CN116786834B - 一种大粒径胶体金及其制备方法和应用 - Google Patents

一种大粒径胶体金及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种大粒径胶体金及其制备方法和应用，属于免疫层析检测技术领域。本发明提供的胶体金的制备方法，包括如下步骤：将水加热至90～100℃，然后加入氯金酸，在搅拌转速为500rpm±50rpm条件下加入聚乙烯醇和柠檬酸三钠，得到所述胶体金。本发明在还原法的理论基础上，采用三种组合试剂制备的胶体金粒径大(90～100nm)，分散性好且稳定；该方法制备的胶体金标记简单、速度快；适合于产业化；本发明的标记方法封闭采用卵清蛋白和明胶的双重试剂，使得制备的胶体金标记抗体具有更好的特异性；适用于全血、血清或血浆中的病原微生物的检测。

Description

一种大粒径胶体金及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及免疫层析检测技术领域，具体涉及的是一种大粒径胶体金及其制备方法和应用。
背景技术
胶体金(Colloidal Gold)又称金溶胶(Gold Solution)，胶体金颗粒的结构包括一个金核和外层包围的双离子层，即内层负离子AuCl2-紧密围绕在金核表面和外层正离子H+分散于胶体金溶液中，呈现良好的单分散状态。
胶体金免疫层析法(colloidal gold immunochromatographic assay，GICA)是一种以微孔滤膜为载体的，将胶体金标记和蛋白质层析相结合的固相膜免疫分析技术。胶体金标记抗体时，它们之间的作用力主要有三种：静电相互作用、疏水相互作用和金硫键共用电子对。其中静电相互作用占主导地位，即：该标记是大分子物质(如蛋白质等)被吸附到金纳米粒子表面的过程，理论上来说是金纳米粒子表面的负电荷与蛋白质的正电荷基团通过静电相互作用牢固结合。胶体金纳米粒子在透射电镜或电子显微镜下呈现黑色或者褐色不透明颗粒，当将其作为信号载体用于免疫学检测时，会发现其特异性识别并聚集于配体处，产生有色信号，从而可以进行各种大分子或小分子的免疫学检测和监控。胶体金免疫层析技术作为一种快速诊断技术，具有微量、特异、简便等特点，非常适合基层现场快速检测。
目前，国内外胶体金免疫层析试纸条在检测领域的运用是非常广泛的。如：在食品安全检测领域，毒品检测领域，传染病检测领域，优生优育检测领域及炎症、癌症等检测领域。
金溶胶是通过用还原剂煮沸四氯金酸溶液而产生的。使用不同种类和剂量的还原剂去还原不同浓度的氯金酸溶液可以合成不同粒径和形态的胶体金纳米粒子，即胶体金纳米颗粒的粒径可以通过改变还原剂的种类、含量和底物浓度进行调节。研究报道，常用的还原剂有柠檬酸三钠、硼氢化钠、抗坏血酸、鞣酸、白磷、对苯二酚、羟胺等。目前还原剂还原法制备的胶体金的粒径一般在10～40nm，粒径较小。
2001年Jana N R,Gearheart L报道种子法合成大粒径胶体金，其是通过控制种子、还原剂和氯金酸的加入比例，从而控制所合成胶体金的粒径大小在种子生长法合成胶体金的过程中，层层生长相比一次生长能够更有效地避免二次成核的可能性，该法与原有的直接还原法合成的胶体金相比粒径均一、形状近似球形且单分散性良好。但是，这类方法合成的胶体金方法较为复杂，不容易产业化。而且种子法制备的胶体金的粒径在60～80nm间。
现有技术中报道的其它的如与二氧化硅衍生结合、与聚丙烯酰胺等衍生结合制备的复合微球其粒径在100nm～300nm之间，但是该类合成方法较为复杂，且后继的标记方法也较复杂，不适合产业化。利用对苯二酚、油胺一类的衍生化羧基或氨基的大粒径胶体金的方法，其合成过程复杂，且反应过程中可能产生有害副产物，更不利于产业化用于免疫层析检测试纸条。
发明内容
本发明解决的技术问题是制备粒径大、分散性好和/或稳定的大粒径胶体金。
为了解决以上技术问题，本发明提供了大粒径胶体金及其制备方法和应用。
本发明在还原法的理论基础上，采用三种组合试剂制备的胶体金粒径大(90～100nm)，分散性好且稳定；该方法制备的胶体金标记简单、速度快；适合于产业化。
