CN115166254A - 一种三维膜状sers纳米探针的制备及免疫层析应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种三维膜状SERS纳米探针的制备及免疫层析应用，该三维膜状SERS纳米探针以单层氧化石墨烯(GO)纳米片的表面生长粗糙均匀的金壳作为二维SERS平台，利用强正电聚合物聚乙烯亚胺(PEI)作为内置纳米间隙，最后在PEI层上吸附密集胶体银(AgNPs)以提供一个大面积的稳定SERS热点，制备方式如下：首先将聚乙烯亚胺(PEI)修饰在GO纳米片表面，再吸附一层胶体金(3nm)，形成种子化的GO复合纳米片(GO‑Auseed)，然后再通过种子生长法原位生长出粗糙的纳米金外壳(GO@Au)，最后使用PEI修饰的GO@Au继续吸附胶体银(30nm)，形成三维膜状SERS纳米探针材料GO@Au/Ag。

Description

一种三维膜状SERS纳米探针的制备及免疫层析应用
技术领域
本发明涉及新型纳米材料、表面增强拉曼散射(SERS)及现场即时检测领域，具体涉及一种三维膜状SERS纳米探针的制备及免疫层析应用。
背景技术
基于快速色谱分离和抗体-抗原特异性识别的免疫层析已经发展成为最受欢迎的即时检测(POCT)技术，被广泛应用于人类健康监测和食品安全控制，可以实现对各种生物和化学分子，包括毒素、农药、蛋白质、核酸和病毒的高灵敏和多通道测定。然而，由于细菌的尺寸(一般为0.6-5微米)相对于免疫层析的硝酸纤维素膜孔径(一般<18微米)来说过大，容易堵塞硝酸纤维素膜，导致检测结果不准或灵敏度低。目前常用的免疫层析信号探针为球形纳米颗粒(NPs)或复合纳米球，它们与细菌表面结合，形成的细菌-纳米标记复合物进一步增加了细菌的体积，削弱了它们在试纸上的分散性。同时真实细菌样品(如临床标本、食品基质)中的复杂成分(如酸、高盐、蛋白质、细胞碎片)容易影响免疫层析传统纳米标记的胶体稳定性，产生无效甚至错误的结果。因此，需要一种能对细菌病原体进行多重和灵敏检测的新型免疫层析技术。
氧化石墨烯(GO)作为一种二维蜂窝状的碳纳米片，具有大的比表面积、良好的电子传导性、优异的稳定性和分散性。在此基础上，我们设计并引入了一种基于GO的三维膜状SERS标签(GO@Au/Ag)，并将其引入免疫层析系统，以取代普通球形SERS纳米标签用于细菌检测。抗体标记的GO@Au/Ag标签可以有效而紧密地覆盖在细菌表面，不仅可以提供更强的SERS信号，而且有利于细菌-纳米标签复合物的流动性，从而提高免疫层析系统对细菌检测的检测灵敏度和多路分析能力。同时，两种拉曼报告分子包括5,5′-二硫代双(二硝基苯甲酸)(DTNB)和4-巯基苯甲酸(4-MBA)被用来制备GO@Au/Ag纳米标签，以提供不相交的拉曼峰，在两条检测线上同时检测四种细菌。这一策略有效地提高了免疫层析技术的检测通量，在提升检测灵敏度的同时大大减少了SERS信号评估时间和整个检测时间，为真正实现在免疫层析试纸条上对细菌进行多重和灵敏检测提供了一个新的概念和有效的解决方案。
发明专利内容
本发明的目的是解决现有免疫层析技术检测细菌性能不足的问题，提供了一种三维膜状SERS纳米探针(GO@Au/Ag)，通过在GO@Au纳米片的基底上精确地生长了一个超薄的聚乙酰亚胺(PEI)夹层，作为GO@Au内部和外部胶体银卫星之间的内置纳米间隙，从而提供多个SERS热点，并将其引入SERS免疫层析系统。
为实现上述目的，本发明专利提供如下技术方案：三维膜状SERS纳米探针的制备，该复合纳米材料具有三维结构，在单层GO片的表面涂上均匀的金壳作为二维SERS平台，通过精确控制的聚乙烯亚胺(PEI)夹层作为内置的纳米间隙，以及许多外部组装的胶体银(AgNPs)提供更大的表面积和多个SERS热点，所述三维膜状SERS纳米探针(GO@Au/Ag)具有优异的稳定性、单分散性、卓越的SERS活性和巨大的反应界面，所述GO@Au/Ag复合纳米材料作为高性能SERS探针应用于SERS免疫层析系统。
本发明的制备方法，分为以下步骤：
(1)在氧化石墨烯(GO)表面组装一层PEI形成表面带正电荷的GO@PEI纳米片，将GO@PEI纳米片加入到胶体金溶液中制备种子化的GO复合纳米片(GO-Au seed)；
