CN116559424A - 一种稳定高发光的钙钛矿量子点组装微球免疫层析探针、制备方法及试纸条和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种稳定高发光的钙钛矿量子点组装微球免疫层析探针、制备方法及试纸条和应用,以树枝状介孔二氧化硅微球为模板,在水溶液中与钙钛矿前体盐即溴化铅和溴化铯加热搅拌,干燥处理后放入管式炉中高温煅烧获得了具有高荧光强度的钙钛矿量子点纳米荧光微球,之后洗涤;接着,依次对微球表面进行氨基修饰和羧基修饰,将羧基修饰的微球与抗体进行偶联以及封闭,最终获得稳定高发光的钙钛矿量子点组装微球免疫层析探针。本发明合成了一种具有高发光强度、半峰宽窄、色纯度高、颜色可调、水相胶的新型荧光微球探针,应用于侧流免疫层析平台检测心衰标志物NT‑pro BNP抗原的裸眼定性检测,并通过智能手机软件读取信号强度进行定量分析,应用效果好。
Description
技术领域
本发明涉及一种稳定高发光的钙钛矿量子点组装微球免疫层析探针、制备方法及试纸条和应用。
背景技术
心力衰竭(HF)是各种心脏疾病的严重表现或晚期阶段,它主要是由心脏泵血功能轻微或严重受损造成的,是一种由呼吸困难、疲劳等症状组成的“综合征”,可分为急性心衰和慢性心衰,目前诊断心力衰竭主要靠监测血液中NT-pro BNP的浓度、心电图、X线和超声心电图以判断心衰的类型。NT-pro BNP精准和高灵敏检测,对心力衰竭的早期诊断、危险分层及预后的估计均具有重要的价值。
即时诊断是目前广受关注与好评的诊断模式,与目前主流的NT-pro BNP实验室检测方法如电化学发光、化学发光,酶联免疫吸附等方法相比,其检测仪器携带及操作简便、不限场地、检测时间短,因此应用范围广泛,尤其适合床旁监测及家庭自检应用场景,对于心力衰竭的诊断尤其是对预后患者随时监测NT-pro BNP浓度都具有重要意义。
目前基于侧向流免疫分析平台所用到的标记探针以比色或者荧光为主,比色常用到的是胶体金,胶体金是一种开发简单的材料,但其检出限低无法满足低检出限标志物的需求,只用于定性分析。相比于胶体金,荧光微球能够满足低浓度标志物的需求。目前开发的荧光微球材料通常分为这几大类:第一大类为染料,染料目前已有的种类分为有机荧光染料(如常见的FITC、Cy5)。虽然荧光染料在目前的市面上应用也很广泛,但是其荧光量子产率低,因此对于低浓度标志物检测存在着灵敏度不足的缺点。第二类是镧系稀土配合物,已成功用于商业化荧光标记材料,单其发射波的一般先于稀土粒子类型,目前可用的仅为610-615nm发射的铕配合物微球。该材料易于与水分子配位从而导致猝灭,同时在持续激发下光学稳定性差,因此限制了其应用。第三类是量子点,量子点是一种半导体晶体,尺寸通常在1-10nm范围内,传统的量子点是由Ⅳ、Ⅱ-Ⅵ、Ⅳ-Ⅵ或者Ⅲ-Ⅴ族的元素组成。由于量子点的量子限域效应,这一类材料通常具有荧光量子产率高、摩尔消光系数大、宽吸收且窄发射、斯托克斯位移大以及抗光漂白等优点,因此在免疫层析平台上应用广泛。但是传统的量子点必须通过调节其尺寸来调节其发射波长,才能获得不同颜色的量子点材料,大大增加了实验的难度。钙钛矿量子点作为一种新型的量子点材料,除了具有量子点所具有的优点外,它可以通过调节卤素成分获得不同发射波长的量子点,同时具有比传统量子点更窄的半峰宽以及高色纯度。因此,更加适合于免疫层析平台的构建。
全无机钙钛矿量子点是一种离子型晶体,具有离子的特性,因此对于极性环境非常敏感。为了改善其稳定性,目前开发了几类方法,分为:表面钝化、聚合物包裹以及物理包封等。表面钝化目前发展的多以有机配体或者无机盐进行钝化,虽然在一定程度上改善了其稳定性,但是对于达到在水中的稳定性远远不够。聚合物包裹通常采用有机聚合物包覆,如两性配体有机聚合物、聚苯乙烯等,虽然目前已有文献报道了在水中稳定的钙钛矿材料,但是由于其表面包裹的有机聚合物是疏水的且多是有机烷基链也无法进行表面修饰,因此对于其应用于水相中非常困难,无法应用于免疫层析平台。物理包封多用TiO2、Al2O3以及SiO2等作为包封材料,前两者虽然能够获得稳定性很好的钙钛矿材料,但是其表面的物理基质不亲水,更无法获得纳米基水相胶体分散的量子点探针,无法应用于免疫层析平台。而SiO2作为一种亲水基质,通过包封硅层合成标记探针的材料不在少数,而且SiO2是目前非常广泛应用于包封各种纳米材料的一种基质。但是本身是一种多孔材料,表面所含的微孔易让水分子通过,而钙钛矿量子点又是一种遇水猝灭的材料,同时包封硅层的实验过程的溶液是极性条件,因此通过传统的方法在钙钛矿量子点表面包封二氧化硅无法获得稳定的钙钛矿材料。
