JP2014224729A

JP2014224729A - 植物ウイルスの検出方法と植物ウイルス検出キット

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Publication number: JP2014224729A
Application number: JP2013103488A
Authority: JP
Inventors: 昭川合; Akira Kawai; 聡鍵和田; Satoshi Kagiwada; 健西尾; Takeshi Nishio
Original assignee: Hosei University
Current assignee: Hosei University
Priority date: 2013-05-15
Filing date: 2013-05-15
Publication date: 2014-12-04
Anticipated expiration: 2033-05-15
Also published as: JP6198110B2

Abstract

【課題】検出感度が高く、短時間で試料中の植物ウイルスを検出することができる方法を提供すること。
【解決手段】以下の工程：（１）標的植物ウイルスと特異的に結合する一次抗体が固定されたビーズ体と試料とを接触させる工程；（２）ビーズ体と、標的植物ウイルスと特異的に結合する標識二次抗体とを接触させる工程；および（３）標的植物ウイルスと特異的に結合した標識二次抗体を検出する工程を含む植物ウイルスの検出方法とする。
【選択図】なし

Description

本発明は、植物ウイルスの検出方法および植物ウイルス検出キットに関する。

従来、動物ウイルスや植物ウイルスの検出のためにELISA法（酵素免疫測定法）が広く用いられている。

具体的には、例えば非特許文献１には、ガラスビーズを利用した小児ＲＳウイルスの検出方法が提案されている。また、植物ウイルスの検出においては、例えば非特許文献２に記載されているように、プレートに固定した一次抗体に植物ウイルスを吸着させ、さらに、この植物ウイルスに結合させた二次抗体の酵素反応を検出するELISA方法（いわゆるサンドイッチ法と呼ばれる）が有効であることが報告されている。

特開2006−125994号公報

三国、杏林医学誌、13,355-344,1982 Voller et al, J.gen.Virol.33,165-167,1976

しかしながら、植物ウイルスの検出においては、ガラスビーズを利用した検出方法についての具体的な検討はなされていない。また、例えば非特許文献２のような従来のELISA法による植物ウイルスの検出においては、必ずしも検出感度が十分であるとは言い難く、また、検出時間を短縮することが難しいという問題があった。

本発明は、以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであり、検出感度が高く、短時間で試料中の植物ウイルスを検出することができる方法を提供することを課題としている。

上記の課題を解決するために、本発明の植物ウイルス検出方法は、試料中の植物ウイルスを検出する方法であって、以下の工程：（１）標的植物ウイルスと特異的に結合する一次抗体が固定されたビーズ体と、試料とを接触させる工程；（２）ビーズ体と、標的植物ウイルスと特異的に結合する標識二次抗体とを接触させる工程；および（３）標的植物ウイルスと特異的に結合した標識二次抗体を検出する工程を含むことを特徴としている。

この植物ウイルス検出方法では、ビーズ体の粒径は、0.010〜0.100ｍｍであることが好ましい。

この植物ウイルス検出方法では、工程（２）における標識二次抗体の標識は酵素タンパク質であり、工程（３）では、酵素タンパク質に特異的に反応する基質の分解によって、標的植物ウイルスと特異的に結合した標識二次抗体を検出することが好ましい。

この植物ウイルス検出方法では、工程（２）における標識二次抗体の標識は蛍光色素分子であり、工程（３）では、蛍光色素分子の蛍光によって、標的植物ウイルスと特異的に結合した標識二次抗体を検出することが好ましい。

また、本発明の植物ウイルス検出キットは、試料中の植物ウイルスを検出するための植物ウイルス検出キットであって、標的植物ウイルスと特異的に結合する一次抗体が固定されたビーズ体を含むことを特徴としている。