将单分散的GO薄膜溶液加入到PEI溶液中,通过剧烈超声处理将PEI自组装到GO薄膜表面，形成带正电荷的GO@PEI纳米片，离心收集GO@PEI，清洗两次以去除多余的PEI，并重新悬浮在去离子水中待用；
在超声处理下，将制备的GO@PEI溶液与带负电荷的胶体金种子(3nm)溶液进行孵化，以形成GO-Au seed复合纳米片，通过离心收集GO-Au seed，并储存在乙醇中；
(2)将得到的GO-Au seed复合纳米片通过种子生长法原位生长出粗糙的纳米金外壳(GO@Au)，反应后，将得到的GO@Au纳米薄膜通过离心法洗涤，并重新悬浮在去离子水中待用；
(3)将所得的GO@Au纳米薄膜加入到PEI溶液中，通过剧烈超声处理将PEI自组装到GO@Au纳米薄膜表面，形成第二层PEI修饰的表面带正电荷的GO@Au-PEI纳米薄膜，离心收集GO@Au-PEI，清洗两次以去除多余的PEI，并重新悬浮在去离子水中待用；
(4)将得到的GO@Au-PEI纳米薄膜与带负电荷的胶体银(30nm)溶液进行孵化，以形成GO@Au/Ag复合纳米片，通过离心收集GO@Au/Ag，并储存在乙醇中；
(5)将所得的GO@Au/Ag复合纳米片分别加入到拉曼分子溶液中，剧烈超声反应1小时以上,完成拉曼报告分子的标记。
优选的，步骤(1)中，PEI的分子量为5000～80000，PEI溶液的浓度为0.2mg/mL～5mg/mL，优选为1mg/mL；所述超声时间为20～60min,优选为40min；所述离心后清洗次数为1-3次。
优选的，步骤(1)中，3nm胶体金种子溶液用量优选100mL；所述超声时间为20～60min,优选为30min；所述离心后清洗次数为1-3次。
优选的，步骤(2)中获得GO@Au纳米薄膜的还原方法为种子生长法，PVP(聚乙烯吡咯烷酮)为保护剂，盐酸羟胺作为还原剂，氯金酸(HAuCl4)作为原料；所述离心后清洗次数为1-3次。
优选的，步骤(3)中，PEI的分子量为5000～80000，PEI溶液的浓度为0.2mg/mL～5mg/mL，优选为1mg/mL；所述超声时间为10～60min，优选为20min。
优选的，步骤(4)中30nm胶体银种子溶液用量优选40mL；所述超声时间为20～60min,优选为40min；所述离心后清洗次数为1-3次。
优选的，步骤(5)中，拉曼分子浓度为10～1000μM，优选为10μM；所述超声时间为30～90min，优选为60min。
优选的，所述三维膜状SERS纳米探针表面还修饰有细菌检测抗体，抗体通过拉曼报告分子羧基基团与抗体的氨基端形成肽键偶联。
优选的，所述三维膜状SERS纳米探针引入到SERS免疫层析系统中，同时拥有良好的分散性以及卓越的SERS活性，可实现免疫层析体系中目标物的超敏定量检测。
本申请还提供一种三维膜状SERS纳米探针作为SERS免疫层析检测系统的信号标签的应用，具体为以下步骤：在所述拉曼报告分子标记的三维膜状SERS纳米探针材料表面修饰上伤寒沙门氏菌(S.typhi)、大肠杆菌(E.coli)、金黄色葡萄球菌(S.aureus)和单核细胞增生李斯特菌(L.mono)抗体作为SERS免疫标签(immuno-GO@Au/Ag)并保存在金标缓冲液中，作为液体纳米探针直接检测病原体；将抗金黄色葡萄球菌抗体和抗单核细胞增生李斯特菌抗体的混合物以及抗伤寒沙门氏菌抗体和抗大肠杆菌抗体的混合物分别喷在检测线1(T1)和检测线2(T2)上，以捕获相应的细菌-SERS标签免疫复合物，山羊抗鼠IgG被修饰到质控线上，以固定多余的-SERS标签；将所述硝酸纤维素膜和样品垫、吸水垫、底板组装成免疫层析试纸条；
将待测样本与运行缓冲液混匀，滴加到所述免疫层析试纸条的样品垫上，15-20min后读取免疫层析试纸条的两条检测线处的拉曼信号，实现对伤寒沙门氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和单核细胞增生李斯特菌的同时、高灵敏检测。
与现有技术相比，本发明专利的有益效果如下：
