CN113003562A - 一种碳纳米粒及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种碳纳米粒及其制备方法和应用。碳纳米粒的制备方法包括如下步骤：S1.预加热：将葡萄糖和N‑乙酰‑D‑葡萄糖胺的混合含碳有机物完全溶于pH为6.0～9.0的溶液中，在密闭反应体系内预加热至100～120℃；S2.水热合成：将上述反应体系升温至160～190℃，反应5～30min，完成碳纳米粒成核反应，降温至120～160℃，继续反应30～180min，完成碳纳米粒生长反应，继续降温至室温，反应6～24h，完成熟化反应；S3.分离纯化：将上述熟化反应产物分离纯化制备得到碳纳米粒。本发明的水溶性碳纳米粒以葡萄糖和葡萄糖胺作为碳源，通过调节葡糖胺含量，可以在适当的pH值下方便地获得不同尺寸的碳纳米粒，相比于传统的胶体金标记检测技术，以碳纳米粒标记的免疫层析试纸卡可将最检测浓度降低2～3倍。

Description

一种碳纳米粒及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及碳纳米材料技术领域，更具体地，涉及一种碳纳米粒及其制备方法和应用。

背景技术

新型冠状病毒(2019-nCoV)的正式分类名为严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2)，是以前从未在人体中发现的冠状病毒新毒株。以RT-PCR为代表的新型冠状病毒核酸检测(分子诊断)技术灵敏高度、特异性好，但核酸检测操作复杂，检测过程中还可能形成气溶胶，因此对检测环境及人员要求高，极大地影响了诊断效率。相比于核酸检测方法，免检检测法成本更低、速度更快。以胶体金试纸卡为代表的免疫层析检测技术简便快捷、可肉眼判读，已在新冠抗体快速筛查中得到了部分应用，但胶体金标记检测技术灵敏度低，只适用于浓度较高的血清抗体筛查，而对抗原检测这类样品较少的检测需求，胶体金检测灵敏度过低的问题制约了其应用。在金标免疫层析基础上，又发展出磁微粒、量子点、时间分辨荧光等众多新型纳米标记快检技术，但这些新型高灵敏纳米标记检测技术大多需要特殊的分析设备，综合检测成本高，推广普及难度较大。碳纳米粒在可见光范围内具有强烈的宽光谱吸收，黑色的碳纳米粒在硝酸纤维素膜等白色背景材料上显色清晰，对比度极高，可以提供较强的信号值，所得的图像也更适合于灰度分析，有利于实现更高灵敏度的检测。此外，碳纳米粒化学性质稳定，且制造成本极其低廉，也可以大批量生产。碳纳米粒这些特性使得人们越来越多地关注到它在免疫层析当中的应用。

水热法是一种常用的自下而上合成无机纳米材料的方法，在高温高压密闭的反应釜中，以含碳有机物作为碳源，以水作为反应介质，可以获得水溶性的碳纳米粒。虽然传统的水热法可通过控制压力、温度和投料比等制备条件调节碳纳米粒的尺寸，但尺寸调控范围有限，加上大规模制备时难以做到均匀快速升温，大批量生产时普遍存在产物均一性不好、工艺重现性差等问题，制约了碳纳米粒在高灵敏免疫层析中的应用范围。

CN103771391A公开了一种具有荧光性质的水溶碳纳米粒子的制备方法，包括下述步骤：步骤一：以柠檬酸为前躯体，加入到去离子水中，配制成水溶液；步骤二：将成核剂加入到步骤一配制的水溶液中，得到混合液，所述成核剂为硝酸盐；步骤三：将步骤二得到的混合液放入水热釜中进行加热反应，将反应后得到的溶液进行离心分离。上述水溶碳纳米粒子技术需要加入额外的硝酸盐成核剂，通过改变成核剂的浓度来实现碳纳米粒子的粒径调控，并不能通过反应自身的调控实现碳纳米离子粒径的控制，且粒径控制的效果也有待于进一步改善。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有的碳纳米粒制备尺寸调控范围有限，且产物均一性不好的缺陷和不足，提供一种碳纳米粒的制备方法，通过控制特定反应pH体系下的N-乙酰-D-葡萄糖胺和葡萄糖的质量比即可调控碳纳米粒尺寸，从而获得粒径均一、单分散性好且粒径可控的水溶性碳纳米粒。

