CN105505897B - 细菌磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶抗体制备及检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶，具有序列表表SEQ ID No.1的碱基序列的基因所编码，或由具有序列表SEQ ID No.2的氨基酸序列。本发明还涉及了上述磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶的原核表达、获得纯化蛋白的方法以及多克隆抗体的制备方法。本发明获得了外源磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶并且得到了该蛋白的多克隆抗体，以及该蛋白的Western blotting检测方法，为进一步开展细菌中磷酸泛酰巯基乙胺基功能分析奠定基础，并为细菌体内聚酮合成酶系在生物工程应用提供重要依据。

Description

细菌磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶抗体制备及检测方法
技术领域
本发明属于分子生物学领域，涉及细菌中二十碳五烯酸生物合成途径中必需的酶蛋白磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶抗体的制备及检测方法。
背景技术
细菌Shewanella sp.Ac10是分离于海水的一株低温菌，其能够在低温下很好的生长，并生产二十碳五烯酸。二十碳五烯酸具有抗氧化、抗衰老、预防心脑血管疾病的作用。也可大大降低患肿瘤的风险。对人类的这些益处让科学家对二十碳五烯酸极为关注，表明其有广阔的应用价值，仅存于植物和海洋生物中，是人体生活所必须的，但人与动物不能合成。因此利用生物合成法是生产二十碳五烯酸的一个替代途径。
细菌合成二十碳五烯酸过程中必须要有磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶的参与。磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶能够将辅酶A上的磷酸泛酰巯基乙胺基转移到酰基载体蛋白的丝氨酸残基上，近年来植物中该酶参与合成多不饱和脂肪酸的路径已经阐释清楚，而细菌中合成多不饱和脂肪酸的机制仍然未知，研究细菌中磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶在二十碳五烯酸合成中的作用显得尤为迫切。为了研究该酶在细菌生产二十碳五烯酸的分子机制作用，制备与检测其抗体是一个必须的前提基础。目前尚未有与细菌磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶抗体制备及检测方法的相关报道。
发明内容
为了解决以上问题，本发明的第一目的是提供了一种细菌来源的磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶的基因序列。
本发明的第二目的是提供该磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶兔来源的多克隆抗体的制备方法。
本发明的第三目的是提供该磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶兔来源的多克隆抗体的检测方法。
本发明采用的技术方案是：
一、细菌Shewanella sp.Ac10的磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶具有SEQ ID No.1的基因序列，或者具有序列表SEQ ID No.2的氨基酸序列。
二、细菌磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶制备抗体的方法，包括如下步骤：
(1)原核表达纯化磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶；
(2)制备更高纯度的磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶；
(3)以更高纯度的磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶为抗原蛋白，采用常规多克隆抗体制备方法制备抗血清；
(4)将抗血清进行抗体纯化处理。
步骤(1)中，原核表达纯化磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶又包括克隆如SEQ ID No.1的核酸序列，构建重组质粒，转化入大肠杆菌原核表达，收集菌体裂解菌体后纯化蛋白。
