CN111337691A - 一种灵敏、稳定的血清降钙素原测定试剂盒及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种降钙素原（PCT）测定试剂盒，试剂盒含有试剂R1和试剂R2；试剂R1中含有以下成分：哌嗪‑1,4‑二乙磺酸(PIPES)缓冲液、NaCl、MgCl2、硫酸软骨素、透明质酸、表面活性剂、防腐剂。试剂R2：哌嗪‑1,4‑二乙磺酸(PIPES)缓冲液、羊抗人PCT抗体包被胶乳颗粒、助悬剂、稳定剂、防腐剂。本发明同时提供了该试剂盒的制备方法和应用，该试剂盒可以有效避免乳糜微粒的干扰，同时采用不同规格的胶乳颗粒，新型表面活性剂以及不同的保护剂和悬浮剂，是一种稳定性强，灵敏度高，重复性好，成本低的液体试剂盒。

Description

一种灵敏、稳定的血清降钙素原测定试剂盒及其制备方法和 应用

技术领域

本发明涉及生化试剂测定技术领域，特别涉及一种降钙素原测定试剂盒，还涉及所述降钙素原测定试剂盒制备方法和应用。

背景技术

PCT是降钙素(CT)的前体物，116个氨基酸糖蛋白，在人体内的半衰期约20-24小时，稳定性好；在正常人血清中含量极低，小于0.5ng/mL。在除甲状腺创伤或肿瘤外，系统炎症反应综合症(SIRS)、血液疾病、急慢性肺炎、急性胰腺炎、活动性肝炎、创伤等患者血清中显著升高，尤其对SIRS/血液疾病，PCT是一种非常敏感特异的血清学标志。而在病毒刚感染时则保持低水平，PCT在严重细菌感染(2-3小时后)早期即可升高，因此具有早期诊断价值；在局部感染、病毒感染、慢性非特异性炎症、移植物宿主排斥反应或自身免疫性等疾病时PCT浓度轻微增加，在严重的全身系统性感染时明显增加，这就决定了PCT的高度特异性；PCT浓度和炎症严重程度成正相关，并随着炎症的控制和病情的缓解而降低至正常水平，因而PCT又可作为判断病情与预后以及疗效观察的可靠指标。PCT在临床上具有广泛而又重要的应用价值。

目前检测降钙素原的方法有法有胶乳免疫比浊法、双抗夹心免疫化学发光法(ILMA)、胶体金比色法。双抗夹心免疫化学发光法(ILMA)，准确性和灵敏度高，但是仪器设备昂贵，试剂保存不方便，价格高；胶体金比色法，操作简单，出结果快，但是只能定性研究，无法定量。胶乳免疫比浊法法具有特异性高，操作简单快捷、准确安全、可自动化分析、成本较低的优点，但现有技术中国产试剂盒存在分析灵敏度低，稳定性差，容易受乳糜微粒(CM)影响等缺点，本发明针对现有降钙素原试剂盒的缺点进行改进以满足临床检测以及化学分析的要求。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供一种降钙素原测定试剂盒及其制备方法和应用，该试剂盒是一种稳定性强，灵敏度高，重复性好，成本低的液体试剂盒。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种降钙素原测定试剂盒，试剂盒含有试剂R1和试剂R2；

试剂R1中含有以下成分：

试剂R2中含有以下成分：

其中所述百分比为体积比。

优选地，所述试剂R1的pH为7.0-7.5。

优选地，所述试剂R2的pH为6.5-7.5。

优选地，所述试剂R1和R2试剂中的表面活性剂选自吐温-20、曲拉通x-100、聚氧乙烯烷基醚EMULGEN 709中的一种或多种。更优选地，表面活性剂为聚氧乙烯烷基醚EMULGEN709。