本发明所提供的胶体金的制备方法，包括如下步骤：
将水加热至90～100℃，然后加入氯金酸(四氯金酸)，在搅拌转速为500rpm±50rpm的条件下加入聚乙烯醇和柠檬酸三钠，得到所述胶体金。
上述制备方法中，每1L水中，所述氯金酸的加入量为0.2g；所述聚乙烯醇的加入量为0.75～1g；所述柠檬酸三钠的加入量为0.12～0.20g。
具体的，每1L水中，所述聚乙烯醇的加入量为0.75g或1g；所述柠檬酸三钠的加入量为0.15～0.17g；更具体可为0.15295～0.161g、0.15295g或0.161g；
上述的制备方法中，所述水分为上下两部分，下半部分加热到95～100℃，上半部分加热至90～95℃时，加入所述氯金酸。
上述的制备方法中，所述制备方法还包括在加入聚乙烯醇和柠檬酸三钠后，继续在搅拌转速为500rpm±50rpm的条件下搅拌6～8min的步骤；
所述加入聚乙烯醇和柠檬酸三钠后继续搅拌的温度为：下半部分液体温度为95～100℃，上半部分液体温度为90～95℃。
上述的制备方法中，所述氯金酸、聚乙烯醇和柠檬酸三钠以水溶液的形式加入；
更为具体的，所述氯金酸的水溶液的浓度为0.2g/mL；所述聚乙烯醇的水溶液的浓度为1g/mL；所述柠檬酸三钠的水溶液的浓度为0.161g/mL；
所述聚乙烯醇和柠檬酸三钠的加入时间相差不超过10秒。
上述的制备方法中，所述制备方法中所用水均为超纯水；
搅拌结束后停止加热，并冷却至室温得到所述胶体金。
所述室温为本领域技术人员公知，一般为15～35℃。
上述的制备方法中，加入氯金酸后在搅拌转速为500rpm±50rpm的条件下搅拌30s～120s后再加入聚乙烯醇和柠檬酸三钠。
上述的制备方法中，所述胶体金的粒径为90～100nm；更具体可为单一粒径的颗粒；如胶体金的粒径可为92nm或100nm。
本发明还提供了上述制备方法制备得到的胶体金。
本发明还提供了一种产品，其为含有所述胶体金的试剂盒或含有所述胶体金的免疫层析试纸。
上述的产品中，含有所述胶体金的试剂盒或含有所述胶体金的免疫层析试纸按照包括如下步骤的方法制备：用所述胶体金标记抗体得到胶体金标记抗体，所述标记采用卵清蛋白和明胶进行封闭。
具体的，每1mL胶体金中，所述卵清蛋白的加入量为2.4mg～5.0mg，所述明胶的加入量为3～6mg。
上述的胶体金或含有所述胶体金的免疫层析试纸在制备检测病原微生物试剂盒中的应用。
上述的应用中，所述试剂盒用于检测全血、血清或血浆中的病原微生物。
上述的应用中，所述病原微生物为登革热病毒。
本发明具有如下有益效果：
(1)本发明的方法制备的胶体金其密度大于现有技术制备的胶体金；主要体现在用紫外分光光度计法测定的OD值的大小；
(2)本发明的制备方法简单，制备的胶体金粒径大(90～100nm)，分散性好且稳定；大粒径的胶体金能够较大的提高免疫层析试纸条的灵敏度；
(3)本发明的方法制备得到的胶体金标记简单、速度快；适合于产业化；
(4)本发明的标记方法封闭采用卵清蛋白和明胶的双重试剂，使得制备的胶体金标记抗体具有更好的特异性；适用于全血、血清或血浆中的病原微生物的检测；
(5)采用本发明的方法制备的胶体金及标记方法制备的登革热病毒抗原检测试剂盒具有较好的灵敏度和特异性。
附图说明
图1为实施例1制备的胶体金的可见紫外分光光度图谱。
图2为实施例2制备的胶体金的可见紫外分光光度图谱。
图3为对比例1制备的胶体金的可见紫外分光光度图谱。
图4为放置不同时间的胶体金的稳定性图片；其中，1号为实施例2制备；2号为对比例1制备。
图5为对比例2制备的胶体金的可见紫外分光光度图谱。
图6为对比例3制备的胶体金的可见紫外分光光度图谱。
图7为实际切割的试纸条。
图8为试纸条示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
如背景技术所述，现有技术中报道的胶体金的制备方法难以制备出产业化用于免疫层析检测试纸条的胶体金，本发明在还原法的理论基础上，采用三种组合试剂并控制聚乙烯醇(PVA)和柠檬酸三钠的加入量以及加入时机、搅拌转速等，制备得到了分散性好、稳定性好的大粒径胶体金(90～100nm)；该方法制备的胶体金标记简单、速度快；适合于产业化；本发明的标记方法封闭采用卵清蛋白和明胶的双重试剂，使得制备的胶体金标记抗体具有很好的特异性；适用于全血、血清或血浆中的病原微生物的检测；制备的试剂盒对于登革热病毒具有较好的检测灵敏度和特异性。
