CN113740526A - 一种改性封闭剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种改性封闭剂及其制备方法，属于医疗产品和技术领域，包含如下重量份的原料：5‑15份羊血清蛋白、0‑5份卵清蛋白、1‑6份明胶、20‑50份修饰剂、30‑80份改性剂、50‑100份硫酸软骨素。本发明得到的改性封闭剂表面的具有均匀电荷，是用于封闭使用时，具有良好的封闭效果，且使试剂具有更好的分散性，减少蛋白间的团聚情况；提高了试剂的稳定性和保存时间。
Description
技术领域
本发明属于医疗产品和技术领域，具体涉及一种改性封闭剂及其制备方法。
背景技术
免疫比浊分析是将液相内的沉淀反应与现代光学仪器和自动分析技术相结合的一项分析技术，当抗体浓度固定时，形成的免疫复合物的量随着检样中抗原量的增加而增加，反应液的浊度也随之增加，通过测定反应液的浊度与一系列标准品对照，即可计算出检样中抗原的含量。该技术已经在医学检验方面得到广泛应用。
固相吸附蛋白是非特异性的，在包被目的免疫蛋白后，未吸附蛋白的固相表面仍然有吸附其它蛋白的能力，为了保障抗原抗体反应的特异性，因此，包被剩余的固相表面应该用抗原抗体反应无关蛋白封闭。目前常用的封闭剂有牛血清白蛋白(BSA)、酪蛋白、脱脂奶粉、明胶等蛋白溶液，此类封闭剂在进行封闭时，多以非特异性吸附的方式对固相载体空白位点进行封闭，以占据的方式阻止标记物与固相载体的空白位点进行结合。但目前很多液体试剂仍存在封闭不完全、影响灵敏度的问题，同时封闭不完全的试剂在临床中出现假阳性或者假阴性以及稳定性不好的问题。因此，先需研发一种封闭效果良好的改性封闭剂。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供一种改性封闭剂及其制备方法，得到的改性封闭剂表面的具有均匀电荷，是用于封闭使用时，具有良好的封闭效果，且使试剂具有更好的分散性，减少蛋白间团聚情况。
一种改性封闭剂，包含如下重量份的原料：5-15份羊血清蛋白、0-5份卵清蛋白、1-6份明胶、20-50份修饰剂、30-80份改性剂、50-100份硫酸软骨素。
进一步地，改性封闭剂包含如下重量份的原料：8-10份羊血清蛋白、1-3份卵清蛋白、2-5份明胶、30-45份修饰剂、50-70份改性剂、60-90份硫酸软骨素。
进一步地，所述改性剂为对十二烷基苯磺酰叠氮、二硫丁二钠按照任意比例的组合；所述修饰剂为半胱氨酸脱硫酶、生物素按照任意比例的组合。
进一步地，所述改性剂为对十二烷基苯磺酰叠氮、二硫丁二钠按照1-3:1的质量比例的组合。
进一步地，所述修饰剂为半胱氨酸脱硫酶、生物素按照1:1-5的质量比例的组合。
本发明提供所述改性封闭剂的制备方法，包括如下步骤：
(1)向羊血清蛋白、卵清蛋白中加入水稀释，再向其中加入明胶搅拌混合均匀，得到蛋白液；
(2)向蛋白液中加入修饰剂混合均匀，然后置于温度35-37℃下搅拌反应10-15min，得到修饰蛋白液，向修饰蛋白液中加入改性剂，继续于温度35-37℃下搅拌反应10-15min，得到改性蛋白液，将所述改性蛋白液离心分离出改性蛋白；
(3)将所述改性蛋白与硫酸软骨素混合均匀，即得到改性封闭剂。
进一步地，步骤(1)中加入水至羊血清蛋白质量浓度为1-2％。
本发明提供所述改性封闭剂的应用，将所述改性封闭剂用其质量5-15倍的水稀释后使用即可。
本发明具有以下有益效果：
1.本发明的封闭剂经过修饰剂、改性剂处理后，得到的改性封闭剂表面的具有均匀电荷，是用于封闭使用时，具有良好的封闭效果，且使试剂具有更好的分散性，减少蛋白间团聚情况。
2.本发明采用羊血清蛋白、卵清蛋白、明胶共同作为封闭剂的主体材料，其中的卵清蛋白含有二硫键和巯基，能够使封闭剂表面的具有均匀电荷，具有更好的分散性，减少蛋白间团聚。
3.本发明的改性剂中含有一定的叠氮基和硫基，与蛋白结合，可使其表面的电荷分别更加均匀，用于封闭剂使用时，使试剂具有更高的稳定性；添加的修饰剂可使试剂进一步提高稳定性；本发明还添加了硫酸软骨素，进一步提高了所述试剂的稳定性和保存时间。
具体实施方式
以下结合具体实施实例进一步详细描述本发明，但本发明的应用并不限于此。本发明如下使用原料均购自化学、生物试剂原料公司，可直接使用。
实施例1