(1)本发明提出的三维膜状SERS纳米探针性能优越，从结构上看，GO纳米片具有广阔的比表面积；精确控制的PEI夹层作为内置的纳米间隙，以及许多外部组装的胶体银提供更大的表面积和多个SERS热点；此外，该材料具有优异的稳定性、单分散性和优异的SERS性能，明显优于传统的球形SERS标签；
(2)本发明提出采用PEI层层自组装法制备的三维膜状SERS纳米探针材料，制备方法简单，可实现批量生产；
(3)本发明提出的PEI层层自组装法是一种高性能SERS纳米材料的制备方法。通过控制PEI夹层的厚度，可以制备内置SERS热点的信号标签；
(4)本发明提出的三维膜状SERS纳米探针具有广阔的应用前景，包括在生物成像、生物传感、现场快速检测等领域的应用。在三维膜状SERS纳米探针表面修饰上不同的检测抗体，即可作为高性能的SERS免疫标签用于多种目标物的快速检测；
(5)本发明提出的三维膜状SERS纳米探针材料作为高性能SERS标签用于免疫层析检测，可以提供更大的表面积、更好的分散性及卓越的SERS性能，因此可以有效提高SERS免疫层析检测的灵敏度和检测通量。
附图说明
图1为本发明的三维膜状SERS纳米探针的制备方法示意图；
图2为三维膜状SERS纳米探针制备过程中各组分的透射电子显微镜图；
图3为三维膜状SERS纳米探针材料的性能表征图；
图4为本发明实施例2的三维膜状SERS纳米探针表面修饰抗体的制备过程；
图5为本发明实施例3的三维膜状SERS纳米探针作为高性能SERS标签与免疫层析系统联用检测伤寒沙门氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和单核细胞增生李斯特菌的实验流程图；
图6为基于三维膜状SERS纳米探针的免疫层析系统检测伤寒沙门氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和单核细胞增生李斯特菌的测试分析结果图。
具体实施方式
下面将结合本发明专利实施例中的附图，对本发明专利实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明专利一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明专利中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明专利保护的范围。
本发明制备的三维膜状SERS纳米探针材料，通过三个主要步骤制作的，首先采用种子介导的生长策略，将粗糙的金壳还原到GO-Au seed纳米片的表面作为二维SERS平台；接下来在GO@Au表面精确地吸附上一层PEI层，作为内置的纳米间隙，以提供能够容纳DTNB/MBA分子的位点；最后将许多胶体银固定在GO@Au的PEI层上，外部组装的胶体银卫星将二维的GO@Au转换成三维的GO@Au/Ag纳米片，具有更大的表面积和多个SERS热点。
如图1所示，一种三维膜状SERS纳米探针材料的制备方法，包括以下步骤：
(1)制备GO@PEI纳米片：
将20mg GO纳米片加入到50mL的PEI水溶液(1mg/mL)中，该混合物被大力超声处理30min，通过离心收集GO@PEI，清洗两次并重新悬浮在10mL去离子水中待用；
(2)制备GO-Au seed复合纳米片：
在超声处理下，将制备的GO@PEI溶液(1mL)与40mL带负电荷的胶体金(3nm)溶液反应，以形成GO-Au seed纳米片，超声处理30min后，通过离心收集GO-Au seed复合纳米片，并储存在10mL的乙醇中待用，
(3)制备GO@Au复合纳米片：
在超声处理下，将1mL GO-Au seed溶液注入到40mL含有1wt％PVP的盐酸羟胺水溶液(0.5mg/mL)和100μL HAuCl4(5mM)，反应5min后，将得到的GO@Au纳米薄膜通过离心法洗涤两次，并重新悬浮在10mL去离子水中待用；
(4)制备GO@Au-PEI复合纳米片：
将制备好的GO@Au溶液与40mL的PEI水溶液(0.1mg/mL)在超声下孵化，超声处理15min后，所得的GO@Au-PEI纳米片通过离心收集，用去离子水洗涤，并重新悬浮在10mL去离子水中，供后续使用；
(5)制备GO@Au/Ag复合纳米片：
