JPH05508078A - キチンを検出する分析装置及び方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 キチン　る　び 光皿Φ公団 本発明は標的物質を検出するだめの分析の分野に関し、特にキチンの存在を判定 しそしてそれにより試料中のカビ、酵母及び昆虫のようなキチン含有有機体の存 在を判定するための分析に関する。

茸景 カビや酵母によって引き起こされる感染症は、ヒトを含めて動物及び植物に世界 的に影響を及ぼす、水や食物の供給源を汚染しそして種々の体組織や体液におい て感染症を引き起こし得るかかる有機体が多数存在する。

汚染性のカビ、酵母及び昆虫の存在を検出するだめの慣用的方法は、これらの有 機体を含有している疑いのある動物や植物から試料を得てそしてこの試料を培養 して試料中に存在する所望有機体をそれらの存在を目視的に容易に検出するのに 充分な数になるように生育することを必要とする。典型的には、該有機体を培養 することは、特別な培地並びに数週間までの長い培養時間を必要とする。

他の方法は、固体サブストレート上の試料片の汚れをきれいにするために２０％ 水酸化カリウムのような熱い塩基性溶液を用いることを伴う。きれいにされた該 試料片は次いで例えば墨を用いて染色し、次いでこの処理後残存するカビ組織の 存在を検出するため顕＠鏡により調べられる。

カビ、酵母及び昆虫は、個々の種に対して特定的であり得るタンパク質を含めて 成る物質を含有する。他の物質は、より広く分布している。例えば、キチン（Ｎ −アセチルグルコサミンオリゴマー）は、たいていのカビ、酵母及び昆虫に見ら れる細胞壁の多に！類成分でありそしてレクチンのような試薬に対して反応性で ある（［ガラン（Ｇａｌｕｎ）等、アーク・マイクロパイオル（Ａｒｃｈ、Ｍｉ ｃｒｏｂｉｏｌ、）、１０Ｂ　（１）、９〜１６　（１９７６）Ｊ）。

カビのようなキチン含有有機体の存在に対する分析は公知であるが、比色測定（ 「シャーマ（Ｓｈａｒｍａ）等、トランス・プル・マイコル・ツク（Ｔｒａｎｓ 、Ｂｒ、Ｍｙｃｏｌ、Ｓｏｃ、）、６９　（３）、４７９〜８３　（１９７７） Ｊ）並びに亜硝酸−３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾン塩酸塩−塩 化第二鉄の使用及び光学鏡検法（［カミンスキイ（Ｋａｍｉｎｓｋｙｊ）等、キ ャン・ジェイ・ポット（Ｃａｎ、Ｊ、Ｂｏｔ、）、６０　（１２）、２５７５〜 ８０（１９８２）Ｊ）を含めて化学的分析を用いるキチンの検出に限られていた 。抗体を用いてカビを含む種々の微生物を検出するための免疫学的分析も公知で あり、しかしてこれらには個々の有機体に関連した抗原に対して反応性であるモ ノクローナル抗体を用いるもの（「ゴ・−ルドステイン（Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ） 、　欧州特許出１１１ＥＰ１７６．３５５　（１９８６）Ｊ）が含まれる。かか る分析は、種に特定的であるタンパク質に基づく、加えて、有機体を検出するた めに該分析は典型的には、特定的である該タンパク質が分析の際に抗体との反応 のために単離又は暴露されることを必要とする。

標識キチナーゼが、電子鏡検法やケイ光鏡検法でのキチンの目視化のために有用 であると報告されている。「チャンバーランド（Ｃｈａｍｂｅｒｌａｎｄ）等、 ヒストケミカル・ジャーナル（Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｊｏｕｒｎａｌ） ５上工、３１３〜３２１　（１９８５）ｊは、宿主−病原菌の関係を研究するた めにフザリウム種（Ｆｕｓａｒｉｕｍ　ＳＰ、）により感染されたトマト根細胞 にキチン超微細構造を局在させるためにキチナ全錯体金錯体を用いることを報告 している。「モラノ（Ｍｏｌａｎｏ）等１　ジエイ・セル・パイオル（Ｊ、Ｃｅ １Ｉ　Ｂｉｏｌ、）、８５．１９９〜２１２　（１９８０）Ｊは、サツカロマイ セス０セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中 のキチンの分布を研究するためにキチナーゼ−全錯体の使用を報告している。両 方の技術とも、目視化のために電子顕微鏡の使用を必要とする。モラノ（Ｍｏｌ ａｎＯ）等はまた、ケイ光鏡検法でキチンを目視化するためにフルオレセインイ ソチオシアネート（ＦＩＴＣ）−キチナーゼの使用を報告している。

「ハドウィガー（Ｈａｄｗｉｇｅｒ）等、プラント・フィシオル（ＰｌａｎｔＰ ｈｙｓｉｏｌ、）、６７．１７０〜１７５　（１９８１）Ｊは、エンドウーフサ リウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）相互作用におけるカビ成分の局在化を研究するため に抗キトサン性かつ抗カビ性の細胞壁抗血清の使用を報告している。該抗血清は 、ＦｊＴＣと結合された。それ故、組織中のキチンを検出するために試料は、紫 外線顕微鏡で調べられねばならなかった。試料切片の埋封及び免疫化学的染色ち また、透過電子鏡検法のために行われた。チャンバーランド（Ｃｈａｍｂｅｒｌ ａｎｄ）等、モラノ（Ｍｏｌａｎｏ）等及びハドウィガー（Ｈａｄｗｉｇｅｒ） 等により記載されているような手順は、試料中のキチンを目視化するために鏡検 法を必要とする。これらの手順は、通常精巧な試料調製法を伴う。

