CN108333361A - 桥连有抗体的磁性微球复合制剂及其制备方法与应用 - Google Patents
桥连有抗体的磁性微球复合制剂及其制备方法与应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN108333361A CN108333361A CN201710040715.3A CN201710040715A CN108333361A CN 108333361 A CN108333361 A CN 108333361A CN 201710040715 A CN201710040715 A CN 201710040715A CN 108333361 A CN108333361 A CN 108333361A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- antibody
- bridging
- afp
- magnetic microsphere
- carrier
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57407—Specifically defined cancers
- G01N33/57438—Specifically defined cancers of liver, pancreas or kidney
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57476—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving oncofetal proteins
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/577—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving monoclonal antibodies binding reaction mechanisms characterised by the use of monoclonal antibodies; monoclonal antibodies per se are classified with their corresponding antigens
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
- G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
- G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
- G01N2333/4701—Details
- G01N2333/471—Pregnancy proteins, e.g. placenta proteins, alpha-feto-protein, pregnancy specific beta glycoprotein
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/08—Hepato-biliairy disorders other than hepatitis
- G01N2800/085—Liver diseases, e.g. portal hypertension, fibrosis, cirrhosis, bilirubin
Abstract
本发明公开了一种桥连有抗体的磁性微球复合制剂及其制备方法、AFP‑L3分离检测剂、试剂盒和系统。本发明磁性微球复合制剂包括桥连载体,所述桥连载体包被磁性微球和偶联抗AFP抗体,所述抗AFP抗体的Fc片段被切除。本发明AFP‑L3分离检测剂、试剂盒和系统均包括桥连有抗体的磁性微球复合制剂和发光标记物标记的凝集素。本发明桥连有抗体的磁性微球复合制剂有效避免了凝集素与抗体发生非特异的结合,提高了待测AFP‑L3抗原与抗AFP抗体的特异结合,从而提高检测AFP‑L3抗原的特异性和准确性,因此,本发明AFP‑L3分离检测剂、试剂盒和系统检测AFP‑L3抗原的特异性和准确性高。
Description
技术领域
本发明属于体外诊断试剂技术领域,具体的是涉及一种桥连有抗体的磁性微球复合制剂及其制备方法、AFP-L3分离检测剂、AFP-L3分离检测试剂盒、AFP-L3分离检测系统。
背景技术
原发性肝癌,发生于肝细胞或肝内胆管细胞,是全球范围内致死率仅次于肺癌和胃癌的恶性肿瘤。其发病机制至今未研究清楚,目前认为病毒性肝炎、肝硬化、化学致癌物如黄曲霉毒素以及环境污染等因素等造成的肝细胞损伤都有可能诱发原发性肝癌。由于原发性肝癌恶性程度高,易转移和复发,早期诊断难以及时发现,容易错过最佳治疗时期,因此,针对原发性肝癌的生物标志物的检测对于该病的早期诊断、治疗检测和预后判定具有十分重要的意义。
甲胎蛋白(Alpha-fetoprotein/AFP),一种分子量约69Kda的单链糖蛋白,过去一直被认为是诊断原发性肝癌的特异性肿瘤标志物,具有确立诊断、早期诊断、鉴别诊断的作用。大量的临床却发现,部分肝硬化病人的血清中会长期出高浓度AFP,但多年都没有肝癌的迹象;同时发现约20%的晚期肝癌病人,AFP仍处于较低浓度。早在70年代,研究人员发现在对AFP进行凝胶电泳分析时,AFP存在不同的迁移率,根据与扁豆凝集素结合后不同的电泳带,将AFP分为三类,分别为源自良性肝病细胞分泌的AFP-L1、源自孕妇体内分泌的AFP-L2以及源自肝癌细胞分泌的AFP-L3(甲胎蛋白异质体Alpha-fetoprotein variant/AFP-L3),其中,AFP-L3用于肝癌诊断具有高敏感性和特异性,被作为新一代肝癌标志物。美国FDA于2005年批准该指标应用于肝癌预警,并把AFP-L3/AFP诊断肝癌的阳性界定值定为10%。AFP-L3被公认是比AFP更为特异的原发性肝癌指标。
当前检测AFP-L3的方法有多种,其检测原理主要根据不同AFP对植物性扁豆凝集素具有不同亲和力而达到分离从而实现检测。常用的检测方法主要有免疫交叉电泳技术(考马斯亮蓝法、放射自显影法、金银染色法)、免疫印迹法、亲和层析法、LiBASys系统自动分析法、双位点夹心酶免法、微流控芯片分析法、免疫磁性微球捕获分离法等。其中,免疫交叉电泳技术和免疫印迹法因制备要求高、操作复杂、需要专门检测人员,耗时耗力,限制了其在临床上的应用;LiBASys系统自动分析法需要特殊的检测系统,操作繁琐,设备昂贵,难以在中小城市普及应用;双位点夹心酶免法需要制备特殊的单克隆抗体且仅限于实验研究,重复性难以保证,无法实现批量稳定生产和临床应用;微流控芯片分析法目前尚处于研究阶段,还无法大规模进行推广应用;而免疫磁性微球捕获分离法虽然操作简便、分离迅捷,但分离后仍需要额外配备试剂盒检测,目前该项目仍无成熟的商业试剂盒上市。亲和层析法虽然制备方法简单,无需特殊设备,但该法需要人工操作,耗时费力,且无法实现自动化检测。
在上述现有的检测方法存在缺陷的基础上,化学发光分析法由于具有灵敏度高,线性范围宽,特异性好,仪器设备操作简单等优点,迅速被用于生命科学、食品科学、临床医学以及环境检测等领域,成为现代分析领域中一种有效的微量及痕量分析技术。如在当前公开的一种甲胎蛋白异质体的分离检测组合物和检测方法中,分离检测组合物包括分离试剂和检测试剂,所述分离试剂包括偶联扁豆凝集素的磁性颗粒和洗脱液,所述偶联扁豆凝集素的磁性颗粒用于与待检测样品中的AFP-L3特异性结合;所述检测试剂包括包被甲胎蛋白抗体的磁性颗粒、标记酶的抗甲胎蛋白抗体。其检测方法采用了凝集素-抗体两步夹心法的原理以达到分离检测甲胎蛋白异质体的目的,第一步,偶联了凝集素的磁性颗粒与待测物中的甲胎蛋白异质体形成特异性结合,形成凝集素磁性颗粒-甲胎蛋白异质体的复合物;第二步,标记了酶的抗甲胎蛋白抗体与第一步中的甲胎蛋白异质体形成特异性结合,形成标记酶的抗甲胎蛋白抗体-甲胎蛋白异质体-凝集素磁性颗粒的夹心复合物,通过标记物的显色或发光以实现检测待测物中甲胎蛋白异质体的目的。
在临床使用过程中发现,该检测方法存在以下几个主要技术问题:
1.由于抗体(包括但不限于单克隆抗体,多克隆抗体)是一种免疫球蛋白IgG,同样也是一种糖蛋白,在抗体的Fc片段上存在若干个糖链,在分离检测过程中扁豆凝集素会无法避免地与抗体Fc片段上的糖链发生非特异性结合,影响目标抗原(甲胎蛋白异质体AFP-L3)与抗甲胎蛋白抗体的结合,造成抗体亲和力的下降。因此该检测方法采用“扁豆凝集素包被磁球捕获抗原,标记物标记AFP抗体作为检测抗体”的扁豆凝集素-抗体夹心的方法学会存在相当高的非特异结合,从而影响试验结果的特异性和准确性。
2.该检测方法采用扁豆凝集素包被磁球,但由于扁豆凝集素能够与甲胎蛋白抗体形成非特异性结合,且扁豆凝集素与甲胎蛋白异质体AFP-L3的结合力(亲和常数)要远小于AFP-L3与AFP抗体的结合力,因此会造成抗体亲和力以及特异性的下降,从而影响试验结果的准确性。同时,扁豆凝集素与甲胎蛋白抗体非特异性结合后也会造成样本虚高的情况发生。;
3.该检测方法采用扁豆凝集素包被磁球,由于扁豆凝集素属于植物凝集素,植物凝集素是一种具有糖结合活性的蛋白,因此无法避免凝集素与检测样本(血清)中其他的糖蛋白等物质发生非特异结合,从而干扰扁豆凝集素与AFP-L3的特异性结合,进而导致检测样本本底(背景值)升高。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的上述不足,提供一种桥连有抗体的磁性微球复合制剂及其制备方法,以克服现有AFP-L3的分离检测组合物和检测方法存在的非特异性结合和导致检测样本本底(背景值)升高的技术问题。
