CN113624955A - 一种血清补体c4测定试剂盒及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种补体C4测定试剂盒，试剂盒含有试剂R1和试剂R2；试剂R1中含有以下成分：三羟甲基氨基甲烷‑盐酸（Tris‑HCl）缓冲液、NaCl、表面活性剂、防腐剂。试剂R2：2‑(N‑吗啉代)乙磺酸（MES）缓冲液、鼠抗人C4抗体包被胶乳颗粒、聚氧乙烯二油酸酯、增悬剂、稳定剂、防腐剂。本发明同时提供了该试剂盒的制备方法和应用，是一种稳定性强，灵敏度高，重复性好，成本低的液体试剂盒。

Description

一种血清补体C4测定试剂盒及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生化试剂测定技术领域，特别涉及一种补体C4测定试剂盒，还涉及所述补体C4测定试剂盒制备方法和应用。

背景技术

补体C4是一种多功能β1-球蛋白，存在于血浆中。在补体传统途径活化中，C4被C1s水解为C4a、C4b，它们在补体活化、促进吞噬、防止免疫复合物沉着和中和病毒等方面发挥作用。

C4是补体经典激活途径的一个重要组分，它的测定有助于SLE等自身免疫性疾病诊断，治疗和病因探讨。降低：见于免疫复合物引起的肾炎、系统性红斑狼疮、病毒性感染、狼疮性症候群、肝硬化、肝炎等。增高：见于各种传染病、急性炎症、组织损伤、多发性骨髓瘤等。C4含量升高常见于风湿热的急性期、结节性动脉周围炎、皮肌炎、心肌梗塞、Reiter综合征和各种类型的多关节炎等；降低则常见于自身免疫性慢性活动性肝炎、SLE、多发性硬化症、类风湿性关节炎、IgA肾病、亚急性硬化性全脑炎等。在SLE，C4的降低常早于其他补体成分，且缓解时较其他成分回升迟。狼疮性肾炎较非狼疮性肾炎C4值显著低下。

目前检测补体C4的方法有法有胶乳免疫比浊法、双抗夹心免疫化学发光法(ILMA)、胶体金比色法。双抗夹心免疫化学发光法(ILMA)，准确性和灵敏度高，但是仪器设备昂贵，试剂保存不方便，价格高；胶体金比色法，操作简单，出结果快，但是只能定性研究，无法定量。胶乳免疫比浊法法具有特异性高，操作简单快捷、准确安全、可自动化分析、成本较低的优点，但现有技术中国产试剂盒存在检测值偏低，稳定性差等缺点，本发明针对现有补体C4试剂盒的缺点进行改进以满足临床检测以及化学分析的要求。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供一种补体C4测定试剂盒及其制备方法和应用，该试剂盒是一种稳定性强，灵敏度高，重复性好，成本低的液体试剂盒。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种补体C4测定试剂盒，试剂盒含有试剂R1和试剂R2；