この植物ウイルス検出キットでは、外部からの液体が流通可能なケース体の内部に、前記ビーズ体が保持されていることが好ましい。

本発明の植物ウイルスの検出方法によれば、検出感度が高く、短時間で植物ウイルスを検出することができる。

本発明の植物ウイルスの検出キットの一実施形態を例示した概要断面図である。本発明の植物ウイルスの検出キットの使用方法の一実施形態を例示した概要図である。

本発明の植物ウイルスの検出方法の対象となる植物ウイルスは、特に限定されず、例えば、アルファモウイルス属（アルファルファモザイクウイルス）、カルモウイルス属(メロンえそ斑点ウイルス)、コモウイルス属(スカッシュモザイクウイルス)、ククモウイルス属(キュウリモザイクウイルス、キク微斑ウイルス)、ファバウイルス属(ソラマメウイルトウイルス)、ネポウイルス属(アラビスモザイクウイルス、タバコ輪点ウイルス、トマト黒色輪点ウイルス、トマト輪点ウイルス)、ポテックスウイルス属（ジャガイモXウイルス）、ポティウイルス属(パパイア輪点ウイルス、ジャガイモYウイルス、カボチャモザイクウイルス、ズッキーニ黄斑モザイクウイルス)、トバモウイルス属(タバコモザイクウイルス、キュウリ緑斑モザイクウイルス、スイカ緑斑モザイクウイルス、ペッパーマイルドモットルウイルス、トマトモザイクウイルス)、トンブスウイルス属(トマトブッシースタントウイルス)、トスポウイルス属(トマト黄化えそウイルス、メロン黄化えそウイルス、スイカ灰白色斑紋ウイルス)、カルラウイルス属(カーネーション潜在ウイルス、キクBウイルス、インパチェンス潜在ウイルス)、カリモウイルス属(カリフラワーモザイクウイルス、ペチュニア葉脈透化ウイルス)、イラルウイルス属（プルヌスネクロティックリングスポットウイルス、タバコ条斑ウイルス）、ネクロウイルス属(トルコギキョウえそウイルス、タバコネクロシスウイルス)、ポティウイルス属（サツマイモ縮葉モザイクウイルス、カーネーションベインモットルウイルス、サツマイモ斑紋モザイクウイルス、タバコ脈緑モザイクウイルス、カブモザイクウイルス、トブラウイルス属(タバコ茎えそウイルス)、トスポウイルス属(インパチェンスネクロティックスポットウイルス、アイリスイエロースポットウイルス)、ウメ輪紋ウイルスなどを例示することができる。

本発明の植物ウイルスの検出方法は、ELISA法のうち、サンドイッチ法と呼ばれる原理を利用する。

具体的には、本発明の植物ウイルスの検出方法は、試料中の植物ウイルスを検出する方法であって、以下の工程：
（１）標的植物ウイルスと特異的に結合する一次抗体が固定されたビーズ体と、試料とを接触させる工程、
（２）ビーズ体と、標的植物ウイルスと特異的に結合する標識二次抗体とを接触させる工程、および
（３）標的植物ウイルスと特異的に結合した標識二次抗体を検出する工程を含む。

工程（１）では標的植物ウイルスと特異的に結合する一次抗体が固定されたビーズ体と試料とを接触させる。

ビーズ体は、従来使用されている、円盤状、真球状などの各種真球状を適宜使用することができるが、特に好ましくは真球状のビーズ体である。ビーズ体の材料は特に限定されないが、例えば、ガラスや、ポリスチレン、ラテックス粒子などのプラスチック、磁性ビーズを含む金属などを例示することができ、なかでも、ガラスビーズは取扱い性などに優れるため好ましく使用することができる。

従来、ELISA法における固相としてガラスビーズを用いることは知られているが（例えば特許文献１、非特許文献１など）、植物ウイルスの検出におけるガラスビーズの有効性についての検討はこれまでなされていない。

ビーズ体の粒径は、0.5ｍｍ以下であることが好ましく、0.010〜0.100ｍｍであることがより好ましい。ビーズ体の粒径がこの範囲であると、植物ウイルスの検出感度が向上する。

一次抗体は、標的植物ウイルスと特異的に結合する抗体であればよく、例えば、IｇG、IgMなどを例示することができる。また、一次抗体は適宜希釈して使用することもできる。

一次抗体は、例えば共有結合によってビーズ体に固定することができる。例えば、酸無水物を介した共有結合法による抗原の固定化方法としては、ビーズ体表面に存在する酸無水物基を介して抗原を固定化してもよいし、ビーズ体表面に存在するカルボキシル基、ホルミル基、アミノ基、アジド基、イソシアネート基、クロロホルミル基、エポキシ基等の他の反応性官能基に酸無水物基体を導入した後、これを介して一次抗体を固定化してもよい。また、酸無水物基、反応性官能基のいずれも高分子材料表面に無い場合にはビーズ体表面に直接酸無水物基を導入して一次抗体を固定化してもよいし、あるいは反応性官能基を導入した後、酸無水物基を導入して一次抗体を固定化してもよい。

