CN107422134A - 一种扩宽免疫胶体金检测范围的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种扩宽免疫胶体金检测范围的方法，所述方法分别在t_0.5和t时间时使用免疫层析判读记录仪测定胶体金测试条的反应线(T线)的信号值GOD_0.5和GOD值，t表示完全反应的时间，t_0.5表示完全反应时信号值一半的时间，当GOD/GOD_0.5>1.5时判定为未出现钩状效应，按直线回归方程对检测结果的信号值进行浓度值计算，当GOD/GOD_0.5<1.5时判定为出现钩状效应，按照logistic曲线拟合四参数法方程对检测结果的信号值进行浓度值的计算；该方法能判断检测样本是否存在钩状效应，又能直接对存在钩状效应的样本进行直接判读检测，无需浪费试剂，仅一次检测便可测定检测结果，快速容易，且准确性高。

Description

一种扩宽免疫胶体金检测范围的方法

技术领域

本发明涉及体外免疫检测技术领域，尤其是一种扩宽免疫胶体金检测范围的方法。

背景技术

胶体金是由氯金酸在还原剂如白磷、抗坏血酸、枸橼酸钠、鞣酸等作用下，聚合成为特定大小的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态，称为胶体金。胶体金在弱碱环境下带负电荷，可与蛋白质分子的正电荷基团形成牢固的结合，由于这种结合是静电结合，所以不影响蛋白质的生物特性。免疫胶体金技术是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体的一种新型的免疫标记技术。

在免疫胶体金定量试验中，检测范围受抗体(或抗原)性质和抗体(或抗原)使用量的影响。在免疫胶体金检测中高浓度样本会产生钩状效应，对试剂的检测范围都有局限性，不能满足临床样本对试剂的需要。钩状效应即HOOK效应,是指由于抗原抗体比例不合适而导致假阴性的现象，其中抗体过量叫做前带效应；抗原过量叫做后带效应。抗原抗体特异性反应时，生成结合物的量与反应物的浓度有关。例如，当标本中待测抗原浓度相当高时，过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合，而不再形成夹心复合物，所得结果将低于实际含量。钩状效应严重时甚至可出现假阴性结果。

消除免疫胶体金检测中钩状效应的方法有稀释法即同时检测稀释前和稀释后的待测样本，若稀释后的浓度值乘以相应稀释倍数所得的浓度值远远大于稀释前的浓度值，则该样本出现钩状效应，最终浓度值需要多次稀释后取其最大浓度值；反之稀释前的浓度值则为最终浓度值。专利CN105044332A能监测高浓度样本在免疫胶体金试验中是否存在HOOK效应，若不存在HOOK效应则直接显示结果，若出现HOOK效应则需要稀释高浓度样本后重新测试。

稀释法能消除免疫胶体金检测中钩状效应的方法，但其无法通过一次检测就判断出检测样本是否存在钩状效应，需要至少两次检测，操作复杂，检测次数增加，造成了检测试剂的极大浪费和增加了检测人员的操作误差，给检测结果的准确性带来了隐患，同时稀释后的样本其检测结果的准确性有待验证。专利CN105044332A虽然能通过一次检测就能判断出检测样本是否存在钩状效应，但出现钩状效应的样本，还是需要至少两次检测，操作复杂，检测次数增加，造成了检测试剂的极大浪费和增加了检测人员的操作误差，给检测结果的准确性带来了隐患，同时稀释后的样本其检测结果的准确性有待验证。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种扩宽免疫胶体金检测范围的方法，该方法可扩宽免疫胶体金检测范围，判断免疫胶体金检测中检测样本是否存在钩状效应，又能无需二次检测，直接对存在钩状效应的样本进行判读检测。

为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：

一种扩宽免疫胶体金检测范围的方法，分别在t_0.5和t时间时使用免疫层析判读记录仪测定胶体金测试条的反应线(T线)的信号值GOD_0.5和GOD值，t表示完全反应的时间，t_0.5表示完全反应时信号值一半的时间，当GOD/GOD_0.5>1.5时判定为未出现钩状效应，按直线回归方程对检测结果的信号值进行浓度值计算，当GOD/GOD_0.5<1.5时判定为出现钩状效应，按照logistic曲线拟合四参数法方程对检测结果的信号值进行浓度值的计算。