本发明的另一目的在于提供一种AFP-L3分离检测剂和AFP-L3分离检测试剂盒以及AFP-L3分离检测系统,以解决现有采用凝集素-抗体两步夹心法存在的非特异结合和假阳性发生等导致的检测准确性不高的技术问题。
为了实现上述发明目的,本发明的一方面,提供了一种桥连有抗体的磁性微球复合制剂,包括磁性微球,还包括:
抗AFP抗体,所述抗AFP抗体的Fc片段被切除;
桥连载体,所述桥连载体包被所述磁性微球和偶联所述抗AFP抗体。
本发明的另一方面,提供了一种桥连有抗体的磁性微球复合制剂的制备方法。所述制备方法包括如下步骤:
将抗AFP抗体中抗体Fc片段切除并分离,得到能够与抗原识别的含抗体片段的抗体;
在所述抗体上偶联桥联载体,形成抗体-桥联载体偶联物;
将所述抗体-桥联载体偶联物包被磁性微球,得到本发明桥连有抗体的磁性微球复合制剂。
本发明的又一方面,提供了一种AFP-L3分离检测剂。所述AFP-L3分离检测剂包括如下组分:
桥连有抗体的磁性微球复合制剂,所述桥连有抗体的磁性微球复合制剂为本发明桥连有抗体的磁性微球复合制剂或由本发明制备方法制备的桥连有抗体的磁性微球复合制剂;
发光标记物标记的凝集素。
本发明的又一方面,提供了一种AFP-L3分离检测试剂盒。所述AFP-L3分离检测试剂盒包括本发明AFP-L3分离检测剂。
本发明的又一方面,提供了一种AFP-L3分离检测系统,所述分离检测系统包括:
本发明AFP-L3分离检测剂或本发明AFP-L3分离检测试剂盒;
磁分离模块,与所述分离桥连有抗体的磁性微球复合制剂和发光标记物标记的凝集素配合,用于自液体中分离磁性微球,完成对包括AFP-L3的分离;
检测模块,与磁分离模块分离的磁性微球和激发底物配合,用于完成对包括AFP-L3含量的检测;
数据处理模块,用于计算所述AFP-L3的含量。
本发明的又一方面,提供了本发明桥连有抗体的磁性微球复合制剂、本发明AFP-L3分离检测剂、本发明AFP-L3分离检测试剂盒、本发明AFP-L3分离检测系统任一种在分离检测甲胎蛋白异质体中的应用。
与现有技术相比,本发明桥连有抗体的磁性微球复合制剂所偶联的抗AFP抗体的Fc片段被切除,有效避免了凝集素在反应过程中与抗体发生非特异的结合,从而消除了因非特异结合而造成的空间位阻,保证了抗AFP抗体与待测AFP抗原(如包括AFP-L3、AFP-L2、AFP-L1)的特异结合,从而提高检测AFP-L3抗原的特异性和准确性。
本发明桥连有抗体的磁性微球复合制剂的制备方法先将抗AFP抗体中Fc片段酶切除去,然后偶联桥联载体,最后将抗体-桥联载体偶联物包被磁性微球。这样桥联载体一端偶联抗AFP抗体,另一端包被磁性微球,有效地避免了因抗体直接偶联磁球时形成的较大空间位阻以及酶切抗体与磁球刚性界面接触造成活性的损失,使得制备的抗AFP抗体-桥联载体-磁性微球结构的桥连有抗体的磁性微球复合制剂结构稳定,而且使得制备的桥连有抗体的磁性微球复合制剂在检测过程中有效避免了凝集素与抗体发生非特异的结合,消除了因非特异结合而造成的空间位阻,保证了抗AFP抗体与待测AFP抗原(如包括AFP-L3、AFP-L2、AFP-L1)的特异结合。
本发明AFP-L3分离检测剂和AFP-L3分离检测试剂盒以及AFP-L3分离检测系统由于是以本发明桥连有抗体的磁性微球复合制剂为基础,并将其先捕获和分离待测样本中的AFP抗原包括AFP-L3抗原,形成免疫复合物,然后将免疫复合物再与凝集素进行反应。这样,保证了凝集素只与AFP-L3抗原的充分反应,有效避免了现有检查方法将凝集素直接与待测样本进行直接接触而导致凝集素与待测样本其他杂蛋白发生非特异结合,进而导致检测样本本底(背景值)升高的问题或造成的特异性的下降以及假阳性情况的发生,从而提高了检测结果的特异性和准确性。
附图说明
图1是本发明实施例桥连有抗体的磁性微球复合制剂结构示意图;
图2是本发明实施例桥连有抗体的磁性微球复合制剂制备方法流程图;
图3是本发明实施例桥连有抗体的磁性微球复合制剂与AFP-L3抗原和发光标记物标记的凝集素结合后的结构示意图;
图4是本发明实施例AFP-L3分离检测方法流程图。
具体实施方式
为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白,以下结合实施例与附图,对本发明进行进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。
缩略语解释:
甲胎蛋白(Alpha-fetoprotein/AFP)、甲胎蛋白异质体(Alpha-fetoproteinvariant/AFP-L3)、原发性肝癌(primary hepatocellular carcinoma)、扁豆凝集素(lensculinaris agglutinin/LCA)、磁性微球(Magnetic microspheres/MB)、捕获分离(Captureand separation)、CLIA(化学发光免疫分析法)、SPDP(3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯)、SMPT(琥珀酰亚胺基-6-[α-甲基-α-(2-吡啶基二硫)甲苯酰胺基]己酯)、KUMS(N-[κ-马来酰亚胺十一酰氧]-琥珀酰亚胺酯)、DTT(二硫苏糖醇)、TCEP(三(2-羧乙基)膦)、SDS(十二烷基硫酸钠)、SPDP(3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯)、SMPT(琥珀酰亚胺基-6-[α-甲基-α-(2-吡啶基二硫)甲苯酰胺基]己酯)、KUMS(N-[κ-马来酰亚胺十一酰氧]-琥珀酰亚胺酯)、PDP(琥珀酰酰亚胺酯)、SM(PEG)n(马来酰亚胺-聚乙二醇聚合物)、Isoluminol(异鲁米诺)、ABEI(N-(4-氨基丁基)-N-乙基异鲁米诺)、AHEI(N-(6-氨基已基)-N-乙基异鲁米诺)、ITCI(异硫氰酸异鲁米诺)、ITCBEI(N-(4-异硫氰基丁基)-N-乙基异鲁米诺)
一方面,本发明实施例提供了一种能够有效避免凝集素与抗体发生非特异性结合的桥连有抗体的磁性微球复合制剂。所述桥连有抗体的磁性微球复合制剂的结构如图1所示,其包括如下部分:
磁性微球1、桥连载体2、抗AFP抗体3,且桥连载体2一端包被磁性微球1,桥连载体2的另一端偶联抗AFP抗体3,形成磁性微球1-桥连载体2-抗AFP抗体3结构。
其中,上述磁性微球1作为桥连载体2、抗AFP抗体3的载体。在一实施例中,上述桥连有抗体的磁性微球复合制剂中磁性微球1与桥连载体2的质量比为(50-200):1。控制磁性微球1表面包被附上的桥连载体2的量,就间接影响偶联抗AFP抗体3的量,从而提高桥连有抗体的磁性微球复合制剂捕获总AFP抗原的量。因此,在另一实施例中,上述桥连有抗体的磁性微球复合制剂中桥连载体2与抗AFP抗体3摩尔比为1:1。
在上述各实施例的基础上,上述磁性微球1可以选用本领域常用的磁性微球,具体的可以选用纳米磁性微球。只要是能够适用于本发明实施例技术方案的本领域所有的磁性微球均在本发明公开的范围。
在一实施例中,该磁性微球1为表面被活化处理的磁性微球。磁性微球表面活化处理可以按照下文桥连有抗体的磁性微球复合制剂制备方法中磁性微球活化方法进行活化处理。
上述桥连载体2有效连接磁性微球1和抗AFP抗体3,使得上述桥连有抗体的磁性微球复合制剂的结构稳定。在一实施例中,该桥连载体2为N-羟基琥珀酰亚胺-(聚乙二醇)n-马来酰亚胺基团,其中,n为4-24,n具体可以是4、6、8、12、24等。该N-羟基琥珀酰亚胺-(聚乙二醇)n-马来酰亚胺基团由SM(PEG)n试剂形成提供。在具体实施例中,该SM(PEG)n为SM(PEG)8、SM(PEG)4、SM(PEG)6、SM(PEG)12、SM(PEG)24等。
上述抗AFP抗体3为含糖链的抗体Fc片段被切除的抗AFP抗体。正常的抗AFP抗体包括含有糖链的抗体Fc片段,理所当然的是也同时包括抗体片段,一实施例中,所述抗AFP抗体所保留的能够与抗原识别的抗体片段为F(ab)2’片段、Fab片段、Fab’片段中的至少一种。在本发明实施例中,上述抗AFP抗体3所含的含糖链Fc片段被切除,如采用下文桥连有抗体的磁性微球复合制剂制备方法中的酶切除,保留的能够与抗原识别的抗体片段如F(ab)2’片段、Fab片段、Fab’片段中的至少一种。当采用凝集素-双抗体夹心法定量检测AFP-L3抗原过程中,会用到凝集素,而由于凝集素的特性,其会与抗AFP抗体中Fc片段上的糖链发生非特异性结合,从而形成空间位阻,影响目标甲胎蛋白异质体AFP-L3与抗AFP抗体的结合,造成抗体亲和力的下降。而在上述抗AFP抗体3中的含糖链Fc片段被切除,这能够有效避免出现凝集素与抗AFP抗体3发生非特异性结合,也即是避免出现空间位阻,从而有效保证并提高了待测AFP-L3与抗AFP抗体3的结合。
一实施例中,上述桥连载体2是偶联在抗AFP抗体3的切除所述Fc片段酶切部位上,这样有效保证了抗AFP抗体3的活性。
因此,上述桥连有抗体的磁性微球复合制剂在用于AFP-L3抗原检测方法如采用凝集素-双抗体夹心法检测AFP-L3方法中,由于上述桥连有抗体的磁性微球复合制剂结合有抗AFP抗体,其能够有效与AFP抗原特异结合,该AFP抗原包括AFP-L1、AFP-L2、AFP-L3。当结合有AFP抗原的上述桥连有抗体的磁性微球复合制剂与凝集素混合后,不仅能够有效避免凝集素在反应过程中与抗AFP抗体3发生非特异的结合,从而消除了因非特异结合而造成的空间位阻,而且提高了待测AFP抗原(如包括AFP-L3、AFP-L2、AFP-L1)与抗AFP抗体3的特异结合,当凝集素与AFP-L3反应结合后,从而提高检测AFP-L3的特异性和准确性。
另外,上述各实施例中的桥连有抗体的磁性微球复合制剂可以于稀释液中配制悬浮液,该稀释液包括但不限于碳酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液等。