１９８９年ｌＯ月２４日に出願された米国特許出願第４２６，５３８号（参照の ため挙げられる。）は、生体内又は生体外の培養技術あるいは複雑な染色試薬を 必要としないカビ、酵母及び昆虫の検出法を開示し、しかしてこの方法はキチン を標的とするレクチン抗体又はキチン抗体に基づく０本発明は、この方法に対し て実質的な改善をもたらす。

光朋Ω要豹 本分析方法並びに該方法を実施するための手段の基本的な発明的概念は、カビ、 酵母及び昆虫を含めて成る有機体がキチンに冨んでいるという認識に基づいてい る。従って、本発明の分析は、キチンを直接的に検出しそして含蓄的にキチン含 有有機体の存在を演えきするためである０本発明の必須的特徴は、キチンに特異 的に結合する酵素を用いることを伴うことである。かかる酵素は、キチン結合性 生物学的試薬並びにキチン結合性又はキチン特異性酵素と称されそしてキチナー ゼ及びリソチームを含む、かかるキチン結合性酵素は、キチンに結合する前又は 後に標識に直接的に又は間接的に付着される。それにより本発明の分析は、試料 内に存在するキチンに検出可能な標識を選択的に付着させるように用いられ得る 。

本発明の分析は、キチンに特異的に結合する酵素を用いることによりキチンを検 出することを可能にする０本発明はいくつかの特定的態様に関して記述され得る けれども、かかる特定的態様は一般に２つの副総体的（ｓｕｂｇｅｎｅｒｉｃ） ａ様に分類され得る。より特定的には、一つの副総体的態様によれば、キチナー ゼのようなキチンに特異的に結合する酵素が、微小滴定量皿の溜めの底部、ガラ ススライドの表面又は浸漬ＩＩ（ｄｉｐｓｔｉｃｋ）の表面のような支持体の表 面に結合される。次いで試験されるべき試料が該表面に結合された酵素と接触さ れ、そして該表面上の酵素に結合するキチンの存在を判定して検出するために種 々の手順が実施される。第２の副総体的態様によれば、流体試料又は流動化試料 が膜（いわゆるメンプラン）を通じて濾過されて該試料の固体成分が該膜の表面 上に捕獲される。従って、該試料内のキチン含有有機体、キチン又はそれらの断 片が、該膜の表面に結合するようになる。結合した該試料は次いで、該試料中の キチンに選択的に結合し得る酵素例えばキチナーゼ又はリソチームと接触される 、キチン結合性の該酵素は、検出を可能にするように直接的に又は間接的に標識 され得る。カビのようなキチン含有有機体の存在は、該標識を肉眼で目視的に検 出することにより判定される。

本発明の主たる目的は、生体外又は生体内の培養技術あるいは時間のかがる染色 手順を必要とすることなくキチン含有有機体の存在を判定するためにキチン結合 性酵素を用いる迅速検出分析を提供することである。

本発明の特徴は、本分析がカビ、酵母及び昆虫のようなすべてのキチン含有有機 体の細胞キチン成分を検出することであり、しかして該キチン成分は一般に細菌 並びに哺乳類及び植物の組織中に存在せず、従って間違いの起こり得る正の読取 りが減じられる。

本発明の利点は、いかなる培養技術又は染色手順を必要とすることなくすべての タイプの生物学的（ＩＪ！乳類及び植物）流体及び組織並びに食物及び水の試料 中のキチンを検出しそしてキチン含を有機体の存在を演えきするのに用いられ得 ることである０本方法はカビ、酵母又は昆虫の特別な種に限定されず、何故なら かかる有機体はすべてキチンを含有するからである。

本発明の別の利点は、患者のカビ感染症の迅速診断のための効率的で経済的で臨 床的な実験室的分析技法を提供することである。

本発明の別の特徴は、カビ、昆虫並びに関連の病原菌及び汚染物の存在について 野外試料を評価するために農業試験所及び食品試験所により用いられ得る分析手 順を提供することである。

本発明の別の目的は、効率的で経済的なやり方でキチン含有有機体の存在を検出 するために用いられ得る携帯用（好ましくは使い捨て）＃断キットを提供するこ とである。

本発明の別の特徴は、カビ汚染物が直接的に培養される必要がなく、また汚染物 の局在化のための古典的な化学的染色手順の使用も必要とされないことである本 発明の別の特徴はキチンを検出するのにレクチンも抗キチン抗体も用いられない ことであり、このことは望ましい特徴であり、即ちレクチンはキチン以外の非カ ビ炭水化物にしばしば非特異的に結合し、一方抗キチン抗体はキチンの乏しい免 疫原性に因り生じるのがせいぜい困難であるので望ましくない。

本発明の利点は、検出手段が検出を遂行するのに電子鏡検法又はケイ光鏡検法の どちらの使用も必要としないことである。

本発明のこれらの及び他の目的、利点及び特徴は、以下に一層詳しく記述されか つ詳細の一部をなす添付図面を参照して本発明の構成及び使用についての詳細を 読解すると当業者に明らかになろう。

図面□□□呈単な記述 本発明は添付図面に関連して記述され、しかして各図は以下の通りである。

第１図は、キチンが透過性膜マトリックス上に結合される本発明のＢ様の概略図 である。

第２図は、被覆された微小滴定量溜め中にキチン含有試料が存在する概略図であ る。

第３図は、膜支持体、キチナーゼ、ウサギ抗キチナーゼ抗体並びにヤギ抗つサギ ＩｇＧ抗体に結合されたアルカリ性ボスファターゼ（この酵素は、色素原溶液か ら着色生成物を生じさせ得る。）を含む分析１！様の成分を表す概略図である。

第４図は本発明の別の分析Ｂ欅の成分を表す概略図であり、この場合多孔質膜が キチンを捕獲し、結合したキチンにキチン結合性酵素が付着し、その後このキチ ン結合性試薬に対して反応性である抗体に結合された信号発生酵素から構成され た複合体が該キチン結合性試薬に結合しそして色素原溶液が添加され、しかして 該溶液は該信号発生酵素に対する基質を含有しかつ該基質は該酵素と接触された 時色素を放出する。

