CN109633174B - 一种基于生物素量子点探针的c反应蛋白超敏检测方法 - Google Patents
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Abstract
一种基于生物素量子点探针的C反应蛋白超敏检测。1、分别在盛有包被好抗‑CRP固相单抗的膜芯片基底的西林瓶中，各自加入2mL含有不同浓度的CRP溶液，37℃孵育1h后用浓度为0.01mol/L，pH＝7.4的PBS冲洗三遍；2、分别加入2mL含有0.01mg/mL链霉亲和素和抗CRP单抗耦合的QDs探针受体蛋白的PBS溶液，37℃孵育30min后用浓度为0.01mol/L，pH＝7.4的PBS冲洗三遍；3、加入2mL 1:2000倍稀释的生物素化荧光QDs，37℃下孵育20min后用浓度为0.01mol/L，pH＝7.4的PBS冲洗三遍，氮气快速吹干纤维素膜基底后用紫外，可见光分光光度计测量荧光强度。
Description
技术领域
本发明属于C反应蛋白检测技术领域，具体涉及一种基于生物素量子点探针的C反应蛋白超敏膜蛋白芯片检测方法。
背景技术
荧光量子点(Quantum Dots，以下简称QDs)为粒径小于或接近激子波尔半径的半导体纳米晶体颗粒。其激发光谱宽且连续分布，发射光谱窄而对称、荧光稳定性强，不易发生光漂白且可实现对发射光谱的控制，因此较传统各类荧光试剂具有显著的优势。本发明以生物素修饰的QDs作为荧光探针，利用两组识别C反应蛋白不同抗原表位的单克隆抗体，分别制备出与链霉亲和素耦合的蛋白作为荧光探针荧光信号放大受体；以及表面通过抗体修饰的纤维素滤膜做为芯片基底。建立起一种用于C反应蛋白体外检测的超敏荧光膜芯片检测系统。
本发明不仅可用于C反应蛋白的超敏体外检测，该发明体系也可适用于构建各种肿瘤标志物和激素如癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)、甲胎蛋白(alphafetoprotein,AFP)、前列腺特异性抗原(prostate specific antigen,PSA)、促卵泡生成素(follicle-stimulating hormone,FSH)、黄体化激素(luteinizinghormone,LH)、人绒毛促性腺激素(human chorionic gonadotropin,HCG)等的检测；以及各种病原体特异性蛋白抗原如乙肝表面抗原(hepatitis B surface antigen,HBsAg)、鼠疫耶尔森杆菌F1抗原、葡萄球菌A蛋白(staphylococcal protein A,SPA)、链球菌异嗜抗原M蛋白等的检测，在这里为了能直观明了地阐述该发明，特以本发明覆盖的诸多检测类型之一：C反应蛋白(CRP)为例加以说明。
C-反应蛋白(C-reactive protein,CRP)是在机体受感染或组织受损时产生的一种急性蛋白，因为可以结合肺炎球菌细胞壁C-多糖故而得名。CRP可激活补体并介导吞噬细胞的调理作用，清除入侵机体的病原微生物和损伤，坏死，凋亡的组织细胞。在机体的天然免疫过程中发挥重要的保护作用。CRP作为一种非特异的炎症标志物，可用于判断组织炎症或损伤程度，对临床疾病鉴别诊断及治疗观察上均有重要意义。而近十年的研究揭示了CRP直接参与了炎症与动脉粥样硬化等心血管疾病，并且是心血管疾病最强有力的预示因子与危险因子。目前临床上常通过非免疫标记法如胶乳凝集法、免疫比浊法、单项免疫扩散等，以及酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)、胶体金法、放射免疫法、化学发光等各类免疫标记技术对CRP进行检测。非标记类免疫检测法虽操作相对简便，但结果有灵敏度低，准确性差，耗时长等缺点。而标记类免疫检测技术虽然提高了灵敏度，却需要特殊的仪器设备，对操作人员乃至工作环境有一定要求，成本高，流程复杂，耗时长，试剂昂贵且有危险性。