固相熔融法是一种有效合成具有表面致密保护层的纳米材料的方法,可用于二氧化硅等基质载体的封口处理,进行有效包覆,将其用于钙钛矿量子点的包覆有望解决因表面包覆基质不致密的问题。目前,二氧化硅载体的获取途径主要是商用的分子筛硅模板以及实验室制备的介孔二氧化硅。如常见的MCM-41、SBA-15、MS-550等,但是这类模板是一种具有有序孔道、长方体形状的模板,这一类模板通常得在600℃的高温才能融化,而CsPbBr3钙钛矿量子点的熔点是在567℃,且该类模板孔道开放极差,难以实现基元的载体内部高效填充。因此,以上述二氧化硅模板,难以合成高负载量以及发光基元均匀分布的钙钛矿量子点荧光微球。为了解决以上问题,本发明开发了以中心-放射到孔道结构的大孔型树枝状二氧化硅作为开放孔道模板进行钙钛矿量子点荧光微球合成的策略。通过对模板、温度、负载前体以及可控成分去调节发射性能,首次合成了可应用于侧流免疫层析平台的高亮度/水溶性探针,并用于定量检测心肌标志物NT-pro BNP抗原。
侧流免疫层析技术是一种非常优异的快检技术、具有方便快捷的优点,但目前应用于此的标记探针基本上多是以胶体金或者染料荧光微球为主,这两类材料都存在着灵敏度不足的缺点,因此,本发明基于此构建了一种新型的量子点荧光探针。钙钛矿量子点作为一种优异的量子点,具有比传统量子点更窄的半峰宽以及荧光可调等优点被广泛应用于各个领域,然而,使用常规的化学胶体法获得的钙钛矿量子点存在着稳定性差等缺点。因此,本发明提出通过使用固相熔融法将钙钛矿量子点封装在树枝状二氧化硅球中,以获得具有致密保护层且具有高度亲水性、高度稳定性、高色纯度以及发射可调的钙钛矿量子点荧光探针。固相熔融法为钙钛矿量子点提供致密保护层,树枝状二氧化硅为其生长提供足够大的比表面积,二氧化硅又为其应用提供了高度的生物相容性,通过此构建了一种新型的荧光探针,用于侧流免疫层析平台,拓宽了钙钛矿量子点的应用。
发明内容
针对现有技术存在的上述技术问题,本发明的目的在于提供一种稳定高发光的钙钛矿量子点组装微球免疫层析探针、制备方法及试纸条和应用。本发明公开了一种基于高温固相熔融法将钙钛矿量子点原位合成并封装再树状介孔二氧化硅的方法,旨在通过高温合成表面致密耐极性溶剂的钙钛矿组装体,并对组装体表面的硅进行功能化修饰合成生物相容的荧光探针,合成了一种具有高发光强度、半峰宽窄、色纯度高、颜色可调、水相胶的新型荧光微球探针,将其应用于侧流免疫层析平台检测心衰标志物NT-pro BNP抗原的定性检测,并通过只能手机软件读取信号强度进行定量分析。
本发明是以树枝状介孔二氧化硅微球为模板,在高温熔融状态下生长钙钛矿量子点,同时模板在高温下表面的树状介孔闭合,表面的二氧化硅层在高温状态下变得致密,同时二氧化硅层是亲水层,制备一种尺寸均匀、高荧光量子产率、半峰宽窄且具有良好生物相容性的可功能化的钙钛矿量子点荧光微球。首先通过阴离子辅助法合成树状二氧化硅模板,随后在水溶液中与钙钛矿前体盐即溴化铅和溴化铯加热搅拌,使得前体盐均匀分散在二氧化硅球表面与介孔内部,对其进行干燥处理后放入管式炉中高温煅烧获得了具有高荧光强度的钙钛矿量子点纳米荧光微球。接着,通过3-氨丙基三乙氧基硅烷对微球表面进行氨基修饰以获得表面带有氨基基团的荧光微球,之后加入丁二酸酐与微球表面的氨基发生反应获得表面带有羧基基团的微球,将微球与抗体进行偶联以及封闭,制备获得了荧光信号探针。将其应用于侧流免疫层析平台进行目标物的免疫识别分析,定性检测心肌标志物NT-pro BNP以判断心衰的发生。
本发明采用的技术方案如下:
所述的一种稳定高发光的钙钛矿量子点组装微球免疫层析探针的制备方法,其特征在于以树枝状介孔二氧化硅微球为模板,随后在水溶液中与钙钛矿前体盐即溴化铅和溴化铯加热搅拌,使得钙钛矿前体盐均匀分散在二氧化硅微球表面与介孔内部,对其进行干燥处理后放入管式炉中高温煅烧获得了具有高荧光强度的钙钛矿量子点纳米荧光微球,之后加入去离子水洗涤,洗去多余的盐;接着,通过3-氨丙基三乙氧基硅烷对微球表面进行氨基修饰以获得表面带有氨基基团的荧光微球,之后加入丁二酸酐与微球表面的氨基发生反应获得表面带有羧基基团的微球,将羧基修饰的微球与抗体进行偶联以及封闭,最终获得稳定高发光的钙钛矿量子点组装微球免疫层析探针。
