CN101413958B - 一种用亲和素化的荧光量子标记的免疫印迹定量检测蛋白的方法 - Google Patents
一种用亲和素化的荧光量子标记的免疫印迹定量检测蛋白的方法 Download PDFInfo
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Abstract
一种用亲和素化的荧光量子标记的免疫印迹定量检测蛋白的方法，属于免疫检测技术领域。本发明首先将待测蛋白跑电泳，跑完电泳的凝胶进行半干式western blotting蛋白转移，将凝胶中的待测蛋白转移至聚偏二氟乙烯膜PVDF上，然后对转移完的PVDF膜进行封闭，加抗待测蛋白的一抗反应，加生物素标记的二抗反应，再加入亲和素标记的荧光量子团进行反应，最后进行结果鉴定；本发明在传统免疫印迹分析的基础上引入亲和素化的荧光量子点，简化了操作步骤，灵敏度很高，利于进行微量目标蛋白的检测分析。本法将微量蛋白量的信号转化为光信号，再将光信号转化为数字信号，通过建立标准曲线，达到定量分析微量蛋白的目的。
Description
技术领域
本发明涉及用亲和素化荧光量子团做标记的免疫印迹分析检测微量蛋白的方法，特别强调了用亲和素化荧光量子团做标记时的高灵敏度及实验结果的可保存性，属于免疫检测技术领域。
背景技术
免疫印迹法(Western blotting)是一种将高分辨率凝胶电泳和免疫化学分析技术相结合的杂交技术。免疫印迹法具有分析容量大、敏感度高、特异性强等优点，是检测蛋白质特性、表达与分布的一种最常用的方法，如组织抗原的定性定量检测、多肽分子的质量测定及病毒的抗体或抗原检测等。但传统的免疫印迹方法只能做定性或半定量分析，在做更深入的分析时受到一定限制，本发明在传统免疫印迹方法的基础上引入CdTe(635nm)荧光量子点，把待测目标蛋白量的信号转化为光信号，最后转化为数字信号，通过建立标准曲线，以达到定量分析的目的。
发明内容：
(一)要解决的技术问题
本发明旨在建立一个以CdTe荧光为信号的免疫印迹(western blotting)蛋白分析方法。本发明利用量子点的荧光信号，提高免疫印迹分析方法的灵敏度、准确度，建立标准曲线达到蛋白定量分析的目的。
(二)技术解决方案
一种用亲和素化的荧光量子标记的免疫印迹定量检测蛋白的方法，首先将待测蛋白跑电泳，跑完电泳的凝胶进行半干式western blotting蛋白转移，将凝胶中的待测蛋白转移至聚偏二氟乙烯膜PVDF上，然后对转移完的PVDF膜进行封闭，加抗待测蛋白的一抗反应，加生物素标记的二抗反应，再加入亲和素标记的荧光量子团进行反应，最后进行结果鉴定；
(一)亲和素化荧光量子团的制备
(1)BSA变性：
将16.5mg BSA溶于10mL双蒸水中，搅拌下加入0.42mg NaBH4，室温下反应1h，60-80℃下加热20min分解过量的NaBH4，BSA变性后成dBSA，二硫键打开成-SH，最终的dBSA水溶液的浓度为5×10-5M；
(2)dBSA的琥珀酰胺生物素化，即制备NHS-biotin-dBSA：将琥珀酰胺生物素NHS-biotin按20mg/mL溶于二甲亚砜中，dBSA与NHS-biotin摩尔比1∶30进行混合，搅拌反应2h，反应完成后紫外扫描进行鉴定；
(3)生物素化的dBSA包裹量子点：
将dBSA和量子点分别按摩尔比1∶1，1∶2，1∶4，1∶6混合，60-80℃水浴加热15min，室温下保持两天，使包裹完全，即为荧光量子团；
(4)亲和素化荧光量子团的制备：
将亲和素与荧光量子团按摩尔比4∶1反应1h，4000r/min离心5min，去上清，用pH 7.4PBS复溶沉淀即得亲和素标记的荧光量子团；
(二)免疫印迹分析目标蛋白
(1)SDS凝胶电泳：
根据待测蛋白样品分子量选择合适的分离胶及浓缩胶浓度；配制相应浓度的分离胶、浓缩胶，在恒压条件进行电泳；
(2)western blotting转移蛋白：
将凝胶电泳去除浓缩胶部分，于电极缓冲液中浸泡15min，PVDF膜与滤纸切成凝胶一样大小，PVDF膜于电极缓冲液中浸泡至少5min，滤纸于电极缓冲液中浸湿即可，按3层滤纸、凝胶、PVDF膜、3层滤纸叠放，置于半干式转印槽中，以2mA/cm2，转移40min，即达到转移蛋白的目的；