第５図は本発明の分析の更に別の１！様の成分を表す概略図であり、この場合色 素原溶液と支持体を含み、該支持体にはキチンが結合され、該キチンにはアビジ ンが結合されたキチン結合性生物学的試薬が結合され、該試薬にはビオチニル化 酵素が結合される。

第６図は本発明の分析の更に別の態様の成分を表す概略図であり、この場合固体 支持体上にキチンがあり、該キチンには酵素が結合されたキチン結合性生物学的 試薬が結合され、しかしてこの複合体の酵素が色素原溶液中の基質と反応して着 色生成物を形成する。

第７図は本発明の分析の更に別のＵ樟の成分を表す概略図であり、この場合固体 支持体上に被覆されるキチナーゼであるキチン結合性生物学的試薬、被覆された 該支持体に結合されるキチン、該キチンに結合されるキチン結合性生物学的試薬 、該試薬に結合されるウサギ抗キチン結合性試薬抗体、ヤギ抗つサギＩｇＧ抗体 に結合された酵素、及び色素原溶液を含む。

好１シ■胆携ｑ詳述 カビ、酵母及び昆虫のようなキチン含有有機体を検出する本方法並びにかかる方 法を実施するための分析装置及びキットを記述するが、本発明は記述されている 個々の方法、分析装置又はキットそれ自体に限定されないで熱論変更され得ると いうことが理解されるべきである０本発明の範囲は添付の請求の範囲によっての み限定されるので、ここに用いられている用語は個々の態様を記述する目的のた めのみであり限定する意図ではないということも理解されるべきである。

本明細書及び添付の請求の範囲において用いられている名詞について、文脈が明 らかに単数又は複数を指摘していない限り単数及び複数の対象を含むということ が留意されねばならない、かくして、例えば“酵素”への言及は１種の酵素及び 複数種の酵素の混合物を含み、“試験用試料”への言及は１種のかかる試料及び 複数種のかかる試料の混合物を含み、“該方法”への言及は記述された方法の１ つ又はそれ以上を含む、等である。

本発明の方法は、カビ、酵母及び昆虫を含めて種々のキチン含有を機体の存在の 迅速な検出を、該有機体の費用がかかりかつ時間がかかる培養又は染色を必要と することなく可能にする。該方法はキチンに特異的な酵素試薬を用いてキチンを 検出するための分析を提供し、有機体の特定の株又は種に限定されない、加えて 本方法は、本分析における検出の前に、有機体を含有している疑いのある試料か らタンパク譬又は炭水化物のような特定の物質が単離されることを必要としな本 発明の方法で検出される物質は、はとんどすべてのカビ及び酵母の細胞壁並びに 多くの昆虫及び他の節足動物の外骨格に存在するキチン即ちＮ−アセチルグルコ サミンオリゴマーである。

本方法を実施するために、標的有機体を含有している疑いのある試料が入手され る。該試料は、流体成分及び非流体成分を含み得そして人間、動物、植物又は食 料品から生じ得る。典型的な試料は、尿、せき髄液、全血液又は血清のような生 物学的流体を含む、他の試料は、皮膚断片、だ液、組織ホモジネート、傷滲出物 又は毛を含む、加えて試料は、組織、断片、流体、滲出物及びホモジネートを含 めて植物からの物質から成り得あるいは汚染の疑いのある水又は食物であり得る 。

入手される試料のタイプに依り本発明の異なる１！様が、該試料中のキチンの存 在についての分析のために一層容易に適用できる。本発明は広範な種々の可能な ｓ樺並びにこれらのＢＨの各々に関連して用いられ得る種々の化学的及び生物学 的試薬を含むけれども、本発明は一般に２つの副総体的態様に含まれる。第１の 副総体的態様によれば、試料は流体成分及び非流体成分を含みあるいは両成分を 含有するように流動化されそしてその後多孔ｉｔ！ＩＩを通じて濾過されて線膜 の表面上に非流体含有成分が捕獲される９次いで、これらの非流体含有成分中の キチンの存在が、キチンに特異的に結合する酵素の使用により分析される。この 副総体的１Ｍ様は一般的に第１図に示されており、そしてその特定的Ｂ様が第３ 〜６図に概略的に示されている。

本発明の第２の副総体的Ｂ様は、微小滴定量溜めのような物質の表面をキチンに 特異的に結合する酵素で被覆することを伴う。いったんキチナーゼのような酵素 が該表面に結合されると、分析されるべき試料が、該試料中のキチンと該表面に 結合されたキチナーゼとの間で結合が起こるのに充分な期間、結合された該キチ ナーゼと接触される。本発明のこの副総体的態様は第２図に示されている。この 副総体的態様がいかに実施され得るかを概略的に示す特定的態様は、第７図に示 されている。しかしながら、当業者に明らかである種々の操作により、第２図に 示された副総体的態様もまた第３〜６図に示された特定的態様を用いて実施され 得、即ち第７図の特定的態様のみを用いて実施される必要はないということが留 意されるべきである。

キチン特異性酵素がサブストレート表面に接着されるべきである場合、該酵素は ガラススライド、微小滴定量溜め、浸漬棒又は他の適当な物質の表面に接着され 得る。試料が膜を通じて濾過されるべきである場合、いかなる適当な膜フィルタ ーも用いられ得、例えば種々の合成又は天然のポリマー物質から構成されている ものである。