试剂R1中含有以下成分：

缓冲液 20-80mmol/L；

NaCl 9g/L；

表面活性剂 0.1%-2%；

防腐剂 0.5-1 g/L。

试剂R2中含有以下成分：

缓冲液 20-80mmol/L；

鼠抗人C4抗体包被胶乳颗粒 0.20%-0.35%；

稳定剂 10-20g/L；

表面活性剂 0.1%-2%；

增悬剂 10-40g/L；

防腐剂 0.5-1g/L。

其中所述百分比为体积比。

优选地，所述试剂R1的pH 为7.0-7.5。

优选地，所述试剂R2 的pH为6.5-7.5。

优选地，所述试剂 R1 和R2试剂中的表面活性剂选自吐温-20、曲拉通x-100和聚氧乙烯二油酸酯中的一种或多种。

优选地，所述试剂 R2试剂中的稳定剂为牛血清白蛋白（BSA）、山梨醇和聚乙二醇6000中的一种或多种。

优选地，所述试剂 R2试剂中增悬剂为甘氨酸、蔗糖、甘露醇和丙三醇中的一种或多种。

优选地，所述试剂R1 和R2试剂中的防腐剂为叠氮钠、proclin300、MIT和苯甲酸钠中的一种或多种。

优选地，所述试剂R1与试剂R2的体积比为1～5:1。更优选地，所述试剂R1与试剂R2的体积比为3:1。

上述所述的补体C4测定试剂盒的制备方法，包括以下步骤：鼠抗人补体C4抗体包被胶乳颗粒的制备方法为：首先取适量表面羧基化的聚苯乙烯胶乳颗粒，胶乳颗粒的粒径为100nm和150nm质量比例为1：1，加入到10ml缓冲液中，使胶乳颗粒终质量浓度为2.0%；加入0.01g的硝酸钠，0.02g的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐及0.03g的N-羟基丁二酰亚胺，配成胶乳液；其次，取2ml浓度为1mg/mL的鼠抗人补体C4抗体，加入到10ml缓冲液中，加入0.02g 的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐及0.03g 的N-羟基丁二酰亚胺，配成抗体液；胶乳液和抗体液室温下各孵育搅拌30min；最后，胶乳液和抗体液等比例混合，室温下孵育搅拌60min；反应完，12000 rpm离心20分钟，去除上清，所得沉淀即为鼠抗人补体C4抗体包被胶乳颗粒；再加入其他试剂，配制成补体C4测定试剂盒。

本发明还公开了补体C4测定试剂盒的应用，用于非疾病的诊断和治疗目的测定血清中补体C4的浓度。

本发明试剂盒采用胶乳免疫比浊法，其反应原理为样本中的C4可与吸附在胶乳颗粒上的抗C4抗体产生抗原抗体的凝集反应，形成免疫复合物，通过测定该免疫复合物吸光度的变化，可算出样本中C4的含量。反应具有特异性，使用全自动生化仪进行检测，操作简单、自动化程度高，可减少人为误差，适合大多数临床实验室应用。

有益效果

1）本发明稳定的补体C4测定试剂盒为液体双试剂，无需复溶配制，开瓶可以直接使用。

2）胶乳颗粒与抗体结合前，首先胶乳颗粒与硝酸钠，EDC及NHS孵育，抗体与EDC及NHS孵育，然后再进行混合孵育，硝酸钠可以更好的提高胶乳颗粒中羧基的活性。EDC及NHS可以提高抗体中氨基的活性，进而提高结合浓度和效率。两种胶乳颗粒的选择可以更好的提高样本检测样本准确度和线性，节约成本，使该试剂在市场中进一步的推广。

3）通过采用新型表面活性剂聚氧乙烯二油酸酯，可以提高抗体胶乳颗粒和抗体结合稳定性，结合后更好的分散，防止体系聚集沉淀，进一步增强试剂的稳定性。

4）本发明R1和R2试剂分别采用不同的缓冲液体系和表面活性剂，可以相应的去除样本中血脂和一些还原性物质的干扰，同时也增强了试剂的重复性和稳定性。

5）该试剂的准确度、重复性、分析灵敏度、线性范围、稳定性等性能指标卓越，价格便宜，使用方便，有利于该试剂在市场中进一步推广。

附图说明

图1为线性相关试验图。

图2为实施例1和对比例1、4、5、6、7提供的补体C4测定试剂进行稳定性试验的浓度变化。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步说明：

本实施例所述试剂盒，在使用时，其测定方法是采用具有双试剂功能的迈瑞800全自动生化分析仪，利用速率法进行测定，检测主波长为340nm，操作如下：

加入生理盐水、样本或校准品2µL，再加入250µL 的R1试剂，预孵育5min后，再加入50µL的R2试剂，混匀，延迟1min，读取吸光度 A1，5min后读取吸光度A2，