(3)蛋白质鉴定，即免疫检测：
转移成功后的PVDF膜在37℃烘箱中干燥1h，取出后用甲醇浸泡数分钟，超纯水洗净，加5％BSA+0.05％Tween对膜进行封闭，室温1h，用pH7.4PBS5min洗涤3遍；加稀释1000倍的一抗3mL在室温下反应1h，用pH7.4PBS5min洗净3遍；加稀释1000倍的生物素标记的二抗3mL室温反应1h，用pH7.4PBS5min洗涤3遍；再加稀释1000倍的亲和素标记的荧光量子团3mL反应2h，用pH7.4PBS5min洗净3遍；洗涤后用荧光成像仪进行检测；待测蛋白量越多，所得荧光值越高；
标准曲线的建立：将已知蛋白含量的待测样品的标准品配成由高到低6个浓度，进行(一)、(二)步骤的反应，根据荧光成像仪测定结果，以标准蛋白质量为横坐标，以所测荧光强度为纵坐标，绘制标准曲线。
所用的量子点是指能够发射荧光的纳米粒子，即发光微粒，购于博阳生物科技(上海)有限公司。
所述的SDS凝胶电泳：待测蛋白样品为蛋白A，配制质量浓度10％的分离胶、质量浓度5％的浓缩胶，在恒压条件进行电泳：先80V电压下跑至浓缩胶与分离胶界面，然后100V电压下跑完。
所说的电泳凝胶进行半干式western blotting蛋白转移是在半干式westernblotting转印槽中利用电流作用将凝胶中的蛋白转移至PVDF膜上，以便做进一步分析。
所说的PVDF膜的封闭是将PVDF上未结合蛋白的位点进行封闭，以保证在后续免疫反应中一抗、二抗与待测蛋白的特异性结合，避免其非特异性地吸附到PVDF膜上，以至背景值过高。
所说的加一抗、二抗反应是指加入待测目标蛋白特异的多克隆抗体，二抗是生物素化的羊抗兔抗体。
所说的结果鉴定是最后加入亲和素化的荧光量子团，反应后用荧光凝胶成像仪进行检测分析。
(三)有益效果：
(1)本发明在传统免疫印迹分析的基础上引入亲和素化的荧光量子点，简化了操作步骤，灵敏度很高，利于进行微量目标蛋白的检测分析。
(2)本法突破了免疫印迹方法半定量分析的局限，将微量蛋白量的信号转化为光信号，再将光信号转化为数字信号，通过建立标准曲线，达到定量分析微量蛋白的目的。
(3)量子点的光信号在一定溶液中可以长时间保存。
(4)对于珍贵的蛋白样品，本法还适用于进行重复检测。
附图说明
图1变形BSA(dBSA)的生物素化。1.琥珀酰胺生物素，2.变性BSA，3.生物素化dBSA。
图2生物素化的dBSA包裹量子点。1.标准蛋白；2.量子点；3.变性BSA；4.变性BSA-量子点(摩尔比6∶1)；5.变性BSA-量子点(摩尔比4∶1)；6.变性BSA-量子点(摩尔比2∶1)；7.变性BSA-量子点(摩尔比1∶1)。
图3生物素化的dBSA包裹量子点荧光扫描图。图中数值为变性BSA与量子点摩尔比值。
图4protein A的荧光免疫分析标准曲线
具体实施方法
(一)亲和素化荧光量子团的制备
(1)BSA变性：
将16.5mgBSA溶于10mL双蒸水中，搅拌下加入0.42mg NaBH4，室温下反应1h，60-80℃下加热20min，分解过量的NaBH4，BSA变性，二硫键打开成-SH，最终的dBSA水溶液的浓度为5×10-5M。
(2)dBSA的琥珀酰胺生物素化(NHS-biotin-dBSA的制备)
将琥珀酰胺生物素(NHS-biotin)按20mg/mL溶于二甲亚砜中，dBSA与NHS-biotin摩尔比1∶30进行混合，搅拌反应2h，反应完成后紫外扫描进行鉴定。
(3)生物素化的变性BSA包裹量子点：
将dBSA和量子点按一定的摩尔比(1∶1，1∶2，1∶4，1∶6)混合，60-80℃水浴加热15min，室温下保持两天，使包裹完全。
用SDS-PAGE荧光扫描鉴定包裹结果。
SDS-PAGE条件：10％分离胶，4％浓缩胶，电压：120V。
(4)亲和素化荧光量子团的制备
将亲和素与荧光量子团按摩尔比4∶1反应1h，4000r/min离心5min，去上清，用pH 7.4PBS复溶沉淀即得。
(二)免疫印迹分析目标蛋白
(1)SDS凝胶电泳
取待测样品蛋白A，配制10％浓度的分离胶、5％浓度的浓缩胶，在恒压条件进行电泳：先80V电压下跑至浓缩胶与分离胶界面，然后100V电压下跑完。