本発明の２つの副総体的ａ様が第１図及び第２図に示されている。第１図におい ては、液体成分及び固体成分から構成された試料の固体成分が膜マトリックスに 付着される０種々の特定的ａｍが第３〜６図に示されている。該マトリックスの 表面は好ましくは、該表面が該固体成分及び特に該試料中のキチンを該マトリッ クスの表面上の適所にしっかりと保持するように設計される。キチンにより占め られていない活性結合部位を保護するようにブロッキング剤（後で更に記述され る。）を含むこともしばしば望ましい。試料がマトリックスに固着された後、種 々の手順が行われ、それにより信号（好ましくは目視可能なカラー信号）が発生 されそしてキチンの有無が判定され、従ってキチン含有微生物の有無が判定され る。

キチンが結合されていない線膜の表面の部位は好ましくは、例えば該膜上の固定 された試料をウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、カゼイン又は卵アルブミンのよう な無関係のタンパク質溶液と共に保温することによりブロックされる。ブロッキ ングにより、キチンを検出するための分析を妨害し得る結合性部位の非特異的相 互作用（即ち、静電気的相互作用）が減じられる。

第２図に示された態様によれば、溜めの表面はキチン特異性酵素で被覆される。

次いで、ブロッキング剤が、該層めのすべての残存結合性部位を占めるように施 用される。処理された該層めの表面に、キチンを含有しているかも知れない試料 が置かれる。特定的態様が第７図に示されている。キチナーゼが添加され、そし てキチナーゼが該試料内に存在するキチンに結合するよう約３分ないし約１時間 の範囲の期間該試料と共に保温される。次いで、該層めは緩衝荊で洗浄されて、 微小滴定量溜めの表面上のキチナーゼに結合されたキチンに結合されていないキ チナーゼが除去される。この洗浄後、溜め皿上の固定化キチンが、該キチナーゼ に直接的に又は間接的に結合される標識を接触させた後発色反応を起こす試薬を 添加することにより検出される。この方法論は、不溶性及び可溶性信号検出手法 のどちらについても用いられ得る。即ち、不溶性信号試薬が用いられる場合は、 信号は溜めの底部及び側部上に被覆されるように認められる。可溶性信号試薬が 用いられる場合は、上澄み液がその場で肉眼で目視的にあるいは高信鯨性の普通 に用いられる自動大皿読取器により読み取られ得、あるいは別個の検出器で処理 するために取り出され得る。

試料はまたガラススライド上に綿棒、解剖刀刃又は他の同様な器具を用いて手で 塗布され、完全に乾燥されそして次いで化学薬品で固定され得る。固定化のため に加熱も用いられ得、例えば試料が固体相上に接着するまで固体相は沸騰（１０ ０℃）水浴上に置かれ得る。

試料が流体成分を有さない場合、該試料は固体相に手で置かれそして化学的固定 剤を用いて接着され得、あるいは流体中に懸濁されそして上述のように固体相に 施用され得る。

本発明の分析方法論は、標識に直接的に又は間接的に付着されるキチン特異性酵 素の使用に基づいている。従って、本発明の分析は、キチン含有有機体が存在し ているかも知れない表面を除去又は破壊する必要なく該表面上で存在するキチン 含有有機体をその場で検出するのに用いられ得る０例えば植物がその表面におい てカビ感染症にかかっている疑いがある場合、キチン特異性酵素を含有する本発 明の生物学的試薬が該植物の表面上に噴霧され得る。その後、結合されていない キチン特異性酵素を洗い流すために洗浄が行われるべきである。洗浄後、第３〜 ７図の特定的態様で示されているような種々の手順が、該植物に存在しているか も知れないキチンに結合されたキチン特異性酵素を検出するために行われ得る。

かかる方法は、色素原溶液と接触された時色素を生じる別の酵素に結合されたキ チナーゼを用いて行われ得る。かかる２種の酵素の複合体が該植物の表面と接触 され、その後洗浄されそしてその後色素原溶液の施用がなされ得る。該表面が色 変化を起こす場合、このことは該植物の表面にキチン含有有機体が存在すること を指摘する。

本発明の分析は、キチンに特異的に結合するキチン結合性酵素試薬の結合並びに 標識化系によるこの結合の目視化に依る。結合性試薬は、好ましくはキチナーゼ である。

キチナーゼに対して反応性であるポリクローナル抗体は、免疫原としてキチナー ゼを用いる哺乳類宿主の免疫化後血清含有抗体を回収することにより得られ得る 。ポリクローナル抗体を造る手順は周知であり、ここでは繰り返して述べない。

血清含有ポリクローナル抗体は、キチン含有有機体を検出するため下記に述べる 分析においてキチンに結合しているキチナーゼに結合させるために用いられるキ チナーゼに対して反応性であるモノクローナル抗体もまた、キチナーゼに結合す べき分析に用いられ得る。これらのモノクローナル抗体は、モノクローナル抗体 を得る方法を開示している「コーラ−（Ｋｏｈｌｅｒ）及びミルシュティン（Ｍ ｉｌｓｔｅｉｎ）、”ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）”、２５６，４９５　（１９ ７５）Ｊ（参照のため挙げられる。）の手順に従って公知の技術を用いて誘導さ れ得る。この手順では、体細胞ハイブリダイゼーシヨンを用いて、抗体産生細胞 （典型的には、抗原で前もって免疫化されたマウスの膵臓細胞）を骨髄腫細胞の ような不滅の細胞系統からの細胞に融合させることにより、ハイブリドーマが製 造される。

キチンは実質的に非免疫原であること並びにそれ故キチン抗体を生じせしめるこ とは困難であることがわかったけれども、抗キチナーゼ抗体は生じせしめられ得 ること並びにかかる抗キチナーゼ抗体は本発明の種々の態様に従って有用である ことがわかった。抗キチナーゼ抗体であるポリクローナル抗体及び／又はモノク ローナル抗体は、本発明の種々の特定的！！様を実施するのに有用である０本発 明者は、キチナーゼの検出に用いられ得るポリクローナル抗キチナーゼ抗体をウ サギにおいて生じせしめた。従って、キチンが支持体表面に結合されそしてキチ ナーゼが添加されかつ次いで該キチンに付着されるならば、該抗キチナーゼ抗体 は該キチナーゼに結合しよう。かかる抗キチナーゼ抗体は一般に例えば酵素で標 識され、しかして該酵素は色素原溶液と接触された時発色する。

