CN113113079A - 一种识别定量免疫层析试验中钩状效应的方法 - Google Patents

一种识别定量免疫层析试验中钩状效应的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种识别定量免疫层析试验中钩状效应的方法，包括以下步骤：使用定量免疫分析仪对样本检测并制作反应时间曲线或反应起始点和反应平衡点差值；根据曲线特点判断是否为钩状效应，即当反应时间曲线为由低逐渐增大达到平衡，则未出现钩状效应；当反应时间曲线为由大逐渐减小达到平衡，则判为存在钩状效应；根据反应起始点和反应平衡点差值判断是否为钩状效应，即当反应起始点和反应平衡点差值为负数，则未出现钩状效应；当反应起始点和反应平衡点差值为正数，则判为存在钩状效应。本发明可以快速判断定量免疫层析试验中是否出现HOOK效应，及时更正检测结果。

Description

一种识别定量免疫层析试验中钩状效应的方法
技术领域
本发明涉及钩状效应识别方法，具体涉及一种识别定量免疫层析试验中钩状效应的方法。
背景技术
免疫层析技术是基于抗原抗体特异性免疫反应的膜检测技术。其中定量免疫层析是根据发光材料发光强度与待分析浓度呈比例关系进行定量分析，以固定有检测线(T线包被抗体)和质控线(C线包被抗抗体)的条状纤维层析材料为固定相，测试液为流动相，荧光微球、彩色微球或胶体金等发光材料标记抗体固定于结合垫，通过毛细管作用使待分析物在层析条上移动。测试液中的待分析物在层析过程中先与发光材料标记的待分析物抗体结合，然后继续往上层析，随后结合物会被包被在T线上的待分析物抗体结合，在T线位置会形成固相待分析物抗体-待分析物-标记待分析物抗体-发光材料复合物；多余未结合的发光材料标记的待分析物抗体，继续往上层析，被C线上的抗抗体结合，则在C线则形成固相抗抗体-标记待分析物抗体-发光材料复合物。用相应的定量免疫分析仪检测T线和C 线发光材料的发光强度，根据T线光信号和C线光信号的比值(T/C)与测试液中的待分析物浓度关系曲线，可对测试液中的待分析物进行定量分析。
正常的，随着待分析物浓度增大，T线发光强度越大，C线则发光强度越小，T/C越大。但是实际过程中，当待分析物浓度很高时，T/C反而更小，该现象即为钩状效应(HOOK 效应)。
结合定量免疫层析技术原理，出现HOOK效应的原因是当测试液中待分析物浓度很大时，一部分待分析物与结合垫上的经标记待分析物抗体结合，而大部分处于游离状态，然后一起向反应膜T线层析，由于游离状态的待分析物分子小，层析速度快，故能先与T线待分析物抗体反应，占据T线位置，这样含发光物质的待分析物与T线反应减少，与C线抗抗体反应增加，因此T/C反而变小，即发生钩状效应。
现有的HOOK效应鉴定方法如下：通过检测设备的传感器来鉴定HOOK效应；通过检测设备的内置标准曲线来鉴定HOOK效应；通过在样品和标记抗体中加入检测微球形成检测复合物来鉴定HOOK效应；通过在样品中加入探针来检测HOOK效应；通过在免疫层析检测卡的检测T线和质控C线之间设置一条检测H线来排出HOOK效应。
由上可知，目前已有方法有通过检验仪器、样本处理、试纸条工艺优化，虽然能鉴定 HOOK效应，但是都比较复杂且成本较高，而且反应不是那么直观，虽能鉴定HOOK效应后提示对样本进行稀释检测，但均未给出浓度范围指导如何进行稀释，该方法不仅能鉴定HOOK效应，还能给出浓度范围，进而指导稀释，保证快速得到浓度值。
发明内容
本发明的目的在于提供一种识别定量免疫层析试验中钩状效应的方法，其可以快速判断定量免疫层析试验中是否出现HOOK效应，及时更正检测结果。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种识别定量免疫层析试验中钩状效应的方法，包括以下步骤：
(1)使用定量免疫分析仪对样本检测并制作反应时间曲线或反应起始点和反应平衡点差值；
(2)根据曲线特点判断是否为钩状效应，即当反应时间曲线为由低逐渐增大达到平衡，则未出现钩状效应；当反应时间曲线为由大逐渐减小达到平衡，则判为存在钩状效应，提示需要适当稀释样本后再测，并根据曲线变化幅度判断样本浓度范围，幅度越大，浓度越小进而指导稀释倍数，最后结果乘以稀释倍数即得；
(3)根据反应起始点和反应平衡点差值判断是否为钩状效应，即当反应起始点和反应平衡点差值为负数，则未出现钩状效应；当反应起始点和反应平衡点差值为正数，则判为存在钩状效应，提示需要适当稀释样本后再测，根据正数值大小判断样本浓度范围，差值越大，浓度越小进而指导稀释倍数，最后结果乘以稀释倍数即得。
优选地，所述步骤(1)中，反应时间曲线制作方法如下，样本滴加后，每隔一定时间，用仪器检测记录T/C值，直到反应达到平衡，根据反应时间与对应T/C值制作反应时间曲线，以反应时间为横坐标，检测T/C为纵坐标。
优选地，反应时间曲线特点查看方法如下，如果反应T/C随反应时间变大而增大，即反应时间曲线呈由低到高的向上曲线，即未出现钩状效应；如果反应T/C随反应时间变大为减小，即反应时间曲线呈由高到低的向下曲线，即出现钩状效应。
优选地，所述步骤(1)中，反应起始点和反应平衡点由如下方法得到，以滴加样本后某一时间定为反应起始点，并用仪器检测得到T/C，以反应达到平衡时为反应平衡点，并用仪器检测得到T/C。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1)采用本发明的检测方法可以快速判断定量免疫层析试验中是否出现HOOK效应，及时更正检测结果，对于出现HOOK效应的样本进行稀释，重新测定，结果乘以稀释倍数为最终检测结果，如判断不存在HOOK效应，直接报告检测结果无需再对样本稀释重测，可大大提高定量免疫层析检测效率和准确率；