本发明提供的胶体金的制备方法，包括如下步骤：将水加热至90～100℃，然后加入氯金酸，在搅拌转速为500rpm+50rpm的条件下加入聚乙烯醇和柠檬酸三钠，得到所述胶体金。
在一些实施例中，每1L水中，所述氯金酸的加入量为0.2g；所述聚乙烯醇的加入量为0.75～1g；所述柠檬酸三钠的加入量为0.12～0.20g；
具体的，每1L水中，所述聚乙烯醇的加入量为0.75g或1g；所述柠檬酸三钠的加入量为0.15～0.17g；更具体可为0.15295～0.161g、0.15295g或0.161g。
在一些实施例中，所述水分为上下两部分，下半部分加热到95～100℃，上半部分加热至90～95℃时，加入所述氯金酸。
在一些实施例中，所述氯金酸、聚乙烯醇和柠檬酸三钠以水溶液的形式加入；
具体的，所述氯金酸的水溶液的浓度为0.2g/mL；所述聚乙烯醇的水溶液的浓度为1g/mL；所述柠檬酸三钠的水溶液的浓度为0.161g/mL；
本发明的所述制备方法中所用水均为超纯水；
在一些实施例中，所述制备方法还包括在加入聚乙烯醇和柠檬酸三钠后，继续在搅拌转速为500rpm±50rpm的条件下搅拌6～8min的步骤；
本发明的方法中，所述聚乙烯醇和柠檬酸三钠的加入时间相差不超过10秒。
本发明的方法制备得到的胶体金的粒径为90～100nm。
登革病毒(Dengue virus,DENV)是一类主要由蚊虫所传播的，能导致人类感染登革热的黄病毒。DENV目前有5种血清型，当前主要流行的为DENV-1,2,3,4四种血清型，并且与其他黄病毒存在着交叉免疫反应。感染DENV后常见症状有高烧、头痛、呕吐、肌肉和关节痛以及皮疹，登革热的恢复周期一般为2到7天。此外，个别病例会发展为登革出血热以及登革休克综合征。
2009年，世界卫生组织将登革热分为两类：轻症和严重，登革出血热进一步细分为I-IV级：Ⅰ级是发烧的人只出现容易擦伤或止血带测试阳性，Ⅱ级是出现皮肤和其他地方的自发性出血，Ⅲ级是临床休克，Ⅳ级是严重到无法检测到血压和脉搏的休克；III级和IV级被称为DSS。登革热病毒主要通过伊蚊传播，特别是埃及伊蚊。此外，登革热还由感染者的血液制品和捐献的器官进行传染。据报道，登革热会通过怀孕或分娩期间进行垂直传播，甚至性传播也有报道。从2000年到2019年，世卫组织统计的登革热病例数量增加了8倍，从505,430例增加到了420万例；2000年到2015年间登革热造成的死亡人数也从960例增加了4032例。在2021年孟加拉国登革热发病人数接近3万人，其中就有101人死亡，同年登革热疫情在印度也造成了超10万人感染和上百人死。NS1是早期建立的用于检测登革热的生物标志物，也是目前诊断的重要靶标，因其具有高度保守的48kDa糖蛋白，NS1蛋白是参与DENV感染发病的重要蛋白之一；并且它从感染开始后的第一天就可被检测到，从而用作感染的重要诊断生物标志物，而IgM通常在4～6天后被检测到。目前国内使用的DENV NS1检测试剂以胶体金试纸条为主，且主要为Bio-Rad、InBios、Panbio、Abbott等进口品牌，而受制于原料供应、产品灵敏度方面的原因，国内目前产品相对较少。进口检测试纸条价格昂贵、产品供应易受国际环境影响，因此，开发具有高灵敏度的胶体金检测试纸条是非常有必要的。
采用本发明的方法制备的胶体金制备的登革热病毒抗原检测试剂盒比常规方法制备的胶体金的试剂盒具有更高的灵敏度。采用卵清蛋白(OVA)和明胶联合进行封闭的标记方法标记的抗体具有较好的灵敏度和特异性。与常规的方法如用BSA或PEG进行封闭的标记方法相比，本发明的试剂盒对登革热病毒的检测具有更好的特异性。
下述实施例中的阴性血清为来自未感染登革热病毒的人的血清，阳性血清为来自感染登革热病毒的人的血清。
实施例1
1、胶体金的制备
(1)按照0.2g/mL的量称取四氯金酸于刻度管内，然后加入超纯水；配制5mL的氯金酸水溶液。
