CN117106443B - 一种溴铅铯@二氧化硅@四氧化三铁@Exosome复合纳米材料及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种溴铅铯@二氧化硅@四氧化三铁@Exosome复合纳米材料及其制备方法，属于发光材料制备技术领域。制备方法，包括以下步骤：(1)将溴化铯、溴化铅和二氧化硅分散于水中，加热搅拌后烘干，将得到的粉末加入甲苯中，然后滴加硅烷偶联剂，搅拌反应后高温煅烧，得到CsPbBr3@SiO2；(2)将铁盐、柠檬酸钠、醋酸钠溶于有机溶剂中，然后加入CsPbBr3@SiO2，剧烈搅拌后高压反应，得到CsPbBr3@SiO2@Fe3O4；(3)将CsPbBr3@SiO2@Fe3O4和外泌体混合，然后经超声破碎、冷却后孵育，得到复合纳米材料。本发明的复合纳米材料具有强大的磁性和优异的光学性能。
Description
技术领域
本发明涉及发光材料制备技术领域，特别是涉及一种溴铅铯@二氧化硅@四氧化三铁@Exosome复合纳米材料及其制备方法。
背景技术
癌症的早期诊断和治疗对于降低死亡率和复发概率非常重要。循环肿瘤细胞(circulating tumor cells，简称CTCs)是从原发性肿瘤脱落并进入负责转移的外周血循环系统的肿瘤细胞。近年来，循环肿瘤细胞检测作为一种新型的“液体活检”，已成为肿瘤无创诊断和实时疗效监测的先进手段之一，在早期癌症检测、复发的早期检测、治疗效果的实时监测、预后判断以及治疗靶点和耐药机制的检测方面发挥着越来越重要的作用。
尽管目前已经开发出几十种不同的CTCs检测方法和数以百计的商业化CTCs检测产品，但CTCs检测技术仍面临着两大挑战。一方面是更高的富集效率，一毫升血液中可能存在数个至数十个CTCs，但却存在数亿背景细胞，因此CTCs的富集面临巨大的技术挑战。另一方面是特异的鉴定策略，外周血中白细胞的数量众多，即使经过CTC富集之后仍然会有大量残留，因此必须通过特异的方法对CTCs进行鉴定。
目前，已经开发出多种针对循环肿瘤细胞的识别与分离平台，其中绝大多数是利用磁分离CTCs。磁性纳米材料作为分离介质，偶联在磁性纳米材料上的抗体与CTCs特异性结合的免疫磁分离法是最常用的分离方法。但磁性材料很难起示踪和成像作用，因此，亟待开发一种标记和分离循环肿瘤细胞稳定的多功能材料。
发明内容
本发明的目的是提供一种溴铅铯@二氧化硅@四氧化三铁@Exosome复合纳米材料及其制备方法，以解决上述现有技术存在的问题，本发明的制备过程操作简单，可重复合成，获得的CsPbBr3@SiO2@Fe4O3纳米材料相较于同类型纳米材粒径小，元素集中；化学稳定性高，可长期存储；磁性功能强，高量子产率，光稳定性强。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明的技术方案之一：一种CsPbBr3@SiO2@Fe4O3@Exosome复合纳米材料(溴铅铯@二氧化硅@四氧化三铁@Exosome复合纳米材料)的制备方法，包括以下步骤：
(1)将溴化铯、溴化铅和介孔二氧化硅分散于水中，加热搅拌后烘干，将得到的粉末加入甲苯中，然后滴加硅烷偶联剂，搅拌反应后高温煅烧，得到CsPbBr3@SiO2；
硅烷偶联剂的作用是通过水解缩合在介孔二氧化硅表面形成一层新的二氧化硅层，增强钙钛矿稳定性；
(2)将铁盐、柠檬酸钠、醋酸钠溶于有机溶剂(乙二醇)中，然后加入CsPbBr3@SiO2，剧烈搅拌后高压反应，得到CsPbBr3@SiO2@Fe3O4；
柠檬酸钠为静电稳定剂，醋酸钠为碱源和辅助还原剂，乙二醇既充当溶剂也是还原剂。
(3)将CsPbBr3@SiO2@Fe3O4和外泌体混合，然后经超声破碎、冷却后孵育，得到所述CsPbBr3@SiO2@Fe3O4@Exosome复合纳米材料(溴铅铯@二氧化硅@四氧化三铁@Exosome复合纳米材料)。
利用超声的方式使外泌体破碎解体，然后通过冰水浴孵育使外泌体重新组装，包覆在CsPbBr3@SiO2@Fe3O4纳米粒子表面，形成一层外泌体膜。
进一步地，步骤(1)中，所述溴化铯和溴化铅的摩尔比为1:1；所述加热搅拌的温度为80℃；所述搅拌反应的温度为40℃，时间为8h；所述硅烷偶联剂包括四甲氧基硅烷、正硅酸乙酯和3-氨丙基三乙氧基硅烷中的任意一种。
进一步地，步骤(1)中，所述高温煅烧的温度为550～600℃，时间为30min。
