JPH03504924A - 迅速ホモアルギニン感応性アルカリホスフアターゼ（ｆｈａｐ）免疫検定法およびこれに有用な抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 迅速ホモアルギニン感応性アルカリ ホスファターゼ（ＦＨＡＰ）免疫検定法およびこれに有用な抗体 １皿丘！ 本発明は、一般的には、血清のＦＨＡＰ　（癌マーカ）の免疫検定法に関する。

より詳細には、本発明は、疾病のインディケータとしての２つのＦＨＡＰ成分の 物理的会合の測定に関する。

１１孜１ 組織の退化に関する疾病を持つ人間の血液は、高レベルの膜小片をしばしば含む 。一般的には、ジンカイ（Ｓｈｉｎｋａｉ）等のキャン・レス（Ｃａｎ、　Ｒｅ ｓ、）第３２巻、第２３０７−２３１３頁（１９７２年）を参照されたい。この 論文並びにここにおいて言及されるその他の全ての論文および特許の記載は、本 明細書において引用して、本明細書中に十分に説明されているものとして記載に 代える。１つのかかる小片であるｒＦＨＡＰＪは電気泳動により分離され（例え ば、米国特許第４．１６６、７６６号参照）、アルカリホスファターゼ活性によ り最初に検出された。その独特の（迅速な（ｆａｓｔ）　）電気泳動移動度とホ モアルギニンによる抑制に対する感応性が、その頭字語の根拠である。この点に 関して、ＦＨＡＰは、ある種の酢酸セルロース電気泳動において肝臓アルカリホ スファターゼよりも迅速である。

ＦＨＡＰは種々の癌のマーカであることが、研究により示されている。例えば、 ボウサーフィン（Ｂｏｗｓｅｒ−Ｆｉｎｎ）等のチューマー・バイオロジイ（Ｔ ｕｍｏｕｒ　Ｂｉｏ−１ｏｇｙ）第７巻、第３４３−３５２頁（１９８６年）を 参照されたい。Ｆ　ＨＡ、　Ｐは、当初はイソエンザイムであると考えられてい たが、この物質は実際には、大きな複合体、とりわけアルカリホスファターゼ、 ロイシンアミノペプチダーゼ、ガンマグルタミルトランスフェラーゼおよび５° ヌクレオチダーゼを特に含む大きな複合体である。これらの酵素は膜に存在する 酵素であるので、ＦＨＡＰはある種の疾病の種々の段階において発生される細胞 膜の小片からなることが現在では明らかである。

血清中のＦＨＡＰはセルロースポリアセテート電気泳動により測定することがで きるが、この方法の比較的乏しい感度は、その有用性を、ＦＨＡＰ濃度が遊離の 肝朦／骨／腎臓アルカリホスファターゼ濃度に近い数少ない場合に限定する。血 清中のＦＨＡＰレベルはまた、イオン交換分離および米国特許第４．１６６、７ ６６号に詳述されている酵素検定法により測定することができる。しかしながら 、これは、測定当たりかなりの量の血清と、過度のコストおよび時間とを必要と する。更に、検定の感度は、ある場合には、健康コントロールの血清に存在する ＦＨＡＰ様の物質の検出を許す。

免疫検定の開発に向けた第１段階として、ＦＨＡＰに対する抗体を開発する試み がなされてきた。しかしながら、本発明の以前は、これらの努力は不首尾に終っ ていた。別の問題として、先行技術の検定法は定量レベルに関する情報を提供す るが、癌の種類または癌の段階については殆ど何も知らせないことがある。

か（して、疾病について多量の情報を提供するとともに、使用がより簡単なＦＨ ＡＰ試験が待望されている。

及旦Ａ目１立 本発明は、Ｆ　ＨＡ　Ｐの抗体を提供するものである。

本発明はまた、ＦＨＡＰの抗体、好ましくは、モノクロナル抗体を生産すること ができるハイブリドーマを提供するものである。

本発明の別の局面は、検定法を提供する。好ましい形態においては、検体（例え ば、大血清）を、ＦＨＡＰの第１部分を認識する化合物（例えば、抗体）にさら す。次に、検体における血清中のＦＨＡＰの第２の別の部分の存在とこれが第１ の部分と物理的に会合する程度とを測定する。次に、検定結果を対照レベルと比 較して、疾病のおきる可能性の特徴を提供する。