本发明的另一目的在于提供一种上述碳纳米粒的制备方法制备得到的碳纳米粒。

本发明的再一目的在于提供一种碳纳米粒在制备体外诊断制品中的应用。

本发明的又一目的在于提供一种适用于新型冠状病毒抗原检测的检测卡。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

一种碳纳米粒的制备方法，包括如下步骤：

S1.预加热：将葡萄糖和N-乙酰-D-葡萄糖胺完全溶于pH为6.0～9.0的缓冲溶液中，在密闭反应体系内预加热至100～120℃；

S2.水热合成：将上述反应体系升温至160～190℃，反应5～30min，完成碳纳米粒成核反应，降温至120～160℃，继续反应30～180min，完成碳纳米粒生长反应，继续降温至室温，反应6～24h，完成熟化反应；

S3.分离纯化：将上述熟化反应产物分离纯化制备得到所述碳纳米粒；

其中，S1中N-乙酰-D-葡萄糖胺占葡萄糖和N-乙酰-D-葡萄糖胺总质量的0～20％。

其中，需要说明的是：

本发明的加热方式优选为微波加热。

本发明的室温为25℃左右的温度。

本发明的水热反应条件有利于碳纳米粒子的成核和生长，促进碳纳米粒子生成，反应温度过低无法成核形成碳纳米粒子，反应温度过高不利于碳纳米粒子粒径的控制，也不能达到粒径均一，且分散的效果。其中，S1中先缓慢预加热至100～120℃，为后续快速升温成核反应做准备，提供一个初始温度，可以确保整个反应体系的温度快速达到成核所需的温度(160℃～190℃)，便于形成均一的碳核。

本发明S3的分离纯化是为了除去未反应的原料和产生的杂质成分，获得均一分散的碳纳米粒子。

同时，为了获得更好的分离纯化效果，具体可以采用如下分离纯化方法：

反应结束后，打开反应容器，将反应产物从反应釜中转移至离心管中，先低速离心去除沉淀物，再高速离心去除上清液。必要时可反复用水复溶离心，产物可干燥后存贮备用。

其中，低速离心条件为800g 10min，高速离心条件为9000g 30min。

本发明S1步骤中pH值的控制一方面可以促进N-乙酰-D-葡萄糖胺的水解，保证水热反应中相关葡萄糖氨基的含量，另一方面，本发明的pH值控制还能实现水热反应中相关碳纳米粒粒径的控制，确保生成的碳纳米粒粒径的均一性性和可控性。

粒径可调控的碳纳米粒制备技术是实现碳纳米粒标记侧向流免疫层析检测的关键。小尺寸的碳纳米粒层析速度快，不易堵塞，有利于缩短检测时间；而大尺寸的碳纳米粒颜色更深(信号强)、层析速度更慢(免疫结合反应充分)，有利于实现更低浓度样品的高灵敏检测。本发明的碳纳米粒的制备方法通过碳纳米粒尺寸调控可以兼顾检测速度和检测灵敏度，有利于实现更低浓度样品的高灵敏检测。

在本发明的碳纳米粒的制备方法中，葡糖胺含量越高，生成的碳纳米粒的尺寸越大，通过调整葡糖胺的占比可以非常方便地调节终产物的尺寸大小。

较高的pH值易获得尺寸较大的碳纳米粒，而在较低的pH值条件下，碳纳米粒产物的尺寸均一性较好。本发明在综合考虑碳纳米粒的粒径需求和尺寸均一性的平衡条件下，选择合适的葡糖胺含量占比，通过不同的葡糖胺含量占比控制可以得到不同粒径的碳纳米粒。

优选地，S1中溶液为pH9.0的磷酸盐缓冲液，缓冲溶液有助于通过稳定的pH环境，pH9.0的磷酸盐缓冲液的常用浓度为0.05M。

优选地，S1中预加热反应的升温速率为1～3℃/min。升温速率需要考虑实际生产需求，还需要考虑体系升温的均匀性，不同碳纳米粒的个体升温速率的均匀性。

优选地，S2中成核反应的升温速率≥30℃/min，反应温度为180℃，反应时间5～10min，生长反应温度为140℃，反应时间40min，熟化反应温度为室温，反应时间12h。