优选地，所述试剂R2试剂中的稳定剂为牛血清白蛋白(BSA)、明胶和聚乙二醇6000中的一种或多种。更优选地，稳定剂由牛血清白蛋白与聚乙二醇6000组成。

优选地，所述试剂R2试剂中助悬剂为海藻糖、丙二醇和丙三醇中的一种或多种。更优选地，助悬剂为海藻糖和丙三醇复配而成。

优选地，所述试剂R1和R2试剂中的防腐剂为叠氮钠、proclin300、MIT和苯甲酸钠中的一种或多种。

优选地，所述试剂R1与试剂R2的体积比为1～5:1。更优选地，所述试剂R1与试剂R2的体积比为3:1。

上述所述的降钙素原测定试剂盒的制备方法，包括以下步骤：羊抗人降钙素原抗体包被胶乳颗粒的制备方法为：取适量表面羧基化的聚苯乙烯胶乳颗粒，加入到10ml缓冲液中，使胶乳颗粒终浓度为1.0％；然后加入适量羊抗人降钙素原抗体、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)及N-羟基丁二酰亚胺(NHS)，室温下混合搅拌3小时左右，加入1ml 10g/L的BSA溶液，12000rpm离心40分钟，去除上清，所得沉淀即为羊抗人降钙素原抗体包被胶乳颗粒。再按照比例加入其它物质溶解，制成降钙素原测定试剂盒。羊抗人降钙素原抗体包被胶乳颗粒为三种不同粒径大小的颗粒，分别为：50nm、100nm和150nm，质量比为1:1:1。

本发明还公开了降钙素原测定试剂盒的应用，用于非疾病的诊断和治疗目的测定血清中降钙素原的浓度。

本发明试剂盒采用胶乳免疫比浊法，其反应原理为样本中的PCT可与吸附在胶乳颗粒上的抗PCT抗体产生抗原抗体的凝集反应，形成免疫复合物，通过测定该免疫复合物吸光度的变化，可算出样本中PCT的含量。反应具有特异性，使用全自动生化仪进行检测，操作简单、自动化程度高，可减少人为误差，适合大多数临床实验室应用。

有益效果

1)本发明稳定的降钙素原测定试剂盒为液体双试剂，无需复溶配制，开瓶可以直接使用。

2)通过在试剂R2中加入牛血清白蛋白、聚乙二醇6000组成复合稳定剂，海藻糖和丙三醇组成复合悬浮剂，新型表面活性剂聚氧乙烯烷基醚EMULGEN 709，各组分协同作用，有效地提高了试剂中抗体胶乳颗粒的稳定性，使试剂稳定性能优异，有利于该试剂在市场中进一步的推广。

3)添加硫酸软骨素、透明质酸两种多聚阴离子化合物共同作用，与乳糜微粒形成聚合物，可以有效掩蔽乳糜微粒，避免干扰，大大增强试剂的抗干扰能力，一定程度的提高了试剂的稳定性。

4)确定了三种不同粒径大小50nm、100nm和150nm的表面羧基化的聚苯乙烯胶乳颗粒的不同作用，同时三种不同粒径胶乳颗粒联合使用，可以减少胶乳颗粒的用量，降低试剂成本，提高试剂的性能。

5)该试剂的准确度、重复性、分析灵敏度、线性范围、稳定性等性能指标卓越，价格便宜，使用方便，有利于该试剂在市场中进一步推广。

附图说明

图1为实施例1线性的相关性曲线；

图2为实施例1和对比例1、2、3、4、5、6、7提供的降钙素原测定试剂进行稳定性试验的浓度变化。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步说明：

本实施例所述试剂盒，在使用时，其测定方法是采用具有双试剂功能的迈瑞800全自动生化分析仪，利用速率法进行测定，检测主波长为600nm，操作如下：

加入生理盐水、样本或校准品15μL，再加入180μL的R1试剂，预孵育5min后再加入60μL的R2试剂，混匀，延迟1min，读取吸光度A1，5min后读取吸光度A2，