(2)western blotting转移蛋白
将凝胶电泳去除浓缩胶部分，于电极缓冲液中浸泡15min，PVDF膜与滤纸切成凝胶一样大小，PVDF膜于电极缓冲液中浸泡至少5min，滤纸于电极缓冲液中浸湿即可，按3层滤纸、凝胶、PVDF膜、3层滤纸叠放，置于半干式转印槽中，以2mA/cm2，转移40min，即可达到转移蛋白的目的。
(3)蛋白质鉴定(免疫检测)
转移成功后的PVDF膜在37℃烘箱中干燥1h，取出后用甲醇浸泡数分钟，超纯水洗净，加5％BSA+0.05％Tween对膜进行封闭，室温1h。用pH7.4PBS5min洗涤3遍，加一抗(稀释1000倍)3mL在室温下反应1h，5min洗净3遍，加生物素标记的二抗(稀释1000倍)3mL室温反应1h，5min洗涤3遍，最后加亲和素标记的荧光量子团(稀释1000倍)3mL反应2h，洗涤后用荧光成像仪对结果进行处理。待测蛋白量越多，所得荧光值越高。
标准曲线的建立：将已知含量的待测样品的标准品配成由高到低6个浓度，进行(一)、(二)步骤的反应，根据荧光成像仪测定结果，以标准蛋白质量为横坐标，以所测荧光强度为纵坐标，绘制标准曲线。
Claims (1)
1.一种用亲和素化的荧光量子标记的免疫印迹定量检测蛋白的方法，其特征是首先将待测蛋白跑电泳，跑完电泳的凝胶进行半干式western blotting蛋白转移，将凝胶中的待测蛋白转移至聚偏二氟乙烯膜PVDF上，然后对转移完的PVDF膜进行封闭，加抗待测蛋白的一抗反应，加生物素标记的二抗反应，再加入亲和素标记的荧光量子团进行反应，最后进行结果鉴定；
(一)亲和素化荧光量子团的制备
(1)BSA变性：
将16.5mg BSA溶于10mL双蒸水中，搅拌下加入0.42mg NaBH4，室温下反应1h，60-80℃下加热20min分解过量的NaBH4，BSA变性后成dBSA，二硫键打开成-SH，最终的dBSA水溶液的浓度为5×10-5M；
(2)dBSA的琥珀酰胺生物素化，即制备NHS-biotin-dBSA：
将琥珀酰胺生物素NHS-biotin按20mg/mL溶于二甲亚砜中，dBSA与NHS-biotin摩尔比1∶30进行混合，搅拌反应2h，反应完成后紫外扫描进行鉴定；
(3)生物素化的dBSA包裹量子点：
将dBSA和量子点分别按摩尔比1∶1，1∶2，1∶4，1∶6混合，60-80℃水浴加热15min，室温下保持两天，使包裹完全，即为荧光量子团；
(4)亲和素化荧光量子团的制备：
将亲和素与荧光量子团按摩尔比4∶1反应1h，4000r/min离心5min，去上清，用pH 7.4PBS复溶沉淀即得亲和素标记的荧光量子团；
(二)免疫印迹分析目标蛋白
(1)SDS凝胶电泳：
根据待测蛋白样品分子量选择合适的分离胶及浓缩胶浓度；配制相应浓度的分离胶、浓缩胶，在恒压条件进行电泳；
(2)western blotting转移蛋白：
将凝胶电泳去除浓缩胶部分，于电极缓冲液中浸泡15min，PVDF膜与滤纸切成凝胶一样大小，PVDF膜于电极缓冲液中浸泡至少5min，滤纸于电极缓冲液中浸湿即可，按3层滤纸、凝胶、PVDF膜、3层滤纸叠放，置于半干式转印槽中，以2mA/cm2，转移40min，即达到转移蛋白的目的；
(3)蛋白质鉴定，即免疫检测：
转移成功后的PVDF膜在37℃烘箱中干燥1h，取出后用甲醇浸泡数分钟，超纯水洗净，加5％BSA+0.05％Tween对膜进行封闭，室温1h，用pH7.4PBS 5min洗涤3遍；加稀释1000倍的一抗3mL在室温下反应1h，用pH7.4PBS 5min洗净3遍；加稀释1000倍的生物素标记的二抗3mL室温反应1h，用pH7.4PBS 5min洗涤3遍；再加稀释1000倍的亲和素标记的荧光量子团3mL反应2h，用pH7.4PBS 5min洗净3遍；洗涤后用荧光成像仪进行检测；待测蛋白量越多，所得荧光值越高；
(三)标准曲线的建立：将已知蛋白含量的待测样品的标准品配成由高到低6个浓度，进行(一)、(二)步骤的反应，根据荧光成像仪测定结果，以标准蛋白质量为横坐标，以所测荧光强度为纵坐标，绘制标准曲线。
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