发明内容
本发明能解决的技术问题
为了解决上述问题，本发明提供了一种基于生物素量子点探针的C反应蛋白超敏检测方法。
本发明的具体技术方案为：一种基于生物素量子点探针的C反应蛋白超敏检测方法，包括以下步骤：
步骤一、分别在盛有包被好CRP单抗体的纤维膜基底的西林瓶中，各自加入2mL含有10μg/mL、1μg/mL、100ng/mL、10ng/mL、1ng/mL、0.1ng/mL、0ng/mL的C反应蛋白溶液，37℃孵育1h后用PBS(0.01mol/L，pH＝7.4)冲洗三遍；
步骤二、分别加入2mL含有0.01mg/mL链霉亲和素和CRP单抗耦合荧光探针受体蛋白的PBS溶液，37℃孵育30min后用PBS(0.01mol/L，pH＝7.4)冲洗三遍；
步骤三、加入2mL 1:2000倍稀释的生物素荧光QDs探针，37℃下孵育20min后用PBS(0.01mol/L，pH＝7.4)冲洗三遍，氮气快速吹干结合了QDs探针的膜芯片基底后用紫外—可见光分光光度计测量其荧光强度。
优选的，步骤一所述CRP固定抗体的膜芯片基底的制备方法：
将表面羧基化处理的纤维素滤膜片放置西林瓶中，加入浓度为0.15mol/L、pH＝4.7的MES缓冲溶液1000μl，分别加入2.5mmol EDC和4.5mmol Sulfo-NHS在20℃下反应45min，之后将膜片取出，用浓度为0.01mol/L、pH＝7.4的PBS缓冲溶液冲洗干净膜片表面残留的反应液，将之放置于浓度为0.01mol/L、pH＝7.4的1000μl PBS缓冲溶液中，同时加入CRP单抗，使溶液中抗体的终浓度为20μg/ml，20℃～25℃下反应3.5h，反应结束后取出膜片，用浓度为0.01mol/L、pH＝7.4的PBS缓冲溶液再次将膜片表面残留的反应液冲洗干净后加入1％BSA溶液于37℃孵育封闭40min，之后将膜片用浓度为0.01mol/L、pH＝7.4的PBS缓冲溶液冲洗三遍后待检测用。
优选的，步骤二所述链霉亲和素—抗CRP单抗耦合荧光探针受体蛋白的制备方法为：
步骤一、将80μg CRP单抗溶解于100μL超纯水中，超声溶解5min，严格控制水浴温度不能超过40℃；
步骤二、加入150μL 0.1M新鲜配制的的过碘酸钠溶液，室温(20℃)下避光反应30min；
步骤三、反应结束后将反应溶液装入截留分子量为10kDa的透析袋中，于1mM,pH＝4.5的醋酸钠溶液中4℃下透析过夜、
步骤四、透析结束后加入0.2M pH＝9.5的碳酸钠缓冲液2μL，调节溶液的pH到9.5，之后立即加入20μL溶解有150μg链霉亲和素0.1M碳酸缓冲液中，室温(20℃)下避光轻微搅拌2.5小时；
步骤五、反应结束后快速加入100μL新鲜配制的4.5mg/mL硼氢化钠，充分混合均匀，在4℃轻微搅拌反应2小时，还原抗体分子过多氧化的糖基；
步骤六、反应结束后将上述产物置于透析袋中，在0.15M，PH＝7.4的PBS缓冲液中4℃下透析24小时，每8小时更换一次透析液；
步骤七、将透析后的产物置于截留分子量为100kD的浓缩离心管中，于3000rpm下离心30min，除未反应的蛋白；
步骤八、浓缩离心后的产物利用G25Sephadex琼脂葡聚糖凝胶分子筛层析柱纯化分离并测定浓度后于4℃保存待用。
优选的，步骤三所述的生物素荧光QDs探针的制备方法为：
步骤一、取300uL 10mg/mL水溶性QDs于离心管中，加入900μL 0.1M pH＝4.7MES后超声分散5min，混合后体积为1200μL；