(2)按照0.161g/mL的量称取柠檬酸三钠于刻度管内，然后加入超纯水；配制5mL柠檬酸三钠水溶液。
(3)按照1g/mL的量称取聚乙烯醇(PVA)于刻度管内，然后加入超纯水；配制10mLPVA水溶液。
(4)将2升的三角烧瓶放置在有加热功能的磁力搅拌器上，向三角烧瓶内加入1L的超纯水，并打开磁力搅拌器，并加热。
待三角烧瓶的液体的下半部分温度加热到95～100℃，液体的上半部分温度加热到90～95℃时，加入1mL上述制备的氯金酸水溶液到三角烧瓶内；将搅拌器(上海越众仪器设备有限公司，型号：ZNCL-BS)的速度设置到最大转速(550rpm)。此时，三角烧瓶内的水溶液呈现黄色。
加入后计时，保持上述温度并在550rpm的转速下继续搅拌60s，迅速加入上述制备的PVA水溶液1mL。
然后迅速加入柠檬酸三钠水溶液1mL。保持上述温度并在550rpm的转速下继续搅拌6分钟，停止加热；此时三角烧瓶内的水溶液，先是紫黑色，然后变成紫色，最后变成深酒红色，立即停止加热。将反应完成的溶液，转移到另外的磁力搅拌器上，并用水浴进行冷却至室温。
上述PVA水溶液的加入时间和柠檬酸三钠水溶液的加入时间几乎同时进行。两者加入的时间相差不能超过10秒；否则无法制备出粒径圆润且分散度好的胶体金溶液。
2、检测
待制备的胶体金溶液冷却后，取1mL的溶液，然后用微量紫外分光光度计(Nanodrop型)扫描200nm～800nm波段光谱。本实施例制备的胶体金溶液在557nm处有最大吸收峰，且OD值为1.32，无杂峰(见图1)；即本实施例制备的胶体金为粒径100nm的胶体金。
实施例2
1、胶体金的制备
(1)氯金酸水溶液、柠檬酸三钠水溶液、PVA水溶液的制备与实施例1相同。
(2)将2升的三角烧瓶放置在有加热功能的磁力搅拌器上，向三角烧瓶内加入1L的超纯水。并打开磁力搅拌器，并加热。
待三角烧瓶的底层液体温度加热到95～100℃，上层液体温度加热到90～95℃时，加入1mL上述制备的氯金酸水溶液到三角烧瓶内；将搅拌器的速度设置到最大转速(550rpm)。此时，三角烧瓶内的水溶液呈现黄色。
加入后计时，保持上述温度并在550rpm的转速下继续搅拌60s，迅速加入上述制备的PVA水溶液0.75mL。
然后迅速加入柠檬酸三钠水溶液0.95mL。保持上述温度并在550rpm的转速下继续搅拌8分钟，停止加热；此时三角烧瓶内的水溶液，先是紫黑色，然后变成紫色，最后变成深酒红色，立即停止加热。将反应完成的溶液，转移到另外的磁力搅拌器上，并用水浴进行冷却至室温。
上述PVA水溶液的加入时间和柠檬酸三钠水溶液的加入时间几乎同时进行。两者加入的时间相差不能超过10秒。否则无法制备出粒径圆润且分散度好的胶体金溶液。
2、检测
待制备的胶体金溶液冷却后，取1mL的溶液，然后用微量紫外分光光度计(Nanodrop型)扫描200nm～800nm波段光谱。本实施例制备的胶体金溶液在554nm处有最大吸收峰，且OD值为1.38，无杂峰(见图2)；即本实施例制备的胶体金为粒径92nm的胶体金。
对比例1、常规方法制备胶体金
(1)配制0.01％(即每100mL水0.01g氯金酸)的氯金酸水溶液；
(2)配制1％(即每100mL水1g柠檬酸三钠)柠檬酸三钠水溶液；
(3)将上述配制的1L氯金酸水溶液置于三角烧瓶内，放置在磁力搅拌器上加热到100℃并搅拌，且转速设定是550rpm。
(4)向上述溶液中加入4.2mL的柠檬酸三钠水溶液，继续搅拌5分钟。
(5)之后，停止加热，继续搅拌20分钟，然后冷却至室温。
(6)即获得90.5nm的胶体金溶液。
注：制备的胶体金的粒径与加入的柠檬酸三钠水溶液的对照如表1所示。
表1 1％柠檬酸三钠溶液加入量对应的胶体金粒径
2、检测
待制备的胶体金溶液冷却后，取1mL的溶液，然后用微量紫外分光光度计(Nanodrop型)扫描200nm～800nm波段光谱。本对比例制备的胶体金溶液(加入4.2mL的1％柠檬酸三钠溶液制备的胶体金)的紫外可见分光谱如下：以此方法制备的胶体金的波峰较宽，说明粒径的均匀度差；同时，其最大吸收峰处的OD值较小，为0.419(见图3。)。说明制备获得的胶体金颗粒的得率较低，这种胶体金不适用于产业化生产。
实施例3、胶体金的稳定性
