CN114517090B - 一种高亮度的近红外荧光复合微球及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种高亮度的近红外荧光复合微球及其制备方法，利用法将Cypate染料掺杂进入二氧化硅纳米颗粒，得到染料二氧化硅微球Cypate@SiO2微球；对微球表面氨基化后在氨基化染料微球表面利用PAH逐层自组装量子点，组装后的微球采用聚丙烯酸(PAA)对微球表面进行羧基化，再加入戊二醛对两层邻近的PAH层增加化学连接，得到高亮度的近红外荧光复合微球。

Description

一种高亮度的近红外荧光复合微球及其制备方法
技术领域
本发明涉及荧光标记技术领域，特别是涉及一种高亮度的近红外荧光复合微球及其制备方法。
背景技术
免疫层析过程采用抗原抗体标记试剂，通过对疾病标志物的特异性识别与结合可以实现对疾病的快速诊断。但是，在现有技术中，如免疫层析常用的抗原抗体标记试剂的胶体金和染料/量子点微球，存在灵敏度低、血液样本中干扰性高即相对荧光强度低的技术问题。
量子点作为一种新型的荧光标记材料，具有宽激发、窄发射峰且耐光漂白的优良性质。然而量子点本身粒径小、表面能高等缺点限制了其应用。现有技术中已有将微球结合量子点形成的量子点荧光微球，目前已报道的制备量子点荧光微球的方法主要分为二氧化硅包覆法、溶胀法、层层自组装法，其中层层自组装法参见文献Hong,X.；Li,J.；Wang,M.；Xu,J.；Guo,W.；Li,J.；Bai,Y.； Li,T.,Fabrication of Magnetic LuminescentNanocomposites by a Layer-by-Layer Self-assembly Approach.Chemistry ofMaterials 2004,16 (21),4022-4027。
其中，最常用的方法是二氧化硅包覆法，它存在两种方式：一种是法，通过量子点溶于水中直接二氧化硅聚合包覆的方式；一种是反相微乳法，既能直接在水溶液中，也能借助表面活性剂在油相溶液中对量子点进行包覆。二氧化硅包覆法制备的量子点荧光微球虽然具备一定的稳定性，但是单个微球包覆量少，导致荧光强度弱；小尺寸的二氧化硅微球均一性较差等限制了其应用。
溶胀法通过用良溶剂溶胀聚合物微球，将量子点负载于微球内，但量子点主要集中在微球外围且分散不均匀，随时量子点都可能泄露。
逐层自组装技术(layer-by-layer self-assembly，LbL)是利用逐层交替沉积的原理，通过模板表面的化学基团与成膜物质之间的作用力，在模板表面自发形成具有完整结构和功能的薄膜的一种技术。与其他传统的表面修饰技术相比，LbL最大的优势是其可控性，通过控制吸附分子层的数量，可以调控多层膜的物理性质，如机械性质，壳层厚度可以调整到纳米级的精度；并且所组装的多层膜的结构和化学性质可以通过改变聚电解质或者其他带电物质种类来调控；但现有公开的基于逐层自组装技术构建的荧光微球仍存在荧光强度低、荧光寿命短且由于仅依靠静电力和氢键等弱作用力而导致的结构稳定性较低的问题。
发明内容
为了克服上述现有技术的不足，本发明通过逐层自组装和近红外染料微球相结合制备了一种高亮度近红外复合荧光微球及其制备方法，另外本发明还提供一种单分散高荧光近红外染料微球的尺寸调节方法。
本发明所采用的技术方案是：
本发明的技术关键点一是在于合成高荧光强度的近红外发射区间的 CdTe/CdS量子点，二是合成尺寸均一的近红外染料微球，三是在于逐层自组装静电吸附过程中增加化学键连接。
一种高亮度的近红外荧光复合微球的制备方法包括以下步骤，如图1和图2 所示：
步骤S1：利用法将Cypate染料掺杂进入二氧化硅纳米颗粒，得到染料微球即Cypate@SiO2微球,制备过程化学路径如下所示：
步骤S2：对步骤S1中获得的染料微球即Cypate@SiO2微球表面氨基化，获得产物氨基化染料微球即Cypate@SiO2-NH2微球；
步骤S3：对步骤S2中获得的氨基化染料微球表面进行逐层自组装量子点，量子点为CdTe/CdS，所述量子点直径为5～15nm，组装层数记为n且n≧1,得到的产物记为Cypate@SiO2/(CdTe/CdS)n微球；