特に好ましい形態においては、暴露工程に先立って、ＦＨＡＰに対するマウス抗 体を得て、これを固体表面（例えば、ウェル（ｗｅｌｌ））に固定する。抗体を ウェルに直接吸収させるが、または羊の抗マウスＩｇＧを使用してマウス抗体を ウェルにリンクさせることにより、これを行なうことができ、抗マウスＩｇＧは ウェルに予め取着される。暴露工程においては、ＦＨＡＰの第１の部分は、マウ ス抗体に結合され（か（してウェルに取着される）。第１のＦＨＡＰ部分はＦＨ ＡＰの第２の部分に結合されたままであるので、第２のＦ　ＨＡ　Ｐ部分もまた 、溶液から「引出される」。被覆されたウェルの代わりとして、抗体をＦＨＡＰ に暴露する前または後に、沈澱化化合物を抗体に結合することができる。

測定工程は、ウェルに結合された物質のアルカリホスファターゼ酵素活性を測定 を有しているのが好ましい。見出された１つの抗体はアルカリホスファターゼに 向けられていなかったので、この測定工程により、２つの異なるＦＨＡＰパラメ ータの会合を測定することができた。これにより、癌の原因と段階とを一層詳細 に認識することができるとともに、遊離のアルカリホスファターゼの干渉が極力 押えられるので、間違った陽性が著しく少なくなる。

ＦＨＡＰに対する抗体をスクリーン処理するこれまでの試みは不成功であったこ とが理解されるべきである。本発明の−の局−面は、従って、抗体を形成するハ イブリドーマを検圧する手段を設計することにあった。スクリーニング助剤（ｓ ｃｒｅｅｎｉｎｇ　ａｉｄ）として洗浄剤を使用することが必要であることがわ かった。本発明の目的は、従って、 （ａ）上記した種類の抗体とハイブリドーマを提供し、 （ｂ）上記した種類の免疫検定法を提供し、かつ、 （ｃ）使用が安価で、信頼性があり、しかも情報を与えることができる上記した 種類の検定法を提供するものである。本発明のこれらのおよび更に別の目的と利 点は、以下の説明から明らかになるであろう。

日を　　するだめの　　のジ態 Ａ、ＦＨＡＰのサンプルを′ること ＦＨＡＰを単離する１つの方法が米国特許第４．１６６゜７６６号に記載されて いる。別の好ましい技術は、１．１００ｍＭＮａＣ１，２０ｍＭ）リス（４°に おいてｐＨ８）°、１ｍＭＭｇＣ１，，２０）ＭＺｎＣｌを含む６００容量の透 析緩衝液に対し４℃で１８時間人血清の透析を行なう。

２．７０００ｘｇ　（１５分間）遠心分離を行なう。

３、セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）　Ｓ　−４００カラム（７４ｘｌＯｃ ｍ）により６００ｍ１／時間の流速でゲルろ過を行なう。

４．３０ｘ１．６ｃｍＤＥＡＥ−セファセル（Ｓｅｐｈａｃｅｌ）カラムにかけ た空隙率留分（ｐｏｏｌｅｄ　ｖｏｉｄｖｏｌｕｍｅ　ｆｒａｃｔｉｏｎ）を集 める。２００ｍ１のサンプル緩衝液で洗浄する。０．１−０．６Ｍ直線状傾斜で 溶離する。

５、最高の特定活性の物質を集める。

Ｂ、ＦＨＡＰに・　る　　を′ること ハイブリドーマおよび抗体形成の幾つかの技術が現在周知である（一般的には、 ビー・イー（Ｐ、　Ｅｙ）等のイミュノケミストリイ［ｆｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓ ｔｒｙ）第１５巻、第４２９−４３６頁（１９７８年）参照）が、ＦＨＡＰに対 する抗体をスクリーン処理する試みはこれまでは不首尾であることが知られてい る。これらの問題点を克服するため、次の手順が使用された。