ポリクローナル抗キチナーゼ抗体が、２匹のニエージーランド産白ウサギを用い て生じせしめられた。該ウサギは、すと（Ｒｉｂｉ）アジュバント中に存在する １ｍｇのストレプトマイセス・グリセウス（ＳｔｒｅｐｔＯｍ７ＣｅＳ　ｇｒｉ ｓｅｕｓ）からのキチナーゼ（シグマ社のカタログＣ１５２５がら入手できる、 ）で免疫化された。これらのウサギは３週間後２回目の免疫化を受け、次いで２ 週間の間隔にて更に２回免疫化された。これらのウサギがら血清が集められ、そ してＥＬＩＳＡにより抗キチナーゼ抗体について分析された。得られた結果は、 両方のウサギとも高血清カ価の抗キチナーゼ抗体を有していたことを示した。

該ウサギから得られた血清が、−３０”Ｃにて保存されそして下記に述べるよう な分析に用いられた。

抗キチナーゼ抗体は新規であると信じられ、それ数本発明の別の側面をなす。

更に、抗キチナーゼ抗体と、色素原溶液との接触で着色剤を生じ得る酵素との間 で形成された複合体は本発明の別の側面をなす、抗キチナーゼ抗体は他の酵素に 直接的に又は間接的に結合され得る、ということが指摘される。かがる間接的複 合化を例示すると、抗キチナーゼ抗体に対する他の抗体が生じせしめ得、しがし てこの抗体は色素原溶液と接触すると発色し得る標識即ち酵素と結合される。

キチン含有カビの存在を検出するための分析は、直接的な結合分析であり得る、 かかる分析では、キチン結合性酵素試薬即ちキチナーゼ又はリソチームが、固体 相に付着された試料を結合性標識試薬と接触させることにより、試料中に存在す るカビのキチンと反応される。該標識は次いで目視的に検出されて、カビが存在 するかどうか判定される。

カビの存在は、既定量の標識分析試薬を用いそして標準的結合曲線を用いて該標 識により生（ンた信号の強度（反応した分析試薬の量の関数である。）をキチン の４虜に関係づけることにより定量化され得る。該曲線は、既知量のキチンを用 いて生じた信号の強度を測定することにより作られる。

キチンの量はまた間接的な拮抗阻害分析を用いて定量化され得、しかしてこの場 合は標識分析試薬例えばキチナーゼが有機体含有溶液と混合され、そして次いで 固体支持体に付着されたキチンと反応するように添加される。キチン含有有機体 は固定化キチンと競争し、かくして標識により生じる信号の度合は投与量に関連 して低減し、試料中の有機体に存在するキチンの量の測定力制能になる。

試料中に存在するキチンへの分析試薬の結合の目視化は、公知の手順を用いて、 信号例えば放射性核種、酵素又はケイ光剤を生じ得る物質でキチナーゼを直接的 に又は間接的に標識することにより達成され得る。酵素標識が用いられる場合、 適当な色素原試薬と反応された時色素又は他の目視検出可能な信号を生じる酵素 が選択される。固体指上の試料に結合された酵素標識試薬と接触させるために酵 素基質が溶解して用いられるべきである場合、酵素セイヨウワサビペルオキシダ ーゼ（ＨＲＰ）に対して反応性であるオルトフェニレンジアミン（ＯＰＤ）のよ うな可溶性酵素基質が用いられ得る。

別の方法によれば、試料又は試料片は、目視化されるためにガラススライドのよ うな固体相に手で施用される。ジアミノベンジジン又は３−アミノ−９−エチル カルバゾールのような基質並びにＨＲＰが用いられる。該酵素による該基質の開 裂から生成する不溶性着色反応生成物が、該酵素の位置又はその近くで沈着され る。かくして、カビ組織が酵素標識キチナーゼで被覆される場合、酵素標識の酵 素反応が該カビ組織上及びその回りに着色基質を沈着させ、該カビは目視検査に より容易に検出され得る。

その代わりにキチン結合性酵素分析試薬が間接的に標識され得、しかして該分析 試薬に結合する追加的物質に信号生成標識が付着される０例えばキチナーゼがキ チンを検出するために用いられる場合、抗キチナーゼ抗体が標識と結合されそし てキチンと反応させるためにキチナーゼに結合され得る。この分析は有機体の検 出のための一層感応的な分析を提供し得、何故なら分析試薬の単位当たり一層多 量の標識が結合され得るからである。

ビオチン／アビジン試薬が、結合を達成するのに用いられ得る。この場合、ビオ チンは抗体例えば抗キチナーゼ抗体に共有的に結合される。ビオチン特異性受容 体タンパク質であるアビジンは信号発生酵素に結合され、次いでビオチンと反応 して該抗体を１識する。この標識抗体は次いで、分析される試料中のキチンに結 合されたキチナーゼを検出するため分析に用いられる。

特定的分析態様 ここに記載の分析の一般的ａｍ即ち副総体的態様が、第１図及び第２図に示され ている。これらの副総体的！！様の両方ともキチナーゼのようなキチン結合性酵 素の使用を伴うけれども、第１図に示されたプロトコールは試料をサブスト１／ −トに最初に結合させることを伴うのに対し、第２図に示されているプロトコー ルはキチナーゼをザブストレートに最初に結合させることを伴う、どちらのプロ トコールが用いられようが、試料内のキチンは最終的には着色剤を生じ得る標識 即ち酵素に付着され、それにより試料内のキチンの有無を目視的に判定するのが 可能になる。第１図に示された副総体的ｔｑｍは、以下に詳述される第３〜６図 に概略的に示された特定的態様により更に詳細に本質的に記述される、第２図に 示された副総体的態様は、第７図に示された特定的概略図に言及して更に記述さ れる、唯１つの特定的概略図（第７図）が第２図の副総体的態様に関して与えら れているけれども、第２図の副総体的態様の特定的Ｌｇｉ樟を実施するのに第３ 〜６図に従って種々の成分を再配置することも可能である。