步骤S4：步骤S3获得的Cypate@SiO2/(CdTe/CdS)n微球重悬液中加入聚丙烯酸(PAA)对微球表面进行羧基化，得到的产物记为 Cypate@SiO2/(CdTe/CdS)n-COOH微球；
步骤S5：步骤S4获得的Cypate@SiO2/(CdTe/CdS)n-COOH微球重悬液中加入戊二醛对两层邻近的PAH层增加化学连接，得到最终制备的荧光复合微球，即本发明所述的结构稳定的高亮度的近红外荧光复合微球。
进一步的，步骤S1中所述具体制备过程包括：
步骤S1.1近红外染料二氧化硅前驱体的合成：将Cypate染料溶于N,N-二甲基甲酰胺(DMF)或者二甲基亚砜(DMSO)中，加入1-乙基-(3-二甲基氨丙基) 碳酰二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)和N-羟基丁二酰亚胺(NHS)避光反应3～6h后，向其中加入3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)继续反应12～24h，得到染料二氧化硅前驱体溶液Cypate-APTES。
步骤S1.2近红外染料二氧化硅微球的合成：在无水乙醇体系中加入1mL上述的染料二氧化硅前驱体溶液Cypate-APTES后，室温避光搅拌15min，滴加一定量的硅酸四乙酯(TEOS)，继续室温搅拌30min～120min后，加入浓度 25％～28％wt.氨水，避光反应6h，即得到染料二氧化硅微球Cypate@SiO2。
进一步的，步骤S2中所述具体制备过程包括：将Cypate@SiO2分散于无水乙醇，加入APTES水浴50～90℃避光反应12～24h，即得氨基化微球 Cypate@SiO2-NH2。
进一步的，步骤S3中所述量子点制备过程：首先合成碲氢化钠(NaHTe)前体——取一定量的硼氢化钠溶于水，在氮气保护下加入碲(Te)粉反应2～4h置于4℃保存。将氯化镉(CdCl2)溶于水中，加入一定量的3-巯基丙酸(3-MPA)，再用氢氧化钠将溶液调至碱性，将合成好的NaHTe的溶液加入上述镉前体溶液中。搅拌一段时间后置于聚四氟乙烯水热釜中，180℃反应80～100min即得近红外CdTe/CdS量子点。
进一步的，步骤S3中所述氨基化染料微球表面逐层自组装量子点制备过程具体包括：首先称取一定量的氨基化染料微球超声分散于超纯水中，加入量子点原液孵育30min，然后加入一定量的EDC·HCl水溶液继续孵育30min后，离心弃上清并用超纯水重悬至M mL，M大于0；接着向上述重悬液中加入一定量的聚烯丙基胺盐酸盐(PAH·HCl)水溶液孵育30min，离心弃上清并用超纯水重悬至M mL。可重复上述吸附量子点和PAH包覆的操作，得到吸附多层量子点的荧光微球。
进一步的，步骤S4中所述加入聚丙烯酸(PAA)对微球表面进行羧基化具体步骤包括：向步骤S3得到的Cypate@SiO2/(CdTe/CdS)n微球重悬液中加入聚丙烯酸(PAA)水溶液，孵育30min后，离心弃上清并用超纯水重悬至M mL。
进一步的，步骤S5中所述加入戊二醛对两层邻近的PAH层增加化学连接具体步骤包括：步骤S4获得的Cypate@SiO2/(CdTe/CdS)n-COOH微球重悬液中加入 10～30微升0.1Vol％的戊二醛水溶液孵育30min后，离心弃上清并水洗2次，复溶于超纯水中即得近红外复合荧光微球。
本发明采用的Cypate是吲哚菁绿染料(ICG)的一种双羧基衍生物，是一种常用的光热化合物，其疏水性强，结构稳定性好，而且结构中有两个羧基，便于进行结构修饰。