计算∆A=(A2-A1)。

补体C4含量（mg/L）=（ΔA样本÷ΔA校准品）*校准品浓度。

样本要求：

1.不溶血血清。

2.样本稳定性：标本2~8℃保存可稳定3天，-20℃保存可稳定2周。

实施例1

一种常规的补体C4测定试剂盒，它包括试剂R1和试剂R2。

试剂R1中含有以下成分：

三羟甲基氨基甲烷-盐酸（Tris-HCl）缓冲液 50mmol/L；

NaCl 9g/L；

曲拉通x-100 1%；

proclin300 1 ml/L。

试剂R1的pH值为7.5。

试剂R2中含有以下成分：

2-(N-吗啉代)乙磺酸（MES）缓冲液 50mmol/L；

鼠抗人C4抗体包被胶乳颗粒 0.3%；

牛血清白蛋白（BSA） 5g/L；

聚乙二醇6000 5g/L；

甘氨酸 10g/L；

丙三醇 10ml/L；

聚氧乙烯二油酸酯 1%；

proclin300 1ml/L。

试剂R2的pH值为7.2。

其中所述百分比为体积比。试剂R2中胶乳颗粒的粒径为100nm和150nm比列为1：1。

鼠抗人C4抗体包被胶乳颗粒的制备方法为：

首先取适量表面羧基化的聚苯乙烯胶乳颗粒，胶乳颗粒的粒径为100nm和150nm质量比例为1：1，加入到10ml缓冲液中，使胶乳颗粒终质量浓度为2.0%；加入0.01g的硝酸钠，0.02g的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐及0.03g的N-羟基丁二酰亚胺，配成胶乳液；其次，取2ml浓度为1mg/mL的鼠抗人补体C4抗体，加入到10ml缓冲液中，加入0.02g的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐及0.03g 的N-羟基丁二酰亚胺，配成抗体液；胶乳液和抗体液室温下各孵育搅拌30min；最后，胶乳液和抗体液等比例混合，室温下孵育搅拌60min；反应完，12000 rpm离心20分钟，去除上清，所得沉淀即为鼠抗人补体C4抗体包被胶乳颗粒。

对比例1

市售的进口Sigma补体C4测定试剂盒。

对比例 2

鼠抗人补体C4抗体包被胶乳颗粒的制备方法为：首先取适量表面羧基化的聚苯乙烯胶乳颗粒，胶乳颗粒的粒径为100nm和150nm质量比例为1：1，加入到10ml缓冲液中，使胶乳颗粒终质量浓度为2.0%；加入0.02g的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐以及0.03g的N-羟基丁二酰亚胺，配成胶乳液。其次，取2ml浓度为1mg/mL的鼠抗人补体C4抗体，加入到10ml缓冲液中，加入0.02g的 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐以及0.03g的N-羟基丁二酰亚胺，配成抗体液。胶乳液和抗体液室温下各孵育搅拌30min。最后，胶乳液和抗体液等比例混合，室温下孵育搅拌60min。反应完，12000 rpm离心20分钟，去除上清，所得沉淀即为鼠抗人补体C4抗体包被胶乳颗粒。与实施例 1区别在于胶乳颗粒孵育时无硝酸钠加入，其他与实施例 1 相同。

对比例 3

与实施例 1 中补体C4测定试剂盒的区别在于鼠抗人补体C4抗体包被胶乳颗粒的制备方法为：首先取适量表面羧基化的聚苯乙烯胶乳颗粒，胶乳颗粒的粒径为100nm和150nm质量比例为1：1，加入到10ml缓冲液中，使胶乳颗粒终质量浓度为2.0%；加入0.02g的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐以及0.03g发热N-羟基丁二酰亚胺，配成胶乳液。其次，加入2ml浓度为1mg/mL的鼠抗人补体C4抗体。最后，胶乳液和抗体液等比例混合，室温下孵育搅拌90min。反应完，12000 rpm离心20分钟，去除上清，所得沉淀即为鼠抗人补体C4抗体包被胶乳颗粒。其它与实施例1相同。

对比例 4

与实施例 1 中补体C4测定试剂盒的区别仅在于试剂R2中表面活性剂为曲拉通x-100，其它与实施例 1 相同。

对比例 5

与实施例 1 中补体C4测定试剂盒的区别仅在于试剂R2中无表面活性剂，其它与实施例 1 相同。

对比例 6

与实施例 1 中补体C4测定试剂盒的区别仅在于试剂R1中也采用同浓度的2-(N-吗啉代)乙磺酸（MES）缓冲液，其它与实施例 1 相同。

对比例 7

与实施例 1 中补体C4测定试剂盒的区别仅在于试剂R2中也采用同浓度的三羟甲基氨基甲烷-盐酸（Tris-HCl）缓冲液，其它与实施例 1 相同。

性能验证

试验一

准确度比对试验1：取具有溯源性的质控物质，质控物（靶值50±5mg/dL），实施例1和对比例1、2、3、4、5、6、7提供的补体C4测定试剂进行检测，分别各检测5次，计算平均值、标准差和变异系数。检测结果见表1-1。