将上述实施例2制备的胶体金溶液和常规方法制备的胶体金溶液(对比例1中加入4.2mL的1％柠檬酸三钠溶液制备的胶体金)分别放置在2～8℃的冰箱内，分别放置1个月、3个月、6个月、9个月和12个月。在以上时间点时，拿出观察溶液的沉降情况(结果见表1和图4)。由此可见，本发明的方法制备的胶体金溶液的稳定性要远好于常规方法制备的胶体金溶液。
表2胶体金溶液稳定性
对比例2
(1)氯金酸水溶液、柠檬酸三钠水溶液、PVA水溶液的制备与实施例1相同。
(2)制备方法与实施例1相同，不同的是PVA水溶液加入量为0.5mL，柠檬酸三钠水溶液的加入量为0.7mL；加入柠檬酸三钠水溶液后加入过程中，三角烧瓶内的水溶液，先是紫黑色，然后变成紫色，最后变成浑浊深紫黑色。
2、检测
待制备的胶体金溶液冷却后，取1mL的溶液，然后用微量紫外分光光度计(Nanodrop型)扫描200nm～800nm波段光谱。本对比例制备的胶体金溶液在600nm处，有最大吸收峰，且OD值为0.29，有多个小杂峰出现(见图5)；即本对比例制备的胶体金为粒径约>100nm的胶体金。其OD值较低，表明胶体金颗粒的得率较低，无法应用于层析试纸。其图谱呈现多峰，说明胶体金溶液中的颗粒大小不一。由此可见，还原试剂的加入量是非常重要的，如果加入量不合适，无法获得90～100nm、稳定且得率较高的胶体金溶液。
对比例3
(1)氯金酸水溶液、柠檬酸三钠水溶液、PVA水溶液的制备与实施例2相同。
(2)制备方法与实施例2相同，不同的是向三角烧瓶内加入1L的超纯水，并打开磁力搅拌器，并加热；待三角烧瓶的底层温度加热到90℃，上层温度为85℃时，加入1mL的氯金酸水溶液，且搅拌器的速度设定为400rpm。
2、检测
待制备的胶体金溶液冷却后，取1mL的溶液，然后用微量紫外分光光度计(Nanodrop型)扫描200nm～800nm波段光谱。本对比例制备的胶体金溶液在533nm处，有最大吸收峰，且OD值为1.584，无杂峰，即粒径为小于90nm的胶体金(见图6)；经计算其粒径约为43nm。由此可见，低温和低速搅拌下，即使还原剂的比例合适，也无法获得90nm～100nm的大粒径胶体金。
实施例4、胶体金的应用
将本发明实施例1制备的胶体金应用于血清中登革热病毒抗原检测的胶体金试纸条。以实施例1制备的胶体金为标记示踪物，来制备胶体金免疫层析试纸条。
1、抗登革热病毒NS1抗体的标记
本技术采用的是直接标记的方法。即在室温下，将市售的抗体登革热病毒NS1抗体(菲鹏生物，货号：DN-REAB-G5-009)直接与胶体金溶液反应，然后离心得到所需的金标记物。具体方法如下：
1.1标记的pH的确定
(1)将胶体金溶液，各取1ml放入EP管内，共计10管，然后用0.1M的碳酸钾将上述胶体金溶液的pH分别调至5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0，并做好标记。然后，按照每1mL胶体金溶液中加入10μg抗体的量分别加入抗登革热病毒NS1标记抗体，涡旋混匀。
(2)上述各溶液静置10分钟，按照100μL/管的量加入10％的氯化钠水溶液到各EP管内，涡旋混匀。
(3)静置15分钟，观察颜色变化。
(4)选择没有沉淀、变紫色或黑色的胶体金溶液那管的pH为最佳的标记pH；即刚好未发生颜色变化仍呈酒红色的溶液的pH未最佳pH，所得最佳pH为8.0。
1.2标记量的确定
(1)将胶体金溶液，各取1mL放入EP管内，共计10管，然后用0.1M的碳酸钾将上述胶体金溶液的pH分别调至8.0并做好标记。然后，按照2μg/mL、4μg/mL、6μg/mL、8μg/mL、10μg/mL、12μg/mL、14μg/mL、16μg/mL、18μg/mL或20μg/mL的量(μg/mL指的是每1mL胶体金溶液中加入抗体的质量)分别加入抗登革热病毒NS1标记抗体，涡旋混匀。
(2)静置10分钟，然后按照240μL/mL(即每1mL胶体金溶液中加入240μL OVA水溶液)的量向各管内加入卵清蛋白(OVA)水溶液(由每10mL水含0.1g OVA制成)，并涡旋混匀。
(3)按照200μL/mL(按照胶体金溶液的体积计算)的量加入明胶水溶液(每10mL水含0.15g的明胶)，并涡旋混匀。
