CN116239657A - 一种基于菊花b病毒外壳蛋白特异性片段制备多克隆抗体 - Google Patents

一种基于菊花b病毒外壳蛋白特异性片段制备多克隆抗体 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物领域，具体涉及一种基于菊花B病毒外壳蛋白特异性片段制备多克隆抗体。本发明公开了抗原决定簇CVB‑CP‑A、CVB‑CP‑B及其获取方法，本发明还公开了抗原决定簇制备而得的抗原CVB‑CP‑A、抗原CVB‑CP‑B，以及利用CVB‑CP‑A制备而得的抗体Ab‑CVB‑CP‑A、利于抗原CVB‑CP‑B制备而得抗体的Ab‑CVB‑CP‑B。本发明还同时公开了上述抗体在检测菊花B病毒中的应用。

Description

一种基于菊花B病毒外壳蛋白特异性片段制备多克隆抗体
技术领域
本发明属于生物领域，具体涉及一种基于菊花B病毒外壳蛋白特异性片段制备多克隆抗体。
背景技术
菊花(Chrysanthemum morifolium Ramat.)为菊科菊属多年生草本植物，浙江省著名的“浙八味”之一。菊花在生产中主要以扦插、分株等无性繁殖方式繁殖种苗，使得植物病毒随着繁殖世代增加而积累，严重降低了菊花产量和品质。至今，菊花中已经报道的病毒和类病毒菊花大约有20多种，其中菊花B病毒(CVB)是危害最严重的病毒之一。该病毒最早发现于荷兰(Noordam,1952)，在全球各地的菊花基地普遍发生，严重阻碍了菊花产业健康持续发展(Trolinger et al.,2018；Sastry et al.,2019)。病毒侵染给菊花生产带来严重影响，健康脱毒种苗具有显著的增效提质作用，为此生产中急需建立杭白菊种苗病毒病的快速检测技术，助力优质种子种苗的规模化应用。
酶联免疫吸附测定(Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)是将具有免疫活性和可溶性的抗原或者抗体包被于固体载体上，利用抗原抗体发生特异性结合的原理来进行定量或者定性检测，ELISA已成为许多生物医学、临床和免疫实验室中流行的免疫测定方法，ELISA技术需要特异性的抗原作为免疫原才能得到特异性的抗体，但由于CVB病毒粒子纯化技术要求高，用完整CVB病毒颗粒作免疫原无法实现，为此选择特异性强的病毒外壳蛋白片段作为免疫原尤为重要。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种基于菊花B病毒外壳蛋白特异性片段制备多克隆抗体，采用该方法可以制备并获得高特异性、高灵敏性的抗体，实现杭白菊种苗CVB快速检测。
为了解决上述技术问题，本发明提供抗原决定簇，其氨基酸序列为如下任一：
CVB-CP-A：
IGRPALQPPPNMRGDPTNMYSQVSTDFLWKIKPQRISNNMATSEDMVKIQVALEGLGVPT；
CVB-CP-B：MHLQQTPPSDWSAMGFHPNVKYAAFD。
本发明还同时提供了上述抗原决定簇的获取方法，包括以下步骤：
1)、将CVB外壳蛋白的氨基酸序列(UniProt登录号A0A3G5AWF4)输入SWISS-MODEL，进行CVB外壳蛋白的三维结构预测；
2)、根据步骤1)预测所得的三维结构，选择外露结构区域序列等为候选抗原决定簇；
3)、将步骤2)所得的候选抗原决定簇进行二维结构氨基酸的亲水性的偏好性分析，从而验证三维结构中所选择的片段是否符合抗原决定簇的要求；
4)、经上述方法选定和分析，获得抗原决定簇CVB-CP-A、CVB-CP-B。
即，根据三维结构和二维结构的分析结果，结合亲水性、柔韧性、处于结构表面等抗原决定簇的要求，进行综合评估；经上述方法选定和分析，获得抗原决定簇CVB-CP-A、CVB-CP-B。
作为本发明的抗原决定簇的获取方法的改进：所述步骤2)的二维结构氨基酸的亲水性的偏好性分析包括Chou Fasman Beta Turn预测、Emini表面可达性预测、KarplusSchulz柔韧性预测、Kolaskar Tongaonkar抗原性预测、Parker亲水性预测分析。
本发明还同时提供了利于上述抗原决定簇制备而得的抗原CVB-CP-A、抗原CVB-CP-B。