所述的一种稳定高发光的钙钛矿量子点组装微球免疫层析探针的制备方法,其特征在于二氧化硅微球模板在水溶液中与钙钛矿前体盐加热搅拌,使得钙钛矿前体盐均匀分散在二氧化硅微球表面与介孔内部的具体过程为:称取溴化铯和卤化铅加入至去离子水中,于75-85℃下搅拌5-20min,随后加入二氧化硅微球模板,于75-85℃下继续搅拌0.5-2h;其中,所述溴化铯、卤化铅和去离子水的投料比为33-90mg:110-190mg:15-25mL;所述二氧化硅微球模板与溴化铯的质量比为1:0.4~1。
所述的一种稳定高发光的钙钛矿量子点组装微球免疫层析探针的制备方法,其特征在于高温煅烧是本实验形成稳定性荧光微球的关键:使用溴化铅或者氯化铅中的一种或两种合成的微球在进行煅烧时只需要在空气里煅烧即可,但是对于使用碘化盐合成的微球而言,必须在氩气的条件下进行煅烧。高温煅烧的温度选取基本上在500℃以上。高温煅烧的温度为500-600℃,保持时间0.5-1h。
所述的一种稳定高发光的钙钛矿量子点组装微球免疫层析探针的制备方法,其特征在于通过3-氨丙基三乙氧基硅烷对微球表面进行氨基修饰的过程为:将钙钛矿量子点纳米荧光微球分散在乙醇中,加入氨水和3-氨丙基三乙氧基硅烷,在室温下搅拌反应10-15h,之后离心,用乙醇清洗,即获得表面带有氨基基团的荧光微球。
所述的一种稳定高发光的钙钛矿量子点组装微球免疫层析探针的制备方法,其特征在于通过丁二酸酐进行修饰的过程为:将带有氨基基团的荧光微球分散在含有丁二酸酐的N,N-二甲基甲酰胺溶液中,搅拌反应3-5h,之后离心,用乙醇和水清洗,即获得羧基修饰的荧光微球。
所述的一种稳定高发光的钙钛矿量子点组装微球免疫层析探针的制备方法,其特征在于将羧基修饰的微球与抗体进行偶联以及封闭的过程为:将羧基修饰的微球加入pH=6.0PB缓冲液中,加入NHS和EDC,于摇床中37℃孵育20~40min;随后离心收集产物;将产物重悬于pH=7.4PB缓冲液中,加入标记抗体,37℃摇床反应2~3h;反应结束后,离心,用含有0.5-2%BSA的pH=7.4PB缓冲液封闭1.5-3h;随后离心收集微球,用pH=7.4PB缓冲液洗涤后,保存在pH=7.4PB缓冲液中冷藏保存。
一种用于检测心肌标志物NT-pro BNP抗原的免疫层析试纸条,包含本发明所述的钙钛矿量子点组装微球免疫层析探针。
所述的一种用于检测心肌标志物NT-pro BNP抗原的免疫层析试纸条,其特征在于包括样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水纸和塑料底板,硝酸纤维素膜搭接在硝酸纤维素膜上,样品垫、结合垫依次叠压在硝酸纤维素膜的左端,吸水纸叠压在硝酸纤维素膜的右端;所述硝酸纤维素膜上设置靠近结合垫的检测线T线、靠近吸水纸的一条控制线C线;
所述结合垫上包被所述的钙钛矿量子点组装微球免疫层析探针;
所述硝酸纤维素膜的T线和C线上分别包被捕获抗体和羊抗鼠抗体。
所述的一种用于检测心肌标志物NT-pro BNP抗原的免疫层析试纸条的应用,其特征在于取含有NT-pro BNP抗原的缓冲液滴加至免疫层析试纸条的样品垫上,在吸收垫的毛细作用力下,抗原和探针一起朝着检测区域以及吸收垫方向移动,在经过检测线和质控线时,抗原和探针被捕获形成了三明治免疫夹心结构;5-20min后用智能手机的“colorpicker”软件读取硝酸纤维素膜的T线的G值进行定量,实现了荧光响应的检测模式,进行裸眼定性判读以及手机定量分析。裸眼判读值可达0.2ng/mL,定量检出限达0.035ng/mL。
本发明的关键点在于:
1、本发明基于固相熔融法合成了分散性好、荧光量子产率高及半峰宽窄的以树枝状介孔二氧化硅为模板的CsPbX3量子点荧光探针,方法简单,操作便捷,同时探究了孔径对于量子点生长的影响。钙钛矿量子点是一类离子型晶体,当它接触到极性溶剂时,会发生猝灭。如果使用常规的方法将钙钛矿量子点封装在树枝状二氧化硅球中,获得的微球表面没办法提供致密的保护层避免钙钛矿量子点接触极性溶剂,荧光微球一旦接触到水或者乙醇等极性溶剂,荧光微球内部的钙钛矿量子点会猝灭。而本发明获得的微球是具有致密二氧化硅层的荧光微球,致密的保护层可以阻挡极性环境与钙钛矿量子点接触。
2、本发明构建了一种新型的量子点荧光探针,即具有高荧光量子产率、窄发射、分散性好且稳定性好的钙钛矿量子点荧光探针,拓宽了钙钛矿量子点的应用,也提供了一种新型的荧光纳米标记材料。通过将钙钛矿量子点封装在树枝状介孔二氧化硅中,可集成多个量子点在微球内部,与单个量子点相比,实现单颗纳米球负载多个量子点实现单个模板的信号增强作用。利用微球表面大量的硅羟基在碱性条件下可进行脱水缩合的原理,对微球表面进行氨基化修饰,氨基继续与丁二酸酐反应获得了表面羧基化的荧光微球。通过EDC和NHs活化微球表面羧基,与抗体进行偶联后加入BSA封闭获得了荧光探针。通过一系列实验反应,制备获得的探针具有高效的免疫识别活性、优良的液相胶体分散性以及高量子产率。