将准备好的GO@Au-PEI溶液(1mL)与过量的30nm胶体银溶液(40mL)混合，将该混合物超声处理30min，以形成GO@Au/Ag纳米片，通过离心法收集GO@Au/Ag纳米片，并将其储存在10mL的乙醇中以备将来使用；
(6)制备拉曼报告分子修饰的GO@Au/Ag复合纳米片：
首先，将10μL的拉曼报告分子DTNB/MBA(10mM)加入到1mL的GO@Au/Ag乙醇溶液中，在超声处理2h后，通过离心用乙醇纯化DTNB/MBA标记的GO@Au/Ag纳米片；
图2为本实施例步骤(2)制得的GO-Au seed复合纳米片，步骤(3)制得的GO@Au复合纳米片，步骤(4)制得的GO@Au-PEI复合纳米片，步骤(5)制得的GO@Au/Ag复合纳米片的高分辨透射电镜图(HRTEM)，由上述HRTEM结果可见，GO@Au/Ag复合纳米材料，具有灵活的结构和良好的分散性，30nm的胶体银可以通过带正电荷的PEI夹层的强静电作用固定在GO@Au-PEI的表面上，从而形成一个具有多个胶体银卫星的三维纳米片，在创造多个SERS热点的同时，为细菌结合提供丰富的表面位置。
本实施例所制得的三维膜状SERS纳米探针的性能表征结果如图3所示，本发明提出的三维膜状SERS纳米探针材料集成了大量的胶体银卫星，膜状的GO@Au/Ag表现出远比普通胶体金或胶体银更好的稳定性，如图3a-b所示，GO@Au/Ag悬浮液的比色和紫外可见光谱在高盐溶液(0-1000mM NaCl)中保持稳定，而常用的胶体金和胶体银在高浓度盐处理后严重结块，与传统的胶体纳米标记相比，抗体标记的GO@Au/Ag具有更大的表面积、更多的表面结合点和更灵活的薄膜结构，图3g-j的TEM图像和图3k-n的SEM图像清楚地表明，膜状的GO@Au/Ag可以紧密地粘附在其目标细菌表面，相比之下，在相同的条件下，抗体修饰的胶体银在细菌上的数量显然低于本发明提出的三维膜状SERS纳米探针(图3c-f)。
实施例2
本发明提出的三维膜状SERS纳米探针的表面修饰了带有羧基的拉曼报告分子，表面具有大量游离羧基在活化后可以用于抗体偶联，可以非常简便的实现纳米材料的表面功能化，本发明的三维膜状SERS纳米探针表面抗体修饰的步骤如图4所示，包括以下步骤：
首先，将10μL的拉曼报告分子DTNB/MBA(10mM)加入到1mL的GO@Au/Ag乙醇溶液中，在超声处理2h后，用乙醇纯化DTNB/MBA标记的GO@Au/Ag纳米片，并重新分散在1mL的2-(N-吗啉)乙磺酸溶液(10mM，pH6.0)中，然后加入10μL碳二亚胺溶液(0.1M)和20μL N-羟基琥珀酰亚胺溶液(0.1M)，超声反应15min活化GO@Au/Ag表面的羧基；离心回收并重悬于200μL的PBS缓冲液(10mM，pH 7.4)；将约10μg的抗伤寒沙门氏菌抗体和抗金黄色葡萄球菌抗体分别与GO@Au/Ag-DTNB溶液混合，而将10μg的抗大肠杆菌抗体和抗单核细胞增生李斯特菌抗体分别加入GO@Au/Ag-MBA溶液中，室温震荡反应2h后加入100μL BSA(1％)，以阻断纳米片的任何未反应的部位，最后，通过离心收集SERS纳米片，并将其重新分散在0.5mL保存缓冲液中，作为液体纳米探针用于直接检测病原体。
实施例3
本发明提出的三维膜状SERS纳米探针表面修饰目标细菌抗体后可作为高性能SERS标签用于免疫层析系统的检测，本实施例采用伤寒沙门氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和单核细胞增生李斯特菌抗体修饰的SERS标签作为免疫层析系统标签，检测含有不同浓度(106-0cells/mL)的伤寒沙门氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和单核细胞增生李斯特菌的混合细菌样品，图5为本实施例所示的SERS标签与免疫层析系统联用快速检测四种目标细菌的实验流程图，图6为基于三维膜状SERS纳米探针的免疫层析系统检测四种目标细菌的测试分析结果，图6a(i)和(ii)分别展示了基于GO@Au/Ag免疫层析试纸条的两条T线的照片和相应的SERS图谱图像，随着混合细菌浓度的降低，GO@Au/Ag的颜色强度和整个T线的SERS强度逐渐减弱，T1/T2线