第３図の分析 本発明の分析の特別なり様が、第３図に概略的に示されている。この分析は第４ 〜７回の分析よりも詳細に記述され、しかして第４〜７図の分析は、第３図に関 して以下に与えられる特定的情報が第４〜７図に示された分析に適用され得る点 で比較的簡単に記述される。第３図の分析によれば、キチンの存在について試験 されるべき試料が、図示されている多孔質膜のような膜表面上に置かれる。該試 料中のキチンが、線膜に接着される。これは、上述した方法のいずれかを用いて なされ得る。好ましくは、フィルターとして働きそしてキチンのような該試料中 の固体を捕捉する透過性膜に該試料を通すことによりなされ得る。

いったん試料が多孔質膜に固着されると、ＢＳＡのような無関係なタンパク質溶 液の添加により、該膜上の他の結合部位をブロックすることが望ましい。かかる ブロッキング剤の使用により、本発明の分析態様のいずれも一層特異的にされ得 る。かかる分析に関してブロッキングタンパク質及びブロッキング剤を用いるこ とは当業者にとって公知であるので、次の記述は、ブロッキング試薬の使用に関 する工程は更に繰り返して述べない。

キチナーゼ又はリソチームのようなキチン結合性酵素が、分析されるべき試料に 、キチン結合性試薬が該試料中に存在するキチンに結合され得る条件下で添加サ レル、結合環境は、該酵素が該キチンに結合し得るが該キチンを速やかに分解し 得ないように制御され得る。いくらかの酵素分解が起二り得るけれども、当該系 は信号を発生させるのにキチンの分解に依存せず、該キチンが部分的に分解され 得るとしても検出能力は維持される。一層特定的には、咳系は、基質キチンに特 異的に結合する酵素自身の能力を利用する。

該キチン結合性試薬に対する抗体（例えば、ウサギ抗キチナーゼ抗体）は今や、 第１の抗原−抗体反応を与えるためにキチン−キチナーゼ錯体に結合され得る第 ２の酵素が、抗抗体即ち第１の抗体に対する抗体に結合される０例えば、アルカ リ性ホスファターゼが、ヤギ抗つサギＩｇＧ抗体に結合される。これは、第２の 抗原−抗体反応を与えるために添加される。最後に、この複合抗体に対する試薬 （基質）が、検出信号を発生させるために添加される。アルカリ性ホスファター ゼに対する基質は、アミノエチルプロパンジオールの緩衝剤中のプロモークロロ −インドリルホスフェート及びニトロブルーテトラゾリウムを含む。しかしなが ら、他の色素原信号も利用され得る。その代わりに、抗キチナーゼ結合性抗体そ れ自体が、色素原溶液との組合わせで発色し得る酵素のような標識に結合され得 る。かかる酵素は、ウレアーゼ及びペルオキシダーゼを含む。

第４図の分析 第４図に示された分析の概略図は多孔質膜の形態の支持体を含み、しかしてキチ ンを含有していると考えられている試料が該膜上に宜かれる。次いでキチナーゼ のようなキチン結合性酵素が、存在するキチンにキチナーゼが結合され得るよう な条件下で添加される。異物及び結合されていない物質は、次いで洗い流され得 る０次いで、ウサギ抗キチナーゼ抗体に結合されている酵素から構成されている 複合体が添加される。キチナーゼがキチンに結合して存在しているならば、該抗 体は該キチナーゼに結合しよう０次いで、結合されていない物質は洗い流される 。その後、色素原溶液が、目視的に検出され得る色素を生じるように添加される 。

第５図の分析 第５図では、キチナーゼはアビジンに結合されて複合体を形成する。この複合体 がキチナーゼの特異性に因りキチンに結合された後、ビオチンが結合されたアル カリ性ホスファターゼであるビオチニル化酵素が添加される。該ビオチニル化酵 素はアビジンに結合し、しかして結合された物質は色素原溶液の添加時に検出さ れ得る。

第６図の分析 本発明の分析の非常に単純な態様が第６図に示されている。この態様によれば、 必須的成分は、アルカリ性ホスファターゼのような酵素に結合されたキチナーゼ から構成されている複合体である。該キチナーゼは、支持体上に存在するキチン に結合しよう、この結合後洗浄が行われ、その後色素原溶液が添加され、しかし てアルカリ性ホスファターゼが存在するならば色素を生じる。

第７図の分析 第７図に概略的に示されている分析Ｂ様は、第２図に示された副総体的方法の特 定的Ｌｉ様である。この態様によれば、キチナーゼのようなキチン結合性酵素が 、ポリスチレン支持体のような固体支持体の表面に最初に結合される。利用可能 な支持体表面のすべてにキチナーゼを結合させる必要はない。キチナーゼが結合 していない活性部位は、ＢＳＡのような適当なブロッキング剤の添加により保護 され得る。キチナーゼ及びブロッキング剤が添加された後、キチンを含有してい るかも知れない試料が該表面上に置かれる。キチンが該試料中に存在しているな らば、該キチンは固定化キチナーゼに結合しよう０次いで、該表面は洗浄されそ して更にキチナーゼが添加され、しかして該表面に固定化されたキチナーゼに付 着されているキチンに結合しよう、当該キチナーゼを該キチンに結合させた後、 キチナーゼに結合する抗キチナーゼ抗体が添加される。該抗体が結合された後、 洗浄が行われそしてその後複合体が添加される。この複合体は、キチナーゼ抗体 に結合する抗体に結合されたアルカリ性ホスファターゼのような酵素から構成さ れている。例えば、かかる抗抗体はヤギ抗つサギＩｇＧ抗体のような抗ＩｇＧ抗 体であり得る。結合が行われそして洗浄が行われた後、アルカリ性ホスファター ゼのような酵素と接触した後発色する色素原溶液が添加される。