升温速率过慢，整个反应过程过于缓慢，升温速率不能低于30℃/min，可以高于此速率，不影响粒径均一性，其升温上限受仪器性能和传质速率影响，按一般本领域要求控制。

同时，本发明还具体保护一种所述碳纳米粒的制备方法制备得到的碳纳米粒。

优选地，所述碳纳米粒的粒径为100～1000nm，zeta电位为-20～-50mV。

zeta电位可以表征碳纳米粒的羧基含量，zeta电位绝对值越大则现有的碳纳米粒的羧基含量越高，进一步羧基含量会影响碳纳米粒在实际应用中的亲水偶联效果。

且zeta电位绝对值过低，碳纳米粒材料容易聚集沉降，不能得到分散的水溶性体系，一定范围的zeta电位值可以保证单个碳纳米粒之间有足够的相互排斥力，可以形成均一稳定的水溶性体系，分散性好。

在实际应用中，上述碳纳米粒在制备体外诊断制品中的应用也在本发明的保护范围之内。

本发明还具体保护一种新型冠状病毒抗原检测卡，包括支撑底板，依次粘贴在支撑底板上的样品垫、结合垫、带有检测线和质控线的硝酸纤维素膜和吸收垫，其中所述结合垫上包载有权利要求5所述碳纳米粒标记的新型冠状病毒抗体Ab1，所述硝酸纤维素膜上的检测线位置包被有另一个新型冠状病毒抗体Ab2，硝酸纤维素膜上的质控线位置包被有可与Ab1特异性结合的二抗。

所述Ab1与Ab2是一对抗体，可以共同非竞争地与新冠抗原特异性结合，形成双抗夹心免疫复合物。

优选地，所述碳纳米粒的粒径为200～400nm。更小尺寸的碳纳米粒层析速度快，有利于缩短检测时间；但小尺寸碳纳米粒颜色偏浅(深棕色)，检测信号稍弱。更大尺寸的碳纳米粒颜色深(黑色)信号强，有利于提高检测方法的敏感度；但层析速度较慢。

更优选地，所述碳纳米粒的粒径为300nm。

优选地，所述新型冠状病毒抗原为新型冠状病毒N蛋白或新型冠状病毒S蛋白。

优选地，所述抗体Ab1和Ab2为小鼠源单克隆抗体。

优选地，所述二抗为羊抗小鼠二抗。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明提供了一种尺寸易于调控的水溶性碳纳米粒的制备方法，以葡萄糖和葡萄糖胺作为碳源，通过调节葡糖胺含量，可以在适当的pH值下方便地获得不同尺寸的碳纳米粒，并间接调节纳米粒表面基团种类和Zeta电位，制备方法方便快捷，生产成本低廉，可以制备得到粒径为100～1000nm，zeta电位为-20～-50mV的碳纳米粒。

本发明的尺寸可调控的碳纳米粒标记用于侧向流免疫层析技术中可以兼顾检测速度和敏感性，可以根据实际需求可选择不同尺寸的碳纳米粒标记抗体：小尺寸的碳纳米粒层析速度快，有利于缩短检测时间，大尺寸的碳纳米粒颜色更深(信号强)、层析速度更慢(免疫结合反应充分)，有利于实现更低浓度样品的高灵敏检测。

本发明的碳纳米粒标记侧向流免疫层析技术实现了新型冠状病毒抗原的高灵敏检测，相比于传统的胶体金标记检测技术，以300nm碳纳米粒标记的免疫层析试纸卡可将最检测浓度降低2～3倍。

附图说明

图1为以葡萄糖和葡糖胺混合物作为碳源制备水溶性碳纳米粒的原理示意图。

图2为制备得到的不同尺寸(100nm、200nm、300nm、600nm、800nm、1000nm)碳纳米粒的TEM电镜照片。

图3为胶体金检测卡(a)与碳纳米粒标记检测卡(b)的成像对比。

图4为双抗夹心法的检测曲线对比。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明作进一步的说明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非另有说明，本发明实施例采用的原料试剂为常规购买的原料试剂。

实施例1～4

一种碳纳米粒的制备方法，包括如下步骤：

S1.称取100g葡萄糖，溶于1000mL pH9.0的缓冲溶液中，待完全溶解后，再加入如表1所示N-乙酰-D-葡萄糖胺(CAS号：7512-17-6，简称“葡糖胺”)充分搅拌混合均匀，将溶液转入密闭耐压微波反应釜中，密封好后，于微波加热器中反应，开启微波加热器进行预加热，以3℃/min速率将反应液缓慢加热至120℃，并稳定2min；

