CN112986566A - 一种识别丝织品的桑蚕单克隆抗体的胶体金标记方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及文物检测领域，公开了一种识别丝织品的桑蚕单克隆抗体的胶体金标记方法，包括：1）取超声后分散均匀的胶体金8‑12ml，调节pH为8.0~9.0；2）取桑蚕单克隆抗体用PBS缓冲液稀释；3）将胶体金滴加至桑蚕单克隆抗体溶液中搅拌；4）添加BSA进行蛋白的封闭，搅拌；5）添加PEG‑20000，搅拌；6）将标记好的胶体金离心，弃上清液；7）沉淀物用含BSA、叠氮钠的PBS溶液重悬，做防腐处理，冷藏备用。本发明方法能有效解决胶体金在标记过程中因为结合比浓度问题导致死金沉淀的问题。
Description
技术领域
本发明涉及文物检测领域，尤其涉及一种识别丝织品的桑蚕单克隆抗体的胶体金标记方法。
背景技术
丝绸，是古代中华文明的重要组成部分，为后世传达着各个历史阶段重要的政治、经济和文化信息。中国自古以来就是丝绸之国，中国的丝织品闻名世界。近年来，越来越多的丝织品被发掘出土，对这些丝织品文物进行分析鉴定，可为追溯丝绸的起源和传播提供重要信息。而通过胶体金免疫层析技术可以在考古现场对文物进行快速检测，具有广阔的应用前景。
由于静电作用，金颗粒之间相互排斥而悬浮成为一种稳定的胶体状态，形成带负电的疏水胶溶液，故称胶体金。胶体金具有高电子密度，能与多种生物大分子结合，已成为继荧光素、放射性同位素和酶之后，在免疫标记技术中较常用的一种非放射性示踪剂。胶体金的粒径一般在1~100nm之间，能够均匀、稳定地分散在液体中，呈球形小颗粒或椭圆形大颗粒。胶体金颗粒最外层可以吸附大量的正离子，能够均匀分散在溶液中。由于胶体金表面呈负电性，能够与表面带正电荷的抗原、抗体通过静电作用进行标记。但是不同的抗体的最适pH以及标记浓度都不同，在结合过程中操作不当胶体金会有死金沉淀标记不完全等现象。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种识别丝织品的桑蚕单克隆抗体的胶体金标记方法，本发明方法能有效解决胶体金在标记过程中因为结合比浓度问题导致死金沉淀的问题。
本发明的具体技术方案为：一种识别丝织品的桑蚕单克隆抗体的胶体金标记方法，包括以下步骤：
1）取超声后分散均匀的胶体金8-12ml，加入碳酸钾溶液调节pH为8.0~9.0；
加入碳酸钾调节pH至桑蚕单克隆抗体与胶体金结合的最佳pH，增加结合成功率。
2）取桑蚕单克隆抗体用pH=8的PBS缓冲液稀释至浓度为10~20ug/ml；
3）将步骤1）所得胶体金以25-35滴/min的速度滴加至步骤2）所得桑蚕单克隆抗体溶液中，室温匀速搅拌45~60min；
将调好pH的胶体金以上述速度滴加进稀释后的桑蚕单克隆抗体溶液中，可有效防止胶体金在标记过程中浓度过高发生死金沉淀等现象。
4）向步骤3）所得溶液中添加BSA至其终浓度为0.3-0.5wt%，进行蛋白的封闭，继续搅拌8-12min；
BSA作为保护稳定剂，增加桑蚕单克隆抗体与胶体金结合的稳定性。
5）向步骤4）所得溶液中添加PEG-20000至其终浓度为0.15-0.25wt%，继续搅拌8-12min；
PEG-20000可以有效的抑制纳米粒子的聚集，进而使得纳米粒子可以很好的分散开。
6）将步骤5）所得标记好的胶体金在12000~15000rpm下离心15~30min，弃上清液；
7）沉淀物用含0.8-1.2wt%BSA、0.03-0.05wt%叠氮钠的0.01mol/L的PBS溶液重悬，做防腐处理，冷藏备用。
作为优选，步骤1）中，调节pH为8.2。
此pH下胶体金与桑蚕单克隆抗体的标记成功率增加。
作为优选，步骤2）中，稀释至浓度为20 ug/ml。
桑蚕单克隆抗体稀释最佳浓度为20ug/ml，可以与胶体金高效结合，不会因为抗体浓度过高导致标记率低，也不会因为抗体浓度过低导致胶体金死金沉淀。
作为优选，步骤3）中，室温匀速搅拌60min。
作为优选，步骤6）中，在12000r/min下离心30 min。
与现有技术对比，本发明的有益效果是：本发明方法能有效解决胶体金在标记过程中因为结合比浓度问题导致死金沉淀的问题。
附图标记
图1为本申请实施例1-3的胶体金显色图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的描述。
实施例1
1） 取超声后分散均匀的胶体金约10ml，加入0.1mol/L的碳酸钾溶液调节pH为8.0。