本发明利用法将Cypate染料掺杂进入二氧化硅纳米颗粒中，参见文献：Lian,Y.；Ding,L.J.；Zhang,W.；Zhang,X.A.；Zhang,Y.L.；Lin,Z.Z.； Wang,X.D.,Synthesis of highly stable cyanine-dye-doped silica nanoparticle forbiological applications.Methods Appl Fluoresc 2018,6 (3),034002.由于/>法合成二氧化硅需要碱性条件，而近红外(NIR)染料在高碱性条件下暴露可能不能存活，而本发明采用的这种粒径可控的改进后的合成方法，减少了染料在高碱性条件下的有害暴露，使Cypate染料以非聚集状态封装在二氧化硅中；在二氧化硅纳米颗粒中掺入吲哚菁染料，一方面可以提高荧光微球的化学稳定性和光稳定性，提高纳米材料的亮度；另一方面，二氧化硅基质为染料提供了最佳的承载条件，这有助于在应用过程中保持其荧光性能，且二氧化硅表面可修饰、生物相容性、无毒无害和成本低。
虽然经步骤S4处理后获得的Cypate@SiO2/(CdTe/CdS)n-COOH微球已能够实现高亮度近红外荧光，但是由于量子点逐层自组装工艺本身存在的一定缺陷，上述制备的荧光微球结构主要是依靠静电力来维持结构的稳定性，为了进一步提高 Cypate@SiO2/(CdTe/CdS)n-COOH微球的结构稳定性、且鉴于化学键连接稳定性明显高于静电力本身的稳定性，在通过静电力吸附量子点后增加化学键连接的步骤，利用戊二醛对两层邻近的PAH层增加化学连接，具体的是基于PAH的氨基和戊二醛的醛基之间形成席夫碱(–C＝N–)，将量子点限制在两层PAH之间，所以加入戊二醛，有利于整个体系的稳定，量子点更不容易泄露出，使荧光复合微球整体的稳定性进一步提升。
最终制备的荧光复合微球在近红外区具备高荧光且结构稳定、掺杂的染料荧光可作为外部量子点荧光的补充，进一步提高整体的荧光。
因为免疫层析根据使用需求不同，NC膜的孔径大小不一，本发明提供的一种单分散高荧光近红外染料微球还可通过尺寸控制可扩大荧光微球的使用场景。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明提供的荧光复合微球对于PCT抗原的检测限能够达到0.24ng/ml，明显低于传统的胶体金检测限0.5～10ng/ml，具备更高的灵敏度；同时近红外荧光微球也比可见光染料/量子点微球在血液等样品中具备更少的背景干扰。
本发明提供的荧光复合微球之所以可以达到较低的检测限，主要是因为本发明合成的近红外复合荧光微球荧光强度是传统近红外染料微球的10～20倍，且荧光强度还可以通过增加吸附量子点的层数得到进一步增强，具体的，本发明可将多个荧光团载于在单个二氧化硅粒子中，使纳米颗粒的光吸收和发射特性不受颗粒大小的控制，复合荧光微球表面具有大量的羧基基团，通过调节微球的尺寸可控制表面羧基量，以此解决传统微球标记效率不高导致低灵敏度的问题，此处的标记效率是指偶联抗体的微球和抗原的结合效率，微球表面羧基多，有助于偶联更多的抗体，抗体的增多有助于提高偶联抗体的微球对抗原的标记效率。
本发明采用层层自组装法通过将量子点吸附在微球表面并逐层吸附聚合物层，量子点依靠静电作用吸附在微球表面，虽然静电吸附结合能力弱，但是通过增加化学健连接可极大改善其结合稳定性。传统的层层自主装主要依靠静电力、氢键等弱作用力，加入EDC/NHS和戊二醛等试剂增加了共价键连接，使得整个体系更加稳定。传统的层层自组装的成膜的作用力仅为聚电解质之间的静电作用力。本发明选择的聚电解质分别是PAA和PAH，羧基和氨基可发生酰胺化反应，共价键的形成增加了结构的稳定性。
在染料微球的表面逐层静电吸附量子点所制备的复合荧光微球具备更稳定的抗光漂白性质且荧光得到进一步提升，因此在体外诊断和生物检测等领域更具潜力。尤其是在免疫诊断领域(体外诊断中的一种)，可确定疾病的病因和病变部位，或是确定机体免疫状态是否正常，例如肝炎检测、肿瘤检测、孕检等。
附图说明
图1为本发明所述近红外复合荧光微球合成过程的示意图；
图2为本发明所述近红外荧光复合微球的制备流程图；
图3为实施例1中制备的近红外复合荧光微球的透射电镜图；
图4为实施例1中选用原料Cypate的紫外荧光图；
图5为实施例4中所述Cypate@SiO2/(CdTe/CdS)n的LBL荧光图；
图6为实施例1中制备的Cypate@SiO2/(CdTe/CdS)n的LBL过程Zeta电位；
图7实施例6中所述荧光微球稳定性实验结果图；