相应地,本发明实施例还提供了一种用于上文所述桥连有抗体的磁性微球复合制剂的制备方法。该制备方法流程如图2所示,同时请参见图1,包括如下步骤:
S01.制备能够与抗原识别含抗体片段的抗体:将抗AFP抗体中含糖链的抗体Fc片段切除并分离,得到能够与抗原识别的含抗体片段的抗体,即是图1中所述的抗AFP抗体3;
S02.制备抗AFP抗体-桥联载体偶联物:在步骤S01制备的抗体即抗AFP抗体3上偶联桥联载体2,形成抗体-桥联载体偶联物,即是抗AFP抗体3-桥联载体2偶联物;
S03.抗AFP抗体-桥联载体偶联物包被磁性微球:将步骤S02制备的抗体-桥联载体偶联物包被磁性微球1,得到上文所述的桥连有抗体的磁性微球复合制剂。
具体地,上述步骤S01中的切除所述抗体Fc片段的方法可以是本领域常规的切除方法,如采用酶切处理。一实施例中,该酶切处理所用包括但不限于胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、无花果蛋白酶中的至少一种,如可以是采用一种酶进行酶切处理,当然也可以采用两种以上的酶进行混合,形成混合酶液进行酶切处理。
其中,所述抗体包括但不限于抗体F(ab)2’片段,Fab片段,Fab’片段。在酶切处理过程中,酶的浓度优选的相对抗AFP抗体是足量,如在一实施例中,抗AFP抗体与酶的比例为(10-40):1(w/w)。另外,酶切处理的体系为能够保证酶活性的体系,酶切处理的环境如稳定等为酶工作的温度,时间应该是充分的,在具体实施例中,酶切可以按照下文实施例1中酶切处理。
酶切处理后,除去Fc片段,纯化抗体,纯化可以按照下文实施例1中酶切处理后的纯化处理。
上述步骤S02中的在所述抗体上偶联桥联载体的方法可以采用异形双功能交联剂定点连接方法制备获得,如可以是下述方法A或方法B。当采用下述方法A获得抗体上偶联桥联载体时,其方法包括如下步骤:
S021:将所述抗体与异形双功能交联剂进行交联反应,生成抗体-酰亚胺酯;
S022:将所述抗体-酰亚胺酯经还原剂还原处理,生成抗体-SH;
S023:将异形双功能交联剂与桥联载体化合物进行交联反应,生成桥联载体-酰亚胺酯;
S024:将所述抗体-SH与所述桥联载体-酰亚胺酯进行偶联反应,生成所述抗体-桥联载体偶联物。
当采用下述方法B获得抗体上偶联桥联载体时,其方法包括如下步骤:
S025:将桥联载体化合物与异形双功能交联剂进行交联反应,生成桥联载体-酰亚胺酯;
S026:将所述桥联载体-酰亚胺酯经还原剂还原处理,生成桥联载体-SH;
S027:将异形双功能交联剂与所述抗体进行交联反应,生成所述抗体-酰亚胺酯;
S028:将所述桥联载体-SH与所述抗体-酰亚胺酯进行偶联反应,生成所述抗体-桥联载体偶联物。
上述S021中交联剂反应中,异形双功能交联剂能够与抗体酶切部位的氨基、巯基基团发生交联反应,生成酰亚胺酯基团。或者上述S025中的桥联载体化合物中的功能基团与异形双功能交联剂发生交联反应,生成酰亚胺酯基团;具体的是桥联载体化合物一端的马来酰亚胺基团与异型双功能交联剂的巯基基团发生交联反应。
异形双功能交联剂优选足量,使得异形双功能交联剂充分与抗体也即是上文中的抗AFP抗体3或桥联载体化合物充分反应。
一实施例中,所述异形双功能交联剂包括但不限于3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(SPDP)、琥珀酰亚胺基-6-[α-甲基-α-(2-吡啶基二硫)甲苯酰胺基]己酯(SMPT)、N-[κ-马来酰亚胺十一酰氧]-琥珀酰亚胺酯(KUMS)中的任一种。当然,如果添加比例适当,可以是该些种类的异形双功能交联剂中两种以上的混合物。该异形双功能交联剂均能够与氨基和巯基基团交联。在一实施例中,该交联反应的温度为20℃-30℃,且反应应该是充分的,如反应时间为30min-90min。
待该交联反应后,对生成的抗体-酰亚胺酯产物或桥联载体-酰亚胺酯的纯化方法包括但不限于:Sphadex G-25柱层析法,透析袋透析法。
上述步骤S022或步骤S026中,步骤S021中制备的抗体-酰亚胺酯的酰亚胺酯基团。或上述步骤S026中,步骤S025的桥联载体-酰亚胺酯的酰亚胺酯基团在还原剂的还原下生成-SH基团,也即是生成抗体-SH产物或桥联载体-SH。在还原反应过程中,还原剂优选相对酰亚胺酯基团是足量,使得酰亚胺酯基团充分与还原剂反应,将酰亚胺酯基团还原成-SH基团。
一实施例中,所述还原剂包括但不限于二硫苏糖醇(DTT)、β-巯基乙醇、三(2-羧乙基)膦(TCEP)、十二烷基硫酸钠(SDS)中的任一种。当然,如果添加比例适当,可以是该些种类的还原剂中两种以上的混合物。该氧化还原反应的还原剂浓度为10mmol/mL-50mmol/mL,反应温度为20℃-30℃,且反应应该是充分的,如反应时间为30min-90min。
待该还原反应后,对生成的抗体-SH或桥联载体-SH产物的纯化方法包括但不限于:Sphadex G-25柱层析法,透析袋透析法。
上述步骤S023中,异形双功能交联剂与桥联载体化合物进行交联反应是桥联载体化合物一端的马来酰亚胺基团与异型双功能交联剂的巯基基团反应,其反应原理与上述步骤S025中原理相同。或上述步骤S027中,异形双功能交联剂与抗体进行交联反应原理与上述步骤S021中原理相同。
实施例中,该步骤S023中的交联反应的反应物桥联载体化合物与异形双功能交联剂的用量质量比1:(10-20)或该步骤S027中的交联反应异形双功能交联剂相对抗体足量。在另一实施例中,该交联反应的温度为20℃-30℃,且反应应该是充分的,如反应时间为30min-90min。
该步骤S023或步骤S027中的所述异形双功能交联剂可以与上述步骤步骤S021或步骤S025中的异形双功能交联剂相同或不同,如包括但不限于3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(SPDP)、琥珀酰亚胺基-6-[α-甲基-α-(2-吡啶基二硫)甲苯酰胺基]己酯(SMPT)、N-[κ-马来酰亚胺十一酰氧]-琥珀酰亚胺酯(KUMS)中的任一种,当然,如果添加比例适当,可以是该些种类的异形双功能交联剂中两种以上的混合物。另一实施例中,步骤S023中的桥联载体化合物可以与步骤S025中的桥联载体化合物相同或不同,如桥联载体化合物为马来酰亚胺-聚乙二醇聚合物(SM(PEG)n,n为4-24),具体可以是但不限于SM(PEG)4、SM(PEG)6、SM(PEG)8、SM(PEG)12、SM(PEG)24等。
待该交联反应后,对生成的桥联载体-酰亚胺酯(桥联载体-PDP)产物的纯化方法包括但不限于:Sphadex G-25柱层析法,透析袋透析法。
另外,上述步骤S023与步骤S021没有先后顺序。上述步骤S027与步骤S025也没有先后顺序。
上述步骤S024中,抗体-SH与桥联载体-PDP的偶联反应使得抗体与桥联载体连接,生成抗体-桥联载体偶联物。上述步骤S028中,桥联载体-SH与抗体-PDP的偶联反应使得抗体与桥联载体连接,生成抗体-桥联载体偶联物。
在一实施例中,抗体-SH与桥联载体-PDP的用量摩尔比为1:1或桥联载体-SH与抗体-PDP的用量摩尔比为1:1。在另一实施例中,该偶联反应的温度为4℃,且反应应该是充分的,如反应时间为20h。在反应过程中,可以采用磁力搅拌器上缓慢搅拌反应20h。
上述步骤S03中,被包被的磁性微球1可以是上文桥连有抗体的磁性微球复合制剂中磁性微球1,为了节约篇幅,在此不再赘述。优选的是被活化处理后的磁性微球。在一实施例中,用于活化磁性微球1的活化剂包括但不限于N,N'-二异丙基碳二亚胺(CDC)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)、二环己基碳二亚胺(DCC)中的任一种,当然,如果添加比例适当,可以是该些种类的活化剂中或两种以上的混合物。活化磁性微球1的方法可以但不仅仅按照下文实施例1中活化方法。
在包被处理过程中抗体-桥联载体偶联物与磁性微球1按照质量比为1:(50-200),使得抗体-桥联载体偶联物充分包被磁性微球1。
待偶联反应后,对反应产物进行磁性分离,洗涤处理。所述洗涤液包括但不限于BSA溶液、乙醇胺溶液、明胶溶液等。
待洗涤后获得的桥连有抗体的磁性微球复合制剂可以置于稀释液中进行保存,所述稀释液包括但不限于碳酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液中的至少一种。
上述采用桥连有抗体的磁性微球复合制剂的制备方法制备的桥连有抗体的磁性微球复合制剂中,桥联载体2一端偶联抗AFP抗体3,另一端包被磁性微球1,有效地避免了因抗体直接偶联磁球时形成的较大空间位阻以及酶切抗体与磁球刚性界面接触造成活性的损失,使得制备的抗AFP抗体3-桥联载体2-磁性微球1结构的桥连有抗体的磁性微球复合制剂结构稳定,而且使得制备的桥连有抗体的磁性微球复合制剂在检测过程中有效避免了凝集素与抗AFP抗体3发生非特异的结合,消除了因非特异结合而造成的空间位阻,保证了抗AFP抗体与待测AFP抗原(如包括AFP-L3、AFP-L2、AFP-L1)的特异结合。
另一方面,在上述桥连有抗体的磁性微球复合制剂及其制备方法的基础上,本发明实施例提供了一种AFP-L3分离检测剂。所述AFP-L3分离检测剂包括如下组分:
桥连有抗体的磁性微球复合制剂和发光标记物标记的凝集素。
其中,上述桥连有抗体的磁性微球复合制剂为上文所述的桥连有抗体的磁性微球复合制剂或由上文所述的桥连有抗体的磁性微球复合制剂制备方法制备的桥连有抗体的磁性微球复合制剂。在分离检测AFP-L3过程中,该桥连有抗体的磁性微球复合制剂与待测样本进行反应后,该桥连有抗体的磁性微球复合制剂所含的抗AFP抗体1与待测样本中的AFP抗原(包括AFP-L1、AFP-L2和AFP-L3)特异性结合,实现AFP抗原包括AFP-L3从待测样本中分离。
