种同这两种分析物都能专一结合的物质竞相结合的反应的情况下测定发自被标记分析物的发光强度。
在这些情况下,有专一结合能力的物质的组合的例子可包括:抗原与抗体、核酸与其互补的顺序、效应物(分子)与受体分子、酶与抑制剂、抗生物素蛋白与生物素,以及含糖链的物质与其对应的外源凝集素。
作为另一种应用,例如在所谓柱后(post-column)高性能液相色谱法中的分析物测定方法中的应用,包括:采用本发明化合物(I)来标记分析物;用上述的例如色谱法等分离方法分离出被标记分析物;然后利用化学发光检测器测定该分析物。
在上述诸标记方法中,本发明的化合物(I)能克服传统上已知的吖啶鎓酯的种种缺点,这些缺点是:例如被标记分析物不溶化的问题、氨基所潜在的失活,甚至对分析物在生物活性方面的要求,恒定结合摩尔比之下结合困难、难以在结合反应中确立可重复性以及在结合反应条件下就过早发光及分解。
作为本发明进一步的应用实例,可提及下述方法。即,同时也用于本发明化合物(I)的合成的中间体(II),预先与一种含巯基的分析物进行反应(以下称“预标记”)。然后让一种适当的N-烷基化试剂反应,继而在碱性条件下,令足够量的化学发光剂,例如过氧化氢,发生作用。用化学发光检测器检测造成的化学发光以测定该分析物。
在式(II)代表的吖啶酯中,马来酰亚胺端基具有对巯基的结合活性。而且,它可作为稳定的化合物分离出来。因此,可使之预先结合到含巯基的物质上。
上述的用中间体(II)对分析物进行预标记反应中的结合方法、预标记分析物的分离方法等等,可按照与使用化合物(I)基本上相同的方式来进行。
上述的预标记分析物可通过它与烷基化试剂(III)在适当溶剂中的反应,进一步转化为吖啶鎓酯标记的分析物。烷基化试剂(III)的可用例子包括卤代烷,例如碘甲烷、碘乙烷及溴乙烷、三氟甲烷磺酸甲酯、氟代磺酸甲酯、甲烷磺酸甲酯以及对甲苯磺酸甲酯,正如上面也提到的。而,可用溶剂的例子除上述标记反应中所使用的溶剂之外还有四氢呋喃及乙腈。
当反应后吖啶鎓酯标记的分析物以晶体形式从所使用的溶剂中沉淀出来时,可用过滤将其分离出来。当它不沉淀时,可用柱色谱将其分离出来。
以中间体(II)进行预标记反应之后,反应产物用烷基化试剂(III)进一步进行N-烷基化处理。如此标记的分析物产生的化学发光及其应用等等与有关化合物(I)所述内容相近。
顺便指出,采用中间体(II)的标记方法,考虑到在结合反应之后要用烷基化试剂(III)进行标记,故不适用于那些除了巯基之外还含有其他对烷基化试剂具有活性的基团的分析物。在这种情况下,需要采取诸如用保护基团等措施将这些活性基团保护起来。
下面,将结合以下的实施例更具体地说明本发明。但是,应当记住,本发明既不限于,也不受这些实施例的限制。
实例1
4-(2-甲苯磺酰氧乙基)苯酚(1)的合成
4-羟苯乙醇(3.2克)溶于50毫升吡啶中,在冰的冷却下向其中徐徐加入4.0克甲苯磺酰氯。让反应混合物的温度升至室温,然后在此温度下搅拌2小时。接着,滤除不溶物并在减压下蒸出吡啶。借助硅胶柱上的色谱法(洗脱液:氯仿)分离并提纯残余物,于是获得3.4克化合物(1)(收率:59%)。
实例2
9-吖啶羧酸氯化物的合成(2)
亚硫酰氯(20毫升)加入到2.2克9-吖啶羧酸中,随后在回流下加热5小时。在减压下蒸除亚硫酰氯之后,再加入20毫升二氯甲烷。在减压下反复蒸馏两次,于是得到2.4克化合物(2)(收率:化学计算值)。
