CN113030470B - 肌酸激酶同工酶测定试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了肌酸激酶同工酶(CKMB)测定试剂盒，包括第一试剂和第二试剂，其中第一试剂为含有聚乙二醇和肝素的磷酸盐缓冲液；所述第二试剂为含有肌酸激酶同工酶胶乳抗体和透明质酸的甘氨酸缓冲溶液。本发明肌酸激酶同工酶测定试剂盒可通过定量客观反映CKMB的存在，为临床诊断及疗效观察和预后判断提供了更有力的实验诊断依据。本发明所提供的肌酸激酶同工酶测定试剂盒特异性高，重复性好，检测灵敏度高，线性范围宽，稳定性高。

Description

肌酸激酶同工酶测定试剂盒

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及肌酸激酶同工酶测定试剂盒，特别是涉及一种胶乳免疫比浊法肌酸激酶同工酶测定试剂盒及其应用。

背景技术

肌酸激酶(CreatineKinase,CK)广泛存在于各种组织中，与三磷酸腺苷(ATP)的再生有关。肌酸激酶是由M和B两种亚单位组成的二聚体，在细胞质内共有三种同工酶：即CK-MM、CK-MB和CK-BB。在细胞线粒体内还有另一种同工酶，称为CK-Mt。这几种同工酶虽然相对分子质量相同，但是免疫特性不同。肌酸激酶的同工酶在临床诊断中有十分重要的意义，在各种病变包括肌肉萎缩和心肌梗塞发生时，人的血清中肌酸激酶水平迅速提高，目前认为在心肌梗塞的诊断中测定肌酸激酶的活性比做心电图更为可靠。心肌梗死时，肌酸激酶在起病6小时内升高，24小时达高峰，3-4日内恢复正常。其中肌酸激酶的同工酶CK-MB诊断的特异性最高，临床上主要用于心肌梗死、病毒性心肌炎的辅助诊断。

肌酸激酶同工酶测定的方法有电泳法、离子交换柱层析法、免疫抑制法、金标记法、免疫酶标法和放射免疫法等。常规应用电泳法和免疫抑制法较多，但电泳法无法应用于全自动生化分析仪，所用仪器价格昂贵，所以无法普及。其他常用检测还有免疫比浊法和酶联免疫吸附法等。由于酶联免疫吸附法检测耗时且操作复杂，已经不能满足大型医院快速定量检测的要求，而免疫比浊法随着全自动生化仪的普及，已经发展出来多种快速免疫比浊检测技术。

乳胶增强免疫透射比浊法的基本原理是，首先将抗体吸附在一种胶乳颗粒上，当遇到相应的抗原时，抗原抗体结合而出现乳胶凝集。单个乳胶颗粒的大小在入射波长之内，光线可透过，当两个以上的乳胶颗粒凝集时，可阻碍光线透过，使得透射光减少，其减少程度与抗原的量成正比。此法提高了检测的灵敏度和准确度，得到了广泛的应用。然而，乳胶增强免疫比浊法反应后会产生沉淀，不利于生化仪的清洗，干扰试验结果，且乳胶制造成本较高，导致免疫比浊试剂盒价格和检测成本偏高。因此又出现了纳米颗粒增强的免疫比浊法，如专利CN101680890便公开了一种通过比浊法测量人抑半肮氨酸蛋白酶蛋白C的比浊免疫测定方法和试剂组合，以及中国专利CN101819208中公开了一种利用微球免疫比浊法检测脑钠肽试剂盒。专利CN101680890中具体公开了，表面修饰了抗体的由聚苯乙烯、聚氯乙烯、环氧树脂、聚偏1,1-二氯乙烯、聚-α-萘基甲基丙稀酸酯、聚乙烯萘以及它们相应的共聚物制成的粒径在80-105nm的有机高分子胶体纳米颗粒。

中国专利申请CN 109613242 A公开了一种肌酸激酶同工酶检测试剂盒及其制备方法，包括：磁分离试剂和酶标记抗体；磁分离试剂包括：表面上结合有第一抗CK-MB单克隆抗体和第二抗CK-MB单克隆抗体的磁微粒；酶标记抗体包括：酶标记的第三抗CK-MB单克隆抗体；和/或，酶标记的第四抗CK-MB单克隆抗体；其中，第一、第二、第三和第四抗CK-MB单克隆抗体分别特异于肌酸激酶同工酶的不同表位。