3、本发明首次将原创性的钙钛矿量子点微球探针应用于侧流免疫层析平台,以望提升试纸条的检测灵敏度。通过优化抗体偶联比、层析缓冲液、探针用量等条件,实现心肌标志物NT-pro BNP的低浓度响应。通过裸眼判读T线的存在与否判断心衰的是否发生,通过智能手机的“colorpicker”软件读取T线的G值信号实现定量分析,较好地解决了NT-proBNP项目的即时诊断需求。
与现有技术相比,本发明取得的有益效果是:
1、与现有技术相比,本发明主要是通过模板优化,解决孔道开发性问题,实现钙钛矿量子点深层包埋与高负载量。同时,通过模板孔道优化、封口温度优化,解决钙钛矿量子点低负载率、分散性差的问题,平衡了光学性能与胶体分散性能,最终得到了高荧光量子产率、窄半峰宽、液相胶体分散性优异的荧光纳米标记材料。
2、通过调控卤化物的比例合成不同发射波长的量子点,获得了一系列荧光可调、高荧光量子产率的钙钛矿量子点荧光微球,操作简易且方法简单。
3、通过对荧光微球进行表面功能化修饰以偶联抗体,制备了一种用于侧流免疫层析平台的信号探针用于检测心肌标志物NT-pro BNP以判断心衰的是否发生,首次实现了钙钛矿量子点在侧流免疫层析平台的应用,实现了裸眼可视化的定性分析以及便携式平台手机的定量分析。
附图说明
图1为本申请iSPQS探针的合成路线和结构示意图;
图2为实施例1获得的树枝状介孔二氧化硅球dSiO2模板以及SPQS荧光微球的性能表征结果图;
图2中:(a)树枝状介孔二氧化硅球dSiO2的扫描电镜图;(b)树枝状介孔二氧化硅球dSiO2的透射电镜图;(c)SPQS荧光微球的透射电镜图;(d)单个树枝状介孔二氧化硅球SiO2的扫描电镜图;(e)单个树枝状介孔二氧化硅球dSiO2的透射电镜图;
(f)单个SPQS荧光微球的的透射电镜图;(g)单个SPQS荧光微球的STEM图和EDS元素分布(Cs、Pb、Br、Si、O和元素叠加分布图);
图3为本发明iSPQS探针合成过程中中间产物及iSPQS探针的性能表征结果;
图3中:(a)不同发射波长的SPQS荧光微球的荧光光谱图,插图为荧光微球在365nm激发下的照片;(b)SPQS荧光微球浸泡在水中的荧光强度随时间变化图,插图分为为日光和紫外灯下的照片;(c)iSPQS探针制备过程的粒径变化图;(d)SPQS荧光微球的XRD图谱;
图4为实施例1中获得的iSPQS在试纸条上的检测原理图、试纸条照片以及手机定量读取检测结果的线性拟合曲线。
图4中:(a)试纸条检测原理图;(b)iSPQS信号探针检测不同浓度的心衰标志物NT-pro BNP抗原的免疫层析试纸条的照片(在365nm紫外光激发下的荧光照片),其裸眼检测限为0.2ng/mL;(c)所示检测结果的相应标准曲线及其定量检测限。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明,但本发明的保护范围并不限于此。
本发明实施例中浓盐酸的质量浓度是36%,氨水的质量分数是25%。
实施例1(参见图1):
1、dSiO2模板的合成:
称取0.068mg的三乙醇胺(TEA)将其加入到50mL的去离子水中,在80℃下预先搅拌30min,接着加入380mg十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)和168mg水杨酸钠(NaSal)继续搅拌60min,之后加入8mL的正硅酸四乙酯,继续搅拌180min,结束反应获得粗产品。将上述产品高速离心以洗去多余的CTAB,离心获得的白色沉淀分散在浓盐酸和甲醇(体积比1:1)的混合溶液中,在60℃下萃取6h,需要萃取2次,以除去多余的CTAB。萃取完成后,将其离心获得白色略带透明沉淀,将其用乙醇继续洗涤数次以获得终产品树枝状介孔二氧化硅球dSiO2模板。
实施例1获得的树枝状介孔二氧化硅球dSiO2的扫描电镜图见图2(a),单个树枝状介孔二氧化硅球dSiO2的扫描电镜图见图2(d)。实施例1获得的树枝状介孔二氧化硅球dSiO2的透射电镜图见图2(b),单个树枝状介孔二氧化硅球dSiO2的透射电镜图见图2(e)。图2的a、b、d和e观察到获得单分散且均匀、尺寸大约在160nm左右的dSiO2模板,说明模板分散性好。