实例3
4-(2-甲苯磺酰氧乙基)苯基9-吖啶基羧化物(3)的合成
在30毫升吡啶中,溶入2.4克从实例2中得到的化合物(2)。在水冷却及搅拌下,徐徐加入2.9克从实例1得到的化合物(1)。室温下搅拌2小时后,减压下蒸除吡啶。再加入氯仿,然后在减压下反复蒸馏两次。借助硅胶柱上的色谱法(洗脱液:氯仿)分离并提纯残余物,于是获得2.7克化合物(3)(收率:54%)。
实例4
4-(2-(4-氨甲基哌啶-1-基)乙基)苯基9-吖啶羧化物(4)的合成
在30毫升DMF中,溶入2.9克从实例3得到的化合物(3),然后加入0.59克4-氨甲基吡啶。获得的混合物在室温下搅拌,在冰冷却下向其中加入0.60克叔丁醇(t-Buok)。得到的混合物在室温下搅拌5小时。减压下蒸除DMF,将残余物溶解在氯仿中。用水洗涤如此得到的溶液,然后在无水硫酸镁上空干燥。减压下蒸除溶剂。借助硅胶柱上的色谱法(洗脱液:氯仿/甲醇=7/3)分离并提纯残余物,于是获得0.41克化合物(4)(收率:18%)。
实例5
4-(2-(4-((马来酰亚胺-1-基)甲基)哌啶-1-基)乙基)苯基9-吖啶羧化物(5)的合成
在20毫升乙酸中,加入0.41克从实例4得到的化合物(4)、0.30克马来酐及0.30克乙酸钠,接着在回流下加热3小时。然后,在减压下蒸除乙酸。向残余物中加入水,再用氯仿萃取。萃取液置于硫酸镁上空干燥,在减压下蒸除氯仿。借助硅胶柱上的色谱法(洗脱液:氯仿)分离并提纯残余物,于是获得0.22克化合物(5)(收率:43%)。该物质的分析数据如下:
NMR(核磁共振)(CDCl3)δ:
8.3(m,4H),8.0-7.6(m,4H),7.3(s-状,4H),
6.7(s,2H),3.4(d,J=7,2H),3.1-2.5(m,6H),
2.2-1.5(m,7H)。
MASS(质谱)(FAB):520(M+1)。
实例6
4-(2-(4-(马来酰亚胺-1-基)甲基-1-甲基-哌啶鎓(piperidinium)-1-基)乙基)苯基10-甲基吖啶鎓-9-羧化物(6)的合成
在20毫升甲苯中,溶入0.22克从实例5得到的化合物(5),在室温及搅拌下向其中加入0.30克三氟甲烷磺酸甲酯。得到的混合物在室温下搅拌1小时后,放置过夜。过滤后得到的红色沉淀物用甲苯洗涤并在空气中干燥,于是得到30毫克化合物(6)(收率:9.2%)。该物质的分析数据如下:
NMR(核磁共振)(DMSO(二甲基亚砜)-d6)δ:
8.8-8.0(m,8H),7.5(s-状,4H),6.8(s,2H),
5.1(s,3H),3.3(s,3H),3.7-3.0(m,10H),
2.0-1.6(m,5H)。
MASS(质谱)(FAB):550(M+1)。
实例7
4-(2-氨乙基硫基)苯酚(7)的合成
在30毫升乙醇中,加入1.2克4-巯基苯酚、2.1克2-溴乙胺盐酸化物及1.4克碳酸钾,接着在室温下搅拌3小时。加水,得到的混合物用乙醚萃取。萃取液在硫酸镁上空干燥,然后在减压下蒸除乙醚,于是得到1.7克混合物(7)(收率:化学计算值)。
实例8
4-(2-N-Boc-氨乙基硫基)苯酚(8)的合成
在30毫升乙腈中,溶入1.7克从实例7得到的化合物(7)。加入无水Boc(2.4克),继而搅拌1小时。减压下蒸除溶剂后,加入吡啶。然后,在减压下蒸除吡啶,于是得到2.7克化合物(8)(收率:化学计算值)。