计算ΔA＝(A2-A1)。

降钙素原含量(ng/mL)＝(ΔA样本÷ΔA校准品)×校准品浓度。

样本要求：

1.不溶血血清。

2.样本稳定性：标本2～8℃保存可稳定3天，-20℃保存可稳定2周。

实施例1

一种常规的降钙素原测定试剂盒，它包括试剂R1和试剂R2。

试剂R1中含有以下成分：

试剂R1的pH值为7.0。

试剂R2中含有以下成分：

试剂R2的pH值为6.8。

其中所述百分比为体积比。试剂R2中胶乳颗粒的粒径50nm、100nm和150nm质量比为1：1：1。

对比例1

市售的进口Sigma降钙素原测定试剂盒。

对比例2

与实施例1中降钙素原测定试剂盒的区别仅在于试剂R2中胶乳颗粒的粒径全部为50nm。其它与实施例1相同。

对比例3

与实施例1中降钙素原测定试剂盒的区别仅在于试剂R2中胶乳颗粒的粒径全部为100nm，其它与实施例1相同。

对比例4

与实施例1中降钙素原测定试剂盒的区别仅在于试剂R2中胶乳颗粒的粒径全部为150nm，其它与实施例1相同。

对比例5

试剂R1中含有以下成分：

试剂R1的pH值为7.0。

试剂R2中含有以下成分：

试剂R2的pH值为6.8。

其中所述百分比为体积比。试剂R2中胶乳颗粒的粒径为50nm、100nm和150nm质量比为1：1：1。

对比例6

试剂R1中含有以下成分：

试剂R1的pH值为7.0。

试剂R2中含有以下成分：

试剂R2的pH值为6.8。

其中所述百分比为体积比。试剂R2中胶乳颗粒的粒径为50nm、100nm和150nm质量比为1：1：1。

对比例7

本对比例采用市售的国家食品药品监督管理局认可的国产的降钙素原检测试剂盒。

对比例8

与实施例1中降钙素原测定试剂盒的区别仅在于试剂R1中不含有硫酸软骨素、透明质酸，其它与实施例1相同。

对比例9

与实施例1中降钙素原测定试剂盒的区别仅在于试剂R1中不含有硫酸软骨素，其它与实施例1相同。

对比例10

与实施例1中降钙素原测定试剂盒的区别仅在于试剂R1中不含有透明质酸，其它与实施例1相同。

性能验证

试验一

准确度比对试验：取具有溯源性的质控物质，中值质控物(靶值2.00±0.20ng/mL)、高值质控物(靶值6.00±0.30ng/mL)各一份，实施例1和对比例1、2、3、4、7提供的降钙素原测定试剂进行检测，分别各检测5次，计算平均值、标准差和变异系数。检测结果见表1-1,1-2。

表1-1中值质控物比对试验数据表

表1-2高值质控物比对试验数据表

由表1-1和1-2的可以看出，检测中值质控和高值质控，实施例1、对比例1、对比例2、对比例3、对比例4的检测结果均在靶值范围内，均值结果均优于对比例7。高值质控检测结果，对比例7超出了靶值范围。实施例1和对比例2的变异系数较小。因此本发明提供的实施例1试剂与进口试剂的准确度比对试验，实施例1试剂准确度完全可以替代进口试剂且显著优于国内试剂。

试验二

精密度试验：实施例1和对比例1、2、3、4、7，对临床样品进行20次检测，计算20次检测结果平均值、标准差和变异系数。结果见表2。

表2精密度检测数据表

由表2可以看出，实施例1、对比例1和对比例2的检测数值标准偏差小，变异系数小，重复性较好，精密度较高优于对比例3、对比例4和对比例7。实施例1和对比例2精密度优于对比例1。由对比例2、3、4可以看出，当试剂采用的胶乳颗粒粒径较小时，可以提高试剂的精密度较好。因此本发明提供的实施例1试剂包含较小粒径的乳胶颗粒，精密度较好。实施例1精密度完全可以替代进口试剂且显著优于国内试剂。