图8为实施例2中所述基于不同氨水投料量条件下获得的染料二氧化硅微球的尺寸调控图；
图9为实施例3中所述不同时间合成的CdTe/CdS QDs荧光图；
图10为实施例5中所述荧光复合微球在PCT样品免疫层析检测实验结果图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明进一步说明。
实施例1本发明荧光复合微球的一种较佳的具体制备过程
以下使用的吲哚菁绿染料Cypate合成过程如参考文献：Ye,Y.；Bloch,S.； Kao,J.；Achilefu,S.,Multivalent Carbocyanine Molecular Probes: Synthesis andApplications.Bioconjugate Chemistry 2005,16(1),51-61.中记载步骤，其紫外与荧光特性如图4所示；
染料二氧化硅前驱体的合成：称取4mg即0.0064mmol的Cypate染料溶于 1mL DMF中，并加入2.5mg即0.013mmol的EDC·HCl和1.5mg即0.013mmol 的NHS，避光反应3～6h，再向其中加入1.8μL即0.0064mmol的APTES继续反应12h，得到染料二氧化硅前驱体溶液Cypate-APTES；
染料二氧化硅微球的合成：量取50mL无水乙醇，并加入4mL5氨水和1mL 水，搅拌30min后，加入250μL上述的染料二氧化硅前驱体溶液Cypate-APTES，避光反应6h，最后12000rpm离心5min收集沉淀，并用无水乙醇洗2次，最后分散在2mL无水乙醇中，烘干得到染料二氧化硅微球Cypate@SiO2粉末。
近红外荧光染料二氧化硅微球表面氨基化：取上述1mL染料二氧化硅微球的乙醇溶液超声分散于30mL无水乙醇，加入900μL APTES在50℃下避光反应12h，最后12000rpm离心5min收集沉淀，并用无水乙醇洗2次，烘干得到氨基化微球Cypate@SiO2-NH2粉末。
近红外CdTe/CdS量子点的合成：首先合成碲氢化钠(NaHTe)前体——称取90mg的NaBH4(约2mmol)溶解在2ml的蒸馏水中，迅速在氮气下脱气0.5h，整个过程在冰浴下进行，快速加入127mg(1mmol)的碲粉，继续反应0.5h，将ep管密封置于4℃冰箱反应8h，黑色碲粉缓慢溶解，生成透明的紫色溶液，即为NaHTe溶液。取366.6mg(2mmol)CdCl2溶于100ml蒸馏水中，加入314 μL(3.6mmol)的3-巯基丙酸，逐滴加入2M的NaOH溶液，将溶液的pH调至 11。将合成好的NaHTe的溶液加入上述镉前体溶液中，搅拌一段时间后置于聚四氟乙烯水热釜中，180℃反应90min即得近红外CdTe/CdS量子点。
氨基化染料微球表面逐层自组装量子点即Cypate@SiO2/(CdTe/CdS)n的LBL 过程：称取10mg氨基化的染料微球超声分散于1mL水中；第1次吸附量子点：加入1mL量子点原液(5mg/mL)、超声30s后，加入30μL EDC·HCl水溶液 (0.3mg)，反应30min后12000rpm离心5min，弃上清并用水重悬至1mL；第 1次PAH包覆：向上述重悬液中加入2mL 1mg/mL的聚烯丙基胺盐酸盐(PAH， Mw～15000)水溶液，反应30min后12000rpm离心5min，弃上清并用水重悬至 1mL；第2次吸附量子点：重复第1次吸附量子点过程，即向上述重悬液中加入 1mL量子点原液(5mg/mL)和300μL EDC·HCl水溶液(0.3mg)，反应30min 后12000rpm离心5min，弃上清并用水重悬至1mL；第2次PAH包覆：重复第 1次PAH包覆过程，即向上述重悬液中加入2mL的PAH水溶液，反应30min后 12000rpm离心5min，弃上清并用水重悬至1mL；第3次吸附量子点：重复第 1次吸附量子点过程，操作步骤完全相同，不再赘述；第3次PAH包覆：重复第 1次PAH包覆过程，操作步骤完全相同，不再赘述；PAA包覆：向上述1mL重悬液中加入2mL的1mg/ml的聚丙烯酸(PAA,Mw～3000)水溶液，反应30min后12000 rpm离心5min，弃上清并用水重悬至1mL；戊二醛交联：向1mL重悬液中加入 10μL 0.5vol％的戊二醛水溶液，反应30min后12000rpm离心5min弃上清，再水洗2次，最终定容至1mL，即得到1ml浓度为10mg/ml的量子点荧光微球。