本发明还同时提供了抗原的制备方法：
抗原CVB-CP-A的制备方法为：将CVB-CP-A相对应的DNA序列根据大肠杆菌密码子的偏爱性进行优化，连接表达载体pET-41a(+)，转化至E.coli BL21(DE3)菌株，经IPTG诱导和Ni-NTA重力柱层析获得了纯化的大小约为38kDa的融合蛋白，得到抗原CVB-CP-A；
在CVB-CP-B末端添加一个半胱氨酸(C)，与KLH偶联，得到抗原CVB-CP-B。
本发明还同时提供了利于上述抗原制备而得的抗体：利用CVB-CP-A制备而得抗体Ab-CVB-CP-A、利于抗原CVB-CP-B制备而得抗体Ab-CVB-CP-B。
本发明还同时提供了抗体的制备方法：
以抗原CVB-CP-A/CVB-CP-B作为免疫原，免疫新西兰白兔制备抗血清，共进行4次免疫，最后一次免疫完成7天后采集全血，分离得到抗血清；抗血清用Protein A亲和纯化后，对应得到浓缩后的抗体Ab-CVB-CP-A/Ab-CVB-CP-B。
本发明还同时提供了抗体在检测菊花B病毒中的应用。
作为本发明应用的改进：以菊花(疑似CVB感染的菊花病叶)作为待测品，采用Dot-ELISA方法、RT-PCR进行菊花携带CVB的检测。
本发明具有如下技术优势：
1、本发明所选择的肽段具有特异性，因此决定了免疫原的特异性。
2、本发明根据蛋白序列，对DNA的密码子进行优化，排除稀有密码子，从而提高蛋白表达水平。
3、本发明采用人工抗原免疫家兔，不采用病毒纯化粒子免疫家免的办法制备抗血清，因此本发明具有人工抗原制备效率高、制备简单的优势。
而现有的病毒纯化粒子免疫家兔，首先要获得毒株，再进行人工模式植物寄主接种，随后进行病毒的分离纯化，纯化后的病毒粒子才能对家兔进行免疫，因此导致步骤繁多、周期长，而且实验要求技术高的不足之处。
3、本发明所用的多抗血清由于采用了单一抗原决定簇作免疫原，所得到的抗体具有单克隆抗性的特异性，且制作时间缩短，同时制作费用也大大降低。
综上，采用本发明选定的抗原簇进行多克隆抗体制备，具有灵敏度高、成本低，有利于推广应用。利用上述特定的抗血清可进一步建立免疫学检测技术(如免疫胶体金试纸条等)。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
图1为CVB CP的三维结构以及选择抗原决定簇(圆圈)；
注：A：CVB-CP-A抗原决定簇，B：CVB-CP-B抗原决定簇。
图2以Ab-CVB-CP-A(A)、Ab-CVB-CP-B(B)建立的Dot-ELISA方法以及RT-PCR(C)对田间菊花样品感染CVB检测结果；
注：1-19是在田间采集的19个菊花疑似感染病毒样本，CK是健康无病毒的菊花，作为阴性对照，M：DNA Marker。
图3为Dot-ELISA方法的灵敏度分析；
注：CK是健康无毒的菊花，作为阴性对照，稀释倍数为1:20。
图4为CVB-CP-A优化前后的序列比对图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：
1)菊花B病毒外壳蛋白特异片段的选择与合成
将CVB外壳蛋白的氨基酸序列(UniProt登录号A0A3G5AWF4)输入SWISS-MODEL，进行CVB外壳蛋白的三维结构预测；根据预测的三维结构，选择外露结构区域序列为候选抗原决定簇；将抗原决定簇进行二维结构氨基酸的亲水性的偏好性分析，即Chou Fasman BetaTurn预测、Emini表面可达性预测、Karplus Schulz柔韧性预测、Kolaskar Tongaonkar抗原性预测、Parker亲水性预测等分析，根据三维结构和二维结构的分析结果，结合亲水性、柔韧性、处于结构表面等抗原决定簇的要求，进行综合评估；经上述方法选定和分析，序列为IGRPALQPPPNMRGDPTNMYSQVSTDFLWKIKPQRISNNMATSEDMVKIQVALEGLGVPT的片段作为抗原决定簇，编号：CVB-CP-A(见图1)；对每个氨基酸的表面可接触性(SurfaceAccessibility)、亲水性(Hydrophilicity)和弹性(flexibility)进行计算可以大体推算出抗原决定簇区域，抗原决定簇区域应综合以上三个特点。可利用专业测定软件(如MacVestor、Protean、GCG等)进行测定。