１、ＢＡＬＢ／ｃマウスを部分的に精製されたＦＨＡＰで免疫付与する。

２、標準的な技術を使用してマウスの牌およびヒニーズ（ｆｕｓｅ）の牌の細胞 をＮＳ−１骨髄腫細胞とともに除去する。

３、候補の抗体をスクリーニングすることによりＦＨＡＰに対する抗体を形成す るハイブリドーマを次のようにして検出する。

（ａ）ポリスチレンマイクロタイタブレートに羊の抗マウスＩ　ｇＧ　（ＳＡＭ Ｉ　ｇＧ）を被覆する。

（ｂ）１０％トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ　−１００（洗浄剤）１０容量％を組 織培養上澄み液に加える（新工程）。

（ｃ）ＳＡＭＩｇＧを被覆したプレートのウェルにおいて組織培養上澄み液（０ ，１ｍ１）を培養する。

（ｄ）プレートを洗浄する。

（ｅ）高レベルのＦＨＡＰを含むことが知られている集めた大血清を加える。

（ｆ）プレートを洗浄する。

（ｇ）２０　）ＭＺｎＣｌｚと１　、０　ｍＭＭ　ｇ　Ｃｌ　ｘを含む、１．０ Ｍ２−アミノ−２−メチル−１−プロパツールに溶解した０、２ｍｇ／ｍｌの４ −メチルーウンブリフェリルホスフェート、ｐＨ９，９を加える（これにより、 アルカリホスファターゼの存在下における時間の関数としての、ＦＨＡＰが有す る蛍光が増加する）。

（ｈ）０分と９０分での蛍光レベルを測定する。蛍光の差を算出する。

（ｉ）算８された差が陰性の対照媒体（ＮＳ−１細胞からの組織培養上澄み液） の場合に観察される差よりも有意に大きい場合には、試験は陽性である。

独特のスクリーン処理剤であるトリトンＸ−１００洗浄剤が使用されることに留 意されたい。マウスのハイブリドーマは、培養基において成長すると自然に膜の 小片を解放するので、洗浄剤を使用しなければならないことがわかった。ハイブ リードからの小片は、従って、免疫グロブリンとアルカリホスファターゼとを有 し、かくして、アルカリホスファターゼに基づ（スクリーニング試験を使用する と、抗体の特殊性に拘らず、間違った陽性の結果を与えることになる。トリトン Ｘ−１００は、マウスの膜小片を破壊して免疫グロブリンとアルカリホスファタ ーゼを分離しく次に、洗浄剤とアルカリホスファラーゼを工程ｅにおいて洗い落 す）。このようにして、小片を工程（ｅ）において加えられた人血清からのアル カリホスファターゼと結合させる抗体だけを検出する。

好ましいハイブリドーマは、１９８８年２月８日に、アメリカ合衆国、メリーラ ンド州、ロックビルでのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍ ｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）においてＡ ＴＣＣ−ＨＢ９６４３として寄託され、生育性が１９８８年２月１０日に確認さ れた。培養物は、適用される特許法が必要とする場合に、入手することができる 。かかる入手性は、ライセンスとして意図されない。菌株は、抗ＦＨＡＰねずみ バイプリドーマに１６０Ｃ２−Ｂ２、ＩＧと表示されている。これが生産する抗 体は、ＦＨＡＰのロイシンアミノペプチダーゼ部分を認識する。

Ｃ１免ｉ挾」Ｌ珠 ９６のウェル・フロー・ラボラトリーズ・タイターチック（Ｗｅｌｌ　Ｆｌｏｗ 　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　Ｔｉｔｅｒｔｅｋ）ポリスチレンＥＩＡプレート を、精製したＫｌ　６０Ｃ２−Ｂ２抗体で被覆した。抗体を、０．１５ＭＮａＣ １，０，１０Ｍトリス（ヒドロキメチル）アミノメタン緩衝液、ｐＨ９，０に２ ５℃で１０マイクログラム／ｍ１溶解した。次に、カラム３．４．７．８．１１ および１２の各ウェルに０．１ｍｌの抗体溶液を加え、次いで、ベルコ・ミニオ ービタル・シェーカ（Ｂｅｌｌｃ。

Ｍｉｎｉｏｒｂｉｔａｌ　５ｈａｋｅｒ）を用い、スピード７で５秒間、プレー トの渦混合を行なった。その後、プレートをカバーし、密閉したプラスチックバ ッグに入れて２５℃で１５−１８時間プレートを培養した。その後、プレートを ０．１５ＭＮａＣ１、Ｏ，ＩＯＭ）−リス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩 衝液、ｐＨ９，０で５回洗浄した。次に、プレートを逆にしてペーパタオルに叩 いて残留している緩衝液を除去し、次に、プレートを空気乾燥し、カバーしであ るプレートを４℃で保存した。ウェルは、抗体がプラスチックウェルに直接吸収 するタイプのものである。