的SERS图谱图像在1328和1585cm-1处的拉曼信号显示，当样品中的细菌浓度高于104cells/mL时，四种细菌-纳米片免疫复合物在测试区的均匀分布，图6c和f分别显示了SERS免疫层析试纸条的T2线和T1线的平均SERS光谱，在这些SERS信号的基础上，伤寒沙门氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和单核细胞增生李斯特菌的标准曲线分别显示在图6d、e、g、h，我们通过使用细菌浓度和1328cm-1和1585cm-1处的SERS强度的sigmoidal函数来构建这些曲线，在此基础上，我们计算了SERS免疫层析的灵敏度(LODs)，伤寒沙门氏菌的LODs大约为9cells/mL，大肠杆菌为9cells/mL，金黄色葡萄球菌为8cells/mL，而单核细胞增生李斯特菌为9cells/mL，此外，通过基于胶体金的免疫层析的比色信号对四种目标细菌的LODs在5×103到104cells/mL范围内(图6b)。
需要说明的是：图2中a图为GO纳米片，b图为GO-Au seed纳米片，d图为GO@Au纳米片，e图为GO@Au-PEI，g图为GO@Au/Ag纳米片，c图为GO-Au seed、f图为GO@Au-PEI和h-i图为GO@Au/Ag纳米片的局部形态的放大TEM图像；
图3中a-b图为GO@Au/Ag纳米片的稳定性：a图为在不同的盐浓度(0-1000mM NaCl)下，胶体金、胶体银和GO@Au/Ag的颜色变化，b图为相应的紫外-可见光谱，c-n图为GO@Au/Ag纳米贴的细菌结合能力，形成的细菌-胶体银标签复合物的TEM图像：c图为单核细胞增生李斯特菌-胶体银，d图金黄色葡萄球菌-胶体银，e图大肠杆菌-胶体银，f图为伤寒沙门氏菌-胶体银，形成的细菌-GO@Au/Ag复合物的TEM和SEM图像：g图和k图为单核细胞增生李斯特菌-GO@Au/Ag，h图和l图为金黄色葡萄球菌-GO@Au/Ag，i图和m图为大肠杆菌-GO@Au/Ag，j图和n图伤寒沙门氏菌-GO@Au/Ag；
图6中a图为基于GO@Au/Ag的SERS免疫层析在T2上同时检测伤寒沙门氏菌和大肠杆菌，在T1上检测金黄色葡萄球菌和单核细胞增生李斯特菌的照片和相应的SERS映射图像，b图为传统的基于胶体金免疫层析检测四种目标细菌的图片，c图和图f为不同浓度的四种细菌(106-0cells/mL)的平均SERS光谱，d图、e图、g图和h图分别伤寒沙门氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和单核细胞增生李斯特菌的相应校准曲线。
综上所述，本申请发明的利用PEI层层自组装法制备的三维膜状SERS纳米探针纳米材料制备简单、高效、重复性好，制备出三维膜状SERS纳米探针材料具有更大的表面积、卓越的SERS性能、更好的稳定性和在复杂样品中的分散性，在生物样本检测特别是超敏SERS免疫层析检测领域具有广阔的应用前景。
尽管已经示出和描述了本发明专利的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明专利的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明专利的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (10)

1.一种三维膜状SERS纳米探针的制备，其特征在于，该复合纳米材料具有三维结构，在单层GO片的表面涂上均匀的金壳作为二维SERS平台，通过精确控制的聚乙烯亚胺(PEI)夹层作为内置的纳米间隙，以及许多外部组装的胶体银(AgNPs)提供更大的表面积和多个SERS热点，所述三维膜状SERS纳米探针(GO@Au/Ag)具有优异的稳定性、单分散性、卓越的SERS活性和巨大的反应界面，所述GO@Au/Ag复合纳米材料作为高性能SERS探针应用于SERS免疫层析系统。
2.一种三维膜状SERS纳米探针的制备方法，分为以下步骤：
(1)在氧化石墨烯(GO)表面组装一层PEI形成表面带正电荷的GO@PEI纳米片，将GO@PEI纳米片加入到胶体金溶液中制备种子化的GO复合纳米片(GO-Au seed)；