第７図は第２図の副総体的態様の唯一の特定的態様を提供するけれども、第２図 の一般的概念に含まれる他の特定的１！様は、この開示を読解しそして第３〜６ 図に示された特定的Ｂ様を検討すると当業者には明らかであろう。１！様はすべ て、キチンに結合させるためにキチナーゼのようなキチン結合性酵素の使用を含 む。抗体及び複合体のような他の試薬を伴う種々の層化技法が、種々の所望効果 を得るために種々の形態及びやり方で用いられ得る。

本発明の分析に関して有用な種々の複合体もまた、本発明の側面をなすと考えら れる。当業者に知られた方法論を用いて、種々の複合体が形成され得る。酵素複 合体に対する特異性抗体の形成に関して、１９９１年に発行された免疫化学に関 するシグマ社のカタログ及びそれに挙げられている種々の刊行物が参照される、 かかる刊行物には、酵素／抗体複合体、アルカリ性ホスファターゼと他の酵素又 は抗体との間で形成される複合体、ペルオキシダーゼと他の酵素又は抗体との間 で形成される複合体並びにウレアーゼと他の酵素又は抗体との間で形成される複 合体のような特定的複合体が記述されている。ビオチン複合体の形成に関して特 定的記述がなされている。シグマ社の該カタログ並びに該カタログに挙げられて いる種々の刊行物になされている記載が参照される。

本発明の重要な側面は、上述した方法に従って造られた抗キチナーゼ抗体を含む 、これらの抗キチン抗体を用いて形成された種々の複合体もまた、本発明の重要 な側面をなすと考えられる。かかる複合体はキチナーゼ／他の酵素の抗体を含み 得、しかして他の酵素は一般に色素原溶液と接触された時発色し得る酵素である 。抗キチナーゼ抗体もまた他の抗体に結合され得、しかして他の抗体は、色素原 溶液と接触されると発色し得る他の酵素に結合される。

本発明が向けられる当業者にとって明らかなように、本発明は、本発明の精神又 は必須的特徴から逸脱することな（、上記に特定的に論じた技術以外の技術を用 いて実施され得る。それ故、上記に述べた個々の材料及び方法は、すべての点で 例示的であり、制限的でないと考えられるべきである。例えば、放射性核種又は ケイ光剤のような酵素以外の４１［ｍ剤が、当該技術で知られた手順を用いて、 キチンに結合された試薬を検出するのに用いられ得る。加えて、試料は、他の手 順例えば流体試料の濾過並びに固体相への物質の遠心処理によりザブストレート に付着され得る０本発明の範囲は、上記に述べた方法及び手順の例に制限される というよりむしろ添付の請求の範囲に記載された通りである。

寧 も 示 皆 ＃ 似 皆 二　固体支持体−多孔質膜 第３図 Ｑ　色素原溶液 第４図 第５図 ０　色素原溶液 第６図 。　色素原溶液 ＝コ　固体支持体−ポリスチレン表面 第７図 要約書 キチン　る　び 光朋ｐ盟約 キチンに特異的に結合する酵素を用いてキチンの存在を検出することにより、固 体相に付着された試料中のカビ、酵母及び昆虫のようなキチン含有有機体を検出 する方法が開示されている。該方法は好ましくは、キチン質の物質を膜上に捕獲 しかつ接着させるために、キチンを含有する試料を膜に通すことにより実施され る。キチナーゼ又はリソチームのようなキチン結合性酵素が、この酵素が該膜上 のキチンに結合されるような条件下で添加される。このキチン−キチナーゼ錯体 を検出するために、信号発生化合物が、該キチナーゼ（又はリソチーム）に直接 的に結合されるか、あるいは抗キチナーゼ（又はリソチーム）抗体又は抗１ｇＧ 抗体（該抗キチナーゼ抗体に結合する。）のいずれかに間接的に結合される。

キチンの存在を指摘する検出信号を生じせしめるために、該信号発生化合物に対 する試薬が添加される。本発明の方法を実施するために必要な物質を含むキット もまた、新規複合体と同様開示されている。

国際調査報告

Claims (34)