S2.开启微波加热器的最大加热功率，快速升温至180℃后，升温速率30℃/min，在该温度反应8min，停止微波加热并鼓风降温，将反应温度快速降低至140℃后，微波恒温模式下继续反应40min，最后，关闭微波加热，将反应温度自然降至室温，继续反应12小时；

S3.反应结束后，打开反应容器，将反应产物从反应釜中转移至离心管中，800g低速离心10分钟，去除沉淀物；将上清液9000g高速离心30min，弃上清液，将沉淀物用水复溶，超声分散后重复离心1～2次，待最后一次离心去上清后，将沉淀加入10mL纯水溶解分散，于-20℃冰箱冷冻结冰后放入真空冷冻干燥机中进行冻干后，即得到碳纳米粒。

其中S1中葡萄糖胺占葡萄糖和葡萄糖胺总质量具体见下表1。

用超纯水将碳纳米粒(粉末)配制成质量分数0.005％的溶液，测粒径、电位等指标。

产物粒径主要受葡糖胺的加入量影响，反应液的pH值及反应温度、时间对碳纳米粒的粒径和均一性也有一定影响。

表1

上表中PDI可以很好地表征材料的粒径均匀性，PDI值越小均一性越好，从上表数据可以看出，本发明所制备的不同粒径的碳纳米粒均具有很好的粒径均一性。

其中，以葡萄糖和葡糖胺混合物作为碳源制备水溶性碳纳米粒的原理如图1所示。加入葡糖胺可在糖环链上引入氨基，氨基在环上位置是随机的，本发明之所以不直接用氨基葡萄糖参与反应而选择葡糖胺，是因为氨基葡萄糖上直接暴露的氨基可能在反应初期就直接与羧基发生缩合反应而被消耗掉，无法贡献与后续反应，不能实现相关量的控制，进而影响碳纳米粒粒径的调控和均一性。

本发明制备的不同尺寸的碳纳米粒的TEM电镜照片如图2所示。

实施例5

一种碳纳米粒的制备方法，包括如下步骤：

S1.称取100g葡萄糖，溶于1000mL pH6.0的缓冲溶液中，待完全溶解后，再加入如表1所示N-乙酰-D-葡萄糖胺(CAS号：7512-17-6，简称“葡糖胺”)充分搅拌混合均匀，将溶液转入密闭耐压的微波反应釜中，密封好后，于微波加热器中反应，开启微波加热器进行预加热，以3℃/min速率将反应液缓慢加热至120℃，并稳定2min；

S2.开启微波加热器的最大加热功率，快速升温至180℃后，升温速率30℃/min，在该温度反应8min，停止微波加热并鼓风降温，将反应温度快速降低至140℃后，微波恒温模式下继续反应40min，最后，关闭微波加热，将反应温度自然降至室温，继续反应12小时；

S3.反应结束后，打开反应容器，将反应产物从反应釜中转移至离心管中，800g低速离心10分钟，去除沉淀物；将上清液9000g高速离心30min，弃上清液。将沉淀物用水复溶，超声分散后重复离心1～2次，待最后一次离心去上清后，将沉淀加入10mL纯水溶解分散，于-20℃冰箱冷冻结冰后放入真空冷冻干燥机中进行冻干后，即得到碳纳米粒粉末。

其中，S1中葡萄糖胺占葡萄糖和葡萄糖胺总质量的20％。

制备得到的碳纳米粒子的TEM估算直径为1000nm，PDI为0.117；Zeta电位为-25mV。

实施例6

一种碳纳米粒的制备方法，包括如下步骤：

S1.称取100g葡萄糖，溶于1000mL pH7.0的缓冲溶液中，待完全溶解后，再加入如表1所示N-乙酰-D-葡萄糖胺(CAS号：7512-17-6，简称“葡糖胺”)充分搅拌混合均匀，将溶液转入密闭耐压的微波反应釜中，密封好后，于微波加热器中反应，开启微波加热器进行预加热，以2℃/min速率将反应液缓慢加热至100℃，并稳定2min；

S2.开启微波加热器的最大加热功率，快速升温至160℃后，升温速率30℃/min，在该温度反应30min，停止微波加热并鼓风降温，将反应温度快速降低至120℃后，微波恒温模式下继续反应120min，最后，关闭微波加热，将反应温度自然降至室温，继续反应12小时；