实例9
4-(2-N-Boc-氨乙基硫基)苯基9-吖啶羧化物(9)的合成
在30毫升吡啶中,溶入2.4克从实例2得到的化合物(2),在水冷却及搅拌下向其中徐徐加入2.7克从实例8得到的化合物(8)。得到的混合物在室温下搅拌2小时后,减压下蒸除吡啶。再加氯仿,并在减压下蒸馏两次。借助硅胶柱上的色谱法(洗脱液:氯仿)分离并提纯残余物,于是获得3.2克化合物(9)(收率:68%)。
实例10
4-(2-氨乙基硫基)苯基9-吖啶羧化物(9)的合成
向1.9克从实例9得到的化合物(9)中加入20毫升三氟乙酸,继而在室温下搅拌30分钟。减压下蒸除三氟乙酸,于是得到1.4克化合物(10)(收率:化学计算值)。
实例11
4-(2-(马来酰亚胺-1-基)乙基硫基)苯基9-吖啶羧化物(11)的合成
在20毫升乙酸中,加入1.4克从实例10得到的化合物(10)、1.0克马来酐及1.0克乙酸钠,然后在回流下加热3小时。减压下蒸除乙酸。残余物中加水。用氯仿萃取得到的混合物。萃取液在硫酸镁上空干燥,并在减压下蒸除氯仿。借助硅胶柱上的色谱法(洗脱液:氯仿)提纯残余物,于是获得1.1克化合物(11)(收率:63%)。该物质的分析数据如下:
NMR(核磁共振)(CDCl3)δ:
8.3(m,4H),8.0-7.6(m,4H),7.3(s-状,4H),
6.7(s,2H),3.8(t,J=7,2Hz),3.2(t,J=7,2Hz)。
MASS(质谱)(FAB):455(M+1)。
实例12
4-((2-(马来酰亚胺-1-基)乙基)甲基锍)苯基10-甲基吖啶鎓-9-羧化物(12)的合成
在20毫升甲苯中,溶入0.90克从实例11得到的化合物(11)。在室温下搅拌的情况下,加入1.0克三氟甲烷磺酸甲酯,接着在室温下搅拌1小时。随后让反应混合物静置过夜。过滤后收集红色沉淀物,用甲苯洗涤并在空气中干燥,于是得到1.1克化合物(12)(收率:71%)。该物质的分析数据如下:
NMR(核磁共振)(DMSO(二甲基亚砜)-d6)δ:
9.0-8.0(m,8H),7.6(d,J=7,2H),7.4(d,J=7,2H),
6.7(s,2H),5.1(s,3H),3.8(t,J=7,2H),3.7(s,3H),
3.2(t,J=7,2H)。
MASS(质谱)(FAB):467(M+1)。
实例13
2-(2-N-Boc-氨乙氧基)乙醇(13)的合成
在30毫升乙腈中,溶入2.1克2-氨乙氧基乙醇.加入无水Boc(4.8克),接着搅拌1小时。减压下蒸除溶剂后,加入吡啶。继而在减压下蒸除吡啶,于是得到3.7克化合物(13)(收率:化学计算值)。
实例14
2-(2-甲苯磺酰基氧乙氧基)-N-Boc-乙胺(14)的合成
在50毫升吡啶中,溶入3.7克从实例13得到的化合物(13),在冰冷却及搅拌下向其中徐徐加入4.0克甲苯磺酰氯。让得到的混合物温度升至室温,在此温度下混合物搅拌2小时。滤除不溶物,并在减压下蒸除吡啶。借助硅胶柱上的色谱法(洗脱液:氯仿)分离并提纯残余物,于是获得5.5克化合物(14)(收率:76%)。
实例15
4-(2-(2-N-Boc-氨乙氧基)乙氧基)苯基苄基醚(15)的合成