検定を行なうため、血清を溶液Ａ　（０，１５ＭＮａＣ１，０，０５Ｍトリス（ ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液、２５℃でｐＨ７，４、Ｏ，ＯＯＩＭＭ ｇｃｌｚ　％０．０２ｍＭＺｎＣ１ｇ　、０．００４６ＭＮａＮ５．２．５ｇ／ Ｌゼラチン）で２０倍に希釈する。陽性の対照血清を、同じ緩衝液で適宜希釈し なければならない（例えば、１２０倍）。次に、同じ列の隣接する４つのウェル （例えば、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３およびＢ４）のそれぞれにサンプル０．２ｍｌを分 配し、ウェルＡ１、Ａ２、Ａ３およびＡ４に溶液Ａを０．２ｍ１分配し、かつ、 ウェルＨ９、ＨＩＯ％Ｈ１１およびＨＩ３にＯ−２ｍｌの希釈した陽性の対照を 分配する。その後、カバーを行ない、スピード７で５秒間濃混合を行ない、水で 飽和した雰囲気において２５℃で４０−４２時間培養する。サンプルの希釈は、 血清サンプル中の遊離ＦＨＡＰ抗体（この場合には、非ＦＨＡＰが結合したロイ シンアミノペプチダーゼ）からの干渉を最小にするために必要となるものである 。

次の工程は、未結合の物質を洗い落すためである。

これを行なうため、プレートを逆にし、自動プレート洗浄機を使用して溶液Ｂ　 （０，１５ＭＮａＣ１，０，０５Ｍトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩 衝液、２５℃でｐ）（’７．４、Ｏ，００１ＭＭｇＣ１２，０，０２ｍＭＺｎＣ １１，０，００４６ＭＮａＮ、）で５回洗浄する。その後、プレートを１度ベー パタオルに叩く。

次に、固体表面に結合している抗体により認識される抗原と物理的に会合してい る几ｌ（蛋白質（または非蛋白質抗原）の存在を測定する。この物質は、酵素、 蛋白質抗原または抗体により認識される蛋白質抗原と非共有的に会合している非 蛋白質抗原とすることができる。好ましい系は、溶液Ｃ（０，２ｍｇ／ｍｌナト リウム４−メチルウンベリフェリルホスフェート、１Ｍ２−アミノ２−メチル１ −プロパツール、２５℃でｐＨ１０，３、Ｏ、ＯＯＩ　Ｍ　Ｍ　ｇ　ＣＩ　２　 。

０．０２０ｍＭＺｎＣ１ｇ　）０．２ｍｌを各ウェルに分配することにより、ウ ェルに結合した化合物のアルカリホスファターゼ酵素活性を測定するものである 。

次に、溶液Ｃｏ、２ｍｌを別のプレートの幾つかのウェルに分配し、希釈した対 照血清０．０１ｍ１を各ウェルに加える（例えば、溶液Ａで６４倍または１２８ 倍に希釈したシグマ・ケミカル・カンパニー（ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌ　Ｃ ｏｍｐａｎｙ）の２Ｎ−エンザイム・コントロール（２Ｎ　Ｅｎｚｙｍｅ　Ｃｏ ｎｔｒｏｌ）　）。

暗所において２４０分間２５℃で培養した後、３４０乃至４００ｎｍの光で励起 しかつ４５０ｎｍでの発行を測定することにより、各ウェルの蛍光を測定する。

グイナテック・ラボラトリーズ・インコーホレイテッド（Ｄｙｎａｔｅｃｋ　Ｌ ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｉｎｃ、）のマイクロフルオロ・リーダ（Ｍｉｃｒ ｏｆｌｕｏｒ　Ｒｅａｄｅｒ）とフロー・ラボラトリーズ・タイターチック・フ ルオロスキャン（Ｆｌｏｗ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　Ｔｉｔｅｒｔｅｋ　Ｆ ｌｕｏｒｏｓｋａｎ）が適当な装置である。各サンプルに対して、抗体で被覆し たウェルの２つの値の平均と被覆を行なわなかったウェルの２つの値の平均との 差（例えば、［Ｂ３＋Ｂ４−Ｂｌ−Ｂ２］／２）を算出する。第２の化合物はま た、（第２の蛋白質に特有の放射性または酵素共役抗体（ｅｎｚｙｍｅ　ｃｏｎ ｊｕｇａｔｅｄ　ａｎｔｉｂｏｄｙ）のような）免疫学的技術またはその他の手 段によって測定することもできるものである。