步骤(2)中，更高纯度的磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶的制备方法为，取纯化后的磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后进行凝胶染色，染色后将磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶蛋白于聚丙烯酰胺凝胶中切下，将切下的胶块置于透析袋中、并于电泳槽中进一步电泳，将蛋白完全析出，并去除胶块，浓缩获得更高纯度的抗原蛋白。
步骤(3)中，常规多克隆抗体制备方法为，将更高纯度的抗原蛋白采用兔耳皮下注射法免疫2～3kg的白兔，500μg每次，2～3周免疫一次，共免疫3～5次，收集血清。
步骤(4)中，抗体纯化处理是将抗原蛋白与Ni-NTA偶联制备成抗体纯化层析柱，将所得抗血清与PBS等量混合后，缓慢经过层析柱，待抗体与抗原结合后用甘氨酸洗脱缓冲液洗脱，获得纯化的抗体。
三、细菌磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶的多克隆抗体的检测方法，通过ELISA方法确定抗体针对抗原的效价，效价大于1:50，000进行最终采血制备抗血清，纯化制备得多克隆抗体，并利用Western blotting检测。
本发明的有益效果是：本发明得到了细菌磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶并且制备得到了该蛋白的多克隆抗体，以及该蛋白的ELISA检测方法和Western Blotting检测方法，为进一步开展磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶功能分析奠定基础，为多聚不饱和脂肪酸在细菌中的合成路径的阐释提供证据。
附图说明
图1为双酶切核酸电泳示意图；
图2为表达质粒pET21a-Ppt示意图；
图3为蛋白纯化SDS-PAGE分析图；
图4为目的蛋白SDS-PAGE电泳图谱；
图5为细菌磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶多克隆抗体的Western Blotting分析图。
具体实施方式
下面结合具体的实施例对本发明的技术方案做进一步说明，但不应理解为对本发明的限制：
实施例1
细菌磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶转移酶蛋白的表达纯化按以下步骤进行：
(1)克隆酶蛋白基因序列
通过比对GnenBank提供的Shewanella sp.SC2A，Shewanellasp.Ac10等菌株的磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶同源基因序列,设计引物F1与R1(见表1)。扩增以Shewanellasp.Ac10基因组为模板，扩增反应体系如下：10×PCR反应缓冲液5μl，25mmol/LMgSO4 2μl,10mmol dNTP 5μl,10nmol/L引物各1μl，基因组DNA模板80ng，KoD-Plus DNA聚合酶1μl，双蒸去离子水定容至50μl。反应条件为：95℃预变性5min；95℃30s，55℃30s，68℃延伸1.30min，共计30个循环；68℃延伸10min；15℃保持10min。将PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳后，切胶回收，克隆测序，测序由ABI3100测序仪完成。
表1实验中的引物序列表
(2)构建重组质粒
上述PCR产物回收后经限制性内切酶NdeI和EcoRI双酶切，与经相同限制内切酶消化的商业化载体pET21a(+)进行琼脂糖凝胶电泳、切胶回收，如图1所示：ladder为marker,pET21a(+)为载体pET21a(+)经NdeI和EcoRI双酶切的产物，PCR product为上述PCR产物经NdeI和EcoRI双酶切。双酶切后的pET21a(+)与PCR产物再经高效DNA连接酶High Ligation(TOYOBO)催化连接，构建出基因表达质粒pET21a-Ppt，如图2所示为表达质粒pET21a-Ppt示意图。
(3)将重组质粒pET21a-Ppt转化大肠杆菌BL21(DE3)
经测序无突变的重组质粒pET21a-Ppt转化大肠杆菌BL21(DE3)表达宿主，筛选阳性克隆。将阳性克隆置于1000ml含有终浓度为50μg/ml的Amp LB培养基中，37℃培养4小时，待OD600达到0.6时，转入28℃培养并添加终浓度为0.5mM的IPTG诱导培养至OD600为2.0，4℃离心收集菌体。
(4)纯化重组蛋白
以Tris-HCl(20mM，pH 8.0)100ml重新悬浮上述收集的菌体。超声破碎15分钟，4℃离心1小时，收集上清液并利用Ni-NTA亲和层析色谱柱纯化蛋白，蛋白纯化系统采用Biologic(BIORAD)蛋白纯化系统。通过10％SDS-PAGE检测各收集管中蛋白以收集目的蛋白，结果如图3所示，M为marker,序号1～10对应为1～10号收集管中的重组蛋白。