在30毫升DMF中,溶入2.0克对苄基氧苯酚,向其中加入1.2克叔丁醇钾。得到的混合物在室温下搅拌30分钟后,加入3.9克从实例14得到的化合物(14)。如此得到的混合物在室温下搅拌3小时。减压下蒸除DMF之后,将残余物溶解在乙醚中。得到的溶液用稀盐酸洗涤一遍、水洗涤两遍,然后再用氯化钠饱和水溶液洗涤一遍。该溶液在硫酸镁上空干燥之后,在减压下蒸除乙醚。借助硅胶柱上的色谱法(洗脱液:氯仿)提纯残余物,于是获得3.2克化合物(15)(收率:83%)。
实例16
4-(2-(2-N-Boc-氨乙氧基)乙基氧)苯酚(16)的合成
在40毫升乙酸中,溶入3.0克从实例15得到的化合物(15),向其中加入2.0克钯黑。随后,得到的混合物在氢气氛及室温下搅拌2小时。滤除钯,在减压下蒸除滤液。借助硅胶柱上的色谱法(洗脱液:氯仿/甲醇=9/1)分离并提纯残余物,于是获得2.4克化合物(16)(收率:化学计算值)。
实例17
4-(2-(2-N-Boc-氨乙氧基)乙氧基)苯基9-吖啶羧化物(17)的合成
在30毫升吡啶中,溶入2.4克从实例2得到的化合物(2)。在水冷却及搅拌下,徐徐加入从实例16得到的化合物(16)。如此得到的混合物在室温下搅拌2小时后,减压下蒸除吡啶。再加氯仿,并在减压下进行两次蒸馏。借助硅胶柱上的色谱法(洗脱液:氯仿)分离并提纯残余物,于是获得2.1克化合物(17)(收率:47%)。
实例18
4-(2-(2-氨乙氧基)乙氧基)苯基9-吖啶羧化物(18)的合成
在2.1克从实例17得到的化合物(17)中加入三氟乙酸(20毫升),接着在室温下搅拌30分钟。减压下蒸除三氟乙酸,然后加水。得到的混合物用碳酸氢钠中和,然后借过滤收集沉淀物。借助硅胶柱上的色谱法(洗脱液:氯仿/甲醇=9/1)分离并提纯滤液,于是获得1.7克化合物(18)(收率:化学计算值)。
实例19
4-(2-(2-(马来酰亚胺-1-基)乙氧基)乙氧基)苯基9-吖啶羧化物(19)的合成
在40毫升乙酸中,加入1.7克从实例18得到的化合物(18)、1.2克马来酐及1.2克乙酸钠,继而在回流下加热3小时。反应混合物冷却后,在减压下蒸除乙酸。向残余物中加水,得到的混合物用氯仿萃取。萃取液置于硫酸镁上空干燥,然后在减压下蒸除氯仿。借助硅胶柱上的色谱法(洗脱液:氯仿)提纯残余物,于是获得0.81克化合物(19)(收率:42%)。该物质的分析数据如下:
NMR(核磁共振)(CDCl3)δ:
8.3(m,8H),7.4-7.0(m,4H),6.8(s,2H),4.2(m,2H),
3.9(m,2H),3.8(s-状,4H)。
MASS(质谱)(FAB):483(M+1)。
实例20
4-(2-(2-(马来酰亚胺-1-基)乙氧基)乙氧基)苯基10-甲基吖啶鎓-9-羧化物(20)的合成
在50毫升甲苯中,溶入0.81克从实例19得到的化合物(19),在室温及搅拌下向其中加入0.60克三氟甲烷磺酸甲酯。得到的混合物在室温下搅拌1小时,然后静置过夜。借过滤收集到黄色沉淀物,用甲苯洗涤,然后在空气中干燥,于是得到0.39克化合物(22)(收率:37%)。该物质的分析数据如下:
NMR(核磁共振)(DMSO(二甲基亚砜)-d6)δ:
9.0-8.0(m,8H),7.4(d,J=7,2H),7.1(d,J=7,2H),
6.8(s,2H),5.1(s,3H),4.2(m,2H),3.9(m,2H),
3.8(s-状,4H).