2） 取桑蚕单克隆抗体用0.01mol/L的PBS缓冲液（pH=8.0）稀释至浓度为15ug/ml。
3） 将调好pH的胶体金以30滴/min的速度滴加进稀释后的桑蚕单克隆抗体溶液中，室温匀速搅拌45min。
4） 加入浓度10%的BSA至其终浓度为0.4%，此步骤进行蛋白的封闭。继续搅拌10min。
5） 加入浓度10%的PEG-20000至终浓度为0.2%，继续搅拌10min。
6） 将标记好的胶体金在12000rpm下离心15min，弃上清液。
7） 沉淀物用0.01mol/L的PBS（1%BSA，0.04%叠氮钠）重悬，做防腐处理，保存在4℃备用。
实施例2
1） 取超声后分散均匀的胶体金约10ml，加入0.1mol/L的碳酸钾溶液调节pH为8.8。
2） 取桑蚕单克隆抗体用0.01mol/L的PBS缓冲液（pH=8.0）稀释至浓度为10ug/ml。
3） 将调好pH的胶体金以30滴/min的速度滴加进稀释后的桑蚕单克隆抗体溶液中，室温匀速搅拌60min。
4） 加入浓度10%的BSA至其终浓度为0.4%，此步骤进行蛋白的封闭。继续搅拌10min。
5） 加入浓度10%的PEG-20000至终浓度为0.2%，继续搅拌10min。
6） 将标记好的胶体金在15000rpm下离心30min，弃上清液。
7） 沉淀物用0.01mol/L的PBS（1%BSA，0.04%叠氮钠）重悬，做防腐处理，保存在4℃备用。
实施例3
1） 取超声后分散均匀的胶体金约10ml，加入0.1mol/L的碳酸钾溶液调节pH为8.2。
2） 取桑蚕单克隆抗体用0.01mol/L的PBS缓冲液（pH=8.0）稀释至浓度为20ug/ml。
3） 将调好pH的胶体金以30滴/min的速度滴加进稀释后的桑蚕单克隆抗体溶液中，室温匀速搅拌60min。
4） 加入浓度10%的BSA至其终浓度为0.4%，此步骤进行蛋白的封闭。继续搅拌10min。
5） 加入浓度10%的PEG-20000至终浓度为0.2%，继续搅拌10min。
6） 将标记好的胶体金在12000rpm下离心30min，弃上清液。
沉淀物用0.01mol/L的PBS（1%BSA，0.04%叠氮钠）重悬，做防腐处理，保存在4℃备用。
图1为本申请实施例的胶体金显色图，其中由左至右1-7列依次为依次标记为1-7，其中1-4列为胶体金与抗体标记失败，死金，呈现灰紫色沉淀；5-7列分别为实施例1-3，胶体金标记抗体成功呈现为粉红色。
本发明中所用原料、设备，若无特别说明，均为本领域的常用原料、设备；本发明中所用方法，若无特别说明，均为本领域的常规方法。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变换，均仍属于本发明技术方案的保护范围。
Claims (5)
1.一种识别丝织品的桑蚕单克隆抗体的胶体金标记方法，其特征在于包括以下步骤：
1）取超声后分散均匀的胶体金8-12ml，加入碳酸钾溶液调节pH为8.0~9.0；
2）取桑蚕单克隆抗体用pH=8的PBS缓冲液稀释至浓度为10~20ug/ml；
3）将步骤1）所得胶体金以25-35滴/min的速度滴加至步骤2）所得桑蚕单克隆抗体溶液中，室温匀速搅拌45~60min；
4）向步骤3）所得溶液中添加BSA至其终浓度为0.3-0.5wt%，进行蛋白的封闭，继续搅拌8-12min；
5）向步骤4）所得溶液中添加PEG-20000至其终浓度为0.15-0.25wt%，继续搅拌8-12min；
6）将步骤5）所得标记好的胶体金在12000~15000rpm下离心15~30min，弃上清液；
7）沉淀物用含0.8-1.2wt%BSA、0.03-0.05wt%叠氮钠的0.01mol/L的PBS溶液重悬，做防腐处理，冷藏备用。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1）中，调节pH为8.2。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2）中，稀释至浓度为20 ug/ml。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3）中，室温匀速搅拌60min。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤6）中，在12000r/min下离心30 min。
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