优选的，上述扩宽免疫胶体金检测范围的方法中使用的免疫层析判读记录仪为中新科炬生物制药股份有限公司生产的编号为NS3001和NS7001的免疫层析判读记录仪。

上述扩宽免疫胶体金检测范围的方法中所述时间t和t0.5是通过如下方法确定的：取一已知低浓度的阳性样本(未发生钩状效应的样本)，使用免疫层析判读记录仪连续监测该阳性样本的胶体金测试条的反应线的信号值随时间变化，待反应线信号值不再随时间的变化而变化时，即确定出完全反应的时间t，t0.5为完全反应时信号值一半的时间。

所述判定是否发生钩状效应的方法，使用免疫层析判读记录仪连续监测已知浓度的阳性样本的胶体金测试条的反应线的信号值随时间的变化发现未发生钩状效应的样本，反应线的信号值会随着时间的增加而缓慢增加，不会在短时间内达到峰值，故GOD/GOD0.5>1.5，而发生钩状效应的样本，反应线的信号值会随着时间的增加而迅速增加，会在短时间内达到峰值，故GOD/GOD0.5<1.5。

优选的，上述扩宽免疫胶体金检测范围的方法，免疫胶体金未发生钩状效应的区域和发生钩状效应的区域的标准曲线通过以下方法确定的：

(i)分别用不同浓度的标准品对试剂在t和t0.5时间内进行测定，不同浓度的标准品显示出不同强度色带，用免疫层析判读记录仪将相应强度的色带转化成信号值，所得出的信号值符合GOD/GOD0.5>1.5时，小于该浓度值的范围为未发生倒钩区域，所得出的信号值符合GOD/GOD0.5＜1.5时，大于该浓度值的范围为发生倒钩区域(未发生倒钩反应的最大浓度值为发生钩状效应区域的起始浓度)，判断出未发生倒钩区域和发生倒钩区域的浓度范围。

(ii)上述未发生钩状效应的区域的标准曲线是由下述方法确定的：

将已知浓度的且处于未发生倒钩的目标标准品分别进行检测时间为t的重复十次的检测，所得出的信号值的平均值即为该浓度所对应的信号值，以其为Y轴，以处于未发生倒钩的目标标准品的浓度为X轴，所得的直线回归曲线即为该区域的标准曲线。

(iii)上述发生钩状效应的区域的检测信号值的标准曲线是由下述方法确定的：

(a)将已知浓度的且处于发生倒钩的目标标准品分别进行检测时间为t的重复十次的检测，所得出的信号值的平均值即为该浓度所对应的信号值，以其为Y轴(包含未发生倒钩反应的最大浓度值所对应的信号平均值)，以目标标准品的浓度为X轴(包含未发生倒钩反应的最大浓度值，该浓度值为发生钩状效应区域的起始浓度)，用ELISA Cale回归/拟合计算程序软件的logistic曲线拟合(四参数)进行分析得到的曲线Y＝(A-D)/[1+(X/C)B]+D即为该区域的标准曲线。

(b)上述曲线方程Y＝(A-D)/[1+(X/C)B]+D中，A代表X趋于无穷大或者无穷小时Y的最大值，B代表斜率，C代表拐点浓度，D代表X趋于无穷大或无穷小时Y的最小值。

本发明的有益效果是：

上述上述扩宽免疫胶体金检测范围的方法，能判断检测样本是否存在钩状效应，又能无需二次检测，直接对存在钩状效应的样本进行直接判读检测，无需浪费试剂，仅一次检测便可测定检测结果，快速容易，且准确性高。

附图说明

图1为标准样本的HCG免疫胶体金信号值与时间的关系；

图2为标准样本的FOB免疫胶体金信号值与时间的关系。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明所述技术方案作进一步的说明。

实施例1

目前，常用的HCG免疫胶体金测试条的定量检测范围最大为10-15000mIu/mL，该方法的最高仅可检测到15000mIu/mL，应用本发明方法可将其定量的检测范围扩大至10-1600000mIu/mL，其中包括了未发生钩状效应的检测区域10-25000mIu/mL和发生了倒钩的区域25000-1600000mIu/mL避免了葡萄胎等一些非正常妊娠(高浓度HCG值)产生的钩状效应所带来的假阴性结果，对检测结果造成误判。

1.HCG的t和t_0.5的确定

取低浓度5000mIu/mL和高浓度10000mIu/mL的HCG目标标准品样本，采用免疫层析判读记录仪连续检测HCG免疫胶体金测试条的反应线的信号值与时间的关系见图1所示，反应线的信号值恒定不变的开始时间即为完全反应的时间，从图1曲线可看出高低浓度的HCG的t为10分钟，而反应线完全反应时信号值的一半的时间即为t_0.5，从图1曲线可看出高低浓度的HCG的t_0.5为80s。