2)菊花B病毒抗体的制备
可参照常规的已公开发表的《细胞免疫学实验研究方法》(孙黎飞主编P124，2009)进行如下：
将CVB-CP-A相对应的DNA序列根据大肠杆菌密码子的偏爱性进行优化，连接表达载体pET-41a(+)，转化至E.coli BL21(DE3)菌株，经IPTG诱导和Ni-NTA重力柱层析获得了纯化的大小约为38kDa的融合蛋白，得到抗原CVB-CP-A。
以抗原CVB-CP-A作为免疫原，免疫新西兰白兔制备抗血清，共进行4次免疫，最后一次免疫完成7天后采集全血，分离得到抗血清。抗血清用Protein A亲和纯化后，得到浓缩后的抗体Ab-CVB-CP-A。
上述DNA序列(即，原始序列)为：
ATAGGTAGGCCTGCACTCCAGCCCCCACCCAATATGCGAGGGGATCCAACTAATATGTACAGTCAGGTGTCTACCGATTTCCTGTGGAAGATTAAACCACAGAGGATTTCCAACAACATGGCGACATCTGAGGATATGGTGAAAATACAAGTGGCCCTTGAAGGCCTGGGGGTACCTACC
优化后所得为：
ATTGGTCGTCCGGCACTGCAGCCTCCGCCTAATATGCGTGGTGATCCGACCAATATGTATAGCCAGGTTAGCACCGATTTTCTGTGGAAAATCAAACCGCAGCGCATTAGCAATAATATGGCAACCAGCGAAGATATGGTGAAAATTCAGGTTGCACTGGAAGGTCTGGGTGTTCCGACC
序列比对如图4所示。
3)、Ab-CVB-CP-A对CVB检测准确性分析
从浙江桐乡杭白菊基地采集的19份菊花样本(疑似CVB感染的菊花病叶)以Ab-CVB-CP-A建立的Dot-ELISA方法和RT-PCR进行菊花携带CVB检测，结果发现Dot-ELISA和RT-PCR检测样品中CVB的检测率均为100％，检测一致性达到100％(见图2B)。
以Ab-CVB-CP-A建立的Dot-ELISA方法进行菊花携带CVB检测方法为：
1)取上述19份菊花样本作为样品，液氮中快速研磨，将组织叶片用新鲜配置的0.01MPBS从1:20(w/v，g/mL)至1:1280倍倍比稀释，8000r·min-1离心5min，上清即为植物组织粗提液；
2)在NC膜上划分好区间，取2-3μL粗提液性点到NC膜上，37℃恒温箱烘干10min；
3)烘干完成后，配制封闭液，将NC膜浸入其中，室温下封闭1h，封闭完成后，弃去封闭液，倒入PBST缓冲液，充分洗膜3次，每次3min；
4)将Ab-CVB-CP-A按照1:1 000的比例在封闭液中进行稀释，随后将NC膜放入配制好的一抗中，室温孵育1h；
5)一抗孵育完成后，弃去一抗，倒入PBST缓冲液，充分洗膜3次，每次3min；
6)将AP酶标记羊抗兔IgG二抗按照1:5000的比例在封闭液中进行稀释，随后将NC膜放入配制好的二抗中，室温孵育1h，用PBST洗膜6次，每次3min；
7)显色：用吸水纸把膜吸干，加入NBT和BCIP底物进行显色，肉眼观察结果，当阳性对照显现紫色斑点，而阴性对照无变色时，拍照并记录结果。
所得结果为如图2A所述：19份菊花样本中中CVB的感染率均为100％。而对照无斑点显色，为阴性。
RT-PCR进行菊花携带CVB检测方法为(常规技术)：
1)实验前先用酒精将通风橱消毒，离心机4℃预冷。将灭菌后的研钵研棒在液氮中充分冷却，在液氮即将完全挥发时，迅速放入19份疑似CVB感染的菊花病叶作为样品，约100mg，快速研磨5次，加入1mL RNA isolate，然后使用涡旋仪将其充分混匀；
2)将混合均匀的样品在冰上静置5min，随后放入预冷为4℃的离心机，参数为12000r·min-1，10min；
3)离心后的样品分为上下两层，吸取上层清液到新的EP管中，再加入1/5同上清等体积的氯仿，使用涡旋仪将其充分混匀，待溶液充分混匀后放置在冰上，静置5min，随后放入离心机，参数为12 000r·min-1，15min；