そして、ビーズ体に一次抗体を固定した後に、ビーズ体表面において非特異的に抗原などと結合する部分を抗血清や非干渉性のタンパク質でブロックする操作（ブロッキング）を行う。ブロッキングには、スキムミルク、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ），オボアルブミン，ヘモグロビン，ゼラチンなどを利用することができ、例えば、これらを塩化ナトリウムを含むトリス−塩酸緩衝液あるいはリン酸緩衝液に溶解してブロッキング液とし、一次抗体を固定化したビーズ体に作用せればよい。反応後は、例えば、0.05％ポリエチレンソルビタンモノラウレート(Tween 20)、塩化ナトリウムを含むトリス−塩酸緩衝液またはリン酸緩衝液などで２〜６回洗浄することができる。

そして、ウイルスを検出するための試料は、例えば、検出すべき植物ウイルスに感染している可能性がある植物の葉などを例示することができ、このような試料を適宜なバッファーとともに摩砕したものをビーズ体とを接触させることができる。

工程（１）において、試料中に検出すべき植物ウイルスが含まれている場合には、ビーズ体に固定された一次抗体に捕捉され、ビーズ体の表面に植物ウイルスが吸着された状態となる。

工程（２）では、ビーズ体と、標的植物ウイルスと特異的に結合する標識二次抗体とを接触させる。

標識二次抗体は、標的植物ウイルスと特異的に結合する抗体であればよく、例えば、IｇG、IgMなどを例示することができ、一次抗体とは異なるエピトープに結合するものなどを適宜選択することができる。

さらに、標識二次抗体は、予め標識されていることが望ましい。標識されていない二次抗体とビーズ体とを接触させる場合には、その後、適宜な酵素タンパク質などで標識する工程が必要となる。

標識となる酵素タンパク質としては、ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、ウレアーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコアミラーゼ、カルボニックアンヒドラーゼ、アセチルコリンエステラーゼなどが挙げられる。また、標識として、アビジン−ビオチンや蛍光色素分子を用いたり、抗体結合性を持つプロテインＡ、プロテインＧやレクチンを介して標識を導入させる方法なども用いられる。

また、工程（２）は、工程（１）と略同時に行うこともできる。この場合、例えば、工程（１）において試料と混合するバッファー（摩砕液）に標識二次抗体を添加しておくことなどが考慮される。

工程（２）においては、試料中に検出すべき植物ウイルスが含まれている場合（工程（１）でビーズ体の表面に植物ウイルスが吸着された状態となっている場合）には、植物ウイルスに標識二次抗体が結合する。

工程（３）では、標的植物ウイルスと特異的に結合した標識二次抗体を検出する。

工程（２）において、植物ウイルスに酵素タンパク質で標識された標識二次抗体が結合している場合には、基質を添加することで標識二次抗体の酵素タンパク質と基質とが特異的に反応するため、この反応（基質の分解）を検出することで標識二次抗体を検出することができ、これによって、試料中の植物ウイルスの存在を確認することができる。

具体的には、酵素タンパク質の基質については、例えば標識酵素としてペルオキシダーゼを使用する場合、蛍光法にて測定するには過酸化水素水と３−（４−ヒドロキシフェニル）プロピオン酸などを用い、比色法にて測定するには過酸化水素水と４−ヒドロキシフェニル酢酸や３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン，１，２−フェニレンジアミンなどを用い、発光法にて測定するにはルミノール(Amersham 社) などを用いることができる。また、例えば、アルカリフォスファターゼ（AP）を用いる場合、蛍光法にて測定するには４−メチルウンベリフェリルリン酸などを用い、比色法にて測定するには４−ニトロフェニルリン酸やＮＡＤＰなどを用いることができる。また、例えば、β−Ｄ−ガラクトシダーゼを用いる場合、蛍光法にて測定するには４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトシドなどを用い、比色法にて測定するには２−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシドなどを用いることができる。