将单分散的GO薄膜溶液加入到PEI溶液中,通过剧烈超声处理将PEI自组装到GO薄膜表面，形成带正电荷的GO@PEI纳米片，离心收集GO@PEI，清洗两次以去除多余的PEI，并重新悬浮在去离子水中待用；
在超声处理下，将制备的GO@PEI溶液与带负电荷的胶体金种子(3nm)溶液进行孵化，以形成GO-Au seed复合纳米片，通过离心收集GO-Au seed，并储存在乙醇中；
(2)将得到的GO-Au seed复合纳米片通过种子生长法原位生长出粗糙的纳米金外壳(GO@Au)，反应后，将得到的GO@Au纳米薄膜通过离心法洗涤，并重新悬浮在去离子水中待用；
(3)将所得的GO@Au纳米薄膜加入到PEI溶液中，通过剧烈超声处理将PEI自组装到GO@Au纳米薄膜表面，形成第二层PEI修饰的表面带正电荷的GO@Au-PEI纳米薄膜，离心收集GO@Au-PEI，清洗两次以去除多余的PEI，并重新悬浮在去离子水中待用；
(4)将得到的GO@Au-PEI纳米薄膜与带负电荷的胶体银(30nm)溶液进行孵化，以形成GO@Au/Ag复合纳米片，通过离心收集GO@Au/Ag，并储存在乙醇中；
(5)将所得的GO@Au/Ag复合纳米片分别加入到拉曼分子溶液中，剧烈超声反应1小时以上,完成拉曼报告分子的标记。
3.根据权利要求2所述的三维膜状SERS纳米探针的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，PEI的分子量为5000～80000，PEI溶液的浓度为0.2mg/mL～5mg/mL，优选为1mg/mL；所述超声时间为20～60min,优选为40min；所述离心后清洗次数为1-3次。
4.根据权利要求2所述的三维膜状SERS纳米探针的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，3nm胶体金种子溶液用量优选100mL；所述超声时间为20～60min,优选为30min；所述离心后清洗次数为1-3次。
5.根据权利要求2所述的三维膜状SERS纳米探针的制备方法，其特征在于，步骤(2)中获得GO@Au纳米薄膜的还原方法为种子生长法，PVP(聚乙烯吡咯烷酮)为保护剂，盐酸羟胺作为还原剂，氯金酸(HAuCl4)作为原料；所述离心后清洗次数为1-3次。
6.根据权利要求2所述的三维膜状SERS纳米探针的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，PEI的分子量为5000～80000，PEI溶液的浓度为0.2mg/mL～5mg/mL，优选为1mg/mL；所述超声时间为10～60min，优选为20min。
7.根据权利要求2所述的三维膜状SERS纳米探针的制备方法，其特征在于，步骤(4)中30nm胶体银种子溶液用量优选40mL；所述超声时间为20～60min,优选为40min；所述离心后清洗次数为1-3次。
8.根据权利要求2所述的三维膜状SERS纳米探针的制备方法，其特征在于，步骤(5)中，拉曼分子浓度为10～1000μM，优选为10μM；所述超声时间为30～90min，优选为60min。
9.根据权利要求1所述的三维膜状SERS纳米探针的制备，其特征在于，所述三维膜状SERS纳米探针表面还修饰有细菌检测抗体，抗体通过拉曼报告分子羧基基团与抗体的氨基端形成肽键偶联。
10.根据权利要求1所述的三维膜状SERS纳米探针，其特征在于，所述三维膜状SERS纳米探针引入到SERS免疫层析系统中，同时拥有良好的分散性以及卓越的SERS活性，可实现免疫层析体系中目标物的超敏定量检测。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116106284A (zh) * 2023-04-11 2023-05-12 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 一种基于氧化石墨烯的比色荧光双模式复合纳米片及其制备方法与应用

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