2.判断HCG样本是否发生钩状效应和准确测定其浓度值的方法

由上述试验可确定该HCG免疫胶体金试纸条的t为10分钟，t_0.5为80s。选取14份已知浓度的标准品，分别测定该阳性样本在时间t和t_0.5的信号值，实验数据如表1所示，判断该样本是否发生钩状效应的符合率为100％。分别用0，10，150，500，1000，2500，5000，10000，25000，50000，100000，500000，1000000，1600000mIu/mL的HCG标准品对试剂进行测定，每个浓度点重复10次，不同浓度的标准品显示出不同强度色带，用免疫层析判读记录仪将相应强度的色带转化成信号值，分别检测在时间80s和10分钟的HCG信号值，若GOD/GOD0.5>1.5，则判定为未发生钩状效应的样本，以其GOD值平均值为Y轴，以目标标准品的浓度(0，10，150，500，1000，2500，5000，10000，25000mIu/mL)为X轴，所得的直线回归曲线即为该区域的标准曲线。若GOD/GOD0.5<1.5，则判定为发生钩状效应的样本。以GOD值平均值为Y轴，以目标标准品的浓度(25000，50000，100000，500000，1000000，1600000mIu/mL)为X轴，用ELISA Cale回归/拟合计算程序软件的logistic曲线拟合(四参数)进行分析得到的曲线Y＝(A-D)/[1+(X/C)B]+D即为该区域的标准曲线。上述曲线方程Y＝(A-D)/[1+(X/C)B]+D中，A代表X趋于无穷大或者无穷小时Y的最大值，B代表斜率，C代表拐点浓度，D代表X趋于无穷大或无穷小时Y的最小值，并输入免疫层析结果判读记录仪中，完成HCG标准曲线参数设置将HCG的Cutoff值设为25mIu/mL，完成结果判定参数设置。

表1 14份已知浓度的HCG标准品是否发生钩状效应

采用已编好上述程序的免疫层析判读记录仪对该10份HCG阳性样本(取自天津市中心妇产医院)进行免疫胶体金定量测试，结果如表2所示，由表2可知其偏差范围不高于15％，在试剂允许的偏差范围内，该方法准确性好。

表2检测结果与实际结果的对比

实际HCG浓度(mIu/mL)	检测HCG结果(mIu/mL)	偏差(％)
			59.03	53.68	-9.06％
442.57	465.04	5.08％
			1153.36	1096.67	-4.92％
2607.43	2659.65	2.00％
			5233.06	5315.86	1.58％
15963.82	15368.06	-3.73％
			52679.22	53721.49	1.98％
205986.35	213168.06	3.49％
			867594.06	845389.23	-2.56％
1468732.62	1426543.65	-2.87％

实施例2

1.FOB的t和t_0.5的确定

取低浓度0.2ug/mL和高浓度1ug/mL的FOB目标标准品样本，采用免疫层析判读记录仪连续检测FOB免疫胶体金测试条的反应线的信号值与时间的关系见图2所示，反应线的信号值恒定不变的开始时间即为完全反应的时间，从图1曲线可看出高低浓度的FOB的t为10分钟，而反应线完全反应时信号值的一半的时间即为t_0.5，从图1曲线可看出高低浓度的FOB的t_0.5为140s。

2.判断FOB样本是否发生钩状效应和准确测定其浓度值的方法

由上述试验可确定该FOB免疫胶体金试纸条的t为10分钟，t_0.5为140s。选取10份已知浓度的FOB标准品，分别测定该阳性样本在时间t和t_0.5的信号值，实验数据如表3所示，判断该样本是否发生钩状效应的符合率为100％。