表1-1 质控物比对试验数据表

准确度比对试验2：实验方案为：实施例1、对比例1、对比例2、对比例3、对比例6和对比例7，同时检测了10个临床血清样本，样本4为高值样本，样本5为溶血样本，样本9为脂浊样本；以对比例1检测结果作为对照值，对两组检测结果进行相关性分析，计算相对偏差，要求相对偏差不超过±10%。检测结果见表1-2。

表1-2 临床样本比对试验数据表

由表1-1和1-2的可以看出，检测定值质控，检测结果均在靶值范围内。实施例1无论在标准差还是变异系数均优于对比例试剂。对比例4试剂检测平均值较好，但是试剂变异系数较大，试剂重复性稍差。由表1-2的可以看出，实施例1与对比例1比较，样本检测结果相关性较好，其他对比例组检测样本整体偏低。实施例1与对比例2、3相比，特别是高值样本，说明实施例1选用加入硝酸钠的胶乳颗粒和抗体结合效率高，两种胶乳粒径的选择也较好的提高了试剂的检测准确度。 针对脂浊样本，实施例1与对比例4、5相比，说明聚氧乙烯二油酸酯比曲拉通x-100抗干扰能力强，效果更好。实施例1与对比例6、7相比，说明不同的缓冲液体系搭配，对于试剂的检测准确度和抗干扰能力也有提高。实施例1试剂完全可以替代进口试剂。

试验二

精密度试验：实施例1和对比例1、2、3、4、5、6、7，对临床样品进行10次检测，计算10次检测结果平均值、标准差和变异系数。结果见表2。

表2 精密度检测数据表

由表2可以看出，实施例1和对比例1的检测数值基本一致，准确度较好，变异系数小，重复性较好，精密度较高。实施例1和对比例1的检测值优于其他对比例试剂。因此本发明提供的实施例1试剂准确度完全可以替代进口试剂。

试验三

线性实验：取补体C4高值样本为160mg/dL，并进行稀释，配制6个不同浓度的样本，依次为160mg/dL、80mg/dL、40mg/dL、20mg/dL、10mg/dL、0mg/dL浓度的样本，用实施例1试剂进行检测，每个浓度水平各样本分别测定三次，分别取其平均值。结果见表3，图1。

表3线性相关验证实验检测数据表

由表3可以看出，本发明实施例1随稀释浓度呈线性变化，线性相关系数达到0.999，大于0.990，符合标准要求。说明实施例1线性范围较好，两种规格粒径胶乳颗粒提高了试剂的线性。实施例1试剂较好的线性变化能够符合临床病例样本的要求。

试验四

加速稳定性实验：对实施例1和对比例1、4、5、6、7提供的补体C4测定试剂进行加速稳定性试验，试验方案为：对实施例1和对比例1、4、5、6、7提供的试剂，每一例平行包含7组，一起放入37℃水浴锅中存储，每天检测靶值为50±5mg/dL的质控品，每组测试5次，求平均值，并监测质控品测定值的变化。结果见表4，图2。

表4试剂热稳定性验证数据

由表4和图2可以看出，本发明提供的实施例1试剂在37℃条件下10天内基本无变化，稳定性较好；对比例1试剂10天变化在靶值范围内，而对比例4、5、6、7试剂在10内变化明显，超出靶值范围。实施例1的试剂盒稳定性优于对比实施例1、4、5、6、7试剂盒的稳定性，说明本发明缓冲液体系和新型表面活性剂聚氧乙烯二油酸酯，以及多种保护剂和悬浮剂的加入共同作用，显著提高补体C4测定试剂盒的稳定性。