上述发光标记物标记的凝集素是与上述从待测样本捕获有AFP抗原包括AFP-L3的桥连有抗体的磁性微球复合制剂进行反应,具体的是凝集素与AFP-L3进行反应,实现凝集素与AFP-L3结合,反应后的产物如图3所示。在图3中,桥连载体2一端偶联抗AFP抗体3,另一端包被活化处理的磁性微球1,形成上文桥连有抗体的磁性微球复合制剂,从待测样本中捕获的AFP抗原4(包括AFP-L3)与抗AFP抗体3特异性结合,凝集素5与AFP-L3抗原4结合,发光标记物6与凝集素5结合。
一实施例中,发光标记物标记的凝集素的制备可以是按照下述方法制备获得:将发光标记物6加入到透析好的凝集素5中进行反应,纯化得到发光标记物标记的凝集素。
其中,该发光标记物6的浓度为250ng/mL-1000ng/mL,凝集素的浓度为500ng/mL-5000ng/mL。该发光标记物标记的凝集素可以加入BSA的保护液,并加入稀释液稀释处理,该稀释液包括但不限于碳酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液中的至少一种。
在一实施例中,所述发光标记物标记的凝集素中的凝集素5包括但不限于扁豆凝集素、小兵豆凝集素、刀豆凝集素等中的至少一种,优选为扁豆凝集素。在另一实施例中,发光标记物6包括但不限于鲁米诺、异鲁米诺(Isoluminol)及其衍生物、吖啶酯及其衍生物,1,2-二氧杂环丁烷及其衍生物中的任一种。其中,异鲁米诺为N-(4-氨基丁基)-N-乙基异鲁米诺(ABEI)、N-(6-氨基已基)-N-乙基异鲁米诺(AHEI)、异硫氰酸异鲁米诺(ITCI)、N-(4-异硫氰基丁基)-N-乙基异鲁米诺(ITCBEI)中的任一种,异鲁米诺衍生物、吖啶酯衍生物、1,2-二氧杂环丁烷衍生物可以是本领域常用的衍生物。
另外,基于上述AFP-L3分离检测剂检测AFP-L3抗原的原理和方法,所述桥连有抗体的磁性微球复合制剂与所述发光标记物标记的凝集素两组分是彼此隔开设置,只有当桥连有抗体的磁性微球复合制剂与待测样本反应后,再将发光标记物标记的凝集素与结合的AFP抗原(包括AFP-L3)反应。
又一方面,本发明实施例提供了一种AFP-L3分离检测试剂盒。所述AFP-L3分离检测试剂盒包括的试剂有:上文所述的本发明实施例AFP-L3分离检测剂。
一实施例中,所述桥连有抗体的磁性微球复合制剂中的所述桥连载体偶联所述抗AFP抗体的浓度为5μg/mL-20μg/mL,所述磁性微球的浓度为0.5mg/mL-2mg/mL。另一实施例中,所述发光标记物标记的凝集素中的所述发光标记物浓度:250ng/mL-1000ng/mL,所述凝集素的浓度:500ng/mL–5000ng/mL。
为了方便该AFP-L3分离检测试剂盒使用,提高AFP-L3分离检测的效率和准确性。在一实施例中,该AFP-L3分离检测试剂盒还包括校准样品、缓冲液中的至少一种试剂。其中,该校准样品可以是AFP-Ag,如包括浓度为10.938IU/mL-20.313IU/mL的低浓度校准品和浓度为350.000IU/mL-650.000IU/mL高浓度校准品。另外,为了进一步方便该AFP-L3分离检测试剂盒使用,该试剂盒还可以配置激发底物试剂,该激发底物激发发光标记物发光,以便于定量检测。
因此,基于上文所述的本发明实施例AFP-L3分离检测剂和AFP-L3分离检测试剂盒,AFP-L3分离检测方法如图4所示,包括如下步骤:
S04.利用桥连有抗体的磁性微球复合制剂捕获AFP抗原:将待测样本与上文所述的本发明实施例桥连有抗体的磁性微球复合制剂进行温育处理,后进行磁分离,获得捕获有待测样本AFP抗原的磁性微球复合制剂;
S05.将发光标记物标记的凝集素与捕获的AFP-L3抗原结合:将所述捕获有待测AFP抗原的磁性微球复合制剂与发光标记物标记的凝集素再进行温育处理,后进行磁分离,获得结合有AFP-L3抗原-凝集素的磁性微球复合制剂;
S06.检测发光信号,计算AFP-L3浓度:向所述结合有凝集素的磁性微球复合制剂的中加入激发底物,获得发光信号,并检测所述发光信号强度计算所述待测样本中的AFP-L3浓度。
其中,上述步骤S04中,所述桥连有抗体的磁性微球复合制剂中的所述桥连载体偶联所述抗AFP抗体的浓度为5μg/mL-20μg/mL,所述磁性微球的浓度为0.5mg/mL-2mg/mL。
上述步骤S05中,发光标记物标记的凝集素中的所述发光标记物浓度:250ng/mL-1000ng/mL,所述凝集素的浓度:500ng/mL-5000ng/mL。
因此,该AFP-L3分离检测方法以上文所述的本发明实施例AFP-L3分离检测剂和AFP-L3分离检测试剂盒为基础,采用凝集素-双抗体夹心法定量检测检测AFP-L3抗原,其特异性和准确性高。
相应地,基于上述AFP-L3分离检测方法,本发明实施例提供了一种AFP-L3分离检测系统。所述AFP-L3分离检测系统包括:
上文所述的本发明实施例AFP-L3分离检测剂或上文所述的本发明实施例AFP-L3分离检测试剂盒、磁分离模块、检测模块和数据处理模块。
其中,磁分离模块,与上文所述的本发明实施例AFP-L3分离检测剂或上文所述的本发明实施例AFP-L3分离检测试剂盒所含的分离桥连有抗体的磁性微球复合制剂和发光标记物标记的凝集素配合,用于自液体中分离磁性微球,完成对甲胎蛋白异质体的分离;具体的是桥连有抗体的磁性微球复合制剂与待测样本混合反应后,采用磁分离模块对磁性微球进行分离,然后将分离的磁性微球再与发光标记物标记的凝集素混合进行反应,再次采用磁分离模块对磁性微球进行分离;
检测模块,与磁分离模块分离的磁性微球和激发底物(包括NaOH和H2O2)配合,用于完成对包括AFP-L3含量的检测;具体的,该检测模块是将磁分离模块分离的捕获有待测样本中AFP-L3的磁性微球在激发底物的作用下获得光信号。
数据处理模块,用于计算所述AFP-L3的含量,可以显示AFP-L3的含量数据,或进一步计算或显示AFP-L3占比数据。具体是对检测模块中光信号进行数据处理,计算出AFP-L3的含量。因此,一实施例中数据处理模块还可以包括光信号读取装置。
另外,上述AFP-L3分离检测系统还可以包括取样模块,用于取样至上述磁分离模块中。
由上述可知,上文所述的本发明实施例AFP-L3检测剂、AFP-L3检测试剂盒和AFP-L3分离检测系统由于是以上文本发明实施例桥连有抗体的磁性微球复合制剂为基础,并将其先捕获和分离待测样本中的AFP抗原包括AFP-L3抗原,形成免疫复合物,然后将AFP抗原与AFP抗体形成的免疫复合物再与凝集素进行反应。这样,保证了凝集素只与AFP-L3抗原的充分反应,避免了如现有检查方法将凝集素与待测样本进行直接接触,有效避免了现有检测中凝集素与待测样本其他杂蛋白发生非特异结合,或造成的特异性的下降以及假阳性情况的发生,从而提高了检测结果的特异性和准确性。
现结合具体实例,对本发明实施例桥连有抗体的磁性微球复合制剂及其制备方法和AFP-L3分离检测剂、AFP-L3分离检测试剂盒、AFP-L3分离检测方法进行进一步详细说明。下述各实施例所用到的材料来源如下:
扁豆凝集素LCA(来源:Aladdin公司)
磁性微球(来源:新产业生物医学工程股份有限公司生产)
ABEI(来源:新产业生物医学工程股份有限公司生产)
Anti-AFP antibody(来源:Meridian公司)
胃蛋白酶(来源:SIGMA-ALDRICH公司)
AFP校准品(来源:Bio-Rad公司,)
桥连有抗体的磁性微球复合制剂及其制备方法实施例
实施例1
本实施例提供了一种桥连有抗体的磁性微球复合制剂及其制备方法。其中,桥连有抗体的磁性微球复合制剂结构如图1所述,其包括纳米磁性微球1、SM(PEG)4桥联载体2和抗AFP的F(ab)2’抗体3形成的纳米磁性微球1-SM(PEG)4桥联载体2-抗AFP的F(ab)2’抗体3。
桥连有抗体的磁性微球复合制剂制备方法包括如下步骤:
S11.抗AFP单克隆抗体的F(ab)2’片段的酶切处理:
1)抗AFP抗体在0.2M的醋酸钠缓冲液(pH4.0)4℃透析过夜,IgG抗体浓度在1-20mg/mL之间;
2)将透析后的抗体用紫外-可见分光光度计测定280nm下的波长,并计算抗体的浓度;
3)胃蛋白酶与抗AFP的IgG抗体溶液混合,胃蛋白酶:抗体=1:20(W:W),在37℃水浴反应6h;
4)加入3M Tris-Base碱溶液(pH 8.0-9.0),用1M HCl将体系pH调整至pH8.0;
5)将4)的上述抗体在磷酸盐缓冲液(PBS,pH8.0)体系下4℃透析过夜;
6)用磷酸盐缓冲液(PBS,pH8.0)平衡Protein A/G-Plus Beads抗体纯化柱(10倍柱体积),每次上样1mL样品,收集穿出部分液体(包含有F(ab)2’片段);
7)磷酸盐缓冲液(PBS,pH8.0)平衡26*900mm Sephacryl S-200柱(5倍柱体积),进一步纯化收集的液体,最终获得纯化的抗AFP的F(ab)2’抗体。
S12.SPDP定点连接工艺制备F(ab)2’-桥联载体偶联物:
1)用SPDP处理F(ab)2’:
取5mg AFP酶切单抗(F(ab)2’),溶于0.5mL 0.1mol/mL PBS(pH7.4)中,迅速滴入一定量SPDP液(溶于无水乙醇),在23℃-25℃环境温度下反应30min,同时低速搅拌;反应结束后,将反应液通过Sphadex G-25柱以除去多余SPDP及副产物,平衡及洗脱液均为含0.1mol/mL NaCl的0.1mol/mL醋酸盐缓冲液(pH7.4),收集并得到反应产物:F(ab)2’-PDP;
2)F(ab)2’-PDP的还原:
取上述F(ab)2’-PDP溶液,加入固体DTT(二硫苏糖醇),使其终浓度达到25mmol/mL,在23℃-25℃环境温度下反应30min,不断搅拌;反应结束后,过Sphadex G-25柱,平衡及洗脱液均为含0.1mol/mL NaCl的0.1mol/mL PBS(pH7.4),收集并得到反应产物:F(ab)2’-SH;