实施例2
细菌磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶制备抗体方法包括以下步骤：
(1)制备更高纯度的磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶；
(2)以更高纯度的磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶为抗原蛋白，采用常规多克隆抗体制备方法制备抗血清；
(3)将抗血清进行抗体纯化处理。
步骤(1)中，更高纯度的磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶的制备方法为，取纯化的后的磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后进行凝胶染色，染色后将磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶蛋白于聚丙烯酰胺凝胶中切下，将切下的胶块置于透析袋中、并于电泳槽中进一步电泳，将蛋白完全析出，并去除胶块，浓缩获得更高纯度的抗原蛋白。如图4所示，M为marker,1号为更高纯度的抗原蛋白。
步骤(2)中，常规多克隆抗体制备方法为，将更高纯度的抗原蛋白采用兔耳皮下注射法免疫2kg的白兔，500μg每次，3周免疫一次，共免疫5次，收集抗血清。
步骤(3)中，抗体纯化处理是将抗原蛋白与Ni-NTA偶联制备成抗体纯化层析柱，将所得抗血清与PBS等量混合后，缓慢经过层析柱，待抗体与抗原结合后用甘氨酸洗脱缓冲液洗脱，获得纯化的抗体。
实施例3
磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶兔来源的多克隆抗体的检测方法包括纯化抗体浓度测定，ELISA效价测定，Western Blotting抗体特异性测定。
上述纯化抗体浓度测定方法，包括如下步骤：
(1)CBB染色液配制：根据样品数量，将5×CBB染色液稀释，充分混匀。
(2)根据需要取适量BSA标准蛋白，配制终浓度分别为1mg/ml、0.75mg/ml、0.5mg/ml、0.25mg/ml和0.125mg/ml标准样，并混匀。标准样采用PBS为溶剂。
(3)取一块酶标板，按下表2加入试剂。
表2酶标板的试剂
孔号 A B C D E F
标准样浓度(mg/ml) 0 0.125 0.25 0.5 0.75 1
各浓度标准样(μl) 1 1 1 1 1 1
去离子水 9 9 9 9 9 9
CBB染色液 200 200 200 200 200 200
对应蛋白含量(μg) 0 0.125 0.25 0.5 0.75 1
最终体积(μl) 210 210 210 210 210 210
(4)振荡混匀后，室温下静置30min。
(5)用酶标仪测定562nm处的吸光值，以不含BSA的光吸收为空白对照。
(6)以蛋白含量(μg)为横坐标，吸收值为纵坐标，绘出标准曲线。
(7)样品测定：将待测蛋白样品用去离子水稀释不同浓度梯度，各取1μl并稀释至10μl，再加入200μl 1×CBB，混匀后室温下静置30min，然后以不含蛋白的溶剂为空白对照，测定样品吸收值。
(8)根据测得的吸收值，在标准曲线上计算样品的蛋白含量。
上述ELISA效价测定方法，包括以下步骤：
(1)用pH 9.5碳酸钠缓冲液将抗原稀释到10μg/ml，将抗原置于酶标96孔板，每孔100μl，孵育1h后用PBST清洗酶标板3次；
(2)然后每孔加入100μl的5％脱脂奶粉，封闭酶标板1h后用PBST清洗酶标板3次；
(3)然后每孔加入5000倍稀释的血清，孵育抗原1h后用PBST清洗酶标板3次；
(4)然后每孔加入100μl HRP标记的羊抗兔抗体，羊抗兔抗体用PBST以1：5000的比例稀释，孵育1h后用PBST清洗酶标板3次；
(5)清洗完毕后每孔加入100μl显色液ABST，反应20min后每孔加入50μl过氧化氢；
(6)最后分光光度计上测420nm下上述步骤(5)中样品的OD值。
上述Western Blotting抗体特异性测定方法包括以下步骤：
(1)细菌Shewanella sp.Ac10培养至OD为2.0，取1.5ml离心收集菌体，300μgTris-HCl重悬，超声破碎，15,000rpm离心、分别收集上清与沉淀；上清取20μl与5μl5x SDS上样缓冲液混合，其中10μl进行SDS-PAGE电泳，沉淀用30μl 1x SDS上样缓冲液悬浮，其中3μg进行SDS-PAGE电泳。Magic上样量为0.8μl；
(2)上样后，电泳仪恒定为18mA，直到电泳结束；
(2)电泳结束后，将凝胶上的蛋白样品通过电转处理转移至PVDF膜，设定电转电流为0.23A，电转时间为35min；