更进一步地，步骤(1)中，所述高温煅烧的温度为570℃，时间为30min。
进一步地，步骤(2)中，所述有机溶剂为乙二醇；所述铁盐为六水三氯化铁。
进一步地，步骤(2)中，所述剧烈搅拌的速度为1000rpm，时间为30min；所述高压反应的温度为200℃，时间为10h。
进一步地，步骤(3)中，所述CsPbBr3@SiO2@Fe3O4和外泌体的质量比为5:4。
进一步地，还包括，重复6次步骤(3)中的超声破碎、冷却的过程。
进一步地，步骤(3)中，所述超声破碎的时间为30s；所述冷却的方法为：置于冰水浴中150s；所述孵育的温度为37℃，时间为90min。
钙钛矿量子点因高量子产率在光电领域备受关注，而纳米磁性Fe3O4因超顺磁特性在生物医药等领域有着广泛的潜在应用前景。本发明将二者的特性结合，使制备的纳米材料(CsPbBr3@SiO2@Fe3O4)具备磁性和荧光双重功能。通过超声和低温孵育的方式，将外泌体与CsPbBr3@SiO2@Fe3O4混合，形成了磁性的荧光探针。
本发明的技术方案之二：一种上述制备方法制备的CsPbBr3@SiO2@Fe4O3@Exosome复合纳米材料。
本发明的技术方案之三：一种上述CsPbBr3@SiO2@Fe4O3@Exosome复合纳米材料在肿瘤液体活检中的应用。
更近一步地，所述CsPbBr3@SiO2@Fe4O3@Exosome复合纳米材料具有标记与分离富集的功能。
更进一步地，所述应用具体为：在识别和捕获黑色素瘤循环肿瘤细胞中的应用。
单纯的CsPbBr3@SiO2不具有磁功能，不具有分离的特征，获得的纳米颗粒应用范围较小，因此在本发明的反应过程中，利用Fe3O4的磁性功能，以及CsPbBr3@SiO2的发光特性，结合形成一种多功能CsPbBr3@SiO2@Fe3O4复合纳米材料。通过超声破碎和低温孵育，将黑色素瘤来源的外泌体包覆在CsPbBr3@SiO2@Fe3O4纳米粒子表面形成具备生物功能化的CsPbBr3@SiO2@Fe4O3@Exosome复合纳米材料。本发明包覆过程操作简单，获得的CsPbBr3@SiO2@Fe4O3@Exosome复合纳米材料粒径小，元素集中，磁性功能强，量子产率高，光和化学稳定性强，可长期存储；并且外泌体包覆促进了识别亲本循环肿瘤的效率。
本发明公开了以下技术效果：
(1)本发明通过超声处理的方式，成功制备出一种CsPbBr3@SiO2@Fe4O3@Exosome复合纳米材料，可以用于标记和分离富集黑色素瘤CTCs。
(2)本发明制备的CsPbBr3@SiO2@Fe4O3@Exosome水溶性和生物相容性好，可以提高识别黑色素瘤CTCs的效率。
(3)本发明的制备过程操作简单，获得的CsPbBr3@SiO2@Fe4O3@Exosome复合纳米材料粒径小、表面光滑，元素集中，包覆步骤简单，磁性功能强(具有磁分离特性)，量子产率高，光和化学稳定性强，可长期存储；并且外泌体包覆促进了识别亲本循环肿瘤的效率。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1制备的CsPbBr3@SiO2@Fe4O3在自然光和紫外光下的宏观照片，其中，a为CsPbBr3@SiO2@Fe4O3粉末的照片，b为CsPbBr3@SiO2@Fe4O3溶液的照片；
图2为本发明实施例1制备的CsPbBr3@SiO2@Fe4O3的储存稳定性；
图3为本发明实施例1制备的CsPbBr3@SiO2@Fe4O3的透射电镜图和对应的元素分析；
图4为本发明实施例1制备的CsPbBr3@SiO2@Fe4O3@Exosome复合纳米材料的透射电镜图和对应的元素分析；
图5为本发明实施例1制备的CsPbBr3@SiO2@Fe4O3和CsPbBr3@SiO2@Fe4O3@Exosome复合纳米材料的发射光谱图；
图6为本发明实施例1制备的CsPbBr3@SiO2@Fe4O3的磁滞回线结果图；
图7为本发明实施例1制备的CsPbBr3@SiO2@Fe4O3的MTT实验结果图；
图8为本发明实施例1制备的CsPbBr3@SiO2@Fe4O3@Exosome复合纳米材料富集分离悬浮B16细胞的激光共聚焦结果图。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
本发明以下实施例中原料均为市售所得。
实施例1
一种CsPbBr3@SiO2@Fe4O3@Exosome复合纳米材料的制备方法：