3)用SPDP处理SM(PEG)4桥联载体:
取5mg SM(PEG)4桥联载体,溶于0.5mL 0.1mol/mL PBS(pH7.4)中,迅速滴入一定量SPDP液(溶于无水乙醇),在23℃-25℃环境温度下反应30min,同时低速搅拌;反应结束后,将反应液通过Sphadex G-25柱以除去多余SPDP及副产物,平衡及洗脱液均为含0.1mol/mL NaCl的0.1mol/mL醋酸盐缓冲液(pH7.4),收集并得到反应产物:SM(PEG)4桥联载体-PDP;
4)F(ab)2’-SH与SM(PEG)4桥联载体-PDP的偶联:
将上述F(ab)2’-SH与SM(PEG)4桥联载体-PDP混合,在4℃放置20h,不时取出轻摇,反应结束后,将溶液浓缩至0.5mL,其中产物主要为F(ab)2’-SM(PEG)4桥联产物;
5)F(ab)2’-SM(PEG)4桥联载体产物中游离F(ab)2’的除去:
用Sepharyl S-200,层析柱为67*1.3cm,床体积为88mL,平衡及洗脱液均为含0.1mol/mL NaCl的0.1mol/mL PBS(pH7.4),收集第一峰,第二峰主要是游离的F(ab)2’;
6)F(ab)2’-SM(PEG)4桥联产物中游离桥联载体的除去:
用ConA-Affi-Gel柱,层析柱为67*1.3cm,床体积为88mL,平衡及洗脱液均为含0.1mol/mL NaCl的0.1mol/mL PBS(pH7.4),收集第一峰,第二峰主要是游离的SM(PEG)4桥联载体;
本步骤S12涉及G-25层析步骤时,均可以透析法替代之;
S13.磁性微球的活化和包被:
1)取一定量的磁性微球,按每毫克磁性微球加入0.5mg的DCC,然后加入DMF溶液使磁性微球的浓度为20mg/mL,置于在38℃水浴锅中并振摇或者机械搅拌2小时;
2)活化好的纳米磁性微球溶液去除上清液,然后加入pH 9.5的碳酸盐缓冲液,使其浓度达到20mg/mL(以纳米磁性微球计);再以每毫克磁性微球100μg的量添加F(ab)2’-SM(PEG)4桥联产物,然后置于室温震摇反应2小时;磁性分离,用洗液(0.5%BSA溶液)清洗固体三遍,得到包被好F(ab)2’-SM(PEG)4桥联产物的磁性微球,即本发明所述检测剂;将该获得的检测剂加入磷酸盐缓冲液中,使其浓度为1mg/mL,备用。
实施例2
本实施例提供了一种桥连有抗体的磁性微球复合制剂及其制备方法。其中,桥连有抗体的磁性微球复合制剂结构如图1所述,其包括纳米磁性微球1、SM(PEG)4桥联载体2和抗AFP的Fab’抗体3形成的纳米磁性微球1-SM(PEG)4桥联载体2-抗AFP的Fab’抗体3。
桥连有抗体的磁性微球复合制剂制备方法包括如下步骤:
S21.抗AFP单克隆抗体的Fab’片段的酶切处理:
参照实施例1中S11酶切处理处理,不同之处是酶切获得抗AFP的Fab’抗体;
S22.SPDP定点连接工艺制备Fab’-SM(PEG)4桥联载体偶联物:
1)用SPDP处理Fab’:参照实施例1中S12中1)用SPDP处理F(ab)2’方法,不同在于用AFP酶切单抗(Fab’)替代AFP酶切单抗(F(ab)2’),获得Fab’-PDP;
2)Fab’-PDP的还原:参照实施例1中S12中2)方法,不同在于用Fab’-PDP替代F(ab)2’–PDP;
3)用SPDP处理SM(PEG)4桥联载体:参照实施例1中S12中3)方法;
4)Fab’-SH与SM(PEG)4桥联载体-PDP的偶联:参照实施例1中S12中4)方法,不同在于用Fab’-SH替代F(ab)2’-SH;
5)Fab’-SM(PEG)4桥联载体产物中游离Fab’的除去:参照实施例1中S12中5)方法;
6)Fab’-SM(PEG)4桥联产物中游离桥联载体的除去:参照实施例1中S12中6)方法;
本步骤S22涉及G-25层析步骤时,均可以透析法替代之;
S23.磁性微球的活化和包被:
1)磁性微球的活化参照实施例1中S13中1)方法;
2)磁性微球的包被参照实施例1中S13中2)方法,不同在于用Fab’-SM(PEG)4桥联产物替代F(ab)2’-SM(PEG)4桥联产物,得到包被好Fab’-SM(PEG)4桥联产物的磁性微球。
实施例3
本实施例提供了一种桥连有抗体的磁性微球复合制剂及其制备方法。其中,桥连有抗体的磁性微球复合制剂结构如图1所述,其包括纳米磁性微球1、SM(PEG)12桥联载体2和抗AFP的F(ab)2’抗体3形成的纳米磁性微球1-SM(PEG)12桥联载体2-抗AFP的F(ab)2’抗体3。
桥连有抗体的磁性微球复合制剂制备方法包括如下步骤:
S31.抗AFP单克隆抗体的F(ab)2’片段的酶切处理:
参照实施例1中S11酶切处理处理,
S32.SPDP定点连接工艺制备Fab’-SM(PEG)12桥联载体偶联物:
1)用SPDP处理F(ab)2’:参照实施例1中S12中1)用SPDP处理F(ab)2’方法;
2)F(ab)2’-PDP的还原:参照实施例1中S12中2)方法;
3)用SPDP处理SM(PEG)12桥联载体:参照实施例1中S12中3)方法;不同在于用SM(PEG)12桥联载体替代SM(PEG)4桥联载体;
4)F(ab)2’-SH与SM(PEG)12桥联载体-PDP的偶联:参照实施例1中S12中4)方法,不同在于用SM(PEG)12桥联载体-PDP替代SM(PEG)4桥联载体-PDP;
5)F(ab)2’-SM(PEG)12桥联载体产物中游离F(ab)2’的除去:参照实施例1中S12中5)方法;
6)F(ab)2’-SM(PEG)12桥联产物中游离桥联载体的除去:参照实施例1中S22中6)方法;
本步骤S32涉及G-25层析步骤时,均可以透析法替代之;
S33.磁性微球的活化和包被:
1)磁性微球的活化参照实施例1中S13中1)方法;
2)磁性微球的包被参照实施例1中S13中2)方法,不同在于用F(ab)2’-SM(PEG)12桥联产物替代F(ab)2’-SM(PEG)4桥联产物,得到包被好F(ab)2’-SM(PEG)12桥联产物的磁性微球。
实施例4
本实施例提供了一种桥连有抗体的磁性微球复合制剂及其制备方法。其中,桥连有抗体的磁性微球复合制剂结构如图1所述,其包括纳米磁性微球1、SM(PEG)4桥联载体2和抗AFP的F(ab)2’抗体3形成的纳米磁性微球1-SM(PEG)4桥联载体2-抗AFP的F(ab)2’抗体3。
桥连有抗体的磁性微球复合制剂制备方法包括如下步骤:
S41.抗AFP单克隆抗体的F(ab)2’片段的酶切处理:
参照实施例1中S11酶切处理处理,
S42.SMPT定点连接工艺制备F(ab)2’-SM(PEG)4桥联载体偶联物:
1)用SMPT处理F(ab)2’:参照实施例1中S12中1)用SPDP处理F(ab)2’方法,不同在于用SMPT替代SPDP;
2)F(ab)2’-PDP的还原:取上述F(ab)2’-PDP溶液,加入β-巯基乙醇,使其终浓度达到25mmol/mL,在23℃-25℃环境温度下反应30min,不断搅拌;反应结束后,过Sphadex G-25柱,平衡及洗脱液均为含0.1mol/mL NaCl的0.1mol/mL PBS(pH7.4),收集并得到反应产物:F(ab)2’-SH;
3)用SMPT处理SM(PEG)4桥联载体:取5mg SM(PEG)4桥联载体,溶于0.5mL0.1mol/mLPBS(pH7.4)中,迅速滴入一定量SMPT液(溶于无水乙醇),在23℃-25℃环境温度下反应30min,同时低速搅拌;反应结束后,将反应液通过Sphadex G-25柱以除去多余SMPT及副产物,平衡及洗脱液均为含0.1mol/mL NaCl的0.1mol/mL醋酸盐缓冲液(pH7.4),收集并得到反应产物:桥联载体-PDP;
4)F(ab)2’-SH与SM(PEG)4桥联载体-PDP的偶联:参照实施例1中S12中4)方法;
5)F(ab)2’-SM(PEG)12桥联载体产物中游离F(ab)2’的除去:参照实施例1中S12中5)方法;
6)F(ab)2’-SM(PEG)12桥联产物中游离桥联载体的除去:参照实施例1中S22中6)方法;
本步骤S42涉及G-25层析步骤时,均可以透析法替代之;
S43.磁性微球的活化和包被:
1)取一定量的磁球,按每毫克磁球加入0.5mg的EDC,然后加入磷酸盐缓冲液使磁球的浓度为20mg/mL,置于在38℃水浴锅中并振摇或者机械搅拌2小时。
2)磁性微球的包被参照实施例1中S13中2)方法。
AFP-L3分离检测剂实施例
实施例5
本实施例提供了一种AFP-L3分离检测剂,其包括如下组分:
实施例1提供的桥连有抗体的磁性微球复合制剂和发光标记物标记扁豆凝集素,且两组分是被分开封装。
其中,所述发光标记物标记扁豆凝集素按照如下方法制备获得:
取1mg扁豆凝集素,用0.1mol/L碳酸盐缓冲液(pH9.5)将其体积调至1mL,然后放入透析袋中,并置于pH9.5碳酸盐缓冲液中透析1小时;取出透析好的扁豆凝集素,加入100μgABEI-半琥珀酰胺酸-NHS,室温震摇1.5小时;安装好G-25凝胶柱,用纯化水洗脱干净后,再用pH值7.4的PBS缓冲液进行平衡洗脱;G-25凝胶柱平衡洗脱完毕后,将标记好ABEI的扁豆凝集素过柱纯化,然后收集出现峰值的蛋白溶液;将收集好的蛋白溶液,加入等体积的含5%的BSA的保护液,加入稀释液稀释至0.15μg/mL。
实施例6
本实施例提供了一种AFP-L3分离检测剂,其包括如下组分:
实施例2提供的桥连有抗体的磁性微球复合制剂和发光标记物标记扁豆凝集素,且两组分是被分开封装。
其中,所述发光标记物标记扁豆凝集素按照实施例5中发光标记物标记扁豆凝集素制备。
实施例7
本实施例提供了一种AFP-L3分离检测剂,其包括如下组分:
实施例1提供的桥连有抗体的磁性微球复合制剂和发光标记物标记刀豆凝集素,且两组分是被分开封装。