步骤二、分别加入2.2mM EDC和4.5mM NHS，37℃下避光反应40min；
步骤三、29000rpm下冷冻高速离心30min后弃上清，用0.01M pH＝7.4的PBS溶液冲洗后将量子点分散于该溶液中重复离心，之后将沉淀再次分散于上述PBS溶液中；
步骤四、于溶液中加入0.78mg/mL生物素乙二胺PBS溶液，在37℃下避光反应3h；
步骤五、用含1.5％BSA的PBS溶液封闭45min后于30000rpm冷冻高速下离心30min弃上清；
步骤六、将得到的沉淀再次分散于0.01M pH＝7.4的PBS溶液中4℃保存待用。
本发明的有益效果为：(1)本发明充分利用了荧光量子点荧光量子产率高、抗光漂白等的诸多优点，通过生物素化处理后制备出荧光探针，同时利用C反应蛋白单抗与链霉亲和素结合制备出耦合蛋白作为生物素荧光探针的信号放大受体。该受体可高亲和、高通量地与生物素化量子点荧光探针结合。因为每个受体蛋白上的链霉亲和素分子可结合4个生物素荧光量子点探针，因此相比传统的荧光免疫法和化学发光法有更强的荧光信号；该发明中荧光探针与受体蛋白结合利用了生物素—亲和素系统，此结合过程是目前已知的强度最高的非共价结合，因此比胶体金检测法中利用静电吸附将金纳米颗粒与抗体蛋白结合的标记法更加稳定、牢固。
(2)本发明中采用抗体修饰的纤维素滤膜作为膜芯片的基底，制备该基底时，通过基底表面呈递出来的化学官能团与抗体分子携带的对应残基结合形成化学键，稳定地将抗C反应蛋白单克隆抗体固定在基底表面作为捕获抗原用的固定相抗体。该方法较之传统的胶体金检测试纸利用纤维的空间位阻包被抗体的方法，以及传统ELISA技术通过静电吸附包被的方法，大大提高了固定相抗体的结合率以及稳定性；本发明对CRP的检测最低浓度可达到1ng/mL为目前常用ELISA方法最低检测浓度的百分之一，检测全套时间仅110分钟，比ELISA方法缩短了70分钟，本发明不仅具备胶体金检测法简便、快捷的优点，缩短了检测时间，所使用的材料均安全无毒、绿色环保，更具备甚至超越ELISA、放免法、化学发光法的高灵敏度，扩展了检测低浓度极限，真正实现了对C反应蛋白的超敏快速检测，在临床应用方面有着广阔的空间和极大的市场潜力
本发明中特出特点为：首先，对C反应蛋白的检测灵敏度大大提高，其实施准确检测的最低浓度为0.1ng/mL，对比目前市场常规的C反应蛋白ELISA试剂盒检测最低浓度10ng/mL，本发明的检测灵敏度提高了100倍，真正实现了微量超敏检测；其次，检测操作流程简化，整套检测所需时间仅为110min。检测时间对比同类ELISA检测所需的180min，缩短了70min，节约了时间成本，极大提高了检测效率；此外，因为生物素量子点荧光探针有着抗光漂白和抗荧光猝灭的优良特性，因此检测荧光信号稳定，可以实现反复检测。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1.超敏荧光膜芯片检测CRP的流程示意图。
图2.生物素化荧光QDs探针的制备原理示意图。
图3.超敏荧光膜芯片检测不同浓度CRP时的荧光强度图及CRP浓度与荧光量子产率的线性拟合关系图。其中左图为荧光强度与CRP浓度变化关系图，图中7条曲线按照峰高自上而下分别代表检测CRP浓度为10μg/mL、1μg/mL、100g/mL、10ng/mL、1ng/mL、0.1ng/mL和0ng/mL的荧光强度图；右图为荧光强度与CRP浓度线性拟合关系图。