2、SPQS荧光微球的合成
将dSiO2模板放置80℃的烘箱烘干2h,称取85.2mg的dSiO2模板待用。称取85.2mg溴化铯和146.8mg溴化铅加入20mL去离子水在80℃下搅拌10min,加入上述已经干燥的85.2mg的dSiO2模板,继续搅拌1h。将溶液在80℃下的环境下烘干至干燥后,在玛瑙研钵中研磨15-20min至混合均匀。将上述混合物放置到瓷舟中,放入管式炉设置升温程序煅烧,以5℃/min的速度加热至560℃保持1h后进行降温。煅烧完成后获得橙黄色粉末,加入去离子水洗涤,洗去多余的盐,此过程重复多次,对其进行长时间破碎,最后获得的绿色纳米球(钙钛矿荧光微球)分散在水中待用。
实施例1获得的SPQS荧光微球的透射电镜图见图2(c),单个SPQS荧光微球的透射电镜图见图2(f)。图2(c)说明合成获得的SPQS荧光微球具有良好的分散性;图2(f)观察到模板内部负载了说明内部负载了致密的量子点。
单个SPQS荧光微球的STEM图和EDS元素分布见图2(g),验证了SPQS荧光微球的组成成分:Cs、Pb、Br、Si、O。
3、SPQS-COOH荧光微球的合成:
将步骤2获得的钙钛矿荧光微球的水分散液离心后,取48mg钙钛矿荧光微球沉淀加入40mL乙醇中分散,并加入500μL氨水、40μL 3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)混合,在室温下搅拌反应12h。将得到的氨基修饰的荧光微球离心,用乙醇清洗,然后分散在40mL含5mg/mL丁二酸酐的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液中,继续搅拌反应4h后得到羧基修饰的SPQS(SPQS-COOH)纳米结构。用乙醇和水洗涤几次后分散于去离子水中。
图3(b)是实施例1中合成的SPQS-COOH微球在去离子水中浸泡60天的荧光强度变化图,图3(b)中可以观察到,经过60天后的水溶液测试,SPQS的荧光强度没有发射太大变化,验证了SPQS微球的水稳定性。
图3(d)表示的是实施例1中SPQS微球的XRD图谱。图3(d)可以看出SPQS微球的XRD图谱能与CsPbBr3的标准XRD卡片基本对应上,(100)、(110)、(111)、(200)四个主要晶面是吻合的,验证了SPQS微球内部CsPbBr3良好的结晶度。
4、iSPQS探针的合成:
单克隆抗体1(标记抗体,具体为NT-pro BNP McAb5)通过共价偶联与微球表面连接。取1mgSPQS-COOH分散在1mL的10mM PB 6.0中,加入100μL的NHS(10mg·mL-1)和50μL的EDC(10mg·mL-1)后,将其放入摇床中孵育30min,之后将活化完成的SPQS-COOH离心并重悬于0.25mL的PB(10mM,pH=7.4)中,加入单克隆抗体1(标记抗体,用量约20μg)反应2.5h。随后,在含有1%BSA(w/v)的PB缓冲液(10mM,pH=7.4)中封闭2h。然后,通过离心收集生成的iSPQS,然后用PB缓冲液(10mM,pH=7.4)洗涤3次,最终将其保存在PB缓冲液中,存储在4℃下的环境中。
图3(c)表示的是实施例1中合成探针过程获得的不同阶段的产物的粒径图,图3c中测出的尺寸是使用马尔文粒径-电位仪获得的结果,待测样本是在水溶液中测出来的,获得的是微球的水合粒径数据结果。图3(c)水合粒径的测试是为了说明在iSPQS制备过程中微球水合粒径基本不发生变化,从而验证制备过程中微球保持良好的分散性。图3(c)中可看到在合成iSPQS探针的各个阶段获得的产物的粒径没有发生太大变化,说明制备过程中,微球一直保持着良好的分散性且没有发生聚集现象。
5、iSPQS荧光探针的免疫层析试纸条:
免疫层析试纸条主要由样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水纸、塑料底板五个部分组成。首先用样品垫处理液(纯水,含1.2%Tris,0.12%EDTA,0.04%酪蛋白酸钠,1%海藻糖,0.5%吐温-20,pH=7.4)处理样品垫,将iSPQS荧光探针溶于PB缓冲液(0.02mol/L,pH=7.4,含05%BSA,0.1%酪蛋白酸钠,3%海藻糖,0.5%吐温-20)的缓冲溶液中,并均匀喷涂在结合垫上,并在37℃下干燥。