如图3所示为实施例1中制备的产物量子点荧光微球的透射电镜图，左图为比列尺1μm下观察图，右图为比例尺200nm下的观察图。
如图6为Cypate@SiO2/(CdTe/CdS)n的LBL过程Zeta电位图，横坐标为组装次数，共计7次组装，从左至右依次对应上述第1次吸附量子点(染料微球吸附第一层QDs)，第1次PAH包覆(PAH氨基化)，第2次吸附量子点(吸附第二层QDs)，第2次PAH包覆(PAH氨基化)，第3次吸附量子点(吸附第三层QDs)、第3次PAH包覆(PAH氨基化)，PAA包覆(表面PAA羧基化)，通过Zeta电位图可以判断上述组装过程中的每次组装是否成功。
实施例2改变氨水的投料量以调控微球尺寸
设置4个对比组，每组在染料二氧化硅微球的合成步骤中，设置不同的氨水投料量，加入的氨水(25％～28％wt.)用量分别为2mL(浓度0.5M)、3mL(0.7M) 和4mL(0.9M)，其余操作均与实施例1相同的条件下得到不同尺寸的染料二氧化硅微球Cypate@SiO2粉末；
如图8所示，为基于不同氨水投料量条件下获得的染料二氧化硅微球的尺寸调控图。
实施例3改变合成时间以达到量子点发射可调
设置5个对比组，每组在CdTe/CdS量子点的合成步骤中，具体操作如下：称取90mg的NaBH4(约2mmol)溶解在2mL的蒸馏水中，迅速在氮气下脱气 0.5h，整个过程在冰浴下进行，快速加入127mg(1mmol)的碲粉，继续反应 0.5h，将ep管密封置于4℃冰箱，溶液缓慢变成透明的紫色溶液，即为NaHTe 溶液。取366.6mg(2mmol)CdCl2溶于100mL蒸馏水中，加入314μL(3.6mmol) 的3-巯基丙酸，逐滴加入2M的NaOH溶液，将pH调至碱性，然后将所制备的无氧NaHTe迅速加入上述溶液中，充分搅拌。最后，将10mL混合前驱体溶液转移到内衬聚四氟乙烯的不锈钢高压釜中，在180℃保持一定的反应时间，具体每组设置的反应时间分别为45min、55min、65min、75min和90min左右，并通过水冷过程冷却至室温，即得相应的CdTe/CdS量子点。
如图9所示为不同时间合成的不同发射的CdTe/CdS QDs荧光发射图，说明反应时间对最终合成的量子点尺寸有较大的影响，从而影响量子点的荧光发射区间。
实施例4逐层自组装的次数对近红外复合荧光微球荧光强度的关系
设置4个对比组，每组在氨基化染料微球表面逐层自组装量子点过程中，组装的量子点层数不同，对不同组装阶段的染料微球进行荧光测试，具体操作如下：每组首先称取10mg氨基化的染料微球超声分散于1mL的超纯水中，加入1mL 量子点原液，搅拌30min后，加入30μL EDC·HCl水溶液反应30min后，离心弃上清并用超纯水重悬至1mL。接着向上述重悬液中加入2mL 1mg/mL的聚烯丙基胺盐酸盐水溶液，反应30min后离心弃上清并用超纯水重悬至1mL。各组吸附量子点和PAH包覆的操作重复次数分别为0、1、2、3次；之后向每组1mL 重悬液中加入2mL的1mg/ml的聚丙烯酸水溶液，反应30min后，离心弃上清并用超纯水重悬至1mL。最后向1mL重悬液中加入10μL的0.5vol％戊二醛水溶液，反应30min后，离心弃上清并水洗2次，复溶于1mL超纯水中，最终获得复合荧光微球。
图5为Cypate@SiO2/(CdTe/CdS)n的LBL荧光图，从下至上依次为染料微球、染料微球吸附一层CdTe/CdS量子点、染料微球吸附两层CdTe/CdS量子点、染料微球吸附三层CdTe/CdS量子点的荧光图。
实验例5荧光复合微球在PCT样品免疫层析检测实验过程