其中,所述发光标记物标记刀豆凝集素按照如何发放制备获得:
取1mg刀豆凝集素,用0.1mol/L碳酸盐缓冲液(pH9.5)将其体积调至1mL,然后放入透析袋中,并置于pH9.5碳酸盐缓冲液中透析1小时;取出透析好的刀豆凝集素,加入100μgABEI-半琥珀酰胺酸-NHS,室温震摇1.5小时;安装好G-25凝胶柱,用纯化水洗脱干净后,再用pH值7.4的PBS缓冲液进行平衡洗脱。G-25凝胶柱平衡洗脱完毕后,将标记好ABEI的刀豆凝集素过柱纯化,然后收集出现峰值的蛋白溶液;将收集好的蛋白溶液,加入等体积的含5%的BSA的保护液,加入稀释液稀释至0.15μg/mL。
实施例8
本实施例提供了一种AFP-L3分离检测剂,其包括如下组分:
实施例3提供的桥连有抗体的磁性微球复合制剂和发光标记物标记扁豆凝集素,且两组分是被分开封装。
其中,所述发光标记物标记扁豆凝集素按照实施例5中发光标记物标记扁豆凝集素制备。
实施例9
本实施例提供了一种AFP-L3分离检测剂,其包括如下组分:
实施例4提供的桥连有抗体的磁性微球复合制剂和发光标记物标记扁豆凝集素,且两组分是被分开封装。
其中,所述发光标记物标记扁豆凝集素按照实施例5中发光标记物标记扁豆凝集素制备。
AFP-L3分离检测试剂盒实施例
实施例10
本实施例提供了一种AFP-L3分离检测试剂盒,其包括如下组分:
a.实施例5提供的AFP-L3分离检测剂:
实施例1提供桥连有抗体的磁性微球复合制剂,其中,SM(PEG)4桥联载体-F(ab)2’的浓度10μg/mL,磁性微球浓度:1mg/mL
发光标记物标记扁豆凝集素,其中ABEI浓度:250ng/mL,扁豆凝集素的浓度:5000ng/mL
b.低浓度校准品浓度:15.625IU/mL;
c.高浓度校准品,浓度:500.000IU/mL;
d.Buffer缓冲液:Tris-HCl缓冲液pH 7.5,含1mM氯化钙,1mM氯化镁,1mM氯化锰。
实施例11
本实施例提供了一种AFP-L3分离检测试剂盒,其包括如下组分:
a.实施例6提供的AFP-L3分离检测剂:
实施例2提供桥连有抗体的磁性微球复合制剂,其中,SM(PEG)4桥联载体-Fab’的浓度10μg/mL,磁性微球浓度:1mg/mL
发光标记物标记扁豆凝集素,其中ABEI浓度:250ng/mL,扁豆凝集素的浓度:5000ng/mL
b.低浓度校准品浓度:15.625IU/mL;
c.高浓度校准品,浓度:500.000IU/mL;
d.Buffer缓冲液:Tris-HCl缓冲液pH 7.5,含1mM氯化钙,1mM氯化镁,1mM氯化锰。
实施例12
本实施例提供了一种AFP-L3分离检测试剂盒,其包括如下组分:
a.实施例7提供的AFP-L3分离检测剂:
实施例1提供桥连有抗体的磁性微球复合制剂,其中,SM(PEG)4桥联载体-F(ab)2’的浓度10μg/mL,磁性微球浓度:1mg/mL
发光标记物标记刀豆凝集素,其中ABEI浓度:250ng/mL,刀豆凝集素的浓度:5000ng/mL
b.低浓度校准品浓度:15.625IU/mL;
c.高浓度校准品,浓度:500.000IU/mL;
d.Buffer缓冲液:Tris-HCl缓冲液pH 7.5,含1mM氯化钙,1mM氯化镁,1mM氯化锰。
实施例13
本实施例提供了一种AFP-L3分离检测试剂盒,其包括如下组分:
a.实施例8提供的AFP-L3分离检测剂:
实施例3提供桥连有抗体的磁性微球复合制剂,其中,SM(PEG)12桥联载体-F(ab)2’的浓度10μg/mL,磁性微球浓度:1mg/mL
发光标记物标记扁豆凝集素,其中ABEI浓度:250ng/mL,扁豆凝集素的浓度:5000ng/mL
b.低浓度校准品,浓度:15.625IU/mL;
c.高浓度校准品,浓度:500.000IU/mL;
d.Buffer缓冲液:Tris-HCl缓冲液pH 7.5,含1mM氯化钙,1mM氯化镁,1mM氯化锰。
实施例14
本实施例提供了一种AFP-L3分离检测试剂盒,其包括如下组分:
a.实施例9提供的AFP-L3分离检测剂:
实施例4提供桥连有抗体的磁性微球复合制剂,其中,SM(PEG)4桥联载体-F(ab)2’的浓度10μg/mL,磁性微球浓度:1mg/mL
发光标记物标记扁豆凝集素,其中ABEI浓度:250ng/mL,扁豆凝集素的浓度:5000ng/mL
b.低浓度校准品浓度:15.625IU/mL;
c.高浓度校准品,浓度:500.000IU/mL;
d.Buffer缓冲液:Tris-HCl缓冲液pH 7.5,含1mM氯化钙,1mM氯化镁,1mM氯化锰。
对比例1
本对比例1提供了一种AFP-L3化学发光免疫分析试剂和试剂盒。
1.其AFP-L3化学发光免疫分析试剂,包括磁性微球-抗甲胎蛋白抗体复合物和发光标记物标记扁豆凝集素。
其中,磁性微球-抗甲胎蛋白抗体复合物的制备方法为:
1)磁球活化:取一定量的磁球,按每毫克磁球加入0.5mg的DCC,然后加入DMF溶液使磁球的浓度为20mg/mL,置于在38℃水浴锅中并振摇或者机械搅拌2小时;
2)磁球的包被:活化好的纳米磁球溶液去除上清液,然后加入pH9.5的碳酸盐缓冲液,使其浓度达到20mg/mL(以纳米磁球计);再以每毫克磁球10μg的量添加抗甲胎蛋白抗体,然后置于室温震摇反应2小时。磁性分离,用洗液(0.5%BSA溶液)清洗固体三遍,得到包被好抗甲胎蛋白抗体的磁球。将该获得的检测剂加入磷酸盐缓冲液中,使其浓度为1mg/mL,备用。
发光标记物标记扁豆凝集素制备方法为:
取1mg扁豆凝集素,用0.1mol/L碳酸盐缓冲液(pH9.5)将其体积调至1mL,然后放入透析袋中,并置于pH9.5碳酸盐缓冲液中透析1小时。取出透析好的扁豆凝集素,加入100μgABEI-半琥珀酰胺酸-NHS,室温震摇1.5小时。安装好G-25凝胶柱,用纯化水洗脱干净后,再用pH值7.4的PBS缓冲液进行平衡洗脱。G-25凝胶柱平衡洗脱完毕后,将标记好ABEI的扁豆凝集素过柱纯化,然后收集出现峰值的蛋白溶液。将收集好的蛋白溶液,加入等体积的含5%的BSA的保护液,加入稀释液稀释至0.15μg/mL。
2.AFP-L3化学发光免疫分析试剂盒包括如下制剂:
a.磁性微球-抗甲胎蛋白抗体复合物溶液,其中,抗甲胎蛋白抗体的浓度10μg/mL,磁性微球浓度:1mg/mL;
b.低浓度校准品浓度:15.625IU/mL;
c.高浓度校准品,浓度:500.000IU/mL;
d.ABEI发光标记物标记的扁豆凝集素;其中,发光物浓度:250ng/mL,扁豆凝集素的浓度:5000ng/mL;
e.Buffer缓冲液:Tris-HCl缓冲液pH 7.5,含1mM氯化钙,1mM氯化镁,1mM氯化锰。
对比例2
本对比例2提供了一种AFP-L3化学发光免疫分析试剂和试剂盒。
1.其AFP-L3化学发光免疫分析试剂,包括扁豆凝集素磁球和发光标记物标记抗甲胎蛋白抗体。
其中,扁豆凝集素磁球的制备方法为:
1)磁球活化:取一定量的磁球,按每毫克磁球加入0.5mg的DCC,然后加入DMF溶液使磁球的浓度为20mg/mL,置于在38℃水浴锅中并振摇或者机械搅拌2小时。
2)磁球的包被:活化好的纳米磁球溶液去除上清液,然后加入pH9.5的碳酸盐缓冲液,使其浓度达到20mg/mL(以纳米磁球计);再以每毫克磁球10μg的量添加扁豆凝集素,然后置于室温震摇反应2小时。磁性分离,用洗液(0.5%BSA溶液)清洗固体三遍,得到包被好扁豆凝集素的磁球。将该获得的检测剂加入磷酸盐缓冲液中,使其浓度为1mg/mL,备用。
发光标记物标记抗甲胎蛋白抗体制备方法为:
取1mg扁豆凝集素,用0.1mol/L碳酸盐缓冲液(pH9.5)将其体积调至1mL,然后放入透析袋中,并置于pH9.5碳酸盐缓冲液中透析1小时。取出透析好的抗甲胎蛋白抗体,加入100μg ABEI-半琥珀酰胺酸-NHS,室温震摇1.5小时;安装好G-25凝胶柱,用纯化水洗脱干净后,再用pH值7.4的PBS缓冲液进行平衡洗脱。G-25凝胶柱平衡洗脱完毕后,将标记好ABEI的抗甲胎蛋白抗体过柱纯化,然后收集出现峰值的蛋白溶液。将收集好的蛋白溶液,加入等体积的含5%的BSA的保护液,加入稀释液稀释至0.15μg/mL。
2.AFP-L3化学发光免疫分析试剂盒包括如下制剂:
a.磁性微球-扁豆凝集素复合物溶液;其中,扁豆凝集素的浓度10μg/mL,磁性微球浓度:1mg/mL;
b.低浓度校准品浓度:15.625IU/mL;
c.高浓度校准品,浓度:500.000IU/mL;
d.发光标记物标记的抗甲胎蛋白抗体;其中,发光物浓度:250ng/mL,抗甲胎蛋白抗体的浓度:5000ng/mL;
e.Buffer缓冲液:Tris-HCl缓冲液pH 7.5,含1mM氯化钙,1mM氯化镁,1mM氯化锰。
实验方法、数据和结果分析
以上述实施例10-14提供的AFP-L3分离检测试剂盒和对比例1提供的AFP-L3分离检测试剂盒为基础,按照上文具体实施方式部分中所述的AFP-L3分离检测系统,按照如下检测方法对血清样本中AFP-L3进行分离检测。
1.实施例10-14提供的AFP-L3分离检测试剂盒和对比例1提供的AFP-L3分离检测试剂盒为基础的AFP-L3分离检测方法如下:
1)十点标准曲线的配制:
将AFP-L3企业校准品用0.02M PBS缓冲液将其稀释至1000.000IU/mL,将1000.000IU/mL的中间品依次梯度稀释,分别得到十点曲线的浓度点,通过2点定标校正曲线计算得到工作曲线。
2)AFP-L3化学发光免疫分析方法:
分别利用上述实施例10-14提供的AFP-L3分离检测试剂盒和对比例1提供的AFP-L3分离检测试剂盒,在Maglumi 2000Plus仪器上检测,检测步骤包括:
a.将20μL血清待测样本、高低浓度校准品加入到反应杯中;
b.加入20μL试剂盒中桥连有抗体的磁性微球复合制剂溶液;