将单克隆抗体2(捕获抗体,具体为NT-pro BNP McAb10)(1mg/mL)的PB(pH=7.4,0.01mol/L,含1%BSA)缓冲溶液以及羊抗鼠抗体(1mg/mL)的PB(pH=7.4,0.01mol/L)缓冲溶液用XYZ三维划膜喷金仪以0.75μL/cm的用量分别固定在NC膜的T线和C线上,然后在37℃下干燥。最后将吸水纸、NC膜、结合垫和样品垫依次组装,并用切条机切成3.8mm宽的纸条于干燥条件下密封保存,即制得基于iSPQS荧光探针的免疫层析试纸。
6、NT-pro BNP抗原的检测:
取80μL含有NT-pro BNP抗原的缓冲液滴加至免疫层析试纸条的样品垫上,在吸收垫的毛细作用力下,抗原和探针一起朝着检测区域以及吸收垫方向移动,在经过检测线和质控线时,抗原和探针被捕获形成了三明治免疫夹心结构。15min后用相机拍照,用于之后的裸眼判读以及手机定性分析。
利用用智能手机通过图像采集和颜色输出功能来对待测样品进行分析,图像的颜色被转换成数据,通过手机“colorpicker”颜色识别软件读取T线上图像的G值,以G值为纵坐标,NT-pro BNP抗原浓度为横坐标绘制标准曲线。
图4表示的是实施例1中获得的iSPQS在试纸条上的检测原理图、试纸条照片以及手机定量读取检测结果的线性拟合曲线。
图4是层析实验的原理和测试结果图:图4(a)在检测时,将80μL含有不同浓度NT-pro BNP的样品溶液滴加到样品垫上,在毛细管力的作用下,抗原流向结合垫上与被预先喷涂的探针结合形成免疫复合物,当流过检测区域时,与T线的捕获抗体特异性识别,形成三明治夹心结构,多余的探针继续移动并与C线上的IgG抗体捕获。图4(b)是荧光灯下试纸条的检测结果照片,图中可以观察到在0.2ng/mL处观察到开始出现T线,实现了0.2ng/mL的裸眼读数。通过手机color picker读取T线上图像的G值,以G值为纵坐标,NT-pro BNP抗原浓度为横坐标绘制标准曲线,标准曲线绘制结果见图4(c),图4(c)可以观察到该实验的线性范围实在0.2-10ng/mL,线性相关系数为0.995说明具有良好的线性,检出限为0.035ng/mL。
实施例2:(对应630nm荧光微球)
1、dSiO2模板的合成:
称取0.068mg的三乙醇胺(TEA)将其加入到50mL的去离子水中,在80℃下预先搅拌30min,接着加入380mg十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)和168mg水杨酸钠(NaSal)继续搅拌60min,之后加入8mL的正硅酸四乙酯,继续搅拌180min,结束反应获得粗产品。将上述产品高速离心以洗去多余的CTAB,离心获得的白色沉淀分散在浓盐酸和甲醇(体积比1:1)的混合溶液中,在60℃下萃取6h,需要萃取2次,以除去多余的CTAB。萃取完成后,将其离心获得白色略带透明沉淀,将其用乙醇继续洗涤数次以获得终产品。
2、SPQS荧光微球的合成
将dSiO2模板放置80℃的烘箱烘干2h,称取85.2mg的dSiO2模板待用。称取85.2mg溴化铯和184.4mg碘化铅加入20mL去离子水在80℃下搅拌10min,加入上述已经干燥的85.2mg的dSiO2模板,继续搅拌1h。将溶液在80℃下的环境下烘干至干燥后,在玛瑙研钵中研磨15-20min至混合均匀。将上述混合物放置到瓷舟中,放入管式炉设置升温程序煅烧(煅烧需要在氩气的条件下进行,以保护PbI2不被氧化),以5℃/min的速度加热至560℃保持1h后进行降温。煅烧完成后获得橙黄色粉末,加入去离子水洗涤,洗去多余的盐,此过程重复多次,对其进行长时间破碎,最后获得的红色纳米球分散在水中待用。
实施例3:(对应446.5nm荧光微球)
1、dSiO2模板的合成:
称取0.068mg的三乙醇胺(TEA)将其加入到50mL的去离子水中,在80℃下预先搅拌30min,接着加入380mg十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)和168mg水杨酸钠(NaSal)继续搅拌60min,之后加入8mL的正硅酸四乙酯,继续搅拌180min,结束反应获得粗产品。将上述产品高速离心以洗去多余的CTAB,离心获得的白色沉淀分散在浓盐酸和甲醇(体积比1:1)的混合溶液中,在60℃下萃取6h,需要萃取2次,以除去多余的CTAB。萃取完成后,将其离心获得白色略带透明沉淀,将其用乙醇继续洗涤数次以获得终产品。
2、SPQS荧光微球的合成