4)离心完成后，离心管中的溶液分为3层，只需要将上层小心转移至新的EP管，否则会导致提取的RNA质量变差，再悬空加入1/5同上清等体积的氯仿，涡旋震荡，混匀后放置在冰上，静置5min，随后在4℃的条件下离心，参数为12 000r·min-1，15min；离心完成后，将离心管中的上层清液转移到新的EP管，加入相同体积预冷过的异丙醇，缓缓上下颠倒将其混匀，在室温下静置10min，随后放入离心机中，参数为12 000r·min-1，10min；
5)离心完成后，观察管底是否有白色沉淀，白色沉淀即为RNA，将上清倒出，然后沿着管壁缓慢加入1mL新鲜配制的用DEPC水配置好的75％的乙醇，轻轻颠倒离心管，去除残留的溶液，放入离心机，参数为12 000r·min-1，5min，离心完成后，重复此操作，用乙醇清洗两次RNA；
6)将乙醇缓慢弃去，把EP管转移至杀菌后的超净工作台中干燥数分钟至酒精挥发完全，然后加入适量体积的DEPC水对其进行溶解；
7)RNA溶解完成后，立即放入冰中，用NanoDrop对提取的RNA进行浓度测定，最后将RNA冷冻至-80℃，进行之后的反转录。在RNase free离心管中加入5×gDNA digester Mix3μL，模板RNA，RNase free dd H2O至总体积为15μL，在42℃加热台孵育2min，完成后在第1步的反应管中再加入
Figure BDA0004106678740000061
ⅢSuperMix plus，慢慢混匀，逆转录程序设置为25℃5min，55℃15min，85℃5min。制备好的cDNA可用于接下来的实验。9)RT-PCR扩增，根据报道的引物，CVB-U：5'-ACCGAATTCTTAGTCACAATGCCTCCC-3'和CVB-L：5'-TCCGAGCTCATAGAGACGGCATACCTT-3'，参照诺唯赞公司的Green Taq Mix说明书进行PCR扩增，退火温度为52℃。电泳观察。
所得结果为如图2C所述：19份疑似CVB感染样本中，CVB的感染率均为100％；而对照无条带，为阴性；
因此，证明：以Ab-CVB-CP-A建立的Dot-ELISA方法和RT-PCR检测样品中CVB的检测率均为100％，检测一致性达到100％。
4)Dot-ELISA检测抗体对菊花B病毒的敏感性
取感染CVB的菊花病叶在研钵中研磨匀浆，用0.01M PBS(磷酸盐缓冲液)从1:20至1:2560倍比稀释(w/v，g/mL)，分析Dot-ELISA方法检测CVB的灵敏度，所得结果如图3所示：1:20～1:1280倍比稀释度下显示为紫色斑点，而1:2560倍比稀释度下显示为无斑点；因此证明Ab-CVB-CP-A的灵敏度为1:1280。
说明：上文所述的感染CVB的菊花，显示为叶片变厚、明脉、斑驳、叶缘向上翻卷、植株矮化、长势弱、花型小等症状，且按照本行业公认的检测正确性高的RT-PCR法进行检测确认确实已经感染CVB。
实施例2：
1)菊花B病毒外壳蛋白特异片段的选择与合成
CVB外壳蛋白的氨基酸序列(UniProt登录号A0A3G5AWF4)输入SWISS-MODEL，进行CVB外壳蛋白的三维结构预测；根据预测的三维结构，选择不同空间位置、不同长度的序列为候选抗原决定簇；将抗原决定簇进行二维结构氨基酸的亲水性的偏好性分析，即ChouFasman Beta Turn预测、Emini表面可达性预测、Karplus Schulz柔韧性预测、KolaskarTongaonkar抗原性预测、Parker亲水性预测等分析，根据三维结构和二维结构的分析结果，结合亲水性、柔韧性、处于结构表面等抗原决定簇的要求，进行综合评估；经上述方法选定不同的空间位置，选定序列为MHLQQTPPSDWSAMGFHPNVKYAAFD的片段作为抗原决定簇，编号：CVB-CP-B(见图1)；
2)菊花B病毒抗体的制备
可参照常规的已公开发表的《细胞免疫学实验研究方法》(孙黎飞主编P124，2009)进行如下：
在CVB-CP-B末端添加一个半胱氨酸(C)，与KLH偶联，得到抗原CVB-CP-B，以抗原CVB-CP-B作为免疫原，免疫新西兰白兔制备抗血清，共进行4次免疫，最后一次免疫完成7天后采集全血，分离得到抗血清。抗血清用Protein A亲和纯化后，得到浓缩后的抗体Ab-CVB-CP-B。
3)Ab-CVB-CP-B对CVB检测准确性分析