c.加入100μL Buffer缓冲液;
d.37℃温育15min,置于磁环境下清洗3次;
e.加入200μL试剂盒中发光标记物标记凝集素;
f.37℃温育15min,置于磁环境下清洗3次;
g.加入发光底物(主要包括NaOH和H2O2),检测光信号强度;
h.通过校准品修正后的工作曲线可根据样本检测光强度自动计算得出待测样本的AFP-L3浓度。
2.以上述对比例2提供的AFP-L3分离检测试剂盒为基础,按照如下检测方法对血清样本中AFP-L3进行分离检测:
1)十点标准曲线的配制
将AFP-L3企业校准品用0.02M PBS缓冲液将其稀释至1000.000IU/mL,将1000.000IU/mL的中间品依次梯度稀释,分别得到十点曲线的浓度点,通过2点定标校正曲线计算得到工作曲线。
2)以对比例2中试剂盒为基础的AFP-L3化学发光免疫分析方法:
利用对比例2中试剂盒,在Maglumi 2000Plus仪器上检测,检测步骤包括:
a.将20μL血清待测样本、高低浓度校准品加入到反应杯中;
b.加入20μL试剂盒中磁性微球-扁豆凝集素复合物溶液;
c.加入100μL Buffer缓冲液;
d.37℃温育15min,置于磁环境下清洗3次;
e.加入200μL试剂盒中发光标记物标记的抗甲胎蛋白抗体;
f.37℃温育15min,置于磁环境下清洗3次;
g.加入发光底物(主要包括NaOH和H2O2),检测光信号强度;
h.通过校准品修正后的工作曲线可根据样本检测光强度自动计算得出待测样本的AFP-L3浓度。
3.临床实验:
AFP-L3化学发光免疫分析试剂盒对肝癌、肝硬化、肝炎样本以及正常人样本的检测与应用
为了验证上述实施例10-14提供的AFP-L3分离检测试剂盒和对比例1、对比例2提供的AFP-L3分离检测试剂盒与临床阳性样本检测结果的情况,在合作医院收集了115例已确诊为原发性肝癌的样本,105例肝硬化样本,125例肝炎样本,以及200例正常人样本,采用上述上述实施例10-14提供的AFP-L3分离检测试剂盒和对比例1、对比例2提供的AFP-L3分离检测试剂盒和AFP-L3分离检测方法分别定量检测样本中AFP-L3的含量,同时采用新产业生物医学工程股份有限公司生产的甲胎蛋白试剂盒(化学发光法)定量测定样本中的总AFP的含量,通过计算AFP-L3/AFP%,来判定阳性比例。其中,对比例2的试剂盒是按照上述对比例2所用的检测方法进行检测。
4.检测结果和分析
按照上述方法检测结果如下表1所示。由表1中数据可知:
实施例10提供的试剂盒对于原发性肝癌的阳性检出率高达95%,对于肝硬化和肝炎的检测特异性较高,分别为97%和98%,对于正常人的特异性为100%;
实施例11提供的试剂盒所测得结果要稍低于实施例10的结果,说明酶切抗体后,F(ab)2’片段的活性与效价要高于Fab片段;
实施例12提供的试剂盒所测得的结果要低于实施例11的结果,说明刀豆凝集素与AFP-L3的结合特异性要稍弱于扁豆凝集素与AFP-L3的结合效价;
实施例13提供的试剂盒所测得的结果要低于实施例11的结果,说明酶切抗体与磁性微球之间的桥联载体SM(PEG)n的链长因链过长而可能形成了交错扭曲,反而影响了抗体与抗原之间的特异性结合;
实施例14提供的试剂盒所测得的结果要低于实施例11的结果,说明实施例5中SMPT作为交联剂和β-巯基乙醇作为还原剂,其偶联效率要低于实施例1中SPDP作为交联剂和DTT作为还原剂时的偶联效率。
实施例11与对比例1的结果比较可以得出,抗体未做酶切处理,会造成凝集素与抗体Fc片段发生非特异结合,从而造成背景的升高,假阳性的出现以及空间位阻的发生,亲和力的下降,造成特异性的下降。
实施例11与对比例2的结果比较可以得出,凝集素包被磁球先与样本中的AFP-L3结合过程中,会导致凝集素与样本中其他杂质发生非特异结合从而降低了与目标抗原的结合效率,增大了非特异结合的背景干扰,导致出现大范围的漏检和假阳性情况的出现。
因此,通过上述实施例10-14试剂盒的测试结果表明,虽然抗体不同活性有所差别,凝集素的种类与AFP-L3的结合特异性有差异,桥联载体的链长影响了抗体与抗原之间的特异性结合,但是,本发明实施例提供的试剂盒均表现出优异的特异性,准确性,能够有效避免凝集素与抗体Fc片段发生非特异结合或者与待测样本中其他杂质发生非特异结合而导致特异性的下降、漏检和假阳性等不良现象发生。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (16)
1.一种桥连有抗体的磁性微球复合制剂,包括磁性微球,其特征在于,还包括:
抗AFP抗体,所述抗AFP抗体的Fc片段被切除;
桥连载体,所述桥连载体包被所述磁性微球和偶联所述抗AFP抗体。
2.根据权利要求1所述的磁性微球复合制剂,其特征在于:所述桥连载体为N-羟基琥珀酰亚胺-(聚乙二醇)n-马来酰亚胺基团,其中,n为4-24。
3.根据权利要求1所述的磁性微球复合制剂,其特征在于:所述磁性微球与桥连载体的质量比为(50-200):1;
所述桥连载体与所述抗AFP抗体摩尔比为1:1。
4.根据权利要求1-3任一所述的磁性微球复合制剂,其特征在于:所述抗AFP抗体所保留的能够与抗原识别的抗体片段为F(ab)2’片段、Fab片段、Fab’片段中的至少一种;和/或
所述桥连载体偶联在所述抗AFP抗体的切除所述Fc片段酶切部位。
5.一种桥连有抗体的磁性微球复合制剂的制备方法,包括如下步骤:
将抗AFP抗体中抗体Fc片段切除并分离,得到能够与抗原识别的含抗体片段的抗体;
在所述抗体上偶联桥联载体,形成抗体-桥联载体偶联物;
将所述抗体-桥联载体偶联物包被磁性微球,得到权利要求1-4任一所述的桥连有抗体的磁性微球复合制剂。
6.根据权利要求5所述的制备方法,其特征在于:在所述抗体上偶联桥联载体的方法包括如下步骤:
将所述抗体与异形双功能交联剂进行交联反应,生成抗体-酰亚胺酯;
将所述抗体-酰亚胺酯经还原剂还原处理,生成抗体-SH;
将异形双功能交联剂与桥联载体化合物进行交联反应,生成桥联载体-酰亚胺酯;
将所述抗体-SH与所述桥联载体-酰亚胺酯进行偶联反应,生成所述抗体-桥联载体偶联物。
7.根据权利要求5所述的制备方法,其特征在于:在所述抗体上偶联桥联载体的方法包括如下步骤:
将桥联载体化合物与异形双功能交联剂进行交联反应,生成桥联载体-酰亚胺酯;
将所述桥联载体-酰亚胺酯经还原剂还原处理,生成桥联载体-SH;
将异形双功能交联剂与所述抗体进行交联反应,生成所述抗体-酰亚胺酯;
将所述桥联载体-SH与所述抗体-酰亚胺酯进行偶联反应,生成所述抗体-桥联载体偶联物。
8.根据权利要求6或7所述的制备方法,其特征在于:所述异形双功能交联剂选用3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯、琥珀酰亚胺基-6-[α-甲基-α-(2-吡啶基二硫)甲苯酰胺基]己酯、N-[κ-马来酰亚胺十一酰氧]-琥珀酰亚胺酯中的任一种或两种以上的混合物;和/或
所述桥联载体化合物为马来酰亚胺-聚乙二醇聚合物;和/或
所述还原剂选用二硫苏糖醇、β-巯基乙醇、三(2-羧乙基)膦、十二烷基硫酸钠中的任一种或两种以上的混合物。
9.根据权利要求5-7任一所述的制备方法,其特征在于:所述抗体含的所述抗体片段为F(ab)2’片段、Fab片段、Fab’片段中的至少一种;和/或
切除所述抗体Fc片段的方法是采用酶切处理除去,且所述酶切处理所用的酶选用胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、无花果蛋白酶中的任一种,且所述抗AFP抗体与所述酶的质量比例为(10-40):1。
10.根据权利要求5-7任一所述的制备方法,其特征在于:所述包被处理过程中,所述抗体-桥联载体偶联物与所述磁性微球的质量比例为(50-200):1;和/或
所述磁性微球为被活化处理,所述活化处理所用的活化剂选用N,N'-二异丙基碳二亚胺、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺、二环己基碳二亚胺中的任一种或两种的混合物。
11.一种AFP-L3分离检测剂,包括如下组分:
桥连有抗体的磁性微球复合制剂,所述桥连有抗体的磁性微球复合制剂为权利要求1-4任一所述的桥连有抗体的磁性微球复合制剂或由权利要求5-10任一所述的制备方法制备的桥连有抗体的磁性微球复合制剂;
发光标记物标记的凝集素。
12.根据权利要求11所述的AFP-L3分离检测剂,其特征在于:所述凝集素为扁豆凝集素、小兵豆凝集素、刀豆凝集素中的至少一种;和/或
发光标记物选用鲁米诺、异鲁米诺及其衍生物、吖啶酯及其衍生物,1,2-二氧杂环丁烷及其衍生物中的任一种。
13.一种AFP-L3分离检测试剂盒,包括权利要求11-12任一所述的AFP-L3分离检测剂。
14.根据权利要求13所述的试剂盒,其特征在于:还包括校准样品、缓冲液中的至少一种;和/或
所述桥连有抗体的磁性微球复合制剂中的所述桥连载体偶联抗AFP抗体的浓度为5μg/mL-20μg/mL,所述磁性微球的浓度为0.5mg/mL-2mg/mL;
发光标记物标记的凝集素中的所述发光标记物浓度:250ng/mL-1000ng/mL,所述凝集素的浓度:500ng/mL-5000ng/mL。
15.一种AFP-L3分离检测系统,其特征在于,包括:
权利要求11-12任一项所述的AFP-L3分离检测剂或权利要求13-14任一所述的试剂盒;
磁分离模块,与所述分离桥连有抗体的磁性微球复合制剂和发光标记物标记的凝集素配合,用于自液体中分离磁性微球,完成对包括AFP-L3的分离;
检测模块,与磁分离模块分离的磁性微球和激发底物配合,用于完成对包括AFP-L3含量的检测;
数据处理模块,用于计算所述AFP-L3的含量。