また、蛍光色素分子で標識された標識二次抗体を用いる場合には、蛍光顕微鏡やフローサイトメーターからの光（電磁波）による、蛍光色素分子に固有の蛍光（励起波長）を検出することで、標的植物ウイルスと特異的に結合した標識二次抗体を検出することができる。これによって、試料中の植物ウイルスの存在を確認することができる。

工程（３）においては、標識二次抗体と基質との反応を適宜な方法（例えば、蛍光法など）で検出することで、試料中の植物ウイルスの量などを検出することができる。

本発明の植物ウイルスの検出方法は、ビーズ体（一次抗体が固定された）を利用して植物ウイルスの検出するため、従来の検出方法と比較して高感度で、かつ、短時間で植物ウイルスの検出が可能である。

さらに、本発明の植物ウイルスの検出方法に適用可能な植物ウイルス検出キットについて説明する。

図１は、本発明の植物ウイルスの検出キットの一実施形態を例示した概要断面図である。

本発明の植物ウイルスの検出キットＫには、例えば、図１に例示したビーズ体１およびケース体２が含まれる。

具体的には、外部から液体を流通可能なケース体２の内部に、標的植物ウイルスと特異的に結合する一次抗体が固定されたビーズ体１が保持されている。ビーズ体１に一次抗体を固定する方法は、上述した適宜な方法を採用することができる。また、ビーズ体１の粒径は、上述したように、検出感度や洗浄容易性を考慮して、0.010〜0.5ｍｍ程度の範囲で適宜設計することができる。

ケース体２としては、例えば、ビーズ体１よりも小さなメッシュを有するフィルター部材２１を備えた袋状または箱状の部材を例示することができる。具体的には、図１に例示したケース体２は、やや縦長のフレーム部２２の下方において、上下に間隔をあけて２枚のフィルター部材２１が配設されており、この２枚のフィルター部材２１の間の空間に一次抗体が固定されたビーズ体１が保持されている。フィルター部材２１は、液体（水）が流通可能であるため、例えば、上方からケース体２の内部に液体（水）を供給することで、ビーズ体１を洗浄して下方から排出することができる。

ケース体２の材料は具体的に限定されないが、フレーム部２２の材料としてはプラスチックなどを例示することができる。また、ケース体２の形状、大きさなども具体的に限定されないが、例えば、市販のプラスチックチューブ（1.5ml）に収納可能な形状、大きさに設計することができる。また、フィルター部材の材料も特に限定されず、例えば、織物、編物、開口形成された樹脂成形体、セラミックス、金属成形体などを例示することができる。

図２は、本発明の植物ウイルスの検出キットの使用方法の一実施形態を例示した概要図である。

本発明の植物ウイルスの検出キットＫを使用する場合、例えば、図２（Ａ）に例示したように、まず、プラスチックチューブＴ１（例えば、1.5ｍｌ）内に試料Ｓ（植物の葉など）を入れ、標識二次抗体を含む摩砕液Ｑを加え、ペレットミキサーＭなどで摩砕する。次に、図２（Ｂ）に例示したように、図１に例示した、ビーズ体１を保持したケース体２をプラスチックチューブＴ１内に挿入し、試料Ｓ（摩砕液Ｑ）とビーズ体１とを、例えば５〜２０分間接触させる。これによって、試料Ｓ中に標的植物ウイルスが含まれている場合には、ビーズ体１上に固定された一次抗体に、標識二次抗体で標識された標的植物ウイルスが結合する。続いて、図２（Ｃ）に例示したように、このケース体２を取り出し、別のプラスチックチューブＴ２（例えば、15ｍｌ）に上方から装着し、その上から洗浄液を流してフィルター部材２１の内部のビーズ体１を洗浄する。図２（Ｄ）に例示したように、このケース体２をさらに別のプラスチックチューブＴ３（例えば、1.5ｍｌ）内に挿入し、例えば、標識二次抗体が酵素で標識されている場合には、この酵素と特異的に反応する基質液Ｌを添加することで標識二次抗体の酵素と基質とが反応するため、この反応を比色法などで検出することで植物ウイルスを検出することができる。