(4)静置15分钟，然后按照100μL/mL的量向上述各管内，加入氯化钠水溶液(每10mL水中含1.5g的氯化钠)，涡旋混匀。
(5)静置2小时，观察各管内的沉降情况及颜色变化。选择没有沉淀、变紫色或黑色的胶体金溶液那管的蛋白的量为最佳的标记量；即刚好未发生颜色变化仍呈酒红色的溶液的蛋白量为最佳标记量；所得最佳登革热病毒NS1抗体终浓度为12μg/mL。
1.3抗登革热病毒NS1抗体的胶体金标记
(1)取100mL的胶体金溶液于烧杯内。
(2)用0.1M的碳酸钾溶液将胶体金溶液的pH调节至8.0。并放置在磁力搅拌器上搅拌。
(3)用2mM的pH7.4的Tris缓冲液将抗登革热病毒NS1标记抗体的浓度稀释至1.2mg/mL，然后取1mL的稀释后的蛋白溶液加入到(2)中的胶体金溶液中。边搅拌边加入。
Tris缓冲液的配制：按照每100mL水0.22gTris的量，称取Tris并放于烧杯内，加入9mL的水然后用6M的盐酸溶液调节pH至7.4，然后用纯化水定容至所需体积，即得。
(4)磁力搅拌器上搅拌25分钟。
(5)按照240μL/mL(以胶体金溶液的体积计算)的量向上述溶液内加入OVA水溶液(由每10mL水中含有0.1g的OVA制成)，继续搅拌30分钟。
(6)按照200μL/mL(以胶体金溶液的体积计算)的量向上述溶液内加入1.5％的明胶溶液(即：每10mL水中含有0.15g明胶)，继续搅拌1小时。
(7)将上述反应好的溶液，转移至离心管内。
(8)4℃下，按照8000～15000rpm离心速度，本实验为12000rpm的离心速度，离心30分钟；去上清。
(9)用2mM的pH 7.4的Tris缓冲液复溶沉淀，即得到标记完成的金标记登革热病毒NS1抗体。
2、样品垫的制备
2.1样品垫处理液的配制
(1)按照40g/L的硼砂的量称取硼砂，并放入烧杯内，然后烧杯内加入80mL的水，并将烧杯放置在磁力搅拌器上，搅拌。
(2)向上述烧杯内加入0.3g的乙二胺四乙酸盐，继续搅拌；
(3)向上述溶液内，分别加入1g的环氧丙烷、环氧乙烷和乙烯基二元胺共聚物(市售)，继续搅拌；
(4)向上述溶液中加入0.05mL的Proclin 300，继续搅拌；
(5)向上述溶液中加入0.05mL的Tween20，继续搅拌。
(6)待溶液完全溶解澄清后，用盐酸或氢氧化钠调节溶液的pH至8.2，然后用纯化水定容至所需的体积。
(7)室温备用。
2.2样品垫的制备
(1)准备好市售的玻璃纤维垫(长*宽：300mm*254mm)；
(2)按照每100mL 2.1中制备的液体，浸泡1片的量来处理玻璃纤维垫；首先将玻璃纤维垫浸泡入样品垫处理液中2分钟，然后取出，用玻棒轻轻滤去多余的水分。翻面，再次将玻璃纤维垫浸泡入样品垫处理液中2分钟，用玻棒轻轻滤去多余水分；即得样品垫。
(3)将得到的样品垫，放入37℃烘箱内，过夜烘干(时间17～20小时)。
(4)烘干后，样品垫密闭保存，放置在干燥环境内。
2.3片材的制备
(1)将硝酸纤维素膜粘贴在PVC底板上；
(2)包被液的制备
检测线：用150μL 0.01M的PB(磷酸缓冲液)将抗登革热NS1包被抗体稀释至1mg/mL，共计制备稀释后的溶液体积为200μL。按照每片2μL/cm的量来准备检测线的量。
质控线：用184μL0.01M的PB将羊抗鼠IgG稀释至0.8mg/mL，共计制备稀释后的溶液体积为200μL。按照每片2μL/cm的量来准备质控线的量。
包被：用划膜剂将溶液包被在硝酸纤维素膜上。
(3)将包被完成的片材，放入37℃烘箱内，过夜烘干。
(4)烘干的片材，密闭保存，干燥处存放。
2.4金标条的制备
(1)用含有1％的牛血清白蛋白和20％蔗糖的0.01M的PB缓冲液将1.3制备的金标记登革热病毒NS1抗体进行稀释。稀释的比例按照46％的金标溶液和54％的上述的0.01M的PB溶液进行稀释。即：稀释时，若取46mL的上述金标溶液和54mL的0.01M的PB溶液，就得到100mL吸收后的金标溶液。
(2)稀释后的溶液用点金标机按照每条60μL的量进行金标的喷制。喷制的基底垫为玻璃纤维垫(长*宽：300mm*84mm)。
(3)喷制完成后，将金标条放入37℃烘箱内，过夜烘干。