最後に、物理的に会合した第２の化合物の量を標準の上限と比較する。上記した 例においては、標準対照の上限は、抗体に１６０Ｃ２−Ｄ２により認識される抗 原と会合した０、２ＩＵ／Ｌアルカリホスフアターゼであった。この抗原と会合 したより高濃度のアルカリホスファクーゼが、癌、肝炎および糖尿病をもつ個体 においてしばしば観察される。

１１上立皿月１ 上記実施例において達成された、従来の方法を凌ぐ改良として、必要とされるサ ンプルの減少と、イオン交換、電気泳動またはゲルろ過分離工程の省略と、改良 された特異性とが挙げられる。更に、各患者の血清サンプルの膜小片の組成の別 の分析と組合わせてこの検定法を使用すると、疾病の原因または状態に関する情 報を得ることができる。

１Δ皇土主 本発明は、単一の抗体もしくはハイブリドーマの使用またはこれらから誘導され る（例えば、直接または間接的に誘導される）使用に限定されるものではない。

かくして、本発明は、好ましい実施例に限定されるものではない。むしろ、請求 の範囲が本発明の完全な範囲を定めるものとして参照される。

「覇　ｍ　　ｔｍ　　審　躯　牛 １ｍｅｍｍａｌ　＆−１−ｍ　　ＰＣＴ／ＵＳ　９０１００７３２

Claims (15)

【特許請求の範囲】
1. １．ＦＨＡＰに対する抗体。
2. ２．抗体がロイシンアミノペプチダーゼに対する抗原でもあることを特徴とする 請求項１に記載の抗体。
3. ３．抗体はＡＴＣＣ・ＨＢ９６４３のハイブリドーマまたはＡＴＣＣ・ＨＢ９６ ４３の子孫から誘導されたものであることを特徴とする請求項１に記載の抗体。
4. ４．ＦＨＡＰに対する抗体を形成することができるハイブリドーマ。
5. ５．ＦＨＡＰに対するモノクロナル性抗体を形成することができることを特徴と する請求項４に記載のハイブリドーマ。
6. ６．ハイブリドーマが形成することができる抗体はまたロイシンアミノペプチダ ーゼに対する抗体でもあることを特徴とする請求項４に記載のハイブリドーマ。
7. ７．ハイブリドーマはＡＴＣＣ・ＨＢ９６４３のハイブリドーマまたはＡＴＣＣ ・ＨＢ９６４３の子孫から誘導されたものであることを特徴とする請求項４に記 載のハイブリドーマ。
8. ８．ＦＨＡＰの第１の部分を認識する化合物に検体をさらす段階と、 検体におけるＦＨＡＰの第２の別の部分の存在と、該第２の部分が第１の部分と 物理的に会合する程度とを測定する段階とを備えることを特徴とする検定方法。
9. ９．化合物はＦＨＡＰの第１の部分に結合する抗体であることを特徴とする請求 項８に記載の検定方法。
10. １０．暴露段階に先立って、抗体が固体表面に固定されることを特徴とする請求 項９に記載の検定方法。
11. １１．固体表面は壁面であることを特徴とする請求項１０に記載の検定方法。
12. １２．暴露段階においてＦＨＡＰの第１の部分はＦＨＡＰの第２の部分に結合さ れたまま抗体を介して固体表面に結合されることを特徴とする請求項１０に記載 の検定方法。
13. １３．測定段階はアルカリホスファターゼ酵素活性を測定することを特徴とする 請求項８に記載の検定方法。
14. １４．疾病の可能性の兆候をみるために検定結果を対照レベルと比較する段階を 更に備えることを特徴とする請求項８に記載の検定方法。
15. １５．他の抗体で被覆されたプレートを使用してＦＨＡＰ用の抗体を形成するこ とができるハイブリドーマの存在をスクリーニング処理する方法において、 スクリーニング処理の際に検体に洗浄剤を添加することを特徴とする方法。