S3.反应结束后，打开反应容器，将反应产物从反应釜中转移至离心管中，800g低速离心10分钟，去除沉淀物；将上清液9000g高速离心30min，弃上清液。将沉淀物用水复溶，超声分散后重复离心1～2次，待最后一次离心去上清后，将沉淀加入10mL纯水溶解分散，于-20℃冰箱冷冻结冰后放入真空冷冻干燥机中进行冻干后，即得到碳纳米粒粉末。

其中，S1中葡萄糖胺占葡萄糖和葡萄糖胺总质量的12％。

制备得到的碳纳米粒子的TEM估算直径为800nm，PDI为0.100；Zeta电位为-31mV。

实施例7

新冠病毒抗原检测试纸卡的制作

1.碳纳米粒标记抗体的制备

实施例1-6所制得的碳纳米粒表面含有大量羟基、羧基等亲水基团，可用常规的EDC/NHS偶联剂活化后，与待标记蛋白(抗原或抗体)上的氨基反应，形成稳定的标记物。此外，也可在水溶液中通过静电、疏水等作用直接与标记蛋白相结合完成标记过程。

碳纳米粒与新冠抗体Ab1(小鼠源)的标记过程如下：

通过实验测得待标记新冠抗体Ab1的蛋白等电点pI；用pH＝pI+0.5的缓冲溶液溶解待标记蛋白，配制成1～10mg/mL的溶液。将事先制备好的碳纳米粒用相同的缓冲溶液溶解，将抗体和碳纳米粒按3：1的摩尔比混合。

将混合液在4℃下轻柔混匀反应12小时后，6000g离心20min，弃上清液。将沉淀物用抗体保存液复溶，即得碳纳米粒标记的新冠抗体C-Ab1。

2.新冠病毒抗原检测卡的制备

结合垫：将碳纳米粒标记的新冠抗体C-Ab1喷涂于处理好的结合垫上，喷量为2μL/cm，37℃烘箱干燥18h，加干燥剂密封保存备用。

划线：先将硝酸纤维素膜贴于PVC支撑底板上，将羊抗鼠二抗划于硝酸纤维素膜上的质控线(C线)位置，将另一新冠捕获抗体Ab2划于检测线(T线)位置，羊抗鼠二抗和新冠抗体Ab2的划线浓度为2mg/mL，37℃烘箱干燥18h，加干燥剂铝箔袋密封保存备用。

组装：将样品垫、结合垫、吸水垫等材料依次粘贴在已贴好划好T线、C线的硝酸纤维素膜上，切条、装壳后，与干燥剂一起密封包装，即获得本发明的新型冠状病毒抗原检测卡，室温保存备用。

实施例8

新冠病毒抗原检测

收集待测样品并保存在样品保存液中。待测样品可以是鼻拭子提取液、咽拭子提取液、环境拭子提取液中的任意一种。

从包装中取出检测卡，将取好的待测样品滴加150μL到检测卡的样品垫上。样品溶液将在毛细作用下向前移动，首先会与结合垫上的纳米粒标记抗体C-Ab1混合。如果样品中含有新冠抗原Ag，将会特异性结合形成C-Ab1-Ag免疫复合物。该免疫复合物将在毛细作用下继续向前移动，在T线位置与固定的捕获抗体Ab2结合，形成肉眼可见的免疫复合物C-Ab1-Ag-Ab2；如果样品中无新冠抗原Ag，则T线不显色。无论T线是否显色，多余的C-Ab1都将在C线位置被羊抗鼠二抗捕获形成肉眼可见C线。

水平静置15～20分钟后读取结果。超过20min之后读取的结果无效。

结果判读：

阳性结果：检测线位置出现一条深色条带，质控线位置也出现一条深色条带；

阴性结果：仅在质控线位置出现一条深色条带，在检测线位置无条带出现；

无效结果：质控线位置无条带，无论检测线位置是否有条带出现，均为无效结果。

对比例1

1.胶体金标记抗体的制备

胶体金是通过柠檬酸三钠还原法制备的粒径为40nm的金纳米粒，其标记抗体的过程是通过静电、疏水等作用直接与蛋白形成金-蛋白复合物。

胶体金与新冠抗体Ab1(小鼠源)的标记过程如下：

通过实验测得待标记新冠抗体Ab1的蛋白等电点pI；用0.2M碳酸钠水溶液调节胶体金pH值为pI+0.5，同时用pI+0.5的缓冲溶液溶解待标记蛋白，配制成1mg/mL的溶液。按每毫升胶体金标记20μg抗体的量，将抗体溶液加入至胶体金溶液中，室温搅拌15min，再加入一定量的10％BSA溶液，使BSA的终浓度为1％，继续搅拌10min后，6000g离心30min，去掉上清，用金复溶液复溶沉淀，即得胶体金-新冠抗体复合物Au-Ab1。