别用0，0.2，1，2，5，10，100，500，1000，2000ug/mL的FOB标准品对试剂进行测定，每个浓度点重复10次，不同浓度的标准品显示出不同强度色带，用免疫层析判读记录仪将相应强度的色带转化成信号值，分别检测在时间140s和10分钟的FOB信号值，若GOD/GOD0.5>1.5，则判定为未发生钩状效应的样本，以其GOD值平均值为Y轴，以目标标准品的浓度(0，0.2，1，2，5，10ug/mL)为X轴，所得的直线回归曲线即为该区域的标准曲线。若GOD/GOD0.5<1.5，则判定为发生钩状效应的样本。以GOD值平均值为Y轴，以目标标准品的浓度(10，100，500，1000，2000ug/mL)为X轴，用ELISA Cale回归/拟合计算程序软件的logistic曲线拟合(四参数)进行分析得到的曲线Y＝(A-D)/[1+(X/C)B]+D即为该区域的标准曲线。上述曲线方程Y＝(A-D)/[1+(X/C)B]+D中，A代表X趋于无穷大或者无穷小时Y的最大值，B代表斜率，C代表拐点浓度，D代表X趋于无穷大或无穷小时Y的最小值，并输入免疫层析结果判读记录仪中，完成FOB标准曲线参数设置将FOB的Cutoff值设为0.2ug/mL，完成结果判定参数设置。

表3 10份已知浓度的FOB标准品是否发生钩状效应

采用已编好程序的免疫层析判读记录仪对该10份FOB阳性样本(取自天津市泰达医院)进行免疫胶体金定量测试，结果如表4所示，由表4可知其偏差范围不高于15％，在试剂允许的偏差范围内，该方法准确性好。

表4检测结果与实际结果的对比

实际FOB浓度(ug/mL)	检测FOB结果(ug/mL)	偏差(％)
			0.31	0.32	3.23％
0.84	0.83	-1.19％
			1.9	1.86	-2.11％
4.82	4.78	-0.83％
			8.99	8.95	-0.44％
11.28	11.23	-0.44％
			89.4	89.37	-0.03％
441.05	453.69	2.87％
			887.36	897.18	1.11％
1446.3	1468.26	1.52％

上述参照实施例对该一种扩宽免疫胶体金检测范围的方法进行的详细描述，是说明性的而不是限定性的，可按照所限定范围列举出若干个实施例，因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改，应属本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.一种扩宽免疫胶体金检测范围的方法，其特征在于：分别在t_0.5和t时间时使用免疫层析判读记录仪测定胶体金测试条的反应线T线的信号值GOD_0.5和GOD值，t表示完全反应的时间，t_0.5表示完全反应时信号值一半的时间，当GOD/GOD_0.5>1.5时判定为未出现钩状效应，按直线回归方程对检测结果的信号值进行浓度值计算，当GOD/GOD_0.5<1.5时判定为出现钩状效应，按照logistic曲线拟合四参数法方程对检测结果的信号值进行浓度值的计算。

2.根据权利要求1所述的扩宽免疫胶体金检测范围的方法，其特征在于：所述免疫层析判读记录仪为中新科炬生物制药股份有限公司生产的编号为NS3001和NS7001的免疫层析判读记录仪。

3.根据权利要求1所述的扩宽免疫胶体金检测范围的方法，其特征在于：免疫胶体金未发生钩状效应的区域和发生钩状效应的区域的标准曲线是通过以下方法确定的：

(i)分别用浓度为不同浓度的标准品对试剂在t和t0.5时间内进行测定，不同浓度的标准品显示出不同强度色带，用免疫层析判读记录仪将相应强度的色带转化成信号值，所得出的信号值符合GOD/GOD0.5>1.5时，小于该浓度值的范围为未发生倒钩区域，所得出的信号值符合GOD/GOD0.5＜1.5时，大于该浓度值的范围为发生倒钩区域，判断出未发生倒钩区域和发生倒钩区域的浓度范围；

(ii)上述未发生钩状效应的区域的标准曲线是由下述方法确定的：

将已知浓度的且处于未发生倒钩的目标标准品分别进行检测时间为t的重复十次的检测，所得出的信号值的平均值即为该浓度所对应的信号值，以其为Y轴，以处于未发生倒钩的目标标准品的浓度为X轴，所得的直线回归曲线即为该区域的标准曲线；

(iii)上述发生钩状效应的区域的检测信号值的标准曲线是由下述方法确定的：

(a)将已知浓度的且处于发生倒钩的目标标准品分别进行检测时间为t的重复十次的检测，所得出的信号值的平均值即为该浓度所对应的信号值，以其为Y轴，以目标标准品的浓度为X轴，用ELISA Cale回归/拟合计算程序软件的logistic曲线拟合进行分析得到的曲线Y＝(A-D)/[1+(X/C)B]+D即为该区域的标准曲线；

(b)上述曲线方程Y＝(A-D)/[1+(X/C)B]+D中，A代表X趋于无穷大或者无穷小时Y的最大值，B代表斜率，C代表拐点浓度，D代表X趋于无穷大或无穷小时Y的最小值。