将dSiO2模板放置80℃的烘箱烘干2h,称取85.2mg的dSiO2模板待用。称取85.2mg溴化铯和111.2mg氯化铅加入20mL去离子水在80℃下搅拌10min,加入上述已经干燥的85.2mg的dSiO2模板,继续搅拌1h。将溶液在80℃下的环境下烘干至干燥后,在玛瑙研钵中研磨15-20min至混合均匀。将上述混合物放置到瓷舟中,放入管式炉设置升温程序煅烧,以5℃/min的速度加热至560℃保持1h后进行降温。煅烧完成后获得橙黄色粉末,加入去离子水洗涤,洗去多余的盐,此过程重复多次,对其进行长时间破碎,最后获得的蓝色纳米球分散在水中待用。
实施例4:(对应466.5nm荧光微球)
1、dSiO2模板的合成:
称取0.068mg的三乙醇胺(TEA)将其加入到50mL的去离子水中,在80℃下预先搅拌30min,接着加入380mg十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)和168mg水杨酸钠(NaSal)继续搅拌60min,之后加入8mL的正硅酸四乙酯,继续搅拌180min,结束反应获得粗产品。将上述产品高速离心以洗去多余的CTAB,离心获得的白色沉淀分散在浓盐酸和甲醇(体积比1:1)的混合溶液中,在60℃下萃取6h,需要萃取2次,以除去多余的CTAB。萃取完成后,将其离心获得白色略带透明沉淀,将其用乙醇继续洗涤数次以获得终产品。
2、SPQS荧光微球的合成
将dSiO2模板放置80℃的烘箱烘干2h,称取85.2mg的dSiO2模板待用。称取85.2mg溴化铯、36.7mg溴化铅、83.4mg氯化铅加入20mL去离子水在80℃下搅拌10min,加入上述已经干燥的85.2mg的dSiO2模板,继续搅拌1h。将溶液在80℃下的环境下烘干至干燥后,在玛瑙研钵中研磨15-20min至混合均匀。将上述混合物放置到瓷舟中,放入管式炉设置升温程序煅烧,以5℃/min的速度加热至560℃保持1h后进行降温。煅烧完成后获得橙黄色粉末,加入去离子水洗涤,洗去多余的盐,此过程重复多次,对其进行长时间破碎,最后获得的蓝色纳米球分散在水中待用。
实施例5:(对应480nm荧光微球)
1、dSiO2模板的合成:
称取0.068mg的三乙醇胺(TEA)将其加入到50mL的去离子水中,在80℃下预先搅拌30min,接着加入380mg十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)和168mg水杨酸钠(NaSal)继续搅拌60min,之后加入8mL的正硅酸四乙酯,继续搅拌180min,结束反应获得粗产品。将上述产品高速离心以洗去多余的CTAB,离心获得的白色沉淀分散在浓盐酸和甲醇(体积比1:1)的混合溶液中,在60℃下萃取6h,需要萃取2次,以除去多余的CTAB。萃取完成后,将其离心获得白色略带透明沉淀,将其用乙醇继续洗涤数次以获得终产品。
2、SPQS荧光微球的合成:
将dSiO2模板放置80℃的烘箱烘干2h,称取85.2mg的dSiO2模板待用。称取33.6mg溴化铯、146.8mg溴化铅加入20mL去离子水在80℃下搅拌10min,加入上述已经干燥的85.2mg的dSiO2模板,继续搅拌1h。将溶液在80℃下的环境下烘干至干燥后,在玛瑙研钵中研磨15-20min至混合均匀。将上述混合物放置到瓷舟中,放入管式炉设置升温程序煅烧,以5℃/min的速度加热至560℃保持1h后进行降温。煅烧完成后获得橙黄色粉末,加入去离子水洗涤,洗去多余的盐,此过程重复多次,对其进行长时间破碎,最后获得的蓝色纳米球分散在水中待用。
图3(a)从左至右五种荧光曲线分别表示实施例3-5、实施例1、实施例2中获得的具有不同颜色的SPQS荧光微球的的荧光光谱图对比结果,对应波长依次分别为依次为蓝色446.5nm、466.5nm、480nm、绿色515nm以及红色630nm,插图为荧光微球在365nm激发下的照片。图3(a)获得了五种颜色的荧光微球,说明了该方法合成的SPQS荧光简单可调。
钙钛矿量子点是一种离子型晶体(CsPbX3 QDs),通过调控卤素离子的比例可以获得不同发射的荧光纳米晶体。因此,本实验中通过调控不同卤化铅的成分会获得不同颜色的荧光微球:如把溴化铅换成氯化铅时,会获得具有蓝色荧光的SPQS微球,换成碘化铅的话,则会获得红色荧光的SPQS微球。卤化盐的比例不同、成分不同,会获得不同颜色的微球,实际上,除了红、绿、蓝外,还能获得其他颜色的微球。
本说明书所述的内容仅仅是对发明构思实现形式的列举,本发明的保护范围不应当被视为仅限于实施例所陈述的具体形式。