综上所述，本试剂盒首次采用胶乳颗粒与硝酸钠，EDC及NHS孵育，抗体与EDC及NHS孵育，然后再进行混合孵育，提高了结合效率，降低了成本。两种胶乳颗粒的选择可以更好的提高样本检测样本准确度和线性范围。新型表面活性剂聚氧乙烯二油酸酯，提高了抗体胶乳颗粒和抗体结合稳定性，结合后更好的分散，防止体系聚集沉淀，进一步增强试剂的稳定性。R1和R2试剂分别采用不同的缓冲液体系和表面活性剂，可以相应的去除样本中血脂和一些还原性物质的干扰，同时也增强了试剂的重复性和稳定性。本试剂是一种稳定性强，灵敏度高，重复性好，成本低的液体试剂盒。为本发明试剂盒提供了良好的发展空间，同时增强了本发明试剂盒在市场上竞争力。

本文中所描述的具体实施例仅仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。

尽管对本发明已作出了详细的说明并引证了一些具体实施例，但是对本领域熟练技术人员来说，只要不离开本发明的精神和范围可作各种变化或修正是显然的。

Claims (10)

1.一种补体C4测定试剂盒，其特征在于，试剂盒含有试剂R1和试剂R2；

试剂R1中含有以下成分：

缓冲液 20-80mmol/L；

NaCl 9g/L；

表面活性剂 0.1%-2%；

防腐剂 0.5 ~1 g/L；

试剂R2中含有以下成分：

缓冲液 20-80mmol/L；

鼠抗人C4抗体包被胶乳颗粒 0.20%-0.35%；

稳定剂 10-20g/L；

表面活性剂 0.1%-2%；

增悬剂 10-40g/L；

防腐剂 0.5-1g/L；

其中所述百分比为体积比。

2.根据权利要求1所述的补体C4测定试剂盒，其特征在于，所述试剂R1和试剂R2的缓冲液体系为三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液、4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液、哌嗪-1,4-二乙磺酸缓冲液、磷酸盐缓冲液、N-氨基甲酰甲基乙磺酸缓冲液或2-(N-吗啉代)乙磺酸缓冲液中的一种。

3.根据权利要求1所述的补体C4测定试剂盒，其特征在于，所述试剂R1的pH 为7.0-7.5、试剂R2的pH为6.5-7.5。

4.根据权利要求1所述的补体C4测定试剂盒，其特征在于，所述试剂 R1和R2试剂中的表面活性剂选自吐温-80、曲拉通x-100和聚氧乙烯二油酸酯中的一种或两种。

5.根据权利要求1所述的补体C4测定试剂盒，其特征在于，所述试剂R2试剂中的稳定剂为牛血清白蛋白、山梨醇和聚乙二醇6000中的一种或多种。

6.根据权利要求1所述的补体C4测定试剂盒，其特征在于，所述试剂R2中的增悬剂为甘氨酸、蔗糖、甘露醇和丙三醇中的一种或多种。

7.根据权利要求1所述的补体C4测定试剂盒，其特征在于，所述试剂R1和R2试剂中的防腐剂为叠氮钠、proclin300、MIT和苯甲酸钠中的一种或多种。

8.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂R1与试剂R2的体积比为1～5:1。

9.一种权利要求1-8之一所述的补体C4测定试剂盒的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：鼠抗人补体C4抗体包被胶乳颗粒的制备方法为：首先取适量表面羧基化的聚苯乙烯胶乳颗粒，胶乳颗粒的粒径为100nm和150nm质量比例为1：1，加入到10ml缓冲液中，使胶乳颗粒终质量浓度为2.0%；加入0.01g的硝酸钠，0.02g的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐及0.03g的N-羟基丁二酰亚胺，配成胶乳液；其次，取2ml浓度为1mg/mL的鼠抗人补体C4抗体，加入到10ml缓冲液中，加入0.02g 的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐及0.03g 的N-羟基丁二酰亚胺，配成抗体液；胶乳液和抗体液室温下各孵育搅拌30min；最后，胶乳液和抗体液等比例混合，室温下孵育搅拌60min；反应完，12000 rpm离心20分钟，去除上清，所得沉淀即为鼠抗人补体C4抗体包被胶乳颗粒；再加入其他试剂，配制成补体C4测定试剂盒。

10.一种权利要求1-8之一所述的补体C4测定试剂盒的应用，用于非疾病的诊断和治疗目的测定血清中补体C4的浓度。

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