从浙江桐乡杭白菊基地采集的19份菊花样本(同实施例1)以Ab-CVB-CP-B建立的Dot-ELISA方法进行菊花携带CVB检测，检测方法中使用Ab-CVB-CP-B，其余等同于实施例1。
以Ab-CVB-CP-B建立的Dot-ELISA方法进行菊花携带CVB检测方法所得结果如图2B所述：19份菊花样本中CVB的感染率均为100％。而对照无斑点显色，为阴性。
因此证明：以Ab-CVB-CP-B建立的Dot-ELISA方法Dot-ELISA检测样品，CVB的检测率为100％，检测一致性达到100％(见图2B)。
4)Dot-ELISA检测抗体对菊花B病毒的敏感性
取感染CVB的菊花病叶在研钵中研磨匀浆，用0.01M PBS从1:20至1:2560倍比稀释(w/v，g/mL)，分析Dot-ELISA方法检测CVB的灵敏度，所得结果如图3所示：1:20～1:640倍比稀释度下显示为紫色斑点，而1:1280～1:2560倍比稀释度下显示为无斑点；因此证明Ab-CVB-CP-B的灵敏度分别为1:640。
对比例1、
取消实施例1步骤2)的优化，即将CVB-CP-A相对应的DNA序列(优化前的原始序列)连接表达载体pET-41a(+)，其余按照实施例1所述方法进行操作，所得结果为：无法得到有效的融合蛋白，无法进行抗体制备，从而无法建立基于Ab-CVB-CP-C的Dot-ELISA方法进行菊花CVB病毒检测。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (9)

1.抗原决定簇，其特征在于其氨基酸序列为如下任一：
CVB-CP-A：
IGRPALQPPPNMRGDPTNMYSQVSTDFLWKIKPQRISNNMATSEDMVKIQVALEGLGVPT；
CVB-CP-B：MHLQQTPPSDWSAMGFHPNVKYAAFD。
2.如权利要求1所述的抗原决定簇的获取方法，其特征在于包括以下步骤：
1)、将CVB外壳蛋白的氨基酸序列输入SWISS-MODEL，进行CVB外壳蛋白的三维结构预测；
2)、根据步骤1)预测所得的三维结构，选择外露结构区域序列等为候选抗原决定簇；
3)、将步骤2)所得的候选抗原决定簇进行二维结构氨基酸的亲水性的偏好性分析，从而验证三维结构中所选择的片段是否符合抗原决定簇的要求；
4)、获得抗原决定簇CVB-CP-A、CVB-CP-B。
3.根据权利要求2所述的抗原决定簇的获取方法，其特征在于：所述步骤2)的二维结构氨基酸的亲水性的偏好性分析包括Chou Fasman Beta Turn预测、Emini表面可达性预测、Karplus Schulz柔韧性预测、Kolaskar Tongaonkar抗原性预测、Parker亲水性预测分析。
4.利于如权利要求1所述的抗原决定簇制备而得的抗原CVB-CP-A、抗原CVB-CP-B。
5.抗原的制备方法，其特征在于：
抗原CVB-CP-A的制备方法为：将CVB-CP-A相对应的DNA序列根据大肠杆菌密码子的偏爱性进行优化，连接表达载体pET-41a(+)，转化至E.coli BL21(DE3)菌株，经IPTG诱导和Ni-NTA重力柱层析获得了纯化的大小约为38kDa的融合蛋白，得到抗原CVB-CP-A；
在CVB-CP-B末端添加一个半胱氨酸(C)，与KLH偶联，得到抗原CVB-CP-B。
6.利于如权利要求4所述的抗原制备而得的抗体，其特征在于：利用CVB-CP-A制备而得抗体Ab-CVB-CP-A、利于抗原CVB-CP-B制备而得抗体Ab-CVB-CP-B。
7.抗体的制备方法，其特征在于：以抗原CVB-CP-A/CVB-CP-B作为免疫原，免疫新西兰白兔制备抗血清，共进行4次免疫，最后一次免疫完成7天后采集全血，分离得到抗血清；抗血清用Protein A亲和纯化后，对应得到浓缩后的抗体Ab-CVB-CP-A/Ab-CVB-CP-B。
8.如权利要求6所述的抗体在检测菊花B病毒中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：以菊花作为待测品，采用Dot-ELISA方法进行菊花携带CVB的检测。
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