Claims (10)
1.一种稳定高发光的钙钛矿量子点组装微球免疫层析探针的制备方法,其特征在于以树枝状介孔二氧化硅微球为模板,随后在水溶液中与钙钛矿前体盐即溴化铅和溴化铯加热搅拌,使得钙钛矿前体盐均匀分散在二氧化硅微球表面与介孔内部,对其进行干燥处理后放入管式炉中高温煅烧获得了具有高荧光强度的钙钛矿量子点纳米荧光微球,之后加入去离子水洗涤,洗去多余的盐;接着,通过3-氨丙基三乙氧基硅烷对微球表面进行氨基修饰以获得表面带有氨基基团的荧光微球,之后加入丁二酸酐与微球表面的氨基发生反应获得表面带有羧基基团的微球,将羧基修饰的微球与抗体进行偶联以及封闭,最终获得稳定高发光的钙钛矿量子点组装微球免疫层析探针。
2.如权利要求1所述的一种稳定高发光的钙钛矿量子点组装微球免疫层析探针的制备方法,其特征在于二氧化硅微球模板在水溶液中与钙钛矿前体盐加热搅拌,使得钙钛矿前体盐均匀分散在二氧化硅微球表面与介孔内部的具体过程为:称取溴化铯和卤化铅加入至去离子水中,于75-85 ℃下搅拌5-20 min,随后加入二氧化硅微球模板,于75-85 ℃下继续搅拌0.5-2 h;其中,所述溴化铯、卤化铅和去离子水的投料比为33-90 mg:110-190 mg:15-25 mL;
所述二氧化硅微球模板与溴化铯的质量比为1:0.4~1。
3.如权利要求2所述的一种稳定高发光的钙钛矿量子点组装微球免疫层析探针的制备方法,其特征在于卤化铅选择溴化铅或者氯化铅中的一种或两种时,后续管式炉中高温煅烧的气氛为空气;卤化铅选择碘化盐时,后续管式炉中高温煅烧的气氛为氩气;高温煅烧的温度为500-600 ℃,保持时间0.5-1 h。
4.如权利要求1所述的一种稳定高发光的钙钛矿量子点组装微球免疫层析探针的制备方法,其特征在于通过3-氨丙基三乙氧基硅烷对微球表面进行氨基修饰的过程为:将钙钛矿量子点纳米荧光微球分散在乙醇中,加入氨水和 3-氨丙基三乙氧基硅烷,在室温下搅拌反应10-15h,之后离心,用乙醇清洗,即获得表面带有氨基基团的荧光微球。
5.如权利要求1所述的一种稳定高发光的钙钛矿量子点组装微球免疫层析探针的制备方法,其特征在于通过丁二酸酐进行修饰的过程为:将带有氨基基团的荧光微球分散在含有丁二酸酐的N,N-二甲基甲酰胺溶液中,搅拌反应3-5h,之后离心,用乙醇和水清洗,即获得羧基修饰的荧光微球。
6.如权利要求1所述的一种稳定高发光的钙钛矿量子点组装微球免疫层析探针的制备方法,其特征在于将羧基修饰的微球与抗体进行偶联以及封闭的过程为:将羧基修饰的微球加入pH=6.0 PB缓冲液中,加入NHS和EDC,于摇床中37℃孵育20~40 min;随后离心收集产物;将产物重悬于pH=7.4 PB缓冲液中,加入标记抗体,37℃摇床反应2~3 h;反应结束后,离心,用含有0.5-2% BSA的pH=7.4 PB缓冲液封闭1.5-3 h;随后离心收集微球,用pH=7.4 PB缓冲液洗涤后,保存在pH=7.4 PB缓冲液中冷藏保存。
7.如权利要求1-6任一所述方法制备的一种稳定高发光的钙钛矿量子点组装微球免疫层析探针。
8.一种用于检测心肌标志物NT-pro BNP抗原的免疫层析试纸条,其特征在于包含权利要求7所述的钙钛矿量子点组装微球免疫层析探针。
9.如权利要求8所述的一种用于检测心肌标志物NT-pro BNP抗原的免疫层析试纸条,其特征在于包括样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水纸和塑料底板,硝酸纤维素膜搭接在硝酸纤维素膜上,样品垫、结合垫依次叠压在硝酸纤维素膜的左端,吸水纸叠压在硝酸纤维素膜的右端;所述硝酸纤维素膜上设置靠近结合垫的检测线T线、靠近吸水纸的一条控制线C线;
所述结合垫上包被所述的钙钛矿量子点组装微球免疫层析探针;
所述硝酸纤维素膜的T 线和C线上分别包被捕获抗体和羊抗鼠抗体。
10.如权利要求9所述的一种用于检测心肌标志物NT-pro BNP抗原的免疫层析试纸条的应用,其特征在于取含有NT-pro BNP抗原的缓冲液滴加至免疫层析试纸条的样品垫上,在吸收垫的毛细作用力下,抗原和探针一起朝着检测区域以及吸收垫方向移动,在经过检测线和质控线时,抗原和探针被捕获形成了三明治免疫夹心结构;5-20 min后用智能手机对硝酸纤维素膜的T线拍照,用于之后的裸眼判读以及手机定量分析。
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