MASS(质谱)(FAB):497(M+1)。
实例21
4-(2-(马来酰亚胺-1-基)乙基)苯基9-吖啶羧化物(22)的合成
在20毫升乙酸中,加入0.71克4-(2-氨乙基)苯基9-吖啶羧化物(21)、0.60克马来酐及0.60克乙酸钠,接着在回流下加热3小时。反应混合物冷却后,在减压下蒸除乙酸。向残余物中加水,然后得到的混合物用氯仿萃取。萃取液在无水硫酸镁上空干燥,然后在减压下蒸除氯仿。借助硅胶柱上的色谱法(洗脱液:氯仿)提纯残余物,于是获得0.14克化合物(22)(收率:95%)。该物质的分析数据如下:
NMR(核磁共振)(CD3OD)δ:
8.2-7.6(m,8H),7.4(s,4H),6.8(s,2H),
3.8(t,J=8,2H),3.0(t,J=8,2H)。
MASS(质谱)(FAB):423(M+1)。
实例22
4-(2-(马来酰亚胺-1-基)乙基)苯基10-甲基吖啶鎓-9-羧化物(23)的合成
在20毫升甲苯中,溶入0.17克上述的马来酰亚胺(22)。在室温及搅拌下向该溶液中加入0.10克三氟甲烷磺酸甲酯。得到的混合物在室温下搅拌1小时后静置过夜。然后,过滤收集析出的黄色沉淀物,再用甲苯洗涤。沉淀物在空气中干燥,于是得到0.12克化合物(23)(收率:51%)。该物质的分析数据如下:
NMR(核磁共振)(CD3OD)δ:
8.9-8.0(m,8H),7.4(s,4H),6.8(s,2H),5.1(s,2H),
3.8(t,J=8,2H),3.0(t,J=8,2H)。
MASS(质谱)(FAB):437(M+)。
实例23
抗人体血红蛋白抗体的标记
(1)向3毫升含有0.1摩尔氯化钠的0.1摩尔乙酸钠缓冲溶液(pH4.5)中加入10毫克提纯的抗人体血红蛋白兔多克隆抗体。向该溶液中加入并溶解0.4克由猪胃液转化而来的提纯胃蛋白酶粉末。溶液在37℃下恒温48小时,于是,兔IgG的Fc部分便被消化了。通过采用0.1摩尔含有5毫摩尔EDTA、作为洗脱液的磷酸钠缓冲溶液(pH6;以下称“pH6缓冲液”)以及“Superdex 200 Column(分离色谱柱)”(Pharmacia公司产品)进行凝胶过滤,消化混合物被分级,于是就得到含5毫克F(ab’)2在3毫升pH6缓冲液中的溶液。
向溶液中加入2-巯基乙胺(24毫克),得到的混合物在37℃下恒温24小时,F(ab’)2便还原为Fab’。通过“Sephadex G25 Column(分离色谱柱)”(Pharmacia公司产品;洗脱液:pH6缓冲液)进行凝胶过滤,于是就得到含2毫克Fab’在3毫升pH6缓冲液中的溶液。
使用一部分该溶液,通过测定4-巯基吡啶的数量对巯基进行了定量,该物质是通过4,4’-二硫吡啶与Fab’的巯基之间的化学计量反应而获得的,定量是利用324纳米波长处的吸收作出的。结果,据发现每分子Fab’含有一个巯基。
(2)接着,将0.5毫升含有0.04毫克实例6中合成的化合物(6)的pH6缓冲液加入到0.75毫升含有0.5毫克Fab’的pH6缓冲液中。换句话说,将二者合在一起,使得Fab’与化合物(6)在二者的结合反应中的摩尔比为1∶5。得到的混合物在4℃下恒温48小时,于是Fab’便用化合物(6)标记好了。反应后,通过“Sephadex G25 Column”(Pharmacia公司产品;洗脱液:pH6缓冲液)将过量加入的化合物(6)分离掉,于是得到0.5毫克溶于3毫升pH6缓冲液的标记抗体(标记抗体A)。根据Fab’的E280摩尔吸收系数及化合物(6)的E260摩尔吸收系数对标记抗体进行了定量。据发现,在如此得到的标记抗体A中Fab’与化合物(6)按1∶1的摩尔比彼此结合在一起。