图4.超敏荧光膜芯片对CRP的最佳检测时间及为检测时间对荧光强度增量的变化拟合。其中左图为荧光强度随检测时间变化图，图中5条曲线按照峰高自上而下分别代表检测时间为30min、60min、100min、10min、1min时的荧光强度；右图为检测时间对荧光强度增量的变化趋势，如图中所示，当检测时间为30分钟时其荧光信号达到最高，继续延长检测时间，荧光信号无明显增加，因此30分钟为该检测系统对CRP检测的最优化时间。
图5.水溶性QDs与生物素化QDs探针粒径分布及Zeta胶体电位对比。测试结果显示：对比水溶性QDs的粒径42.3nm(图5.a)；Zeta电位为-48.5mV(图5.c)，生物素化QDs探针的粒径为44.28nm(图5.b)；Zeta电位为-30.1mV(图5.d)，其粒径平均值改变仅为1.98nm，说明制备出的QDs探针无团聚和变性，物理性质保持完好；生物素化QDs探针Zeta电位均处于±50mV～±30mV之间，证明该胶体分散系具备较好的稳定性。
图6.水溶性QDs与生物素化QDs探针扫描电镜结果对比，通过扫描电子显微镜观察生物素化QDs探针的微观结构和晶体颗粒形貌，其中a图为水溶性QDs扫描电镜的结果；b图为生物素化QDs探针扫描电镜的结果，从两图对比可以看出水溶性QDs经过生物素化处理后QDs其晶体颗粒形貌微观结构没有发生改变，保持了较好的稳定性。
图7.CRP超敏荧光膜芯片检测体系非特异性吸附鉴定结果图。从图中可以看出，未检测CRP的膜芯片基底与只用生物素化QDs探针作用的膜芯片基底均无明显的荧光信号，说明该CRP超敏荧光膜芯片在未检测CRP抗原时不会对QDs探针发生直接或者间接的非特异性吸附，检测系统荧光信号背景干扰低，无非特异性吸附，性质优良。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
1)固定CRP单抗的纤维膜芯片基底的制备方法：
如图1所示，将表面羧基化处理的纤维素滤膜片放置于洁净的西林瓶中，加入浓度为0.1mol/L、pH＝4.7的MES缓冲溶液1000μl，分别加入2.5mmol EDC和4.5mmol Sulfo-NHS在20℃下避光反应40min，之后将膜片取出，用浓度为0.01mol/L、pH＝7.4的PBS缓冲溶液冲洗干净膜片表面残留的反应液，将之放置于浓度为0.01mol/L、pH＝7.4的1000μl PBS缓冲溶液中，同时加入CRP固定抗体，使溶液中抗体的终浓度为10μg/ml，20℃～25℃下避光反应3h，反应结束后取出膜片，用浓度为0.01mol/L、pH＝7.4的PBS缓冲溶液再次将膜片表面残留的反应液冲洗干净后加入1％BSA溶液于37℃孵育封闭30min，之后将膜片用浓度为0.01mol/L、pH＝7.4的PBS缓冲溶液冲洗三遍后待检测用，于此制备出固定有CRP捕获抗体的膜芯片基底。
2)链霉亲和素和抗CRP单抗耦合荧光受体蛋白的制备方法为：
步骤一、将50μg CRP单抗溶解于100μL超纯水中，超声溶解5min，严格控制水浴温度不能超过40℃；
步骤二、加入160μL 0.1M新鲜配制的的过碘酸钠溶液，室温(20℃)下避光反应20min；
步骤三、反应结束后将反应溶液装入截留分子量为10kDa的透析袋中，于1mM,pH＝4.4的醋酸钠溶液中4℃下透析过夜、
步骤四、透析结束后加入0.2M pH＝9.5的碳酸钠缓冲液2μL，调节溶液的pH到9.2，之后立即加入20μL溶解有0.1mg链霉亲和素的0.1M碳酸缓冲液中，室温(20℃)下避光轻微搅拌2.5小时；
步骤五、反应结束后快速加入100μL新鲜配制的4mg/mL硼氢化钠，充分混合均匀，在4℃轻微搅拌反应2小时，还原抗体分子过多氧化的糖基；
步骤六、反应结束后将上述产物置于透析袋中，在0.15M，PH＝7.4的PBS缓冲液中4℃下透析24小时，每6小时更换一次透析液；
步骤七、将透析后的产物置于截留分子量为100kD的浓缩离心管中，于3000rpm下离心30min，除未反应的蛋白；