2.新冠病毒抗原检测卡(胶体金)的制备

结合垫：将胶体金-新冠抗体复合物Au-Ab1喷涂于处理好的结合垫上，喷量为3μL/cm，37℃烘箱干燥18h，加干燥剂密封保存备用。

划线：先将硝酸纤维素膜贴于PVC底板上，将羊抗鼠二抗划于硝酸纤维素膜上的质控线(C线)位置，将另一新冠捕获抗体Ab2划于检测线(T线)位置，羊抗鼠二抗和新冠抗体Ab2的划线浓度为2mg/mL，37℃烘箱干燥18h，加干燥剂铝箔袋密封保存备用。

组装：将样品垫、结合垫、吸水垫等材料依次粘贴在已贴好划好T线、C线的硝酸纤维素膜上，切条、装壳后，与干燥剂一起密封包装，即获得新型冠状病毒抗原检测卡(胶体金)，室温保存备用。

结果检测

将上述胶体金检测卡(a)与实施例3的碳纳米粒标记的检测卡(b)进行新冠重组抗原检测，成像对比如图3所示，从左至右的抗原浓度依次升高，分别为0、0.5、1、2、5、10、20、30、50、80、100、150、200、400、600、1000ng/mL，可以看出碳纳米粒标记检测卡在较低抗原浓度时即可显现出比较清晰的检测线，具有更灵敏的检测效果。

胶体金检测卡和碳纳米标记检测卡检测新冠重组抗原，得到的检测结果曲线对比如图4所示，从图4可以看出碳纳米检测卡的灵敏度大约是胶体金检测卡的3倍(IC50：碳纳米检测卡为6.8ng/mL，胶体金检测卡为20.1ng/mL)。

显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种碳纳米粒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1.预加热：将葡萄糖和N-乙酰-D-葡萄糖胺完全溶于pH为6.0～9.0的缓冲溶液中，在密闭反应体系内预加热至100～120℃；

S2.水热合成：将上述反应体系升温至160～190℃，反应5～30min，完成碳纳米粒成核反应，降温至120～160℃，继续反应30～180min，完成碳纳米粒生长反应，继续降温至室温，反应6～24h，完成熟化反应；

S3.分离纯化：将上述熟化反应产物分离纯化制备得到所述碳纳米粒；

其中，S1中N-乙酰-D-葡萄糖胺占葡萄糖和N-乙酰-D-葡萄糖胺总质量的0～20％。

2.如权利要求1所述碳纳米粒的制备方法，其特征在于，S1中溶液为pH9.0的磷酸盐缓冲液。

3.如权利要求1所述碳纳米粒的制备方法，其特征在于，S1中预加热反应的升温速率为1～3℃/min。

4.如权利要求1所述碳纳米粒的制备方法，其特征在于，S2中成核反应升温速率≥30℃/min，反应温度为180℃，反应时间5～10min，生长反应温度为140℃，反应时间40min，熟化反应温度为室温，反应时间12h。

5.一种权利要求1～4任意一项所述碳纳米粒的制备方法制备得到的碳纳米粒。

6.如权利要求5所述碳纳米粒，其特征在于，所述碳纳米粒的粒径为100～1000nm，zeta电位为-20～-50mV。

7.一种权利要求5所述碳纳米粒在制备体外诊断制品中的应用。

8.一种新型冠状病毒抗原检测卡，其特征在于，包括支撑底板，依次粘贴在支撑底板上的样品垫、结合垫、带有检测线和质控线的硝酸纤维素膜和吸收垫，其中所述结合垫上包载有权利要求5所述碳纳米粒标记的新型冠状病毒抗体Ab1，所述硝酸纤维素膜上的检测线位置包被有另一个新型冠状病毒抗体Ab2，硝酸纤维素膜上的质控线位置包被有可与Ab1特异性结合的二抗。

9.如权利要求8所述的新型冠状病毒抗原检测卡，其特征在于，所述碳纳米粒的粒径为200～400nm。

10.如权利要求8所述的新型冠状病毒抗原检测卡，其特征在于，所述新型冠状病毒抗原为新型冠状病毒N蛋白或新型冠状病毒S蛋白。

Images