一种改性封闭剂，包含如下重量份的原料：15份羊血清蛋白、5份卵清蛋白、6份明胶、50份修饰剂、80份改性剂、100份硫酸软骨素；所述改性剂为对十二烷基苯磺酰叠氮、二硫丁二钠按照4:1的质量比例的组合；所述修饰剂为半胱氨酸脱硫酶、生物素按照1:7的质量比例的组合；
(1)向羊血清蛋白、卵清蛋白中加入水稀释，再向其中加入明胶搅拌混合均匀，得到蛋白液；
(2)向蛋白液中加入修饰剂混合均匀，然后置于温度37℃下搅拌反应15min，得到修饰蛋白液，向修饰蛋白液中加入改性剂，继续于温度37℃下搅拌反应15min，得到改性蛋白液，将所述改性蛋白液离心分离出改性蛋白；
(3)将所述改性蛋白与硫酸软骨素混合均匀，即得到改性封闭剂。
实施例2
一种改性封闭剂，包含如下重量份的原料：5份羊血清蛋白、1份明胶、20份修饰剂、30份改性剂、50份硫酸软骨素；所述改性剂为对十二烷基苯磺酰叠氮、二硫丁二钠按照1:5的质量比例的组合；所述修饰剂为半胱氨酸脱硫酶、生物素按照10:1的质量比例的组合；
(1)向羊血清蛋白、卵清蛋白中加入水稀释，再向其中加入明胶搅拌混合均匀，得到蛋白液；
(2)向蛋白液中加入修饰剂混合均匀，然后置于温度36℃下搅拌反应12min，得到修饰蛋白液，向修饰蛋白液中加入改性剂，继续于温度36℃下搅拌反应12min，得到改性蛋白液，将所述改性蛋白液离心分离出改性蛋白；
(3)将所述改性蛋白与硫酸软骨素混合均匀，即得到改性封闭剂。
实施例3
一种改性封闭剂，包含如下重量份的原料：8份羊血清蛋白、1份卵清蛋白、2份明胶、30份修饰剂、50份改性剂、60份硫酸软骨素；所述改性剂为对十二烷基苯磺酰叠氮、二硫丁二钠按照2:1的质量比例的组合；所述修饰剂为半胱氨酸脱硫酶、生物素按照1:4的质量比例的组合；
(1)向羊血清蛋白、卵清蛋白中加入水稀释，再向其中加入明胶搅拌混合均匀，得到蛋白液；
(2)向蛋白液中加入修饰剂混合均匀，然后置于温度37℃下搅拌反应10min，得到修饰蛋白液，向修饰蛋白液中加入改性剂，继续于温度37℃下搅拌反应10min，得到改性蛋白液，将所述改性蛋白液离心分离出改性蛋白；
(3)将所述改性蛋白与硫酸软骨素混合均匀，即得到改性封闭剂。
实施例4
一种改性封闭剂，包含如下重量份的原料：10份羊血清蛋白、3份卵清蛋白、5份明胶、45份修饰剂、70份改性剂、90份硫酸软骨素；所述改性剂为对十二烷基苯磺酰叠氮、二硫丁二钠按照3:1的质量比例的组合；所述修饰剂为半胱氨酸脱硫酶、生物素按照1:1的质量比例的组合；
(1)向羊血清蛋白、卵清蛋白中加入水稀释，再向其中加入明胶搅拌混合均匀，得到蛋白液；
(2)向蛋白液中加入修饰剂混合均匀，然后置于温度35℃下搅拌反应15min，得到修饰蛋白液，向修饰蛋白液中加入改性剂，继续于温度35℃下搅拌反应15min，得到改性蛋白液，将所述改性蛋白液离心分离出改性蛋白；
(3)将所述改性蛋白与硫酸软骨素混合均匀，即得到改性封闭剂。
实施例5
一种改性封闭剂，包含如下重量份的原料：9份羊血清蛋白、2份卵清蛋白、3份明胶、40份修饰剂、60份改性剂、80份硫酸软骨素；所述改性剂为对十二烷基苯磺酰叠氮、二硫丁二钠按照1:1的质量比例的组合；所述修饰剂为半胱氨酸脱硫酶、生物素按照1:5的质量比例的组合；
(1)向羊血清蛋白、卵清蛋白中加入水稀释，再向其中加入明胶搅拌混合均匀，得到蛋白液；
(2)向蛋白液中加入修饰剂混合均匀，然后置于温度37℃下搅拌反应10min，得到修饰蛋白液，向修饰蛋白液中加入改性剂，继续于温度37℃下搅拌反应15min，得到改性蛋白液，将所述改性蛋白液离心分离出改性蛋白；
(3)将所述改性蛋白与硫酸软骨素混合均匀，即得到改性封闭剂。
对比例1：封闭剂为羊血清蛋白。
对比例2：封闭剂包含羊血清蛋白、实施例5改性剂，制备方法与实施例5一致。
应用实施例：
应用方法：以本公司CRP试剂盒为例，在试剂制备过程中，分别加入实施例1-5、对比例1-2的封闭剂(封闭剂分别用其质量10倍的水稀释后使用)，检测其封闭效果；
具体的检测方法如下：
1、检测试剂的加速稳定性，考察在规定时间内试剂测值的波动情况，将加入实施例1-5、对比例1-2封闭剂的CRP试剂，储存条件置于37℃，分别在第0天至第7天后各取出，测试CRP质控品，然后对靶值进行稳定性分析。
2、检测试剂的灵敏度(LOB)，考察封闭剂的加入对试剂灵敏度的影响。
(1)加速稳定性结果如表1-表7所示。
表1
由表1方差分析数据可得，加入实施例1封闭剂的CRP试剂加速7天，p＝0.704，p＞0.05，所以趋势不显著，即加入实施例1封闭剂的CRP试剂在37℃下储存7天，其检测结果的变化趋势不显著，处于稳定状态。