中国专利申请CN 108548926 A公开了一种肌酸激酶同工酶检测试剂盒。该试剂盒包括第一试剂、第二试剂。第一试剂包含缓冲液、防腐剂、增凝剂、表面活性剂、保护剂、阻断剂；第二试剂包含缓冲液、稳定剂、防腐剂、保护剂、聚苯乙烯胶乳颗粒、肌酸激酶同工酶抗体。

发明内容

基于上述背景技术，现有技术尚未关注试剂盒在存储过程中的稳定性问题。本发明所要解决的技术问题在于一种肌酸激酶同工酶测定试剂盒，其目标在于提高试剂盒的长期稳定性。为了实现本发明的发明目的，拟采用如下技术方案：

本发明一方面涉及肌酸激酶同工酶测定试剂盒，包括第一试剂和第二试剂，其特征在于：

其中第一试剂为含有聚乙二醇和肝素的磷酸盐缓冲液；

所述第二试剂为含有肌酸激酶同工酶胶乳抗体和透明质酸的甘氨酸缓冲溶液。

在本发明的一个优选实施方式中，所述试剂盒中还包括肌酸激酶同工酶的标准品缓冲溶液。

在本发明的另一个优选实施方式中，所述试剂盒中还包括肌酸激酶同工酶的质控品缓冲溶液。

在本发明的一个优选实施方式中，所述第一试剂还含有电解质、表面活性剂和防腐剂。其各自的含量为本领域的常规含量。

在本发明的一个优选实施方式中，所述第一试剂中所含有的电解质为NaCl，表面活性剂是Tween 80，防腐剂是叠氮钠。

在本发明的一个优选实施方式中，所述第二试剂还含有稳定剂和防腐剂。其各自的含量为本领域的常规含量。

在本发明的一个优选实施方式中，所述第二试剂中所含有的稳定剂为蔗糖，防腐剂是叠氮钠。

在本发明的一个优选实施方式中，所述第一试剂中肝素的量为0.2-0.5g/L。当肝素的含量在本发明的优选范围时，其更有利于提供对第一试剂的保护，以提高试剂盒的长期稳定性等。

在本发明的另一个优选实施方式中，所述第二试剂中透明质酸的量为40-60g/L。当透明质酸的量在本发明的优选范围时，其有利于提高第二试剂的粘度以及防止聚苯乙烯胶乳颗粒的沉降等。

本发明另一方面还涉及上述试剂盒在制备定量测定肌酸激酶同工酶测定试剂盒中的应用。

有益效果

本发明肌酸激酶同工酶测定试剂盒可通过定量客观反映肌酸激酶同工酶的存在，为临床诊断及疗效观察和预后判断提供了更有力的实验诊断依据。本发明所提供的肌酸激酶同工酶测定试剂盒特异性高，重复性好，检测灵敏度高，线性范围宽，稳定性高。

具体实施方式

为了进一步理解本发明，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

如无特殊说明，本发明实施例中所涉及的试剂均为市售产品，均可以通过商业渠道购买获得。

实施例1

(1)制备第一试剂：称取18g三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液、13gNaCl、9gPEG 8000、15g Tween 80、1.5g叠氮钠、0.5g肝素，溶于1.0L双蒸水中，调节ph至7.2，定容至1.5L即得试剂第一试剂(分装为30mL/剂)：

(2)制备第二试剂：用甘氨酸缓冲液将表面具有羧基官能团的聚苯乙烯胶乳颗粒(平均粒径350nm)稀释至1％(w/v)，将浓度为0.1％至1％(w/v)的EDAC水溶液加入至颗粒中，在恒温摇床中37℃反应30min；用甘氨酸缓冲溶液将肌酸激酶同工酶抗体(小鼠单抗)稀释至0.5mg/ml，将其加入至颗粒中，在恒温摇床中37℃反应3h；加入封闭剂，常温过夜放置；将封闭过夜的颗粒，加入清洗液清洗离心3次，保存，备用；在颗粒中加入100mL双蒸水，5g透明质酸、0.5g叠氮钠、10g蔗糖，搅拌混匀，调节甘氨酸缓冲液pH至7.2，超声至主波长吸光度基本不变化即得第二试剂(分装为40mL/剂)。