称取实施例1中制备的荧光微球加入超纯水超声复溶(体系浓度＝10mg/ml)，取上述微球溶液100μl，加入500μl 50mM pH 6.1的MES缓冲液，超声分散后， 15000rpm,4℃离心5min。除去上清。向上述洗好的微球中加入500μl 50mM pH 6.1 的MES缓冲液超声分散。向上述微球溶液中加入10μl浓度为10mg/ml的EDC，快速涡旋，室温孵育30min。向活化后的微球溶液中加入35μl降钙素原(PCT) 抗体(2.9mg/ml，大约0.1mg抗体)，快速涡旋；再加入3.6μl鸡IgY抗体 (14mg/ml，大约0.05mg),快速涡旋。室温孵育1～3h。将偶联溶液超声分散，向上述偶联溶液中加入5μl牛血清白蛋白(BSA)封闭剂后涡旋。37℃封闭 30min～1h。用pH8.0的Tris保存液清洗4次，并用保存液定容至100μl.在封闭后的结合垫进行包被。将包被好的条带真空干燥。制备试纸条：142样品垫，结合垫，142缓冲垫，NC膜，吸水垫。用人血清白蛋白稀释PCT抗原标准品100 倍，制成大约18000ng/ml,再依次3倍稀释15次+空白阴性对照。在18.5℃下，加入60μl检测液，孵育8min，读值，结果如图10中结果表所示，本发明制备的荧光复合微球在PCT样品免疫层析检测实验结果图。
实施例6不同时隔测量荧光微球的荧光考察其稳定性
将实施例1中制备的近红外荧光微球在放置10/20/30/45/60天时，测量微球的荧光，结果如图7所示。

Claims (2)

1.一种高亮度的近红外荧光复合微球的制备方法，其特征在于：包括以下步骤，
步骤S1.1近红外染料二氧化硅前驱体的合成：将 Cypate染料溶于N,N-二甲基甲酰胺或者二甲基亚砜中，加入1-乙基-（3-二甲基氨丙基）碳酰二亚胺盐酸盐和N-羟基丁二酰亚胺避光反应3~6h后，向其中加入3-氨基丙基三乙氧基硅烷继续反应12~24h，得到染料二氧化硅前驱体溶液Cypate-APTES；
步骤S1.2近红外染料二氧化硅微球的合成：在无水乙醇体系中加入所述染料二氧化硅前驱体溶液Cypate-APTES后，室温避光搅拌15 min，滴加一定量的硅酸四乙酯，继续室温搅拌30min~120min后，加入浓度25%~28%wt.的氨水，避光反应6h，即得到染料二氧化硅微球Cypate@SiO2；
步骤S2染料微球表面进行氨基化：将Cypate@SiO2分散于无水乙醇，加入APTES水浴50~90℃避光反应12~24 h，即得氨基化染料微球；
步骤S3.1量子点制备：首先合成碲氢化钠前体：取一定量的硼氢化钠溶于水，在氮气保护下加入碲粉反应2~4h获得NaHTe溶液，置于4℃保存；将氯化镉溶于水中，加入一定量的3-巯基丙酸，再用氢氧化钠将溶液调至碱性，制成镉前体溶液；将合成好的NaHTe的溶液加入上述镉前体溶液中，搅拌一段时间后置于聚四氟乙烯水热釜中，180℃反应90min即得近红外CdTe/CdS量子点；
步骤S3.2氨基化染料微球表面逐层自组装量子点制备：首先称取一定量的氨基化染料微球超声分散于超纯水中，加入量子点原液孵育 30 min，然后加入一定量的1-乙基-（3-二甲基氨丙基）碳酰二亚胺盐酸盐水溶液继续孵育30 min后，离心弃上清并用超纯水重悬至MmL，M大于0；接着向上述重悬液中加入一定量的聚烯丙基胺盐酸盐水溶液孵育30min，离心弃上清并用超纯水重悬至M mL；重复上述吸附量子点和PAH包覆的操作，得到吸附n层量子点的Cypate@SiO2/(CdTe/CdS)n微球，所述量子点直径为5~15nm，n为量子点组装层数且n=3；
步骤S4加入聚丙烯酸对微球表面进行羧基化：向步骤S3.2得到的Cypate@SiO2/(CdTe/CdS)n微球重悬液中加入聚丙烯酸水溶液，孵育30 min后，离心弃上清并用超纯水重悬至MmL；
步骤S5加入戊二醛对外两层量子点组装层加强化学连接：在步骤S4获得的Cypate@SiO2/(CdTe/CdS)n-COOH微球重悬液中加入0.1Vol%的戊二醛水溶液孵育30 min后，离心弃上清并水洗2次，复溶于超纯水中即得近红外复合荧光微球。
2.权利要求1所述制备方法制得的高亮度的近红外荧光复合微球。
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