【特許請求の範囲】
1. １．試料中のキチンの存在を判定する方法であって、（ａ）キチンを含有してい る疑いのある試料をサブストレートに付着させ、（ｂ）サブストレートに付着し た該試料を、キチンに選択的に結合し得る酵素と接触させ、そして （ｃ）該試料中に存在するキチンに結合した酵素を検出し、それによってキチン の存在を判定する ことからなる上記方法。
2. ２．該酵素を肉眼で目視的に検出可能な標識に結合させて酵素−標識複合体を形 成させる、請求の範囲１記載の方法。
3. ３．該酵素を該標識に直接的に結合させる、請求の範囲２記載の方法。
4. ４．該酵素を中間の化合物又は抗体によって該標識に間接的に結合させる、請求 の範囲２記載の方法。
5. ５．該酵素を抗キチナーゼ抗体を経て該標識に間接的に結合させる、請求の範囲 ２記載の方法。
6. ６．該酵素を抗キチナーゼ抗体及び抗ＩｇＧ抗体を経て該標識に間接的に結合さ せる、請求の範囲２記載の方法。
7. ７．該酵素がキチナーゼ及びリソチームから成る群から選択される、請求の範囲 １記載の方法。
8. ８．該酵素がキチナーゼである、請求の範囲７記載の方法。
9. ９．該標識が色素原溶液と接触された時信号を発生し得る酵素である、請求の範 囲２記載の方法。
10. １０．該試料がヒトの生物学的流体である、請求の範囲１記載の方法。
11. １１．該生物学的流体が尿、血液、だ液及びせき髄液から成る群から選択される 、請求の範囲１０記載の方法。
12. １２．該試料が皮膚、だ液、組織ホモジネート、滲出物及び毛から成る群から選 択される、請求の範囲１記載の方法。
13. １３．該試料がキチン含有有機体で汚染されていると考えられている水である、 請求の範囲１記載の方法。
14. １４．該試料がキチン含有有機体で汚染されていると考えられている食物である 、請求の範囲１記載の方法。
15. １５．該試料がキチン含有有機体で汚染されていると考えられている植物から入 手される、請求の範囲１記載の方法。
16. １６．該試料が昆虫を含有していると考えられている流動化植物組織からなる、 請求の範囲１記載の方法。
17. １７．該サブストレートがフィルター、膜、ビーズ、粒子、微小滴定量皿、スラ イド及び磁気粒子から成る群から選択される、請求の範囲１記載の方法。
18. １８．該サブストレートが透過性ポリマー物質から構成されている、請求の範囲 １記載の方法。
19. １９．試料中のキチン含有有機体の存在を判定する方法であって、（ａ）キチン 含有有機体を含有している疑いのある試料をサブストレートの表面に付着させ、 （ｂ）サブストレートに付着した該試料を、キチンに選択的に結合し得る酵素で あってキチナーゼ及びリソチームから成る群から選択される酵素と接触させ、そ して （ｃ）該試料中に存在するキチンに結合した酵素を検出し、それによってキチン 含有有機体の存在を判定する ことからなる上記方法。
20. ２０．該キチン含有有機体がカビ、酵母及び昆虫から成る群から選択される有機 体である、請求の範囲１９記載の方法。
21. ２１．試料中のキチンの存在を判定する方法であって、（ａ）キチンに選択的に 結合し得る酵素をサブストレートの表面に付着させ、（ｂ）該酵素をキチンを含 有している疑いのある試料と、該試料中のキチンが該酵素に結合するのに充分な 時間接触させ、そして（ｃ）該サブストレートの表面に結合された酵素に結合し たキチンを検出し、それによって該試料中のキチンの存在を判定することからな る上記方法。
22. ２２．該酵素に結合したキチンを、キチンに選択的に結合し得る酵素と接触させ 、そしてキチンに選択的に結合するこの酵素に選択的に結合し得る抗体が標識に 結合されている複合体を接触させることを更に含む、請求の範囲２１記載の方法 。
23. ２３．キチン検出分析キットであって、（ａ）キチナーゼ、 （ｂ）抗キチナーゼ結合性抗体、及び （ｃ）信号発生酵素に結合されている抗ＩｇＧ抗体からなるキチン検出分析キッ ト。
24. ２４．更に （ｄ）信号発生酵素との接触で発色する色素原溶液を含む、請求の範囲２３記載 のキチン検出分析キット。
25. ２５．キチン検出分析キットであって、（ａ）リソチーム、 （ｂ）抗リソチーム結合性抗体、及び （ｃ）信号発生酵素に結合されている抗ＩｇＧ抗体からなるキチン検出分析キッ ト。
26. ２６．更に （ｄ）信号発生酵素との接触で発色する色素原溶液を含む、請求の範囲２５記載 のキチン検出分析キット。
27. ２７．キチン検出分析キットであって、（ａ）キチンに選択的に結合し得る酵素 であってキチナーゼ及びリソチームから成る群から選択される酵素、 （ｂ）キチンに選択的に結合し得る該酵素に選択的に結合する抗体、及び（ｃ） 該抗体（ｂ）に結合する抗ＩｇＧ抗体であって信号発生酵素に結合されている抗 ＩｇＧ抗体 からなるキチン検出分析キット。
28. ２８．植物の表面におけるキチンの存在を判定する方法であって、（ａ）キチン を含有している疑いのある植物の表面を、キチナーゼ及びリソチームから成る群 から選択されるキチン結合性酵素を含有する試薬と接触させ、（ｂ）該植物の表 面を洗浄して、該植物の表面におけるキチンに結合していない酵素を洗い流し、 （ｃ）該植物の表面を、信号発生酵素に直接的に又は間接的に結合されている抗 キターゼ結合性抗体と接触させ、 （ｄ）該植物の表面を洗浄して、結合していない信号発生酵素を洗い流し、そし て （ｅ）該植物の表面を、該信号発生酵素と接触された時着色生成物を生じる基質 を含有する色素原溶液と接触させる ことからなる上記方法。
29. ２９．試料中のキチン含有有機体の存在を判定する方法であって、（ａ）キチン 含有有機体を含有している疑いのある試料を支持基材に付着させ、（ｂ）支持基 材に付着した該試料をキチナーゼと接触させ、（ｃ）該キチナーゼを抗キチナー ゼ結合性抗体と接触させ、（ｄ）該抗キチナーゼ結合性抗体を、検出信号を発生 し得る試薬と結合されている抗ＩｇＧ抗体と接触させ、そして （ｅ）該信号の有無を判定し、それによって該試料中のキチンの有無及び該試料 中のキチン含有有機体の有無を演えきすることからなる上記方法。
30. ３０．該試料がヒトの生物学的法体である、請求の範囲２９記載の方法。
31. ３１．該生物学的流体が尿、血液及びせき髄液から成る群から選択される、請求 の範囲３０記載の試料。
32. ３２．信号発生酵素に結合したキチナーゼから構成されている複合体。
33. ３３．該キチナーゼが該信号発生酵素に直接的に結合している、請求の範囲３０ 記載の複合体。
34. ３４．該キチナーゼが、該信号発生酵素に結合した抗キチナーゼ抗体に結合して いる、請求の範囲３０記載の複合体。