步骤八、浓缩离心后的产物利用G25Sephadex琼脂葡聚糖凝胶分子筛层析柱纯化分离测定浓度后于4℃保存待用，于此制备出霉亲和素和抗CRP单抗耦合的QDs探针受体蛋白。
3)参考图2所示，生物素化荧光QDs探针的制备方法为：
步骤一、取300μL浓度为10mg/mL水溶性QDs于离心管中，加入900μL 0.1M pH＝4.7MES后超声分散5min，混合后体积为1200μL；
步骤二、分别加入2.2mM EDC和4.5mM NHS，37℃下避光反应40min；
步骤三、29000rpm下冷冻高速离心30min后弃上清，用0.01M pH＝7.4的PBS溶液冲洗后将量子点分散于该溶液中重复离心后将沉淀再次分散于上述PBS溶液中；
步骤四、于溶液中加入0.78mg/mL生物素乙二胺PBS溶液，在37℃下避光反应3h；
步骤五、用含1％BSA的PBS溶液封闭45min后于30000rpm冷冻高速下离心30min弃上清；
步骤六、将得到的沉淀再次分散于0.01M pH＝7.4的PBS溶液中4℃保存待用，于此制备出生物素化荧光QDs探针。
一种基于生物素量子点探针的C反应蛋白超敏检测方法，包括以下步骤：
步骤一、分别在盛有包被好C反应蛋白固定抗体的纤维膜芯片基底的西林瓶中，各自加入2mL含有10μg/mL、1μg/mL、100ng/mL、10ng/mL、1ng/mL、0.1ng/mL、0ng/mL的C反应蛋白溶液，37℃孵育30min后用PBS(0.01mol/L，pH＝7.4)冲洗三遍；
步骤二、分别加入2mL含有0.01mg/mL链霉亲和素和抗C反应蛋白抗体耦合蛋白的PBS溶液，37℃孵育30min后用PBS(0.01mol/L，pH＝7.4)冲洗三遍；
步骤三、加入2mL 1:2000倍稀释的生物素荧光QDs，37℃下孵育20min后用PBS(0.01mol/L，pH＝7.4)冲洗三遍，氮气快速吹干膜芯片基底后用紫外—可见光分光光度计测量其荧光强度。其荧光强度随检测浓度变化如图3.所示，对CRP的最低检测浓度可达到0.1ng/mL。
实施例2
最佳检测时间的测定：
步骤一、分别取2mL浓度为1μg/mL的C反应蛋白溶液各加入到5组C反应蛋白抗体固定的纤维膜芯片基底上，37℃孵育1小时后用PBS(0.01mol/L，pH＝7.4)冲洗三遍；
步骤二、加入2mL 0.01mg/mL链霉亲和素——CRP抗体耦合蛋白，于室温(20℃)下分别将5组抗体固定的纤维素膜基底按时间梯度孵育1min、10min、30min、60min、100min；
步骤三、取出膜芯片基底并用PBS缓冲溶液(0.01mol/L，pH＝7.4)将表面冲洗三遍后加入2mL 1:2000倍稀释的生物素化QDs探针，37℃下孵育20min后用PBS(0.01mol/L，pH＝7.4)冲洗三遍；
步骤四、氮气快速吹干上述结合了生物素化QDs探针的膜芯片基底并用紫外—可见光分光光度计测量其荧光强度，分析荧光强度随反应时间的变化趋势，如图4，得到在pH为7.4的生理环境下，该系统最佳的检测时间是30min。
实施例3
生物素化QDs探针的动态光散射(Dynamic Light Scattering，DLS)表征
通过动态光散射可以测定出生物素化QDs探针的粒径分布和胶体分散系中的Zeta电位，从而得知生物素化QDs探针的稳定性。