试验三

线性实验：取降钙素原高值样本为80ng/mL，并进行稀释，配制6个不同浓度的样本，依次为80ng/mL、40ng/mL、20ng/mL、10ng/mL、5ng/mL、0ng/mL浓度的样本，用实施例1和对比例1、2、3、4、7试剂进行检测，每个浓度水平各样本分别测定三次，分别取其平均值。检测结果如表所示：

表3线性相关验证实验检测数据表

由表3和图1可以看出，本发明实施例1随稀释浓度呈线性变化，线性相关系数达到0.9991，大于0.990，符合标准要求，并且数值大于其他对照组。说明实施例1线性范围较好，优于进口试剂以及单规格粒径胶乳颗粒的试剂。由对比例2、3、4可以看出，当试剂采用的胶乳颗粒粒径较小时，可以提高试剂的线性。实施例1线性范围全可以替代进口试剂且显著优于国内试剂。实施例1试剂较好的线性变化更能够符合临床病例样本的要求。

试验四

低值样本灵敏度检测试验：取具有良好溯源性的质控品稀释出2个低浓度样本，分别为1.20ng/mL、0.50ng/mL，用实施例1和对比例1、2、3、4、7试剂进行检测，分别检测5次，求平均值的相对偏差。结果见表4-1，表4-2。

表4-1 1.20ng/mL样品检测数据表

表4-2 0.50ng/mL样品检测数据表

由表4-1、表4-2可知，在检测低值样本是，实施例1和对比例4检测结果较好，当试剂采用的胶乳颗粒粒径较对比例2和对比例3胶乳粒径大时，试剂检测低值样本的灵敏度较好，含有150nm胶乳粒径的试剂，灵敏度较好。实施例1和对比例4检测结果优于对比例1。由对比例2、3、4可以看出，当试剂采用的胶乳颗粒粒径较大时，可以提高试剂的分析灵敏度。本发明通过采用不同粒径的微粒和适当的反应体系，显著的提高了试剂的分析灵敏度，对于临床检验有重要意义。

试验五

稳定性实验：对实施例1和对比例1、2、3、4、5、6、7提供的降钙素原测定试剂进行稳定性试验，试验方案为：对实施例1和对比例1、2、3、4、5、6、7提供的试剂，每一例平行包含12组，一起放入2-8℃冰箱中存储，每月检测靶值为2.00±0.20mg/L的质控品，每组测试5次，求平均值，并监测质控品测定值的变化，结果见表5。

表5试剂热稳定性验证数据

由表5和图2可以看出，与对比例6相似，本发明提供的实施例1试剂在2-8℃条件下12月内基本无变化，稳定性较好；而对比例1、2、3、4、5、7试剂在12月内变化明显。实施例1的试剂盒稳定性优于对比实施例1、2、3、4、5、7试剂盒的稳定性，说明本发明缓冲液和不同粒径胶乳微粒，以及新型表明活性剂、多种保护剂和悬浮剂的加入共同作用，显著提高降钙素原测定试剂盒的稳定性。

试验六

干扰实验：取具有溯源性的质控物质，中值质控物(靶值2.00±0.20ng/mL)，同时稀释出0.50ng/mL的样品，分别加入表格中乳糜微粒的含量。然后分别用实施例1试剂，与对比例1试剂、对比例7试剂、对比例8、对比例9、对比例10同时对样本中降钙素原的含量进行检测，分别测量5次求平均值，各组的测定结果见表6-1，表6-2。

表6-1试剂抗干扰验证结果1

表6-2试剂抗干扰验证结果2

由表6-1,6-2可以看出，当乳糜微粒为0.2g/L和0.4g/L时，实施例1试剂未受到明显干扰，对比例1、对比例7、对比例8试剂受到显著干扰。实施例1与对比例9、对比例10比较，包含两种组分的实施例1抗干扰能力更强。这说明通过加入硫酸软骨素、透明质酸成分后，两者协同作用使实施例1试剂的抗干扰性能显著提高，优于对比例1试剂，满足临床要求。