(4)烘干的金标条密闭于自封袋内，然后干燥环境避光保存。
2.5试纸条的组装
(1)将制备的金标条剪切成长300mm宽8mm的小条，粘贴在片材的硝酸纤维素膜的下边缘，压过硝酸纤维素膜1～2mm；
(2)将样品垫切成长300mm宽20mm的小条，粘贴在片材的下端；样品垫的下边缘长出片材的下边缘3mm，样品垫的上边缘演过金标条的白边。
(3)将吸水滤纸切成长300mm宽17mm的小条，吸水滤纸的上边缘与片材的上边缘对齐，下边缘压过硝酸纤维素膜约2mm。
(4)将粘贴完成的试剂卡压紧。然后用切割机切成宽4.0mm宽的小条。
2.6试剂盒的组装
将切成的4.0mm的试纸条装入塑料卡壳的下板的卡槽内。盖紧上卡壳。即得到登革热病毒抗原检测试剂盒。
试纸条示意图见图8，实际切割的试纸条见图7。
3、上样稀释液的制备
按照每100mL中，加入0.6g的磷酸二氢钠、8g的氯化钠、0.2g磷酸二氢钾和0.02mL的Proclin 300进行溶液配制，并将溶液的pH调至7.8。得到上样稀释液。
4、测试
4.1重组蛋白的测试：将登革热病毒NS1重组蛋白用上样稀释液稀释为1ng/mL或0.1ng/mL。用这两个浓度的重组蛋白对上述试剂盒进行测试，测试结果均为阳性。用上样稀释液做阴性进行测试，测试结果均为阴性。
4.3.2全血/血清/血浆测试：
取1滴全血/血清/血浆，约15～20μL到试剂盒的加样孔内，然后加入3滴上样稀释液(约80μL～100μL)；计时15分钟观察测试结果。结果观察时间在15～30分钟，超过30分钟，判读结果无效。
5、检测结果
表3重组蛋白检测结果
检测项目 重复测试1 重复测试2 重复测试3
阴性 － － －
1ng/mL阳性 ++ ++ ++
0.1ng/mL阳性 + + +
表4阴性血清和阳性血清测试结果
检测项目 重复测试1 重复测试2 重复测试3
阴性血清1 － － －
阴性血清2 － － －
阴性血清3 － － －
阴性血清4 － － －
阴性血清5 － － －
阳性血清1 ++ ++ ++
阳性血清2 +++ +++ +++
阳性血清3 +++ +++ +++
阳性血清4 +++ +++ +++
阳性血清5 ++++ ++++ ++++
采用本发明实施例1制备的胶体金和对比例1制备的胶体金制备试剂盒，检测登革热病毒NS1重组蛋白(试剂盒制备和检测方法与上述相同)，结果见表5。由表5可知，本发明的方法制备的胶体金比常规方法制备的胶体金(对比例1中加入4.2mL的1％柠檬酸三钠溶液制备的胶体金)具有更高的灵敏度。
表5两种方法结果对比
6、采用卵清蛋白(OVA)和明胶联合进行封闭的标记方法标记的抗体具有较好的灵敏度和特异性。对全血/血清/血浆样本进行检测时，使用常规的方法如用BSA或PEG进行封闭时易出现假阳性，其试剂盒特异性差。而使用本发明的标记方法制备的登革热病毒抗原检测试剂盒具有较好的特异性，对于全血/血清/血浆样本的特异性为100％。
卵清蛋白(OVA)和明胶联合进行封闭的试剂盒制备和检测与上述方法相同。常规BSA标记封闭法制备金标记登革热病毒NS1抗体的具体方法如下：
即：(1)取100mL的实施例1制备的胶体金溶液于烧杯内。
(2)用0.1M的碳酸钾溶液将胶体金溶液的pH调节至8.0。并放置在磁力搅拌器上搅拌。
(3)用2mM的pH7.4的Tris缓冲液将抗登革热病毒NS1标记抗体的浓度稀释至1.2mg/mL，然后取1mL的稀释后的蛋白溶液加入到(2)中的胶体金溶液中；边搅拌边加入。
Tris缓冲液的配制：按照每100mL水0.22gTris的量，称取Tris并放于烧杯内，加入9mL的水然后用6M的盐酸溶液调节pH至7.4，然后用纯化水定容至所需体积，即得。
(4)磁力搅拌器上搅拌25分钟。
(5)然后加入500μL 100g/L的BSA水溶液封闭；
(6)搅拌反应1小时。
(7)将上述反应好的溶液，转移至离心管内。
(8)4℃下，按照8000～15000rpm离心速度，本实验为12000rpm的离心速度，离心30分钟；去上清。
(9)用2mM的pH 7.4的Tris缓冲液复溶沉淀，即得到对比组的标记完成的金标记登革热病毒NS1抗体。