本発明の植物ウイルスの検出方法は、以上の形態に限定されることはない。例えば、ビーズ体の洗浄や乾燥などのELISA法に従った適宜な工程を含むことができることは言うまでもない。また、標識二次抗体の標識となる酵素や蛍光色素分子などは、公知の材料を適宜利用することができる。さらに、本発明の植物ウイルスの検出キットには、摩砕液（標識二次抗体などを含む）や基質液などを含むことができる。

以下、本発明の植物ウイルスの検出方法の形態について実施例とともに説明するが、本発明の植物ウイルスの検出方法は、以下の実施例に何ら限定されるものではない。

＜実施例１＞抗体付着ガラスビーズ（ビーズ体）の作成
次の手順にて抗体付着ガラスビーズを作成した。

ビーズ体としてのガラスビーズ（直径0.35-0.5 mm, 0.105-0.125 mm, 0.037-0.063 mm）に3%の3-アミノプロピルトリエトキシレンアセトン溶液を加え45℃で2時間振盪（60/m）した。アセトンで3回洗浄した後に、純水にて数回洗浄、1%のグルタルアルデヒド液で室温にて1時間振盪した。次いでpH 7.0 PBSで3-5回洗浄した。ガラスビーズ5 gについて、0.1 M PBS 5 mlとウメ輪紋ウイルス（以下PPV）に特異的に反応するIgG （１次抗体）62.5 μlを混ぜた溶液に浸して、室温で30分振盪した（60/m）。振盪後、4℃で一晩静置した。0.1 M PBSTで3回洗浄した後に、30%スキムミルク溶液にガラスビーズを浸し、37℃で2時間振盪した（30/m）。振盪後0.1M PBSTで白濁が無くなるまで洗浄し、純水で2回すすいだ。ろ紙を敷いたブフナ漏斗を用いて洗浄、軽く乾燥させた後に、ろ紙ごとシャーレに移して凍結乾燥機に2-3時間程度入れることで完全に乾燥させた。これを1.5 mlエッペンチューブ1本あたり0.1 gずつ小分けし−20℃で保存した。

＜実施例２＞抗体付着ガラスビーズを用いた検定
実施例１で作製した抗体付着ガラスビーズを用いて次の通り検定を行った。

1 cm角の葉片（0.02 g）をシール袋に入れて、磨砕Buffer（PBS-T-PVP 200 μl, PPV-IgG AP（標識二次抗体）コンジュゲート4 μl）で磨砕した。15 mlファルコンチューブにPPV抗体付着ガラスビーズを移しておき、ここに磨砕液を入れてなじませ37℃で10分間静置した。その後、洗浄瓶でPBS-Tをチューブに注入して（10ml以上）ビーズを洗浄した。ビーズが沈んだらデカンテーションで洗浄液を排除した。洗浄液が透明になるまで、数回、洗浄・排除を繰り返した。最後に、洗浄液がビーズ面に位置する状態になるまでピペットなどで残液を吸い取った。基質液（10%ジエタノールアミンpH 9.8を5 ml, p-ニトロフェニルリン酸二ナトリウム六水和物10 mg）をビーズの3倍量程度加え、デカンテーションでビーズ面上部の余分な基質液を捨てた。これを2回繰り返した後、ピペットなどでビーズ面までの基質液量にして、室温で5-15分程度静置する。基質液を肉眼あるいはNanodrop（Thermo Fisher Scientific社）によりA405の値を測定して判定した。

まず、直径0.35-0.5 mmのガラスビーズを用いて、ビーズに付着させる１次抗体濃度を5段階に希釈して検定した。PPV感染ウメ葉および健全ウメ葉に対し測定を行ったところ、１次抗体が×10から×80希釈までいずれのビーズも、健全葉に比べ感染葉が高い数値となり、ウイルス検出が可能であることが明らかとなった（表１）。

したがって、１次抗体の濃度は×80倍希釈であっても十分な感度でPPVを検出することができることが確認された。

＜実施例３＞ガラスビーズの粒子径の検討
次に、ガラスビーズの粒子径を変えて検定を行った。3種類のガラスビーズ：直径0.35-0.5 mm（大）、直径0.105-0.125 mm（中）、直径0.037-0.063 mm（小）について１次抗体を付着させ、測定を行った。ビーズに付着させた１次抗体はいずれも×80希釈とした。