(3)电转结束后将PVDF膜干燥处理，然后在5％脱脂奶粉封闭液中封闭处理1h；
(4)封闭处理后用PBST清洗PVDF膜5次；
(5)用封闭液5000稀释纯化的抗体,用稀释后的抗体孵育1h后用PBST清洗5次；
(6)清洗完毕后用封闭液1:20000稀释二抗(羊抗兔-HRP)，用稀释后的二抗孵育1h后用PBST清洗5次；
(7)将清洗完毕后的PVDF膜ECL显影，暗室成像，成像结果如图5所示：在30KDa
与40KDa之间有目的条带，说明该抗体可以免疫反应磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶蛋白。

Claims (2)

1.一种细菌磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶抗体制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)原核表达纯化磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶；
(2)制备更高纯度的磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶；
(3)以更高纯度的磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶为抗原蛋白，采用常规多克隆抗体制备方法制备抗血清；
(4)将抗血清进行抗体纯化处理；
所述细菌磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶的碱基序列如序列表SEQ ID No.1所示，或其氨基酸序列如序列表SEQ ID No.2所示；
所述细菌磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶是由原核表达获得的纯化蛋白；
所述步骤(2)中更高纯度的磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶的制备方法为，取纯化后的磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后进行凝胶染色，染色后将磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶蛋白于聚丙烯酰胺凝胶中切下，将切下的胶块置于透析袋中透析后浓缩获得更高纯度的抗原蛋白；
所述步骤(3)中常规多克隆抗体制备方法为，将更高纯度的抗原蛋白采用兔耳皮下注射法免疫2～3kg的白兔，500μg每次，2～3周免疫一次，共免疫3～5次，收集血清；
所述步骤(4)中抗体纯化处理是将抗原蛋白与Ni-NTA偶联制备成抗体纯化层析柱，将所得抗血清与PBS等量混合后，缓慢经过层析柱，待抗体与抗原结合后用甘氨酸洗脱缓冲液洗脱，获得纯化的抗体。
2.一种细菌磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶的多克隆抗体的检测方法，其特征在于：通过ELISA方法确定抗体针对抗原的效价，效价大于1:50000进行最终采血制备抗血清，纯化制备得多克隆抗体，并利用Western blotting检测；
所述ELISA方法包括以下步骤：
(1)用pH 9.5碳酸钠缓冲液将抗原稀释到10μg/ml，将抗原置于酶标96孔板，每孔100μl，孵育1h后用PBST清洗酶标板；
(2)然后每孔加入100μl的5％脱脂奶粉，封闭酶标板1h后用PBST清洗酶标板；
(3)然后每孔加入5000倍稀释的血清，孵育抗原1h后用PBST清洗酶标板；
(4)然后每孔加入100μl HRP标记的羊抗兔抗体，羊抗兔抗体用PBST以1：5000的比例稀释，孵育1h后用PBST清洗酶标板；
(5)清洗完毕后每孔加入100μl显色液ABST，反应20min后每孔加入50μl过氧化氢；
(6)最后分光光度计上测420nm下的OD值；
所述的Western Blotting检测方法包括以下步骤：
(1)培养细菌Shewanella sp.Ac10，离心收集菌体，再用Tris-HCl重悬，再超声破碎处理后离心收集上清与沉淀；上清与上样缓冲液混合，然后将混合物进行SDS-PAGE电泳，沉淀用上样缓冲液悬浮，然后将悬浮液进行SDS-PAGE电泳；
(2)电泳结束后，将凝胶上的蛋白样品通过电转处理转移至PVDF膜，设定电转电流为0.23A，电转时间为35min；
(3)电转结束后将PVDF膜干燥处理，然后在5％脱脂奶粉封闭液中封闭处理1h；
(4)封闭处理后用PBST清洗PVDF膜；
(5)用封闭液稀释纯化的抗体,用稀释后的抗体孵育1h后用PBST清洗；
(6)清洗完毕后用封闭液稀释二抗，用稀释后的二抗孵育1h后用PBST清洗；
(7)将清洗完毕后的PVDF膜ECL显影，暗室成像。
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