参考文献：孙园园1，王云龙2等pH值对胶体金标记单克隆抗体性能的影响；细胞与分子免疫学杂志(Chin J Cell Mol Immunol)2014，30(11)。
其他步骤与表4方法相同。
表6血清检测结果
由表6的数据可知，通过临床常用的计算公式可以计算出本发明方法的特异性为100％。而常规方法的特异性为真阴性人数/(真阴性人数+假阳性的人数)×100％＝90％。
对比例4
使用牛血清白蛋白和PEG20000同时进行封闭，来制备登革热抗原检测试剂盒。对血清样本进行检测，其特异性弱于本发明中的方法。
使用牛血清白蛋白和PEG20000进行封闭制备登革热抗原检测试剂盒的标记部分的方法如下，其它制备过程与上述实施例4一致。
(1)取100mL的实施例1制备的胶体金溶液于烧杯内。
(2)用0.1M的碳酸钾溶液将胶体金溶液的pH调节至8.0。并放置在磁力搅拌器上搅拌。
(3)用2mM的pH7.4的Tris缓冲液将抗登革热病毒NS1标记抗体的浓度稀释至1.2mg/mL，然后取1mL的稀释后的蛋白溶液加入到(2)中的胶体金溶液中；边搅拌边加入。
Tris缓冲液的配制：按照每100mL水0.22gTris的量，称取Tris并放于烧杯内，加入9mL的水然后用6M的盐酸溶液调节pH至7.4，然后用纯化水定容至所需体积，即得。
(4)磁力搅拌器上搅拌25分钟。
(5)按照25μL/mL(以胶体金溶液的体积计算)的量向上述溶液内加入100g/L浓度的BSA水溶液，继续搅拌30分钟。
(6)按照20μL/mL(以胶体金溶液的体积计算)的量向上述溶液内加入10g/mL的浓度的PEG20000溶液，继续搅拌1小时。
(7)将上述反应好的溶液，转移至离心管内。
(8)4℃下，按照8000～15000rpm离心速度，本实验为12000rpm的离心速度，离心30分钟；去上清。
(9)用2mM的pH 7.4的Tris缓冲液复溶沉淀，即得到标记完成的金标记登革热病毒NS1抗体。
采用同等的方法对血清进行检测。具体方法如下：取1滴血清，约15～20μL到试剂盒的加样孔内，然后加入3滴上样稀释液(约80μL～100μL)；计时15分钟观察测试结果。结果观察时间在15～30分钟，超过30分钟，判读结果无效。表7中的本发明的方法与实施例4中表4的测定方法相同。对比检测结果如下：
表7对比结果表

Claims (8)

1.一种胶体金的制备方法，包括如下步骤：
将水加热至90～100℃，然后加入氯金酸，在搅拌转速为500rpm±50rpm的条件下加入聚乙烯醇和柠檬酸三钠，继续在搅拌转速为500rpm±50rpm的条件下搅拌6～8min，得到所述胶体金；
每1L水中，所述氯金酸的加入量为0.2g；所述聚乙烯醇的加入量为0.75～1g；所述柠檬酸三钠的加入量为0.12～0.20g；
所述氯金酸、聚乙烯醇和柠檬酸三钠以水溶液的形式加入；
所述聚乙烯醇和柠檬酸三钠的加入时间相差不超过10秒。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述水分为上下两部分，下半部分加热到95～100℃，上半部分加热至90～95℃时，加入所述氯金酸。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于：所述胶体金的粒径为90～100nm。
4.一种产品，其特征在于：所述产品为权利要求1-3中任一项所述的制备方法制备得到的胶体金或含有所述胶体金的试剂盒或含有所述胶体金的免疫层析试纸。
5.根据权利要求4所述的产品，其特征在于：含有所述胶体金的试剂盒或含有所述胶体金的免疫层析试纸按照包括如下步骤的方法制备：用所述胶体金标记抗体得到胶体金标记抗体，所述标记采用卵清蛋白和明胶进行封闭。
6.权利要求4或5所述的产品在制备检测病原微生物试剂盒中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述试剂盒用于检测全血、血清或血浆中的病原微生物。
8.根据权利要求6或7所述的应用，其特征在于：所述病原微生物为登革热病毒。
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