結果を表２に示す。

表２に示したように、いずれも健全葉に対し、感染葉について高い数値が得られた。なかでも小ビーズを用いた場合が最も検出値が大きくなることが確認された。

＜実施例４＞従来のELISA法との比較
ガラスビーズを利用した本発明の方法と、従来のELISA法との検定比較を行った。

本発明の方法では、実施例１と同様の方法で作製した抗体付着ガラスビーズ（１次抗体は×80希釈、ビーズの粒子径は直径0.35-0.5 mm）を使用し、PPV感染ウメ葉、健全ウメ葉の同一サンプルについて、実施例２と同様の手順で吸光度の測定を行った。

一方、従来のELISA法は、0.05M炭酸Buffer（pH9.6）によりAnti PPV IgG（抗PPVウサギポリクローナル抗体）を500倍希釈した後、マイクロタイタープレート１ウェルごとに200μlを加え、30℃で4時間保温してウェルに抗体を付着させた後に、PBSTで4回洗浄した。PPV感染ウメ葉、健全ウメ葉のサンプルを20倍重量の磨砕液（20mM Tris-HCl）にて磨砕し１ウェルごと200 μl加えた。4℃で一晩静置後、PBSTで4回洗浄した。Conjugation buffer（20 mM Tris, 1 mM MgCl₂, 0.02% KCl, 0.8% NaCl, 0.2% BSA, 2% PVP K25, 0.05% Tween20）にてPPV IgG-ALP（ALP標識抗PPVウサギポリクローナル抗体）を500倍希釈した後、１ウェルごと200 μl加え、30℃で5時間保温した。その後、PBSTで4回洗浄した。基質Buffer（10%ジエタノールアミン, pH9.8）にて基質（p-ニトロフェニルりん酸二ナトリウム六水和物）を1 mg/mlになるように調整し、１ウェルごと200μl加え、30℃で30分間反応させた。その後3N NaOHを１ウェルごと50 μl加えて反応を中止した。プレートリーダーSH-1000Lab（日立ハイテク）によりA₄₀₅における吸光度を測定した。

結果を表３に示す。

表３に示したように、本発明の方法は、従来のELISA法よりも高感度にウイルスを検出することができた。

また、従来のELISA法は、検定葉粗汁液との反応時間が一晩であり検定に２日かかるのに対し、本発明の方法は、粗汁液との反応時間が10分程度で十分であり、抗体付着ビーズさえあらかじめ準備しておけば、総検定時間を30分程度に抑えることができるため、従来の方法に比べて、検出にかかる時間を大幅に短縮することができる。

１ビーズ体
２ケース体

Claims

試料中の植物ウイルスを検出する方法であって、以下の工程：
（１）標的植物ウイルスと特異的に結合する一次抗体が固定されたビーズ体と、試料とを接触させる工程；
（２）ビーズ体と、標的植物ウイルスと特異的に結合する標識二次抗体とを接触させる工程；および
（３）標的植物ウイルスと特異的に結合した標識二次抗体を検出する工程
を含むことを特徴とする植物ウイルスの検出方法。
ビーズ体の粒径は、0.010〜0.100ｍｍであることを特徴とする請求項１の植物ウイルスの検出方法。
工程（２）における標識二次抗体の標識は酵素タンパク質であり、工程（３）では、酵素タンパク質に特異的に反応する基質の分解によって、標的植物ウイルスと特異的に結合した標識二次抗体を検出することを特徴とする請求項１または２の植物ウイルスの検出方法。
工程（２）における標識二次抗体の標識は蛍光色素分子であり、工程（３）では、蛍光色素分子の蛍光によって、標的植物ウイルスと特異的に結合した標識二次抗体を検出することを特徴とする請求項１または２の植物ウイルスの検出方法。
試料中の植物ウイルスを検出するための植物ウイルス検出キットであって、標的植物ウイルスと特異的に結合する一次抗体が固定されたビーズ体を含むことを特徴とする植物ウイルス検出キット。
外部からの液体が流通可能なケース体の内部に、前記ビーズ体が保持されていることを特徴とする請求項５の植物ウイルス検出キット。