表2
由表2方差分析数据可得，加入实施例2封闭剂的CRP试剂加速7天，p＝0.275，p＞0.05，所以趋势不显著，即加入实施例2封闭剂的CRP试剂在37℃下储存7天，其检测结果的变化趋势不显著，处于稳定状态。
表3
由表3方差分析数据可得，加入实施例3封闭剂的CRP试剂加速7天，p＝0.384，p＞0.05，所以趋势不显著，即加入实施例3封闭剂的CRP试剂在37℃下储存7天，其检测结果的变化趋势不显著，处于稳定状态。
表4
由表4方差分析数据可得，加入实施例4封闭剂的CRP试剂加速7天，p＝0.812，p＞0.05，所以趋势不显著，即加入实施例4封闭剂的CRP试剂在37℃下储存7天，其检测结果的变化趋势不显著，处于稳定状态。
表5
由表5方差分析数据可得，加入实施例5封闭剂的CRP试剂加速7天，p＝0.416，p＞0.05，所以趋势不显著，即加入实施例5封闭剂的CRP试剂在37℃下储存7天，其检测结果的变化趋势不显著，处于稳定状态。
表6
由表6方差分析数据可得，加入对比例1封闭剂的CRP试剂加速7天，出现明显的降幅(降幅达到50％左右)，p＜0.05，即加入对比例1封闭剂的CRP试剂在37℃下储存7天，其检测结果的变化趋势显著，试剂处于非常不稳定的状态。
表7
由表7方差分析数据可得，加入对比例2封闭剂的CRP试剂加速7天，也出现了降幅(降幅达到20％左右)，p＜0.05，即加入对比例2封闭剂的CRP试剂在37℃下储存7天，其检测结果的变化趋势显著，试剂处于不稳定的状态。与对比1封闭剂的CRP试剂相比，对比例2稳定性更好，说明改性剂对试剂稳定性影响很大。
(2)检测试剂的空白限LOB
表8
由表8空白限LOB的检测结果可知，实施例1、实施例2、实施例3、实施例4、实施例5的试剂的LOB都在0.15mg/L以下，对比例1试剂的LOB达到1.58mg/L，说明对比例1试剂的灵敏度达不到0.15mg/L，而对比例2达到0.91mg/L，相对于对比例1，对比例2在加入改性剂，可以有效的降低试剂的信噪比与空白限。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明做任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化，均落入本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种改性封闭剂，其特征在于，包含如下重量份的原料：5-15份羊血清蛋白、0-5份卵清蛋白、1-6份明胶、20-50份修饰剂、30-80份改性剂、50-100份硫酸软骨素。
2.根据权利要求1所述改性封闭剂，其特征在于，包含如下重量份的原料：8-10份羊血清蛋白、1-3份卵清蛋白、2-5份明胶、30-45份修饰剂、50-70份改性剂、60-90份硫酸软骨素。
3.根据权利要求1或2所述改性封闭剂，其特征在于，所述改性剂为对十二烷基苯磺酰叠氮、二硫丁二钠按照任意比例的组合；所述修饰剂为半胱氨酸脱硫酶、生物素按照任意比例的组合。
4.根据权利要求3所述改性封闭剂，其特征在于，所述改性剂为对十二烷基苯磺酰叠氮、二硫丁二钠按照1-3:1的质量比例的组合。
5.根据权利要求3所述改性封闭剂，其特征在于，所述修饰剂为半胱氨酸脱硫酶、生物素按照1:1-5的质量比例的组合。
6.一种如权利要求1-5所述改性封闭剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)向羊血清蛋白、卵清蛋白中加入水稀释，再向其中加入明胶搅拌混合均匀，得到蛋白液；
(2)向蛋白液中加入修饰剂混合均匀，然后置于温度35-37℃下搅拌反应10-15min，得到修饰蛋白液，向修饰蛋白液中加入改性剂，继续于温度35-37℃下搅拌反应10-15min，得到改性蛋白液，将所述改性蛋白液离心分离出改性蛋白；
(3)将所述改性蛋白与硫酸软骨素混合均匀，即得到改性封闭剂。
7.根据权利要求6所述改性封闭剂的制备方法，其特征在于，步骤(1)中加入水至羊血清蛋白质量浓度为1-2％。
8.一种如权利要求1-5所述改性封闭剂的应用，其特征在于，将所述改性封闭剂用其质量5-15倍的水稀释后使用即可。
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