(1)将0.6mmol CsBr、0.6mmol PbBr2和0.2g介孔二氧化硅溶于100mL去离子水中，然后置于250mL烧杯中，在80℃下搅拌1h，搅拌结束后烘干，研磨后得到淡黄色粉末A。
(2)将40mg粉末A加入到40mL甲苯中，然后加入1mL四甲氧基硅烷(TMOS)，在40℃下搅拌8h，收集沉淀，烘干研磨得到黄色粉末B。
(3)将粉末B置于在马弗炉中高温煅烧(煅烧温度为570℃，时间为30min)，煅烧结束后，反复清洗，烘干，得到CsPbBr3@SiO2。
(4)将1.08g(4mmol)FeCl3·6H2O、0.2g(0.68mmol)柠檬酸钠、1.2g(14.63mmol)醋酸钠混入20mL乙二醇中，然后加入过量CsPbBr3@SiO2，剧烈搅拌(1000rpm)30min后置于高压反应釜中，在温度为200℃的条件下反应10h，冷却至室温后用乙醇和水反复洗涤，最后在50℃烘干过夜，得到产物CsPbBr3@SiO2@Fe4O3。
(5)将50μg CsPbBr3@SiO2@Fe4O3和40μg外泌体加入含1mL PBS的试管中，混合后将试管置于超声破碎池中，超声破碎30s后置于冰水浴中孵育150s，重复此操作6次，最后将试管置于恒温摇床，调节温度至37℃，孵育90min以恢复外泌体膜，孵育结束后得到CsPbBr3@SiO2@Fe4O3@Exosome复合纳米材料。
效果例1
(1)在自然光和紫外光(365nm)下拍摄本发明实施例1制备的CsPbBr3@SiO2@Fe4O3的宏观照片，结果见图1。
图1中，a为CsPbBr3@SiO2@Fe4O3粉末的照片(左图为自然光下拍摄，右图为紫外光下拍摄)，b为CsPbBr3@SiO2@Fe4O3溶于PBS中的照片(左图为自然光下拍摄，右图为紫外光下拍摄)。
从图1中可以看出，CsPbBr3@SiO2@Fe4O3粉末在自然光下呈现为棕黑色，在紫外灯下表现出明显的绿色荧光。将CsPbBr3@SiO2@Fe4O3分散于PBS中，在自然光下为棕褐色，水溶性良好，在紫外光下发射出明显的绿色荧光。
(2)从图2中可以看出，本发明实施例1制备的CsPbBr3@SiO2@Fe4O3在分散于PBS溶液中可以稳定存储一周以上，在一周之内不发生明显的荧光减弱。
(3)采用高分辨透射电镜(HTEM，仪器来自捷克的*/Talos F200S场发射透射电子显微镜)对本发明实施例1制备的CsPbBr3@SiO2@Fe4O3和CsPbBr3@SiO2@Fe4O3@Exosome复合纳米材料的样品形貌和元素分布进行表征，结果见图3和图4。
从图3中可以看出，本发明实施例1制备的CsPbBr3@SiO2@Fe4O3颗粒均一，形状规则，平均粒径约为407nm，Cs、Pb、Br、Si、O、Fe等元素分布均匀。
从图4中可以看出，本发明实施例1制备的CsPbBr3@SiO2@Fe4O3@Exosome复合纳米材料表面有一层明显的膜状结构，形状并不规则，膜厚约50nm，Cs、Pb、Br、Si、O、Fe等元素分布均匀，来源于外泌体的N元素分布于纳米粒子表面。
(3)采用爱丁堡FLS-1000荧光光谱仪测试本发明实施例1制备的CsPbBr3@SiO2@Fe4O3和CsPbBr3@SiO2@Fe4O3@Exosome复合纳米材料的荧光发射光谱，结果见图5。
测试方法：以实施例1制备的CsPbBr3@SiO2@Fe4O3和CsPbBr3@SiO2@Fe4O3@Exosome复合纳米材料为测试对象，采集365nm激发光激发下的荧光发射光谱。
从图5中可以看出，本发明实施例1制备的CsPbBr3@SiO2@Fe4O3和CsPbBr3@SiO2@Fe4O3@Exosome复合纳米材料在365nm紫外光激发下的发射光谱的波峰为516nm。
(4)磁滞回线
采用7404型振动样品磁强计(VSM)测试CsPbBr3@SiO2@Fe4O3的磁强，结果见图6。
从图6中可以看出，本发明实施例1制备的CsPbBr3@SiO2@Fe4O3具有优异的超顺磁性，饱和磁化强度为34.60874emu/g。此外，CsPbBr3@SiO2@Fe4O3表现出快速的磁响应和可操作性，可以被磁铁吸附(见图6中的插图)。
(5)细胞毒性实验
使用甲基噻唑基四唑(MTT)实验评估了CsPbBr3@SiO2@Fe4O3对黑色素瘤细胞(B16细胞)活性的影响，结果见图7。
a.将处于生长对数期B16细胞按每孔100μL约10×104个细胞的密度接种于96孔板中。