2)通过反应时间曲线，能直观反映并判断是否出现钩状效应，同时也能反映层析反应过程，根据变化趋势大小，并指示浓度范围，便于准确快速找到合理稀释倍数，保证通过一次稀释就能将样本稀释到线性范围内，更省时结果更准确；
3)通过起始点和平衡点差值的正负情况，根据差值大小可以快速判断定量免疫层析试验中是否出现HOOK效应，并指示浓度范围，便于准确快速找到合理稀释倍数，保证通过一次稀释就能将样本稀释到线性范围内，更省时结果更准确；
4)现有技术判断钩状效应，样本进行稀释，但稀释倍数未指出，使得稀释工作变得更繁琐，有可能通过一次稀释，浓度依然为高浓度样本，依然为假阴性，也有可能通过一次稀释，样本浓度低于线性范围，而检测不出，依然为假阴性，进行再次进行多次稀释样本；本发明通过反应时间曲线或起始点和平衡点差值及大小不仅能判断HOOK效应，也能判断样本浓度范围，能通过一次稀释就能将样本稀释到线性范围，结果更准确；
5)本发明不需要对现有层析试纸条工艺、仪器结构、样本处理等进行任何改动，成本低易实现，直接对定量层析试纸条钩状效应识别，避免假阴性。
附图说明
图1为实施例1中血红蛋白定量免疫层析反应时间曲线；
图2为实施例1中选取5个实际样本的反应时间曲线；
图3为实施例2中转铁蛋白定量免疫层析反应时间曲线；
图4为实施例2中选取5个实际样本的反应时间曲线。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
便潜血是指消化道少量出血，红细胞被消化破坏，粪便外观无异常改变，肉眼和显微镜下均不能证实的出血。粪便潜血检查可作为检测各种原因所致的消化道出血及消化道恶性肿瘤早期筛查的重要检测试验，是发现便潜血的有效方法。
目前试剂盒线性范围均为50-800ng/mL，然而当消化道大量出血时，血红蛋白浓度极高，就会存在钩状效应，因此如何识别钩状效应非常有必要。
便潜血测定试剂盒制备：检测卡上的NC膜上反应区(T线)用血红蛋白抗体包被，质控区(C线)用羊抗鼠包被；检测卡上的结合垫涂有用发光材料标记的血红蛋白抗体。
反应时间曲线制作：取浓度为5mg/mL校准品等体积逐级稀释得到不同浓度质控品，用定量免疫分析仪每隔1.5分钟进行检测，检测结果如下表1，根据表1数据制作反应时间曲线如图1。
反应起始点和平衡点检测：以1.5分钟为反应起始点，以15分钟为反应平衡点，得到起始点和平衡点差值，如表2。
选取5个实际样本根据反应时间曲线变化趋势幅度及起始点和平衡点差值大小指导测试液稀释倍数，如图2和表3。
从上述数据可以看出，浓度由19.0735ng/mL增大到4882.8125ng/mL，反应时间曲线为由低逐渐增大达到平衡，反应起始点和反应平衡点差值为负数，说明未出现HOOK效应；而浓度由9765.625ng/mL增大到5000000ng/mL，反应时间曲线为由大逐渐减小达到平衡且曲线变化幅度越来越小，反应起始点和反应平衡点差值为正数且差值越来越小，说明存在HOOK效应；通过该方法对实际样本检测并判断与实际相符。
表1
Figure BDA0002951515180000051
表2
Figure BDA0002951515180000061
表3
Figure BDA0002951515180000062
实施例2
转铁蛋白是人体血浆中一种主要含铁蛋白质，在正常人的消化道中几乎不存在，只要在粪便或胃内容物中被检测到，即说明有消化道出血。因此测定粪便转铁蛋白浓度在消化道出血早期筛查中也具有重要的临床意义。
目前试剂盒线性范围均为5-1000ng/mL，然而当消化道大量出血时，转铁蛋白浓度极高，就会存在钩状效应，因此如何识别钩状效应非常有必要。
粪便转铁蛋白测定试剂盒制备：检测卡上的NC膜上反应区(T线)用转铁蛋白抗体包被，质控区(C线)用羊抗鼠包被；检测卡上的结合垫涂有用发光材料标记的转铁蛋白抗体。
反应时间曲线制作：取浓度为2mg/mL校准品等体积逐级稀释得到不同浓度质控品，用定量免疫分析仪每隔1.5分钟进行检测，检测结果如下表4，根据表4数据制作反应时间曲线如图3。
反应起始点和平衡点：以3分钟为反应起始点，以15分钟为反应平衡点，得到起始点和平衡点差值，如表5。
选取5个实际样本根据反应时间曲线变化趋势幅度及起始点和平衡点差值大小指导测试液稀释倍数，如图4和表6。
从上述数据可以看出，浓度由1.9073ng/mL增大到1953.125ng/mL，反应时间曲线为由低逐渐增大达到平衡，反应起始点和反应平衡点差值为负数，说明未出现HOOK效应；而浓度由3906.25ng/mL增大到2000000ng/mL，反应时间曲线为由大逐渐减小达到平衡且曲线变化幅度越来越小，反应起始点和反应平衡点差值为正数且差值越来越小，说明存在 HOOK效应；通过该方法对实际样本检测并判断与实际相符。
表4
Figure BDA0002951515180000071
表5
Figure DEST_PATH_IMAGE001
表6
Figure DEST_PATH_IMAGE002
以上内容仅仅是对本发明结构所作的举例和说明，所属本技术领域的技术人员对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，只要不偏离本发明的结构或者超越本权利要求书所定义的范围，均应属于本发明的保护范围。