取水溶性QDs和生物化QDs探针，分别用超纯水配制成浓度为0.1mg/mL的胶体溶液,并于恒温37℃下超声分散10min。将分散后的QDs溶液和生物素化的QDs溶液于室温(20℃)静置30min后用激光粒度分析仪分别测量QDs和生物素化QDs探针的粒径分布和Zeta电位，其结果如图5.所示，水溶性QDs初始平均粒径分布约为42.3nm(图5.a)，制备生物素化QDs后平均粒径分布为44.28nm(图5.b)，其平均粒径分布无太大改变，纳米晶体颗粒无明显团聚和变性。图5.c所示水溶性QDs Zeta电位约为-50mV；图5.d所示生物素化QDs探针的Zeta电位-30mV说明该胶体分散系处于较为稳定的状态。
实施例4
生物素化QDs探针的透射电子显微镜(Transmission Electron Microscope，TEM)表征
通过TEM观察生物素化QDs探针的微观结构和晶体颗粒形貌，从而得知生物素化QDs探针的稳定性。
取水溶性QDs和生物化QDs探针，分别用超纯水配制成浓度为0.05mg/mL的胶体溶液,于室温(20℃)下超声分散10min后静置3min，利用TEM观察水溶性QDs和生物素化QDs的微观结构和形貌。其结果如图6.所示。对比水溶性QDs(图6.a),生物素化QDs探针在晶体结构和形貌上没有明显改变(图6.b)，也无团聚现象发生，说明制备出的生物素化QDs探针性质稳定。
实施例5
超敏荧光膜芯片CRP检测系统非特异性吸附检测
通过测试超敏荧光膜芯片CRP检测系统是否会发生非特异性吸附以及是否有背景荧光信号的干扰，从而判断该检测系统的稳定性和准确度。
步骤一、取2mL浓度为0.01mg/mL链霉亲和素——CRP抗体耦合蛋白溶液滴加于C反应蛋白抗体固定的纤维膜芯片基底上，室温(20℃)孵育30min小时后用PBS(0.01mol/L，pH＝7.4)冲洗三遍；
步骤二、取出膜芯片基底并用PBS缓冲溶液(0.01mol/L，pH＝7.4)将表面冲洗三遍后加入2mL 1:2000倍稀释的生物素化QDs探针，37℃下孵育20min后用PBS(0.01mol/L，pH＝7.4)冲洗三遍；
步骤三、氮气快速吹干膜芯片基底并用紫外—可见光分光光度计测量其荧光强度，此结果为CRP空白对照组；
步骤四、将2mL 1:2000倍稀释的生物素化QDs探针直接滴加于C反应蛋白抗体固定的纤维膜芯片基底上，37℃下孵育20min后用PBS(0.01mol/L，pH＝7.4)冲洗三遍，氮气快速吹干膜芯片基底并用紫外—可见光分光光度计测量其荧光强度，此结果为生物素化QDs探针非特异性吸附测试对照组。
测试结果如图7.所示，超敏荧光膜芯片CRP检测系统在不加入待测CRP抗原时，膜芯片基底表面不会和链霉亲和素——CRP抗体耦合蛋白结合，也不会与生物素化QDs探针结合；若单独加入生物素化QDs探针，膜芯片基底表面也不会对其发生非特异性吸附。由此可见本检测系统在无待测样本时，不会对链霉亲和素——CRP抗体耦合蛋白以及生物素化QDs探针发生非特异性吸附，检测系统无荧光背景干扰，有较好的准确度和稳定性。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均包含在本发明的保护范围内。
Claims (2)
1.一种基于生物素量子点探针的C反应蛋白超敏检测试剂盒，其特征在于，所述C反应蛋白(C-reactive protein，以下简称CRP)，包括以下检测步骤：
步骤一、分别在盛有包被好抗-CRP固相单抗的膜芯片基底的西林瓶中，各自加入2mL含有10μg/mL、1μg/mL、100ng/mL、10ng/mL、1ng/mL、0.1ng/mL、0ng/mL的C反应蛋白溶液，37℃孵育1h后用浓度为0.01mol/L，pH＝7.4的PBS冲洗三遍；
步骤二、分别加入2mL含有0.01mg/mL链霉亲和素和抗CRP单抗耦合的QDs探针受体蛋白的PBS溶液，37℃孵育30min后用浓度为0.01mol/L，pH＝7.4的PBS冲洗三遍；