b.置于37℃，含5％ CO2细胞培养箱中培养8h，更换为含不同浓度(0、2、4、8、16、32、63、125、250μg/mL)的CsPbBr3@SiO2@Fe4O3的无血清培养基，继续培养24h。
c.弃去旧培养基，清洗后每孔加入100μL含0.5mg/mL MTT的无血清培养基，细胞培养箱孵育4h。弃去上清，每孔加入100μL二甲基亚砜，孵育5min，用酶标仪测定各孔在490nm波长处的吸光度，结果见图7
本发明用黑色素瘤细胞(B16细胞)。假设未经处理的细胞存活率为100％。结果发现，不同浓度的CsPbBr3@SiO2@Fe4O3孵育24h后，细胞存活率仍保持接近100％。即使浓度增加到250μg/mL，细胞存活率仍保持在70％以上。结果表明，本发明制备的CsPbBr3@SiO2@Fe4O3具有良好的生物相容性。
(6)CTCs富集分离
使用蔡司激光共聚焦显微镜(LSM980)观察CsPbBr3@SiO2@Fe4O3@Exosome复合纳米材料与悬浮黑色素瘤细胞(B16细胞)共孵育的富集分离效果，结果见图8。
a.将105个B16细胞加入到1mL PBS缓冲液中，加入100μg的CsPbBr3@SiO2@Fe4O3@Exosome复合纳米材料，37℃下缓慢摇晃1h后，利用磁铁将材料吸附贴壁，弃去上清液。
b.将吸附的材料重悬于PBS缓冲液中，并在激光共聚焦显微镜下观察。
从图8暗场图片(Dark field)中可以观察来源于CsPbBr3@SiO2@Fe4O3@Exosome复合纳米材料的绿色荧光，从明场图片(Bright field)可以观察到B16细胞的细胞形态，从合并图(Merge)可以看到绿色荧光与B16细胞共定位，说明本发明实施例1制备的CsPbBr3@SiO2@Fe4O3@Exosome复合纳米材料可应用于B16细胞的富集分离。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (7)
1.一种CsPbBr3@SiO2@Fe4O3@Exosome复合纳米材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将溴化铯、溴化铅和二氧化硅分散于水中，加热搅拌后烘干，将得到的粉末加入甲苯中，然后滴加硅烷偶联剂，搅拌反应后高温煅烧，得到CsPbBr3@SiO2；
(2)将铁盐、柠檬酸钠、醋酸钠溶于有机溶剂中，然后加入CsPbBr3@SiO2，剧烈搅拌后高压反应，得到CsPbBr3@SiO2@Fe3O4；
(3)将CsPbBr3@SiO2@Fe3O4和外泌体混合，然后经超声破碎、冷却后孵育，得到所述CsPbBr3@SiO2@Fe3O4@Exosome复合纳米材料；
步骤(1)中，所述高温煅烧的温度为550～600℃，时间为30min；
所述制备方法，还包括，重复6次步骤(3)中的超声破碎、冷却的过程；
步骤(3)中，所述超声破碎的时间为30s；所述冷却的方法为：置于冰水浴中150s；所述孵育的温度为37℃，时间为90min。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述溴化铯和溴化铅的摩尔比为1:1；所述加热搅拌的温度为80℃；所述搅拌反应的温度为40℃，时间为8h；所述硅烷偶联剂包括四甲氧基硅烷、正硅酸乙酯和3-氨丙基三乙氧基硅烷中的任意一种。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述有机溶剂为乙二醇；所述铁盐为三氯化铁。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述剧烈搅拌的速度为1000rpm，时间为30min；所述高压反应的温度为200℃，时间为10h。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述CsPbBr3@SiO2@Fe3O4和外泌体的质量比为5:4。
6.一种权利要求1～5任一项所述的制备方法制备的CsPbBr3@SiO2@Fe4O3@Exosome复合纳米材料。
7.一种权利要求6所述的CsPbBr3@SiO2@Fe4O3@Exosome复合纳米材料在肿瘤液体活检材料制备中的应用。
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