Claims (4)

1.一种识别定量免疫层析试验中钩状效应的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)使用定量免疫分析仪对样本检测并制作反应时间曲线或反应起始点和反应平衡点差值；
(2)根据曲线特点判断是否为钩状效应，即当反应时间曲线为由低逐渐增大达到平衡，则未出现钩状效应；当反应时间曲线为由大逐渐减小达到平衡，则判为存在钩状效应，提示需要适当稀释样本后再测，并根据曲线变化幅度判断样本浓度范围，幅度越大，浓度越小进而指导稀释倍数，最后结果乘以稀释倍数即得；
(3)根据反应起始点和反应平衡点差值判断是否为钩状效应，即当反应起始点和反应平衡点差值为负数，则未出现钩状效应；当反应起始点和反应平衡点差值为正数，则判为存在钩状效应，提示需要适当稀释样本后再测，根据正数值大小判断样本浓度范围，差值越大，浓度越小进而指导稀释倍数，最后结果乘以稀释倍数即得。
2.根据权利要求1所述的一种识别定量免疫层析试验中钩状效应的方法，其特征在于：所述步骤(1)中，反应时间曲线制作方法如下，样本滴加后，每隔一定时间，用仪器检测记录T/C值，直到反应达到平衡，根据反应时间与对应T/C值制作反应时间曲线，以反应时间为横坐标，检测T/C为纵坐标。
3.根据权利要求2所述的一种识别定量免疫层析试验中钩状效应的方法，其特征在于：反应时间曲线特点查看方法如下，如果反应T/C随反应时间变大而增大，即反应时间曲线呈由低到高的向上曲线，即未出现钩状效应；如果反应T/C随反应时间变大为减小，即反应时间曲线呈由高到低的向下曲线，即出现钩状效应。
4.根据权利要求1所述的一种识别定量免疫层析试验中钩状效应的方法，其特征在于：所述步骤(1)中，反应起始点和反应平衡点由如下方法得到，以滴加样本后某一时间定为反应起始点，并用仪器检测得到T/C，以反应达到平衡时为反应平衡点，并用仪器检测得到T/C。
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