以类似的方式,将0.5毫升含有0.04毫克实例12中合成的化合物(12)的pH6缓冲液加入到0.75毫升含有0.5毫克Fab’的pH6缓冲液中,反应后,进行了凝胶过滤,于是得到0.5毫克溶于3毫升pH6缓冲液的标记抗体(标记抗体B)。
同样地,将0.5毫升含有0.03毫克实例20中合成的化合物(20)的pH6缓冲液加入到0.75毫升含有0.5毫克Fab’的pH6缓冲液中,反应后,进行了凝胶过滤,于是得到0.5毫克溶于3毫升pH6缓冲液的标记抗体(标记抗体C)。
又是象上面一样,将0.5毫升含有0.04毫克实例23中合成的化合物(23)的pH6缓冲液加入到0.75毫升含有0.5毫克Fab’的pH6缓冲液中,反应后,进行了凝胶过滤,于是得到0.5毫克溶于3毫升pH6缓冲液的标记抗体(标记抗体D)。
据发现,在如此得到的标记抗体B、标记抗体C及标记抗体D中,Fab’与化合物(12)、Fab’与化合物(20)及Fab’与化合物(23)都是按1∶1的摩尔比彼此结合在一起的。
实例24
用标记抗体对人体血红蛋白的检验
制备了含0.15摩尔氯化钠的、每0.1毫升pH7的0.05M磷酸盐缓冲液(以下简称“PBS”)含5微克提纯抗人体血红蛋白小鼠单克隆抗体的溶液。将该溶液按每次0.1毫升的量逐一转移到微滴板的一个个孔中。溶液在4℃下放置24小时,于是该单克隆抗体就以固相形式被吸收到孔内表面上。
该固相抗体板接受以0.1毫升含有1毫克牛血清清蛋白的PBS的阻断(blocking)处理。另外,提纯的人体血红蛋白溶解在PBS中,分别得到每毫升溶液含0、0.2、1、5、25及125微克/毫升浓度的溶液。取0.1毫升等量的上述溶液的等分试样分别倒入微滴板的一个个孔中。溶液在4℃下放置24小时,于是样品中的人体血红蛋白就被固相抗体俘获。
用PBS洗涤每一个孔以去除未结合的人体血红蛋白之后,向每一个孔中倾入0.1毫升含有5微克在实例23中制备的标记抗体A的PBS。让PBS溶液在4℃下放置24小时,以便让反应进行。用PBS洗涤每一个孔,在去除未结合的标记抗体A之后,加入0.05毫升0.1 N氢氧化钠及0.04毫升0.5%过氧化氢,使之发光。用“Luminus CT-9000D”(Dia-Iatron公司制造)测定发光,这是一种用于测定化学发光的微滴板读取器。发光的数量按2秒钟间隔内的积分值衡量。
以同样的方式用标记抗体B、标记抗体C及标记抗体D分别进行了人体血红蛋白的检验。上述检验的结果一并载于下面的表1中。
表1
血红蛋白浓度(微克/毫升) | 化学发光量(计数器读数(counts)) | |||
标记抗体A | 标记抗体B | 标记抗体C | 标记抗体D | |
0 | 3852 | 3089 | 1655 | 2037 |
0.2 | 39410 | 33301 | 18389 | 19527 |
1 | 99784 | 88131 | 49136 | 52410 |
5 | 255691 | 229749 | 144856 | 149397 |
25 | 727500 | 707136 | 501892 | 443599 |
125 | 2511377 | 2281501 | 1736876 | 1354858 |
从表1明显可见,标记抗体A、标记抗体B、标记抗体C及标记抗体D所产生的发光量都随着人体血红蛋白的浓度提高而增加,因此,这些标记抗体可用于人体血红蛋白的定量。
工业拓展前景
本发明的化合物(I)及(II)对分析物的标记依靠的都是巯基与马来酰亚胺基团之间的稳定结合并且是在温和条件下进行的。由于标记是在这样的温和条件下进行的,标记抗体等的抗原识别部位等不会受到损害,而且,吖啶酯既不会因发光而消耗,也不会因分解而失活。
此外,本发明的标记方法依靠在氨基酸或蛋白质中的含量颇少的巯基。这就使得有可能对分析物进行特定的标记,它带来的突出优点就是:可以做到在分析物与化学发光物质之间以恒定的结合摩尔比进行结合。