比较例1

与实施例1相同，其区别在于制备第一试剂时不加入肝素。

比较例2：

与实施例1相同，其区别在于制备第二试剂时不加入透明质酸。

测试实施例

将实施例1和比较例1～2试剂盒用于标准样品的检测，以确定试剂盒的存储稳定性，具体操作步骤为：

(1)临床血液样本采集后(采集血液样本的采血管可为玻璃管或塑料管)，在室温条件下，须在4小时之内完成检测；血清于2-8℃保存不超过5天，-20℃冷冻保存不超过3个月。全血样本(肝素或EDTA抗凝)在2-8℃保存不超过24小时，不得冻存。

(2)对上述实施例和比较例所制备的3个试剂盒采用日立7080型全自动生化仪进行测试：测定波长为660nm，样本取样量为10μL，加入150μL的第一试剂，37℃恒温5min，然后加入50μL的第二试剂，20秒后读取吸光度A1，37℃孵育4分40秒后读取吸光度A2，反应吸光度为ΔA＝A2-A1。

采用行业通用的方式对上述试剂盒进行性能评价，结果如下：

(1)、最低检测限

检测方法：取不同浓度梯度的低浓度值样本进行检测，每份样本检测5次，对检测结果按照大小进行排序，符合如下条件，即可得到空白限和检出限的范围；低于空白限数值的检测结果的数量应小于或等于3个。

检测结果：CKMB的最低检测限≤1ng/mL。

(2)、准确度

检测方法：根据线性区间，用CKMB抗原配置制成已知3个浓度企业参考品作为样本进行检测，每个样本重复测定10次，计算10次检测结果的均值以及相对偏差。

检测结果：用CKMB抗原配置成已知浓度作为样本进行检测，测定值与理论值的相对偏差不超过±15％。

(3)、线性

CKMB在[3，200]ng/mL线性区间内，拟合曲线的线性相关系数(r)应不小于0.9900。

(4)、精密度

CKMB：平行检测10ng/mL的参考品10次，检测结果的变异系数应不大于15％。

(5)、稳定性

将试剂盒在37℃保存以进行加速试验，要求其至少稳定保存7天(即试剂盒加速试验之后对标准样品的测定值与理论值的偏差不超过±15％)。

表1为实施例和比较例的评估结果对比，测定结果表明本发明的实施例和比较例的相关系数≥0.99；但本发明实施例在检测限、准确度、精密度以及稳定性方面具有更为显著的优势。

表1：实施例和比较例的试剂盒评估结果对比

试剂盒	检测限(ng/mL)	准确度	线性相关系数	精密度	稳定性
						实施例1	0.9	±2.9％	0.999	±1.6％	±4.8％
比较例1	1.5	±4.4％	0.993	±12.3％	±16.2％
						比较例2	1.32	±4.8％	0.994	±10.6％	±18.8％

以上描述了本发明优选实施方式，然其并非用以限定本发明。本领域技术人员对在此公开的实施方案可进行并不偏离本发明范畴和精神的改进和变化。

Claims (2)

1.肌酸激酶同工酶测定试剂盒，包括第一试剂和第二试剂，其特征在于：

（1）制备第一试剂：称取18g 三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液、13g NaCl、9g PEG 8000、15gTween 80、1.5g叠氮钠、0.5g 肝素，溶于1.0L双蒸水中，调节ph至7.2，定容至1.5L即得试剂第一试剂：

（2）制备第二试剂：用甘氨酸缓冲液将平均粒径350nm为表面具有羧基官能团的聚苯乙烯胶乳颗粒稀释至1 w/v％，将浓度为0.1 w/v％至1 w/v％的EDAC水溶液加入至颗粒中，在恒温摇床中37℃反应30min；用甘氨酸缓冲溶液将肌酸激酶同工酶小鼠单抗稀释至0.5mg/ml，将其加入至颗粒中，在恒温摇床中37℃反应3h；加入封闭剂，常温过夜放置；将封闭过夜的颗粒，加入清洗液清洗离心3次，保存，备用；在颗粒中加入100mL双蒸水， 5g 透明质酸、0.5g叠氮钠、10g蔗糖，搅拌混匀，调节甘氨酸缓冲液pH至7.2，超声至主波长吸光度基本不变化即得第二试剂。

2.权利要求1所述的试剂盒在制备定量测定肌酸激酶同工酶测定试剂盒中的应用。