综上所述，该试剂盒采用硫酸软骨素、透明质酸，不同规格的胶乳颗粒，新型表面活性剂，不同的保护剂和悬浮剂，是一种抗干扰性、稳定性强，灵敏度高，重复性好，成本低的液体试剂盒。为本发明试剂盒提供了良好的发展空间，同时增强了本发明试剂盒在市场上竞争力。

本文中所描述的具体实施例仅仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。

Claims (10)

1.一种降钙素原测定试剂盒，其特征在于，试剂盒含有试剂R1和试剂R2；

试剂R1中含有以下成分：

缓冲液 20-80mmol/L；

NaCl 9g/L；

MgCl₂ 0.5mmol/L；

硫酸软骨素 0.5mmol/L；

透明质酸 0.5mmol/L；

表面活性剂 0.1%-2%；

防腐剂 0.5-1 g/L；

试剂R2中含有以下成分：

缓冲液 20-80mmol/L；

羊抗人PCT抗体包被胶乳颗粒 20-35mg/L；

稳定剂 10-20g/L；

表面活性剂 0.1%-2%；

助悬剂 10-40g/L；

防腐剂 0.5-1g/L；

其中所述百分比为体积比。

2.根据权利要求1所述的降钙素原测定试剂盒，其特征在于，所述试剂R1和试剂R2的缓冲液体系为三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液、4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液、哌嗪-1,4-二乙磺酸缓冲液、磷酸盐缓冲液、N-氨基甲酰甲基乙磺酸缓冲液、2-(N-吗啉代)乙磺酸缓冲液中的一种。

3.根据权利要求1所述的降钙素原测定试剂盒，其特征在于，所述试剂R1的pH为7.0-7.5，试剂R2的pH为6.5-7.5。

4.根据权利要求1所述的降钙素原测定试剂盒，其特征在于，所述试剂 R1和R2试剂中的表面活性剂选自吐温-20、曲拉通x-100、聚氧乙烯烷基醚EMULGEN 709中的一种或两种。

5.根据权利要求1所述的降钙素原测定试剂盒，其特征在于，所述试剂R2试剂中的稳定剂为牛血清白蛋白、明胶和聚乙二醇6000中的一种或多种。

6.根据权利要求1所述的降钙素原测定试剂盒，其特征在于，所述试剂R2中的助悬剂为海藻糖、丙二醇和丙三醇中的一种或多种。

7.根据权利要求1所述的降钙素原测定试剂盒，其特征在于，所述试剂R1和R2试剂中的防腐剂为叠氮钠、proclin300、MIT和苯甲酸钠中的一种或多种。

8.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂R1与试剂R2的体积比为1～5:1，优选地，体积比为3:1。

9.一种权利要求1-8之一所述的降钙素原测定试剂盒的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：先制成羊抗人降钙素原抗体包被胶乳颗粒的制备方法：取适量表面羧基化的聚苯乙烯胶乳颗粒，加入到10ml缓冲液中，使胶乳颗粒终浓度为1.0% ；然后加入适量羊抗人降钙素原抗体、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐及N-羟基丁二酰亚胺，室温下混合搅拌3小时，加入1ml 10g/L的BSA溶液，12000 rpm离心40分钟，去除上清，所得沉淀即为羊抗人降钙素原抗体包被胶乳颗粒；再按照比例加入其它物质溶解，制成降钙素原测定试剂盒；所述的羊抗人降钙素原抗体包被胶乳颗粒为三种不同粒径大小的颗粒，分别为：50nm、100nm和150nm，质量比为1:1:1。

10.一种权利要求1-8之一所述的降钙素原测定试剂盒的应用，用于非疾病的诊断和治疗目的测定血清中降钙素原的浓度。

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