步骤三、加入2mL 1:2000倍稀释的生物素化荧光QDs，37℃下孵育20min后用浓度为0.01mol/L，pH＝7.4的PBS冲洗三遍，氮气快速吹干纤维素基底膜后用紫外——可见光分光光度计测量其荧光强度；
所述步骤二所述链霉亲和素和抗CRP单抗耦合的QDs探针受体蛋白的制备方法为：
(1)、将80μg CRP单抗溶解于100μL超纯水中，超声溶解5min，严格控制水浴温度不能超过40℃；
(2)、加入150μL 0.1M新鲜配制的过碘酸钠溶液，室温下避光反应30min；
(3)、反应结束后将反应溶液装入截留分子量为10kDa的透析袋中，于1mM,pH＝4.5的醋酸钠溶液中4℃下透析过夜；
(4)、透析结束后加入0.2M pH＝9.5的碳酸钠缓冲液2μL，调节溶液的pH到9.5，之后立即加入20μL溶解有150μg链霉亲和素的0.1M碳酸缓冲液中，室温下避光轻微搅拌2.5小时；
(5)、反应结束后快速加入100μL新鲜配制的4.5mg/mL硼氢化钠，充分混合均匀，在4℃轻微搅拌反应2小时，还原抗体分子表面过多氧化的糖基；
(6)、反应结束后将上述产物置于透析袋中，在0.15M，PH＝7.4的PBS缓冲液中4℃下透析24小时，每8小时更换一次透析液；
(7)、将透析后的产物置于截留分子量为100kD的浓缩离心管中，于3000rpm下离心30min，除去未反应的蛋白；
(8)、浓缩离心后的产物利用G25 Sephadex琼脂葡聚糖凝胶分子筛层析柱纯化分离，测定浓度后于4℃保存待用，于此制备出链霉亲和素和抗CRP单抗耦合的生物素QDs荧光探针受体蛋白；
步骤三所述的生物素化荧光QDs探针的制备方法为：
(1)、取300μL浓度为10mg/mL水溶性QDs于离心管中，加入900μL 0.1M pH＝4.7MES后超声分散5min，混合后体积为1200μL；
(2)、分别加入2.2mM EDC和4.5mM NHS，37℃下避光反应40min；
(3)、29000rpm下冷冻高速离心30min后弃上清，用0.01M pH＝7.4的PBS溶液冲洗后将量子点分散于该溶液中重复离心后将沉淀再次分散于上述PBS溶液中；
(4)、于溶液中加入0.78mg/mL生物素乙二胺PBS溶液，在37℃下避光反应3h；
(5)、用含1.5％BSA的PBS溶液封闭45min后于30000rpm冷冻高速下离心30min弃上清；
(6)、将得到的沉淀再次分散于0.01M pH＝7.4的PBS溶液中4℃保存待用，于此制备出生物素化荧光QDs探针。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，步骤一所述CRP固相抗体的膜芯片基底的制备方法：
将表面羧基化处理的纤维素滤膜片放置于西林瓶中，加入浓度为0.15mol/L、pH＝4.7的MES缓冲溶液1000μl，分别加入2.5mmol EDC和4.5mmol Sulfo-NHS在20℃下反应45min，之后将膜片取出，用浓度为0.01mol/L、pH＝7.4的PBS缓冲溶液冲洗干净膜片表面残留的反应液，将之放置于浓度为0.01mol/L、pH＝7.4的1000μl PBS缓冲溶液中，同时加入CRP固定抗体，使溶液中抗体的终浓度为20μg/ml，20℃～25℃下避光反应3.5h，反应结束后取出滤膜，用浓度为0.01mol/L、pH＝7.4的PBS缓冲溶液再次将膜片表面残留的反应液冲洗干净后加入1％BSA溶液于37℃孵育封闭40min，之后将膜片用浓度为0.01mol/L、pH＝7.4的PBS缓冲溶液冲洗三遍后待检测用，于此制备出固定有CRP捕获抗体的膜芯片基底。
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