当本发明的标记方法应用于,例如抗体Fab’时,以本发明的化合物(I)(或中间体(II))对整个Fab’进行标记,即使加入的该化合物有些过量,仍旧得到按1∶1摩尔比的标记结果,因为Fab’只含有一个巯基。况且,参与结合反应的巯基与Fab’的生物活性部位无关,故而Fab’抗原识别部位不会受到损害。
因此,分析物的定性或定量分析根据化学发光的数量就能很容易做到。本发明的标记方法尤其适用于药物在活体内分布的示踪以及各种诊断领域,这些领域都要求对痕量物质进行检测。
Claims (11)
3.一种制备下式(Ia)所代表的吖啶化合物的方法:
其中X-代表阴离子,R代表含有1~6个碳原子的烷基或芳基,m1代表1~6的整数,它包括使下式(III)代表的烷基化试剂:
R-X (III)
其中R的含义同上面的规定,X代表易于转化为阴离子的消去基团,作用于下式(IIa)代表的吖啶化合物:
其中m1的含义同上面的规定。
7.一种制备下式(Ib)所代表的吖啶化合物的方法:
其中
Q代表基团-S+RX--、基团-N+RR1-,其中R1代表含有1~6个碳原子的烷基或芳基、基团
其中R2及R3可以相同或不同并且每一个独立地是基团-(CH2)k-(k:1~3的数)或者是-O(CH2CH2O)l-(l:1~3的数);
R代表含有1~6个碳原子的烷基或芳基;
X代表易转换成阴离子的消去基团;
m2表示0~2的数;以及
n表示1~2的数,它包括使下式(III)代表的烷基化试剂:
R-X (III)
其中
Q’代表基团-S-、基团-NR1-,其中R1代表含有1~6个碳原子的烷基或基团
其中R2及R3可以相同或不同并且每一个独立地是基团-(CH2)k-(k:1~3的数)或者是-O(CH2CH2O)l-(l:1~3的数);
m2及n的含义同上面的规定。
8.一种制备下式(IIb’)所代表的吖啶化合物的方法:
其中
Q1代基团-NR1-,其中R1代表含有1~6个碳原子的烷基或基团
其中R2及R3可以相同或不同并且每一个独立地是基团-(CH2)k-(k:1~3的数);
m2代表0~2的数;以及
n代表1~2的数,
其中Y1代表消去基团,m2的含义同上面的规定,与9-吖啶羧酸衍生物发生反应,该羧酸衍生物可用下式(VII)代表:
其中Y2代表消去基团,结果获得用下式(VIII)代表的化合物:
其中Y1及m2的含义同上面的规定;然后让如此得到的化合物与下式(IX)代表的多胺在适当的碱存在下进行反应:
H-Q1-(CH2)n-N(Ra)2 (IX)
其中Q1及n的含义同上面的规定,Ra中每一个独立地是氢原子或氨基保护基团,而且化合物式(IX)的一端含有伯氨基,所述伯氨基任选的由一个或两个保护基团保护着,伯氨基或仲氨基在其相反端,结果获得由下式(X)代表的9-吖啶酯:
其中Q1、Ra、m2及n的含义同上面的规定;然后,当一个或两个端伯氨基的保护基团存在时,消去该一个或两个保护基团;最后,使马来酐作用与之发生反应。
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CN97190552A CN1194642A (zh) | 1996-03-15 | 1997-03-14 | 用于标记巯基的试剂、其制备以及用其进行标记的方法 |
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-
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- 1997-03-14 CN CN97190552A patent/CN1194642A/zh active Pending
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