16.一种权利要求1-4任一所述桥连有抗体的磁性微球复合制剂或权利要求11-12任一项所述的AFP-L3分离检测剂或权利要求13-14任一所述的试剂盒或权利要求15所述的AFP-L3分离检测系统在分离检测AFP-L3中的应用。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201710040715.3A CN108333361A (zh) | 2017-01-19 | 2017-01-19 | 桥连有抗体的磁性微球复合制剂及其制备方法与应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201710040715.3A CN108333361A (zh) | 2017-01-19 | 2017-01-19 | 桥连有抗体的磁性微球复合制剂及其制备方法与应用 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN108333361A true CN108333361A (zh) | 2018-07-27 |
Family
ID=62922822
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201710040715.3A Pending CN108333361A (zh) | 2017-01-19 | 2017-01-19 | 桥连有抗体的磁性微球复合制剂及其制备方法与应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN108333361A (zh) |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN110922476A (zh) * | 2019-12-16 | 2020-03-27 | 蓝怡科技集团股份有限公司 | 一种生物素偶联抗体及其制备方法和应用 |
CN111273027A (zh) * | 2020-02-24 | 2020-06-12 | 安徽医科大学 | 一种用于检测肝癌血清糖链的spdp修饰凝集素芯片及其制备与应用 |
CN112763703A (zh) * | 2020-12-31 | 2021-05-07 | 深圳天深医疗器械有限公司 | 一种免疫磁珠及其制备方法和应用 |
Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20040144649A1 (en) * | 2001-04-04 | 2004-07-29 | Tomohisa Kawabata | Electrophoresis |
CN1773286A (zh) * | 2005-10-09 | 2006-05-17 | 北京微龙阵列生物技术有限公司 | 凝集素竞争法肝癌甲胎蛋白异质体afp-l3定量检测试剂盒 |
CN103293293A (zh) * | 2013-06-24 | 2013-09-11 | 浙江大学 | 用于无标记癌胚抗原检测的电化学免疫传感器的制备方法 |
CN104714026A (zh) * | 2014-12-31 | 2015-06-17 | 北京热景生物技术有限公司 | 一种甲胎蛋白异质体的分离检测组合物、系统及其应用 |
US20150197549A1 (en) * | 2012-07-17 | 2015-07-16 | Daniel J. Capon | Affinity support and method for trapping substance using the same |
CN105785043A (zh) * | 2016-04-06 | 2016-07-20 | 上海良润生物医药科技有限公司 | 用于定量检测afp-l3%的试剂盒 |
-
2017
- 2017-01-19 CN CN201710040715.3A patent/CN108333361A/zh active Pending
Patent Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20040144649A1 (en) * | 2001-04-04 | 2004-07-29 | Tomohisa Kawabata | Electrophoresis |
CN1773286A (zh) * | 2005-10-09 | 2006-05-17 | 北京微龙阵列生物技术有限公司 | 凝集素竞争法肝癌甲胎蛋白异质体afp-l3定量检测试剂盒 |
US20150197549A1 (en) * | 2012-07-17 | 2015-07-16 | Daniel J. Capon | Affinity support and method for trapping substance using the same |
CN103293293A (zh) * | 2013-06-24 | 2013-09-11 | 浙江大学 | 用于无标记癌胚抗原检测的电化学免疫传感器的制备方法 |
CN104714026A (zh) * | 2014-12-31 | 2015-06-17 | 北京热景生物技术有限公司 | 一种甲胎蛋白异质体的分离检测组合物、系统及其应用 |
CN105785043A (zh) * | 2016-04-06 | 2016-07-20 | 上海良润生物医药科技有限公司 | 用于定量检测afp-l3%的试剂盒 |
Non-Patent Citations (8)
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN110922476A (zh) * | 2019-12-16 | 2020-03-27 | 蓝怡科技集团股份有限公司 | 一种生物素偶联抗体及其制备方法和应用 |
CN111273027A (zh) * | 2020-02-24 | 2020-06-12 | 安徽医科大学 | 一种用于检测肝癌血清糖链的spdp修饰凝集素芯片及其制备与应用 |
CN111273027B (zh) * | 2020-02-24 | 2023-03-28 | 安徽医科大学 | 一种用于检测肝癌血清糖链的spdp修饰凝集素芯片及其制备与应用 |
CN112763703A (zh) * | 2020-12-31 | 2021-05-07 | 深圳天深医疗器械有限公司 | 一种免疫磁珠及其制备方法和应用 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN102759631B (zh) | 一种定量检测降钙素原pct的胶乳增强免疫比浊试剂盒 | |
CN100420947C (zh) | 用单一捕获剂定量检测特异性分析物的方法及其试剂盒 | |
JPH05504841A (ja) | リガンドレセプター及びリガンドのコンプレックスに対する抗体及びリガンド―レセプターアッセーでのそれらの用途 | |
CN108333361A (zh) | 桥连有抗体的磁性微球复合制剂及其制备方法与应用 | |
JP4197180B2 (ja) | 検体中の内分泌物質測定方法 | |
KR960029789A (ko) | 생체내 물질의 면역학적 분석용 키트 및 면역학적 분석 방법 | |
CN108139392A (zh) | Pivka-ii的测定方法及pivka-ii免疫测定试剂或试剂盒的制造方法 | |
KR100394940B1 (ko) | 간 질환 진단을 위한 혈중 아사이알로당단백질양의측정방법 및 측정용 킷트 | |
JP2517187B2 (ja) | アナライト変異体分析 | |
CN108333346A (zh) | dsDNA免疫磁性微球体系、其制备方法和应用以及保存液 | |
CN205193076U (zh) | 一种生物素-亲和素系统快速检测卡 | |
CN107843734A (zh) | 一种性激素结合球蛋白的磁微粒化学发光检测试剂盒及制备方法 | |
CN109425598A (zh) | 一种毛细自驱动微流控芯片及其制备方法与应用 | |
JP2004132892A (ja) | 免疫クロマト測定法及びキット | |
CN104198692B (zh) | 一种混合标记物质和标记方法及其应用 | |
CN114354525B (zh) | 一种α-银环蛇毒素检测探针、一种非诊断目的检测α-银环蛇毒素的方法 | |
JP3360174B2 (ja) | 酵素等を抗体等に結合させるホモバイファンクショナル試薬 | |
CN102621301B (zh) | 一种基于硝酸纤维素膜的蛋白芯片封闭液的制备方法 | |
JP5516945B2 (ja) | エクオール定量定性デバイス、エクオール定量定性キットおよびエクオール定量方法 | |
JPS63315953A (ja) | 血中または体液中の微量物質含有量の測定法 | |
CN108267576A (zh) | 经修饰的ccp抗原及其用途和抗ccp抗体检测试剂盒及其制造方法 | |
CN103229057B (zh) | 用于信号放大的方法和试剂 | |
CN1464307A (zh) | 镶嵌式高通量三维立体生物检测技术及试剂盒 | |
JP2010122002A (ja) | 抗体の検出方法及び該方法に用いられる試薬キット | |
EP1406089A1 (en) | A method for selectively staining water soluble protein using reactive dye |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20180727 |
|
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |